Luận án Tiến sĩ Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt lên chất lượng cây giống in vitro ở một số cây trồng có giá trị kinh tế

Chia sẻ: Bobietbo | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:191

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài được thực hiện nhằm đánh giá tác động của các hạt nano bạc (AgNPs) - được sử dụng khử trùng bề mặt mẫu lá và bổ sung vào môi trường nuôi cấy, các hạt nano sắt (FeNPs) - được sử dụng thay thế sắt-Ethylenediamine Tetra Acetate (FeEDTA) trong quá trình vi nhân giống lên chất lượng cây giống trên một số loại cây trồng có giá trị kinh tế (salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt lên chất lượng cây giống in vitro ở một số cây trồng có giá trị kinh tế

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐỖ MẠNH CƯỜNG NGHIÊN CỨU NGHIÊN TÁCTÁC CỨU ĐỘNG CỦA ĐỘNG NANO CỦA BẠCBẠC NANO VÀ VÀ NANO SẮT SẮT NANO LÊN LÊN CHẤT LƯỢNG CHẤT CÂYCÂY LƯỢNG GIỐNG IN VITRO GIỐNG Ở IN VITRO ỞMỘT MỘTSỐSỐCÂY CÂYTRỒNG TRỒNGCÓ CÓGIÁ GIÁTRỊ TRỊKINH KINHTẾ TẾ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thừa Thiên Huế - 2022
ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA NANO BẠC VÀ NANO SẮT LÊN CHẤT LƯỢNG CÂY GIỐNG IN VITRO Ở MỘT SỐ CÂY TRỒNG CÓ GIÁ TRỊ KINH TẾ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9420201 Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Dương Tấn Nhựt 2. PGS.TS. Trương Thị Bích Phượng Hoc viên thực hiện: Đỗ Mạnh Cường Thừa Thiên Huế - 2022
LỜI CẢM ƠN Đối với tôi khoảnh khắc đầu tiên mà không thể nào quên được là lúc lên 6 tuổi, ba mẹ gửi tôi cho một Cha nhà thờ để tôi được đi học mẫu giáo. Cuộc sống của tôi gắn liền với nhà thờ cho đến khi tôi học xong đại học. Khoảnh khắc thứ hai đó là lúc tôi bước vào phòng Sinh học Phân tử và chọn tạo giống cây trồng để học môn Công nghệ Sinh học Thực vật. Chính môi trường làm việc, thầy cô, anh chị và các bạn sinh viên ở đây đã mở ra cho tôi một chân trời mới, một ước mơ mới. Để có được như ngày hôm nay, tôi biết bản thân đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của mọi người. Người mà tôi biết ơn sâu sắc nhất là Thầy - GS.TS. Dương Tấn Nhựt (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên). Thầy đã tận tình chỉ bảo cho tôi biết thế nào là nghiên cứu khoa học, qua sự giảng dạy của Thầy, cả một bầu trời trí thức mở ra trước mắt tôi; cho tôi biết sự ưu tú trong nghề nhà giáo không chỉ là kiến thức mà hơn hết đó là đạo đức, là phong cách sư phạm. Tôi sẽ không bao giờ biết được những điều kỳ diệu ấy nếu như không có sự tâm huyết, nhiệt tình tận tụy của Thầy. Tôi sẽ mãi khắc ghi những lời răn dạy nghiêm khắc trong những cuộc họp; hay những câu chuyện hóm hỉnh nhưng đầy tính triết lý - nhân văn trong cuộc sống ở các bữa ăn, những chuyến đi hội nghị - công tác. Tôi cảm thấy mình rất vinh dự khi được sống, được làm việc cùng Thầy. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô - PGS.TS. Trương Thị Bích Phượng (Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế). Cô luôn tận tình giúp đỡ cũng như động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn TS. Hoàng Thanh Tùng, người đã dành thời gian, nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình viết và chỉnh sửa luận án. Qua đó, tôi đã học được rất nhiều kiến thức và kỹ năng trong nghiên cứu khoa học. Cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của các đề tài, dự án của phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên đã hỗ trợ cho tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Anh, Chị, các bạn sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh ở phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây trồng - Viện i
Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, nơi tôi thực hiện các nội dung chính trong luận án, đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện thí nghiệm và hoàn thành luận án này. Tôi xin cảm ơn ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, Quý Thầy Cô phòng Sau Đại học, Quý Thầy Cô Khoa Sinh học đã cung cấp cho tôi kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây nguyên và Ban lãnh đạo Công ty cổ phần Công nghệ Sinh học Thái Dương đã cho phép và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ người đã sinh ra con, đã luôn bên cạnh, động viên và tạo điều kiện để con được học tập, nghiên cứu. Anh cảm ơn Vợ - người đã luôn yêu thương và đồng hành cùng anh trong mọi chặng đường đi. Lâm Đồng, ngày tháng năm 2022 Đỗ Mạnh Cường ii
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu “Nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt lên chất lượng cây giống in vitro ở một số cây trồng có giá trị kinh tế” là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Dương Tấn Nhựt và PGS.TS. Trương Thị Bích Phượng. Nghiên cứu này là một phần trong nhánh số 3 của Dự án trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu tác động của hạt nano kim loại lên khả năng tái sinh, sinh trưởng phát triển và tích luỹ hoạt chất trong quá trình nhân giống một số cây trồng có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam” thuộc Hợp phần IV “Nghiên cứu cơ chế tác động và đánh giá an toàn sinh học của các chế phẩm nano”, mã số: VAST.TD.NANO.04/15-18 và đề tài “Thiết lập phương pháp mới trong khử trùng mẫu, môi trường nuôi cấy và khắc phục một số hiện tượng bất thường trong vi nhân giống trên một số đối tượng cây trồng có giá trị kinh tế”, Mã số: 106.01-2019.301 của Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED). Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. Các số liệu và hình ảnh trình bày trong luận án là trung thực khách quan, nghiêm túc và chưa được sử dụng để công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về sự cam đoan này. Lâm Đồng, ngày tháng năm 2022 Đỗ Mạnh Cường iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid AAS : Atomic Absorbtion Spectrometric (phương pháp Quang phổ hấp phụ nguyên tử) ACC : 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylic Acid ACS : ACC Synthase Ag : Bạc AgNO3 : Bạc nitrat AgNPs : Các hạt nano bạc BA : Benzyladenine BAP : Benzylaminopurine DNA : Deoxyribonucleic Acid EDTA : Ethylenediamine Tetra Acetate Fe : Sắt FeNPs : Các hạt nano sắt GA3 : Gibberellic acid GC : Gas chromatography (hệ thống Sắc ký khí GC) HCl : Chlohydric Acid HNO3 : Nitric Acid IBA : 3-Indolebutyric Acid IBA : 3-Indolebutyric acid Kin : Kinetin MS : Môi trường Murashige và Skoog (1962) NAA : Naphthaleneacetic acid SAM : S-adenosyl-L-methionine SEM : Scanning Electron Microscope (Kính hiển vi điện tử quét) SH : Môi trường Schenk và Hildebrandt (1972) SPSS : Statistical Package for the Social Sciences (Phần mềm thống kê cho các ngành khoa học xã hội) TDZ : Thidiazuron iv
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................ iv MỤC LỤC ................................................................................................................. v DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. x DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. xii DANH MỤC BIỂU ĐỒ .......................................................................................... xiv MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 5 Vi nhân giống...................................................................................................... 5 1.1.1. Khái niệm vi nhân giống............................................................................ 5 1.1.2. Các giai đoạn trong vi nhân giống thực vật ............................................... 5 1.1.2.1. Khử trùng bề mặt .............................................................................. 5 1.1.2.2. Phát sinh hình thái ............................................................................ 7 1.1.2.3. Cây hoàn chỉnh và thích nghi vườn ươm........................................ 12 1.1.3. Một số hạn chế trong vi nhân giống thực vật .......................................... 13 1.1.3.1. Tích luỹ khí ethylene ....................................................................... 13 1.1.3.2. Hoá nâu mẫu cấy ............................................................................ 15 Nano kim loại.................................................................................................... 16 1.2.1. Giới thiệu chung ...................................................................................... 16 1.2.2. Ứng dụng nano kim loại trong vi nhân giống thực vật ............................ 17 1.2.3. AgNPs và FeNPs trong vi nhân giống thực vật ....................................... 19 1.2.3.1. AgNPs trong vi nhân giống thực vật............................................... 19 v
1.2.3.2. FeNPs trong vi nhân giống thực vật ............................................... 22 1.2.3.3. Hấp thu, vận chuyển và chuyển hóa nano kim loại trong cây ........ 25 1.2.4. Tính an toàn sinh học của các nano kim loại ........................................... 27 Sơ lược về các đối tượng cây trồng sử dụng trong nghiên cứu ........................ 28 1.3.1. Cây salem................................................................................................. 28 1.3.2. Dâu tây ..................................................................................................... 29 1.3.3. Sâm Ngọc Linh ........................................................................................ 31 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 34 Vật liệu .............................................................................................................. 34 2.1.1. Vật liệu thực vật ....................................................................................... 34 2.1.2. Dung dịch nano ........................................................................................ 34 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất....................................................................... 34 Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 35 2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy ................................................................................................... 35 2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro ..................................................................... 35 2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi trong nuôi cấy in vitro .............................................. 35 2.2.4. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro ............................................................................. 36 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 36 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................ 36 2.3.1.1. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy .......................................................................... 36 vi
2.3.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro .................................. 37 2.3.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi trong nuôi cấy in vitro..... 38 2.3.1.4. Thí nghiệm 4: Theo dõi khả năng thích nghi, sinh trưởng, phát triển và tích luỹ hoạt chất của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro .............................................................................. 40 2.3.2. Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu ........................................................... 41 2.3.3. Phương pháp quan sát bề mặt mô sẹo ...................................................... 42 2.3.4. Phương pháp giải phẫu thực vật .............................................................. 42 2.3.5. Phương pháp quan sát và đếm số lượng tế bào........................................ 42 2.3.6. Phương pháp xác định hàm lượng khí ethylene ...................................... 43 2.3.7. Phương pháp xác định hàm lượng AgNPs hấp thụ .................................. 43 2.3.8. Phương pháp phân tích định lượng saponin (G-Rg1, M-R2, G-Rb1) ..... 44 Điều kiện nuôi cấy ............................................................................................ 44 Địa điểm và thời gian tiến hành thí nghiệm ...................................................... 44 Phương pháp xử lý thống kê ............................................................................. 45 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................. 46 Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu cấy .......................................................................................................................... 46 3.1.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem........................................................................................................ 46 3.1.2. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây dâu tây ............................................................................................... 49 vii
3.1.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây sâm Ngọc Linh ........................................................................................ 52 Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái các loại mẫu trong nuôi cấy in vitro ...................................................................................... 57 3.2.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo cây salem nuôi cấy in vitro ............................................................................ 57 3.2.2. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự tái sinh chồi từ huyền phù tế bào cây salem nuôi cấy in vitro ............................................................................ 60 3.2.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên quá trình phát sinh và tăng sinh phôi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro....................................................... 62 Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi nuôi cấy in vitro ......................................................................... 68 3.3.1. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây salem nuôi cấy in vitro.......................................................... 68 3.3.2. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây dâu tây nuôi cấy in vitro ....................................................... 71 3.3.3. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro .......................................... 74 Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây con in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro .......................................................................................................................... 84 3.4.1. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây salem in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro ............................................................................................ 84 3.4.2. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây dâu tây in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro ..................................................................................... 87 viii
3.4.3. Khả năng sinh trưởng tiếp theo của cây sâm Ngọc Linh in vitro nuôi cấy trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs tối ưu ở giai đoạn ex vitro ............................................................................. 90 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ................................................................................. 98 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ....................................................................... 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 101 PHỤ LỤC ix
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tác nhân khử trùng, nồng độ kết hợp với thời gian xử lý trong khử trùng mẫu cấy ......................................................................................... 6 Bảng 1.2. Một số nghiên cứu khử trùng bề mặt mẫu cấy trên cây salem và dâu tây ........................................................................................................... 6 Bảng 1.3. Một số nghiên cứu phát sinh hình thái trên cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh ............................................................................................. 10 Bảng 1.4. Một số nghiên cứu hình thành cây con hoàn chỉnh của cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh .............................................................................. 13 Bảng 1.5. Một số nghiên cứu và ứng dụng nano kim loại trên thế giới ............... 17 Bảng 1.6. Một số nghiên cứu và ứng dụng nano kim loại ở Việt Nam ................ 18 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây salem sau 4 tuần nuôi cấy ..................................................................... 47 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây dâu tây sau 6 tuần nuôi cấy .................................................................. 50 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng bề mặt và cảm ứng mẫu lá cây sâm Ngọc Linh sau 6 tuần nuôi cấy ..................................................... 53 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của AgNPs lện sự tái sinh, sinh trưởng và phát triển chồi từ huyền phù tế bào cây salem sau 4 tuần nuôi cấy ............................. 61 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của AgNPs lên khả năng nhân nhanh phôi và tái sinh chồi từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh sau 6 tuần nuôi cấy ...................... 63 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây salem sau 4 tuần nuôi cấy .................................................. 69 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây dâu tây sau 4 tuần nuôi cấy................................................ 72 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình tạo cây con hoàn chỉnh từ chồi cây sâm Ngọc Linh sau 12 tuần nuôi cấy................................. 75 Bảng 3.9. Khả năng thích nghi và sinh trưởng của cây salem trong vỉ xốp sau 4 tuần nuôi trồng ..................................................................................... 84 x
Bảng 3.10. Khả năng sinh trưởng và phát triển của cây salem trong chậu nhựa sau 12 tuần nuôi trồng .......................................................................... 85 Bảng 3.11. Khả năng thích nghi và sinh trưởng của cây dâu tây trong vỉ xốp sau 4 tuần nuôi trồng .................................................................................. 87 Bảng 3.12. Khả năng sinh trưởng và phát triển của cây dâu tây trong chậu nhựa sau 12 tuần nuôi trồng .......................................................................... 88 Bảng 3.13. Khả năng thích nghi và sinh trưởng cây sâm Ngọc Linh được nuôi trồng trong vỉ xốp sau 6 tháng nuôi trồng ............................................ 90 Bảng 3.14. Khả năng sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh trong rổ nhựa sau 12 tháng nuôi trồng ............................................................... 91 xi
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp khí ethylene trong thực vật ......................... 14 Hình 1.2. Con đường truyền tín hiệu ethylene trong thực vật .............................. 15 Hình 1.3. Cơ chế hấp thu sắt trong thực vật ......................................................... 24 Hình 1.4. Cây salem ............................................................................................. 28 Hình 1.5. Cây dâu tây ........................................................................................... 29 Hình 1.6. Cây sâm Ngọc Linh .............................................................................. 31 Hình 3.1. Sự cảm ứng khác nhau của các mẫu lá salem được khử trùng bằng AgNPs so với HgCl2 sau 4 tuần nuôi cấy ............................................. 48 Hình 3.2. Sự cảm ứng khác nhau của các mẫu lá cây dâu tây được khử trùng bằng AgNPs so với HgCl2 sau 3 và 6 tuần nuôi cấy ............................ 51 Hình 3.3. Sự cảm ứng khác nhau của các mẫu lá sâm Ngọc Linh được khử trùng bằng AgNPs so HgCl2 sau 1, 2, 4 và 6 tuần nuôi cấy .......................... 54 Hình 3.4. Huyền phù tế bào từ mô sẹo cây salem trong môi trường nuôi cấy lỏng lắc ................................................................................................. 58 Hình 3.5. Sự tái sinh, sinh trưởng và phát triển chồi từ huyền phù tế bào cây salem ở đối chứng và các nồng độ AgNPs khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy ........................................................................................................ 61 Hình 3.6. Ảnh hưởng của AgNPs lên quá trình sinh và tăng sinh phôi soma sâm Ngọc Linh sau 14 nuần nuôi cấy .......................................................... 64 Hình 3.7. Hình thái phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh ở đối chứng và 1,6 mg/L AgNPs .................................................................................................. 65 Hình 3.8. Cây salem sinh trưởng và phát triển trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs ở các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy ................................................................................................ 70 Hình 3.9. Cây dâu tây sinh trưởng và phát triển trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs ở các nồng độ khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy ................................................................................................ 73 xii
Hình 3.10. Cây sâm Ngọc Linh sinh trưởng và phát triển trên môi trường bổ sung AgNPs và thay thế Fe-EDTA bằng FeNPs ở các nồng độ khác nhau sau 12 tuần nuôi cấy ............................................................................. 76 Hình 3.11. Sự thích nghi, sinh trưởng và phát triển của cây salem sau 4 tuần và 12 tuần nuôi trồng ................................................................................ 86 Hình 3.12. Sự thích nghi, sinh trưởng và phát triển của cây dâu tây sau 4 tuần và 12 tuần nuôi trồng ................................................................................ 89 Hình 3.13. Sự thích nghi, sinh trưởng và phát triển của cây salem sau 6 tháng và 12 tháng nuôi trồng .............................................................................. 92 Hình 3.14. Sự sinh trưởng, phát triển của cây sâm Ngọc Linh sau 24 tháng nuôi trồng trong điều kiện nhà kính ............................................................. 95 xiii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự gia tăng số lượng tế bào từ mô sẹo cây salem sau 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 ngày nuôi cấy................................ 58 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng AgNPs được hấp thu đến sự biến động khí ethylene trong bình nuôi cấy cây con salem hoàn chỉnh ............. 77 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng AgNPs được hấp thu đến sự biến động khí ethylene trong bình nuôi cấy cây con dâu tây hoàn chỉnh ........... 78 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng AgNPs được hấp thu đến sự biến động khí ethylene tích luỹ trong bình nuôi cấy cây con sâm Ngọc Linh hoàn chỉnh .......................................................................................... 78 Biểu đồ 3.5. Khối lượng tươi của củ sâm Ngọc Linh sau 2 năm trồng trong điều kiện nhà kính ...................................................................................... 93 Biểu đồ 3.6. Hàm lượng saponin của củ sâm Ngọc Linh sau 2 năm trồng trong điều kiện nhà kính .............................................................................. 94 xiv
MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Công nghệ sinh học thực vật - đặc biệt là phương pháp nuôi cấy tế bào, mô và cơ quan thực vật trên môi trường dinh dưỡng được kiểm soát - đã khắc phục được những khó khăn của phương pháp nhân giống truyền thống [101]. Ưu điểm của phương pháp này là tạo ra được số lượng lớn cây trồng đồng nhất về mặt di truyền, tạo ra nguồn giống sạch bệnh, bảo tồn và phát triển nguồn gene cũng như nghiên cứu các đặc tính sinh lý của thực vật. Nuôi cấy mô, tế bào và cơ quan thực vật bao gồm cảm ứng mô sẹo, nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh phôi, tái sinh chồi, hình thành rễ,... Sự thành công của các phương pháp này phụ thuộc vào một số yếu tố như kiểu gene, loại mẫu cấy, phương pháp khử trùng bề mặt, thành phần môi trường nuôi cấy, chất điều hoà sinh trưởng thực vật, hệ thống nuôi cấy, quang chu kỳ,... Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm mang lại thì phương pháp này vẫn còn tồn tại một số hạn chế như quá trình khử trùng bề mặt mẫu cấy bị nhiễm vi sinh vật ảnh hưởng đến hiệu quả tái sinh, hiệu quả của các quá trình phát sinh hình thái không cao, sự tích luỹ khí ethylene ảnh hưởng đến hiệu quả nhân giống, chất lượng cây giống và tỷ lệ sống sót khi thuần hoá ở vườn ươm thấp, giá thành cây giống cao [84], [40]. Do đó việc ứng dụng các nguồn vật liệu mới cũng như cải tiến môi trường và điều kiện nuôi cấy nhằm nâng cao chất lượng cây giống vẫn luôn là một trong những mục tiêu của vi nhân giống thương mại. Chúng ta đang sống trong thời đại mà công nghệ nano được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như vật lý, hoá học, điện tử, môi trường, năng lượng, vật liệu, sinh học [108]. Trong những năm gần đây, tương tác giữa các vật liệu nano với thực vật đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Rất nhiều các nghiên cứu về tác động của các loại hạt nano lên hệ thống thực vật đã được tiến hành. Các nhà nghiên cứu đã cho thấy thành phần, cấu trúc, nồng độ hạt nano có ảnh hưởng tích cực và tiêu cực khác nhau đến sinh trưởng, phát triển thực vật [85]. Tác động tích cực đáng kể của các hạt nano lên thực vật đã được chứng minh thông qua khả năng gia tăng tỷ lệ nảy mầm, tăng cường sinh trưởng và các hoạt động sinh lý, ngăn ngừa bệnh 1
hại, sự sản sinh ethylene và sự rụng các cơ quan sinh sản, tăng sản lượng và năng suất cây trồng cũng như tăng cường chuyển hóa các hợp chất thứ cấp có giá trị như dược phẩm, chất dinh dưỡng và hóa chất nông nghiệp [178], [135], [66]. Từ đó, một loạt các ứng dụng có thể thương mại hóa liên quan tới việc triển khai các hạt nano trong nông nghiệp đã được phát triển một cách nhanh chóng để cải thiện chất lượng cây trồng, hạn chế việc sử dụng dư thừa thuốc trừ sâu, phân bón hóa học. Song song với việc sử dụng các hệ thống nuôi cấy tiên tiến trong nuôi cấy mô tế bào thực vật (hệ thống thoáng khí, bioreactor, vi thủy canh, hệ thống chiếu sáng đơn sắc,…) nhằm cải thiện điều kiện nuôi cấy để khắc phục một số hạn chế còn tồn tại trong vi nhân giống thường quy, các hạt nano cũng đã bắt đầu được đầu tư nghiên cứu và cho thấy tiềm năng ứng dụng cao trong việc kháng khuẩn và cải thiện chất lượng cây giống (khả năng hấp thu ánh sáng, tăng cường quang hợp, điều khiển sinh trưởng, phát triển thực vật) [155]. Chính vì vậy, để hiểu rõ vai trò và tiềm năng của nano trong việc khử trùng, bổ sung như một chất điều hoà sinh trưởng và thay thế dinh dưỡng khoáng nhằm cải thiện các nhược điểm trong hệ thống vi nhân giống, nâng cao chất lượng cây giống nuôi cấy mô, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác động của nano bạc và nano sắt lên chất lượng cây giống in vitro ở một số cây trồng có giá trị kinh tế”. Trong nghiên cứu này, các cây trồng được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu là salem (Limonium sinuatum) - một loài hoa cắt cành phổ biến, dâu tây (Fragaria × ananassa) - cây ăn trái có giá trị kinh tế gắn liền với du lịch của thành phố Đà Lạt và sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) - loài cây dược liệu đặc hữu của Việt Nam. Mục tiêu đề tài Mục tiêu tổng quát Đề tài được thực hiện nhằm đánh giá tác động của các hạt nano bạc (AgNPs) - được sử dụng khử trùng bề mặt mẫu lá và bổ sung vào môi trường nuôi cấy, các hạt nano sắt (FeNPs) - được sử dụng thay thế sắt-Ethylenediamine Tetra Acetate (Fe- EDTA) trong quá trình vi nhân giống lên chất lượng cây giống trên một số loại cây trồng có giá trị kinh tế (salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh). 2
Mục tiêu cụ thể Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs lên hiệu quả khử trùng bề mặt mẫu lá cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh và so sánh với các chất khử trùng truyền thống [calcium hypochlorite [Ca(ClO)2], chlorua thủy ngân (HgCl2)]. Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs lên sự phát sinh hình thái (phát sinh phôi, tái sinh chồi, gia tăng số lượng tế bào) cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên quá trình hình thành cây hoàn chỉnh cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Đánh giá ảnh hưởng của AgNPs được hấp thu đến sự biến động khí ethylene tích luỹ trong quá trình hình thành rễ cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Đánh giá khả năng thích nghi và sinh trưởng cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh ở giai đoạn ex vitro có nguồn gốc từ nghiệm thức tốt nhất của AgNPs và FeNPs trong nuôi cấy in vitro. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu AgNPs (sử dụng làm chất khử trùng và bổ sung vào môi trường nuôi cấy), FeNPs (thay thế Fe-EDTA trong môi trường nuôi cấy) với các nồng độ khác nhau được sử dụng để nghiên cứu khả năng khử trùng, sự sinh trưởng, phát triển và nâng cao chất lượng cây giống cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs lên các giai đoạn khử trùng bề mặt, phát sinh hình thái trong vi nhân giống cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNPs và FeNPs lên giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh trên ba đối tượng cây trồng (salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh) nuôi cấy in vitro. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu Ý nghĩa khoa học của đề tài Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới có giá trị về vai trò của nano kim loại đến quá trình khử trùng bề mặt, sinh trưởng, phát triển, sự biến động khí ethylene và nâng cao chất lượng cây giống trong vi nhân giống cây hoa cảnh, cây ăn trái và cây dược liệu. 3
Luận án là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị cho nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực vi nhân giống thực vật. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả nghiên cứu của luận án có nhiều tiềm năng ứng dụng trong sản xuất cây giống thương mại. Những đóng góp mới của luận án Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu ứng dụng nano kim loại (AgNPs, FeNPs) trong vi nhân giống cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh. Đề tài đã đánh giá được vai trò của AgNPs trong ức chế khí ethylene nhằm nâng cao chất lượng cây giống cây salem, dâu tây, sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro. Bổ sung nano kim loại vào môi trường nuôi cấy trong giai đoạn vi nhân giống đã giúp gia tăng khả năng thích nghi cũng như tỷ lệ sống của cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh ở giai đoạn vườn ươm. Xây dựng được quy trình nhân giống của ba loại cây trồng có giá trị kinh tế cao là cây salem, dâu tây và sâm Ngọc Linh dưới ảnh hưởng của nano kim loại. 4