Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu, thu nhận protein từ sinh khối rong nước lợ (Chaetomorpha sp.) để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:185

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu quá trình thu nhận protein concentrate từ sinh khối rong Chaetomorpha sp. Khảo sát các tính chất sinh học, tính chất chức năng và giá trị dinh dưỡng của protein concentrate từ rong để có thể ứng dụng vào thực phẩm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu, thu nhận protein từ sinh khối rong nước lợ (Chaetomorpha sp.) để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- BẠCH NGỌC MINH NGHIÊN CỨU, THU NHẬN PROTEIN TỪ SINH KHỐI RONG NƯỚC LỢ (Chaetomorpha sp.) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh - 2020
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Bạch Ngọc Minh NGHIÊN CỨU, THU NHẬN PROTEIN TỪ SINH KHỐI RONG NƯỚC LỢ (Chaetomorpha sp.) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã sỗ: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS Hoàng Kim Anh 2. PGS.TSKH Ngô Kế Sương Tp. Hồ Chí Minh - 2020
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Hoàng Kim Anh và PGS.TSKH Ngô Kế Sương. Các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu trong luận án do tôi tự bố trí thí nghiệm, phân tích số liệu một cách trung thực, khách quan. Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác. Nghiên cứu sinh Bạch Ngọc Minh
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận án tiến sĩ này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hoàng Kim Anh và PGS.TSKH Ngô Kế Sương đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu thực nghiệm và quá trình chỉnh sửa nội dung của luận án. Tôi chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và các đồng nghiệp tại Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi để giúp tôi hoàn thành luận án này. Tôi đặc biệt cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo và các bạn trong Phòng Quản lý Tổng hợp đã hỗ trợ tôi trong các thủ tục hành chính dể hoàn thành quá trinhg học tập và thực hiện luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Học viện Khoa học và Công nghệ đã hỗ trợ tôi về mặt hành chính và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án tại Học viện. Tôi cũng xin cảm ơn các đồng nghiệp trong Phòng Công nghệ Biến đổi Sinh học, nơi tôi công tác, đã hộ trợ tôi hết mình trong công việc và tạo nhiều điều kiện thuận lợi để tôi có thời gian học tập và thực hiện luận án. Tôi chân thành gửi lời cảm ơn đến các đơn vị hợp tác: Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.Hồ Chí Minh, Bệnh viện 115, Trung tâm phân tích Kỹ thuật cao Sài Gòn, Viện Công nghệ Nano, Trung tâm Sâm và Dược liệu đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, đã luôn bên cạnh và là nguồn động viên to lớn cho tôi để hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu. Trân trọng Bạch Ngọc Minh
iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... ii MỤC LỤC ...................................................................................................................iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ...................................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ....................................................................... x MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3 1.1. Tổng quan về rong ........................................................................................................... 3 1.1.1. Tổng quan về rong biển ..................................................................................................... 3 1.1.2. Rong lục .............................................................................................................................. 5 1.1.3. Rong Chaetomorpha ........................................................................................................... 7 1.2. Protein thu nhận từ rong .................................................................................................. 8 1.2.1. Đặc điểm protein thu nhận từ rong .................................................................................... 8 1.2.2. Thành phần acid amin trong rong .................................................................................... 10 1.2.3. Protein có hoạt tính sinh học ........................................................................................... 11 1.2.4. Khả năng tiêu hoá của protein ......................................................................................... 12 1.3. Kỹ thuật thu nhận protein .............................................................................................. 13 1.3.1. Kỹ thuật trích ly protein ................................................................................................... 13 1.3.2. Kỹ thuật tinh sạch protein ................................................................................................ 15 1.3.2.1. Phương pháp kết tủa ...................................................................................... 15 1.3.2.2. Phương pháp thẩm tích .................................................................................. 17 1.3.2.3. Phương pháp sắc kí ........................................................................................ 18 1.3.2.4. Phương pháp lọc membrane .......................................................................... 18 1.4. Phân tích tính chất của chế phẩm protein concentrate ................................................. 19 1.4.1. Tính chất sinh học của chế phẩm protein concentrate ................................................... 19 1.4.2. Tính chất chức năng của chế phẩm protein concentrate ................................................ 20 1.4.2.1. Khả năng hòa tan của protein ........................................................................ 21
iv 1.4.2.2. Khả năng hấp thu nước của protein ............................................................... 21 1.4.2.3. Khả năng tạo gel ............................................................................................ 21 1.4.2.4. Khả năng tạo bọt ............................................................................................ 22 1.4.2.5. Khả năng tạo và làm bền nhũ tương .............................................................. 22 1.4.3. Giá trị dinh dưỡng của chế phẩm protein concentrate ................................................... 23 1.4.3.1. Tiêu hóa protein và hấp thu protein ............................................................... 23 1.4.3.2. Đánh giá giá trị dinh dưỡng của protein trong điều kiện in vitro .................. 24 1.4.2.3. Đánh giá giá trị dinh dưỡng của protein trong điều kiện in vivo .................. 24 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................ 27 2.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................................ 27 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................................... 27 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị, hoá chất ............................................................................................... 27 2.2. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................................... 28 2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm ...................................................................................... 30 2.3.1. Xác định các nhóm protein trong rong ............................................................................ 30 2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly protein .... 31 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly protein tan trong nước có sự hỗ trợ của enzyme cellulase ....................................................................................................... 31 2.3.4. Tối ưu hóa quá trình trích ly protein tan trong kiềm có sự hỗ trợ của enzyme ............ 33 2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH ................................................................................................................. 34 2.3.6. Tối ưu hóa quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH ...... 34 2.3.7. Nghiên cứu quá trình tinh sạch protein ........................................................................... 35 2.3.7.1. Khảo sát quá trình kết tủa đẳng điện ............................................................. 35 2.3.7.2. Khảo sát quá trình kết tủa protein bằng ethanol ............................................ 35 2.3.7.3. Khảo sát quá trình kết tủa protein bằng muối (NH4)2SO4 ............................. 36 2.3.7.4. Nâng cao hàm lượng protein bằng phương pháp thẩm tích .......................... 36 2.3.8. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và cấu trúc của chế phẩm protein từ rong ............ 36 2.3.9. Xác định tính chất sinh học của các chế phẩm protein concentrate .............................. 37 2.3.9.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn ............................................................... 37 2.3.9.2. Thử nghiệm khả năng kháng oxy hoá ........................................................... 37
v 2.3.10. Xác định tính chất chức năng của protein ..................................................................... 38 2.3.11. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vitro .................................................... 38 2.3.11.1. Khả năng tiêu hóa – in vitro protein digestibility (IVPD) ........................... 38 2.3.11.2. Chỉ số AAS – Amino acid score .................................................................. 39 2.3.11.3. Chỉ số PDCAAS (Protein Digestibility Corrected Amino Acid Scoring) ... 39 2.3.12. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vivo .................................................... 39 2.4. Phương pháp phân tích .................................................................................................. 40 2.5. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................................. 41 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 42 3.1. Thành phần protein trong rong ...................................................................................... 42 3.1.1. Xác định thành phần sinh hóa của rong .......................................................................... 42 3.1.2. Xác định các nhóm protein trong rong ............................................................................ 44 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly protein .........46 3.3. Quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước với sự hỗ trợ của cellulase................ 47 3.3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly protein với sự hỗ trợ của cellulase ..... 47 3.3.2. Tối ưu hóa quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước ........................................... 52 3.4. Khảo sát quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH ........ 55 3.4.1. Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến quá trình trích ly protein bằng NaOH ........ 55 3.4.2. Tối ưu hoá quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm............................................ 58 3.5. Đánh giá hiệu quả trích ly protein bằng các phương pháp ........................................... 61 3.6. Nghiên cứu quá trình tinh sạch protein ......................................................................... 64 3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình kết tủa đẳng điện............................. 64 3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình kết tủa protein bằng ethanol ........... 66 3.6.3. Khảo sát quá trình kết tủa protein bằng (NH4)2SO4 ....................................................... 67 3.6.4. So sánh hiệu quả của các phương pháp kết tủa protein.................................................. 70 3.7. Xác định tính chất của chế phẩm protein concentrate .................................................. 72 3.7.1. Thành phần protein của chế phẩm protein concentrate .................................................. 72 3.7.2. Thành phần acid amin trong các chế phẩm protein ........................................................ 72 3.7.3. Hình thái và cấu trúc của chế phẩm protein concentrate .............................................. 74 3.8. Xác định tính chất sinh học của chế phẩm protein concentrate ................................... 81 3.8.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn ................................................................................. 81
vi 3.8.2. Thử nghiệm khả năng kháng oxy hóa của chế phẩm protein từ rong ........................... 83 3.8.2.1. Khả năng bắt gốc tự do DPPH ....................................................................................... 83 3.8.2.2. Khả năng trung hoà gốc tự do ABTS•+ ......................................................................... 85 3.8.2.3. Đánh giá khả năng kết hợp với ion Fe2+ ...................................................................... 86 3.8.2.4. Đánh giá hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào (thử nghiệm MDA) .................... 87 3.9. Xác định tính chất chức năng của protein ..................................................................... 89 3.9.1. Khả năng hòa tan .............................................................................................................. 89 3.9.2. Khả năng hấp thu nước .................................................................................................... 90 3.9.3. Khả năng tạo bọt và ổn định hệ bọt thực phẩm .............................................................. 92 3.9.4. Khả năng tạo gel ............................................................................................................... 93 3.9.5. Khả năng tạo nhũ .............................................................................................................. 94 3.10. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vitro .................................................. 96 3.10.1. Khả năng tiêu hóa – in vitro protein digestibility (IVPD) ........................................... 96 3.10.2. Chỉ số AAS và PDCAAS............................................................................................... 97 3.11. Đánh giá giá trị dinh dưỡng của chế phẩm APC-K trong điều kiện in vivo ............. 99 3.11.1. Nhóm sử dụng thức ăn không chứa protein ................................................................ 100 3.11.2. Nhóm sử dụng thức ăn chứa protein ........................................................................... 100 3.11.3. Hệ số tăng trọng (PER) và tỷ lệ hấp thu protein tịnh (NPR) ..................................... 102 3.11.4. Giá trị sinh học (Biological value – BV) .................................................................... 103 3.11.5. Các chỉ số máu chuột thí nghiệm ................................................................................ 105 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 106 Kết luận ............................................................................................................................... 106 Đề nghị ................................................................................................................................ 107 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ........................................................ 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 109 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 123
vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT APC algae protein concentrate protein cô đặc từ rong PC protein concentrate protein cô đặc PI protein isolate protein cô lập SFE supercritical fluid extraction trích ly bằng CO2 siêu tới hạn PLE pressurized liquid extraction trích ly bằng dung môi lỏng SEM scanning electron microscope kính hiển vi điện tử quét MF micro filtration vi lọc NF nano filtration lọc nano UF ultra filtration siêu lọc RO reverse osmosis thẩm thấu ngược BV biological value giá trị sinh học PER protein efficiency ratio hệ số tăng trọng lượng NPR Net Protein Ratio tỉ lệ hấp thu protein tịnh AAS amino acid score điểm acid amin PDCAAS Protein Digestibility Corrected Amino Acid Scoring chỉ số tiêu hoá protein dựa theo acid amin ATCC American Type Culture Collection Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Mỹ
viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm cho quá trình tiền xử lý nguyên liệu .............................. 31 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát quá trình trích ly protein có sự hỗ trợ của enzyme .................................................................................................................................... 32 Bảng 2.3. Mô hình tối ưu hóa 3 yếu tố với 3 thí nghiệm tại tâm................................ 33 Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình trích ly protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH .......................................................................................................... 34 Bảng 2.5. Mô hình tối ưu hóa 2 yếu tố với 3 thí nghiệm tại tâm................................ 35 Bảng 2.6. Thành phần thức ăn được thiết kế theo AIN 93 dành cho chuột trưởng thành [101]. ........................................................................................................................... 40 Bảng 3.1. Kết quả phân tích thành phần sinh hóa của rong ....................................... 43 Bảng 3.2. Kết quả phân tích các nhóm protein rong Chaetomorpha sp. .................... 45 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng Phycocyanin và protein tan trong nước .................................................................................................................................... 48 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và nồng độ enzyme đến hàm lượng Phycocyanin và protein tan trong nước ...................................................................... 49 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Phycocyanin và protein tan trong nước ............................................................................................................................ 50 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng Phycocyanin và protein tan trong nước .................................................................................................................................... 51 Bảng 3.7. Mô hình quy hoạch thực nghiệm và kết quả của quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước dưới sự hỗ trợ enzyme ........................................................... 53 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hiệu suất trích ly protein ................. 54 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ và tỷ lệ dung môi đến hiệu suất trích ly nhóm protein tan trong kiềm ............................................................................................................. 56 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất trích ly nhóm protein tan trong kiềm .................................................................................................................................... 57 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất trích ly nhóm protein tan trong kiềm .................................................................................................................................... 58
ix Bảng 3.12. Mô hình quy hoạch thực nghiệm và kết quả của quá trình trích ly khi thay đổi 2 yếu tố nồng độ NaOH và thời gian trích ly ....................................................... 59 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của các biến độc lập (nồng độ NaOH và thời gian trích ly) đến hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích ................................................. 59 Bảng 3.14. Độ tinh sạch của protein trước và sau thẩm tích ...................................... 69 Bảng 3.15. Hiệu quả tủa protein bằng pH đẳng điện, ethanol, (NH4)2SO4 ................ 70 Bảng 3.16. Hàm lượng protein trong các chế phẩm protein concentrate ................... 72 Bảng 3.17. Thành phần acid amin trong chế phẩm protein ........................................ 73 Bảng 3.18. Giá trị IC50 của chế phẩm protein và đối chứng vitamin C ...................... 84 Bảng 3.19. Độ hòa tan (%) của các loại protein ......................................................... 90 Bảng 3.20. Khả năng hấp thu nước (%) của các loại protein ..................................... 90 Bảng 3.21. Công suất tạo bọt (FC) của các protein và độ bền bọt (FS) của hệ. ......... 92 Bảng 3.22. Khảo sát khả năng tạo gel của protein ..................................................... 93 Bảng 3.23. Chỉ số EAI (m2/g) và chỉ số ESI (phút) của các chế phẩm protein. ......... 95 Bảng 3.24. Khả năng tiêu hóa in vitro của chế phẩm protein thu được từ rong Chaetomorpha sp. ....................................................................................................... 96 Bảng 3.25. Chỉ tiêu AAS và PDCAAS của protein rong dựa theo nhu cầu của người trưởng thành (*): WHO (2007) ................................................................................... 98 Bảng 3.26. Chỉ tiêu AAS và PDCAAS của protein rong dựa theo nhu cầu của trẻ em (*): WHO (2007) ........................................................................................................ 99 Bảng 3.27. Trọng lượng chuột sau 10 ngày sử dụng thức ăn không chứa protein ... 100 Bảng 3.28. Thành phần sinh hóa của các chế phẩm protein APC.K và protein concentrate từ đậu nành ............................................................................................ 101 Bảng 3.29. Thành phần dinh dưỡng của thức ăn do viện Pasteur cung cấp ............. 101 Bảng 3.30. Trọng lượng chuột sau 4 tuần nuôi với thức ăn chứa protein ................ 101 Bảng 3.31. Chỉ số PER và NPR của các nguồn protein khác nhau .......................... 103 Bảng 3.32. Giá trị sinh học của các nguồn protein dùng trong thử nghiệm ............. 104
x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Trang Hình 1.1. Hình thái rong Chaetomorpha aerea và Chaetomorpha linum. .................. 7 Hình 1.2a. Hàm lượng protein trong 18 loại rong thu nhận ......................................... 8 tại bờ biển Okha, Ấn Độ ............................................................................................... 8 Hình 1.2b. Hàm lượng protein trong 15 loại rong thu nhận ......................................... 9 tại bờ biển Sabah, Malaysia .......................................................................................... 9 Hình 1.3. Sự biến đổi hàm lượng protein theo mùa trong rong.................................. 10 Palmaria palmate (Fleurence,1999) ........................................................................... 10 Hình 2.1. (a) Rong Chaetomorpha sp.; ...................................................................... 27 (b) Mẫu đã được sấy khô; (c) Mẫu được nghiền thành bột. ....................................... 27 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình thu nhận chế phẩm Protein concentrate (PC) tan trong nước và tan trong kiềm từ rong Chaetomorpha sp. ............................................................. 29 Hình 2.3. Chuột thí nghiệm trong điều kiện in vivo ................................................... 40 Hình 3.1. Thu hoạch rong mền tại thực địa ............................................................... 43 Hình 3.2. Phơi rong sau thu hoạch.............................................................................. 43 Hình 3.3. Bề mặt đáp ứng biểu thị ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian đến hàm lượng protein thu được........................................................................................ 55 Hình 3.4. Bề mặt đáp ứng biểu thị ảnh hưởng của nồng độ NaOH và thời gian trích ly đến hàm lượng protein thu được. ................................................................................ 60 Hình 3.5. Hiệu quả trích ly 2 nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm bằng các phương pháp khác nhau .............................................................................................. 61 Hình 3.6. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét (độ phóng đại 500x và 1000x, thang đo 50µm) của rong Chaetomorpha sp. ....................................................................... 63 Hình 3.7. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét (độ phóng đại 250x, thang đo 50µm) của bã rong Chaetomorpha sp. sau khi trích ly protein .............................................. 63 Hình 3.8. Chế phẩm protein APC-K........................................................................... 72 Hình 3.9. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét của protein concentrate ở độ phóng đại 500x, thang đo 50µm và ở độ phóng đại 1000x, thang đo 10µm. ........................ 75 Hình 3.10. Sắc ký đồ phân đoạn mẫu protein tan trong nước .................................... 76
xi Hình 3.11. Sắc ký đồ phân đoạn mẫu protein tan trong kiềm .................................... 76 Hình 3.12. Kết quả điện di .......................................................................................... 77 Hình 3.13. Kết quả điện di protein không qua sắc ký. ............................................... 77 Hình 3.14. Sắc ký đồ của chế phẩm protein APC-N khi phân tích LC-MS/MS ........ 79 Hình 3.15. Kết quả phân tích MS mẫu APC-N .......................................................... 80 Hình 3.16. Kết quả phân tích MS mẫu APC-K .......................................................... 80 Hình 3.17. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét của protein concentrate ở độ phóng đại 500x, thang đo 50µm và ở độ phóng đại 1000x, thang đo 10µm. ........................ 81 Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC-N .... 83 Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC-K .... 84 Hình 3.20. Đồ thị biểu diễn hoạt tính ức chế ABTS của chế phẩm APC-N .............. 86 Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn khả năng liên kết với Fe2+ của chế phẩm APC-N .......... 86 Hình 3.22. Khả năng ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào của chế phẩm APC-N ... 87 Hình 3.23. Các chỉ số máu của chuột thí nghiệm ..................................................... 105
1 MỞ ĐẦU Hiện nay một số loài rong (như Chaetomorpha sp.,) đang mọc tự nhiên trong các ao nuôi tôm nước lợ ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Sau khi thu hoạch tôm, một lượng lớn sinh khối rong được nông dân vớt ra khỏi ao và để thành đống thối rữa trên bờ, vừa lãng phí vừa gây ô nhiễm môi trường. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các thành phần trong rong có giá trị cao về mặt dinh dưỡng. Việc nghiên cứu và thu nhận các sản phẩm từ các loài rong trên sẽ tận dụng nguyên liệu sẵn có để tạo ra các sản phẩm có giá trị đồng thời giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường hiện nay tại địa phương. Trong khuôn khổ của Dự án “Nhiên liệu sinh học từ sinh khối thủy sinh Việt Nam” do Viện Sinh học Nhiệt đới chủ trì, thành phần carbohydrate từ rong Chaetomorpha đã được sử dụng để lên men sản xuất nhiên liệu sinh học. Tuy nhiên, protein trong rong có thành phần acid amin cân đối và hàm lượng các acid amin thiết yếu khá cao lại chưa được nghiên cứu sử dụng. Chính vì vậy, mục tiêu của đề tài là thu nhận protein từ sinh khối rong nước lợ (Chaetomorpha sp.), tạo ra nguồn protein concentrate mới từ thực vật để sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Đề tài cũng nghiên cứu các đặc điểm của protein từ rong nước lợ, là nguồn nguyên liệu chưa được khai thác trong nước và trên thế giới. Trong nghiên cứu này, một loại cellulase đặc biệt được sử dụng để thủy phân carbohydrate trong thành tế bào rong Chaetomorpha. Khác với các enzyme cellulase thông thường (có pH tối ưu trong vùng acid), enzyme này có khả năng hoạt động trong vùng pH trung tính hoặc kiềm nhẹ (là điều kiện pH thuận lợi của quá trình trích ly protein) và vì thế sẽ hỗ trợ hiệu quả quá trình trích ly protein từ rong. Ngoài ra, kỹ thuật siêu âm cũng sẽ được sử dụng với mục đích tăng cường khả năng trích ly protein từ sinh khối rong nước lợ Chaetomorpha sp. Chế phẩm protein concentrate tạo ra cũng sẽ được nghiên cứu đánh giá cấu trúc và tính chất chức năng; khả năng kháng khuẩn cũng như khả năng bắt gốc tự do; thử nghiệm lâm sàng để đánh giá về giá trị sinh học cũng như khả năng tiêu hóa của protein từ rong trong điều kiện invitro và invivo.
2 Việc trích ly và thu nhận thành phần protein có giá trị của rong để ứng dụng trong ngành thực phẩm cũng mang tính thực tiễn cao. Ngoài ra, việc nghiên cứu thu nhận các sản phẩm có giá trị từ một nguồn sinh khối hiện dư thừa và gây ô nhiễm môi trường sẽ là cơ sở để tiến hành khai thác tự nhiên hoặc nuôi trồng kết hợp các loại rong nước lợ với các loại thủy hải sản khác để mang lại lợi ích cao hơn.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về rong 1.1.1. Tổng quan về rong biển Giới thiệu chung Rong (rong biển hay rong nước lợ) là loại rong dạng sợi dài kết thành khối lớn trôi nổi trong thủy vực có thể dễ dàng khai thác và sử dụng, các loại rong này còn được gọi là rong lớn (macroalgae) để phân biệt với một số loại rong nhỏ (vi tảo: microalgae). Về mặt phân loại, rong rất khó để phân loại một cách chính xác bởi sự phức tạp trong cấu trúc, đa số loài rong gần với thực vật nhưng một số lại được xem như vi sinh vật (vi khuẩn lam hay tảo lam). Trong số các loại rong trong tự nhiên thì rong biển được sử dụng rộng rãi nhất vì đa dạng về chủng loại và năng suất thu hoạch cao. Rong biển được sử dụng trong các ngành thực phẩm, y học và các hợp chất trích ly từ chúng được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp. Các loại rong nước ngọt được ứng dụng ít hơn rong biển do sự giới hạn diện tích của thủy vực nước ngọt, việc nghiên cứu và ứng dụng rong nước ngọt chỉ phát triển mạnh trong những năm của thế kỷ 20 cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học do đa số trong chúng là các loại vi tảo. Hiện nay, giống Spirulina spp. được sử dụng nhiều nhất bởi chúng hình thành cấu trúc sợi lớn nên dễ khai thác và có nhiều giá trị đặc biệt trong thực phẩm và y học. Gần đây, các nhà khoa học trên thế giới quan tâm đến nhóm rong sống trong vùng nước lợ. Nhóm rong này sống ở vùng thủy vực ở các cửa sông hoặc các vùng nước mặn nhân tạo bên trong vùng châu thổ để nuôi thủy hải sản. Do sự giao thoa giữa hai vùng nước nên rong sống trong khu vực này có những đặc điểm khác biệt với các loại rong sống trong hai vùng nước riêng biệt. Các loại rong nước lợ phần lớn di chuyển từ biển vào và thích nghi dần với độ mặn thấp hơn của vùng nước này. Tuy nhiên việc nghiên cứu và ứng dụng các loại rong này chưa nhiều. Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, thành phần sắc tố, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia thành 9 ngành sau: − Ngành rong Lục (Chlorophyta) − Ngành rong Trần (Englenophyta)
4 − Ngành rong Giáp (Pyrophyta) − Ngành rong Khuê (Bacillareonphyta) − Ngành rong Kim (Chrysophyta) − Ngành rong Vàng (Xantophyta) − Ngành rong Nâu (Phaecophyta) − Ngành rong Đỏ (Rhodophyta) − Ngành rong Lam (Cyanophyta) Trong đó, ba ngành có giá trị kinh tế cao là rong Lục, rong Nâu, rong Đỏ. Ứng dụng của rong biển Từ lâu, rong đã được sử dụng rộng rãi trong khẩu phần ăn của người, đặc biệt là ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc. Những loài rong thường được sử dụng trong thực phẩm như rong mứt (Porphyra sp.), rong dẹt (Laminaria japonica), rong nâu Wakame (Undaria pinnatifida) hoặc Hiziki (Hizika fusiforme), rong nho Caulerpa lentifera… Ngoài ra rong đỏ Palmaria cũng được sử dụng từ lâu đời tại Châu Âu và Bắc Mỹ, hay rong lục Ulva được dùng trong thực phẩm ở đảo Hawai [1, 2]. Ở góc độ dinh dưỡng, rong là loại thực phẩm năng lượng thấp, ít lipid, giàu khoáng chất và protein. Rong là nguồn cung cấp các loại vitamin như A, B C, D, E và các loại khoáng như calcium, phosphorus, sodium, potassium. Rong cũng chứa một lượng lớn polysaccharide, thường là polysaccharide cấu trúc của thành tế bào. Các thành phần polysaccharide của rong như agar, carrageenan, ulvans, fucoidan không được thủy phân bởi amylase trong hệ tiêu hóa của người và động vật, vì thế đây là một nguồn chất xơ và prebiotic có triển vọng để sử dụng trong thực phẩm chức năng. Sự lên men có chọn lọc các chất xơ prebiotic bởi hệ vi khuẩn có ích trong đường ruột sẽ giúp ức chế hoạt động của các vi khuẩn có hại, cải thiện sức khỏe của hệ tiêu hóa và tăng cường khả năng miễn dịch của người sử dụng. Việc sử dụng rong thường xuyên trong khẩu phần ăn đã được chứng minh là mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe của con người. Tại Hàn Quốc, sử dụng khẩu phần ăn hàng ngày chứa Porphyra sp. giúp giảm đáng kể nguy cơ ung thư vú và giảm nguy cơ tiểu đường [3]. Đối với thức ăn chăn nuôi, đặc biệt trong ngành thủy sản rong được sử dụng để thay thế một phần nguồn thức ăn hoặc thay thế hoàn toàn. Kalla và cộng sự nhận thấy
5 việc bổ sung Porphyra spp. vào khẩu phần ăn của cá vền (Seabream) hoặc Valente và cộng sự cũng nhận thấy việc thay thế 5-10% bột cá trong thức ăn của cá vược châu Âu bằng Gracilaria busra-pastonis sẽ làm tăng tốc độ tăng trưởng riêng. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng rong dạng phụ gia bổ sung vào khẩu phần ăn của thủy sản ngoài việc làm gia tăng thể trọng còn góp phần cải thiện các hoạt động sinh lý, đáp ứng stress, sức nhịn đói, kháng bệnh và chất lượng thịt của cá nuôi [4, 5]. Đối với lĩnh vực y học, rong thường được sử dụng như một vị thuốc trong Đông y (Côn bố). Tác động hỗ trợ điều trị bệnh của rong phần lớn do các thành phần dinh dưỡng có giá trị cao như protein, vitamin… như Spirulina. Gần đây nhiều công trình nghiên cứu đã phát hiện thấy một số tác động đặc biệt của một số thành phần hóa học của rong, ví dụ Sheih và cộng sự đã phát hiện thấy một số đoạn peptide từ protein của Chlorella vulgaris có khả năng kháng ung thư cũng như khả năng kháng oxi hóa. Zbakh và cộng sự đã trích ly được một số hợp chất có khả năng kháng vi sinh vật từ một số loại rong ở tầng đáy của Địa Trung Hải hay Lordan và cộng sự đã khảo sát một số loại rong có tiềm năng giảm bớt nguy cơ mắc một số bệnh mãn tính [6-9]. Trong công nghiệp, rong được xem như nguồn thu nhận các hợp chất có giá trị cao như: agar, carageenan, alginate…các hợp chất này được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp và chế biến. Chúng đều có chung đặc tính tạo cấu trúc cho nhiều sản phẩm công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm. 1.1.2. Rong lục Rong lục là các sinh vật nhân thật, có hệ thống quang hợp là các phân tử chlorophyll a và b, bên cạnh đó trong tế bào còn chứa các sắc tố phụ như beta carotene và xanthophylls. Rong có dạng tế bào đơn giản hoặc phức tạp, nhiều tế bào dạng hình phiến hay dạng sợi, chia nhánh hoặc không chia nhánh. Dựa trên dữ liệu phân tử cho thấy tổ tiên chung gần đây nhất của tất cả các loài rong lục có thể đã tồn tại 1100-1200 triệu năm trước [10]. Việc phân loại rong lục rất phức tạp. Trước đây, việc phân loại rong lục dựa vào nhiều tiêu chí khác nhau như hình thái, siêu âm, phân tử. Sự phát triển của kính hiển vi điện tử vào những năm 70 của thế kỷ trước đã tiết lộ nhiều đặc điểm tế bào quan trọng để phân loại rong lục. Mattox và Stewart đã đề xuất một cách phân loại mới, trong đó sự khác biệt trong các tế bào roi (flagellated cells) và cytokinesis trong quá trình nguyên
6 phân là hai đặc tính quan trọng nhất. Trong 20 năm qua, sự ra đời của sinh học phân tử đã tạo ra một cuộc cách mạng để phân loại nhiều loài và rong là một trong những loài bị ảnh hưởng nhiều nhất. Dữ liệu trình tự DNA được sử dụng để phân loại rong đã chỉ ra rằng sự khác biệt về đặc điểm hình thái ở rong lục thường không tương quan với sự phát sinh loài [11-15]. Hiện tại người ta đã xác định rằng rong lục thuộc về một ngành riêng gọi Viridiplantae. Viridiplantae (thực vật xanh) là một nhánh bao gồm tảo lục và thực vật trên cạn. Trong một số hệ thống phân loại nhánh này được coi như là một giới dưới các tên gọi khác nhau, như Viridiplantae, Chlorobionta hay đơn giản chỉ là Plantae. Adl và cộng sự đã đưa ra một phân loại cho toàn bộ thực vật nhân chuẩn vào năm 2005, cũng đã đề xuất tên gọi Chloroplastida cho nhóm này, để chỉ nhóm sinh vật có các lục lạp với diệp lục chủ yếu là màu xanh. Các nhóm đơn ngành Chlorophyta và Streptophyta được phân loại là thuộc về Viridiplantae. Tổng cộng có trên 350.000 loài sinh vật thuộc về Viridiplantae. Có khoảng 8.000 loài rong lục, với nhiều dạng sống khác nhau, từ dạng sống tế bào đơn lẻ, trong khi một số các loài khác hình thành coenobia (khuẩn lạc), các sợi dài hoặc các sợi rong biển lớn gồm rất nhiều tế bào. Rong lục là sinh vật nhân chuẩn sinh sản theo chu kỳ xen kẽ các thế hệ. Sinh sản thay đổi từ sự hợp nhất của các tế bào giống hệt nhau (isogamy) đến sự thụ tinh của một tế bào không di động lớn bằng một tế bào nhỏ hơn (oogamy). Tuy nhiên, cũng có một số biến thể, đáng chú ý nhất là quá trình liên hợp thường xảy ra ở các loài rong lục, tiêu biểu là ở Spirogyra. Các tế bào tảo đơn bội (chỉ chứa một bản sao DNA của chúng) có thể hợp nhất với các tế bào đơn bội khác để tạo thành hợp tử lưỡng bội. Khi các sợi rong làm điều này, chúng tạo thành cầu nối giữa các tế bào, hợp nhất vào một tế bào và để lại các thành tế bào trống phía sau có thể dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi quanh học. Các loài rong Ulva có khả năng sinh sản đẳng giao, giai đoạn sinh dưỡng lưỡng bội là nơi sinh sôi và giải phóng các bào tử đơn bội, nảy mầm và phát triển tạo ra một pha đơn bội xen kẽ với giai đoạn sinh dưỡng. Xét về số lượng các loài rong, thì rong lục (Chlorophyta) trên thế giới chủ yếu phân bố tập trung tại Philippin, tiếp theo là Hàn Quốc, kế tiếp là Indonesia, Nhật Bản và ít hơn là ở Việt Nam. Ngoài ra, rong lục còn phân bố rải rác ở các nước bao gồm: Achentina, Bangladesh, Canada, Chile, Pháp, Hawaii, Israel, Italy, Kenya, Malaysia,
7 Myanmar, Bồ Đào Nha, Thái Lan… Xét về sản lượng thì rong lục chủ yếu là của Nhật Bản khoảng 4.000 tấn rong khô / năm với các chi như Enteromorpha, Monostroma, Ulva, trong đó nuôi trồng khoảng 2.500 tấn, kế tiếp là Hàn Quốc khoảng 1.000 tấn chi Enteromorpha, Philippin khoảng 800 tấn chi Caulerpa, gần như toàn bộ do nuôi trồng. 1.1.3. Rong Chaetomorpha Rong lục thuộc chi Chaetomorpha là các cơ thể đa bào được tạo thành bởi các tế bào hình trụ. Chi này được đặc trưng bởi các sợi không phân nhánh, làm cho nó đặc biệt. Họ hàng gần nhất của nó là các loài phân nhánh của chi Cladophora. Ngành : Chlorophyta Lớp : Ulvophyceae Bộ : Cladophorales Họ : Cladophoraceae Chi : Chaetomorpha Hình 1.1. Hình thái rong Chaetomorpha aerea và Chaetomorpha linum. Có khoảng 50 loài Chaetomorpha hiện được công nhận dựa trên một số đặc điểm hình thái, chẳng hạn như hình thức tăng trưởng, kích thước tế bào và hình dạng của các tế bào đính kèm [16].