Luận án Tiến sĩ Hoá học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Râu mèo Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:277

Thêm vào BST

Báo xấu

18
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kết cấu Luận án gồm có phần mở đầu, nội dung, phần kết luận và danh mục tài liệu tham khảo. Trong phần nội dung co 3 chương: Chương 1 - Tổng quan; Chương 2 - Đối tượng, phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm; Chương 3 - Kết quả và thảo luận. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hoá học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Râu mèo Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI HOÀNG ĐỨC THUẬN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY RÂU MÈO (ORTHOSIPHON STAMINEUS BENTH.) VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 9.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Vũ Quốc Trung 2. TS. Nguyễn Phi Hùng HÀ NỘI – 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình do tôi nghiên cứu, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Vũ Quốc Trung và TS. Nguyễn Phi Hùng. Kết quả nghiên cứu được công bố trong luận án là trung thực. Các tài liệu sử dụng trong luận án có nguồn gốc, xuất xứ rõ ràng. Người cam đoan Hoàng Đức Thuận
LỜI CẢM ƠN Luận án được hoàn thành tại phòng thí nghiệm của phòng Phân tích hóa học, Viện Hóa học Các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS. Vũ Quốc Trung (Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội) và TS. Nguyễn Phi Hùng (Phòng Phân tích hóa học, Viện Hóa học Các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn khoa học, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa học; Phòng Sau Đại học; Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Tôi cũng xin cảm ơn các cán bộ, các nhà khoa học công tác tại phòng Hóa học phân tích, Viện Hóa học Các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Trung tâm nghiên cứu và chế biến cây thuốc Hà Nội – Viện Dược liệu (Ngũ Hiệp, Thanh Trì, Hà Nội)... đã tạo điều kiện, giúp đỡ trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn tới Ban Giám đốc Sở Giáo dục và Đào tạo Hà Nội; Ban Giám hiệu cùng toàn thể các thầy giáo, cô giáo, nhân viên Trường Bồi dưỡng cán bộ giáo dục Hà Nội đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành nhiệm vụ công tác và hoàn thành Luận án. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn khích lệ, động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành Luận án này.
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1 2. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 4 3. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................... 4 4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 4 5. Những đóng góp mới của luận án ................................................................. 5 6. Cấu trúc của luận án ...................................................................................... 6 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 7 1.1. Giới thiệu về Chi Orthosiphon và cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus) ... 7 1.1.1. Sơ lược về chi Orthosiphon.......................................................................................... 7 1.1.2. Sơ lược về cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) ...................................... 8 1.2. Tình hình nghiên cứu về cây Râu mèo ...........................................................10 1.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước.............................................................................. 10 1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước về cây Râu mèo ................................................. 26 Tiểu kết chƣơng I .......................................................................................... 28 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ........................................................................................... 30 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.........................................................................................30 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................30 2.2.1. Điều tra, nghiên cứu sự phân bố, thu thập mẫu thực vật và bảo quản...... 30 2.2.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu ............................................................................... 30 2.2.3. Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất...................................................... 31
2.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất ..................................... 32 2.2.5. Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học............................................................. 32 2.3. Hóa chất và thiết bị.............................................................................................34 2.3.1. Hoá chất......................................................................................................................... 34 2.3.2. Thiết bị........................................................................................................................... 34 2.4. Phân tích thống kê kết quả ...............................................................................36 2.5. Phân lập và tinh chế các hợp chất từ cây Râu mèo .....................................37 2.5.1. Phân lập và tinh chế các hợp chất từ phân đoạn BuOH ......................................... 39 2.5.2. Phân lập và tinh chế các hợp chất từ phân đoạn EtOAc......................................... 42 2.5.3. Phân lập và tinh chế các hợp chất từ phân đoạn CHCl3 ......................................... 45 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 47 3.1. Kết quả thu thập và xác định tên khoa học mẫu thực vật..........................47 3.2. Kết quả phân lập và tinh chế các hợp chất....................................................49 3.3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ phân đoạn BuOH............................................................................................................................51 3.3.1. Hợp chất B1 (OSB-7.4.2): Lithospermic acid ......................................................... 51 3.3.2. Hợp chất B2 (OSB-7.4.4): Hợp chất mới................................................................. 54 3.3.3. Hợp chất B3 (OSB-7.5.4): 9-Methyl lithospermate.............................................. 58 3.3.4. Hợp chất B4 (OSB-3.3.1): (S)-()-rosmarinic acid ................................................. 61 3.3.5. Hợp chất B5 (OSB-3.3.2): (R)-()-rosmarinic acid ................................................ 62 3.3.6. Hợp chất B6 (OSB-3.3.3): methyl rosmarinate ....................................................... 63 3.3.7. Hợp chất B7 (OSB-7.1.2): Clinopodic acid A ......................................................... 64 3.3.8. Hợp chất B8 (OSB-7.4.2.1): Clinopodic acid B ...................................................... 65 3.3.9. Hợp chất B9 (OSB-7.1.1): Astragalin....................................................................... 67 3.3.10. Hợp chất B10 (OSB-1.1.1): 3-(3,4-dihydroxyphenyl)lactic acid........................ 69 3.3.11. Hợp chất B11 (OSB-1.2.0): Protocatechuic acid .................................................. 70 3.3.12. Hợp chất B12 (OSB-1.2.1): Dihydrocaffeic acid.................................................. 70
3.3.13. Hợp chất B13 (OSB-1.2.2): p-hydroxybenzoic acid ............................................ 71 3.3.14. Hợp chất B14 (OSB-2.1.1): Oresbiusin A ............................................................. 72 3.3.15. Hợp chất B15 (OSB-2.1.2): Caffeic acid................................................................ 73 3.3.16. Hợp chất B16 (OSB-2.3.1): Methyl 3,4-dihydroxycinnamate............................ 74 3.3.17. Hợp chất B17 (OSB-2.3.2): Vanillic acid .............................................................. 76 3.4. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ phân đoạn EtOAc ...........................................................................................................................78 3.4.1. Hợp chất E18 (OSEA-12.1.1): 3,7,3′,4'-tetramethylquercetin ...................... 78 3.4.2. Hợp chất E19 (OSEA-11.9): 3,5-dihydroxy-7,4'-dimethoxyflavone .......... 80 3.4.3. Hợp chất E20 (OSEA-11.6.3): 5,7,4'-trimethoxyflavone hay 5,7,4'- trimethylapigenin .................................................................................................................... 81 3.4.4. Hợp chất E21 (OSEA-11.1.5.1): pentamethylquercetin.................................... 82 3.4.5. Hợp chất E22 (OSEA-11.1.4.0): 5-hydroxy-3,7,4′-trimethoxyflavone ... 83 3.4.6. Hợp chất E23 (OSEA-11.1.4.1): 3,5,7,4'-tetramethoxyflavone ..................... 84 3.4.7. Hợp chất E24 (OSEA-10.6.1): 5,7,2′,5′-tetramethoxyflavone ....................... 86 3.4.8. Hợp chất E25 (OSEA-10.5.1): 3-hydroxy-5,7,4′-trimethoxyflavone .......... 87 3.4.9. Hợp chất E26 (OSEA-10.5.2): 5,7,3′,4′-tetramethoxyflavone ....................... 88 3.4.10. Hợp chất E27 (OSEA-10.2.1): 7-hydroxy-3,5,3′,4′-tetramethoxyflavone ... 90 3.4.11. Hợp chất E28 (OSEA-10.2.2): 7,3′,4′-trimethylquercetin ............................. 91 3.4.12. Hợp chất E29 (OSEA-9.6.1): 3,5,3′-trihydroxy-7,4′-dimethoxyflavone ........ 93 3.4.13. Hợp chất E30 (OSEA-9.6.2): 5,7,3′,4′-tetramethylquercetin ............................. 94 3.4.14. Hợp chất E31 (OSEA-9.6.3): 5,7,4′-trimethylquercetin ................................ 95 3.4.15. Hợp chất E32 (OSEA-9.6.11): 5,6,7,3',4'-pentamethoxyflavanone ........... 96 3.4.16. Hợp chất E33 (OSEA-9.6.12): 5′-hydroxy-5,7,3′,4′-tetramethoxyflavanone ... 98 3.5. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc từ phân đoạn CHCl3......................................................................................................................... 100 3.5.1. Hợp chất C34 (OSC-1.5): orthosiphol F ................................................................ 100
3.5.2. Hợp chất C35 (OSC-1.4.4): siphonol D ................................................................. 102 3.5.3. Hợp chất C36 (OSC-1.4.3): siphonol B ................................................................. 105 3.5.4. Hợp chất C37 (OSC-1.5.3): orthosiphol I .............................................................. 107 3.5.5. Hợp chất C38 (OSC-1.5.2): orthosiphol G ............................................................ 108 3.5.6. Hợp chất C39 (OSC-1.3.2): orthosiphol B............................................................. 110 3.5.7. Hợp chất C40 (OSC-1.3.1): orthosiphol N ............................................................ 112 3.6. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất ............................. 114 3.6.1. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phenylpropanoids (B1B17) phân lập được từ phân đoạn BuOH.................................................................................................... 114 3.6.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất flavonoids (E18E33) phân lập được từ phân đoạn EtOAc........................................................................................................ 119 3.6.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất pimarane-diterpenes (C34C40) phân lập được từ phân đoạn CHCl3.......................................................................................... 122 KẾT LUẬN .................................................................................................. 127 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .. 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 132
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 13 C-NMR Carbon-13 Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon- Spectroscopy 13 1 H-NMR Proton Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Spectroscopy ACN Acetonitrile Acetonitrile CC Column Chromatography Sắc kí cột FC Flash Chromatography Sắc ký cột nhanh HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography CTPT Molecular formula Công thức phân tử Đ.n.c. Melting point Điểm nóng chảy DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxide EI-MS Electron Impact-Mass Phổ khối va chạm electron Spectroscopy ESI-MS Electron Spray Ionzation-Mass Phổ khối lượng phun mù electron Spectroscopy HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều Correlation liên kết H→C HR-ESI- High Relution-Electron Spray Phổ khối lượng phân giải cao phun MS Impact Mass Spectroscopy mù electron HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân trực tiếp Correlation H→C IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại
J (Hz) Hằng số tương tác tính bằng Hz KLPT Molecular weight Khối lượng phân tử MDA468 Human breast cancer cell line Tế bào ung thư vú di căn ác tính MeOH Methanol Methanol MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng ppm parts per million Phần triệu RT retention time Thời gian lưu TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng TLTK Reference Tài liệu tham khảo TMS Tetramethylsilan Tetramethylsilan TT Số thứ tự δC Carbon chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của carbon δH Proton chemical shift Độ chuyển dịch hóa học của proton br s Broad singlet singlet tù d Doublet doublet dd Doublet of doublet doublet của doublet dt Doublet of triplet doublet của triplet m Multiplet multiplet s Singlet singlet t Triplet Triplet PTP1B Protein Tyrosine Phosphatase 1B Enzyme protein tyrosine phosphatase 1B 2-NBDG 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3- benzoxadiazol-4-yl)amino]-D- glucose
DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Danh sách các hợp chất phân lập được từ cây Râu mèo ................ 49 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) và 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) của hợp chất B1.............................................. 53 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) và 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) của hợp chất B2 .............................................. 57 Bảng 3.4. Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, methanol-d4) và 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) của hợp chất B3 và hợp chất B1: .................... 60 Bảng 3.5. Số liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) và 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) của hợp chất B4 và hợp chất tham khảo rosmarinic acid ................................................................................ 62 Bảng 3.6. Số liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) và 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) của hợp chất B5 và hợp chất tham khảo rosmarinic acid ................................................................................ 62 Bảng 3.7. Số liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) và 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) của hợp chất B6 và hợp chất methyl rosmarinate .......... 64 Bảng 3.8. Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, methanol-d4) và 13C-NMR (125 MHz, methanol-d4) của hợp chất B7 và hợp chất clinopodic acid A: . 65 Bảng 3. 9. Dữ liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) và 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) của hợp chất B8 và hợp chất tham khảo clinopodic acid B: ........................................................................... 66 Bảng 3.10. Dữ liệu phổ 1H-NMR (400 MHz, methanol-d4) và 13C-NMR (100 MHz, methanol-d4) của hợp chất B9 và hợp chất astragalin: ......... 68 Bảng 3.11. Tác dụng ức chế enzyme PTP1B của cao tổng và các hợp chất phenylpropanoids (B1B17) phân lập được từ phân đoạn BuOH của cây Râu mèo................................................................................... 116
Bảng 3.12. Tác dụng ức chế enzyme PTP1B của các hợp chất flavonoids (E18E33) phân lập được từ phân đoạn EtOAc của cây Râu mèo ... 119 Bảng 3.13. Tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất (E18E33) phân lập được từ phân đoạn EtOAc của cây Râu mèo ................................ 121 Bảng 3.14. Tác dụng ức chế enzyme PTP1B của các hợp chất pimarane- diterpenes (C34C40) phân lập được từ phân đoạn CHCl3 của cây Râu mèo ........................................................................................ 122
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh phần trên mặt đất cây Râu mèo ........................................ 7 Hình 1.2. Hình ảnh cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) tại Ngọc Hồi, huyện Thanh Trì, thành phố Hà Nội. .................................................... 8 Hình 1.3. Các hợp chất flavonoids phân lập từ cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.)............................................................................ 12 Hình 1.4. Các hợp chất diterpenes khung pimarane phân lập từ cây Râu mèo . 15 Hình 1.5. Các hợp chất diterpenes khung pimarane phân lập từ Râu mèo (tiếp) . 16 Hình 1.6. Các hợp chất diterpenes mới phân lập được từ loài Râu mèo (Orthosiphon aristatus var. aristatus) ............................................ 16 Hình 1.7. Các hợp chất triterpenoids phân lập được từ cây Râu mèo............ 17 Hình 1.8. Các hợp chất phenylpropanoids phân lập từ Râu mèo ................... 18 Hình 1.9. Các hợp chất hóa học khác phân lập và nhận dạng được từ Râu mèo .. 19 Hình 1.10. Các hợp chất monoterpenes và sesquiterpenes trong thành phần tinh dầu của cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus) ........................ 20 Hình 1.11. Các hợp chất monoterpenes và sesquiterpenes trong thành phần tinh dầu của cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus) (tiếp). ............. 21 Hình1.12.Các hoạt chất phân lập được từ cây Râu mèo (Orthosiphon staminues Benth.) ở Việt Nam. ....................................................... 28 Hình 2.1.Quá trình ngâm chiết mẫu dược liệu Râu mèo sử dụng máy siêu âm .. 37 Hình 2.2. Quá trình lọc mẫu, cô quay đuổi dung môi thu hồi cao chiết ........ 38 Hình 3.1. Hình ảnh cây Râu mèo tươi thu hái tại Hà Nội và Thái Nguyên ... 47 Hình 3.2. Hình ảnh tiêu bản mẫu dược liệu Râu mèo (OS201701.HN) ........ 48 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học và các tín hiệu tương tác HMBC chính của hợp chất B1 ............................................................................................ 52 Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất B2 .................................................. 54
Hình 3.5. Các tín hiệu HMBC, COSY and NOESY của hợp chất B2 ........... 56 Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của hợp chất B3 .................................................. 58 Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất B4. ................................................. 61 Hình 3.9.Cấu trúc hóa học của hợp chất B5. .................................................. 63 Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của hợp chất B6. ............................................... 64 Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất B7 ................................................ 65 Hình 3.12. Cấu trúc hóa học của hợp chất B8 ................................................ 66 Hình 3.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất B9 ................................................ 67 Hình 3.14. Cấu trúc hóa học và các dữ kiện ghép phổ của hợp chất B10...... 69 Hình 3.15. Cấu trúc hóa học của hợp chất B11 .............................................. 70 Hình 3.16. Cấu trúc hóa học và các dữ kiện ghép phổ của hợp chất B12...... 71 Hình 3.17. Cấu trúc hóa học của hợp chất B13 .............................................. 72 Hình 3.18. Cấu trúc hóa học và các dữ kiện ghép phổ của hợp chất B14...... 73 Hình 3.19.Cấu trúc hóa học và các dữ kiện ghép phổ của hợp chất B15....... 74 Hình 3.20. Cấu trúc hóa học và các dữ kiện ghép phổ của hợp chất B16...... 75 Hình 3.21. Cấu trúc hóa học của hợp chất B17 .............................................. 76 Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của các hợp chất (B1-B17) phân lập từ phân đoạn BuOH của cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) .... 78 Hình 3.23. Cấu trúc hóa học của hợp chất E18 .............................................. 79 Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất E19 .............................................. 80 Hình 3.25. Cấu trúc hóa học của hợp chất E20 .............................................. 81 Hình 3.26. Cấu trúc hóa học của hợp chất E21 .............................................. 82 Hình 3.27. Cấu trúc hóa học của hợp chất E22 .............................................. 83 Hình 3.28. Cấu trúc hóa học của hợp chất E23 .............................................. 85 Hình 3.29. Cấu trúc hóa học của hợp chất E24 .............................................. 86 Hình 3.30. Cấu trúc hóa học của hợp chất E25 .............................................. 87 Hình 3.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất E26 .............................................. 89
Hình 3.32. Cấu trúc hóa học của hợp chất E27 .............................................. 90 Hình 3.33. Cấu trúc hóa học của hợp chất E28 .............................................. 92 Hình 3.34. Cấu trúc hóa học của hợp chất E29 .............................................. 93 Hình 3.35. Cấu trúc hóa học của hợp chất E30 .............................................. 94 Hình 3.36. Cấu trúc hóa học của hợp chất E31 .............................................. 96 Hình 3.37. Cấu trúc hóa học của hợp chất E32 .............................................. 97 Hình 3.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất E33 .............................................. 98 Hình 3.39. Cấu trúc hóa học của các hợp chất (E18-E33) phân lập từ phân đoạn EtOAc của cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) . 100 Hình 3.40. Cấu trúc hóa học của hợp chất C34 ........................................... 101 Hình 3.41. Cấu trúc hóa học của hợp chất C35 ........................................... 103 Hình 3.42. Cấu trúc hóa học của hợp chất C36 ........................................... 106 Hình 3.43. Cấu trúc hóa học của hợp chất C37 ........................................... 108 Hình 3.44. Cấu trúc hóa học của hợp chất C38 ........................................... 109 Hình 3.45. Cấu trúc hóa học của hợp chất C39 ........................................... 111 Hình 3.46. Cấu trúc hóa học của hợp chất C40 ........................................... 112 Hình 3.47. Cấu trúc hóa học của các hợp chất (C34-C40) phân lập từ phân đoạn CHCl3 của cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) .. 113 Hình 3.48. Tác dụng thúc đẩy sự hấp thụ đường 2-NBDG trên dòng tế bào mô mỡ 3T3-L1 của các hợp chất pimarane-diterpenes (B1-B17) phân lập từ cây Râu mèo. ........................................................................................ 118 Hình 3.49. Tác dụng thúc đẩy sự hấp thụ đường 2-NBDG trên dòng tế bào mô mỡ 3T3-L1 của các hợp chất pimarane-diterpenes (C34-C40) phân lập từ phân đoạn chloroform của cây Râu mèo. .................. 124 Hình 3.50. Độc tính của các hợp chất pimarane diterpene (C33-C40) đối với dòng tế bào mô mỡ 3T3-L1. ......................................................... 125
DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết cao tổng và cao phân đoạn từ cây Râu mèo ......... 38 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ quy trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn BuOH ......... 41 Sơ đồ 2.3. Sơ đồ quy trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn EtOAc ........ 43 Sơ đồ 2.4. Sơ đồ quy trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn EtOAc-tiếp . 44 Sơ đồ 2.5. Sơ đồ quy trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn CHCl3......... 46
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam là một nước có vị trí địa lý nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, địa hình nhiều đồi núi chia cắt nên điều kiện khí hậu cũng rất đa dạng, có nhiều tiểu vùng khí hậu khá đặc trưng. Những yếu tố trên đã tạo nên những hệ sinh thái, thảm thực vật nhiệt đới phong phú và phát triển với nhiều loài thực vật quý hiếm mà trên thế giới không có [1, 2]. Theo ước tính, nước ta hiện có khoảng 12000 loài thực vật thuộc hơn 2256 chi, 305 họ (chiếm 4% tổng số loài, 15% tổng số chi và 57% tổng số họ thực vật trên thế giới) đã được phát hiện và ghi nhận, những cây thuốc này đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống của người dân Việt Nam, 1/3 trong tổng số các loài thực vật này đã được sử dụng trong y học cổ truyền và các mục đích khác phục vụ cho đời sống con người [3, 4]. Tuy nhiên, trong số đó mới chỉ có khoảng dưới 2% được nghiên cứu hiện đại về mặt hóa học và dược lý học [5]. Ngoài sự phong phú về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn có giá trị to lớn trong việc điều trị các căn bệnh khác nhau trong dân gian. Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức độc vị hay phối hợp với nhau tạo nên các bài thuốc cổ phương, đang tồn tại phát triển đến tận ngày nay. Ngoài ra, hàng trăm cây thuốc đã được khoa học y - dược hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng. Xu hướng đi sâu nghiên cứu các cây thuốc và động vật làm thuốc để tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao nhằm sản xuất các loại thuốc có giá trị cao phục vụ cuộc sống ngày càng được thế giới quan tâm [2]. Việc sử dụng các loại thảo dược theo cổ truyền hay các hợp chất nguồn gốc thiên nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học, sinh học, công nghiệp và nông nghiệp thực phẩm. Chế phẩm thảo dược có thể bao gồm một hay nhiều loại dược liệu nhưng trong đó lại
2 chứa hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau, và trong mọi trường hợp hầu hết đều chưa xác định rõ hoạt chất của từng chất. Trong vài năm trở lại đây, đã xuất hiện một số công trình nghiên cứu về các nhóm cây có ích, trong đó nhóm cây có hoạt tính sinh học ngày càng được quan tâm và nghiên cứu có hệ thống. Có thể nói, nhóm cây có hoạt tính sinh học có nhiều ý nghĩa trong đời sống xã hội của loài người, đặc biệt là giá trị sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Vì vậy, những bài thuốc sử dụng thảo dược là đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên. Từ đó, định hướng cho việc nghiên cứu, chiết xuất để tìm ra các loại hoạt chất mới hay các hợp chất có hoạt tính mạnh trong việc chữa trị nhiều căn bệnh khác nhau.Các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên từ sinh vật nói chung và từ thực vật nói riêng thể hiện hoạt tính sinh học rất phong phú và đặc biệt như: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống ung thư, kháng virus, chống sốt rét, điều hòa miễn dịch… Đây là nguồn nguyên liệu lý tưởng để tạo ra nhiều loại thuốc mới chữa bệnh, đặc biệt là các căn bệnh hiểm nghèo, các sản phẩm thực phẩm chức năng hỗ trợ phòng và điều trị bệnh, các chế phẩm phục vụ nông nghiệp và thủy hải sản (thuốc phòng và chữa bệnh dịch cho động vật, diệt côn trùng, điều hòa sinh trưởng, phát triển…) có hoạt tính cao mà không ảnh hưởng đến môi sinh. Chính vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Các thực vật chi Orthosiphon đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu từ rất sớm do tính đa dạng sinh học trong đó có chứa nhiều lớp chất thiên nhiên có cấu trúc phong phú và có nhiều hoạt tính sinh học rất đáng chú ý, nổi trội nhất là tác dụng chống viêm, hạ đường huyết và chống ung thư. Đặc biệt trong thời gian gần đây, nhiều thử nghiệm về hoạt tính kháng viêm, chống oxi hóa, lợi tiểu, bảo vệ gan, thận… của các loài thực
3 vật này đã được nghiên cứu đánh giá và có nhiều triển vọng ứng dụng trong y dược. Cây Râu mèo (Cat’s whiskers), còn gọi là Râu mèo xoắn, cây Bông bạc, có tên khoa học là Orthosiphon stamineus Benth., thuộc họ Bạc hà (Lamiaceae). Ở Việt Nam, Râu mèo phân bố rải rác ở vùng đồng bằng và miền núi như: Lào Cai (Sa Pa), Cao Bằng, Thanh Hóa (Vĩnh Lộc), Hà Nội (Văn Điển, Ba Vì), Sơn La, Bắc Giang, Lâm Đồng (Đà Lạt), Phú Yên (Tuy Hòa), Ninh Thuận (Phan Rang), Kiên Giang (Phú Quốc)...[3, 4]. Theo Đông y, Râu mèo có vị ngọt nhạt, tính mát, không độc; có tác dụng lợi tiểu, thanh nhiệt, trừ thấp, dùng làm thuốc lợi tiểu mạnh, thông mật, dùng trong bệnh sỏi thận, sỏi túi mật, viêm túi mật, dùng trị viêm thận cấp tính và mạn tính; viêm bàng quang; sỏi tiết niệu [5]. Một số các hợp chất bao gồm các flavonoids và dẫn xuất của caffeic acid, đặc biệt là một số các hợp chất diterpenes [6] đã được tìm thấy là thành phần hóa học chính có mặt trong loài này. Theo Viện Dược liệu, cây Râu mèo ở nước ta được trồng nhiều ở các vùng đồng bằng, bà con thường sử dụng làm nguyên liệu để đun nước uống hàng ngày (như chè nụ vối, hoa hòe, nhân trần…) với lượng tiêu thụ tương đối lớn. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài Orthosiphon, trong đó phải kể đến là các hoạt tính nổi trội như chống oxihóa, kháng viêm, hạ huyết áp, ức chế sự phát triển của khối u, đặc biệt là tác dụng lợi tiểu sử dụng điều trị sỏi thận, sỏi tiết niệu, bàng quang. Tuy nhiên, ở Việt Nam, các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Râu mèo còn rất ít, chưa chuyên sâu, các nghiên cứu về tác dụng sinh học hiện đại của loài Râu mèo ở Việt Nam còn chưa được công bố nhiều [7]. Có thể nói rằng, cho tới nay chưa có công trình nào trong nước đặt vấn đề nghiên cứu một cách hệ thống về thành phần hóa học và tác dụng sinh học cụ thể như chống tiểu đường, béo phì và chống ung thư của loài Râu mèo ở Việt Nam
4 được thực hiện. Do vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth) Việt Nam” để nghiên cứu. 2. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu ở đây chúng tôi chọn là toàn bộ phần trên mặt đất của cây Râu mèo được thu hái tại Trung tâm nghiên cứu và chế biến cây thuốc Hà Nội – Viện Dược liệu (địa chỉ: km-13, Ngũ Hiệp, Thanh Trì, Hà Nội). 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Nghiên cứu thành phần hóa học của phần trên mặt đất cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.). - Nghiên cứu tác dụng sinh học (ức chế enzyme PTP1B và tăng cường hấp thụ đường 2-NBDG trên mô hình tế bào mô mỡ 3T3-L1) của các hợp chất hóa học phân lập được từ cây Râu mèo. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau khi thu thập về được xử lý sơ bộ, làm sạch, loại bỏ tạp. Mẫu sau đó tiến hành thái nhỏ bằng dao thái dược liệu. Mẫu nguyên liệu sau đó được phơi khô trong bóng râm ở nhiệt độ thường, gắn ký hiệu mẫu, sau đó được bảo quản trong túi kín, để trong kho chứa, nơi khô ráo, thoáng khí. Việc xử lý tiếp các mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm. - Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: sử dụng các phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích, sắc ký cột nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau như silica gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích trên các hệ dung môi pha đảo dành cho các cột pha đảo RP-C18. - Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: cấu trúc hoá học của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ tử
5 ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phun mù electron (ESI- MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau như 1 H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY. - Ngoài ra, việc xác định cấu trúc hóa học tương đối và tuyệt đối của các hợp chất được xác định dựa trên việc phân tích các phổ [α]D và CD. - Phương pháp nghiên cứu đánh giá các hoạt tính ức chế enzyme protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B), khả năng tăng cường hấp thụ đường 2-NBDG trên dòng tế bào mô mỡ 3T3-L1 và tác dụng gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư vú được miêu tả ở phần phương pháp và thực nghiệm. 5. Những đóng góp mới của luận án Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu chi tiết về thành phần hóa học của cây Râu mèo (O. stamineus). Từ cao chiết tổng của loài này đã phân lập được 40 hợp chất bao gồm: 08 hợp chất khung phenylpropanoids là các dẫn xuất của lithospermic acid và rosmarinic acid (B1B8), 07 hợp chất là dẫn xuất của benzoic acid (B10B17), 17 hợp chất khung flavonoids (B9, E18E33), và 07 hợp chất diterpen khung pimarine (C34C40). Trong số các hợp chất này phát hiện được 01 hợp chất mới đặt tên là orthospilarate (B2). Tất cả 40 hợp chất phân lập đều được đánh giá tác dụng ức chế enzyme protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B). 17 hợp chất phenylpropanoids (B1B17 ) và 07 hợp chất diterpen (C34C40) được đánh giá tác dụng tăng cường hấp thụ đường 2-NBDG in vitro trên dòng tế bào mô mỡ 3T3-L1. Kết quả hầu hết các hợp chất thể hiện tác dụng và theo hướng phụ thuộc vào nồng độ. 16 hợp chất flavonoid (E18E33) phân lập được từ phân đoạn EtOAc được đánh giá tác dụng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của 03 dòng tế bào ung thư vú người gồm MCF-7, MCF7/TAMR, và MDA-MB-231. Kết quả có 04 hợp chất (E30E33) thể hiện tác dụng mạnh trên cả 03 dòng tế bào ung thu