zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Luận Văn - Báo Cáo

» Khoa học tự nhiên

Luận văn: Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm Trichoderma Reesei

Chia sẻ: QUY (KHANH) | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:66

Báo xấu

252
lượt xem 51
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong công nghiệp sữa: Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn: Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm Trichoderma Reesei

Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Luận văn Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm Trichoderma Reesei 1
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thực phẩm thải ra là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám mì, agar…Các phế thải này có thành phần chính là cellulose. Cellulose có thể bị thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường. Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia qúa trình phân giải này. Vì vậy nếu ta sản xuất được một lượng enzyme cellulase lớn với mức chi phí thấp thì ta có thể tận dụng được nguồn phế thải lớn từ các nhà máy chế biến thực phẩm như: bã mía, trấu, rơm rạ, mạt cưa…góp phần vào bảo vệ môi trường và cung cấp một lượng lớn nguyên liệu cho nghành công nghiệp chế biến thực phẩm. Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Những giống này có thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống. Các nhà khoa học đã thành công trong việc phân lập được chủng nấm Trichoderma Reesei KY-746 để tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả nhất mà giá thành lại rẻ. 2
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Xuất phát từ thực tế này với sự hướng dẫn của kỹ sư Huỳnh Văn Thành tôi đã thực hiện khóa luận này: “Khảo Sát Quy Trình Sản Xuất Enzyme Cellulase Từ Nấm Trichoderma Reesei”. 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu tổng quát  Quy trình sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trihoderma Reesei.  Cố định enzyme cellulase trên Natrialginate. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể  Thu nhận enzyme cellulasse từ nấm Trichoderma Reesei.  Xác định tỷ lệ tủa tối ưu của các tác nhân tủa: Muối ammonium, cồn, aceton.  Xác định nhiệt độ, pH tối ưu cho sự hoạt động của enzyme cellulase.  Cố định enzyme cellulase trên Natrialginate.  Tinh sạch enzyme cellulase. 3
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Sàng lọc các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase ngoại bào Mặc dù có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase, nhưng chỉ có một số ít vi sinh vật là có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase với số lượng lớn. Sau đây là kết quả nguyên cứu các chủng vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase. Bảng 2.1 Sàng lọc các chủng vi sinh vật sinh enzyme cellulase ngoại bào Hoạt tính Thuộc STT Tên chủng Tên phân loại celulase (unit/ml) nhóm 1 B26 Bacillus subtilis 5,20 2 B505 Bacillus subtilis 9,95 3 CFd - 7,71 4 CFh - 1,45 Vi khuẩn 5 MSM 04 - 0,90 6 MSM 11 - 0,92 7 Li Bacillus lichenformis 9,76 8 A-62 Streptomyces sp 0,90 Xạ khuẩn Sarcharomyces 9 Y-519 1,35 fibuligera Sarcharomyces 10 Y-529 2,67 Nấm men fibuligera Sarcharomyces 11 Y-32 1,81 capsularis 12 F273 Aspergillus niger 1,08 Nấm mốc 13 708 Tricoderma konigii 0,89 Nấm sợi 4
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 14 1’ - 1,32 15 V2 - 0,93 - 16 V3 - 1,10 17 V4 - 1,07 (-): chưa phân loại 2.2. Giới thiệu Trichoderma reesei 2.2.1. Lịch sử nghiên cứu về Trichoderma Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó được biết là Trichodermaviride. Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng của vài nhà phân loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa học khác. Tình hình thay đổi trong thế chiến lần thứ II, khi quân đội Mỹ cảnh báo về hiện tượng các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương. Chương trình điều tra của quan đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma"viride" mã số QM 6a là loài nấm phân hủy cellulose ở khu vực này. Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM 6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người đã khám phá ra loài này là Elwyn T.Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natick với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma reesei này và các thể đột biến trên chủng đó. Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu và Châu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của Trichoderma vào cuối thập niên 60. Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma, việc nuôi cấy dể dàng và không tốn kém các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng nghiên cứu cơ bản hơn là nghiên cứu ứng dụng về phân giải cellulose của chúng. Một phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng 5
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp. Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Hình 2.1 Ảnh nhìn qua kính hiển vi về những sợi tơ phát triển của dòng nấm Tricoderma reesei. Trong hình, các protein trong các tế bào nấm được đánh dấu màu đỏ trong khi chất chitin – một thành phần của các thành tế bào – được đáng dấu màu xanh dương. (Ảnh: Mari Valkonen, VTT Finland) 2.2.2. Nuôi cấy Trichoderma reesei trên môi trường bã mía kết hợp cám mì Trichoderma reesei VTT-D-80133 sinh trưởng trên môi trường bán rắn với cơ chất bã mía kết hợp với cám mì. Tỷ lệ BM:CM (7:3), 8 lần nồng độ dinh dưỡng, độ ẩm ban đầu 60%, thời gian nuôi cấy 7 ngày là tối ưu cho Trichoderma. reesei VTT-D- 80133 sinh tổng hợp cellulase trên môi trường lên men bán rắn. 6
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 2.2.3. Hình thái của nấm Trichoderma reesei Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn ty. Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn. Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Hình 2.2 Hình thái Trichoderma Reesei 2.2.4. Đặc điểm Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác, chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng nhất. Nấm Trichoderma hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ, những giống này có thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp. Nấm Trichoderma khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống. Vì vậy, khi được dùng trong xử lý hạt giống, những giống thích hợp nhất sẽ phát triển trên bề mặt rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn 1m phía dưới mặt đất và chúng có thể tồn tại và còn 7
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh hiệu lực cho đến 18 tháng sau khi sử dụng, tuy nhiên không nhiều giống có khả năng này. Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký sinh và lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác. Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất là nơi có nhiều rễ khỏe mạnh, và Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế cho việc tấn công các loài nấm gây bệnh cũng như cơ chế cho việc nâng cao sự sinh trưởng và phát triển của cây. Nhiều phương pháp mới trong kiểm soát sinh học và nâng cao sự sinh trưởng của cây hiện nay đã được chứng minh rõ ràng. Quá trình này được điều khiển bởi nhiều gen và sản phẩm từ gen khác nhau. Sau đây là một số cơ chế chủ yếu: Ký sinh nấm, kháng sinh, cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian, sự chịu đựng các điều kiện bất lợi bằng việc gia tăng sự phát triển của cây và rễ, làm hòa tan và cô lập chất dinh dưỡng vô cơ, cảm ứng sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh. Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là cơ chế sinh sản vô tính. Tuy nhiên, có một số giống sinh sản hữu tính đã được ghi nhận nhưng những giống này không thích hợp để sử dụng trong các phương pháp kiểm soát sinh học. Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên sự khác nhau về hình thái chủ yếu là ở bộ phận hình thành bào tử vô tính, gần đây nhiều phương pháp phân loại dựa trên cấu trúc phân tử đã được sử dụng. Hiện nay nấm Trichoderma có ít nhất là 33 loài. Hình 2.3 Cấu trúc không gian của nấm Trichoderma reesei 8
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 2.2.5. Ứng dụng 2.2.5.1. Lương thực và ngành dệt Trichoderma là những vi sinh vật sản xuất nhiều enzyme ngoại bào có hiệu quả cao. Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất enzyme cellulase và các enzyme khác phân hủy các polysaccharide phức tạp. Nhờ vậy chúng thường được sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và ngành công nghiệp dệt cho các mục đích tương tự. 2.2.5.2. Chất kiểm soát sinh học Hiện nay loài nấm này đã được sử dụng một cách hợp pháp cũng như được đăng ký trong việc kiểm soát bệnh trên thực vật. Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả. Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây. 2.2.5.3. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm qua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường. Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong thời gian gần đây. Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất). Những rễ sâu này giúp các loài cây như: bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán. Một khả năng có lẽ đáng chú ý nhất là những cây bắp có sự hiện diện của nấm Trichoderma dòng T22 ở rễ có nhu cầu về đạm thấp hơn đến 40% so với những cây không có sự hiện diện của loài nấm này ở rễ. 2.2.5.4. Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hoá các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học. Nhiều gen có 9
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh. Chưa có gen nào được thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển. 2.2.5.5. Biện pháp canh tác hữu cơ Hiện nay, việc bón phân hữu cơ cho cây cao su hầu như chưa được bà con nông dân chú trọng dẫn đến mất cân bằng sinh thái môi trường đất. Hệ vi sinh vật suy giảm đã làm cho nấm bệnh, đặc biệt là nấm Corynespora cassiicola có điều kiện phát triển và phát tán rất nhanh trong mùa mưa. Vì vậy, việc bón phân hữu cơ là một trong những giải pháp quan trọng cần được quan tâm thúc đẩy. Trong khi bệnh vàng lá, rụng lá đang có chiều hướng lây lan nhanh việc bón phân hữu cơ có chứa nấm đối kháng Trichoderma là một giải pháp rất hữu hiệu. Ngoài việc giúp cho bộ rễ cây phát triển, đất giữ ẩm tốt, đồng thời nấm đối kháng Trichoderma sẽ tấn công các mầm bệnh corynespora và các loai nấm bệnh khác có trong đất. Việc phun các chế phẩm sinh học có chứa Trichoderma lên tán cây cũng là một giải pháp rất tốt nhằm đưa các bào tử nấm đối kháng phát tán rộng rãi trong môi trường của vườn cao su tạo nên một hệ thống phòng thủ hữu hiệu lâu dài. Qua nhiều kết quả thực tiễn cho thấy, nấm Trichoderma giết nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium, do vậy nấm Trichoderma đã được khuyến cáo sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp công nghệ cao ở tỉnh Lâm Đồng những năm qua. 10
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Hình 2.4 Ủ phân hữu cơ có sử dụng nấm đối kháng Trichoderma 2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (invitro). Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác. Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng (370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…). 11
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất. Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể sinh vật. Tất cả các tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa enzyme nhưng mức độ enzyme thì hoàn toàn khác nhau.  Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:  Động vật (hạn chế).  Thực vật (hạn chế).  Vi sinh vật (phổ biến).  Việc khai thác enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn chế.  Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau:  Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn.  Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú.  Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàng trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật là rất cao.  Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh.  Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên có thể tận dụng những phụ phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme và có thể điều khiển dễ dàng các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để có thể thu được hiệu xuất cao trong sản xuất. 12
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh  Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô công nghiệp. Hình 2.5 Enzyme cắt mối liên kết peptit (-CO-NH-) 2.4. Giới thiệu sơ lược về protease Nhóm enzyme protease (peptit-hidrolase): Xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng la acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin. Protease được phân loại dựa trên các đặc điểm riêng của chúng cũng như cấu tạo trung tâm hoạt động enzyme, hiện tại được chia làm 6 nhóm chính: - Serine proteases. - Threonine proteases. - Cysteine proteases. - Aspartic acid proteases. - Metalloproteases. 13
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh - Glutamic acid proteases. Hiện nay, chúng ta sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận protease: các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và vi rut) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật (gan, dạ dày bê). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt, protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất, do đó protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm có tính thủy phân triệt để và đa dạng. Hình 2.6 Cấu trúc không gian của protease 2.4.1. Ứng dụng của protease Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: Trong công nghiệp sữa: Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus... được dùng trong sản xuất pho mát. 14
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy…. Protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn. Trong công nghiệp chế biến thịt: Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt (ngâm thịt vào dinh dưỡng protease ở pH và nhiệt độ xác định - phương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất). Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. Trong công ngiệp thuộc da: Protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng. Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như: 15
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh - Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. - Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm. - Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh…. - Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để giặt tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm. 2.5. Sơ lược về enzyme cellulase thu nhận từ Trichoderma reesei Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β -1, 4-O- glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác. Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1, 4- glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1, 4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất. 16
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Hình 2.7 Cấu trúc không gian của enzyme cellulase 2.5.1. Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase Một phức hệ enzyme cellulase gồm: endo-β-1,4-glucanase, exo-β-1,4-glucanase, β-glucosidase. Trong đó: Endo- β-1, 4-glucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose. Exo- β-1, 4-glucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cellulose. β -Glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thành glucose. 17
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh Hình 2.8 Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase Cơ Chế Hoạt Động Của Enzyme Cellulase Hình 2.9 Cơ cấu chi tiết của các hoạt động beta-glucosidase của cellulase 18
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 2.5.2. Tính chất lý hóa của enzyme cellulase Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định.  Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-500C. Ở nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới 00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt độ thích hợp. Hoạt tính của enzyme cellulase từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 550C.  Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môi trường phản ứng. Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid. Theo nghiên cứu trước đây cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ Trichoderma reesei là 4,0- 5,0.  Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme.  Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme là khác nhau. Các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%. 19
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Trần Nhật Minh 2.5.3. Ứng dụng của enzyme cellulase Enzym cellulase được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp sản xuất cồn, trong xử lý môi trường. Enzym cellulase được ứng dụng rất ít trong thực phẩm (khoảng 1%) nhưng hầu như quá trình chế biến nào liên quan đến nguồn nguyên liệu là thực vật nếu có enzym cellulase đều cho hiệu suất cao hơn. Hơn nữa cellulase được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp dệt, bột giặt, ngành công nghiệp giấy, cellulase còn được sử dụng cho các ứng dụng dược phẩm. 2.5.4. Các nguồn thu nhận enzyme Hiện nay trên thế giới có 3 nguồn để thu nhận enzyme là từ thực vật, động vật và vi sinh vật. Do những ưu điểm nổi bật về tốc độ sinh trưởng, sinh sản và phát triển mà nguồn vi sinh vật được quan tâm nhiều hơn. Mặt khác, do kích thước vi sinh vật nhỏ nên ta có thể cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy vi sinh vật có thể kiểm soát được mà không phụ thuộc vào yếu tố bên ngoài như thu enzym từ nguồn thực vật và động vật. Có 2 phương pháp để nuôi cấy vi sinh vật tạo enzyme là nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng, tuy nhiên ngày nay phương pháp nuôi cấy bề sâu ngày càng được ứng dụng rộng rãi do khả năng cơ giới hóa và tự động hóa. 2.6. Kỹ thuật cơ bản chuẩn bị dịch protein thô Sau khi lựa chọn được nguồn cung cấp protein việc tiếp theo là phải đưa protein về dạng dịch. Có nhiều phương pháp: phá tế bào bằng áp suất thẩm thấu, nghiền bằng thiết bị trung tính, nghiền tay, phá tế bào bằng phương pháp siêu âm. Các phương pháp kể trên thích hợp để xử lý các mô mềm, mô động vật, thực vật. Đối với vi khuẩn có vỏ bảo vệ chắc chắn thì tốt nhất nghiền bằng cối thủy tinh có thêm vật liệu chà xát như cát hay bột nhôm, hoặc xử lý với lysozine (enzyme phá vách tế bào). Đối với những tế bào có vách bảo vệ rất chắc như nấm men trong một số trường hợp phải sử dụng máy ép 20

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.26: Bộ 320 Luận Văn Thạc Sĩ Y Học

320 tài liệu

1253 lượt tải

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.