LUẬN VĂN: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ SINH SẢN CỦA CÁ NÂU (Scatophagus argus Linnaeus, 1766)

Chia sẻ: Nhu Chau | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:34

Thêm vào BST

Báo xấu

162
lượt xem 17
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng, tỷ lệ huyết sắc tố; khối lượng và nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu cá nâu cái 19 4.1.6. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng hồng cầu, bạch cầu và tỷ lệ bạch cầu với hồng cầu cá nâu cái 19 4.1.7. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến snh dục với hàm lượng i vitellogenines và protein cá nâu cái 20 4.2.ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ SINH SẢN CÁ NÂU ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ SINH SẢN CỦA CÁ NÂU (Scatophagus argus Linnaeus, 1766)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN Nguyễn Tiến Triển NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ SINH SẢN CỦA CÁ NÂU (Scatophagus argus Linnaeus, 1766) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2009 1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN Nguyễn Tiến Triển NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ SINH SẢN CỦA CÁ NÂU (Scatophagus argus Linnaeus, 1766) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Cán bộ hướng dẫn: Ths. Lý Văn Khánh PGs.Ts. Nguyễn Thanh Phương 2009 2
MỤC LỤC Trang Lời cảm tạ-------------------------------------------------------------------------------- iii Tóm tắt ----------------------------------------------------------------------------------- iv Phần I: Đặt vấn đề ----------------------------------------------------------------------- 1 Phần II: Lược khảo tài liệu ------------------------------------------------------------- 2 2.1 Đặc điểm hình thái -------------------------------------------------------------- 2 2.2 Đặc điểm phân bố --------------------------------------------------------------- 2 2.3 Tập tính dinh dưỡng ------------------------------------------------------------ 3 2.4 Đặc điểm sinh trưởng----------------------------------------------------------- 3 2.5 Đặc điểm sinh sản--------------------------------------------------------------- 3 PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU --------------------------------------- 5 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU--------------------------------------------------- 5 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -------------------------------------------- 5 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm ------------------------------------------------------- 5 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu ------------------------------------------------ 5 3.2.3 Phương pháp thu mẫu máu ---------------------------------------------- 6 3.2.4 Các phương pháp phân tích --------------------------------------------- 6 3.2.4.1 Phương pháp phân tích mô học--------------------------------------- 6 3.2.4.2 Phương pháp phân tích vitellogenines------------------------------- 8 3.2.4.3 Phương pháp phân tích hồng cầu và bạch cầu-------------------- 12 3.2.4.4 Phương pháp đo Hematocrit (tỉ lệ huyết sắc tố, %)-------------- 13 3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu--------------------------------------------- 14 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ----------------------------------------- 15 4.1. ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ SINH SẢN CÁ NÂU CÁI ---------------------- 15 4.1.1 Các giai đoạn phát triển của buồng trứng --------------------------- 15 4.1.2.Mối tương quan giữa khối lượng cá với chiều dài và chiều cao cá nâu cái ---------------------------------------------------------------- 16 4.1.3. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục so với hệ số thành thục, độ béo Fulton và độ béo Clark --------------------------------- 17 4.1.4. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục so với tỷ lệ khối lượng gan với khối lượng cá và tỷ lệ khối lượng tuyến sinh dục với khối lượng gan cá nâu cái----------------------------------------- 18 i
4.1.5. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng, tỷ lệ huyết sắc tố; khối lượng và nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu cá nâu cái ---------------------------------------------------------------- 19 4.1.6. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng hồng cầu, bạch cầu và tỷ lệ bạch cầu với hồng cầu cá nâu cái ----------- 19 4.1.7. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến snh dục với hàm lượng i vitellogenines và protein cá nâu cái ----------------------------------- 20 4.2.ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ SINH SẢN CÁ NÂU ĐỰC---------------------- 19 4.2.1. Các giai đoạn phát triển của buồng tinh------------------------------ 21 4.2.2. Mối tương quan giữa khối lượng cá với chiều dài và chiều cao cá nâu đực -------------------------------------------------------------------- 22 4.2.3. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến s dục với hệ số th inh ành thục, độ béo Fulton và độ béo Clark cá nâu đực--------------------- 22 4.2.4. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến snh dục với tỷ lệ khối i lượng gan với khối lượng cá và tỷ lệ khối lượng tuyến sinh dục với khối lượng gan cá nâu đực ----------------------------------------- 23 4.2.5. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng, tỷ lệ huyết sắc tố; khối lượng và nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu cá nâu đực----------------------------------------------------------------- 23 4.2.6. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng hồng cầu, bạch cầu và tỷ lệ bạch cầu với hồng cầu cá nâu đực ---------- 24 4.2.7. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến snh dục với hàm lượng i vitellogenines và protein cá nâu đực ---------------------------------- 24 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT --------------------------------------------- 26 5.1 Kết luận------------------------------------------------------------------------- 26 5.2 Đề xuất ------------------------------------------------------------------------- 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO ------------------------------------------------------------ 27 ii
LỜI CẢM TẠ Trong khoảng thời gian thực hiện luận văn vừa qua nhờ sự chỉ dẫn, dạy bảo tận tình của thầy cô đã giúp cho em có được những kiến thức bổ ích cho công việc sau nầy, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Thầy Nguyễn Thanh Phương, Thầy Lý Văn Khánh đã giúp cho em nhận thấy được những khoảng trống kiến thức cần bổ sung, đồng thời nhờ sự chỉ dẩn quý báo của thầy cô để luận văn hoàn thành theo đúng mục tiêu. Em xin chân thành cám ơn tất cả thầy cô, cán bộ Khoa Thủy Sản đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho em trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài. Em xin chân thành cám ơn các anh chị cao học, các bạn sinh viên lớp nuôi trồng thủy sản K31, các bạn lớp bệnh học thủy sản K31 đã giúp đỡ em trong những lúc em gặp khó khăn. iii
TÓM TẮT Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý sinh sản của cá nâu (Scatophagus argus Linnaeus, 1766) được thực hiện từ tháng 04/2009 đến 06/2009 nhằm mục tiêu xác định mối tương quan giữa các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục với hàm lượng vitellogenines trong huyết tương, số lượng, tỷ lệ hồng cầu và bạch cầu trong huyết tương, hàm lượng protein trong huyết tương, cơ và gan. Kết quả cho thấy cá nâu cái có tuyến sinh dục giai đoạn 5 có độ béo Fulton (13,22) và độ béo Clark (10,93) đạt cao nhất và thấp nhất là giai đoạn 1. Khối lượng gan trung bình của cá nâu cái có tuyến sinh dục giai đoạn 3 là lớn nhất (4,59 g/con) và hàm lượng vitellogenines trong huyết tương của cá nâu cái tăng dần theo sự phát triển của tuyến sinh dục và đạt cao nhất ở cá có tuyến sinh dục giai đoạn 5 (3,73 µg ALP/ml protein). Ở cá nâu đực có hệ số thành thục không khác nhau giữa các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục. Cá nâu đực có tuyến sinh dục giai đoạn 1 có độ béo Fulton (9,01) và độ béo Clark (8,14) đạt cao nhất và thấp nhất là giai đoạn 4 và hàm lượng vitellogenines trong huyết tương của cá nâu đực đạt cao nhất ở cá có tuyến sinh dục giai đoạn 3 (3,48 µg ALP/ml protein). iv
PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Nguồn lợi thủy sản ngày nay được xem là nguồn tài nguyên quan trọng đối với cuộc sống con người. Hầu hết các quốc gia tr n thế giới đều sử dụng sản ê phẩm thủy sản làm thức ăn và đây là nguồn cung cấp đạm tốt nhất cho c n o người. Tuy nhiên, trong những năm gần đây nguồn lợi thủy sản nói chung bị giảm mạnh do khai thác và đánh bắt quá mức đồng thời nghề nuôi cũng đang gặp khó khăn do vấn đề dịch bệnh, ô nhiễm môi trường và vấn đề con giống. Ở Việt Nam, nuôi thủy sản đang là thế mạnh trong phát triển kinh tế xã hội hiện nay, nó đóng góp đáng kể v kim ngạch xuất khẩu của cả n ào ước. Trong nghề nuôi thủy sản ven biển thì tôm sú, tôm thẻ chân trắng, cá mú, cá chẽm, cua biển đang là đối tượng nuôi chính và phổ biến nhưng giá cả giảm mạnh nhất là đối với tôm sú, cá tra, cua biển... Do đó đa dạng hóa đối tượng và mô hình nuôi là một trong những yêu cầu phát triển của nghề nuôi thủy sản nhằm giảm áp lực lên một vài loài tiêu biểu. Hiện nay trong nghề nuôi cá biển, bên cạnh một số loài bản địa như cá mú, cá chẽm,… thì cá nâu cũng được xem là loài có triển vọng nuôi ở vùng ven biển. Cá nâu (Scatophagus argus) là loài có kích thước tương đối lớn, thịt cá béo có mùi vị thơm ngon, có giá trị thương phẩm cao. Các nghiên cứu về đối tượng này còn rất hạn chế đặc biệt là những đặc điểm sinh học sinh lý và sinh sản. Để cung cấp thêm những thông tin cần thiết để hoàn thiện qui trình sản xuất giống và góp phần đưa đối tượng này trở thành đối tượng nuôi phổ biến nên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số chỉ iêu sinh lý sinh s n của cá nâu t ả (Scatophagus argus Linnaeus, 1766)”. Mục tiêu Tìm hiểu mối tương quan giữa các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục với: - Hàm lượng vitellogenines trong huyết tương - Số lượng và tỷ lệ hồng cầu và bạch cầu trong huyết tương - Hàm lượng protein trong huyết tương, cơ và gan Nội dung  Phân tích mô học xác định các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục  Phân tích hàm lượng vitellogenines trong huyết tương  Phân tích số lượng và tỷ lệ hồng cầu và bạch cầu trong huyết tương  Phân tích hàm lượng protein trong máu, cơ và gan 1
PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm hình thái 2.1.1 Vị trí phân loại: Bộ: perciformes Họ: Scatophagidae Giống: Scatophagus (Cuvier và Valenciennes, 1831) Loài: Scatophagus argus Linnaeus, 1766 Cá nâu (Scatophagus argus) có kích thước tương đối lớn, thịt cá béo, có muồi vị thơm ngon, có giá trị thương phẩm cao. Theo Barry (1992) thì cá nâu có 2 giống là Scatophagus và Selenotoca. Ở Việt Nam theo các tác giả nh Yên ư (1992), Khoa và Hương (1993) thì chỉ có một giống và một loài cá nâu duy nhất là (Scatophagus argus Linnaeaus, 1766). Các nghiên cứu về đối tượng nài hiện còn rất hạn chế, phần lớn tập trung vào phân loại, mô tả, một số thông tin ngắn về thành phần giống loài và sự phân bố, còn những dẫn liệu về đặc điểm sinh học dinh dưỡng và sinh sản loài cá nâu (Scatophagus argus) để làm cơ sở cho các nhiên cứu về sản xuất giống và nuôi là một yêu cầu cấp thiết. Hình 2.1: Hình dạng bên ngoài cá nâu (Scatophagus argus Linnaeus, 1766) Cá nâu mình rất dẹp bên, cao thân, lưng hình vòm, nhìn ngan gần như tròn. Cá có đầu nhỏ, mắt ngắn, mõm tù, miện nhỏ, trên hàm có răng mịnh, mắt cá lớn vừa, lỗ mũi trước tròn, lỗ mũi sau là vạch, màng mang hẹp và liền với eo mang. Vảy lược, nhỏ, phủ khắp thân, đầu, gốc vi hậu môn, vi lương và đuôi, rìa tia vi lưng va tia hậu môn gần như thẳng đứng ,viền sau vây đuôi thẳng (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993). Đường bên hoàn toàn, bắt đầu từ mép trên lổ mang, cong lên phía trên, sao đó chạy đến giữa cuốn đuôi. Khởi điểm vi lưng nằm ngang phần cuốn xương nắp mang, gai vi cứng nhọn, gai thứ IV, V, VI đài hơn các vi khác. Trước gốc vi lưng có 1 gai không cử động được, hướng về phía đầu. Khởi điểm vi hậu môn ngang với gai cuốn cùng của vi lưng, vi hậu môn có một gai và nhọn. 2
Cá nâu có thân màu xám , nửa trên của thân có rất nhiều chấm đen, to tròn, các đóm nầy nhạt dần về phía bụng, số lượng và hình dạng thay đổi theo từng cá thể. Vi ngực có màu traengs trong, màng da giữa các tia vi còn lại có nhiều sác tố đen. 2.2 Đặc điểm phân bố Cá nâu được tìm thấy ở Rajpara- Ấn Độ, có chiều dài lớn nhất 334 mm và co khối lượng 1,2kg (Khang, 1984). Phân bố nhiều từ Nhật đến Ấn Độ -Thái Bình Dương bao gồm cả vùng biển phía nam Trung Quốc (Mohsin và ctv, e 1996). Cá nâu có thể sống từ vùng nước mặn, vùng cửa sông và cả trong nước ngọt, phần lớn sống ở biển. vùng phân bố từ bờ biển Trung Quốc dọc đ Úc ến Châu (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu H ương,1993). Theo Nguyễn Hữu Phụng (1995) thì cá nâu sống ở biển , nườc lợ và nước ngọt , phân bố từ Ấn Độ, Úc, Srilanka, Indonesia, Malaysia, Mew Caled onia, Philipphines, Thái Lan, Trung Quốc, Việt Nam. Ở Việt Nam cá nâu phân bố tron đầm, kểnh rạch nước lợ và cửa sông g (Nguyễn Tấn Trịnh và ctv, 1996; Mai Đình Yên, 1992) và có ở cả 3 vùng nước gồm Vịnh Bắc Bộ, Miền Trung và Miền Nam Bộ (Nguyễn Hữu Phựng,1995) 2.3 Tập tính dinh dưỡng Cá nâu ăn được nhiều loại thức ăn khác nhau như giun, giáp xác, côn trùng, các vật chất có nguồn gốc từ thực vật tảo …(Fishbae,2000). Trong báo cáo của Nguyễn Tấn Trịnh cá nâu à loài ăn t p, thức ăn của cá à tảo Silic tảo l ạ l Enteromopha, tảo Chaetomorpha… Theo Chang (1997) thức ăn cho ấu trùng mới nở trong những ngày đầu tiên là luân trùng Branchionus (rotifer). Sau 9 ngày có thể ăn ấu trùng artemia và sau 19 ngày có thể ăn được copepode 2.4 Đặc điểm sinh trưởng Các nghiên cứu về cá nâu hiện nai còn rất ít, theo báo cáo của Nguyễn Tấn Trịnh và ctv (1996) thì cá nâu có kích thước tương đối lớn. Cá nâu lớn nhất được tìm thấy có chiều dài 33 cm (Allen, 2000). Trong m số đầm nuôi ven biển ột chúng có sản lượng khai thác đáng kể, chiều dài cá đánh bắt đạt đến 143-175 mm với khối lượng tương ứng105-140 g. Theo nghiên cứu của Assadi và Delighani (1997) thì cá nâu có chiều dài cực đại là 30 cm. Barry và Fast (1992) nghiên cứu về cá nâu cho biết cá cái dài tối đa 28 cm và con đực 27 cm. cá nâu rất thường được nuôi như một loài cá kiểng, nhất là ở giai đoạn nhỏ (Mohsine, 1996) 2.5 Đặc điểm sinh sản Sự thành thục của cá lần đầu tiên ở cá cái khoảng 150 g, tương ứng với cá khoảng 7-9 tháng tuổi và cá đực thành thục sớm hơn cá cái (Barry và Fast, 1992). Sự khác biệt về giới tính của cá nâu có thể phân biệt được dựa vào hình dạnh đầu (Barry và Fast, 1992). Đặc điểm nầy phân biệt tương tự như xác định trên cá tai tượng (Osphronemus gourami) là “trán cá đực” (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hổ, 2003) Đường kính trứng khoảng 0,4 mm là thích hợp cho việc kích thích cho cá sinh sản bằng phương pháp tiêm kích dục tố. Trứng chín mùi có đường kính 3
trứng khoảng 0,6 mm, giọt dầu khoản 0,2 mm vỏ trứng phẳng, trong suốt, màu vàng sáng, trứng rời và nổi. Trứng cá nâu thụ tinh trôi nổi hoàn toàn, bán trong suốt và đường kính trứng khoảng 0,78-0,8 mm theo Arlo W. Fast (1988) trứng cá nâu thành thục có đường kính trứng 0,5 mm. Sự khác biệt về giới tính của c nâu có thể được phân biệt dựa vào hình á dạng đầu (Barry & Fast, 1992). Đặc điểm nầy cũng đ được tác giả Nguyễn ã Tường Anh xác định trên cá tai tượng “cá đực trán có khối u lớn hơn cá cái”. Theo đánh giá của các nhà khoa học, thì cá nâu có thể trở thành đối tượng nuôi trong các đầm nước lợ vì nó không cạnh tranh thức ăn với các đối tượng nuôi khác và có nguồn giống trong tự nhiên rất phong phú. Tuy nhiên các nghiên cứu trước đây của Yên(1992), Khoa & Hương (1993)cũng như ngoài nước cũng chỉ tập trung vào đặc điểm hình thái phân loại, mô tả và một số thông tin ngắn về sự phân bố, đặc tính dinh dưỡng và sinh sản. Còn những dẩn liệu sinh học sinh sản của loài cá nầy chưa được quan tâm đúng mức. 4
PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Địa điểm: Trại thực nghiệm Bộ môn Kỹ thuật nuôi Hải sản và phòng thí nghiệm sinh lý Bộ môn Dinh d ưỡng và chế biến thủy sản – Khoa Thủy Sản – Trường Đại học Cần Thơ. 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm • Bể nhựa • Ống tiêm 1 ml • Thuốc chống đông • Máy ly tâm • Dụng cụ mỗ cá • Lame, lamelle • Pipet • Lọ nhuộm tiêu bản • Kính hiển vi • Buồng đếm hồng cầu • Tủ trữ đông mẫu (-800C ) • Máy nghiền cơ • Máy cắt mô • Cân điện tử • Thước • Các hóa chất, dụng cụ phòng thí nghiệm sinh lý và phòng thí nghiệm Bộ môn dinh dưỡng và chế biến thủy sản – Khoa Thủy Sản – Trường Đại học Cần Thơ 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu Thu mẫu cá ngoài tự nhiên (đủ 6 giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục, mỗi giai đoạn phát triển phôi thu khoảng 10 cá thể), mẫu cá thu được phân tích các chỉ tiêu: • Đo chiều dài tổng, chiều dài chuẩn và chiều cao • Cân khối lượng cá, khối lượng cá không nội tạng v khối lượng tuyến à sinh dục (buồng trứng và buồng tinh), khối lượng gan cá • Mẫu tuyến sinh dục (buồng trứng và buồng tinh) phân tích mô học xác định giai đoạn tuyến sinh dục. • Mẫu cơ và gan cá phân tích protein 5
• Mẫu máu phân tích vitellogenines, protein, tỷ lệ và số lượng hồng cầu và bạch cầu, hemoglobin • Hệ số thành thục = 100 x (Khối lượng buồng trứng/Khối lượng thân) • Độ béo Fulton (F) = Khối lượng thân (g)/Chiều dài chuẩn (cm) • Độ béo Clark (C) = Khối lượng thân bỏ nội quan (g)/Chiều dài chuẩn (cm) 3.2.3 Phương pháp thu mẫu máu Đa số các loài cá xương đều có hệ thống tuần hoàn giống nhau bao gồm tim, hệ thống động mạch và hệ thống tỉnh mạch nối liền với nhau. Máu được lấy từ động mạch đuôi bằng ống tiêm nhựa có thể tích 1 ml với đầu kim tiêm 1/2-26, gồm các bước sau: - Trước khi lấy mẫu máu, ống ti m và kim tiêm đư tráng qua bằng ê ợc heparin. Heparin là một chất chống đông máu (antico agulant) được sử dụng ở người, heparin nầy ít ảnh hưởng đến các chỉ tiêu về thể tích của tế bào (Blaxhall, 1973), pH máu hay áp suất của O2 và CO2 (Hattingh, 1975; Smit và ctv, 1977) (được trích dẫn bởi Arthur H. Hou ston, 1990). Ống tiêm và kim tiêm được sử dụng riêng biệt cho từng mẫu cá. - Ống chứa máu 1,5 ml (ependorf tube) được chuẩn bị riêng cho từng mẫu cá. - Lượng máu lấy ở mỗi cá khoảng 2 ml và được giữ lạnh trong nước đá suốt thời giai lấy mẫu. 3.2.4 Các phương pháp phân tích 3.2.4.1 Phương pháp phân tích mô học Mẫu tuyến sinh dục xác định các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục bằng phương pháp mô học theo qui trình xử lý mẫu và nhuộm mẫu bằng Mayer's Hematoxylin và Eosin (Hinton, 1990) Giải phẩu cá tách lấy tuyến sinh dục (TSD) cố định trong dung dịch formon 4%, sau 24h lấy mẫu bảo quản trong dung dich cồn 50%. Sau khi cố định TSD được cắt ra thành từng phần nhỏ với độ dầy 3-5 mm cho vào histocasset và ngâm trong cồn 70% đến khi sử lý. Quy trình xử lý mẫu Hoá chất Thời gian Cồn 80% 1 giờ Cồn 95% 1 giờ Cồn 95% 1 giờ Cồn 100% 1 giờ 30 Cồn 100% 1 giờ 30 Cồn 100% 1 giờ 30 Xylen 2 giờ 6
Xylen 2 giờ Xylen 2 giờ Paraffin + xylen (5:5) 2 giờ 30 Paraffin + sáp ong (5:5) 2 giờ Paraffin + sáp ong (7:3) 2 giờ Đúc khối Sau khi xử lí xong đặt mẫu trong khung paraffin khoảng 30 phút để mẫu ngấm paraffin tốt. Sau đó dùng kẹp gắp mẫu ra đặt trong khung inox, định hướng mẫu cho đúng rồi đổ paraffin nóng chảy (57 – 60oC) vào khuôn, đồng thời làm lạnh khuôn để mẫu được cố định vững chắc, ấn cho m sát vào đáy khuôn, tiếp tục đổ ẫu paraffin vào đầy khuôn. Đặt vào ngăn lạnh hay tủ lạnh để paraffin đặc lại. Lấy khối mô ra khỏi khuôn và đặt vào trong tủ lạnh để làm rắn lại. Cắt mẫu Tiếp theo mẫu đ ược cắt thành từng băng dài và mỏng bằng máy cắt (microtome) với độ dày 4 – 6 µm, dùng kim mũi giáo tách lấy đoạn mẫu không bị vỡ và đặt lát cắt lên lam đã nhỏ sẵn một ít nước ấm (45-500C) cho lát cắt căng ra. Cho lên bàn sấy (slide warmer) với nhiệt độ từ 45 – 500C trong thời gian 12 -24 giờ để paraffin tan ra và mẫu được khô. Nhuộm và dán mẫu Hóa chất Thời gian Xylen 5 phút Xylen 5 phút Xylen 5 phút Cồn 100% 5 phút Cồn 100% 5 phút Cồn 70% 5 phút Rửa nước 5 phút Haematoxylin 2 phút Rửa nước 1 phút Rửa nước 1 phút Eosin 2 phút Cồn 95% 5 phút Cồn 100% 5 phút 7
Cồn 100% 5 phút Xylen 5 phút Xylen 15 phút Dán lame vào vùng có mẫu trên lam bằng keo Canada balsam. Làm khô mẫu Đọc kết quả Quan sát mẫu trên kính hiển vi để xác định các giai đoạ phát triển của n tuyến sinh dục. 3.2.4.2 Phương pháp phân tích vitellogenines (protein tạo noãn hoàng) Mẫu Máu được thu từ động mạch lưng bằng kim tim và sau đó ly tâm lạnh ở 4oC trong vòng 6 phút (6 .000 vòng/phút), sử dụng huyết tương để đo hàm lượng vitell genines. o Hàm lư ợng vitell genines o đư ợc xác ịđ nh bằng phương pháp so màu quang ph (theo phương pháp A ổ lkali-Labile Phosphate dựa trên đường chuẩn Phophorus Standard và so màu ở bước sóng 660 nm). Để xác định được hàm lượng vitellogenines cần trước hết cần xác định hàm lượng protein và alkali-labile phosphate (ALP) có trong huyết tương. * Phương pháp phân tích Protein Lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry và ctv (1951) sử dụng Albumine bovine (BSA, Sigma) làm đường chuẩn. Chuẩn bị hoá chất BSA: 10mg/ml H20 Hỗn hợp A: 150 ml Na2CO3 2% + 1,5 ml CuSO4 1% + 1,5 ml NaK Tartrate 2% Folin: 10 ml Folin + 10 ml H2O 8
Quá trình phân tích protein Hóa chất Đường chuẩn Mẫu 0 mg 0,05 mg 0,1mg 0,2 mg 0,5 mg protein protein protein protein protein BSA 0µL 5 µL 10 µL 20 µL 50 µL / Mẫu / / / / / 10 H2O 500 µL 495 µL 490 µL 480 µL 450 µL 490 µL NaOH 1N 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL Ủ trong 30 phút Hỗn hợp A 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml Ủ trong 15 phút Folin 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL Ủ trong 30 phút Đọc ở bước sóng 660 nm Đường chuẩn Albumine bovine cho phép xác định được lượng protein (mg protein/ml plasma) có trong mẫu. * Phương pháp phân tích Alkali-labile phosphate (ALP) ALP được xác định dựa vào đường chuẩn phosphorus standard Hóa chất phân tích Acid Molybdate: 0,625 mg Amonium molybdate/50 ml H2SO4 2,5M Reducer: 1,58 g/10 ml H2S TCA 20%: 20 g Trichloro acetic acid/100 ml H20 NaOH 2N: 8 g/100 ml H20 HCl 2N: 83,4 ml/16,6 ml H20 Ethanol absolut Acetone Diethylether Chloroforrm 9
Quá trình phân tích 30 ml plasma + 1ml TCA 20% trong15 phút Ly tâm 10 phút (40C): RPM = 3300 rpm. Dùng pipet lấy phần cô đặc 1 ml Ethanol Để vào nước nóng 60oC trong vòng 10 phút Li tâm 2 phút (4oC) ; RPM = 8000 rpm. Lấy phần cô đặc 1ml chloroform : 2 ml diethylether : 2ml ethanol trong 5 phút Li tâm 2 phút (4oC); RPM = 8000 rpm. Lấy phần cô đặc 1 ml aceton trong 5 phút Ly tâm 2 phút (4oC); RPM = 8000 rpm. Lấy phần cô đặc 1 ml diethylether trong 5 phút Ly tâm 2 phút(4oC); RPM = 8000 rpm Lấy phần cô đặc sấy khô khoảng 1 giờ (50-60oC) 500 µl NaOH 2N Để vào nước nóng 100oC trong 15 phút. Lấy ra để nguội 500 µl HCl 2N. 10
Dùng pipet hút 400 µl mẫu cho vào ống nghiệm rồi tiến hành như sau: Phosphorus Acid Mẫu Nước Reducer Tổng Standard Molybdate Mẫu 400 / 400 200 50 1.050 Đường chuẩn 0 µg/l / / 800 200 50 1.050 0,2 µg/l / 10 790 200 50 1.050 0,5 µg/l / 25 775 200 50 1.050 1 µg/l / 50 750 200 50 1.050 2 µg/l / 100 700 200 50 1.050 4 µg/l / 200 600 200 50 1.050 6 µg/l / 300 500 200 50 1.050 Chờ 10 phút So màu ở bước sóng 660 nm Thiết lập phương trình tương quan cho mẫu chuẩn từ đó dựa trên đường chuẩn và độ hấp thu để tính toán h lượng ALP (µg ALP/ml plasma) tro àm ng mẫu. Kết quả µg ALP/ml plasma µg ALP Vitellogenines = -------------------------- = -------------- mg protein/ml plasma mg protein 3.2.4.3 Phương pháp phân tích hồng cầu và bạch cầu Định lượng hồng cầu - Máu được pha loãng 200 lần bằng dung dịch Natt & Herrick trong 3 phút và hồng cầu được đếm bằng buồng đếm hồng cầu - Cách pha loãng: 5µl +995µl dd Natt – Henrick. Sau khoảng 3 phút cho vào buồng đếm và đếm số lượng hồng cầu. Số lượng hồng cầu được tính bằng công thức A (triệu tb/mm3) = a x 200/0,02 x 10-6 Trong đó: a: số hồng cầu trong 5 vùng đếm 200: độ pha loãng 0,02: thể tích vùng đếm (5 x 16 x 0,0025 mm3 x 0,1mm) 11
Hình 3.1: Buồng đếm hồng cầu Cách pha dung dịch Natt- Henrick: • NaCl 3,88g • Na2SO4 2,5g • Na2HPO4.12H2O 2,91g • KH2PO4 0,25g • Formalin(27%) 7,5g • Methyl violet 0,1g Định loại bạch cầu Cho một giọt máu lên lam kính, dùng lamel trải đều theo chiều ngược lại, để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó ngâm trong methanol 1 phút. Nhuộm mẫu -2 bằng phương pháp nhuộm Wright &Giemsa (Hamuson, 19 trích dẩn bởi 79 Rowley 1990). các bước nhuộm mẫu: Nhuộm với dung dịch Wright trong 3-5 phút Ngâm trong dung dịch pH 6,2-6,8 trong 5- 6 phút Nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20 – 30 phút Ngâm trong dung dịch pH 6,2 trong 15-30 phút Rửa qua nước cất để khô tự nhiên Quan sát dưới khính hiển vi ở vật kính 100x, xác định các loại bạch cầu theo Supranee (1991) Tổng bạch cầu: đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu trên 1.500 tế bào trên mẫu nhuộm. W = (1500 - h) x H/h Trong đó: h: Số hồng cầu đếm được trên tổng số 1.500 tế bào trên mẫu nhuộm. H: Mật độ hồng cầu trong mẩu máu 12
3.2.4.4 Phương pháp đo Hematocrit (tỉ lệ huyết sắc tố, %) Đây là phương pháp xác định tỉ lệ thể tích các tế bào máu so với huyết tương. Máu thu được cho vào ống thủy tinh (hematocrit tube), ly tâm hematocrit tube bằng máy ly tâm chuyên biệt trong 2 phút với tốc độ lắn 12.000 vòng/ g phút. Dùng thước đo có chia vạch từ 0 -100% để xác định tỉ lệ huyết sắc tố (Larsen & Snieszko,1961 trích dẩn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 1997) Các chỉ số liên quan đến hồng cầu cũng được tính như dựa theo phương pháp của Weiberg và ctv (1972) Thể tích hồng cầu MCV (µ3) = 10 x tỉ lệ huyết cầu (%) [số lượng hồng cầu (106/mm3)] Khối lượng trung bình của huyết cầu trong hồng cầu MCH (pg/tb) = 10 x [huyt sắc tố (g/100 ml)]/ [số ượng hồng cầu ế l 6 3 (10 /mm )] Nồng độ của huyết sắc tố trong hồng cầu (MCHC) (%) MCHC (%) = 100 x tỉ lệ huyết cầu (%)/[huyết sắc tố (g/100 ml)] Phương pháp đo hemoglobin Hemoglobin được đo bằng thuốc thử Drabkin (Oser, 1965) Cách pha Drabkin: gồm thuốc thủ I (Reagent I, HR I) và thuốc thử II (Reagent II,HR II) - Thuốc thử I: 20 g K3Fe(CN)6 trong 1.000 ml nước cất - Thuốc thử II: 75 g KHCO3và KCN trong 1.000 ml nước cất - Pha 10 ml (HR I) và 10 ml (HR II) và 980ml nước cất có dung dịch thử. Cách đo: pha loãng 10µl máu tu được với 2,5ml dung dịch Drabkin trong cuvet. Thuốc thử chuyển huyết sắc tố thành Cynomethemoglobin có màu vàng theo 2 phản ứng Potassium ferrcyanide Hemoglobin (Fe2+) Methemoglobin Potassium cyanide Methemoglobin (Fe3+) Cyanomethemoglobin Dùng máy hấp thu quang phổ (UV spectrophotometer) đo mức độ hấp thu ánh sánh của dung dịch ở bước sóng 540 nm, ở nhiệt độ 25-30ºC. Số lượng huyết sắc tố tính theo công thức: Số lượng huyết sắc tố mmol/l (A) = (0,019 + 37,74 a) x 0,621 Trong đó: a là mức độ hấp thu ánh sáng hay số đo được từ máy quang phổ, mỗi mẫu máu được chuẩn bị thành 2 lần lập lại 13
Số lượng huyết sắc tố g/100 ml = A x 1,1625 3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được phân tích giá trị trung bình (average), độ lệch chuẩn (standard deviation), phương trình hồi qui (sử dụng chương trình microsoft office Excel 2003) và so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức dựa vào phân tích Anova và Duncan (sử dụng phần mềm SPSS 11.5) với mức ý nghĩa p < 0,05. 14