Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Đánh giá khả năng diệt tuyến trùng và kích thích sinh trưởng đối với cây cà phê của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:72

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp nghiên cứu vi sinh và hóa sinh để thử nghiệm và đánh giá: Khả năng diệt tuyến trùng, khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase và cellulase cao, sinh tổng hợp hàm lượng IAA.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Đánh giá khả năng diệt tuyến trùng và kích thích sinh trưởng đối với cây cà phê của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Đào Thùy Dương ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG VÀ KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐỐI VỚI CÂY CÀ PHÊ CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH Bacillus megaterium LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội, 2020
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Đào Thùy Dương ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG VÀ KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐỐI VỚI CÂY CÀ PHÊ CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH Bacillus megaterium Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Người hướng dẫn: PGS.TS Chu Hoàng Hà Hà Nội, 2020
i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả trong khóa luận là do tôi trực tiếp thực hiện. Các số liệu và kết quả là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nghiên cứu nào. . Tác giả Đào Thùy Dương
ii Lời cảm ơn Trong quá trình học tập, thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các đoàn thể, cá nhân trong và ngoài trường. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS.TS. Chu Hoàng Hà cùng các cán bộ, nghiên cứu sinh của Phòng Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Học Viện Khoa học và Công nghệ cùng với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong khuôn khổ đề tài: “Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh CAFE-HTD01 và HOTIEU-HTD03 và sử dụng tích hợp các chế phẩm sinh, hóa học nhằm phát triển hiệu quả và bền vững cây cà phê và hồ tiêu ở Tây Nguyên” mã số KHCN-TN/16-20, thuộc Chương trình Tây Nguyên 3 do TS. Hà Việt Sơn làm Chủ nhiệm. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình và những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tác giả Đào Thùy Dương
iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN Chữ viết tắt/ký hiệu Giải nghĩa đầy đủ B. megaterium 18 Bacillus megaterium 18 CMC Carboxymethyl Cellulose IU International Unit ICO International Coffee Organization IAA Indole-3-acetic acid PTSH Phòng trừ sinh học Gr Gram OD Optical Density (Mật độ quang học của dung dịch) VSV Vi sinh vật VSVNS Vi sinh vật nội sinh VK Vi khuẩn M Molar DNSA 3,5-Dinitrosalicylic acid - Không có hiệu lực + Có hiệu lực ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm TN1 Thí nghiệm 1 TN2 Thí nghiệm 2
iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Thành phần các loài tuyến trùng ký sinh hại cà phê 8 Bảng 3.1. Khả năng lên men sinh axit từ các nguồn cơ chất của 33 chủng vi khuẩn Bacillus megaterium 18 dựa trên kít chuẩn API 50CHB Bảng 3.2. Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase của 36 chủng Bacillus megaterium 18 theo thời gian Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp 37 enzym của chủng Bacillus megaterium 18 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng 38 của chủng vi khuẩn Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh trưởng 39 của chủng vi khuẩn Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ đến khả năng sinh 39 chất kháng sinh của chủng Bacillus megaterium 18 Bảng 3.7. Khả năng kháng tuyến trùng sau 24 giờ nuôi cấy trong 41 phòng thí nghiệm Bảng 3.8. Sinh trưởng của thuốc lá K326 sau lây nhiễm vi sinh vật 44 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của vi khuẩn B.megaterium đến chiều cao và 46 số cặp lá của cây cà phê 20 ngày tuổi sau lây nhiễm vi khuẩn nội sinh Bảng 3.10. Ảnh hưởng của vi khuẩn B.megaterium đến chiều dài rễ 48 chính và số rễ nhánh của cây cà phê 20 ngày tuổi sau lây nhiễm Bảng 3.11. Sinh trưởng của cây cà phê tại vườn ươm sau 3,6 và 9 49 tháng Bảng 3.12. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh tới khả năng sinh 50 trưởng và phát triển của cây cà phê
v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Tác dụng của vi khuẩn nội sinh thực vật và ứng dụng 13 Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn glucoza theo Bernfeld 27 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng Bacillus megaterium 32 18 Hình 3.2. Vòng phân giải CMC của chủng vi khuẩn 34 Hình 3.3. Khả năng làm loãng gelatin của chủng Bacillus megaterium 35 18 Hình 3.4. Ảnh thử nghiệm khả năng ức chế trứng nở sau 7 ngày của 42 chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 ở nồng độ 10% Hình 3.5. Ảnh thử nghiệm khả năng giết chết ấu trùng sau 7 ngày của 42 chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium 18 ở nồng độ 10% Hình 3.6. Cây thuốc lá ở các công thức sau 15 ngày lây nhiễm 45 Hình 3.7 Cây thuốc lá ở các công thức sau 30 ngày lây nhiễm 45 Hình 3.8. Cây cà phê ở công thức ĐC, TN1 và TN2 sau 28 ngày lây 47 nhiễm Hình 3.8. Cà phê tại vườn ươm sau 3 tháng, 6 tháng, 9 tháng 50
vi MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ PHÊ ........................................................... 3 1.1.1. Lịch sử phát triển của cây cà phê.........................................................................3 1.1.2. Đặc điểm thực vật học cây cà phê .......................................................................4 1.1.3. Một số bệnh thường gặp ở cây cà phê ................................................................5 1.2. TUYẾN TRÙNG THỰC VẬT VÀ TUYẾN TRÙNG HẠI CÂY CÀ PHÊ ....................................................................................................................... 7 1.2.1. Cấu tạo và phân loại tuyến trùng thực vật ..........................................................7 1.2.2. Thành phần các loài tuyến trùng gây hại cây cà phê .........................................8 1.2.3. Tình hình tuyến trùng hại cây cà phê ở Việt Nam .............................................9 1.3. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN NỘI SINH THỰC VẬT ...................... 11 1.3.1. Vi khuẩn nội sinh thực vật .................................................................................11 1.3.1.1. Định nghĩa ........................................................................................................11 1.3.1.2. Nguồn gốc vi khuẩn nội sinh thực vật ...........................................................11 1.3.2. Vai trò của vi khuẩn nội sinh thực vật ..............................................................12 1.3.2. Một số ứng dụng của vi sinh vật trong phòng trừ tuyến trùng .......................14 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ PHÊ ...... 18 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước .....................................................................18 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ......................................................................21 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...... 23 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 23 2.2. THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................. 23 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................. 23
vii 2.4. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT................................................................... 24 2.4.1. Thiết bị chính.......................................................................................................24 2.4.2. Hóa chất chính.....................................................................................................24 2.4.3. Môi trường nuôi cấy ...........................................................................................24 2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 24 2.5.1. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật [53].........................................................24 2.5.1.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của các chủng vi khuẩn.24 2.5.1.2. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn [53] ......................................................................................................................26 2.5.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzym ......................................................27 2.5.2. Đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng đối với thực vật của chủng Bacillus megaterium 18 ................................................................................................28 2.5.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của chủng Bacillus megaterium 18 đến sinh trưởng cây thuốc lá ....................................................................................................................28 2.5.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của chủng vi sinh vật nội sinh Bacillus megaterium 18 đến sinh trưởng cây cà phê in vitro ở giai đoạn vườn ươm. ................................28 2.5.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của chủng Bacillus megaterium 18 đến sinh trưởng cây cà phê giai đoạn cây con và giai đoạn cây 1,5 tuổi...........................29 2.6. XỬ LÝ SỐ LIỆU................................................................................... 31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 32 3.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN NGHIÊN CỨU ................. 32 3.1.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào ............................................................32 3.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .................................................................................32 3.1.3. Khả năng phân giải cơ chất của chủng nghiên cứu .........................................34 3.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của chủng Bacillus megaterium 18 ...............................................................................................................35
viii 3.1.4.1. Ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase của chủng vi khuẩn nghiên cứu ..........................................................................................35 3.1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase của chủng vi khuẩn ................................................................................37 3.1.4.3. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp chitinase của chủng vi khuẩn........................................................................................38 3.1.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn..............................................................................................................................39 3.2. THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG DIỆT TUYẾN TRÙNG CỦA CHỦNG Bacillus megaterium 18 Ở QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM ....................... 40 3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG ĐỐI VỚI CÂY CÀ PHÊ CỦA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH Bacillus megaterium 18 ..... 44 3.3.1. Kết quả thử nghiệm trên cây thuốc lá in vitro ..................................................44 3.3.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18 lên sinh trưởng của cây cà phê ở giai đoạn vườn ươm .......................................................................................46 3.3.2.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. megaterium 18 đến sinh trưởng của cây cà phê sau 1 tháng theo dõi ....................................................................................46 3.3.2.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. megaterium đến sinh trưởng của cây cà phê sau 3,6,9 tháng theo dõi. ...................................................................................49 3.3.2.3. Ảnh hưởng của vi khuẩn nội sinh B. Megaterium 18 đến sinh trưởng của cây cà phê 1,5 tuổi .........................................................................................................51 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................. 53 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 53 4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 54
1 MỞ ĐẦU Hiện nay, sự phát triển của ngành nông nghiệp đang đi vào mức độ thâm canh, với việc sử dụng ngày càng nhiều phân hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học, phá rừng canh tác cây công nghiệp chạy theo năng suất, sản lượng…đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng hệ sinh thái đất, hệ vi sinh vật trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh trong đất ngày càng tích lũy….Ðể đối phó với vấn đề này, việc kiểm soát sâu, bệnh hại bằng biện pháp sinh học ngày càng được chú ý đến và đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện trong thời gian gần đây [1]. Cà phê là một trong những mặt hàng nông sản chiến lược, đóng góp hơn 3,5 tỷ USD cho ngân sách nhà nước [2]. Chủ trương của Nhà nước là hình thành các vùng trồng cà phê lớn, sản xuất bền vững, đạt các tiêu chuẩn của cà phê chứng chỉ quốc tế đáp ứng nhu cầu xuất khẩu và mang lại giá trị lợi nhuận cao [3]. Tuy nhiên, sản xuất cà phê Việt Nam nói chung hiện đang phải đối mặt với nhiều thách thức, trong đó có vấn đề lạm dụng phân bón hóa học [4]. Điều này chẳng những làm gia tăng chi phí sản xuất mà còn đã và đang làm giảm khả năng chống chịu của cây cà phê dẫn đến bùng nổ dịch bệnh, ảnh hưởng không tốt đến chất lượng cà phê Việt Nam trên thị trường thế giới và cũng là nguyên nhân có thể dẫn đến thoái hóa đất canh tác, ô nhiễm nguồn nước và môi trường sống. Ngoài ra, dư lượng hóa học còn làm giảm chất lượng hạt cà phê nhân, làm sản phẩm khó có thể đi vào các thị trường đòi hỏi chất lượng cao. Do đó, việc nghiên cứu tìm ra các giải pháp thay thế một phần phân bón và thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong sản xuất cà phê hiện đang là vấn đề quan tâm của nhiều nhà khoa học. Một trong những bệnh điển hình của cây cà phê đang phải đối mặt đó là bệnh sần rễ gây vàng lá rồi chết, bệnh chủ yếu do tuyến trùng gây sần rễ gây ra. Tuyến trùng Meloidogyne incognita là một trong những tuyến trùng gây sần rễ, là tác nhân chủ yếu gây hại cho cây trồng trong đó có cây cà phê. Vi sinh vật nội sinh được xem là một trong những đối tượng quan trọng, được phân lập và sàng lọc để làm chế phẩm sinh học dùng cho việc
2 phòng trừ các loại nấm bệnh. Lợi dụng đặc tính vi sinh vật sống nội sinh trong tế bào mô thực vật đã rút ngắn được thời gian thích nghi của chế phẩm sinh học. Vi sinh vật nội sinh có thể đối kháng với nấm bệnh, kích thích sự sinh trưởng cho cây và đồng thời không ảnh hưởng đến môi trường, sức khỏe cộng đồng [5]. Khảo sát về vi sinh vật nội sinh đã được nghiên cứu trong nhiều loại cây trồng quan trọng như lúa mỳ, chuối, đậu nành và cà chua, nhưng phần lớn vi sinh vật nội sinh trên cây cà phê vẫn còn chưa nhiều nghiên cứu sâu [6]. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Đánh giá khả năng diệt tuyến trùng và kích thích sinh trưởng đối với cây cà phê của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium” Mục đích, yêu cầu: - Mục đích: Đánh giá khả năng diệt tuyến trùng và kích thích sinh trưởng đối với cây cà phê của chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus megaterium. - Yêu cầu: Sử dụng các phương pháp nghiên cứu vi sinh và hóa sinh để thử nghiệm và đánh giá: khả năng diệt tuyến trùng, khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase và cellulase cao, sinh tổng hợp hàm lượng IAA.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ PHÊ 1.1.1. Lịch sử phát triển của cây cà phê Cà phê thuộc bộ Rubiales, họ Rubiacea, chi Coffea. Theo phân loại thực vật học cà phê có khoảng 500 loài với trên 6.000 loại. Tất cả các loại cà phê đều có nguồn gốc từ Châu Phi, loại sống hoang dại đã nổi tiếng và lâu đời nhất là cà phê chè (Coffea arabica). Cây cà phê chè mọc hoang dại được biết đến đầu tiên ở vùng biên giới giáp cao nguyên Boma và Sudan. Năm 1889 đã tìm thấy cà phê vối (Coffea canephora) mọc hoang dại ở vùng thuộc Công Gô và mọc rải rác ở một số vùng khác thuộc Tây Phi gần xích đạo. Cây cà phê được trồng trọt từ thế kỷ XIV tại vùng Arabica (Yêmen). Theo Vesling, quả cà phê được đem từ Yêmen sang bán ở vùng Ai Cập duới dạng quả khô và coi đây là thứ hàng rất xa xỉ. Vào thế kỷ XVII người ta đã lấy cà phê đã rang xay trộn vào dầu mỡ được chứa trong các túi làm thực phẩm để vuợt sa mạc. Hiện nay trên thế giới đang trồng các loài cà phê có giá trị kinh tế sau: Cà phê chè (Coffea arabica Line): Ðược trồng có hệ thống đầu tiên vào khoảng thế kỷ XV tại các khu vườn ở miền nam Yêmen. Từ giữa thế kỷ XVII người Ả-rập mất vị trí độc tôn trong việc trồng cà phê và cà phê chè được lan rộng khắp thế giới. Nguồn gốc từ Ethiopia đến Yêmen sang Yava (1960) đến Amsterdam (Hà Lan) năm 1706, sang Trung Mỹ Năm 1724, đến Colombia năm 1724, từ Yêmen sang Brazil năm 1715 và từ Yava sang Papua New Guinea vào năm 1770. Hiện nay cà phê chè được trồng tập trung chủ yếu tại Brazil, Colombia, Mêhicô và các nước Trung Phi. Cà phê chè bao gồm các chủng phổ biến như: Coffea arabica L. var. Typica, Coffea arabica L. var. Bourbon, Coffea arabica L. var. Amarello chev, Coffea arabica L. var. Caturra, Coffea arabica L. var. Mokka, Coffea arabica L. var. Mundonovo, Coffea arabica L. var. Catuai, Coffea arabica L. var. Catimor [7]. Cà phê vối (Coffea canephora Piere): Cà phê vối từ Tây Phi và Madagascar đưa sang Nam Mỹ và Amsterdam, Hà Lan vào năm 1899. Cà phê vối không chịu được lạnh như cà phê chè vì vậy việc gieo trồng chỉ hạn chế tại một số vùng có điều kiện sinh thái đặc trưng, đồn điền cà phê vối đầu tiên
4 xuất hiện tại Java năm 1900. Cà phê vối chủ yếu được trồng nhiều ở một số nước là Indonesia, Bờ Biển Nga, Uganda, Việt Nam. Cây cà phê vối chịu được nhiệt độ nóng ẩm, năng suất cao nhưng hương vị nước uống kém hơn cà phê chè. Khác với cây cà phê chè, cà phê vối là cây thụ phấn chéo và chỉ ra hoa một lần trên nách của cành ngang. Cà phê mít (Coffea excelsa Chev): Cà phê mít dâu da (Coffea liberica Bull in Hiern). Hai loại cà phê này chỉ được trồng tại các nước Châu Phi như Liberia, Sierra Leon, Cộng Hòa Trung Phi, Benin và các nước Châu Á như Philipin, Indonesia, Việt Nam. Hai loại cà phê này sinh trưởng khỏe, khả năng thích ứng rộng, ít sâu bệnh, nhưng chất lượng nước uống kém, hàm lượng caffein thấp. So với cà phê chè và cà phê vối thì sản lượng của hai loại cà phê này không đáng kể [8]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật học cây cà phê Thân: Cây cà phê chè có thể cao tới 6 m, cà phê vối tới 10 m. Tuy nhiên ở các trang trại cà phê người ta thường phải cắt tỉa để giữ được độ cao từ 2-4 m, thuận lợi cho việc thu hoạch. Cây cà phê có cành thon dài, lá cuống ngắn, xanh đậm, hình ovan. Mặt trên lá có màu xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt hơn. Chiều dài của lá khoảng 8-15 cm, rộng 4-6 cm. Rễ cây cà phê là loại rễ cọc, cắm sâu vào lòng đất từ 1 - 2,5 m với rất nhiều rễ phụ tỏa ra xung quanh làm nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng nuôi cây [6]. Hoa: Hoa cà phê màu trắng, có năm cánh, thường nở thành chùm đôi hoặc chùm ba. Màu hoa và hương hoa dễ làm ta liên tưởng tới hoa nhài. Hoa chỉ nở trong vòng 3 đến 4 ngày và thời gian thụ phấn chỉ vài ba tiếng. Một cây cà phê trưởng thành có từ 30.000 đến 40.000 bông hoa. Ngay từ khi cây cà phê ra hoa kết quả người ta đã có những đánh giá đầu tiên về vụ mùa cà phê. Ở các nước sản xuất cà phê lớn điều này đặc biệt quan trọng trong việc đưa ra những nhận định về giá cả và thị trường. Tuy vậy những đợt rét đậm hoặc hạn hán có thể làm đảo lộn mọi sự tính toán và đẩy thị trường vào tình thế hoàn toàn khác [6]. Quả: Cà phê là loài cây tự thụ phấn, do đó gió và côn trùng có ảnh hưởng lớn tới quá trình sinh sản của cây. Sau khi thụ phấn quả sẽ phát triển
5 trong 7 đến 9 tháng và có hình bầu dục, bề ngoài giống như quả anh đào. Trong thời gian chín, màu sắc của quả thay đổi từ xanh sang vàng rồi cuối cùng là đỏ. Quả có màu đen khi đã chín nẫu. Do thời gian đâm hoa kết trái lâu như vậy mà một vụ cà phê kéo dài gần một năm trời và có thể xảy ra trường hợp trên một cây vừa có hoa, vừa có quả. Thông thường một quả cà phê chứa hai hạt. Chúng được bao bọc bởi lớp thịt quả bên ngoài [6]. 1.1.3. Một số bệnh thường gặp ở cây cà phê Một vấn đề đáng quan tâm trong những năm qua là tình hình phát sinh sâu bệnh trên cây cà phê đang diễn biến hết sức phức tạp, việc áp dụng các biện pháp phòng trừ sâu bệnh vẫn còn nhiều hạn chế, nhiều loại bệnh chưa có thuốc đặc trị, việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trên cây cà phê cũng có nhiều vấn đề đáng bàn… Một ví dụ cụ thể như sự xuất hiện của loại ve sầu gây hại cà phê mới đây đã huỷ diệt trên diện rộng đến hàng chục ngàn ha cà phê tại nhiều tỉnh thành trên cả nước, trong đó đặc biệt là ở các vùng chuyên canh cây cà phê như Đắk Lắk, Lâm Đồng, Gia Lai, Đắk Nông… gây thiệt hại lớn cho người dân và làm cho sự phát triển của cây cà phê trong thời gian tới chưa được bền vững. Cho nên, để cho cây cà phê phát triển ổn định và bền vững thì vấn đề bảo vệ thực vật cho cây cà phê là hết sức cần thiết và đáng quan tâm nhất hiện nay [9]. Theo kinh nghiệm thực tế thì sâu bệnh thường sẽ xuất hiện sau khi thu hoạch xong cà phê cho đến cuối mùa nắng, đầu mùa mưa. Đây là giai đoạn phát triển khá nhanh và khá nhiều loại sâu bệnh trên cây cà phê. Theo Cục Bảo vệ thực vật cho biết, tập đoàn sâu bệnh hại trên cây cà phê rất phong phú và đa dạng gồm 18 loại sâu bệnh chính. Các loài sâu hại quan trọng thuộc 6 họ của 3 bộ gồm: bộ cánh cứng, bộ cánh đều, bộ cánh vảy. Trong đó xuất hiện phổ biến nhất là các loại bệnh sau: rệp sáp, ve sầu hại rễ, sâu đục thân, đục cành, đục quả; bệnh gỉ sắt và các loại bệnh nấm…[10]. Một trong số những bệnh gây hậu quả nghiêm trọng trên cây cà phê đó là 2 loại bệnh sau: a, Bệnh rễ do tuyến trùng (Nematodes) Một số loại tuyến trùng gây hại đối với cà phê ở Việt Nam là:
6 - Tuyến trùng gây vết thương: Pratylenchus coffea. - Tuyến trùng gây nốt sần: Meloidogyne spp. - Tuyến trùng nội sinh và nửa nội sinh là: Tylenchus và Pratylenchus,… Tuyến trùng có thể gây tác hại trong thời kỳ vườn ươm nhưng chủ yếu là ở trên vườn trồng. Cây cà phê bị tuyến trùng thường sinh trưởng kém, mùa khô thường bị vàng héo, cây bị nặng có thể chết khô ngay ở trên lô trồng. Triệu chứng của tuyến trùng gây vết thương là làm cho rễ bị sưng u, có những đường nứt nẻ. Còn tuyến trùng gây nốt sần chỉ ở trên các rễ phụ có những u dạng nốt sần. Biện pháp phòng trừ: Những cây bị bệnh nặng nhổ đem đi đốt. Những vùng đã bị bệnh nặng cần luân canh với cây trồng khác, hoặc cải tạo đất bằng cây phân xanh ít nhất từ 2 - 3 năm sau mới trồng lại cà phê. Con đường chọn lọc giống chống bệnh dùng gốc ghép chống bệnh cũng thường được chú ý để phòng chống bệnh này. Những cây bị bệnh nhẹ tăng cường bón phân hữu cơ, có thể dùng một số loại thuốc sau đây để bơm vào đất xử lý: Nemaphos, Teracur, Nemagon, Methylbromid. Cây cúc vạn thọ cũng là cây có khả năng diệt tuyến trùng. Trồng cây này trong vùng cây bị bệnh hoặc xung quanh gốc cây cà phê để chúng tiết ra các chất diệt tuyến trùng trong đất hoặc ở vùng xung quanh bộ rễ của nó. Có th ể đem băm thân và rễ cây cúc vạn thọ sau đem vùi vào gốc cà phê. b, Bệnh thối rễ Một số loại nấm ở trong đất thuộc chi Rhizoctonia, Fusarium... tấn công gây tác hại vào bộ rễ của cây cà phê. Triệu chứng: Trên các rễ ngang, chóp rễ, phần rễ đuôi chuột xuất hiện những vết thối mềm có màu thâm đen. Cây bị bệnh sinh trưởng cằn cỗi, lá vàng, héo, cây bị nặng sẽ bị chết [19]. Biện pháp phòng trừ: Chú ý tới biện pháp thâm canh, tăng cường bón phân hữu cơ, cải thiện đặc điểm lý và hóa tính của đất đặc biệt là giảm độ chua của đất. Hiện nay chưa có những loại thuốc hóa học để phòng trừ bệnh thối rễ có hiệu quả [11].
7 1.2. TUYẾN TRÙNG THỰC VẬT VÀ TUYẾN TRÙNG HẠI CÂY CÀ PHÊ 1.2.1. Cấu tạo và phân loại tuyến trùng thực vật Tuyến trùng thực vật là nhóm động vật không xương sống có đặc điểm sinh thái thích nghi với đời sống ký sinh ở thực vật. Nhóm tuyến trùng này có một số đặc trưng quan trọng so với nhóm ký sinh ở động vật và các nhóm sinh thái khác, như có kích thước hiển vi, phần miệng có cấu tạo kim hút chuyển hóa để châm chích mô thực vật và hút chất dinh dưỡng, kích thước của trứng lớn hơn kích thước của cơ thể, đời sống của chúng có quan hệ bắt buộc và trực tiếp với thực vật đang phát triển. Trong đó, cấu tạo kim hút chuyển hóa là khác biệt quan trọng nhất. Về mặt phân loại học, tuyến trùng ký sinh thực vật gồm 4 nhóm liên quan đến 4 bộ tuyến trùng là: Bộ Tylenchida (chỉ trừ một số loài tuyến trùng họ Tylenchidae); Bộ Aphelenchida; Các loài tuyến trùng họ Longidoridae của bộ Dorylaimida; Các loài tuyến trùng họ Trichodoridae thuộc bộ Triplonchida. Trong các nhóm ký sinh trên thì nhóm loài thuộc bộ Tylenchida là nhóm tuyến trùng ký sinh đông đảo nhất và có tầm quan trọng nhất đối với sản xuất nông nghiệp. Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh ở tất cả các phần của thực vật đang phát triển, hoa, lá, hạt, thân và rễ, trong đó rễ là nơi gặp nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh nhất. Tuyến trùng ký sinh thực vật có những tập quán dinh dưỡng rất khác nhau, một số loài dinh dưỡng trên những mô ngoài của thực vật, một số khác thâm nhập vào các mô sâu hơn, và một số khác có thể làm cho cây chủ tạo ra những nguồn dinh dưỡng đặc biệt tại nơi chúng ký sinh. Tác hại do tuyến trùng gây ra đối với thực vật thường là tương đối nhẹ, tuy nhiên khi mật độ lớn chúng có thể gây hại nghiêm trọng, thậm chí chúng có thể gây chết thực vật. Ngoài ra, một vài tuyến trùng có thể làm giảm khả năng của thực vật trong việc kháng lại sự xâm nhập của các tác nhân vi sinh vật gây bệnh khác và làm cho tác hại của chúng đối với thực vật càng trầm trọng thêm. Một số tuyến trùng ký sinh chuyển hóa có khả năng lan truyền virus gây bệnh cho thực vật. Tuyến trùng ký sinh có thể làm giảm 12,5% sản lượng cây trồng và thiệt hại do tuyến trùng ký sinh đối với cây trồng nông nghiệp ước tính hàng trăm tỷ đô la Mỹ mỗi năm.
8 Về hình thức ký sinh trên thực vật, tuyến trùng có thể phân thành 3 nhóm ký sinh như sau: - Ngoại ký sinh: tuyến trùng không xâm nhập vào bên trong mô thực vật mà bám bên ngoài bề mặt của rễ, dinh dưỡng của tuyến trùng bằng việc sử dụng kim chích châm chích và hút chất dinh dưỡng trong tế bào thực vật. - Bán nội ký sinh: chỉ phần đầu của tuyến trùng xâm nhập vào trong rễ, còn phần sau cơ thể tuyến trùng vẫn ở ngoài đất. - Nội ký sinh: toàn bộ tuyến trùng xâm nhập vào bên trong rễ. Nhóm này được chia thành 2 nhóm nhỏ: + Nội ký sinh di chuyển: tuyến trùng vẫn giữ khả năng di chuyển trong mô thực vật và chúng chuyển động từ mô này đến mô khác để hút dinh dưỡng. + Nội ký sinh cố định: sau khi xâm nhập vào rễ, tuyến trùng dinh dưỡng tại một nơi cố định tạo nên các tế bào dinh dưỡng, chúng mất khả năng di chuyển và trở nên phình to ra (béo phì). 1.2.2. Thành phần các loài tuyến trùng gây hại cây cà phê Theo White T., thì thành phần tuyến trùng kí sinh hại cà phê gồm các loài như sau: Bảng 1.1. Thành phần các loài tuyến trùng ký sinh hại cà phê [12]. Loài Cà phê chè Cà phê vối (Coffea arabica Line) (Coffea canephora Line) Nội kí sinh ∗Meloidogyne sp. , ∗Meloidogyne sp., (endoparasit) M.africana, M. megadora. M. exigua, ∗Pratylenchus sp., M. coffeicola, P. brachyurus, M. decalineata, P. coffea. M. megadora. ∗Radopholus similis ∗Pratylenchus sp., P. coffea. ∗ Radopholus similis ∗ Rotylenchulus reniformis Bán ký sinh ∗Ditylenchus procerus. * Ditylenchus procerus. (semi – ∗ Helicotylenchus erythrinea. ∗Helicotylenchus erythrinea. ectoparasit) và ∗ Paratylenchus besoekianus, ngoại sinh Paratylenchus acrophallus. (ectoparasit) ∗ Trichodorus christiae, T. monchystera . ∗ Xiphinema mericantum, X.brevicola, X.insigne, X.radicicola
9 1.2.3. Tình hình tuyến trùng hại cây cà phê ở Việt Nam Việc đẩy mạnh tái canh, thay thế vườn cây già cỗi đang đứng trước không ít trở ngại cho ngành cà phê Việt Nam do chi phí trong quá trình tái canh cao, tỷ lệ sâu bệnh nhiều, đặc biệt nghiêm trọng là bệnh tuyến trùng hại rễ - một trong những khó khăn chính ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất cà phê trên thế giới. Các nhóm tuyến trùng phổ biến nhất và gây hại nhiều nhất trên cà phê là Meloidogyne và Pratylenchus. Tại Việt Nam các loài tuyến trùng Pratylenchus coffea, Meloidogyne spp. và Radopholus arabocoffea được biết đến là tác nhân chính gây hại cho 24%, 9% and 12% các mẫu rễ cà phê được phân tích. Tại Việt Nam vào những năm 1970, tuyến trùng Pratylenchus coffeae đã làm suy yếu và chết hàng loạt các vườn cà phê chè tại Phủ Quỳ - Nghệ An. Đến năm 1994, hiện tượng vàng lá do các bệnh hại rễ xuất hiện phổ biến tại một số tỉnh trồng cà phê của tỉnh Đăk Lăk và sau đó là các vùng trồng khác của Tây Nguyên, gây hại hàng trăm ha cà phê tại Đăk Lăk. Năm 1997, ở Đăk Lăk có trên 3.000 ha cà phê bị vàng lá, trong đó có gần 50% diện tích vàng lá do các bệnh hại rễ. Gần đây nhất, trong năm 2008 tại vùng Phủ Quỳ - Nghệ An đã có gần 100ha cà phê chè Catimor được trồng lại trên đất cà phê được thanh lý cũng đã bị tuyến trùng gây hại và chết hàng loạt. Tuyến trùng có thể gây tác hại trong thời kỳ vườn ươm nhưng chủ yếu là ở trên đồng ruộng. Cây cà phê bị tuyến trùng thường sinh trưởng kém, mùa khô thường bị vàng héo, cây bị nặng có thể chết khô ngay ở trên lô trồng. Triệu chứng của tuyến trùng gây vết thương là làm cho rễ bị sưng u, có những đường nứt nẻ. Còn tuyến trùng gây nốt sần chỉ ở trên các rễ phụ có những u dạng nốt sần [13]. Việc phòng trừ nhóm tuyến trùng gây hại rất khó khăn ngay cả khi sử dụng các biện pháp hóa học, sinh học. Ngoài ra các biện pháp canh tác để hạn chế nhóm tuyến trùng được sử dụng như việc để đất hoang hóa một thời gian dài trước khi canh tác mới hay luân canh đều không mang lại hiệu quả cao do ảnh hưởng trực tiếp đến thu nhập kinh tế của người trồng cà phê. Đây là vấn đề nan giải đòi hỏi các biện pháp giải quyết triệt để nhằm đảm bảo sự phát triển ổn định và bền vững của ngành cà phê Việt Nam [14].
10 Các nghiên cứu gần đây cho thấy chất đất và hệ vi sinh vật tồn tại trong đất là một trong những nguyên nhân cơ bản tác động đến sự phân bố của tuyến trùng. Số lượng và thành phần của tuyến trùng khác nhau trong các mẫu đất có đặc điểm khác nhau P. Q. Trinh và đồng sự [15] đã xác định rằng tuyến trùng thuộc nhóm Meloidogyne spp. được tìm thấy nhiều trong đất sét, trong khi nhóm tuyến trùng R. Arabocoffeae tập trung chủ yếu trong đất cát và đất mùn và Pratylenchus spp. tồn tại với số lượng lớn trong đất cát. Nhóm tác giả này cũng chỉ ra rằng trong điều kiện nhà kính vi khuẩn Pasteuria penetrans có khả năng hạn chế đáng kể số lượng tuyến trùng trong đất trồng cà phê. Theo thống kê của Viện Khoa học kỹ thuật nông- lâm nghiệp Tây Nguyên hiện có khoảng 30% diện tích trồng cà phê đang già cỗi cần phải tái canh, tập trung chủ yếu tại Đắk Lắk và Lâm Đồng. Đắk Lắk hiện có trên 185.000 ha cà phê, sản lượng hàng năm đạt 380.000 tấn cà phê nhân. Tuy nhiên, 51% diện tích cà phê ở tỉnh này có độ tuổi trên 15 năm, nên trong 5-10 năm nữa, cây sẽ bị “lão hóa”, hết chu kỳ kinh doanh cho hiệu quả, phải cưa đốn, phục hồi, hoặc tái canh. Diện tích cà phê già cỗi cần phải trồng thay thế và chuyển đổi trong 5 - 10 năm tới nếu không sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất và chất lượng của cà phê Việt Nam. Thực tế đã được chứng minh trong thực tiễn sản xuất cà phê ở Đắk Lắk: Một số diện tích cà phê đã già cỗi hoặc bị sâu bệnh hại đã hủy đi để trồng lại. Các diện tích này do không được luân canh với những cây trồng khác mà sau khi nhổ cây cày bừa làm đất lại đem trồng mới cà phê ngay. Hậu quả là các diện tích này khi bước sang năm thứ 2 thì đã có một số cây vàng héo rồi chết, sang năm thứ 3 tỷ lệ cây chết tăng lên và cuối cùng phải hủy cả vườn cây. Một số vườn cây chỉ hủy bỏ một vài cây xấu, bị sâu bệnh đem trồng cây con cà phê ngay nhưng sau từ 2 đến 3 năm những cây trồng lại này cũng già cỗi, vàng héo rồi chết. Các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy nhiều loại sinh vật gây hại cho cà phê như tuyến trùng, nấm, rệp sáp, mối…Ngoài ra chế độ dinh dưỡng và chế độ canh tác cũng ảnh hưởng đến cây cà phê. Để có thể tái canh bền vững phải phòng trừ được các yếu tố này. Theo Nguyễn Văn Tuất và cộng sự [16], khi nghiên cứu nguyên nhân gây vàng lá, chết cây ở nhóm cà