ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -------------------------------
TRẦN PHÚ CƯỜNG
NGHIÊN CỨU MỐI TƯƠNG QUAN ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA GENE POU1F1 ĐẾN TÍNH TRẠNG SINH TRƯỞNG CỦA DÊ NẢN ĐỊNH HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR- RFLP
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thái Nguyên - 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -------------------------------
TRẦN PHÚ CƯỜNG
NGHIÊN CỨU MỐI TƯƠNG QUAN ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA GENE POU1F1 ĐẾN TÍNH TRẠNG SINH TRƯỞNG CỦA DÊ NẢN ĐỊNH HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR- RFLP Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Bằng Phương
Thái Nguyên – 2019
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu có
nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng quy tắc. Kết quả trình bày trong luận văn
được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng được ai công
bố trước đây.
Thái Nguyên, tháng năm 2019
Tác giả
Trần Phú Cường
ii
LỜI CẢM ƠN
Luận văn này được thực hiện tại bộ môn Sinh Học Phân Tử, Viện khoa học Sự
sống, Trường Đại học Nông lâm- Đại học Thái Nguyên. Để hoàn thành được luận
văn này em đã nhận được sự động viên, giúp đỡ tận tình của rất nhiều cá nhân và
tập thể.
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Bằng
Phương người đã trực tiếp hướng dẫn em rất tận tình trong quá trình thực hiện
đề tài, giúp em hoàn thành tốt luận văn này.
Em xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học- Công nghệ thực
phẩm, các cán bộ trong Trường ĐH Nông Lâm- ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ, tạo
điều kiện cho em trong quá trình học tập.
Cuối cùng em xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã giúp đỡ
động viên và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn!
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC CỤM TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ............................................................................... vii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1
2. Mục tiêu .............................................................................................................. 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ................................................................ 3
1.1.1. Nguồn gốc của dê ..................................................................................... 3
1.1.2. Vị trí phân loại của dê .............................................................................. 4
1.1.3. Một số đặc điểm sinh học của dê ............................................................. 5
1.1.4. Giới thiệu về dê Nản ................................................................................. 6
1.2. Tình hình chăn nuôi dê trên thế giới và ở Việt nam ........................................ 8
1.2.1. Tình hình chăn nuôi dê trên thế giới ........................................................ 8
1.2.2. Tình hình chăn nuôi dê ở Việt Nam ......................................................... 9
1.2.3. Phương hướng phát triển chăn nuôi dê ở Việt Nam ............................... 10
1.3. Cơ sở khoa học của đề tài .............................................................................. 11
1.3.1. Khái niệm đa hình gen ............................................................................ 11
1.3.2. Gene POU1F1 ........................................................................................ 12
1.3.3. Đa hình gen và mối tương quan với các tính trạng sinh trưởng của dê . 15
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 16
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................ 16
2.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất nghiên cứu ...................................................... 16
2.2.1. Dụng cụ nghiên cứu ................................................................................ 16
2.2.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu ............................................................. 16
iv
2.3. Nội dung nghiên cứu...................................................................................... 17
2.3.1. Nội dung 1 .............................................................................................. 17
2.3.2. Nội dung 2 .............................................................................................. 17
2.3.3. Nội dung 3 .............................................................................................. 17
2.3.4. Nội dung 4 .............................................................................................. 18
2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 18
2.4.1. Nội dung 1 .............................................................................................. 18
2.4.2. Nội dung 2 .............................................................................................. 18
2.4.3. Nội dung 3 .............................................................................................. 21
2.4.4. Nội dung 4 .............................................................................................. 22
2.5. Các phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 22
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 23
3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái của dê địa phương Định Hóa .......... 23
3.2. Kết quả phân tích đa hình chiều dài đoạn gene POU1F1 ............................. 24
3.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của một số mẫu dê địa phương Định
Hóa .................................................................................................................... 24
3.2.2. Kết quả PCR khuếch đại gene POU1F1 bằng cặp mồi đặc hiệu ............ 26
3.2.3. Kết quả Cắt đoạn gene POU1F1 bằng enzyme DdeI ............................. 27
3.3. Kết quả Phân tích mối tương quan đa hình di truyền gen POU1F1 liên quan
đến tính trạng sinh trưởng của dê ......................................................................... 31
3.4. Kết quả giải trình tự và xác định sự sai khác di truyền giữa dê Nản Định Hóa
và một số giống dê khác. ...................................................................................... 34
3.4.1. Kết quả giải trình tự gene POU1F1 ........................................................ 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 37
1. Kết luận ............................................................................................................. 39
2. Kiến nghị........................................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 40
v
DANH MỤC CỤM TỪ VIẾT TẮT
Từ - Thuật ngữ viết tắt Nghĩa của từ - thật ngữ
DNA: Deoxyribonucleic acid
RNA: Ribonucleic acid
PCR: Polymerase chain Reaction
RFLP: Reaction Fragment Length Polymorphism DNA
bp: Base paire
Kb: Kilo base
Taq: Thermus aquaticus
Rpm: Revolutions Per Minute
dNTP: Deoxyribonucleotide Triphosphate
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Số lượng Dê trên thế giới và các nước trên khu vực .................................. 8
Bảng 2.1: Danh mục các thiết bị ............................................................................... 16
Bảng 2.2: Danh mục hóa chất ................................................................................... 17
Bảng 2.3: Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR ................................. 20
Bảng 2.4:Thành phần của một phản ứng PCR .......................................................... 20
Bảng 2.5: Thành phẩn phản ứng cắt gene POU1F1 bằng enzyme DdeI .................. 21
Bảng 2.6: Vị trí cắt của enzyme giới hạn .................................................................. 21
Bảng 2.7: Tỷ lệ kiểu gene POU1F1 ở dê Nản........................................................... 21
Bảng 3.1. Kích thước một số chiều đo của dê địa Định Hóa .................................... 23
Bảng 3.2: Tỷ lệ kiểu gene POU1F1 ở dê Nản .......................................................... 29
Bảng 3.3: Sự khác nhau về tần số allele gene POU1F1 giữa các giống dê .............. 30
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của đa hình gen POU1F1 đến sinh trưởng của dê địa
phương Định Hóa .................................................................................. 31
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của đa hình gen POU1F1 đến sinh trưởng của dê đực
và dê cái địa phương Định Hóa ............................................................. 32
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1: Một số hình ảnh Dê ..................................................................................... 3
Hình 1.2: Tập tính ăn uống của Dê ............................................................................. 5
Hình 1.3: Dê Nản ở xã Bộc Nhiêu huyện Định Hóa ................................................... 7
Hình 1.4: sơ đồ mô phỏng các allele của gene POU1F1 .......................................... 13
Hình 1.5: Sơ đồ mô phỏng các kiểu gene của gene POU1F1 ................................... 14
Hình 1.6: Đoạn gene POU1F1 và vị trí cắt của enzyme DdeI .................................. 14
Hình 2.1: Chu kì nhiệt độ của phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gene POU1F1 ...... 20
Hình 3.1: Kết quả tách chiết DNA tổng số 10 mẫu dê Nản ...................................... 24
Hình 3.2: Kết quả tách chiết DNA tổng số 15 mẫu dê Nản ...................................... 25
Hình 3.3: Kết quả tách chiết DNA tổng số 5 mẫu dê Nản ........................................ 25
Hình 3.3: Sản phẩm PCR khuyếch đại từ cặp mồi POU1F1 .................................... 26
Hình 3.4: Sản phẩm PCR khuyếch đại từ cặp mồi POU1F1 .................................... 26
Hình 3.5: Sản phẩm PCR khuyếch đại từ cặp mồi POU1F1 .................................... 27
Hình 3.6: Kết quả phân tích đa hình đoạn gene POU1F1 bằng enzyme DdeI ......... 27
Hình 3.7: Kết quả phân tích đa hình đoạn gene POU1F1 bằng enzyme DdeI ......... 28
Hình 3.8: Kết quả phân tích đa hình đoạn gene POU1F1 bằng enzyme DdeI ......... 28
Biểu đồ 1: Biểu đồ tỷ lệ phần trăm các kiểu gene POU1F1 ..................................... 29
Biểu đồ 2: Biểu đồ tần số allele của gene POU1F1 .................................................. 30
Biểu đồ 3: Biểu đồ kết quả so sánh tần số allele gene POU1F1 giữa dê Nản và
2 loài dê Trung Quốc ............................................................................... 31
Biểu đồ 4: Biểu đồ khối lượng dê đực số 2,dê cái số 3 kiểu Gene D1D1 qua
các giai đoạn tuổi (ss, 1, 3, 6, 12 tháng tuổi) ........................................... 33
Biểu đồ 5: Biểu đồ khối lượng nhóm dê đực số 1, dê cái số 12 kiểu Gene
D1D2 qua các giai đoạn tuổi (ss, 1, 3, 6, 12) ............................................ 33
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Chăn nuôi dê là một ngành có vị trí quan trọng trong ngành chăn nuôi gia súc
ở nước ta hiện nay, vì đó là một nguồn cung cấp thực phẩm với tỷ trọng tương đối
cao và chất lượng tốt cho con người, là nguồn cung cấp phân bón cho ngành trồng
trọt và là nguồn cung cấp các sản phẩm phụ như sữa, da, mỡ, thịt... cho ngành công
nghiệp chế biến khác.`
Chăn nuôi dê ở Việt Nam đã có từ lâu đời nhưng chủ yếu theo phương thức
nhỏ lẻ, không tập trung, quy mô hộ gia đình. Theo số liệu của Tổng Cục thống kê
năm 2000: Tổng đàn dê của cả nước là 525.000 con, trong đó chủ yếu là giống dê
nuôi lấy thịt, phân bố chủ yếu ở các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc. Một trong
số những giống dê địa phương được kể đến là giống dê Nản vùng núi đá huyện
Định Hóa, tỉnh Thái Nguyên.
Định Hóa là huyện miền núi phía tây bắc của tỉnh Thái Nguyên với địa hình
chiếm phần lớn là đồi núi các dãy núi đá vôi hiểm trở, rất phù hợp với việc chăn thả
dê, đặc biệt là với dê Cỏ. Chính vì thế ở huyện Định Hóa hay nói chính xác hơn là
khu vực quanh dãy núi Nản ở đây người dân đã có truyền thống lâu đời về chăn
nuôi dê, nên ở đây đã hình thành giống dê Nản mang thương hiệu riêng của khu
vực. Về giá trị thương phẩm, chất lượng thịt dê Nản tốt, thơm ngon, tỷ lệ nạc cao,
giá trị dinh dưỡng cao, hàm lượng Cholesterol thấp, tốt cho sức khỏe của con người.
Tuy nhiên hiện nay số lượng dê Nản thuần chủng hiện đang giảm mạnh xuống mức
đáng lo ngại, do vậy cần có những biện pháp để cải thiện nguồn gene sinh trưởng,
sinh sản và phát triển loài dê này nhằm mục đích bảo tồn cũng như phát triển quy
mô chăn nuôi để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ của thị trường.
Trên thế giới hiện đã có rất nhiều nghiên cứu về việc chọn lọc giống vật nuôi
bằng chỉ thị phân tử. Trong đó có các nghiên cứu về gene POU1F1 đã chỉ ra tính
tương quan mật thiết giữa các gene này với mức độ sinh trưởng và phát triển của
loài dê cũng như các loài động vật có vú khác.
2
Xuất phát từ vấn đề thực tiễn trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên
cứu mối tương quan đa hình di truyền của gene POU1F1 đến tính trạng sinh
trưởng của Dê Nản Định Hóa bằng phương pháp PCR- RFLP”
2. Mục tiêu
2.1. Mục tiêu chung
Phân tích đa hình di truyền gene POU1F1 của dê Nản Định Hóa.
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Đánh giá đặc điểm hình thái của dê Nản Định Hóa
- Phân tích đa hình chiều dài đoạn gene POU1F1 trên dê Nản.
- Phân tích mối tương quan giữa gene POU1F1 với tính trạng sinh trưởng của
dê Nản Định Hóa.
- Giải trình tự gene POU1F1
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Đánh giá được đa hình kiểu gene POU1F1 của dê Nản Định Hóa.
- Đánh giá được mối tương quan giữa gene POU1F1 với tính trạng sinh
trưởng của dê Nản Định Hóa.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả phân tích đa hình di truyền sẽ tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp
theo sau đó nhằm ứng dụng các kĩ thuật – công nghệ hiện đại, tiên tiến vào công tác
chọn lọc giống vật nuôi có khả năng đem lại giá trị lợi nhuận kinh tế cao, duy trì
giống thuần chủng, phục vụ nhu cầu thị trường và phát triển kinh tế của khu vực
cũng như trên toàn quốc.
3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
1.1.1. Nguồn gốc của dê
Dê là một trong những loài động vật được thuần hóa từ rất lâu đời và được con
người nuôi cách đây hơn hai vạn năm, trong đó các nước Trung Đông, Ấn Độ nuôi
từ rất sớm. Các tác giả Trần Kiên và cs. (1995) cho rằng dê được thuần hóa từ 3
trung tâm.
- Trung tâm cổ nhất là trung tâm Cận Á - Ấn Độ, giống dê ở đây giống với dê
sừng xoắn (Capra Falconeri) hiện còn sống ở miền tây Hymalaya, Kasơmia,
Afganistan, loài dê này có sừng xoắn lên trên.
- Trung tâm Cận Á có giống dê với nguồn gốc từ loài dê rừng (Capra
Aegagrus), hiện còn sống ở miền Tây Ấn Độ, Cáp Ca, Tiểu Á và quần đảo Hy Lạp.
Loài này có sừng dẹp xuôi xuống 2 bên vai và cong về phía sau.
- Trung tâm Đông Nam Á là trung tâm mới nhất, việc nuôi dê bắt đầu từ thời
kỳ đồ đồng. Nơi đây là nguồn gốc của các loài dê núi (Capra Prisca). Sừng của loài
dê này cong về phía sau, đi sang hai bên và hơi xoắn một chút. Giống dê này sau
khi được thuần hóa thì được nuôi phổ biến ở Châu Âu, Châu Á và Châu Phi [2].
Hình 1.1: Một số hình ảnh Dê
4
Theo một số tài liệu khác, dê nhà đã xuất hiện khoảng 6 – 7 nghìn năm trước
Công nguyên. Khó xác định chính xác thời điểm mà con người thuần dưỡng loài dê
và chỉ có thể cho rằng sự thuần dưỡng dê đã xảy ra ở vùng Tây Á hoặc quanh vùng
này. Phần lớn những dê rừng này có bộ lông đen, có lông dài ở khuỷu chân, từ đây
dê được nuôi phổ biến sang các vùng. Việc nghiên cứu nguồn gốc của dê, ngoài ý
nghĩa về lý luận còn có ý nghĩa thực tiễn rất lớn. Bởi vì sự hiểu biết về những biến
đổi lịch sử của động vật sẽ giúp cho việc sử dụng các cá thể hoang dã đã thuần hóa
để lai khác loài và tạo ra những giống mới phù hợp với yêu cầu của thực tiễn sản
xuất hơn [1].
Nhiều nhà khoa học ở các nước khác nhau đã nghiên cứu về nguồn gốc của dê
nhà, tuy còn nhiều ý kiến khác nhau nhưng đại đa số các nhà khoa học cho rằng dê
là một trong những loại vật nuôi được thuần hóa sớm nhất.
Người ta cho rằng dê nhà ngày nay (Capra hircus) có nhiều nguồn gốc khác
nhau. Tổ tiên trực tiếp của dê nhà gồm 2 nhóm dê rừng chính:
+ Dê rừng Bezoar (Capra aegagrus) được tìm thấy ở Iran và các nước vùng
tiểu Á, là tổ liên của phần lớn dê nhà đang được nuôi ở châu Á và châu Âu. Nó
được coi là nhóm tổ tiên thứ nhất của dê nhà. Dê thuộc nhóm này có sừng thẳng
nhưng xoắn vặn.
+ Dê rừng Markhor (Capra Falconeri), nhóm này có sừng cong vặn về phía
sau và được coi là nhóm tổ tiên thứ 2 của dê nhà, còn thấy ở vùng núi Hymalaya và
đang được nuôi nhiều ở hai bên sườn phía Đông là Tây của dãy núi này. Nhóm
Markhor phân bố ở Afghanistan và vùng Kashimir – Karakorum.
Hiện nay, người ta thấy rằng khu vực nuôi dê lâu đời nhất là các nước Trung
Đông, sau đó đến Ấn Độ và Ai Cập, tiếp đến là các nước châu Âu, châu Á và châu
Phi. Khu vực nuôi dê mới nhất là Đông Nam Á [6].
1.1.2. Vị trí phân loại của dê
Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng dê nhà có tên khoa học là: Caprahicus. Về
phân loại động vật học, dê thuộc giới động vật (Animalia), ngành động vật có dây
sống (Chordata), phân ngành động vật có xương sống (Vertebrata), lớp động vật có
vú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), họ trâu bò (bovidae), họ phụ dê cừu
(capra rovanae), thuộc loài dê (Capra) [6].
5
Tuy con dê được xếp cùng trong họ phụ dê cừu nhưng nó khác hẳn cừu không
chỉ ở ngoại hình, mà dê còn khác về tập tính hoạt động như thích leo trèo núi đá, ăn
được rất nhiều loại lá cây mà trâu bò không ăn được.
Dê là con vật hiếu động, dễ dàng di chuyển và có thể sử dụng những diện tích
đồng cỏ rộng, bởi vậy nhiều nước nuôi dê chủ yếu theo phương pháp chăn thả trên
đồng cỏ [4].
1.1.3. Một số đặc điểm sinh học của dê
1.1.3.1. Đặc điểm ngoại hình
Quan sát đặc điểm ngoại hình cho thấy cơ thể dê có góc cạnh, có râu ở các con
đực và con cái. Sừng dê có 2 gốc sừng sần sát nhau và liền choãi ra, mặt cắt ngang
sừng dê có hình tam giác. Lông của dê có nhiều màu khác nhau và rất đa dạng: màu
trắng, đen, xám, ánh nâu, khoang…[6]
1.1.3.2. Tập tính sinh hoạt của dê
+ Tập tính ăn uống:
Dê khác hẳn cừu về tiếng kêu cũng như về tập tính sinh hoạt. Dê thường tập
trung ăn uống thành bầy nhỏ lẻ, ưa những vùng có núi đá cao, khô ráo, thích ăn
những loại thức ăn có hoa cành lá và các cây lùn, cây bụi, cây họ đậu thân gỗ...Dê
rất nhanh nhẹn và hiếu động, chúng di chuyển rất nhanh khi ăn xung quanh cây.. Dê
thích ăn lá cây ở độ cao 0,2 – 1,2m, chúng có thể đứng rất lâu để bứt lá [6].
Hình 1.2: Tập tính ăn uống của Dê
6
Dê thường chọn loại thức ăn nào mà chúng thích ăn nhất, không ăn lại thức ăn
rơi vãi của trâu bò. Chúng có thể ăn lượng thức ăn bằng từ 2 – 4% khối lượng cơ
thể chúng.
+ Tính nết của Dê
Dê là con vật có tính khí thất thường, hiếu động, ương bướng và cũng rất khôn
ngoan. Dê rất phàm ăn nhưng luôn tìm thức ăn mới. Dê leo chèo rất giỏi và ưa mạo
hiểm. Dê chọi nhau rất hăng không chỉ ở con đực mà còn ở cả con cái, chúng
thường dùng sừng húc vào mặt hoặc bụng đối thủ.
+ Tập tính bầy đàn
Dê thường sống tập chung thành bầy đàn, mỗi con có một vị trí riêng trong
đàn, con có vị trí thấp phải phục tùng con có vị trí cao hơn.
Trong đàn, con đầu đàn sẽ dẫn đầu khi ăn. Chúng thích ngủ nghỉ trên những
mô đất hoặc đá phẳng [3].
1.1.4. Giới thiệu về dê Nản
Dê Nản là giống dê địa phương được nuôi ở vùng núi đá thuộc các xã ở huyện
Định Hóa tỉnh Thái Nguyên (thường gọi là Nản đa). Dãy núi đá này dài trên 20 km,
cao từ 50m đến trên 200m qua 3 xã ( Kim Phượng, Phượng Tiến, Trung Hội), thị
trấn . Dê Nản thường leo trèo kiếm ăn tận sườn núi Nản, bám cả vào vách đá, hẻm
núi, đồi thấp, nơi đang có nhiều cây thuốc và cả các loại cây xanh dưới chân núi.
Một trong những vấn đề hạn chế cơ bản của dê Nản là sinh trưởng và tầm vóc.
Đã có nhiều giải pháp đưa ra để cải tạo sinh trưởng và tầm vóc của dê Nản, trong đó
chủ yếu là cho lai với dê ngoại. Phương pháp này đã đem lại những hiệu quả tích
cực trong cải tạo về tầm vóc của dê, tuy nhiên lại dẫn đến một số vấn đề đó là chất
lượng thịt và khả năng thích nghi với điều kiện của địa phương. Hiện nay, việc chọn
giống dựa trên chỉ thị sinh học phân tử nhằm nâng cao hiệu quả chọn lọc ngay từ
giai đoạn sơ sinh đã và đang mở ra những triển vọng mới, góp phần quyết định sớm
tiềm năng của con vật và giữ lại được những đặc điểm quý vốn có.
+ Đặc điểm ngoại hình:
Một số đặc điểm cơ bản của dê Nản Định Hóa qua khảo sát ban đầu cho thấy,
về ngoại hình dê Nản có màu lông khá đa dạng. Tầm vóc nhỏ, mắn đẻ, nhưng số
7
con đẻ ra/lứa lại thấp, tỷ lệ nuôi sống đến cai sữa không cao bằng những giống dê
khác. Theo khảo sát ban đầu dê Nản có thân hình thấp nhỏ so với các giống dê
ngoại nhập. Khối lượng cơ thể sơ sinh khoảng 1,7-1,9 kg. Dê Nản trưởng thành chỉ
đạt từ 25 -30 kg/con. Tính trung bình thì dê đực nặng khoảng 25 kg, và dê cái nặng
khoảng 20 kg. Dê Nản có đầu to, đôi tai nhỏ, ngắn và dựng đứng lên, cặp sừng cũng
ngắn, sắc lông màu trắng hoặc đen, có con khoang trắng đen hoặc màu cánh gián,
cổ ngắn có bờm và có râu cằm. Hình 1.3 là hình ảnh của dê Nản được chụp tại xã
Bộc Nhiêu huyện Định Hóa.
Hình 1.3: Dê Nản ở xã Bộc Nhiêu huyện Định Hóa
+ Chế độ ăn uống
Qua quan sát ban đầu Dê Nản ăn nhiều loại cỏ, lá và cành non của nhiều loại
cây đặc biệt là cây họ đậu, các loại củ quả và hạt ngũ cốc, các phụ phẩm nông
nghiệp. Người ta nuôi dê Nản theo phương thức chăn thả trên núi vào ban ngày,
nhốt vào chuồng từ chiều tối. Mỗi ngày cho mỗi con dê ăn thêm khi đã về chuồng 1
– 2 kg cỏ non và lá cây họ đậu, 200 - 300g thức ăn tổng hợp (cám gạo, bột ngô, bột
săn, bột đậu tượng trộn với một chút muối). Đối với dê cái đang chửa thì tăng 1,5
lần, dê cái đang nuôi con thì tăng gấp 2 - 3 lần lượng thức ăn thêm đó. Mỗi con dê
đực giống mỗi ngày cho ăn khoảng 3,5 - 4,0 kg lá cỏ tươi, 1 - 1,5 kg lá ngô hoặc lá
đậu hoặc lá những cây họ đậu khác giàu chất đạm và 0,3 - 0,4 kg thức ăn tinh.
8
+Tập tính sinh sản:
Dê Nản thành thục sớm, tuổi phối giống lần đầu 6-7 tháng, đẻ 1,4 lứa/năm
và 1,3 con/lứa, khoảng 2 năm đẻ 3 lứa, mỗi lứa 1-2 con. Dê cái mang thai trung
bình từ 145 - 155 ngày là đẻ. Dê con lúc mới đẻ đến khi cai sữa mất khoảng 3
tháng. Dê cái non phải đạt 7 tháng tuổi và có trọng lượng xấp xỉ 24 kg mới cho
phối giống lần đầu
1.2. Tình hình chăn nuôi dê trên thế giới và ở Việt nam
1.2.1. Tình hình chăn nuôi dê trên thế giới
Theo số liệu thống kê của FAO – năm 2004, số lượng dê trong một số năm
gần đây như sau:
Số lượng dê trên thế giới và các khu vực từ năm 2001 – 2003
Bảng 1.1: Số lượng Dê trên thế giới và các nước trên khu vực
(Đơn vị tính: con)
Năm 2001 2002 2003 Khu vực
73.175.842 750.390.679 764.510.558 1. Toàn thế giới
2. Phân bố theo nhóm nước
Các nước phát triển 30.998.608 31.490.117 31.649.683
Các nước đang phát triển 706.177.234 718.849.562 732.860.875
3. Phân bố theo châu lục
Châu Á 464.344.462 474.179.766 487.588.456
Châu Âu 18.199.686 18.179.413 18.425.226
Châu Phi 217.614.386 219.399.142 219.736.486
Châu Mỹ La Tinh và Caribe 34.804.839 36.496.508 35.713.150
Số liệu trên cho thấy, số lượng dê của thế giới tăng dần qua các năm và đến
năm 2003 đạt 764.510.558 con. Trong đó đàn dê tập chung chủ yếu ở các nước
đang phát triển với số lượng 732.860.875 con (chiếm 95,86%) và được nuôi nhiều ở
Châu Á đạt 478.588.456 con (chiếm 63,78% tổng đàn dê của thế giới). Tiếp theo là
Châu Phi có 219.736.486 con (chiếm 28,74% tổng số lượng dê trên thế giới). Châu
9
Mỹ và Caribe có số lượng dê đứng thứ 3 (36.713.150 con – chiếm 4,8% tổng số
lượng dê trên thế giới).
Số liệu trên cũng cho thấy, chăn nuôi dê tập chung chủ yếu ở các nước đang
phát triển. Ở các nước đang phát triển, mặc dù có số lượng dê ít hơn nhưng chăn
nuôi với quy mô đàn lớn hơn, sử dụng phương thức nuôi tiên tiến với mục đích lấy
sữa, làm phomat, do có hiệu quả kinh tế cao [2].
1.2.2. Tình hình chăn nuôi dê ở Việt Nam
Ở Việt Nam, nghề chăn nuôi dê đã có từ rất lâu đời nhưng chủ yếu theo
phương thức quảng canh, tự cung tự cấp. Tới năm 2000, theo số liệu của cục thống
kê: Tổng đàn dê của cả nước là 525.000 con, trong đó chủ yếu là giống dê Cỏ (dê
địa phương), được phân bố tập trung ở các tỉnh miền núi và trung du phía Bắc.
Riêng đàn dê ở miền Bắc chiếm 72,5% tổng đàn, miền Nam chỉ chiếm 27,5%. Đàn
dê của các tỉnh vùng núi phía Bắc chiếm 67% tổng đàn dê của miên Bắc và 48%
tổng đàn dê cả nước.
Theo số liệu thống kê của FAO năm 2003, tổng đàn dê cả nước ta là 780.354
con, đã sản xuất ra được 6000 tấn thịt, tuy nhiên sản lượng sữa thấp và chỉ đạt 120
khoảng tấn.
Nhiều năm qua, ngành chăn nuôi dê của nước ta chưa được quan tâm, chú ý.
Người dân chăn nuôi dê chủ yếu theo phương thức quảng canh, tận đụng các bãi chăn
thả, thiếu kiến thức kỹ thuật. Giống dê chủ yếu là giống dê cỏ địa phương nuôi lấy thịt,
có nhiều màu sắc lông khác nhau và bị pha tạp nhiều, dê có tầm vóc bé, hiệu suất
chuyển hóa thức ăn thấp, hiện tượng suy thoái cận huyết cao, nuôi dưỡng kém, bệnh tật
phát sinh nhiều. Ở một số nơi tỷ lệ chết của dê con từ sơ sinh đến 12 tháng tuổi khá
cao, lên đến 40 % tổng số dê sinh ra [6].
Từ năm 1993, Nhà nước bắt đầu giao nhiệm vụ nghiên cứu và phát triển chăn
nuôi dê trong cả nước do Trung tâm nghiên cứu Dê và Thỏ Sơn Tây thuộc Viện
Chăn Nuôi – Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Từ đó đến nay nhiều công
trình nghiên cứu và chuyển giao kỹ thuật chăn nuôi dê về giống, thức ăn, thú y, chế
biến sản phẩm đã được tiến hành và thu dược những kết quả bước đầu rất tốt.
10
Với các chương trình nghiên cứu và đầu tư phát triển của Nhà nước như trên,
trong 10 năm qua ngành chăn nuôi dê nước ta đã có được nhũng bước phát triển
mạnh. Đặc biệt là việc thành lập Trung tâm nghiên cứu Dê và Thỏ [8].
* Những thuận lợi và khó khăn của nghề nuôi dê ở Việt Nam:
+ Thuận lợi:
- Nước ta có 9 triệu ha đồi trọc, núi đá, là nơi cây quán mộc phát triển rất thích
hợp cho việc chăn nuôi dê.
- Điều kiện khí hậu nóng ẩm của nước ta thích hợp cho cây cối phát triển
quanh năm, đây là điều kiện tốt để phát triển chăn nuôi dê lấy thịt và sữa.
- Hiện tại thị trường tiêu thụ sản phẩm từ dê đang trên đà phát triển.
- Vốn đầu tư cho chăn nuôi dê không lớn, tốc độ qay vòng vốn lại cao.
- Nuôi dê ít gặp được các rủi do bệnh dịch so với các loại vật nuôi khác.
+ Khó khăn:
- Do bản năng hoang dã, nghịch ngơm, ăn nhiều loại lá cây khác nhau nên dê
hay phá phách mùa màng, hoa màu, vì vậy ở vùng đồng bằng thường rất khó phát
triển chăn nuôi dê.
- Do phương thức chăn nuôi quảng canh, chăn nuôi dê chưa được đầu tư đúng
mức vì vậy tốc độ tăng trưởng thấp. Ở những nơi bãi chăn thả hẹp đàn dê không
phát triển được.
- Thị trường mua bán dê giống, dê thịt còn hạn hẹp.
- Kỹ thuật chăn nuôi dê còn chưa phổ biến rộng rãi, nhất là dê nuôi lấy sữa
còn là điều mới mẻ với người dân.
- Chăn nuôi dê cũng làm cho môi trường bị ô nhiễm nếu như người dân không
biết cách xử lý môi trường, do đó ít nhiều cũng gây ảnh hưởng đến cuộc sống của
con người [2].
1.2.3. Phương hướng phát triển chăn nuôi dê ở Việt Nam
- Tập trung khai thác có hiệu quả các bãi chăn thả tự nhiên, diện tích đất trống
đồi núi trọc, núi đá, ven rừng, khu vực ngoại ô thành phố để phát triển đàn dê theo
hướng hàng hóa.
11
- Chú trọng bảo vệ môi trường, tu bổ rừng, bảo vệ và khai thác rừng có kế
hoạch, đẩy mạnh kinh tế rừng vườn, tiếp tục cải thiện đời sống – văn hóa xã hội cho
nhân dân.
- Đẩy mạnh phát triển chăn nuôi dê ở khu vực hộ gia đình, mở rộng hình thức
liên doanh, khuyến khích phát triển trang trại nuôi dê ở các hộ có quy mô đàn lớn,
có kinh nghiệm chăn nuôi và có cơ sở vật chất kỹ thuật.
- Nâng cao chất lượng và số lượng đàn dê bằng cách:
+ Chọn lọc đàn cái nền và đực giống tốt tại các địa phương để nhân giống,
tránh đồng huyết, tạo đàn cái nền để lai tạo nâng cao tầm vóc và khả năng sản xuất
đàn dê trong nước.
+ Nhập những giống tốt của các nước theo hai hình thức: nhập tinh đông lạnh
và con giống theo hướng sản xuất sữa, thịt. Nuôi thích nghi nhân thuần và từng
bước tiến hành lai tạo với các giống dê trong nước để nâng cao khả năng sán xuất ra
sữa, thịt và tạo ra giống dê mới. Khuyến khích người chăn nuôi phát triển nuôi dê
sữa, kết hợp nuôi kinh doanh dê thịt cung cấp sản phẩm cho thị trường trong và
ngoài nước, cùng với việc tự sản xuất giống dê tại các vùng để cung cấp đủ cho
nông dân.
- Tăng cường ứng dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật vào sản xuất, đẩy mạnh
công tác khuyến nông, chuyển giao các tiến bộ kỹ thuật cho người chăn nuôi, dần dần
chuyển từ phương thức chăn thả tự do quảng canh sang phương thức chăn nuôi bán
công nghiệp và công nghiệp.
1.3. Cơ sở khoa học của đề tài
1.3.1. Khái niệm đa hình gen
Đa hình gene do alen quyết định, gene có nhiều alen thì tính đa hình càng cao.
Gregor Mendel (1856) định nghĩa alen như sau: “Alen là các dạng khác nhau của một
gene cùng quy định một tính trạng”. Từ sau năm 1925, sau khi Mogan thành công
trong việc lập bản đồ di truyền của ruồi giấm, thì alen được định nghĩa lại như sau:
“Alen là các dạng khác nhau của cùng một gene định vị trên một locus của cùng một
nhiễm sắc thể cùng quy định cùng một tính trạng nào đó ở cơ thể sinh vật”.
12
Sự đa hình DNA là những biến đổi trong trình tự DNA của một cá thể, sự biến
đổi đó có thể hoặc không thể ảnh hưởng lên kiểu hình. Sự biến đổi này thường được
phát hiện qua nhiều phương pháp sinh học phân tử khác nhau. Những biến đổi được
phát hiện có ảnh hưởng lên kiểu hình được xem như một marker đặc hiệu cho biến
đổi đó. Điều đó có nghĩa là nếu một cá thể có cùng sự đa hình đó, có thể sẽ biểu
hiện một vài đặc điểm tương tự khác [5].
1.3.2. Gene POU1F1
Các yếu tố phiên mã đặc hiệu tuyến yên POU1F1, còn gọi là domain POU,
lớp 1, yếu tố phiên mã 1 (Pit1, yếu tố hormone 1), là yếu tố phiên mã cho hormone
tăng trưởng, thuộc họ protein POU.
POU1F1 là 1 gene dài 450bp, nó mã hóa cho protein quy định sự biểu hiện
của 1 số gene liên quan đến sự phát triển và biểu hiện hormone tuyến yên (PRL và
GH) Gene POU1F1 có sự liên quan tích cực đến hoạt động sản xuất sữa, các tính
trạng sinh sản và các tính trạng trọng lượng của các động vật có vú.
POU1F1(Pit-1) là một chất điều chỉnh tích cực cho hormone tăng trưởng,
prolactin và hormone kích thích tuyến giáp, bằng cách liên kết với các promoter
DNA mục tiêu như là một dimer ở động vật có vú.
Protein POU1F1 có ba miền cấu trúc quan trọng: miền kích hoạt phiên mã N-
terminal (chủ yếu là mã exon thứ nhất, thứ hai và thứ ba của gen POU1F1), vùng
đặc thù POU (chủ yếu là mã exon thứ ba và thứ tư của gen POU1Fl) và vùng tương
đồng POU (chủ yếu là mã exon thứ năm và thứ sáu của gen POU1Fl). POU1F1 chủ
yếu được biểu hiện ở các tế bào tuyến yên trước. Chức năng chính của nó là điều
chỉnh sự phân hóa tế bào và sự phát triển và phát triển của động vật. Nó có thể nhận
ra chuỗi gen cụ thể và kết hợp với nó, dẫn đến sự phiên mã gen nội bào, phiên mã
và biểu hiện của hormone tăng trưởng, prolactin, và kích thích tuyến giáp hormone
tế bào B ở tuyến yên trước, ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, phát triển và sinh sản
của động vật [15].
Phân tích đa hình đoạn gene POU1F1 bằng enzyme DdeI thu được các dạng
allele tương ứng sau:
- allele D1: 200bp – 118bp – 102bp – 20bp – 11bp
13
- allele D2: 200bp – 118bp – 113bp – 20bp
Từ 2 allele trên ta có các kiểu gene tương ứng như sau:
- Kiểu gene D1D1 (200bp – 118bp – 102bp – 20bp – 11bp): các cá thể mang
kiểu gene D1D1 là các cá thể đồng hợp tử về đoạn cắt gene POU1F1. Khi điện di sẽ
thu được 3 băng có kích thước 200bp, 118bp và 102bp. 2 băng 20bp và 11bp có
kích thước quá nhỏ không thể nhìn thấy sau khi điện di.
- Kiểu gene D1D2 (200bp – 118bp – 113bp – 102bp – 20bp – 11bp): các cá
thể mang kiểu gene D1D2 là các cá thể dị hợp tử về đoạn cắt gene POU1F1. Sau
khi điện di sẽ thu được 4 băng có kích thước 200bp, 118bp, 113bp và 102bp. 2 băng
20bp và 11bp có kích thước quá nhỏ không thể nhìn thấy sau khi điện di.
- Kiểu gene D2D2 (200bp – 118bp – 113bp – 20bp): các cá thể mang kiểu
gene D2D2 là các cá thể đồng hợp tử về đoạn cắt gene POU1F1. Khi điện di sẽ thu
được 3 băng có kích thước 200bp, 118bp và 113bp. băng có kích thước quá nhỏ
không thể nhìn thấy sau khi điện di [15].
- Sơ đồ mô phỏng 2 allele D1 và D2 được thể hiện ở hình 1.3 dưới đây:
Hình 1.4: sơ đồ mô phỏng các allele của gene POU1F1
- Sơ đồ mô phỏng 3 kiểu gene D1D1, D1D2 và D2D2 tương ứng được thể
hiện ở hình 2.6 dưới đây:
14
Hình 1.5: Sơ đồ mô phỏng các kiểu gene của gene POU1F1
- Vị trí cắt đa hình của enzyme DdeI trên gene POU1F1:
Hình 1.6: Đoạn gene POU1F1 và vị trí cắt của enzyme DdeI
15
1.3.3. Đa hình gen và mối tương quan với các tính trạng sinh trưởng của dê
* Gene POU1F1
Các yếu tố phiên mã đặc hiệu tuyến yên POU1F1, còn gọi là domain POU,
lớp 1, yếu tố phiên mã 1 (Pit1, yếu tố hormone 1), là yếu tố phiên mã cho hormone
tăng trưởng, thuộc họ protein POU.
Gene POU1F1 đã được nghiên cứu ở lợn, gia súc, gà, dê và các động vật
khác. Gen POU1F1 của bò, cừu và dê đều nằm trên nhiễm sắc thể 1q21-22. Sự biểu
hiện của gen POU1F1 còn là ðiều kiện cần thiết ðể phiên mã gen mã hoá hormone
tăng trưởng GH, prolactin (PRL) và hormone tăng cường tuyến giáp (TSH) ở động
vật. Những gen này tham gia vào các con đường dẫn truyền tín hiệu khác nhau quan
trọng trong nhiều quá trình phát triển và sinh lý bao gồm cả phát triển tuyến yên,
tăng trưởng và phát triển tuyến vú và sản lượng tiết sữa. Hơn nữa, các gen GH,
PRL và TSH và các protein chúng mã hoá cũng có liên quan gần với sự sinh sản ở
động vật.
16
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Dê địa phương Định Hóa
- Địa điểm nghiên cứu:
Thí nghiệm trên dê địa phương Định Hóa triển khai tại các xã (Kim Phượng,
Phượng Tiến, Trung Hội, Bộc Nhiêu) của huyện Định Hóa.
Các nghiên cứu về gene được tiến hành tại Phòng thí nghiệm sinh học phân tử
của Viện Khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên.
- Thời gian nghiên cứu: Từ 08/2017 – 08/2019.
2.2. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2.2.1. Dụng cụ nghiên cứu
Pipette, ống eppendorf, ống PCR, các loại đầu tip tương ứng, ống fancol, dao
mổ, kéo.
2.2.2. Thiết bị và hóa chất nghiên cứu
Bảng 2.1: Danh mục các thiết bị
STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất xứ
1 Bộ điện di Scie- plas Ltd-UK
2 Máy chụp gel Gel logic 1500- Kodak-USD
3 Cân điện tử TE214S- Startorius Germany
4 Máy ly tâm Eppendorf-CHLB Đức
5 Tủ lạnh -200C; -800C Super freezer Eco 130-Ficchetti-Italia
6 Máy vontex Vontex Genius3-IAK Genmany/China
7 Máy spindown E-centrifuge-Wealtex-Taiwan/USA
8 Bể ủ ổn nhiệt Techne-OSI
9 Máy PCR Amplied Biosystems USA/Singapore
17
Bảng 2.2: Danh mục hóa chất
STT Tên hóa chất Hãng sản xuất
1 Proteinase K Thermo scientific
2 RNase Thermo scientific
Isopropanol 3 Merck
Isoamin alcohol 4 Merck
Loading Dye 5 Merck
6 Agarose Bio neer
Ethidium bromide 7 Merck
Enzyme DdeI 8 Thermo scientific
9 Cặp mồi nhân gen POU1F1 Thermo scientific
10 Taq-polymerase 5U/µl Thermo scientific
11 Buffer Taq-polymerase Thermo scientific
12 dNTP: nucleotide tự do A, T, G, C Thermo scientific
13 Elution buffer Thermo scientific
2.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu đặc điểm hình thái của dê Định Hóa
- Khảo sát một số chiều đo: Cao vây, vòng ngực, dài thân chéo, vòng ống...
2.3.2. Nội dung 2: Phân tích đa hình chiều dài gen POU1F1
- Thu thập mẫu mô tai dê trong quần thể nghiên cứu.
- Tách chiết DNA tổng số của dê Nản từ mẫu mô tai.
- Tiến hành phản ứng PCR nhân gene POU1F1 với cặp mồi đặc hiệu.
- Cắt đoạn gen bằng enzyme hạn chế tương ứng với tứng gen.
- Phân tích đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn genne POU1F1.
2.3.3. Nội dung 3: Phân tích mối tương quan đa hình di truyền gen POU1F1 liên
quan đến tính trạng sinh trưởng của dê
- Phân tích đa hình kiểu gen POU1F1.
- Phân tích mối tương quan đa hình gen POU1F1 với tính trạng sinh trưởng
của dê.
18
2.3.4. Nội dung 4: Giải trình tự gene POU1F1
- Giải trình tự gene POU1F1
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu đặc điểm hình thái của dê Định Hóa
+ Nghiên cứu trên đàn dê địa phương nuôi tại huyện Định Hóa.
- Số lượng mẫu nghiên cứu: Mỗi độ tuổi 20 con dê (10 dê đực và 10 dê cái)
+ Các chỉ tiêu nghiên cứu:
- Khảo sát dê tại các thời điểm 1, 3, 6, 12 tháng tuổi. Khảo sát kích thước một
số chiều đo chính của dê ở các lứa tuổi nuôi tại các hộ gia đình (Cao vây, vòng
ngực, dài thân chéo, vòng ống).
Khối Lượng Vòng ngực Dài thân Vòng ống Cao vây (Mean ± (Mean ± chéo (Mean ± Tháng (Mean ± SE) SE) SE) (Mean ± SE) SE) tuổi
Đực Cái Đực Cái Đực Cái Đực Cái Đực Cái
1
3
6
12
2.4.2. Nội dung 2: Phân tích đa hình chiều dài đoạn gene POU1F1
2.4.2.1. Thu thập mẫu mô tai
Thu thập mẫu mô tai trong quần thể nghiên cứu: Tổng số 30 mẫu mô tai dê
trong quần thể nghiên cứu bao gồm 50% cá thể đực và 50% cá thể cái. Chọn ngẫu
nhiên các cá thể ở các đàn khác nhau, tránh tình trạng chọn phải các cá thể cận
huyết hoặc có cùng huyết thống với nhau trong cùng 1 đàn. Sau đó sử dụng các
phương pháp cơ bản trong sinh học phân tử như: Tách chiết DNA tổng số, điện di
trên gel agarose, kỹ thuật PCR với các cặp mồi thiết kế đặc hiệu, cắt các đoạn gene
đích bằng các enzyme giới hạn được đã thiết kế phù hợp nhất. Bên cạnh đó là kết
hợp với kỹ thuật tiên tiến như PCR-RFLP để thu được các dữ liệu mong muốn.
Cuối cùng là sử dụng 1 số phần mềm, ứng dụng phân tích thông dụng trong sinh
học phân tử để phân tích số liệu và đưa ra thống kê cho kết quả cuối cùng.
19
2.4.2.2. Phương pháp lấy mẫu
Phương pháp lấy mẫu mô tai dê được tiến hành như sau: Dùng kìm cắt tai
lấy một mẩu mô tai nhỏ vừa đủ đưa vào ống eppendoft có chứa cồn 70%, đem
bảo quản trong tủ lạnh (-200C) cho đến khi sử dụng.
2.4.2.3 Phương pháp tách chiết DNA tổng số
+ Phương pháp tách triết DNA tổng số bao gồm các bước như sau:
Bước 1: Lấy mẫu ra và thấm khô cồn bằng giấy thấm. Sử dụng dao loại bỏ
sạch lông và phần bẩn màu đen trên mẫu, sau đó làm nhỏ bằng dao.
Bước 2: Cho phần mẫu đã nghiền nhỏ vào ống effendoft 1,5 ml, thêm 500µl buffer
lysis. Sau đó vortex 15s và ủ 56oC trong vòng 1 giờ (15p đảo trộn 1 lần).
Bước 3: Thêm 2 µl Proteinase K vào ống eppendorf chứa mẫu. Ủ qua đêm ở
560C cho đến khi mẫu tan hết.
Bước 4: Thêm 2 µl RNase vào ống eppendorf. Ủ tiếp ở 370C trong 1 giờ.
Bước 5: Bổ sung 500 µl CIAA, mix nhẹ bằng tay cho đến khi thấy dung dịch
có màu trắng sữa đồng nhất. Sau đó ủ tiếp ở -20OC trong 1 giờ.
Bước 6: Ly tâm 12000 rpm trong 15p. Dùng pipette hút và chuyển pha trên
sang ống eppendorf 1,5 ml mới (khoảng 400 µl).
Bước 7: Thêm dung dịch isopropanol với tỉ lệ 2:1. Sau đó đảo trộn đều và ủ ở
-200C trong 2 giờ.
Bước 8: Ly tâm 13000 rpm trong 15p. Loại bỏ dịch nổi và thu cặn DNA.
Bước 9: Bổ sung 500 µl cồn 70% vào ống eppendorf. Ly tâm 8000 rpm trong 5p.
Bước 10: Đổ hết cồn, spindown rồi dùng pipette hút hết cồn dư. Sau đó để khô
tự nhiên. Thu cặn DNA trong suốt.
Bước 11: Thêm 50µl dung dịch đệm Elution Buffer. Bảo quản trong tủ -200C
sử dụng cho các công đoạn tiếp theo.
2.4.2.4 Phương pháp PCR
+ Thiết kế mồi cho trình tự DNA của gen POU1F1
20
Bảng 2.3: Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
Kích Tài liệu tham Tên mồi Trình tự thước dự khảo kiến
POU1F1 – F 5’ CCA TCA TCT CCC TTC TT 3’ 450bp [15] POU1F1 – R 5’ AAT GTA CAA TGT GCC TTC GAG 3’
+ Thành phần mồi cho một phản ứng PCR
Bảng 2.4:Thành phần của một phản ứng PCR
Hoá chất Thể tích (µ)
Buffer 10x 2
dNTP 10mM 0,4
Primer (xuôi và ngược) 1
Taq polymerase 0,1
14,5 H2O
DNA khuôn 2
Tổng thể tích 20
+ Chu kì nhiệt độ phản ứng PCR nhân gene POU1F1
Hình 2.1: Chu kì nhiệt độ của phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gene POU1F1
2.4.2.5. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn hay còn được gọi là Endonuclease giới hạn là những enzyme
có khả năng nhận biết một trình tự DNA đặc hiệu và phá vỡ liên kết phosphodiester
ngay tại đó.
Cắt sản phẩm PCR gen POU1F1 bằng enzyme giới hạn DdeI.
21
Bảng 2.5: Thành phẩn phản ứng cắt gene POU1F1 bằng enzyme DdeI
Thành phần Thể tích (µ)
Enzyme DdeI 2
Buffer Tango 10X 3
Sản phẩm PCR 20
5 H2O
Tổng thể tích 30
Bảng 2.6: Vị trí cắt của enzyme giới hạn
Tên Enzyme Nguồn gốc Vị trí cắt
Vi khuẩn Desulfovibrio 5’ C ↓ T N A G 3’ POU1F1/DdeI desulfuricans 3’ G A N T ↑ C 5’
2.4.3. Nội dung 3: Phân tích mối tương quan đa hình di truyền gen POU1F1 liên
quan đến tính trạng sinh trưởng của dê
2.4.3.1. Phân tích đa hình gene
Sản phẩm PCR của cặp mồi sau khi cắt bằng enzyme giới hạn, phân lập độ dài
các đoạn DNA bằng cách chạy điện di trên gel agarose 1% - 2,5% với điện thế
110V trong 60 phút trong hệ đệm TAE. Sau đó nhuộm bằng Ethidium bromide và
soi chụp dưới tia UV bằng Máy chụp gel “Gel logic 1500- Kodak-USD”. Xác định
kiểu gen cho từng cá thể dựa vào kết quả điện di.
Bảng 2.7: Tỷ lệ kiểu gene POU1F1 ở dê Nản
Kiểu gene D1D1 Kiểu gene D1D2 Kiểu gene D2D2 Số cá thể (n)
(n) % (n) % (n) %
2.4.3.2. Phương pháp xác định phân tích thống kê xác định mối tương quan giữa
gen POU1F1 với đặc tính sinh trưởng
Tần số allele và phân bố kiểu gen được so sánh sử dụng kiểm tra Chi-square. Khi
giá trị P<0,05 khác biệt được cho là có ý nghĩa, và nếu P<0,01 là có ý nghĩa cao.
22
Tần số allele và Chi-square của Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) được
tính toán sử dụng phần mềm GenAIEx version 6. Sự kiên kết giữa kiểu gen của
động vật với các đặc tính sinh trưởng được tính toán bằng cách phân tích các dấu
hiệu của tất cả các con, sử dụng mô hình tuyến tính chung General Linear Model
của phần mềm SAS.
2.4.4. Nội dung 4: Giải trình tự gene POU1F1
Các sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại sẽ được gửi đi giải trình tự ở
công ty 1st BASE tại Singapore.
2.5. Các phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm như Microsoft excel, SPSS 16.0, bioEdit để xử lí số liệu.
23
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái của dê địa phương Định Hóa
Khối lượng (Mean ± SE)
Vòng ống (Mean ± SE)
Cao vây (Mean ± SE)
Vòng ngực (Mean ± SE)
Dài thân chéo (Mean ± SE)
Tháng tuổi
Cái
Đực
Đực
1
Đực Cái 5,10a ± 0,09
5,0a ± 0,05
Cái 31,28b ± 2,22
Cái 33,6b ± 1,99
Cái 32,30b ± 2,52
3
Đực 36,2a ± 1,52 44,4a ± 1,56
5,41a ± 0,09
5,2a ± 0,05
37,22b ± 2,04
41,8b ± 2,41
38,37b ± 2,48
6
52,4a ± 2,39
6,01a ± 0,09
5,9a ± 0,07
43,16a ± 2,68
49,9b ± 2,36
44,57b ± 2,38
12
67,8a ± 1,60
6,73a ± 0,01
6,6a ± 0,09
51,83a ± 2,22
61,5b ± 2,61
56,70b ± 1,94
Đực 3,80 a ± 0,18 6,97 a ± 0,38 11,37 a ± 0,47 20,71 a ± 0,53
3,33 b ± 0,18 6,19 b ± 0,27 10,2 b ± 0,31 17,5 b ± 1,14
34,1a ± 1,51 40,1a ± 1,87 44,2a ± 1,71 53,4a ± 1,96
34,9a ± 0,98 42,0a ± 1,43 47,0a ± 1,19 58,5a ± 1,99
Bảng 3.1. Kích thước một số chiều đo của dê địa Định Hóa
Các chiều đo thể hiện sự sinh trưởng, phát triển của các loài động vật. Kết quả
nghiên cứu của chúng tôi về khối lượng và kích thước một số chiều đo của dê địa
phương Định Hóa được trình bày tại bảng 3.1. Trọng lượng cơ thể, kích thước một
số chiều đo như cao vây, vòng ngực, dài thân chéo và vòng ống của dê địa phương
Định Hóa tăng dần theo lứa tuổi và có sự khác biệt giữa dê đực và dê cái. Khối
lượng trung bình của Dê lúc 1 tháng tuổi đạt 3,57 kg, 3 tháng tuổi đạt 6,59 kg, 6
tháng tuổi đạt 10,79kg và 12 tháng tuổi đạt 19,12 kg. Số đo chiều cao vây trung
bình của dê lúc 1 tháng tuổi đạt khoảng 32,73 cm, 6 tháng tuổi đạt 43,73 cm và đến
12 tháng tuổi đạt 52,65cm. Số đo vòng ngực ở 1 tháng tuổi của dê đạt khoảng 34,96
cm, 6 tháng tuổi đạt 51,18 cm, 12 tháng tuổi đạt khoảng 64,72 cm. Số đo dài thân
chéo đạt lần lượt từ 33,64 – 45,79 - 57,62cm tương ứng với 1 – 6 – và 12 tháng tuổi
và chu vi vòng ống đạt lần lượt từ 5,07 – 5,96 và 6,69cm.
24
Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới cho thấy kích thước một số chiều
đo cơ thể của dê phụ thuộc nhiều vào nguồn gốc giống. Các giống dê khác nhau có
tầm vóc khác nhau và kích thước một số chiều đo chính cũng khác nhau. Trong các
giống dê nội, kết quả nghiên cứu của chúng tôi khá tương đồng với nghiên cứu của
Trần Trang Nhung (2000) (chỉ số dài thân chéo của dê nội nuôi tại vùng Đông Bắc
Việt Nam lúc 12 tháng tuổi là 55,15 cm, chu vi vòng ngực là 59,15cm và cao vây là
47,30 cm). Nhưng so với các nghiên cứu về một số giống dê trên thế giới, kết quả
nghiên cứu về giống dê địa phương Định Hóa lại thấp hơn. Nagamine và cs. (2013)
nghiên cứu về kích thước một số chiều đo của dê lai giữa dê Saanen và dê Nubian ở
các giai đoạn từ 3 đến 12 tháng tuổi, kết quả nghiên cứu cho thấy, chiều cao vây của
dê thí nghiệm ở các giai đoạn 3, 6, 9 và 12 tháng tuổi lần lượt là 51,70; 62,50; 69,70
và 76,10 cm. Chiều dài thân của dê lần lượt là 51,0; 61,40; 71,90 và 80,30 cm. Chu
vi vòng ngực của dê lần lượt là 50,6; 64,6; 74,3 và 83,9 cm.
3.2. Kết quả phân tích đa hình chiều dài đoạn gene POU1F1
3.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của một số mẫu dê địa phương Định Hóa
Kết quả tách chiết DNA tổng số mẫu mô tai dê Nản được thể hiện qua hình
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
dưới đây:
ADN thang chuẩn:….
Hình 3.1: Kết quả tách chiết DNA tổng số 10 mẫu dê Nản
(đường chạy từ mẫu số 1 – 10 tương ứng với các mẫu dê )
25
11 1 2 13 14 15 16 17 18 1 9 20 21 22 23 24 25
Hình 3.2: Kết quả tách chiết DNA tổng số 15 mẫu dê Nản
26 27 28 29 30
(đường chạy từ mẫu số 11 – 25 tương ứng với các mẫu dê )
Hình 3.3: Kết quả tách chiết DNA tổng số 5 mẫu dê Nản
(đường chạy từ mẫu số 26 – 30 tương ứng với các mẫu dê )
Từ hình ảnh kết quả điện di trên cho thấy sản phẩm DNA tổng số thu được
tương đối đồng đều. Các mẫu 01, 02, 03, 04, 05, 06, 13, 15, 16, 18, 22, 23, 24, 26,
27, 28, 29, 30 (tương ứng với các đường chạy từ 1-6) band sáng rõ nét, ít bị đứt gãy.
Các mẫu 07, 08, 09, 10, 11, 14, 17, 19, 20, 21 band sáng rõ, có sự đứt gãy. Tất cả
các mẫu đều đủ điều kiện thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo.
26
3.2.2. Kết quả PCR khuếch đại gene POU1F1 bằng cặp mồi đặc hiệu
Sản phẩm PCR của đoạn gene POU1F1 được khuyếch đại từ cặp mồi do Lan
et thiết kế năm 2007 với kích thước 450bp. Sản phẩm PCR sau khi khuyếch đại
1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10
500bp
450bp
thành công được điện di trên gel agarose 1% trong 30p.
Hình 3.3: Sản phẩm PCR khuyếch đại từ cặp mồi POU1F1
(M: GeneRuler 1kb; đường chạy 1 – 10: sản phẩm PCR
11 1 2 13 14 15 16 17 18 1 9
đoạn gene POU1F1 kích thước 450bp)
Hình 3.4: Sản phẩm PCR khuyếch đại từ cặp mồi POU1F1
(M: GeneRuler 1kb; đường chạy 11 – 19: sản phẩm PCR
đoạn gene POU1F1 kích thước 450bp)
27
19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 11 16
Hình 3.5: Sản phẩm PCR khuyếch đại từ cặp mồi POU1F1
(M: GeneRuler 50bp; đường chạy 19 – 30, 11, 16: sản phẩm PCR đoạn gene POU1F1 kích thước 450bp)
Kết quả PCR gene POU1F1 được thể hiện trên hình 3.3, 3.4, 3.5 cho thấy sản phẩm PCR là 1 băng sáng rõ duy nhất, kích thước xấp xỉ 450bp như dự kiến, đủ
điều kiện thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3. Kết quả Cắt đoạn gene POU1F1 bằng enzyme DdeI
Phân tích đa hình gene POU1F1 dựa vào khả năng cắt của enzyme giới hạn
DdeI trên sản phẩm PCR kích thước 450bp. Sản phẩm cắt được điện di trên gel
agarose 1% trong 90p.
450bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ĐC
200bp 118bp
113bp 102bp
Hình 3.6: Kết quả phân tích đa hình đoạn gene POU1F1 bằng enzyme DdeI
(M: GeneRuler 50bp; đường chạy 1 – 10: sản phẩm cắt gene POU1F1 bằng enzyme Ddel; ĐC: sản phẩm PCR đoạn gene POU1F1 kích thước 450bp đối chứng)
28
11 1 2 13 14 15 M 16 17 18 1 9 20 21 22 23 24 25
(M: GeneRuler 50bp; đường chạy 11 – 25: sản phẩm cắt gene POU1F1 bằng enzyme Ddel)
M 26 27 28 29 30
Hình 3.7: Kết quả phân tích đa hình đoạn gene POU1F1 bằng enzyme DdeI
(M: GeneRuler 50bp; đường chạy 26 – 30: sản phẩm cắt gene POU1F1 bằng enzyme Ddel)
Hình 3.8: Kết quả phân tích đa hình đoạn gene POU1F1 bằng enzyme DdeI
Kết quả trong hình 3.6, 3.7 và 3.8 cho thấy kết quả cắt sản phẩm PCR đoạn
gene POU1F1 bằng enzyme DdeI. Đoạn gene POU1F1 sau khi cắt bằng enzyme
giới hạn DdeI đã phân tách thành các đoạn DNA có kích thước khác nhau. Trong
29
đó, giếng số 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 29,
30 có 3 băng với kích thước 200bp, 118bp và 102bp thể hiện cho kiểu gene D1D1.
Các giếng số 2, 6, 12, 13, 16, 19, 25, 27 có 4 băng với kích thước 200bp, 118bp,
113bp và 102bp thể hiện cho kiểu gene D1D2. Các kiểu gene POU1F1 ở giống dê
Nản đã được xác định, từ đó tỷ lệ kiểu gene và tần số allele xuất hiện cũng được
tính toán dựa trên tổng số cá thể mang kiểu gene đó. Kết quả được thể hiện trong
Bảng 3.2 và Hình 3.7 như sau:
Bảng 3.2: Tỷ lệ kiểu gene POU1F1 ở dê Nản
Số cá thể (n) Kiểu gene D1D1 Kiểu gene D1D2 Kiểu gene D2D2
(n) % (n) % (n) % 30 22 73% 8 27% 0 0%
Biểu đồ 1: Biểu đồ tỷ lệ phần trăm các kiểu gene POU1F1
Kết quả trên Bảng 3.2 và biểu đồ 1 cho thấy, khi sử dụng enzyme DdeI phân
tích đa hình đoạn gene POU1F1 ở 30 mẫu dê Nản có sự xuất hiện của các kiểu gene
khác nhau. Các mẫu dê Nản nghiên cứu có 2 kiểu gene là D1D1 và D1D2 với tỷ lệ
lần lượt là 73% và 27%. Trong đó kiểu gene D1D1 chiếm ưu thế hơn so với kiểu
gene D1D2 và không thấy sự xuất hiện của kiểu gene D2D2 trên giống dê Nản.
30
Biểu đồ 2: Biểu đồ tần số allele của gene POU1F1
Sự khác nhau ở tần số các allele cũng được thể hiện rõ ràng ở biểu đồ 2, trong
đó tần số allele D1 là 0,86 chiếm tỷ lệ cao hơn hẳn so với allele D2 là 0,14.
Lan et al và cộng sự năm 2007 đã tiến hành nghiên cứu đa hình đoạn gene
POU1F1 trên 84, 32 cá thể của 2 giống dê địa phương ở Trung Quốc là Boer, Haimen.
Kết quả cho thấy tỉ lệ allele D1 xuất hiện ở giống Boer là 0,887 và allele D2 là 0,113. Ở
giống Haimen allele D1 xuất hiện với tần số 0,742 và allele D2 là 0,258.
Trong một nghiên cứu khác của M.J.Li et at và cộng sự năm 2015 cũng đã tiến
hành nghiên cứu đa hình gene POU1F1 của 15 giống dê địa phương tại Trung Quốc
và cho kết quả điển hình của một số giống dê như sau: Giống dê Nanjiang có tỉ lệ
allele D1 là 0.581 và D2 là 0.419. Còn ở giống dê Shannbei lại có tỉ lệ allele D1 là
0.66 và allele D2 là 0.34
Các kết quả của các nghiên cứu trên cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu đa
hình đoạn gene POU1F1 trong đề tài này.
Bảng 3.3: Sự khác nhau về tần số allele gene POU1F1 giữa các giống dê
Allele Dê Nản Dê Boer Dê Haimen
0,86 0,887 0,742 D1
0,14 0,113 0,258 D2
31
Biểu đồ 3: Biểu đồ kết quả so sánh tần số allele gene POU1F1 giữa dê Nản và 2
loài dê Trung Quốc
3.3. Kết quả Phân tích mối tương quan đa hình di truyền gen POU1F1 liên
quan đến tính trạng sinh trưởng của dê
Khảo sát mối quan hệ đa hình trên intron 6 của gen POU1F1 với các tính
trạng năng suất sinh trưởng của dê Nản cho thấy không có sự khác biệt thống kê
giữa kiểu gen D1D1 với kiểu gene D1D2 (P<0,05). Mặc dù nhóm dê mang kiểu gen
D1D1 có cân nặng trung bình cao hơn nhóm dê mang kiểu gen D1D2 ở các giai đoạn
tuổi khác nhau (Bảng 3.4).
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của đa hình gen POU1F1 đến sinh trưởng của dê địa
phương Định Hóa
(đơn vị: kg)
Kiểu gene Kiểu gene Kiểu gene
Tháng tuổi D1D1 D1D2
Sơ sinh 1.71 1.67
1 tháng tuổi 3.49 3.44
3 tháng tuổi 6.26 6.31
6 tháng tuổi 10.38 10.25
12 tháng tuổi 18.23 18.22
32
Nhìn vào bảng 3.4 và 3.5 ta thấy, khối lượng dê mang 2 kiểu gene khác nhau
D1D1 và D1D2 đều tăng dần theo độ tuổi từ sơ sinh cho đến khi được 12 tháng tuổi.
Khối lượng trung bình của dê mang kiểu gene D1D1 luôn cao hơn so với khối lượng
trung bình của dê mang kiểu gene D1D2 ở cả con đực và con cái, tuy nhiên không có
sự chênh lệch khối lượng đáng kể và không có sự khác biệt thống kê giữa các kiểu
gene D1D1 so với kiểu gene D1D2. Cụ thể là ở độ tuổi sơ sinh, khối lượng trung bình
của dê mang kiểu gene D1D1 có khối lượng là 1.71 kg, ở độ tuổi 12 tháng tuổi khối
lượng dê trung bình là 18.23 kg. Còn ở nhóm dê mang kiểu gene D1D2, ở độ tuổi sơ
sinh dê có khối lượng trung bình thấp hơn một chút và đạt 1.67 kg, 12 tháng tuổi đạt
18.22 kg.
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của đa hình gen POU1F1 đến sinh trưởng của dê đực và
dê cái địa phương Định Hóa
(đơn vị: kg)
Kiểu gene D1D1 Kiểu gene D1D2 Kiểu gene
Tháng tuổi Đực Cái Đực Cái
1.82 1.61 1.70 1.63 Sơ sinh
3.63 3.35 3.57 3.31 1 tháng tuổi
6.52 6.00 6.60 6.01 3 tháng tuổi
10.72 9.89 10.04 10.61 6 tháng tuổi
19.28 17.19 19.26 17.17 12 tháng tuổi
Qua bảng 3.5 ta thấy: Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của tính biệt đến sinh
trưởng, chúng tôi thấy dê đực thường lớn nhanh hơn dê cái ở cả 2 kiểu gene.
Nguyên nhân chủ yếu của vấn đề này là do ảnh hưởng của hoóc môn androgens đến
quá trình trao đổi protein. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, khối lượng của dê
đực địa phương Định Hóa có kiểu gene D1D1 tại các thời điểm sơ sinh, 1, 3, 6 và 12
tháng tuổi lần lượt là 1,82; 3,63; 6,52; 10,72 và 19,28 kg/con và luôn cao hơn so với
dê cái chỉ đạt 1,61; 3,35; 6,0; 10,04 và 17,19kg/con. Ở nhóm dê có kiểu gene D1D2
cũng có khối lượng tương tự và đạt các giá trị khối lượng ở các thời điểm sơ sinh, 1,
3, 6, 12 tháng tuổi lần lượt là: 1,70; 3,57; 6,6 và 19,26 (dê đực), còn ở dê cái có khối
lượng lần lượt là 1,63; 3,31; 6,01; 9,89 và 17,17. Nguyễn Bá Mùi và cs. (2010)
33
nghiên cứu trên đàn dê cỏ tại huyện Nho Quan tỉnh Ninh Bình cho thấy khối lượng
dê đực và dê cái qua các thời điểm từ sơ sinh đến 12 tháng tuổi có sự khác nhau có
ý nghĩa thống kê (P<0,05). Khối lượng dê đực lúc sơ sinh là 1,68; lúc 1 tháng tuổi
là 3,38; lúc 3 tháng tuổi là 7,77; lúc 6 tháng tuổi là 12,82 và lúc 12 tháng tuổi là
19,99 kg/con. Tương ứng ở dê cái lần lượt là 1,51; 3,06; 6,73;10,98 và 16,36kg/con.
Kết quả nghiên cứu của Mahgoub và cs. (1996) trên dê Batina cho thấy, khối lượng
dê đực Batina luôn cao hơn dê cái. Khối lượng qua các kỳ cân của dê đực từ sơ
sinh, 2, 4, 5 và 6 tháng tuổi lần lượt là 3,03; 11,02; 14,90; 19,64; 23,17 và
24,20kg/con. Trong khi của dê cái lần lượt là 2,55; 8,66; 10,97; 12,85; 15,40 và
18,13 kg/con, theo thứ tự tương ứng. Sự sai khác về khối lượng tại các thời điểm
theo dõi giữa dê đực và dê cái có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Tsegay Teklebrhan
(2018) nghiên cứu trên dê lai giữa dê Boer và hai giống dê địa phương của vùng
phía Đông Ethiopia cũng cho thấy ảnh hưởng của tính biệt đến sinh trưởng của dê.
Tác giả cũng đã chỉ ra rằng, khối lượng của dê đực ở thời điểm sơ sinh và cai sữa
luôn cao hơn dê cái (P<0,05). Ta có thể thấy được tính biệt về sinh trưởng giữa dê
đực và dê cái qua 2 biểu đồ dưới đây:
Biểu đồ 4: Biểu đồ khối lượng dê đực Biểu đồ 5: Biểu đồ khối lượng nhóm dê
số 2,dê cái số 3 kiểu Gene D1D1 qua các đực số 1, dê cái số 12 kiểu Gene D1D2
giai đoạn tuổi (ss, 1, 3, 6, 12 tháng tuổi) qua các giai đoạn tuổi (ss, 1, 3, 6, 12)
34
3.4. Kết quả giải trình tự và xác định sự sai khác di truyền giữa dê Nản Định
Hóa và một số giống dê khác.
3.4.1. Kết quả giải trình tự gene POU1F1
Chất lượng của các kết quả giải trình tự được xác định theo ba cấp độ: Nếu
giá trị chất lượng (Quality Value - QV) nằm trong khoảng từ 0 – 19 thì trình tự có
chất lượng thấp, trình tự có chất lượng trung bình với QV nằm trong khoảng 20-30
và chất lượng cao thì QV lớn hơn 30 (Chen.et al , 2010). Dựa vào giá trị QV thấy
rằng các mẫu có giá trị QV thấp trong khoảng 50 nucleotide đầu tiên và từ
nucleotide thứ 1000 trở đi các nucleotide trong khoảng nucleotide 50 đến nucleotid
dưới 1000 có chất lượng tương đối cao.
Gene POU1F1 được khuếch đại bằng phản ứng PCR, sản phẩm của phản
ứng được tinh sạch và giải trình tự bằng phương pháp Sanger. Kết quả thu được
như sau:
Kết quả giải trình tự gen POU1F1 mẫu 29
Hình 3.9: Kết quả giải trình tự gen POU1F1 mẫu 29
35
Kết quả giải trình tự gen POU1F1 mẫu 30
Hình 3.10: Kết quả giải trình tự gen POU1F1 mẫu 30
Kết quả đăng ký trình tự gen POU1F1 trên ngân hàng gen thế giới
Mã số trên ngân hàng gen: MK 228972
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MK228972?fbclid=IwAR3b1kD6afAfai3rjT vvLnOWENXrvHZtDP9h0sU9qoTvP7uAecM820XOOZI
36
37
3.4.2. Kết quả phân tích sự sai khác di truyền giữa các mẫu nghiên cứu.
So sánh trình tự DNA của mẫu nghiên cứu và 3 mẫu của loài Capra aegagrus hircus đã được công bố trên NCBI có mã số lần lượt là DQ826402 (Capra hircus isolate LS6..), MH892432 (Capra hircus POU1F1...) và DQ826409 (Capra hircus isolate LS7...) bằng phần mềm Bioedit.
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| De Nan -----------------------------------------------TGCTGCTAAAGACGCCCTGGAGAGACACTTTGGAGAACAGAATAAGCCTTCCT DQ 826402 CCATCATCTCCCTTCTTCTTTCCTGCCAACTCCCCACCTCCCAGTAT..................................................... MH 892432 CCATCATCTCCCTTCTTCTTTCCTGCCAACTCCCCACCTCCCAGTAT..................................................... DQ 826409 CCATCATCTCCCTTCTTCTTTCCTGCCAACTCCCCACCTCCCAGTAT..................................................... 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| De Nan CTCAGGAGATCCTGAGGATGGCTGAAGAACTAAACCTGGAGAAAGAAGTGGTGAGGGTTTGGTTTTGTAACCGAAGACAGAGAGAAAAACGGGTGAAAAC DQ 826402 .................................................................................................... MH 892432 .G.................................................................................................. DQ 826409 .G.................................................................................................. 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| De Nan AAGCCTGAATCAGAGCTTATTTCCTATCTCTAAGGAGCATCTTGAATGCAGATAGGTCTCCCATTGTGTAATAGCGAGTTTTTCTGCTTTTCTTTCCCTT DQ 826402 .................................................................................................... MH 892432 .................................................................................................... DQ 826409 .................................................................................................... 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| De Nan CTCTTCTCCAGCCAAAGTAGAAATCAGTTATTTGGTTAGCTTCCAAACGTCACATCAGTAATGTTTGCAGAAGTGTTTCTCTTCTACTTTAAAAACAAAT DQ 826402 .................................................................................................... MH 892432 .................................................................................................... DQ 826409 ................................................................C................................... 410 420 430 440 450 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.. De Nan ACAATTTAAATTATGTTGATGAATTATTCTC-GAAGGCACATTTGTACATTA DQ 826402 ...............................A...........-.......- MH 892432 ...............................A...........-.......- DQ 826409 ...............................A...........-.......-
Hình 3.10: So sánh vị trí sai khác trong trình tự nucleotide mẫu nghiên cứu với 3 mẫu dê trên NCBI
Xây dựng cây phát sinh chủng loại.
Cây phát sinh chủng loại của 1 mẫu nghiên cứu và 3 mẫu của thế giới lần lượt có
mã số trên NCBI là DQ826402 (Capra hircus isolate LS6..), MH892432 (Capra hircus
POU1F1...)và DQ826409 (Capra hircus isolate LS7...) được xây dựng trên NCBI.
Hình 3.11: Mối quan hệ di truyền giữa dê Nản và 3 mẫu dê trên thế giới
38
Hình 3.11 thể hiện mối quan hệ di truyền giữa mẫu dê Nản và 3 mẫu của thế
giới. Các mẫu phân tích được chia ra làm 2 nhóm lớn nhóm I gồm có 2 mẫu của thế
giới, nhóm II có một mẫu dê Nản và một mẫu dê trên thế giới. Sự phân chia nhóm
này là do những vị trí nucleotide khác biệt giữa các mẫu không cố định trong cùng
một nhóm loài. Nhìn vào cây di truyền ta có thể thấy khoảng cách di truyền giữa
các mẫu nghiên cứu là rất nhỏ, và có quan hệ rất gần với 3 mẫu dê trên thế giới.
39
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Dựa vào kết quả nghiên cứu dê Nản thuộc địa phương định hóa tôi đưa ra
được kết quả như sau:
Khối lượng của dê địa phương (Dê Nản) Định Hóa tương đối nhỏ (Lúc 12
tháng tuổi đạt trung bình 19,115 kg/con và khối lượng của dê đực thường cao hơn
dê cái (Lúc 12 tháng tuổi dê đực đạt 20,71 kg/con; dê cái chỉ đạt 17,52 kg/con, sự
sai khác về khối lượng lúc 12 tháng tuổi giữa dê đực và dê cái có ý nghĩa thống kê
(P<0,05).
Kích thước các chiều đo cao vây, dài thân, vòng ngực của dê địa phương Định
Hóa tăng dần từ sơ sinh đến 12 tháng tuổi và có sự khác nhau có ý nghĩa thống kê
(P<0,05) về các chỉ số này giữa dê đực và dê cái.
Đã phân tích thành công đa hình gene POU1F1 của dê Nản Định Hoá với tỉ lệ
kiểu gene D1D1 là 73%, kiểu gene D1D2 là 27%. Tần số allele D1 là 0,86 và allele
D2 là 0,14.
Qua kết quả nghiên cứu mối tương quan đa hình gene POU1F1 với tính trạng
sinh trưởng của dê Nản định hóa chúng tôi đưa ra kết luận không có sự khác biệt về
mặt ý nghĩa đối với nhóm dê có kiểu gene D1D1 và D1D2 mặc dù khối lượng sinh
trưởng của các nhóm dê mang các kiểu gene khác nhau này là khác nhau tuy nhiên
có sự khác nhau không đáng kể.
Đã giải trình tự một số mẫu dê Nản và đăng ký thành công 01 trình tự gene
trên ngân hàng Gene.
2. Kiến nghị
Tiếp tục phân tích đa hình của các gene này với số lượng mẫu lớn hơn để xác
định mối tương quan giữa đa hình các kiểu gene với các tính trạng mong muốn
tương ứng.
Cần mở rộng nghiên cứu thêm mối tương quan đa hình gene POU1F1 đến tính
trạng sinh trưởng của một số loài động vật khác nhau như: Trâu, bò, cừu, lợn...
40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Ngọc Anh, Ngô Hồng Chín, Chu Đức Tụy (2012), Kết quả nghiên cứu
bảo tồn quỹ gen dê Ré núi đá Ninh Bình.
2. Báo cáo kết quả thực hiện nhiệm vụ bảo tồn và khai thác nguồn gen vật nuôi Việt Nam
giai đoạn 2010 -2012. Ban chủ nhiệm Đề án bảo tồn Quỹ gen Vật nuôi quốc gia.
3. Đinh Văn Bình (1994), Nghiên cứu đặc điểm sinh học và sức sản xuất của dê
Bách Thảo – Luận án PTS khoa học Nông Nghiệp.
4. Đinh Văn Bình, Chu Đức Tụy và Chu Đình Khu (2007), Đánh giá đàn dê đực
giống BOERALPINE và SAANEN nhập từ Mỹ qua 4 năm nuôi tại Việt Nam
thông qua khả năng sản xuất ở đời con. Tạp chí Khoa học công nghệ chăn
nuôi, số 8, tr. 30-36.
5. Dương Văn Cường, Nguyễn Huy Thuần (2017), Giáo trình Nguyên lý kỹ thuật
di truyền, NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội. Tr. 19.
6. Trần Trang Nhung (2000), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng
sản xuất của dê nội nuôi ở một số tỉnh trung du, miền núi vùng Đông Bắc Việt
Nam. Luận án Tiến sỹ Nông Nghiệp.
7. Cù Ngọc Tân (2006), Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sản xuất của dê
vùng cao núi đã Hà giang. Luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp
8. Lê Văn Thông, Lê Viết Ly và cộng sự (1999), So sánh khả năng sản xuất của dê
cỏ, Bách thảo và con lai giữa chúng tại Thanh Ninh. Báo cáo khoa học Chăn
nuôi Thú Y 1998-1999 (phần chăn nuôi GS). Trang 58-81.
9. Lê Văn Thông (2004), Nghiên cứu một số đặc điểm của giống dê cỏ và kết quả
lai tạo với dê Bách Thảo tại vùng Thanh Ninh. Luận án tiến sỹ nông nghiệp.
10. Lê Thị Thúy, Trần Thị Thu Thủy (2005), Đánh giá sự sai khác di truyền giữa
một số quần thể dê nội Việt Nam. Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc 2005
nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống.
41
II. TÀI LIỆU TIẾNG ANH
11. A. Caroli, F. Chiatti, S. Chessa, D. Rignanese, E. M. Ibeagha-Awemu, and G.
Erhardt (2007), “Characterization of the Casein Gene Complex in West
African Goats and Description of a New αs1-Casein Polymorphism”,
American Dairy Science Association, 90. 2989 – 2996.
12. A. A. El-Hanafy, M. A. El-Saadani, M. Eissa, G. M. Maharem, Z. A. Khalifa
(2010), “Polymorphism of β-Lactoglobulin gene in barki and damascus and their
cross bred goats in relation to milk yield”, Biotechnology in Animal Husbandry,
26 (1-2)pp. 1- 12.
13. Amr A. El Hanafy, Muhammad Qureshi, Jamal Sabir, Mohamed Mutawakil,
Mohamed M. Ahmed, Hassan El Ashmaoui, Hassan Ramadan, Mohamed
Abou-Alsoud, Mahmoud Abdel Sadek (2014), “DNA Polymorphism Studies
ofβ-Lactoglobulin Gene in Saudi Goats”, World Academy of Science,
Engineering and Technology International Journal of Biological,
Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering 8 (12)pp.
14. Lin Ma, Qiaomei Qin, Qing Yang, Meng Zhang, Haiyu Zhao, Chuanying Pan,
Chuzhao Lei, Hong Chen, Xianyong Lan (5-2017), “Associations of six SNPs
of POU1F1-PROP1-PITX1-SIX3 pathway genes with growth traits in two
Chinese indigenous goat breeds”, The Journal of National Reseach Institute of
Animal Production, 17 (2)pp.
15. X. Y. Lan, C. Y. Pan, H. Chen, C. Z. Lei, L. S. Hua, X. B. Yang, G. Y. Qiu, R. F. Zhang and Y. Z. Lun (9-2007), “DdeI Polymorphism in Coding Region of Goat POU1F1 Gene and Its Association with Production Traits”, The asian- australasian association of animal production societies 20 (9)pp. 1342 – 1348.
PHỤ LỤC I
Bảng 1: Thông tin kí hiệu 30 mẫu mô tai dê Nản sử dụng trong đề tài.
Kí hiệu Tên Kiểu gen Địa điểm thu mẫu mẫu mẫu
1 TH1 Hộ Lê Đình Thượng D1D2
2 TH2 Nt D1D1
3 TH5 Nt D1D1
4 TH9 Nt D1D1
5 TH10 Nt D1D2
6 TH13 Nt D1D1
7 L2 Hộ Nguyễn Văn Luyến D1D1
8 L3 Nt D1D1
9 L10 Nt D1D1
10 L17 Nt D1D1
11 Q5 Hộ Trần Đình Quang D1D1
12 Q9 Nt D1D2
13 Q11 Nt D1D2
14 Q13 Nt D1D1
15 Tr3 Hộ gia đình chị Trang D1D1
Kí hiệu Tên Kiểu gen Địa điểm thu mẫu mẫu mẫu
16 Tr12 Nt D1D2
17 Tr15 Nt D1D1
18 Tr3’ Nt D1D1
19 Tr16 Nt D1D2
KH04 Hộ Lương Xuân Khiêm 20 D1D1
21 KH07 Nt D1D1
22 KH10 Nt D1D1
23 KH16 Nt D1D1
Hộ Nguyễn Thanh Vinh 24 V4 D1D1
25 V7 Nt D1D2
26 V10 Nt D1D1
27 V11 Nt D1D2
28 V16 Nt D1D1
29 V17 Nt D1D1
30 V18 Nt D1D1
BẢNG XỬ LÝ SỐ LIỆU BẰNG EXCELL
1. Chiều cao vây của dê ở độ tuổi 1-3-6-12 tháng tuổi
t-Test: Paired Two Sample for Means
32.65
31.77
Mean
34.18
31.28
Variance
1.528825
2.22065
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.242325215
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
3.044884753
P(T<=t) one-tail
0.007972237
t Critical one-tail
1.859548038
P(T<=t) two-tail
0.015944475
t Critical two-tail
2.306004135
t-Test: Paired Two Sample for Means
38.92
36.54
Mean
40.102
37.217
Variance
1.8749425
2.042294444
Observations
10
10
Pearson Correlation
0.125412343
0
Hypothesized Mean Difference
df
8
t Stat
3.258931154
P(T<=t) one-tail
0.005772867
t Critical one-tail
1.859548038
P(T<=t) two-tail
0.011545734
t Critical two-tail
2.306004135
t-Test: Paired Two Sample for Means
43.15
41.07
Mean
44.29
43.162
Variance
1.71064
2.689653
Observations
10
10
Pearson Correlation
0.254119
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
1.074012
P(T<=t) one-tail
0.15707
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.314141
t Critical two-tail
2.306004
t-Test: Paired Two Sample for Means
53.48
50.22
Mean
53.467
51.832
Variance
1.960953
2.222886
Observations
10
10
Pearson Correlation
0.017669
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
1.427231
P(T<=t) one-tail
0.095679
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.191357
t Critical two-tail
2.306004
2. Vòng ngực của dê ở độ tuổi 1-3-6-12 tháng tuổi
t-Test: Paired Two Sample for Means
34.85
33.29
Mean
36.265
36.649
Variance
1.524094
1.998661
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.06623
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
3.042936
P(T<=t) one-tail
0.007996
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.015992
t Critical two-tail
2.306004
t-Test: Paired Two Sample for Means
42.99
41.25
Mean
44.456
41.804
Variance
2.391036
2.361678
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.07309
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
2.676368
P(T<=t) one-tail
0.014042
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.028084
t Critical two-tail
2.306004
t-Test: Paired Two Sample for Means
52.98
50.22
Mean
52.405
49.984
Variance
2.39695
2.362169
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.293059772
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
2.306004135
P(T<=t) one-tail
0.057609207
t Critical one-tail
1.859548038
P(T<=t) two-tail
0.115218413
t Critical two-tail
1.766961698
t-Test: Paired Two Sample for Means
68.03
62.74
Mean
67.879
61.555
Variance
1.687994
2.6105
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.35529
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
5.221963
P(T<=t) one-tail
0.0004
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.000801
t Critical two-tail
2.306004
3. Dài thân chéo của dê ở độ tuổi 1-3-6-12 tháng tuổi
t-Test: Paired Two Sample for Means
33.47
33.46
Mean
34.971
32.297
Variance
0.980544
2.529844
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.28814
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
2.96939
P(T<=t) one-tail
0.008944
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.017888
t Critical two-tail
2.306004
t-Test: Paired Two Sample for Means
40.46
39.84
Mean
42.073
38.365
Variance
1.438269
2.483011
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.71811
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
3.279295
P(T<=t) one-tail
0.0056
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.0112
t Critical two-tail
2.306004
t-Test: Paired Two Sample for Means
46.12
45.73
Mean
47.002
44.566
Variance
1.185175
2.28395
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.592
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
2.378658
P(T<=t) one-tail
0.02232
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.044639
t Critical two-tail
2.306004
t-Test: Paired Two Sample for Means
58.22
57.49
Mean
58.544
56.697
Variance
1.9985
1.94911
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.09732
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
1.919043
P(T<=t) one-tail
0.045625
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.09125
t Critical two-tail
2.306004
4. Vòng ống của dê ở độ tuổi 1-3-6-12 tháng tuổi
t-Test: Paired Two Sample for Means
5.02
5.12
Mean
5.1
5.04
Variance
0.09036
0.05719
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.31716
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
1.884233
P(T<=t) one-tail
0.048138
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.096276
t Critical two-tail
2.306004
-Test: Paired Two Sample for Means
5.44
5.33
Mean
5.406
5.238
Variance
0.090469
0.053019
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.21022
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
2.965132
P(T<=t) one-tail
0.009002
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.018004
t Critical two-tail
2.306004
t-Test: Paired Two Sample for Means
6.04
5.94
Mean
6.011
5.905
Variance
0.090744
0.07211
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.49696
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
2.020829
P(T<=t) one-tail
0.038979
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.077958
t Critical two-tail
2.306004
t-Test: Paired Two Sample for Means
6.04
5.94
Mean
6.011
5.905
Variance
0.010744
0.09211
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.49696
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
2.020829
P(T<=t) one-tail
0.038979
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.077958
t Critical two-tail
2.306004
5. Khối lượng dê ở 1-3-6-9 tháng tuổi
t-Test: Paired Two Sample for Means
3.701
3.225
Mean
3.80
3.33
Variance
0.279181
0.28190
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.31716
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
2.884233
P(T<=t) one-tail
0.048138
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
1.196276
t Critical two-tail
2.306004
t-Test: Paired Two Sample for Means
6.82
6.05
Mean
6.97
6.19
Variance
0.3391
0.4281
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.21718
Hypothesized Mean Difference
0
df
8
t Stat
1.861881
P(T<=t) one-tail
0.048138
t Critical one-tail
1.859548
P(T<=t) two-tail
0.096276
t Critical two-tail
0.907183
t-Test: Paired Two Sample for Means
11.48
9.58
Mean
11.37
10.2
Variance
0.49449
0.466571
Observations
10
10
Pearson Correlation
-0.09616
Hypothesized Mean Difference
0
df
9
t Stat
2.830334
P(T<=t) one-tail
0.009856
t Critical one-tail
1.833113
P(T<=t) two-tail
0.019712
t Critical two-tail
2.262157
t-Test: Paired Two Sample for Means
21.05
17.25
Mean
20.71
17.5
Variance
1.330495
1.217437
Observations
10
10
Pearson Correlation
0.353007
Hypothesized Mean Difference
0
df
9
t Stat
4.446748
P(T<=t) one-tail
0.000804
t Critical one-tail
1.833113
P(T<=t) two-tail
0.001608
t Critical two-tail
2.262157
