Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào trong sàng lọc một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:61

Thêm vào BST

Báo xấu

34
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm nghiên cứu khả năng ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào trong sàng lọc các chất có hoạt tính chống ung thư hướng đích phân tử (yếu tố nhân NF-κB) ở điều kiện trong nước. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào trong sàng lọc một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN XUÂN THÀNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN XUÂN THÀNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC Ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1.TS. Đỗ Hữu Nghị 2.TS. Nguyễn Xuân Vũ Thái Nguyên 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu. Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng quy tắc. Kết quả trình bày trong luận văn được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng được ai công bố trước đây. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2019 Tác giả Nguyễn Xuân Thành Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
ii LỜI CẢM ƠN Luận văn này được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KHCNVN) và có liên quan đến nội dung nghiên cứu thuộc Đề tài "Phát triển kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang nội hàm cao phục vụ sàng lọc, đánh giá các hợp chất có hoạt tính chống ung thư mức độ tế bào và hướng đích phân tử" (VAST 04.05/18-19). Để hoàn thành được luận văn này tôi đã nhận được sự động viên, giúp đỡ tận tình của rất nhiều cá nhân và tập thể. Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Đỗ Hữu Nghị và TS. Nguyễn Xuân Vũ, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi rất tận tình trong quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Nguyễn Hồng Nhung cán bộ tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KHCNVN) đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, các cán bộ trong Trường ĐH Nông Lâm- ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ, trang bị kiến thức và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã giúp đỡ động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Xin chân thành cảm ơn! Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii MỤC LỤC .................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ...........................................................................................................1 2. Mục tiêu nghiên cứu. ..........................................................................................2 3. Đối tượng nghiên cứu. ........................................................................................2 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn. ..............................................................2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 1 1.1.Tầm quan trọng và ý nghĩa của vấn đề cần nghiên cứu....................................1 1.2. Tổng quan về các vấn đề nghiên cứu ...............................................................2 1.2.1. Tổng quan về ung thư ...............................................................................2 1.2.2. Ung thư cổ tử cung ...................................................................................7 1.2.3. Sàng lọc các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học ..........................9 1.2.4. Hoạt tính điều hòa chu kỳ tế bào (cell cycle) .........................................11 1.2.5. Hoạt tính điều hòa yếu tố nhân kappa B (NF-B) .................................12 1.2.6. Sàng lọc hoạt tính chống ung thư dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào và đích phân tử ............................................................................15 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 22 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. ................................................................22 2.2. Nội dung nghiên cứu......................................................................................22 2.2.1.Thu thập mẫu, sàng lọc hoạt tính sơ bộ và nghiên cứu tối ưu kỹ thuật huỳnh quang tế bào. ..........................................................................................22 2.2.2.Nghiên cứu thử nghiệm tác dụng của chất thử và phân tích các tín hiệu huỳnh quang đặc trưng. ............................................................................22 2.2.3.Nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB. ......................22 2.3. Vật liệu. ..........................................................................................................22 2.3.1.Dòng tế bào ..............................................................................................22 2.3.2.Mẫu thử nghiệm.......................................................................................22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
iv 2.3.3. Môi trường nuôi cấy tế bào ....................................................................23 2.3.4. Hóa chất và thiết bị. ................................................................................24 2.4. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................24 2.4.1. Nuôi cấy và hoạt hóa tế bào ...................................................................24 2.4.2. Đánh giá hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào – phương pháp MTT .....25 2.4.3. Kích hoạt yếu tố NF-κB .........................................................................27 2.4.4. Cố định tế bào .........................................................................................27 2.4.5. Nhuộm huỳnh quang tế bào và đích phân tử ..........................................28 2.4.6. Thu nhận và phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào trên hệ Olympus scanR .................................................................................................................28 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 30 3.1. Sàng lọc hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư .......................................30 3.2. Đánh giá hoạt tính chống ung thư đích phân tử NF-κB trên dòng tế bào HeLa ......................................................................................................................32 3.2.1. Kích thích chuyển vị NF-κB...................................................................32 3.2.2. Thu nhận hình ảnh huỳnh quang ............................................................33 3.2.3. Thiết lập thông số phân tích hình ảnh ....................................................35 3.2.4. Phân tích hình ảnh chuyển vị NF-κB .....................................................37 3.2.5. Thử nghiệm hoạt tính ức chế chuyển vị NF-κB trên tế bào HeLa .........42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 43 1. Kết luận .............................................................................................................43 2. Đề nghị ..............................................................................................................43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CHLB: Công hòa liên bang CTC: Cổ tử cung Dulbecco’s modified Eagle medium – Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM: DMEM DMSO: Dimethyl Sunfoxide EMEM: Eagle’s Minium Essential Medium – Môi trường EMEM GFP: Green fluorescent protein – Protein huỳnh quang xanh HBV: Hepatitis B virus – Viêm gan B HCTN: Hợp chất tự nhiên HCV: Hepatitis C virus – Viêm gan C Hela: Human cervical cancer cells – Tế bào ung thư cổ tử cung Hep-G2: Hepatocellular carcinoma – Tế bào ung thư gan HPV: Human papilloma virus – Virus u nhú ở người IC50: Inhibitory concentration 50%- Nồng độ ức chế 50% cá thể KHCNVN: Khoa học và công nghệ Việt Nam MTT: Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells – Yếu NF-κB: tố nhân kappa B OD: Optical density – Mật độ quang học PBS: Phosphate buffer saline – Đệm muối phosphate TB: Tế bào Tp: Thành phố UTCTC: Ung thư cổ tử cung UTG: Ung thư gan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Danh sách các mẫu hóa học sử dụng trong nghiên cứu sàng một số hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học .................................................. 23 Bảng 3.1: Hoạt tính gây độc tế bào của một số mẫu hợp chất thiên nhiên trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa .......................................................... 30 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Các giai đoạn tiến triển bệnh ung thư ......................................................... 3 Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh mới và tỷ lệ chết do các bệnh ung thư trên toàn thế giới năm 2018 cả hai giới ............................................................................ 5 Hình 1.3: Sự phát triển của các tế bào ung thư ........................................................... 6 Hình 1.4: Tín hiệu đích phân tử NF-κB liên quan các bệnh viêm. ........................... 13 Hình 1.7: Hệ thống sàng lọc/phân tích hiển vi huỳnh quang .................................... 21 Hình 2.1: Cấu trúc phân tử của tetrazolium và formazan ......................................... 26 Hình 3.1: Biểu đồ khả năng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ở các nồng độ khác nhau của các mẫu tinh sạch có biểu hiện hoạt tính ............. 32 Hình 3.3: Tương quan nồng độ chất cảm ứng và sự chuyển vị NF-κB ở dòng tế bào HeLa. Các chất tiền viêm cytokine: IL-1 (─●─) và TNF (--▲--) ......... 33 Hình 3.4: Autofocus hình ảnh tế bào HeLa trên kênh lọc DAPI theo peak chỉnh tinh (Fine) và chỉnh thô (Coarse) trên trục Z ................................... 34 Hình 3.5: Tín hiệu protein huỳnh quang xanh gắn với tiểu đơn vị NF-κB p65 (GFP-p65), DNA nhân tế bào (DAPI) và chồng hình ảnh huỳnh quang (MERGE). Hình ảnh được ghi trên thiết bị hiển vi huỳnh quang Olympus scanˆR. ......................................................................................... 35 Hình 3.6: Lựa chọn thông số xác định viền và kích thước hình ảnh đối tượng phân tíchtrên phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2 ................... 36 Hình 3.7: Tạo thông số xác định đường viền đối với đối tượng phân tích chính Main Object (kênh DAPI) và phần Sub-Object (tương ứng vùng tế bào chất “CytoI”, kênh GFP). Hình ảnh đường viền phân tách tốt với khoảng cách (distance) = -1. ................................................... 37 Hình 3.8: Phân tích hình ảnh thực trên phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2. Tế bào HeLa kích hoạt NF-κB bởi IL-110 ng/mL trong 30 phút......... 38 Hình 3.9: Phân tích sự chuyển vị NF-κB theo tỷ lệ huỳnh quang của protein p65 vùng tế bào chất và trong nhân (Nuc/Cyto) sử dụng phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2 ........................................................... 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
viii Hình 3.10: Xác định hệ số Z' đối với nhóm đối chứng (control) và tế bào HeLa kích hoạt với cytokine (hình-bảng trên). Biểu đồ phân tán cường độ tín hiệu vùng tế bào chất và trong nhân với đối chứng Control (-) và kích hoạt với IL-1 (hình dưới). ............................................................................ 41 Hình 3.11: Hợp chất SHTN-Zer4 điều hòa/ức chế yếu tố kappa B (NF-κB) của tế bào ung thư cổ tử cung HeLa qua đánh giá dựa trên sự chuyển vị NF-κB (p65 gắn GFP). Nhân được xác định đồng thời với nhuộm DAPI. ............................................................................................. 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nguồn hợp chất thiên nhiên (sinh vật biển và đất liền) luôn chiếm được sự quan tâm lớn trong nghiên cứu phát triển các sản phẩm mới có ích cho con người từ xa xưa tới nay. Sự đa dạng sinh học và hóa học trong sinh giới đã đóng một vai trò quan trọng trong lĩnh vực này. Tuy nhiên, vấn đề đáng quan tâm là làm thế nào để phát hiện và khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên này một cách có hiệu quả. Qua quá trình phát triển với việc áp dụng những công nghệ tiên tiến, ngày nay nghiên cứu hóa học định hướng hoạt tính sinh học đã trở thành cơ sở chính của sàng lọc hiệu năng cao (High Throughput Screening -HTS) ở nhiều nước trên thế giới nhằm phát hiện các hợp chất tiềm năng. Các phương pháp thử nghiệm sinh học trong sàng lọc hoạt tính trở thành công cụ mạnh mẽ cho việc tìm kiếm các hợp chất tiềm năng cho nhiều mục đích sinh học khác nhau. Trong đó lĩnh vực mà các hợp chất thiên nhiên vẫn giữ vai trò quan trọng là trong khai thác các thuốc chống ung thư. Điển hình như gần đây nghiên cứu các hợp chất từ sinh vật biển đã có nhiều thành công trong lĩnh vực này với ít nhất 15 chất đã được chứng nhận bởi FDA hoặc qua thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư. Công nghệ ghi hình ảnh tế bào sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động được phát triển nhằm truy suất được các kết quả phân tích kiểu hình cho các mục đích khác nhau và có thể phát triển quy mô sàng lọc trong khi giảm thiểu được các bước thực nghiệm. Bằng việc sử dụng các marker huỳnh quang tương thích sinh học có thể quan sát các ảnh hưởng lên chức năng sinh lý và thay đổi về kiểu hình tế bào từ đó đưa ra các chuẩn đoán về phương thức tác động của chất thử dựa vào “dấu vân tay sinh học” (fingerprint). Đó thường là các quá trình đóng vai trò then chốt trong quá trình sống và phân chia của tế bào. Thật vậy, kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào có thể được ứng dụng trong phân tích các tín hiệu tế bào (yếu tố NF-κB, Wnd/fzd, akt, glucocorticoid receptor...), sinh lý tế bào (sự tăng sinh TB, phosphoryl hóa, ty thể, chu kỳ TB, chuyển vị nội bào, quá trình chết theo chương trình của TB - apoptosis), đánh giá độc tính in vitro của thuốc/chất thử, sinh lý bệnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2 (miễn dịch, tim mạch, các bệnh truyền nhiễm...) và đánh giá chức năng phân tử đích. Sử dụng kỹ thuật này trong đánh giá các chất tiềm năng giúp các nhà hóa học, nhà dược học đánh giá chính xác hơn về hiệu quả của chất thử do đó tiết kiệm thời gian, kinh phí cho các thử nghiệm tiếp theo trên động vật (in vivo) đồng thời cung cấp các thông tin về tác dụng dược lý của chất thử. Do vậy, kỹ thuật sàng lọc hiệu năng cao dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào đang là nhân tố cốt lõi trong khoa học sự sống cũng như nghiên cứu phát triển thuốc hiện đại. Nhằm tiếp cận và bước đầu ứng dụng kỹ thuật hiện đại trong sàng lọc đánh giá các chất có hoạt tính sinh học, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: "Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào trong sàng lọc một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học". 2. Mục tiêu nghiên cứu. Mục tiêu đề tài luận văn là nghiên cứu khả năng ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào trong sàng lọc các chất có hoạt tính chống ung thư hướng đích phân tử (yếu tố nhân NF-κB) ở điều kiện trong nước. 3. Đối tượng nghiên cứu. * Họat tính chống ung thư ở mức độ tế bào được sàng lọc trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa * Đánh giá hoạt tính chống ung thư dựa trên phân tích chuyển vị protein nội bào (yếu tố nhân NF-κB) sử dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào với kính hiển vi huỳnh quang tự động. 4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn. Nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB trong các thử nghiệm mức độ tế bào thường gặp nhiều khó khăn do các tương tác protein nội bào xẩy ra nhanh và phức tạp. Kỹ thuật chuyển gel hay di động điện di EMSA (electrophoretic mobility shift assay) thường được sử dụng để phát hiện liên kết đặc hiệu NF-κB và DNA hoặc có thể sử dụng kỹ thuật Western blot. Một trong các yếu điểm của phương pháp này là chúng không cung cấp đầy đủ thông tin trong mẫu phân tích phức tạp và do đó thiếu độ tin cậy. Ví dụ, khi quan sát giảm 50 % độ mạnh tín hiệu phát hiện được không đồng nghĩa với việc giảm 50 % trong 100 % Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
3 quần thể đó. Trong khi đó phân tích trắc lưu tế bào flow cytometry có thể cung cấp nhiều dữ liệu từ số lượng lớn tế bào thử nghiệm, tuy nhiên rõ ràng kỹ thuật này không thể thu được các dữ liệu phân tích nội bào từ các tín hiệu huỳnh quang. Những hạn chế này có thể được khắc phục bằng kỹ thuật phân tích hình ảnh tế bào và chuyển vị nội bào sử dụng thiết bị hiển vi huỳnh quang. Do vậy chúng tôi nghiên cứu kết hợp phương pháp miễn dịch huỳnh quang và phân tích hình ảnh nội hàm cao trên hệ thiết bị hiển vi tự dộng Olympus scanˆR với quy trình đơn giản hơn và chi phí thấp, phù hợp với điều kiện trong nước. Hơn nữa, quy trình này đồng thời có thể phát triển ứng dụng cho phân tích các phân tử đích protein khác với đặc tính tương tự (chuyển vị nội bào tế bào chất - nhân), ví dụ như đối với NRF2 (nuclear factor erythroid-related factor 2) - một yếu tố phiên mã liên quan đến stress oxy hóa, ung thư và quá trình viêm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tầm quan trọng và ý nghĩa của vấn đề cần nghiên cứu Ung thư là nguyên nhân gây chết hàng đầu ở các nước có nền kinh tế phát triển và thứ hai ở các nước đang phát triển. Gánh nặng ung thư ở các nước đang phát triển tăng lên do hậu quả của lối sống không lành mạnh như hút thuốc lá, uống rượu bia, ít vận động hay ô nhiễm thực phẩm và môi trường. Chúng ta đã biết thực phẩm lành mạnh đóng vai trò quan trọng trong phòng và điều trị bệnh mãn tính không lây trong đó có ung thư. Chính vì vậy, hiện nay các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc thực vật, góp phần tích cực hỗ trợ điều trị bệnh ung thư. Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm và mưa nhiều nên có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Với nguồn thực vật phong phú không chỉ cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn là những phương thuốc chữa bệnh hết sức quý giá bao gồm thuốc chống ung thư nói riêng và các bệnh khác nói chung. Bởi vậy, nghiên cứu tìm ra các hợp chất từ nguồn dược liệu thiên nhiên có sẵn ở nước ta để hỗ trợ điều trị ung thư đã và đang được nhiều nhà khoa học và thầy thuốc đầu tư tập trung nghiên cứu trong nhiều năm nay [1]. Trong khoa học đã khám phá và sử dụng được nhiều hợp chất thiên nhiên (HCTN) có hoạt tính sinh học quý từ động, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, thế giới sinh vật rất phong phú và đa dạng, vẫn còn nhiều loài sinh vật chưa được nghiên cứu khai thác, đặc biệt là các sinh vật ở biển sâu [3]. Do vậy, nguồn HCTN (sinh vật biển và đất liền) luôn chiếm được sự quan tâm lớn trong nghiên cứu phát triển dược phẩm mới có ích cho con người từ xa xưa tới nay. Việc sàng lọc các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học để xác định các chất tiềm năng là vấn đề cần quan tâm đầu tiên trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc. Trong đó, lĩnh vực mà các HCTN và bán tổng hợp vẫn giữ vai trò quan trọng là trong khai thác các thuốc chống ung thư. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2 Công nghệ ghi hình ảnh tế bào (TB) sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động được phát triển nhằm truy xuất được các kết quả phân tích kiểu hình cho các mục đích khác nhau và có thể phát triển quy mô sàng lọc trong khi giảm thiểu được các bước thực nghiệm ngày nay đang được các nhà khoa học quan tâm và được nhiều phòng thí nghiệm trong điểm quốc gia đầu tư bài bản và hiện đại. Bằng việc sử dụng các marker huỳnh quang tương thích sinh học có thể quan sát các ảnh hưởng lên chức năng sinh lý và thay đổi về kiểu hình TB từ đó đưa ra các chẩn đoán về phương thức tác động của chất thử dựa vào “dấu vân tay sinh học” (fingerprint). Đó thường là các quá trình đóng vai trò then chốt trong chu trình sống và phân chia của TB. Thật vậy, kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang TB có thể được ứng dụng trong phân tích các tín hiệu TB (yếu tố NF-KB, Wnd/fzd, akt, glucocorticoid receptor,…), sinh lý TB (sự tăng sinh TB, phosphoryl hóa, ty thể, chu kỳ TB, chuyển vị nội bào, quá trình chết theo chương trình của TB - apoptosis), đánh giá độc tính in vitro của thuốc/chất thử, sinh lý bệnh (miễn dịch, tim mạch, các bệnh truyền nhiễm,…) và đánh giá chức năng giúp các nhà hóa học, các nhà dược học đánh giá chính xác hơn về hiệu quả của chất thử do đó tiết kiệm thời gian, kinh phí cho các thử nghiệm tiếp theo trên động vật (in vivo) đồng thời cung cấp các thông tin về tác dụng dược lý của chất thử. Đề tài luận văn được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các HCTN) – là đơn vị đầu tiên được trang bị hệ thống sàng lọc phân tích nội hàm cao trên thiết bị hiển vi huỳnh quang Olympus scan’R (Heidelberg, CHLB Đức) sử dụng cho mục đích sàng lọc, đánh giá các chất hoạt tính sinh học. Do vậy, đề tài này xuất phát từ yêu cầu và tính cấp thiết của việc phát triển các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học đạt trình độ tiên tiến, có độ chính xác cao, mặt khác nội dung thực hiện của đề tài này bao gồm sàng lọc, phân tích hoạt tính chống ung thư của một số mẫu hợp chất thiên nhiên ứng dụng kỹ thuật sàng lọc/phân tích hình ảnh huỳnh quang TB. 1.2. Tổng quan về các vấn đề nghiên cứu 1.2.1. Tổng quan về ung thư Ung thư là một thuật ngữ được sử dụng cho các bệnh mà các tế bào bất thường phân chia không kiểm soát và các thể xâm nhập vào các mô khác. Các TB ung thư có thể lan tới các bộ phận khác của cơ thể thông qua hệ thống máu và hạch bạch huyết. Có hơn 100 loại ung thư khác nhau đã được biết đến trong y văn thế giới, hầu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
3 hết chúng được đặt tên dựa vào mô hoặc cơ quan mà chúng gây bệnh [11]. Mỗi loại ung thư đều trải qua nhiều giai đoạn thứ tự thời gian: giai đoạn khởi phát, giai đoạn tăng trưởng và thúc đẩy, giai đoạn lan tràn, giai đoạn tiến triển – xâm lấn - di căn. Từ một tế bào, qua quá trình khởi phát dẫn đến những biến đổi mà không thể khồi phục kết quả là hình thành ung thư. Nếu không có sự sửa chữa hoặc có nhưng không kết quả thì cuối cùng ung thư sẽ có biểu hiện trên lâm sàng và dẫn đến tử vong. Hình 1.1. Các giai đoạn tiến triển bệnh ung thư Ngày nay, ung thư đã trở thành một mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng và đang thu hút sự chú ý trên toàn thế giới. Nguyên nhân ung thư có thể gây ra theo một trong ba yếu tố, đó là: chế độ ăn uống không lành mạnh, yếu tố di truyền và các yếu tố môi trường. Người ta ước tính khoảng 95% các loại ung thư là do lối sống và có thể mất khoảng 20 - 30 năm để phát triển thành ung thư. Con người hiện tại đang phải đối mặt với tỷ lệ ung thư và tử vong do ung thư ngày càng tăng [20]. Trong năm 2018, đã có khoảng 9,6 triệu người tử vong và hơn 18 triệu người bị ảnh hưởng trực tiếp bởi các loại ung thư khác nhau trên quy mô thế giới theo số liệu GLOBOCAN toàn cầu gần đây nhất của cơ cơ quan nghiên cứu Ung thư Quốc tế [28]. Các số liệu thống kê cho thấy đàn ông thường bị ung thư phổi, gan, ruột kết, trực tràng và ung thư tuyến tiền liệt, trong khi phụ nữ thường bị ung thư vú, ruột già, trực tràng và ung thư dạ dày [6]. Tại Việt Nam, Bộ Y tế dự báo rằng thế kỷ 21 sẽ là thế kỷ ung thư, bệnh tim mạch và các bệnh không lây nhiễm khác do quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa, cộng thêm các di chứng của chiến tranh vẫn tồn tại và đe dọa đến sức khỏe con người mỗi ngày [7]. Theo thống kê của một số bệnh viện ung bướu ở Hà Nội, Hồ Chí Minh và một số tỉnh khác trong năm 2008, có khoảng 100.000 đến 150.000 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
4 người mắc phải các loại ung thư khác nhau và trên 73% bệnh nhân (khoảng 70.000 bệnh nhân) tử vong cao nhất trên thế giới và con số này có xu hướng tăng trong tương lai gần. Dự báo đến năm 2020 sẽ có khoảng 200.000 ca ung thư mới và 100.000 ca tử vong mỗi năm tại Việt Nam [31]. Những bệnh ung thư phổ biến nhất thế giới Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
5 Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh mới và tỷ lệ chết do các bệnh ung thư trên toàn thế giới năm 2018 cả hai giới . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
6 Ung thư là một bệnh di truyền vì hầu hết các loại ung thư phát sinh từ sự thay đổi (đột biến) trong ADN (deoxyribonucleic acid) của TB bình thường. Ung thư bắt đầu gây tổn hại tới một hoặc nhiều gen trong một TB đơn lẻ. Tổn thương này làm cho các TB tăng sinh không kiểm soát được và tạo ra những TB bất thường. Ở giai đoạn này, nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể không tiêu diệt hay sửa chữa những TB bất thường này, thì chúng sẽ phát triển và cuối cùng chuyển thành TB ung thư. Các đặc tính của TB ung thư là chúng phân chia nhanh hơn các TB bình thường và hình thành khối u ác tính, những khối u này sẽ xâm nhập các mô khỏe mạnh. Quá trình của một TB bình thường trở thành khối ung thư thường mất nhiều năm để phát triển. Hình 1.3: Sự phát triển của các tế bào ung thư Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
7 Trong nghiên cứu in vitro cũng đã phân lập được hơn 200 dòng tế bào ung thư ở người và ngày càng được các phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm ứng dụng cho việc sàng lọc để tìm kiếm các thuốc tiềm năng chống ung thư trong tương lai. Trong đó có thể kể đến hai dòng ung thư phổ biến là dòng tế bào ung thư gan người (HepG2) và dòng tế bào ung thư cổ tử cung ở người (HeLa). Ngày nay, việc nghiên cứu sàng lọc để tìm kiếm các hoạt chất chống lại ung thư đã và đang được quan tâm hàng đầu từ các nhà khoa học theo hướng ức chế biểu hiện hoạt tính của một enzyme tham gia vào quá trình phát triển và di căn khối u, hoặc ức chế sự hình thành mạch và sự xâm nhập của các khối u nguyên phát ở mức độ tế bào, do đó có thể được sử dụng để ức chế sự di căn của khối mô ung thư. 1.2.2. Ung thư cổ tử cung Ung thư cổ tử cung (UTCTC) là ung thư hình thành trong mô cổ tử cung (CTC) được gây ra bởi việc nhiễm virus sinh nhú ở người (HPV). Hầu hết các trường hợp UTCTC đều bắt đầu trong vùng chuyển tiếp giữa cổ trong và cổ ngoài, các TB vùng chuyển tiếp bị tổn thương, nhiễm HPV và biến đổi dẫn dần, phát triển thành các tổn thương tiền ung thư rồi UTCTC. UTCTC là bệnh ung thư tiến triền chậm, giai đoạn đầu thường không có triệu chứng và có thể phát hiện thông qua các phương pháp sàng lọc UTCTC [2]. UTCTC gồm hai loại chính là ung thư TB biểu mô vảy và ung thư TB tuyến, khoảng 80% đến 90% UTCTC là ung thư TB biểu mô vảy phát triển trong TB vảy bao phủ bề mặt vùng cổ ngoài CTC, thường bắt đầu ở vùng chuyển tiếp. Ung thư TB tuyến CTC phát triển từ các TB trụ vùng cổ trong CTC. Có tỷ lệ rất nhỏ UTCTC có các tổn thương của cả hai loại ung thư biểu mô TB vảy và TB tuyến gọi là ung thư hỗn hợp [2]. 1.2.2.1. Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam và trên Thế giới UTCTC là loại ung thư hay gặp ở nữ giới. Bệnh tiến triển qua nhiều năm, ước tính trên thế giới có khoảng 1,4 triệu phụ nữ mắc UTCTC và nhiều hơn gấp 2 - 5 lần (khoảng 7 triệu) phụ nữ có triệu chứng tiền lâm sàng cần được phát hiện và điều trị. Theo kết quả của các ghi nhận ung thư trên thế giới, UTCTC đứng hàng thứ ba trong các loại ung thư chung, đứng thứ hai trong các ung thư ở nữ giới sau ung thư Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn