Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu xác định một số đoạn ADN mã vạch và nhân giống lan Phi điệp tím Hòa Bình (Dendrobium anosmun Lindley) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:86

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu xác định một số đoạn ADN mã vạch và nhân giống lan Phi điệp tím Hòa Bình (Dendrobium anosmun Lindley) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào sẽ là căn cứ để phân loại, lựa chọn, nuôi cấy và xây dựng dữ liệu gen quý góp phần quản lý tài nguyên thiên nhiên, bảo tồn nguồn gen quý của quốc gia. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu xác định một số đoạn ADN mã vạch và nhân giống lan Phi điệp tím Hòa Bình (Dendrobium anosmun Lindley) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP ---------------------------- LUẬN VĂN THẠC SỸ KH OA HỌC LÂM NGHIỆP ĐỖ QUỲNH LIÊN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐOẠN ADN MÃ VẠCH VÀ NHÂN GIỐNG LAN PHI ĐIỆP TÍM HÒA BÌNH (Dendrobium anosmun Lindley) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO CHUYÊN NGHÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. BÙI THỊ MAI HƯƠNG 2. PGS.TS. NGUYỄN VĂN VIỆT Hà Nội, 2020
i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào đã công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận văn của hội đồng khoa học. Hà nội, ngày….. tháng….. Năm 2020 Người cam đoan ( Tác giả ký và ghi rõ họ tên) Đỗ Quỳnh Liên
ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Văn Việt và TS. Bùi Thị Mai Hương đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm luận văn Thạc sĩ này. Tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong quá trình học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Học viên Đỗ Quỳnh Liên
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii MỤC LỤC ....................................................................................................... iii BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT ................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... x ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Chương 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ................................... 3 1.1. Giới thiệu chung về cây Phi điệp tím Hòa Bình .................................. 3 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại .................................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Phi điệp tím Hòa Bình ................ 4 1.1.3. Một số điều kiện sinh thái ............................................................. 5 1.1.4. Giá trị sử dụng ............................................................................. 6 1.2. Tổng quan về ADN mã vạch ............................................................... 7 1.2.1. Giới thiệu về ADN mã vạch (DNA barcode) ................................ 7 1.2.2. Một số locus được sử dụng làm chỉ thị mã vạch ADN ở thực vật ... 10 1.2.3.Những nghiên cứu về ứng dụng ADN mã vạch trong giám định loài .. 13 1.3. Tổng quan về nuôi cấy mô - tế bào. ................................................... 16 1.3.1. Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật 16 1.3.2. Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật.17 1.3.3. Thành tựu trong nuôi cây mô đối với chi Dendrobium ........................19 Chương 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 23 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................... 23 2.1.1. Mục tiêu tổng quát ...................................................................... 23 2.1.2. Mục tiêu cụ thể ............................................................................ 23 2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 23
iv 2.2.1. Xác định một số trình tự ADN mã vạch ...................................... 23 2.2.2. Nhân giống Phi điệp tím Hòa Bình bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào . 23 2.3. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.................. 23 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................... 23 2.3.2. Hóa chất ...................................................................................... 24 2.4. Phương pháp nghiên cứu xác đinh ADN mã vạch ........................... 26 2.4.1.Tách chiết DNA tổng số ............................................................... 26 2.4.2. Phương pháp nhân bản gen đích của kỹ thuật PCR ................... 28 2.4.3.Tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................. 29 2.4.4. Phương pháp đọc trình tự ........................................................... 30 2.4.5. Xử lý số liệu................................................................................. 30 2.5. Phương pháp nhân giống Phi điệp tím Hòa Bình bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào ............................................................................................ 30 2.5.1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch và nuôi cấy khởi động ... 30 2.5.2. Phương pháp nhân nhanh thể chồi ............................................. 31 2.5.3. Phương pháp nhân nhanh chồi ................................................... 32 2.5.4. Phương pháp nghiên cứu ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh ................. 34 2.5.5. Phương pháp huấn luyện và ra ngôi........................................... 35 2.5.6. Điều kiện thí nghiệm ................................................................... 36 2.5.7.Chỉ tiêu theo dõi, đánhgiá ............................................................ 36 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 37 3.1. Kết quả xác định một số đoạn ADN mã vạch.................................... 37 3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số .................................................. 37 3.1.2. Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR ...... 37 3.1.3. Phân tích kết quả ........................................................................ 38 3.2. Kết quả nhân giống cây Phi điệp tím Hòa Bình bằng nuôi cấy mô tế bào ...52 3.2.1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch và nuôi cấy khởi động. .. 52 3.2.2. Phương pháp nhân nhanh thể chồi ............................................. 55
v 3.2.3. Phương pháp nhân nhanh chồi. .................................................. 57 3.2.4. Phương pháp nghiên cứu ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh ................. 63 3.2.5. Phương pháp huấn luyện và ra ngôi........................................... 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 69
vi BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Giải nghĩa 1 ADN Deoxyribonucleic Acid 2 IBA Indol Butyric Acid 3 MS Murashige và Skoog(1962) 4 NAA a- Naphthalen acetic acid 5 CTTN Công thức thí nghiệm 6 ĐHST Điều hòa sinh trưởng 7 BAP 6 -benzynlaminopurin 8 Knops Knops Medium 9 ĐC Đối chứng 10 TB Trung Bình 11 TG Thời gian 12 CTAB Cetyl trimethylammonium bromide 13 PCR Phản ứng chuỗi polymerase 14 EDTA axit ethylenediamine tetraacetic 15 IAA Indol- acetic acid 16 WPM Woody plant medium 17 GA3 Gibberellin A3 Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ 18 NCBI sinh học 19 bp Cặp base 20 ITS Vùng AND nằm giữa các gen
vii TT Chữ viết tắt Giải nghĩa 21 IAE Tris-Acetate-EAIA 22 EBA Đệm tách A 23 EBB Đệm tách B 24 SOS Sodium Đoecyl Sulphate 25 UV Tia cực tím 26 ddNTP Dideoxy nucleotide
viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Dendrobium ................................................ 3 Bảng 2.1. Thành phần đệm tách A (100ml) .................................................... 24 Bảng 2.2. Thành phần đệm tách B (100ml) .................................................... 24 Bảng 2.3. Thành phần đệm TE (100ml).......................................................... 25 Bảng 2.4. Trình tự và thông tin của các cặp mồi được sử dụng ..................... 28 Bảng 2.5. Thành phần của một phản ứng PCR ............................................... 28 Bảng 2.6. Ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến tạo mẫu sạch và khả năng nảy mầm ...................................................................................... 31 Bảng 2.7. Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh thể chồi ............................................................................................................ 32 Bảng 2.8. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến nhân nhanh chồi....... 32 Bảng 2.9. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến nhân nhanh chồi ........ 33 Bảng 2.10. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi .................................................................................................................. 34 Bảng 2.11. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA tới khả năng ra rễ ............ 35 Bảng 2.12. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng cây khi ra ngôi ................................................................................................. 36 Bảng 3.1. Bảng so sánh khoảng cách di truyền của cây Phi điệp tím Hòa Bình với các loài Lan khác trên ngân hàng gen quốc tế NCBI của đoạn trình tự trnH-psbA ........................................................................................................ 40 Bảng 3.2. Bảng so sánh khoảng cách di truyền của cây Phi điệp tím Hòa Bình với các loài Lan khác của đoạn trình tự rbcL.................................................. 45 Bảng 3.3. Bảng so sánh khoảng cách di truyền của cây Phi điệp tím Hòa Bình với các loài Lan khác của đoạn trình tự ycf .................................................... 49 Bảng 3.4. Bảng so sánh khả năng phân biệt của Các đoạn trình tự ycf, trnH- psbA và rbcL ................................................................................................... 52 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến tạo mẫu sạch
ix và nảy mầm ..................................................................................................... 53 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh thể chồi (sau 6 tuần nuôi cấy) ......................................................................... 55 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi (sau 6 tuần nuôi cấy) ............................................................................... 57 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi (sau 6 tuần nuôi cấy) ............................................................................... 59 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi (sau 6 tuần nuôi cấy................................................................................. 61 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA tới khả năng ra rễ (sau 5 tuần nuôi cấy) .................................................................................................. 63 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng cây khi ra ngôi (sau 6 tuần ra ngôi) ................................................................. 65
x DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Ảnh lan Phi điệp tím Hòa Bình ......................................................... 4 Hình 3.1. Ảnh điện di ADN tổng số của 3 mẫu Phi điệp tím ......................... 37 Hình 3.2. Kết quả PCR các đoạn gen rbcL, ITS2, trnH-psbA, ycf của 3 mẫu Phi điệp tím Hòa Bình ..................................................................................... 38 Hình 3.3. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn trnH-psbA ..................... 40 Hình 3.4.Sự sai khác nucleotide của trình tự đoạn gen trnH-psbA giữa loài Phi điệp tím Hòa Bình với loài Dendrobium tosaense (các vị trí sai khác được bôi đỏ) ............................................................................................................................ 43 Hình 3.5. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn rbcL tạo bởi phần mềm mega 10 của cây Phi điệp tím Hòa Bình. ........................................................ 44 Hình 3.6. Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcL của loài Phi điệp tím Hòa Bình với trình tự của loài Dendrobium tosaense (các vị trí sai khác được bôi đỏ) . 47 Hình 3.7. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn ycf tạo bởi phần mềm mega 10 của cây Phi điệp tím Hòa Bình. ........................................................ 49 Hình 3.8. Sự sai khác trình tự đoạn gen ycf của loài Phi điệp tím Hòa Bình với trình tự của loài Dendrobium tosaense (các vị trí sai khác được bôi đỏ) . 51 Hình 3.9. Ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến tạo mẫu sạch và nảy mầm .......................................................................................................... 53 Hình 3.10. Hình ảnh Lan Phi điệp tím Hòa Bình ở giai đoạn tạo mẫu sạch và tái sinh thể chồi ............................................................................................... 54 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ các chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh chồi ................................................................................................ 56 Hình 3.12. Hình ảnh Lan Phi điệp tím Hòa Bình ở giai đoạn nhân nhanh thể chồi.57 Hình 3.13. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi ................................................................................................ 58 Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi ....................................................................................................... 60
xi Hình 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ BAP, Kinetin và NAA đến nhân nhanh chồi……………………………………………………………………..……66 Hình 3.16. Hình ảnh cây lan Phi điệp tím Hòa Bình qua các giai đoạn nuôi cấy ....62 Hình 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA tới khả năng ra rễ ............ 64 Hình 3.18. Hình ảnh cây lan Phi điệp tím Hòa Bình qua các giai đoạn nuôi cấy ................................................................................................................... 65 Hình 3.19. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng cây khi ra ngôi ................................................................................................. 66 Hình 3.20. Hình ảnh cây lan Phi điệp tím Hòa Bình ở giai đoạn cây lan đã huấn luyện ....................................................................................................... 66
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, hoa cây cảnh không những đóng vai trò quan trọng trong đời sống tinh thần mà còn ảnh hưởng đến tâm hồn con người và làm đẹp cho cảnh quan môi trường. Do đó, quan tâm và phát triển hoa cây cảnh là vấn đề cần thiết. Hoa lan là một trong những loại hoa được ưa chuộng nhất vì hình dáng, màu sắc, kích thước phong phú, đa dạng, được coi là nữ hoàng của các loài hoa.Trong đó Phi điệp tím Hòa Bình có tên gọi khác là Giã Hạc hay Giả Hạc có tên khoa học là Dendrobium annosmun Lindley, là giống lan quý của rừng nhiệt đới được nhiều người chơi Lan ưa chuộng không chỉ bởi khuôn bông đẹp, cây sai hoa mà còn đẹp cả về màu sắc lẫn hình dáng. Cánh hoa tao nhã, trên cánh có phủ lông mịn và có ánh kim, trên lưỡi thường có hai mắt tím đậm, nhất là bộ phận môi hoa có cấu trúc phức tạp và độc đáo. Phi điệp tím Hòa Bình có hương thơm đặc biệt, dễ chịu, thoang thoảng mà hầu như không có loại hương liệu nhân tạo nào sánh được. Phi điệp tím Hòa Bình đặc trưng riêng so với các loại phi điệp có nơi phân bố khác về hình dạng màu sắc hoa. Hoa Phi điệp tím Hòa Bình sẽ có cánh to hơn, có màu đậm hơn và có hương thơm đặc biệt hơn hoa Phi điệp ở khu vực phân bố khác. Ngoài giá trị làm cảnh phi điệp có thể làm thuốc để điều trị nhiều bệnh về da, suy nhược thần kinh và tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. Vì vậy, Phi điệp tím Hòa Bình mang lại hiệu quả kinh tế cao [7],[11]. Hiện nay người ta tiến hành nhân giống cây Phi điệp tím Hòa Bình thông qua hình thức ươm cây con bằng cành phát hoa và gieo hạt, tuy nhiên các phương pháp nhân giống trên cho hiệu quả không cao. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phương pháp nhân giống cây trồng cho hiệu quả cao. Nhiều loại cây đã được nhân giống thành công thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào Trước đây, việc phân loại hay giám định sinh vật chủ yếu dựa trên chỉ thị về hình thái hoặc các đặc tính sinh lý sinh hóa bên trong nhờ vào bảng
2 hướng dẫn định danh có sẵn. Phương pháp phân loại truyền thống này trong nhiều trường hợp còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế, như: nhiều sinh vật có hình thái rất giống nhau nhưng thực tế lại rất khác nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất khác nhau), ngược lại nhiều sinh vật có hình thái rất khác nhau nhưng lại rất gần nhau trong hệ thống phân loại (hệ gen rất giống nhau). Mặt khác, phương pháp phân loại này dựa trên các đặc điểm hình thái rất khó phân biệt được sự khác biệt giữa các biến dị dưới loài. Đặc biệt, đối với những mẫu vật có nguồn gốc sinh vật đã bị biến đổi về hình thái, như: những mẫu sinh vật đã chết, bị chôn vùi dưới đất, ở các công trình xây dựng, đã qua chế biến thì không thể xác định được bằng chỉ thị hình thái. Do đó, đòi hỏi cần có phương pháp định danh và phân loại hiện đại hơn khắc phục được những hạn chế này.Việc ứng dụng các gen mã vạch, xác định các đoạn ADN mã vạch là một phương pháp định danh, sử dụng một đoạn ADN chuẩn ngắn nằm trong bộ genome của sinh vật đang nghiên cứu để phục vụ giám định loài, mang lại hiệu quả cao trong thời gian ngắn, góp phần không nhỏ vào sự định danh và bảo tồn các loài thực vật trên thế giới. Phương pháp xác định các đoạn ADN mã vạch cũng được áp dụng phổ biến cho các loài thực vật có giá trị kinh tế cao. Do đó, việc xác định loài bằng ADN mã vạch có độ chính xác rất cao. Phương pháp này trở thành công cụ hữu hiệu cho các nhà khoa học trong việc phân loại, đánh giá đa dạng di truyền và quan hệ di truyền các loài,… Từ những lý do trên, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định một số đoạn ADN mã vạch và nhân giống lan Phi điệp tím Hòa Bình (Dendrobium anosmun Lindley) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào” sẽ là căn cứ để phân loại, lựa chọn, nuôi cấy và xây dựng dữ liệu gen quý góp phần quản lý tài nguyên thiên nhiên, bảo tồn nguồn gen quý của quốc gia.
3 Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Giới thiệu chung về cây Phi điệp tím Hòa Bình 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại Cây Phi điệp tím Hòa Bình hay còn gọi là Giã Hạc hay Giả Hạc, với danh pháp khoa học là Dendrobium anosmun Lindley, Phi điệp tím Hòa Bình là một loài Phong lan thuộc dòng Lan, Phi điệp tím Hòa Bình có đầy đủ các đặc tính của một phong Lan hoàng thảo như thân gồm nhiều giả hành mọc thành bụi, các giả hành phân thành các đốt như đốt tre nứa. Giá thể bám cho dòng lan này đều là các thân cây, xơ dừa hay rêu nếu như trong chậu. Lan Giả Hạc ưu thích khí hậu nhiệt đới vì vậy dòng Lan này được phân bố chủ yếu ở các nước Đông Nam Á như: Thái Lan, Lào, Việt Nam, Campuchia… Tại Việt Nam có ở các tỉnh như Cao Bằng, Hòa Bình, Phú Thọ, Thanh Hóa, Tây Ninh… Tuy nhiên, tùy vào xuất xứ mà Phi điệp tím mang đặc trưng riêng. Đặc biệt, Phi điệp tím Hòa Bình có hình dạng, màu sắc, hương thơm và vẻ đẹp độc đáo riêng biệt so với Phi điệp tím khác bởi cánh hoa to hơn, màu sắc và hương thơm đặc biệt [7]. Hệ thống phân loại: Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Dendrobium Giới Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp Moncotyledoneae Phân Lớp Liliidae Bộ Orchidales Họ Orchidaceae Chi Dendrobium Loài Dendrobium annosmun Lindley
4 Hình 1.1. Ảnh lan Phi điệp tím Hòa Bình Nguồn: hoalanhuyanh.com 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây Phi điệp tím Hòa Bình - Thân: Phi điệp tím Hòa Bình thuộc dạng thân thong, thân có thể dài tới 2m buông rũ xuống. Phi điệp tím Hòa Bình mọc thành từng cụm, thuộc nhóm đa thân và thân có giả hành. Gỉa hành chứa diệp lục, dự trữ nước và chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của giả hành mới và duy trì sự sống. Thân chia thành nhiều đốt, mỗi đốt chứa một mắt ngủ. Độ dài đốt phụ thuộc vào độ tuổi của cây, môi trường… Màu sắc thân Phi điệp tím Hòa Bình rất đa dạng từ màu xanh, chấm tím và tím tùy từng giai đoạn, đường kính thân có thể tới 1,5cm khi vào mùa nghỉ. Thân già các đời trước thì thường khô teo, màu nâu tím hoặc vàng như rơm [7],[11]. - Lá: Lá đơn mọc cách, xếp so le, mọng nước, dài 10-15cm, rộng từ 3-4 cm. Mép lá nguyên, hệ gân song song, đầu lá nhọn [11]. - Rễ: Phi điệp tím Hòa Bình thuộc loại rễ bì sinh, đường kính nhỏ khoảng 1,5-2mm, có hình trụ. Rễ rất dài, chóp rễ có màu xanh [11]. - Hoa: Phi điệp tím không những mọc trên những giả hành mới mà còn mọc trên các giả hành cũ. Hoa Phi điệp tím Hòa Bình nở vào cuối xuân - đầu hè (tháng 4 - 6 dương lịch), hoa to tới 10cm, mọc từ 1-3 chiếc ở các đốt đã
5 rụng lá. Trên cánh có phủ lông mịn và có ánh kim, trên lưỡi thường có hai mắt tím đậm. Hoa có hương thơm ngào ngạt và lâu tàn (2-3 tuần lễ). Nhiều hoa trên phát hoa, một cây nếu mạnh khỏe có thể ra tới 50-70 hoa [29],[32]. - Quả: Quả của Phi điệp tím Hòa Bình thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-6 đường nứt dọc. Khi chín quả nở ra, các mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Bên trong chứa rất nhiều hạt, khi chín hạt có màu vàng. Hạt cấu tạo bởi một phôi chưa phân hóa, chứa đầy không khí. Hạt rất nhiều và nhỏ, toàn bộ hạt trong một quả nặng chỉ bằng một phần mười mg, rất nhẹ nên dễ phát tán nhờ gió [11]. 1.1.3. Một số điều kiện sinh thái 1.1.3.1. Ánh sáng Phi điệp là cây ưa sáng nên có thể trồng nơi có nhiều ánh sáng nhưng không nên phơi dưới thời tiết nắng nóng cả ngày, rễ có thể bị cháy lá non. Tốt nhất nên có một lớp lưới che bảo vệ cây, giúp cây hấp thụ đủ lượng ánh sáng cần thiết mỗi ngày. Cây trồng không nên ở chỗ râm quá, cây sẽ quặt quẹo, lá xanh sẫm, thân lá còi cọc nhất là vào mùa đông, nếu thiếu nắng cây sẽ khó ra hoa. 1.1.3.2. Nhiệt độ Lan Phi điệp tím chịu nóng và chịu lạnh rất tốt. vào mùa nóng cây có thể chịu được nhiệt độ lên đến 38 độ C, còn vào mùa lạnh cây có thể chịu được nhiệt độ xuống thấp tới mứa 3,3,độ C. Tuy nhiên, vào mùa đông nếu nhiệt độ không lạnh dưới 15-16 độ C kéo dài trong khoảng 4 đến 6 tuần lễ thì giả hạc khó ra nụ 1.1.3.3. Độ ẩm và độ thông thoáng Phi điệp tím cũng cần nhiều độ ẩm vào thời điểm các thân non phát triển. Độ ẩm thông thường khoảng 60 - 70%. Loài này cũng thích sống trong điều kiện thoáng gió.
6 1.1.3.4. Lượng nước Nước là điều kiện cần thiết cho sự phát triển của lan, việc tưới nước đúng cách sẽ giúp cây sinh trưởng ổn định và ra hoa đều. Vào mùa hè khi lan ra mầm non và mọc mạnh cần tưới 2 đến 3 lần một tuần. Vào mùa thu, khi cây đã ngừng tăng trưởng, nên tưới nước thưa đi, mỗi tuần chỉ cần tưới một lần cho thân cây khỏi bị teo lại. Vào mùa đông, đây là thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, ngừng hẳn việc tưới nước. Nếu độ ẩm quá thấp nên phun sương mỗi tháng 1-2 lần. 1.1.3.5. Dinh dưỡng Phi điệp tím cũng yêu cầu một lượng dinh dưỡng nhất định để sinh trưởng và phát triển. Các thành phần dinh dưỡng như: N - P - K và các nguyên tố trung và vi lượng. Sử dụng phân NPK tỷ lệ: 10 - 20 - 30 nồng độ 3g/L định kỳ 1 tuần 1 lần. Khoảng 2 tháng trước khi Phi điệp tím ra hoa, phun NPK 15 - 20 - 25 nồng độ 2 g/L một tuần một lần, đến khi hoa tàn thì dừng bón phân. 1.1.4. Giá trị sử dụng 1.1.4.1. Giá trị thẩm mỹ Lan Phi điệp tím Hòa Bình được mệnh danh là món trang sức đẹp nhất mà thiên nhiên ưu đãi ban tặng cho loài người. Màu sắc hoa quyến rũ, trên cánh có phủ lông mịn và ánh kim, trên lưỡi thường có 2 mặt tím đậm với hương thơm ngào ngạt và lâu tàn. Thân cao khỏe và rất siêng hoa , một giả hành một lúc có thể cho rất nhiều hoa. Chính vì lẽ đó, Phi điệp tím Hòa Bình được con người dùng để thưởng lãm vẻ đẹp hay làm cảnh, trang trí, làm đẹp không gian sống [7], [11]. 1.1.4.2. Giá trị kinh tế Khác với các dòng lan Phi điệp khác, Phi điệp tím Hòa Bình mang lại giá trị kinh tế cao bởi sự đẹp lạ và độc đáo của nó. Phi điệp tím Hòa Bình đã chiếm một vị trí quan trọng điểm tô trong các hội nghị, đám cưới, bàn tiệc hay trang trí cô dâu.
7 Phi điệp tím Hòa Bình được khai thác và bán với giá rất cao. Năm 2019 giá lan Phi điệp tím tính theo kg vào khoảng 6 - 7 triệu/kg. Ngoài ra Phi điệp tím Hòa Bình được dùng để chiết xuất tinh dầu thơm trong công nghệ mỹ phẩm mang lại giá trị cho con người. 1.1.4.3. Giá trị y học Ngoài giá trị làm cảnh, Lan Phi điệp tím Hòa Bình còn có giá trị làm thuốc mà ít ai biết được trong nhiều bệnh về da, suy nhược cơ thể, suy nhược thần kinh, đau họng, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể… 1.2. Tổng quan về ADN mã vạch 1.2.1. Giới thiệu về ADN mã vạch (DNA barcode) Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ và toàn diện. Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa). Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài. Ngoài ra, phương pháp phân loại hình thái thường chỉ được thực hiện bởi các chuyên gia hình thái học, việc phân loại đôi khi tốn nhiều thời gian và công sức. Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử. Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn ADN) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen. Trong phương pháp phân loại phân tử, các kỹ thuật thường được
8 ứng dụng để nghiên cứu tính đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, xây dựng cây phát sinh chủng loại cũng như giúp nhận dạng đến cấp phân loại loài hoặc chi. Ở thực vật, một số phương pháp chỉ thị phân tử được sử dụng để nhận dạng loài cũng như sử dụng enzyme giới hạn kết hợp với lai ADN (RFLP), dấu vân tay ADN (DNA fingerprinting), phản ứng chuỗi trùng hợp PCR và đặc biệt việc sử dụng các kỹ thuật mã vạch ADN (DNA barcode) ngày càng trở nên phổ biến. Các phương pháp này đều dựa trên thực tế rằng cấu trúc hóa học của ADN từ mọi loài là giống nhau và sự khác biệt duy nhất giữa chúng là trình tự các cặp base. Năm 2003, nhà nghiên cứu tại đại học Guelph, Canada - Paul Hebert - đã đề xuất một phương pháp xác định loài dựa trên ADN mã vạch (DNA barcode). Mã vạch ADN là trình tự nucleotide của một chuỗi ADN ngắn, có cùng nguồn gốc tổ tiên, trong đó có vùng ít bị thay đổi (vùng bảo thủ) và vùng thay đổi theo quá trình tiến hóa [36]. Ngoài ra việc lựa chọn một vùng trình tự làm ADN mã vạch còn cần phải mang những đặc điểm sau: Có độ dài thích hợp (không quá ngắn để có độ đa hình về trình tự giữa các taxon, không quá dài để có thể giải trình tự theo cách thông thường, thậm chí cả khi trong điều kiện chưa được tối ưu); không phải vùng dị hợp để có thể nhân bản trực tiếp trình tự mà không cần tách dòng; thuận lợi trong việc so sánh trình tự dựa trên vị trí khác biệt các base và không có đoạn trình tự chưa chắc chắn như một vài đoạn lặp microsatellite làm giảm chất lượng trình tự [25]. Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự ADN này để đánh giá sự sai khác di truyền giữa các sinh vật. Hai mẫu vật của hai loài có thể có hình thái bên ngoài rất giống nhau, song chúng có thể được phân biệt bằng cách sử dụng ADN mã vạch. Với ưu thế đó, ADN mã vạch có thể được sử dụng cho hai mục đích chính: nhận dạng về mặt phân tử cho các loài đã được mô tả và tìm ra các loài mới chưa được mô tả [24].