Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

DƯƠNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY SÓI RỪNG

(Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2020

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

DƯƠNG THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY SÓI RỪNG

(Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai)

BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

Ngành : Công nghệ sinh học

Mã số ngành: 8.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. TRẦN THỊ THU HÀ

2. TS. NGUYỄN XUÂN VŨ

Thái Nguyên - 2020

i

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu nhân

giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (thunb.) Nakai) bằng kỹ thuật nuôi cấy in

vitro” là trung thực, được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp -

Đại học Nông lâm - Đại học Thái Nguyên. Ngoài ra, trong bài báo cáo có sử dụng

một số nguồn tài liệu tham khảo đã được trích dẫn rõ ràng và được phép công bố.

Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về tính trung thực của các nội dung trong đề

tài của mình.

Học viên

ii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được

sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân.

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn

PGS.TS. Trần Thị Thu Hà và TS. Nguyễn Xuân Vũ đã luôn tận tình hướng dẫn,

giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này.

Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp

cùng các cán bộ, quý đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề

tài nghiên cứu này.

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,

người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và

thực hiện đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020

Học Viên

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................................i

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. ii

MỤC LỤC .................................................................................................................. iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................vi

DANH MỤC BẢNG.................................................................................................. vii

DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. viii

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................. 2

Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3

1.1. Giới thiệu về Chi Sói rừng và loài cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.)

Nakai) ............................................................................................................................ 3

1.1.1.Phân loại, phân bố ................................................................................................ 3

1.1.2. Đặc điểm thực vật học ........................................................................................ 3

1.1.3. Giá trị của cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) .............................. 4

1.2. Cơ sở việc định danh loài và xác định quan hệ di truyển ...................................... 5

1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng ..................................................... 7

1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng trên thế giới ............................. 7

1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng ở nước ta ................................. 8

1.4. Cơ sở phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống) ....................................... 9

1.4.1. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................. 10

1.4.2. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................ 10

1.4.3. Các phương pháp nuôi cấy mô ......................................................................... 10

1.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật .............................................. 11

1.4.5. Các giai đoạn trong nhân giống invitro ............................................................ 15

Chương 2.ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 18

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ....................................................................... 18

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 18

iv

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................... 18

2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 18

2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 18

2.3.1. Điều tra đánh giá thực trạng phân bố và thu thập mẫu nghiên cứu .................. 18

2.3.2. Phương pháp nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng đặc điểm

hình thái ...................................................................................................................... 21

2.3.3. Phương pháp nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng chỉ thị DNA ....... 22

2.3.4. Phương pháp nhân giống in vitro cây Sói rừng ................................................ 25

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 28

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................................... 29

3.1. Điều tra, đánh giá thực trạng phân bố, giá trị sử dụng của của loài

Sói rừng và thu thập mẫu. ........................................................................................... 29

3.2. Kết quả nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng đặc điểm hình thái ......... 34

3.2.1. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Xín Mần ....................... 34

3.2.2. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Mèo Vạc ....................... 35

3.2.3. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Quản Bạ ........................ 36

3.2.4. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Hoàng Su Phì ............... 37

3.2.5. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Vị Xuyên ...................... 38

3.3. Kết quả nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng chị thị DNA ................... 40

3.3.1. kết quả tách chiết DNA tổng số của mẫu Sói rừng nghiên cứu ........................ 40

3.3.2. Kết quả PCR của mẫu Sói rừng nghiên cứu ..................................................... 41

3.3.3. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA của mẫu Sói rừng nghiên cứu .............. 42

3.3.4. Kết quả phân tích đa dạng di truyền, xác định mối quan hệ di truyền giữa 15

mẫu Sói rừng nghiên cứu ............................................................................................ 43

3.4. Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro cây Sói rừng ......................................... 45

3.4.1. Chọn vật liệu khởi đầu ...................................................................................... 45

3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng

tạo mẫu vô trùng ......................................................................................................... 45

3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng

nhân nhanh chồi Sói rừng ........................................................................................... 47

v

3.4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh đến

khả năng ra rễ chồi Sói rừng ....................................................................................... 55

3.4.5. Nghiên cứu đưa cây ra nhà kính ....................................................................... 58

3.4.6. Chăm sóc cây giai đoạn in vitro .......................................................................... 6

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................... 64

1.Kết luận .................................................................................................................... 64

2. Kiến nghị ................................................................................................................. 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 66

vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ Từ, thuật

ngữ viết tắt (Cả tiếng anh và tiếng việt)

Deoxyribonucleic acid DNA

Plolemerase Chain reaction PCR

Sói rừng SR

Cộng sự Cs

Indole - 3- acetic acid IAA

Naphthylacetic acid NAA

Benzylaminopurine BAP

Indo – 3 – butyric acid IBA

Murashige Skoog MS

Công thức CT

Least Singnificant Difference Test – Sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa LSD

Coeficient of Variation – Hệ số biến động CV

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Đặc điểm phân bố Sói rừng theo tuyến điều tra ......................................... 31

Bảng 3.2. Đặc điểm mẫu thu thập ............................................................................... 33

Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Xín Mần ........... 34

Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Mèo Vạc ........... 35

Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Quản Bạ ........... 36

Bảng 3.6. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Hoàng Su Phì ... 37

Bảng 3.7. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Vị Xuyên .......... 38

Bảng 3.8. Danh sách 15 mẫu lá Sói rừng trong nghiên cứu ....................................... 40

Bảng 3.9. Độ dài trình tự của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu ....................................... 42

Bảng 3.10: Hệ số tương đồng di truyền giữa 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu và 2 mẫu

tham chiếu ................................................................................................................... 44

Bảng 3.11. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1%

đến khả năng tạo mẫu vô trùng (sau 4 tuần nuôi cấy) ................................................ 46

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi

Sói rừng (sau 4 tuần nuôi cấy) .................................................................................... 48

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi

sau 4 tuần nuôi cấy (sau 4 tuần nuôi cấy) ................................................................... 50

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với NAA đến

hệ số nhận chồi (sau 4 tuần nuôi cấy) ......................................................................... 52

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin với IBA đến hệ số nhận chồi

sau 4 tuần nuôi cấy ...................................................................................................... 54

Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của

chồi Sói rừng ............................................................................................................... 56

Bảng 3.17. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi

Sói rừng ....................................................................................................................... 57

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sói rừng

in vitro sau 8 tuần theo dõi .......................................................................................... 59

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cây Sói rừng ................................................................................................. 3

Hình 3.1. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Xín Mần ................................................. 35

Hình 3.2. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Mèo Vạc ................................................. 36

Hình 3.3. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Quản Bạ ................................................. 37

Hình 3.4. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Hoàng Su Phì ......................................... 38

Hình 3.5. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Vị Xuyên ................................................ 39

Hình 3.6. kết quả tách chiết DNA tổng số của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu ............. 41

Hình 3.7. Kết quả PCR của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với cặp mồi

ITS4/ITS5; M: Marker generuler 1kb plus DNA ....................................................... 42

Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với mẫu tham

chiếu MH270480.1 Chloranthus erectus và KP317601.1 Sarcandra glabra .............. 44

Hình 3.9. Kết quả khử trùng mẫu đoạn thân Sói rừng bằng HgCl2 0,1% ................. 47

Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cây Sói rừng ............. 49

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin đến hệ số nhân chồi

cây Sói rừng ................................................................................................................ 51

Hình 3.12. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với NAA đến đến hệ số nhận chồi

cây chồi Sói rừng ........................................................................................................ 53

Hình 3.13. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với IBA đến khả năng nhân

nhanh chồi Sói rừng .................................................................................................... 55

Hình 3.14. Ảnh hưởng của NAA đến kết quả ra rễ chồi Sói rừng.............................. 57

Hình 3.15. Ảnh hưởng của IBA đến kết quả ra rễ chồi Sói rừng ............................... 58

Hình 3.16. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sói rừng ........ 59

Hình 3.17. Sói rừng giai đoạn sau in vitro .................................................................... 8

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Cây Sói Rừng còn gọi là cây sói nhẵn, cây cửu tiết trà, cây thảo san hô, cây

quan âm trà, cây tiếp cốt mộc, cây cửu tiết phong, cây cửu tiết lan, cây sơn hồ tiêu,

cây cốt thuộc họ Hoa sói (Chloranthaceae). Sói Rừng là loại cây giàu dược tính nên

được khai thác để sử dụng làm thuốc chữa trị nhiều bệnh. Đông y cho rằng, cây sói

rừng có vị đắng, cay, tính hơi ấm. Có tác dụng kháng khuẩn tiêu viêm, khu phong trừ

thấp, hoạt huyết chỉ thống. Chủ trị viêm phổi, viêm phế quản, viêm ruột thừa cấp

tính, viêm dạ dày ruột cấp tính, nhiễm khuẩn, phong thấp đau nhức, đòn ngã tổn

thương, gãy xương...Trong dân gian, thường dùng rễ cây này ngâm rượu uống để

chữa tức ngực, đau nhức xương khớp; còn dùng toàn cây sắc uống trị cảm mạo, kinh

nguyệt không đều và viêm phổi. Lá sắc uống trị ho, giã đắp chữa rắn cắn.

Cây Sói rừng phân bố ở nhiều nước như Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản,

Ấn Độ, Việt Nam và Malaysia. Ở Việt Nam, cây Sói rừng mọc hoang ở khắp nơi,

những khu vực đất ẩm ướt, mát, hốc đất trên núi đá. Sói rừng phân bố ở các tỉnh như

Hà Giang, Yên Bái, Phú Thọ, Bắc Kạn, ...

Điển hình ở Hà Giang có trên 1.100 loài cây dược liệu trong tổng số hơn 5000

loài cây dược liệu của cả nước; được đánh giá là vùng trọng điểm về đa dạng cây

dược liệu quý, có giá trị kinh tế cao và là vùng trọng điểm của nước ta để phát triển

cây dược liệu gắn với phát triển du lịch sinh thái vùng cao. Hà Giang có điều kiện tự

nhiên, sinh thái rất thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển nhiều loại cây dược liệu

trong đó có cây Sói rừng, đặc biệt trong sản xuất giống, bảo tồn và sản xuất các loài

dược liệu quý hiếm.

Tuy nhiên, hiện nay các loài cây thuốc quý đang bị khai thác cạn kiệt và nhiều

loài đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Vì vậy, việc nghiên cứu, bảo tồn và phát triển

các loài cây dược liệu, đặc biệt là các loài dược liệu quý, có giá trị kinh tế cao đã và

đang được tỉnh Hà Giang xem là nhiệm vụ trọng tâm và cấp bách theo Kết luận số

71-KL/TW ngày 24/9/2014 của Ban Bí thư Trung ương và triển khai mục tiêu phát

triển bền vững nguồn tài nguyên dược liệu của tỉnh và vùng Tây Bắc. Ở nước ta công

tác bảo tồn các loài cây dược liệu chưa thực sự gắn với phát triển. Để phát triển, công

2

tác chọn tạo giống, công nghệ nhân và nuôi trồng giống tốt cung cấp nguyên liệu

chất lượng cần được quan tâm. Chính vì vậy, việc cải tiến áp dụng công nghệ trong

bảo tồn, nhân giống là một giải pháp hữu hiệu giải quyết vấn đề về phát triển dược

liệu hiện nay. Theo báo cáo của hầu hết các tỉnh ở vùng núi phía Bắc, việc bảo tồn và

phát triển các loài cây dược liệu tại địa phương còn nhiều hạn chế từ giống cho đến

trồng và thu hoạch. Giống sử dụng không rõ nguồn gốc, giống tạp, chất lượng chưa

cao, nhân giống bằng phương pháp truyền thống nên giống không được đảm bảo cả

số lượng và chất lượng. Từ những lý do đó tôi thực hiện nghiên cứu "Nghiên cứu

nhân giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai) bằng kỹ thuật nuôi

cấy in vitro” làm cơ sở khoa học cho công tác bảo tồn và phát triển loài cây Sói rừng

của tỉnh Hà Giang.

2. Mục tiêu nghiên cứu

* Mục tiêu chung

Xây dựng quy trình nhân giống cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.)

Nakai) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào.

* Mục tiêu cụ thể

- Điều tra, đánh giá, thu thập mâu nghiên cứu

- Nhận dạng được loài cây Sói rừng bằng đặc điểm hình thái

- Nhận dạng được đúng loài cây Sói rừng bằng chỉ thị DNA

- Nghiên cứu được chất khử trùng và thời gian khử trùng cho tỷ lệ mẫu vô trùng cao

- Nghiên cứu được chất kích thích sinh trưởng phù hợp đến khả năng nhân nhanh

chồi cây Sói rừng

- Nghiên cứu được chất kích thích sinh trưởng (NAA, IBA) cho giai đoạn ra rễ

chồi cây Sói rừng

- Nghiên cứu được loại giá thể phù hợp cho cây Sói rừng giai đoạn sau in vitro

3. Địa điểm nghiên cứu

- Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp –

Đại học Nông lâm Thái Nguyên

3

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về Chi Sói rừng và loài cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.)

Nakai)

1.1.1.Phân loại, phân bố

Sói rừng có tên khoa học là: Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai. Giới: Plantae;

Bộ: Chloranthales; Họ: Chloranthaceae; Chi: Sarcandra; Loài: Glabra (Đỗ Huy

Bích, 2011) [3].

Ngoài ra còn có tên khác như: Chloranthus brachystachys Blum, Chlorathus

glaber (Thunb.) makino, Sarcandra Chloranthus Gardeno, thuộc họ Hoa sói

Chloranthaceae. Ở Việt Nam cây Sói rừng còn có một số tên gọi khác như: sói lãng,

sói nhẵn, cửu tiết kim túc lan, cửu tiết trà, cửu tiết phong, trúc tiết trà, tiếp cốt liên,

thảo sách hồ, tiếp cốt mộc (Võ Văn Chi, 2012) [4].

Cây Sói rừng phân bố ở nhiều nước: Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn

Độ, Việt Nam và Malaysia. Ở Việt Nam cây mọc từ Hà Giang (Vị Xuyên), Sơn La

(Mộc Châu), Cao Bằng (Thạch An, Nguyên Bình, Tĩnh Túc), Lạng Sơn (Hữu Lũng,

Bắc Sơn), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Nội (Hà Tây), Thừa Thiên Huế, Kom Tum

(Đác lây, KonPlong), Lâm Đồng (Đà Lạt, Bảo Lộc) (Võ Văn Chi, 1996) [5].

1.1.2. Đặc điểm thực vật học

Hình 1.1. Cây Sói rừng

4

Cây Sói rừng có chiều cao 1 - 2 mét, thân nhẵn, các mấu hơi phồng. Nhánh

cây tròn, không có lông, các lá mọc đối, phiến dài hình bầu dục hay hình ngọn giáo,

chiều dài 7 - 20 cm và rộng 2 - 8 cm với 5 - 7 cặp gân bên. Mép lá có răng cưa nhọn

và thô. Cuống lá dài 5 - 8 mm. Bông kép, ít nhánh, nhánh ngắn với hoa nhỏ màu

trắng không có cuống và có một nhị. Bầu nhụy có hình trứng và không có vòi. Cây

ra quả mọng nhỏ, hình gần tròn đường kính 3 - 4 mm, khi chín có màu đỏ hay đỏ

gạch. Cây ra hoa vào tháng 6 - 7 và quả chín vào tháng 8 - 9. Sói rừng mọc hoang ở

vùng núi đất, ở rìa rừng và ven đồi ẩm nhiều nơi và lên đến độ cao 1000m. Thu hái

toàn cây vào mùa hạ thu, có thể dùng tươi hoặc phơi khô (Võ Văn Chi, 1997) [5].

1.1.3. Giá trị của cây Sói rừng (Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai)

1.1.3.1. Giá trị kinh tế

Sói rừng là cây dược liệu có hiệu quả kinh tế cao đang thu hái ở nhiều tỉnh

miền núi nước ta.

1.1.3.2. Giá trị dược liệu

Theo Đông y, cây Sói rừng có vị đắng, tính hơi ấm, có tác dụng hoạt huyết

giảm đau, khử phong trừ thấp, tiêu viêm giải độc. Trong dân gian, rễ cây được ngâm

rượu, uống chữa đau tức ngực. Lá được sắc uống hỗ trợ trị bệnh lao, hoặc giã đắp hỗ

trợ trị rắn cắn, ngâm rượu xoa bóp hỗ trợ trị vết thương, mụn nhọt, phong thấp, đau

nhức xương. Theo Perrot và Hurrier (1906), toàn bộ cây sói rừng cũng được dùng để

hỗ trợ điều trị bệnh động kinh.

Kết quả nghiên cứu hiện đại cho thấy, sói rừng có tác dụng ức chế đối với tụ

cầu khuẩn vàng staphylococcus aureus, trực khuẩn lỵ, trực khuẩn bacillus coli, trực

khuẩn mủ xanh bacillus pyocyaneus; trực khuẩhn thương hàns… Lá có tác dụng

kháng khuẩn mạnh nhất; rễ và cành tươi có tác dụng mạnh hơn rễ và cành khô.

Hỗ trợ điều trị ho, suy nhược, viêm khớp, đau nhức xương, nắn bó gẫy xương

làm giảm u bướu, giảm ứ đọng máu, cải thiện chức năng tuyến tụy, hỗ trợ trị đau dạ

dầy. Toàn cây Hoa sói rừng có cả tác dụng chống ung thư, lẫn tác dụng kháng khuẩn,

nên dùng để hỗ trợ trị ung thư có biến chứng nhiễm khuẩn rất tốt. Đã thấy có hiệu

quả tốt hơn đối với các loại ung thư dạ dầy, ung thư gan, ung thư tuyến tụy, ung thư

thực quản, bệnh bạch cầu và sarcom lưới dòng lympho (Mai Hải Yến, 2010) [15].

Cây Sói rừng cũng có tác dụng mạnh chống lại ôxi hóa, giúp giải nhiệt, tiêu

độc, làm tăng sự sản xuất các tiểu cầu trong máu (từ đó giúp tiêu trừ các huyết khối),

5

tăng tuần hoàn máu và chống viêm. Cũng có các tài liệu cho rằng S. glabra giúp

giảm mệt mỏi trong điều trị ung thư và được đề xuất sử dụng như một giải pháp thay

thế trong điều trị, nhưng chưa có thử nghiệm nào chứng thực điều này.

Sói rừng được sử dụng như một tác nhân dự phòng hóa học, trên bệnh nhân

điều trị bằng tác nhân hóa trị liệu, do có cả 2 tác dụng tăng cường miễn dịch và ức

chế phát triển của tế bào ung thư. Nước sắc toàn cây sói rừng có tác dụng thực bào,

một dạng của tác dụng chống ung thư, nhưng tinh dầu của sói rừng, lại có tác dụng

ức chế thực bào, giống như tác dụng không mong muốn của cyclophosphamid, vì

vậy trước khi sử dụng sói rừng, nên đun sôi thật kỹ, để loại bỏ tinh dầu. isoilaxidin

chiết xuất từ cây sói rừng, có tác dụng ức chế manh bệnh bạch cầu dòng lympho.

Một số cách sử dụng cây Sói rừng:

Hỗ trợ phòng cảm mạo: Dùng sói rừng 10 – 15g, mùa đông thêm tía tô 6g, mùa

hè thêm kim ngân hoa 6g, sắc nước uống thay trà trong ngày.

Hỗ trợ điều trị các chứng viêm nhiễm (có tác dụng chống viêm rất tốt): Mỗi

ngày dùng 30 - 40g cành lá sói rừng tươi, sắc lấy nước, chia 3 lần uống, liên tục 2 - 3

ngày hoặc có thể kéo dài ngày hơn.

Hỗ trợ điều trị đau lưng: Dùng cành lá sói rừng 10 - 15g, sắc với nửa rượu nửa

nước, chia ra uống trong ngày.

Hỗ trợ điều trị đòn ngã tổn thương, gãy xương, viêm khớp xương do phong

thấp: Dùng cây tươi, giã nát, sao rượu, đắp; hoặc dùng 15-30g rễ sắc với nước hoặc

ngâm rượu uống.

Hỗ trợ điều trị ngoại thương xuất huyết: Dùng cây tươi, giã nát, đắp; hoặc dùng

15 - 30g rễ, ngâm rượu uống.

Hỗ trợ điều trị vết thương loét, không liền miệng: Dùng cành lá, lượng thích

hợp, nấu nước rửa, ngày 1- 2 lần.

Hỗ trợ điều trị bỏng: Dùng lá sói rừng, phơi khô, tán mịn, trộn thêm 2 phần dầu hạt

sở hoặc dầu vừng; hàng ngày bôi vào chỗ bị bỏng.

1.2. Cơ sở việc định danh loài và xác định quan hệ di truyển

Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định loài

ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc như những

loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau, càng gần nhau thì tính chất

6

giống nhau càng nhiều. Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh

lý sinh hoá, phôi sinh học. Đối với thực vật, đặc điểm hình thái học của các loài thực

vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ưu điểm dễ quan

sát trực tiếp bằng trực quan nhưng chỉ dựa vào thống kê phân tích một hoặc nhiều

tính trạng được thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả thấp. Điều này thật sự gặp nhiều

khó khăn khi các mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn, mất hình thái bên

ngoài. Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh nghiệm dân gian sẽ

được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại.

Các phương pháp phân loại học phân tử và xác định loài là hướng nghiên cứu

được phát triển mạnh trên thế giới hiện nay, được xây dựng dựa trên việc nhận biết

thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu của các taxon sinh vật. Hiện nay, các kỹ

thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp có hiệu quả cao trong việc định loại và

giám định loài.

Phân loại học phân tử có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen

nhân, hệ gen của các bào quan như ti thể, lục lạp hoặc các sản phẩm của gen như

protein, enzyme. Mỗi loại gen, sản phẩm của gen lại phù hợp với từng đối tượng và

mục đích nghiên cứu khác nhau. Do đó, việc lựa chọn gen nào, loại protein nào có ý

nghĩa lớn đối với sự thành công của mỗi hướng nghiên cứu. Các kỹ thuật thường

được sử dụng bao gồm: kỹ thuật isozym (đồng enzyme), các kỹ thuật phân tích so

sánh trình tự nucleotide các đoạn DNA như phương pháp đa hình chiều dài các đoạn

cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), các kỹ thuật trên

cơ sở phản ứng PCR như SSR (Simple Sequence Repeats), đa hình các đoạn DNA

nhân bản ngẫu nhiên - RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA) (Harvey và

cộng sự, 1996; Roman và cộng sự, 2003), đa hình chiều dài các đoạn DNA nhân bản

- AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), phân tích trình tự DNA …

(Phạm Hồng Sơn, 2006; Lê Duy Thành và cộng sự, 2005) đã giúp giải quyết các mối

nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ

chủng loại và tiến hoá của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật. Thêm vào đó

các kỹ thuật này cũng được sử dụng như những chỉ thị phân tử để xác định những

gen kiểm soát hoặc có liên quan đến tính trạng nào đó của các cá thể, loài hay các

nhóm loài [12], [13], [25].

7

Gần đây, việc sử dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để định danh loài

đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng góp

đáng kể trong việc phân loại loài. Để nhận dạng gen hay đánh giá mức độ tiến hoá

loài thì các nhóm gen chính thường được sử dụng là gen ribosome rRNA, gen ty thể,

và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen rRNA 18S, 5S và 16S hay được dùng để đánh

giá mối quan hệ tiến hoá giữa các sinh vật. So với chỉ thị hình thái và chỉ thị hoá học,

chỉ thị DNA cho độ chính xác cao hơn mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách

quan nào.

Quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều

khó khăn. Ở thực vật hệ gen lục lạp mang nhiều đặc điểm thích hợp đối với chỉ thị

DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal

Transcribed Spacer) thường được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu

(Borsch và cộng sự, 2003; Shaw và cộng sự, 2007; Van và cộng sự, 2000) [16].

Trong nhiều năm gần đây, nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất là chỉ

thị DNA cho thực vật. Tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà

phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận. Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng

đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA

chỉ thị để định danh loài đối với thực vật (Chase và cộng sự, 2005; Kress và cộng

sự, 2008) [17].

1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng

1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng trên thế giới

Sói rừng có thể được nhân giống hữu tính bằng hạt, hoặc vô tính bằng giâm

hom, nuôi cấy mô tế bào. Ở Trung Quốc, S. glabra được nhân giống bằng giâm

hom. Cây 2 năm tuổi cho tỷ lệ hom ra rễ đạt 88,7% sử dụng hom nhúng vào dung

dịch 200mg/L ABT-1 trong 30 phút (Qiu, 2012; Zhu et al., 2010); 82% khi xử lý

với dung dịch 200mg/L IBA (Liu et al., 2008) [24].

Ở Trung Quốc, cây được dùng để chữa một số bệnh ung thư: ung thư tụy, dạ

dày, trực tràng, gan, lỵ, gãy xương, thấp khớp, đau lưng, cảm mạo, kinh nguyệt

không đều, hoa được dùng để ướp trà. Các nhà khoa học Trung Quốc, Mỹ, Nhật

Bản kết luận rằng thành phần hóa học chủ yếu của cây Sói rừng là: sesquiterpen

8

lactose, curmarin, flavonoid (Collons, 1992). Hiện các tài liệu tìm thấy về cây Sói

rừng chỉ tập trung nghiên cứu về các hoạt chất hóa học của loài trong hỗ trợ điều trị

bệnh. Kang et al., (2008) đã nghiên cứu tác dụng ức chế khối u của dịch chiết S.

glabra và gây chết tế bào gây ung thư biểu mô mũi - họng ở người. Kết quả cho thấy

dịch chiết Sói rừng ngăn cản sự phát triển khối u in vivo [22].

Zhu et al., (2010) đã nghiên cứu tạo rễ in vitro trên môi trường MS, kết quả

NAA không có tác dụng cải thiện ra rễ. Môi trường tốt nhất cho ra rễ là 1/2MS+IBA

0.2 mg/L+sucrose30 g/L hoặc 1/4 MS+IBA 0.2 mg/L+sucrose 30 g/L[29].

Li et al., (2008) đã nhân giống in vitro cây Sói rừng trên môi trường MS, 80

% chồi phát sinh trên môi trường MS+BA 1.0 mg/L. Môi trường cấy chuyển là MS +

BA 2.0 mg/L +NAA0 3 mg/L cho hệ số nhân chồi là 6.2. Môi trường tốt nhất cho ra

rễ là 1/2 MS+NAA 1.0 mg/L với tỷ lệ 100 %.

Zhu et al., (2007) đã thu được mẫu cấy vô trùng bằng cách nhúng mẫu trong

cồn 75% trong 30 giây, sau đó bằng HgCl2 0.1% trong 10 phút. Tiếp đó rửa bằng

nước vô trùng và nhúng vào dung dịch 120 mg/l rifampicin trong 4 ngày; Cuối cùng

mẫu được nhúng vào HgCl2 0.1% và rửa bằng nước vô trùng và cấy vào môi trường

tái sinh chồi [31].

1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng ở nước ta

Mai Hoàng Oanh (2016) đã nghiên cứu mẫu Sói rừng thu nhận từ Lạng Sơn,

tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số. Nhân bản thành công hai vùng gen ITS và

rpoC1 bằng phương pháp PCR và tạo dòng thành công hai gen nhân bản được, đã

xác định được trình tự nucleotide của 2 đoạn gen rpoC1 và ITS [9].

Bùi Văn Trọng và cs (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều

hòa sinh trưởng tới sự hình thành rễ của hom cây Sói rừng (Sarcandra glaba

(Thunb.) Nakai.) tại Lâm Đồng. Nhóm tác giả đã sử dụng NAA ở nồng độ 1% cho

kết quả giâm hom Sói rừng tốt nhất đạt 86.67%, hom sống và ra rễ, số lượng rễ trung

bình là 5.08 rễ/hom, chiều dài rễ trung bình là 3,68 cm so với đối chứng (66,67%;

3,9; 3,65 cm, tương ứng) [10].

9

Le Hong En et al., (2016) đã nghiên cứu nhân giống Sói rừng bằng giâm hom.

Tác giả đã sử dụng IBA, IAA, NAA để nghiên cứu tác dụng của chất kích thích ra rễ.

Nồng độ IBA 1-1,5% cho ra rễ tốt nhất. Hom bánh tẻ cho ra rễ tốt hơn các loại hom khác.

Nguyễn Quỳnh Anh (2013), đã Nghiên cứu ứng dụng cây Sói rừng ở Cao Bằng

để hỗ trợ điều trị một số bệnh ung thư. Tác giả đã nghiên cứu quy trình bào chế và

dạng bào chế thành phẩm từ cây Sói rừng. Sau 3 năm nghiên cứu đề tài đã đạt được mục

tiêu đề ra, kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học, một số hoạt tính sinh học, độc tính

và tác dụng điều trị ung thư trên động vật thực nghiệm của bột và lá cây Sói rừng

Sarcandra glabra (Thunb) Nakai, thu hái ở vùng rừng núi xã Bạch Đằng, huyện Hòa An

tỉnh Cao Bằng. Kết quả nghiên cứu đã đưa ra được quy trình Nghiên cứu làm viên tế;

Nghiên cứu làm dạng thuốc bột (thuốc tán); Nghiên cứu làm dạng cao thuốc (cao

nước) [1].

1.4. Cơ sở phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống)

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình nuôi cấy

từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng.

Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho việc ứng dụng

các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận khác nhau của

thực vật với kích thước nhỏ (Nguyễn Quang Thạch, 2009) [11].

Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy mô và

nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các phương thức

nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau. Nguyên lý

cơ bản của nuôi cấy mô là tính toàn năng của tế bào (Totipotency). Gottlieb

Haberlandt (1902) nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho nuôi cấy

mô - tế bào thực vật. Ông đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn

sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời”. Theo ông, mỗi tế bào bất kỳ của cơ

thể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể đó và có khả

năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi (Nguyễn Quang

Thạch, 2009).

10

1.4.1. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật có những ưu điểm sau (Dương Công

Kiên, 2006):

- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp từ 1

cây sau khi được nuôi cấy từ 1 – 2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây.

- Sản phẩm cây đồng nhất: Tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây

mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp.

- Tiết kiệm không gian: Không phụ thuộc vào thời tiết bên ngoài và các vật

liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất

nhiều so với sản xuất truyền thống trên đồng ruộng.

- Lợi thế về vận chuyển: Cây con có kích thước nhỏ, vì vậy có thể vận chuyển

đi xa dễ dàng và thuận lợi.

- Sản xuất được quanh năm: Qúa trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ

thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ.

1.4.2. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Chi phí sản xuất cao: chi phí hóa chất, trang thiết bị hiện đại, tiêu tốn nhiều

năng lượng,….nên giá thành sản xuất con giống cao so với các phương pháp truyền

thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.

- Chất lượng cây giống có thể bị biến dị: cây con nuôi cấy có thể sai khác với

cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma.

1.4.3. Một số phương pháp nuôi cấy mô

Các phương pháp thường được áp dụng phổ biến như sau (Nguyễn Như

Khanh, 2011, Vũ Văn vụ, 2009) [14]:

- Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Trong nuôi cấy mô, một phương thức đơn giản và thường hay được sử dụng

để tái sinh chồi invitro là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.

Trên thực tế người ta thường nuôi cấy đỉnh chồi non với kích thước khoảng

vài mm. Đó có thể đỉnh chồi ngọn hoặc đỉnh chồi nách, mỗi đỉnh sinh trưởng nuôi

cấy ở điều kiện thích hợp sẽ tạo ra một hay nhiều chồi và mỗi chồi sẽ phát triển

thành cây hoàn chỉnh.

11

- Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào vô tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã

phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý bằng các chất điều hòa sinh

trưởng thực vật…) Mẫu cấy ban đầu để tạo mô sẹo có thể lấy từ cây con vô trùng

trong ống nghiệm, rẽ, thân, lá của cây bên ngoài đã được vô trùng. Mô sẹo là nguyên

liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng như: nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma.

- Nuôi cấy bao phấn và túi phấn

Nuôi cấy bao phấn và túi phấn tạo cây đơn bội là sự cảm ứng phát sinh phôi từ

những lần phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các tiểu bao tử, các hạt phấn non.

- Nuôi cấy tế bào đơn

Tế bào đơn có thể ghi nhận bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý bằng

enzyme. Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy

khác nhau.

Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu

ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên quá trình sinh trưởng, phát triển và phân

hóa của tế bào.

1.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật [11],[14]

* Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực

vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay

bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá

mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ…).

Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau

trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì

vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của

mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng

nuôi cấy.

Mẫu nuôi cấy trước khi đưa vào nuôi cấy phải được vô trùng. Phương pháp

phổ biến nhất trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng tiêu

diệt vi sinh vật. Hóa chất được lựa chọn để vô trùng mẫu phải đảm bảo 2 điều kiện:

Có khả năng tiêu diệt vi sinh vật tốt và không hoặc ít độc đối với mẫu. Hiệu quả vô

12

trùng tùy thuộc vào thời gian, nồng độ và khả năng xâm nhập để tiêu diệt vi sinh vật

của hóa chất. Một số hóa chất thường được sử dụng hiện nay để vô trùng mẫu là:

Ca(OCl)2-hypoclorit canxi, NaOCl-hypoclorit natri, oxy già, HgCl2-thủy ngân

clorua, chất kháng sinh (gentamicin, ampixilin…).

* Điều kiện nuôi cấy

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thao tác với mẫu

cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng. Buồng cấy có hệ thống màng lọc giúp

lọc vi sinh vật đồng thời có hệ thống đèn tử ngoại giúp tiêu diệt vi sinh vật trong

không khí và trên bề mặt các dụng cụ thiết bị nuôi cấy. Để khử trùng dụng cụ và môi

trường nuôi cấy có thể sử dụng các phương pháp: Khử trùng khô (bằng nhiệt), khử

trùng ướt (hấp vô trùng), màng lọc.

- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định

về ánh sáng và nhiệt độ.

* Môi trường dinh dưỡng

Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự

phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây.

Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật,

cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích

này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS

(Murashige&Skoog, 1962) , LS (Linsmainer và Skoog, 1965)… Môi trường MS

(Murashige&Skoog, 1962) là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy

mô của tế bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá

mầm. Môi trường Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương,

được sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần.

Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy mô đóng vai trò quyết định

đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi một loại vật

liệu nuôi cấy hay loại cây khác nhau cần những thành phần môi trường thích hợp để

phù hợp với mục đích việc nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Nhìn chung, môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm các thành phần cơ

bản sau :

13

+ Các khoáng đa lượng

+ Các khoáng vi lượng.

+ Nguồn cacbon

+ Các vitamin

+ Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

+ Các chất điều hòa sinh trưởng.

+ Các chất bổ sung khác: nước dừa; dịch chiết nấm men; than hoạt tính; Agar

Khoáng đa lượng

Các khoáng đa lượng bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ

trên 30 ppm tức là 30mg/l. Những nguyên tố đó là : N, Fe, P, K, Ca, Mo. Riêng Na và

Cl cũng được sử dụng trong một vài loại môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng

- Nitrogen: Mô, tế bào thực vật có thể sử dụng nitrogen khoáng như

+ ;

ammonium và nitrate. Tỷ lệ ammonium và nitrat thay đổi tùy theo loại cây và trạng

-, NH4

thái phát triển của mô. Nitrogen được cung cấp dưới NO3

- Phospho ( P): Phospho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật. Nó

2- còn có

tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và

tham gia vào cấu trúc màng. Ngoài ra khi phosphor ở dạng H2PO4 - và HPO4

tác dụng như một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trường trong quá

trình nuôi cấy;

- Kali ( K): K+ là một cation chủ yếu trong cây,giúp cho cây cân bằng các

anion vô cơ và hữu cơ. Ion K được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có hai vai trò

chính là điều hòa pH và áp suất môi trường nội bào. Sự thiếu hụt K+ trong môi

trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thừa nước và làm giảm tốc độ hấp

thu photphate. Người ta cung cấp Kali cho mô nuôi cấy dưới dạng kali nitat (KNO3),

kali clorua (KCl) và kalihydrophotphat (KH2PO4);

- Canxi (Ca): Ca có mặt rất nhiều trong vách tế bào và màng tế bào. Sự có mặt

của Ca2+ rất quan trong trong khả năng đối kháng với sự nhiễm nấm. Sự ổn định 12

của màng tế bào chịu ảnh hưởng rất lớn bỡi ion Ca2+. Sự thiếu hụt Ca2+ sẽ làm tăng

quá trình giải phóng các hợp chất ra khỏi màng tế bào. Canxi được cung cấp dưới

dạng canxi nitrat ( Ca(NO3)2.4H2O) canxi clorua (CaCl2.6H2O);

14

- Magiê (Mg): Là thành phần cấu trúc của diệp lục tố, có tác dụng đến quá

trình quang hợp, phụ trợ cho nhiều enzyme liên quan trong biến dưỡng cacbonhydrat

sự tổng hợp acid nucleic… Ion Mg có tính linh động cao, hầu hết ion Mg2+ đều đc sử

dụng cho việc điều hòa pH nội bào và ổn đinh cân bằng anion và cation. Nếu thiếu

hụt Mg sẽ ngăn cản quá trình tổng hợp RNA. Kết quả là cấu trúc và chức năng của

lục lạp sẽ bị ảnh hưởng nhanh chóng khi xảy ra thiếu hụt Mg, là yếu tố không thể

thiếu trong quá trình trao đổi năng lượng của thực vật bởi vì nó có vai trò quan trọng

trong việc tổng hợp ATP. Mg được cung cấp dưới dạng magiê sunphat (

MgSO4.7H2O);

- Sắt (Fe): Nhưng môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng FeCl2,

FeCl3.6H2O, FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3, Fe(C4H4O6). Hiện nay hầu hết các phòng thí

nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na2-Ethylene Diamine Tetra Acetate

(EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng từ từ ra môi trường theo nhu

cầu mô thực vật.

Khoáng vi lượng

Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co là các nguyên tố vi lượng thường được dùng trong môi

trường nuôi cấy invitro. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong các hoạt

động của enzyme. Chúng được dùng với nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên

tố đa lượng. Các dung dịch vi lượng thường dùng là : Nistch (1951), Heller (1953),

Murashige – skoog ( 1962)

Nguồn cacbon

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các mẫu nuôi cấy nói chung không thể

quang hợp hoặc quang hợp ở cường độ rất thấp, vì vậy trong môi trường nuôi cấy

cần bổ sung các hợp chất hydratcacbon. Nguồn hydratcacbon được sử dụng phổ biến

là đường 13 saccarozơ với hàm lượng từ 2-6% (W/V). Những loại đường khác như

fructose, glucose, maltose, sorbitol,... rất ít dùng

+ Các chất điều hòa sinh trưởng.

Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi

cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật. Hiệu quả của

chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hòa sinh

trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy.

15

Dựa vào hoạt tính sinh lý phân chất điều hòa sinh trưởng thành 2 nhóm: Nhóm chất

kích thích sinh trường và nhóm chất ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy mô, tế bào

thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng.

- Ảnh hưởng giá thể trồng tới sinh trưởng phát triển của cây non ngoài vườn ươm

Trước đây giá thể sử dụng chủ yếu là đất, cát và sỏi. Ngày nay giá thể đã được thay

đổi rất nhiều. Như ta đã biết cây cần cả oxy và dinh dưỡng tiếp xúc với cây. Giá thể

lý tưởng là loại có khả năng giữ nước, tương đương với độ thoáng khí. Khả năng giữ

nước và độ giữ nước của giá thể được quyết định bởi những khoảng trống trong nó.

Giá thể lý tưởng có các đặc điểm:

- Có khả năng giữ ẩm cũng như độ thoáng khí tốt

- Có pH trung tính và có khả năng ổn định pH

- Thấm nước dễ dàng

- Bền, có khả năng tái sử dụng hoặc phân hủy an toàn cho môi trường

- Nhẹ, rẻ và thông dụng

Giá thể có nhiều loại như xơ dừa, trấu hun, mùn cưa, cát, sỏi vụn, rong biển, đất

nung xốp, …

1.4.5. Các giai đoạn trong nhân giống invitro

1.4.5.1. Khử trùng mô nuôi cấy

Là giai đoạn quan trọng, quyết định đến kết quả của quá trình nuôi cấy. Mục

đích của giai đoạn này là tạo nguồn nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy. Kết

quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian khử trùng.

1.4.5.2. Tái sinh mẫu

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh có định hướng sự phát triển của mô

nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ các hợp chất điều hòa

sinh trưởng như auxin/cytokinin đưa vào môi trường nuôi cấy cũng như tuổi sinh lý

của mẫu.

1.4.5.3. Nhân nhanh

Là giai đoạn bao gồm nhiều lần cấy chuyển mô trên các môi trường nhân

nhanh nhằm kích thích tạo các cơ quan phụ hoặc các cấu trúc khác mà từ đó cây con

hoàn chỉnh có thể tái sinh. Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số nhân cao nhất. Để

đạt được mục đích nhân nhanh, người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các

16

chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…) hoặc các chất hữu cơ

(nước dừa, dịch chiết nấm men, …) kết hợp với các yếu tố môi trường (nhiệt độ, ánh

sáng, độ ẩm…)

- Tạo cây con hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển qua môi trường tạo

rễ, hình thành cây con hoàn chỉnh, giai đoạn này môi trường nuôi cấy chủ yếu được

bổ sung thêm auxin giúp tạo rễ cho cây con.

- Ra cây

Cây con nuôi cấy trong phòng thí nghiệm có đầy đủ các bộ phận (thân, lá, rễ)

khỏa mạnh và không bị nhiễm sẽ đưa ra môi trường bên ngoài, trong điều kiện thực

tiễn sản xuất, đây là giai đoạn đưa cây từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn.

1.4.5.4. Giai đoạn huấn luyện và đưa cây con ra môi trường thực tiễn sản xuất

Cây con trong ống nghiệm được sản xuất dưới điều kiện lý tưởng (nhân tạo) về

nhiệt độ, ánh sáng và môi trường dinh dưỡng. Để cấy cây ra bầu đất với tỷ lệ sống cao cần

phải huấn luyện cây cho cứng cáp trước khi cho ra khỏi ống nghiệm. Cây được huấn

luyện bằng cách đặt ống nghiệm (bình cây) trong điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên

với cường độ ánh sáng từ 5000 - 10.000 lux, nếu lớn hơn 10.000 lux cần phải che bớt

lượng ánh sáng. Thời gian huấn luyện khoảng 6 - 8 ngày để cây con quen dần với điều

kiện tự nhiên. Khi thân chuyển sang mầu của tự nhiên, lá xoè ra đầy đủ thì có thể tiến

hành cấy chuyển vào bầu đất.

Chú ý: Không nên kéo dài thời gian huấn luyện vì để lâu rễ bị đen, lá úa vàng,

khi đó tỷ lệ sống khi cấy vào bầu đất hoặc luống đất sẽ không cao.

Ra ngôi:

- Tạo dung dịch hồ rễ. Trước khi hồ rễ ít 12 giờ, trộn đất tầng B với dung dịch

thuốc tím 0,1 %. Khi dùng rửa thuốc tím bằng nước sạch từ 3 - 4 lần và tạo cho đất ở

dạng hồ loãng để hồ rễ cây, Tỷ lệ 1 đất 1 nước - Tạo bầu: Bầu được làm bằng nhựa

PE có đường kính và chiều cao tùy theo từng loài cây, thông thường sử dụng các loại

bầu có đường kính 5 - 6 cm, cao 11 cm không có đáy hoặc có đáy thì phải đục lỗ ở

đáy hoặc xung quanh để thoát nước. Thành phần ruột bầu: Dùng đất tầng B đập nhỏ,

sàng bỏ rễ cây và các tạp chất khác.

17

- Xử lý bầu, luống đất: Trước khi cấy cây 12 - 24 giờ, đất phải được xử lý

bằng dung dịch thuốc tím 0,1% (hoà thuốc tím vào nước và dùng ô doa tưới đều lên

bề mặt đất cho thấm sâu 1,5 - 2 cm. Vào mùa nguy cơ nấm bệnh cao nồng độ thuốc

tím phải cao hơn 0,2 - 0,3%.

- Thao tác ra ngôi: Lấy cây mầm từ trong lọ ra bằng cách đổ ra lòng bàn tay,

nhặt từng cây một cho ra khỏi nền nuôi cấy sau đó rửa sạch thạch bằng nước sạch hồ

rễ bằng đất đã được khử trùng, các thao tác này phải nhẹ nhàng, cẩn thận tránh làm

tổn thương cho cây. Cấy cây đã hồ rễ vào bầu đất như cấy cây con từ hạt. Khi cấy

chú ý cho rễ thẳng và xoè ra tự nhiên, không bị cuốn lại với nhau hoặc bị gập lên trên

mặt bầu.

18

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng: Cây Sói rừng thu thập tại tỉnh Hà Giang.

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu

- Điều tra thu thập mẫu nghiên cứu

- Nghiên cứu nhận dạng đúng loài cây Sói rừng thông qua đặc điểm hình thái

và chỉ thị phân tử

- Nghiên cứu quá trình nhân giống in vitro cây Sói rừng

- Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp, trường Đại

học Nông lâm Thái Nguyên.

2.2. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Điều tra đánh giá thực trạng phân bố và thu thập mẫu nghiên cứu

Nội dung 2: Nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng đặc điểm hình thái

Nội dung 3: Nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng chỉ thị DNA

Nội dung 4: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây Sói rừng

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Điều tra đánh giá thực trạng phân bố và thu thập mẫu nghiên cứu

2.3.1.1. Phương pháp tiếp cận

Để đạt được mục tiêu nghiên cứu, đề tài tiếp cận nghiên cứu như sau:

* Tiếp cận hệ thống:Nghiên cứu, bảo tồn và phát triển nguồn gen cây Sói rừng

(Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai)có giá trị kinh tế cao tại tỉnh Hà Giang, được tiếp

cận một cách hệ thống từ nghiên cứu các đặc điểm sinh học và sinh thái học của loài;

ảnh hưởng của điều kiện môi trường (thời tiết, đất đai, …) và kinh tế xã hội vùng đến

sinh trưởng, phát triển, năng suất, chất lượng, hiệu quả đối với cây Sói rừng; đến

nghiên cứu các công nghệ nhân giống trên quy mô lớn.

Nội dung nghiên cứu được thực hiện một cách tuần tự: Đánh giá thực trạng

phân bố và giá trị sử dụng, đa dạng di truyền nguồn gen; Chọn lọc và xây dựng vườn

19

giống gốc chất lượng cao; Xây dựng quy trình nhân giống vô tính cây Sói rừng trên

quy mô công nghiệp; Quy trình nuôi trồng và triển khai mô hình trình diễn thâm

canh; Tập huấn cán bộ và người dân tham gia vào công tác bảo tồn và phát triển cây

Sói rừng; Xây dựng cơ sở dữ liệu về loài Sói rừng tại Hà Giang để phục vụ bảo tồn

và phát triển các loài cây dược liệu thế mạnh của Hà Giang, có giá trị kinh tế cao và

có tác dụng y học.

* Tiếp cận kế thừa: Đề tài cũng kế thừa từ kết quả nghiên cứu nhân giống một

số loài cây dược liệu từ các nhiệm vụ đã nghiên cứu để hoàn thiện cho phù hợp với

điều kiện sinh thái của Hà Giang.

Để xây dựng quy trình sản xuất giống quy mô lớn, đề tài tiến hành khảo sát

ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh như: nhiệt độ, ẩm độ, chất kích thích ra

rễ…đến hiệu quả của việc tạo rễ, ra lá và tạo cây hoàn chỉnh.

Những kết quả nghiên cứu về cây Sói rừng trong nước và trên thế giới sẽ được

nhóm nghiên cứu tổng hợp, phân tích, chỉ ra những vấn đề đã được giải quyết và

những vấn đề đang tồn tại cần được giải quyết tiếp. Những kết quả nghiên cứu của

các tác giả khác đã công bố sẽ là cơ sở cho việc thiết lập: kỹ thuật nhân giống; nội

dung nghiên cứu sẽ đưa ra hướng nghiên cứu mới về kỹ thuật nhân giống cây Sói

rừng chất lượng cao, sạch bệnh, tỷ lệ sống cao ở quy mô công nghiệp.

* Tiếp cận vùng sinh thái: Phát triển cây Sói rừng tại tỉnh Hà Giang trong thời

gian qua chủ yếu tập trung tại các huyện vùng cao như: Vị Xuyên, Mèo Vạc, Quản

Bạ, Yên Minh, Xín Mần. Tại mỗi một vùng, cây Sói rừnglại được trồng trong các

tiểu vùng khí hậu khác nhau. Trong từng điều kiện cụ thể, mức độ biểu hiện hình

thái, khả năng sinh trưởng và năng suất của các cây Sói rừng là khác nhau. Do đó,

việc lựa chọn các xuất xứ cây Sói rừng để tuyển chọn cây trội cần được tiến hành

trên phạm vi rộng, tập trung vào những vùng có lịch sử phát triển cây Sói rừng. Dựa

trên kết quả khảo sát và số liệu thống kê về diện tích phát triển cây Sói rừng tại các

địa phương trong tỉnh Hà Giang.

* Tiếp cận sử dụng hiệu quả và bền vững nguồn tài nguyên thiên nhiên:

Diện tích đất được sử dụng nuôi trồng Sói rừng ở các tỉnh miền núi phía Bắc

nói chung và tỉnh Hà Giang nói riêng chủ yếu là đất dốc, vùng đầu nguồn, là vùng

20

đất rất nhạy cảm và dễ bị ảnh hưởng dưới tác động của điều kiện tự nhiên và con

người. Như vậy nếu phát triển được các cây Sói rừng dưới tán rừng trên diện tích

lớn, tập trung với các biện pháp kỹ thuật đồng được giải quyết, trong đó trọng tâm là

vấn đề nghiên cứu, chọn giống chất lượng cao, đồng nghĩa với việc giữ rừng tự nhiên

do phát triển cây Sói rừng dưới tán rừng được nâng cao chất lượng và năng suất và

thời gian khai thác sản phẩm điều kiện môi trường (thời tiết, đất đai, …) và kinh tế

xã hội vùng đến sinh trưởng, phát triển, năng suất, chất lượng, hiệu quả đối với loài

Sói rừng; đến nghiên cứu các công nghệ nhân giống trên quy mô lớn.

2.3.1.2. - Điều tra, đánh giá thực trạng phân bố và giá trị sử dụng của của loài Sói

rừng và thu thập mẫu

Phương pháp phỏng vấn

Sử dụng phương pháp điều tra nhanh nông thôn RRA để thu thập thông tin từ

các địa bàn các huyện có phân bố loài Sói rừng để khoanh vùng và tiến hành điều tra

khảo sát, đánh giá thực trạng phân bố, giá trị sử dụng của loài Sói rừng .

Tiến hành sử dụng công cụ phỏng vấn người cung cấp thông tin chủ chốt, đi

lát cắt, phỏng vấn nhóm hộ, cụ thể các đối tượng phỏng vấn là các cán bộ cấp tỉnh,

cấp huyện, cấp xã và các hộ dân. Nội dung phỏng vấn được trình bày trong phiếu

phỏng vấn đã được soạn sẵn về sinh thái loài, địa điểm phân bố hoặc gây trồng, kỹ

thuật trồng (trồng, chăm sóc, bón phân), sinh trưởng và giá trị sử dụng. Từ thông tin

ban đầu thu được tiến hành khảo sát thực địa để thu thập mẫu Sói rừng . Điều tra thu

thập thông tin về các hình thức gây trồng cây Sói rừng trên từng vùng, từng dân tộc

khác nhau.

Phương pháp điều tra đặc điểm phân bố của Sói rừng

Ðiều tra sơ bộ và xây dựng bản đồ phân bố Sói rừng dựa vào cộng đồng:

Nhằm thu thập thông tin khái quát về phân bố, sinh trưởng và phát triển của Sói rừng

tại khu vực nghiên cứu để làm cơ sở để xác định địa điểm để tiến hành điều tra tỉ mỉ.

Căn cứ vào bản đồ phân bố Sói rừng dựa vào cộng đồng, bản đồ địa hình, kết quả

đi sơ thám, tham khảo ý kiến nguời dân và cán bộ quản lý để lập các tuyến điều tra.

Trên cơ sở kế thừa các kết quả nghiên cứu trước đây có liên quan đến loài Sói

rừng đã được công bố, với sự hỗ trợ, cộng tác của các chuyên gia về thực vật của các

21

Viện nghiên cứu, nhóm thực hiện đề tài đã lựa chọn các điểm điều tra nghiên cứu ở

các huyện có loài Sói rừng phân bố trên địa bàn tỉnh Hà Giang.

Ðiều tra theo tuyến: Dựa vào kết quả điều tra sơ bộ, lập các tuyến điều tra

theo các dạng sinh cảnh khác nhau: Rừng tự nhiên, rừng trồng, rừng phục hồi, trảng

cỏ, nương rẫy. Trên các tuyến điều tra tiến hành thu thập các thông tin về số lượng cá

thể, tình hình sinh trưởng, phát triển và các yếu tố sinh thái.

Theo các tuyến tiến hành điều tra số lượng cây, tình hình sinh trưởng và phát

triển. Những cây có chiều dài thân dưới 1m được xem là cây tái sinh, cây có chiều

dài thân lớn hơn 1m được xem là cây trưởng thành, tiến hành đếm số lượng cây, số

nhánh/cây, chất lượng cây tái sinh.

Phương pháp điều tra thực địa kết hợp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh

thái của loài cây Sói rừng: Tiếp cận thông tin thông qua cán bộ ở Sở Nông nghiệp và

PTNT, phòng Nông nghiệp, Chi cục/hạt kiểm lâm và người dân địa phương ở các

vùng đại diện trong tỉnh, đồng thời kế thừa các tài liệu đã có về loài cây Sói rừng kết

hợp với điều tra ngoài thực địa theo tuyến điển hình để từ đó xác định những nơi có

phân bố của loài Sói rừng.

2.3.2. Phương pháp nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng đặc điểm hình thái

2.3.2.1. Phương pháp kế thừa số liệu

Kế thừa các nguồn tài liệu, các kết quả của các nghiên cứu đã công bố, các

hình ảnh, hình vẽ liên quan đến cây Sói rừng đang được lưu giữ tại các thư viện,

phòng tiêu bản, phòng bảo tàng thực vật, website trong và ngoài nước

2.3.2.2. Phương pháp thu mẫu

Mỗi cây thu 3-10 mẫu. Mỗi mẫu phải có đầy đủ các bộ phận, nhất là cành, lá

và hoa (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2007).

2.3.2.3. Phương pháp mô tả phân tích đặc điểm hình thái thực vật

Đặc điểm thực vật của mẫu cây được quan sát bằng mắt thường, kính lúp soi

nổi và mô tả theo phương pháp mô tả phân tích (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2007).

2.3.2.4. Phương pháp xác định tên khoa học mẫu cây

Xác định tên khoa học của cây Sói rừng theo phương pháp so sánh hình thái

truyền thống kết hợp với kinh nghiệm của các chuyên gia và sử dụng một số tài liệu

22

chuyên ngành như: Thực vật chí Đông Dương (Flore générale de l'Indo-Chine); Thực

vật chí Việt Nam (The Flora of Vietnam); Cây cỏ Việt Nam … (Trần Văn Ơn, 2005)

2.3.3. Phương pháp nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng chỉ thị DNA

Sử dụng chỉ thị ITS để nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng

- Vật liệu là 15 mẫu lá của cây Sói rừng được thu thập tại 15 xã của 05 huyện thuộc

Tỉnh Hà Giang

2.3.3.1. Tách chiết ADN tổng số

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sử dụng CTAB

của P. Doyle and Doyle (1987) có một số cải tiến nhỏ để tiến hành tách chiết ADN từ

các mẫu nghiên cứu.

Quy trình:

Bước 1: Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 60C.

Bước 2: Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến

khi thành dạng bột mịn (các mẫu lá, chày, cối được giữ trước ở - 80C).

Bước 3: Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800l CTAB buffer và 60l SDS

10%. Thành phần dung dịch đệm chiết: Tris-bazơ 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1,4

M, CTAB 2%.

Bước 4: Ủ mẫu ở 65C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút.

Bước 5: Bổ sung Chloroform, lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa. Ly tâm

11000 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 4C. Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống

mới.

Bước 6: Tiếp tục chiết lần 2 bằng Chloroform, thu được dịch chiết chứa ADN.

Bước 7: Tủa ADN bằng isopropanol đã làm lạnh. Để ở -20C trong 1 giờ.

Bước 8: Ly tâm thu tủa 10500 vòng/phút trong 15 phút ở 4C.

Bước 9: Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong

đệm TE.

Loại ARN: bổ sung RNase vào mẫu ADN và ủ ở 37C trong 1 giờ.

Các bước tiếp theo tương tự các bước 5-9.

23

2.3.3.2. Thực hiện phản ứng PCR

- Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần:

STT Thành phần Thể tích (µl)

1 Nước cất hai lần khử ion 9

2 Buffer Mg+ 25 Mm 1,5

3 dNTPs 10 Mm 0,3

4 Taq ADN polymerase 5 U/µl 0,2

5 Mồi xuôi 10 µM 1,5

6 Mồi ngược 10 µM 1,5

7 DNA 1

Tổng thể tích của một phản ứng 15,0

- Chương trình chạy PCR

Phản ứng PCR được tiến hành trong ống eppendorf 0,2 ml và thực hiện trên

máy Mastercycler epgradient S theo chu trình sau:

Các bước Thời gian Nhiệt độ(C)

1 94 5 phút

2 94 1 phút

3 56 45 giây

4 72 50 giây

5 Lặp lại từ bước 2, 35 lần

6 72 7 phút

7 4 ∞

Danh sách cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

TT

ITS4 ITS5 Mồi Trình tự Nucelotid TCCTCCGCTTATTGATATGC GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG Sau khi hoàn thành chương trình chạy PCR, sản phẩm PCR được bổ sung 4 µl

loading dye rồi tiến hành điện di.

24

2.3.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose

Cân 0,4 g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn

toàn. Để nguội 45-50C bổ sung 2,5 l Ethidium Bromide, đổ vào khuôn gel đã được

chuẩn bị sẵn. Sau 30-60 phút, khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa

bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm

ngập bản gel khoảng 0,5-1 cm.

Tra mẫu: Sản phẩm PCR được trộn với 4 l loading dye và tra vào các giếng

trên gel.

Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với bộ

nguồn. Đặt 130 V.

Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng nhờ liên kết

với EtBr.

2.3.3.4. Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen

1. Cắt lấy đoạn ADN mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào

ống eppendorf 2ml.

2. Bổ sung buffer QG theo tỷ lệ 3 thể tích QG: 1 thể tích gel (100mg ~100μl).

3. Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn.

4. Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch phải là màu vàng,

nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc màu tím xanh thì phải bổ sung 10μl sodium

acetate 3M, pH 5.

5. Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ

13000 rpm trong 1 phút.

6. Bổ sung 500 μl buffer QG vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000 rpm

trong 1 phút để loại hết agarose dư thừa.

7. Bổ sung 750 μl buffer PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút sau

đó ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút.

8. Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1.5ml sạch.

9. Để hoà tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH 7 - 8.5) vào giữa màng của cột

QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút, thu lượng ADN tinh sạch.

2.3.3.5. Giải trình tự

25

Sản phẩm PCR ITS sau khi được tinh sạch, được giải trình tự tại công ty

Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự được được so sánh với các trình tự

tương đồng trên NCBI. Sau đó, các trình tự được tập hợp lại và phân tích bằng

chương trình MEGA v5.1 để tạo cây phát sinh loài.

2.3.4. Phương pháp nhân giống in vitro cây Sói rừng

2.3.4.1. Phương pháp khử trùng mẫu tạo vật liệu vô trùng

Phương pháp khử trùng mẫu cấy: Mẫu đoạn thân được rửa và loại bớt những

bộ phận không cần thiết dưới vòi nước chảy. Sau đó mẫu được ngâm trong nước xà

phòng loãng 5 phút. Tiếp tục rửa mẫu dưới vòi nước chảy sao cho sạch hết bụi bẩn

và xà phòng. Tráng mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần trước khi đem vào tủ cấy để

tiến hành khử trùng. Trong tủ cấy, mẫu được lắc với cồn 70% trong 60 giây, sau đó

tráng nước cất vô trùng 3 lần. Mẫu sau đó được khử trùng bằng dung dịch HgCl2

0,1% với khoảng thời gian khác nhau: 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút.

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2

0,1% đến khả năng tạo mẫu vô trùng

Dùng pank gắp từng đoạn thân đã khử trùng đặt trên bề mặt giấy thấm.

Thao tác cắt từng đoạn mẫu có ít nhất 1 mắt ngủ. Loại bỏ phần gốc ở từng

đoạn thân để hóa chất khử trùng không ngấm sâu vào mẫu vật.

Mẫu được cấy vào môi trường nuôi cấy theo hướng thẳng đứng.

Công thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi

lần nhắc lại 30 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm. Thời gian theo dõi 4 tuần.

2.3.4.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng

đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng

Thí nghiệm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh

chồi Sói rừng

Cách tiến hành: Mẫu sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy khởi đầu sẽ

cấy sang môi trường MS có bổ sung BAP với dãy nồng độ: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 3 mg/l.

Nồng độ BAP cho hệ số nhân cao nhất sẽ dùng cho thí nghiệm 3.

Lựa chọn chồi có chiều cao 2- 3 cm sau giai đoạn tái sinh, cắt chồi và xiết

chồi đỉnh sau đó cấy vào môi trường nhân nhanh tạo cụm chồi nghiên cứu. Chồi

26

được cấy thẳng đứng, cấy 4 – 5 chồi/bình (bình thể tích 250ml). Giá trị pH của môi

trường cấy là 5,6 – 5,8.

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp Kinetin đến khả năng

nhân nhanh chồi Sói rừng

Môi trường MS + nồng độ BAP thích hợp trong thí nghiệm 2 được bổ sung

thêm kinetin theo dãy nồng độ: 0, 0,2; 0,6; 0,8; 1,0 mg/l.

Cách tiến hành: Lựa chọn chồi có chiều cao 2- 3 cm sau giai đoạn tái sinh, cắt

chồi và xiết chồi đỉnh sau đó cấy vào môi trường nhân nhanh tạo cụm chồi nghiên

cứu. Chồi được cấy thẳng đứng, cấy 4 – 5 chồi/bình (bình thể tích 250ml). Giá trị pH

của môi trường cấy là 5,6 – 5,8.

Thí nghiệm 4: Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với NAA đến khả năng

nhân nhanh chồi Sói rừng

Môi trường MS + đường và agar + nồng độ BAP thích hợp trong thí nghiệm 2

kết hợp nồng độ kinetin thích hợp trong thí nghiệm 3 được bổ sung thêm auxin NAA

theo dãy nồng độ: 0, 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/l.

Các thí nghiệm 2,3,4 được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần

nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: hệ số nhân chồi. Thời gian theo

dõi qua mỗi lần cấy chuyển là 4 tuần.

Thí nghiệm 5: Kết quả ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với IBA đến khả

năng nhân nhanh chồi Sói rừng

Sử dụng môi trường nền MS + nồng độ BAP thích hợp nhất trong thí nghiệm

2 kết hợp nồng độ Kinetin tối ưu nhất trong thí nghiệm 3 được bổ sung thêm auxin

IBA theo dãy nồng độ: 0, 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/l.

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi

lần nhắc lại 30 mẫu. Chỉ tiêu theo dõi: hệ số nhân chồi. Thời gian theo dõi qua mỗi

lần cấy chuyển là 4 tuần.

Các thí nghiệm 3,4,5 có cách tiến hành tương tự thí nghiệm 2.

27

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng NAA đến

khả năng ra rễ chồi Sói rừng

Các chồi Sói rừng đạt tiêu chuẩn, chiều cao ≥ 2 cm, cây thẳng, cứng cáp, có từ

3-4 lá được cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung các chất NAA với dãy nồng

độ: 0; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l.

Dùng dao tách riêng từng chồi, cắt tỉa bớt lá già, lá vàng.

Chồi Đinh lăng được cấy theo hướng thẳng đứng vào môi trường tạo rễ với số

lượng 20 chồi/ bình (bình trụ thể tích 250 ml).

Giá trị pH của môi trường nuôi cấy là 5,6 - 5,8.

Thời gian xuất hiện rễ từ 2 - 3 tuần sau khi cấy chồi vào môi trường tạo rễ.

Thời gian theo dõi sau 4 tuần. Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3

lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại 30 mẫu.

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng IBA đến

khả năng ra rễ chồi Sói rừng

Chồi Sói rừng hữu hiệu được cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung các

chất IBA với dãy nồng độ: 0; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l.

Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ ra rễ, số rễ, chất lượng rễ. Thời gian theo dõi sau 4 tuần.

Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại

30 mẫu.

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống cây Sói rừng

giai đoạn sau in vitro

Để cây con sau giai đoạn in vitro tại vườn ươm có tỷ lệ sống cao, sinh trưởng

và phát triển tốt, cần cảm ứng cây trước ra ngôi như sau:

Bình Sói rừng sau khi ra rễ sẽ được đưa ra nhà lưới cảm ứng với điều kiện bên

ngoài 7-10 ngày để cây con thích nghi dần với ánh sáng tự nhiên. Sau đó rửa sạch, để

ráo nước và tiến hành cấy lên các loại giá thể: Đất (ĐC); Đất + Trấu hun (7:3); ½ Đất

+ ¼ trấu hun+ ¼ xơ dừa. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sống, biến động chiều cao. Thời

gian theo dõi sau 90 ngày. Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần

nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại 30 mẫu.

* Điều kiện thí nghiệm:

Quá trình nuôi cấy (nuôi cấy khởi đầu, nhân chồi và tạo cây hoàn chỉnh) được

28

tiến hành trong điều kiện nhân tạo. Ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm duy trì như sau:

- Ánh sáng: mẫu được nuôi cấy duới ánh đèn neon với cường độ ánh sáng từ

2000- 25000 lux, thời gian chiếu sáng 8 - 10h/ngày.

- Nhiệt độ: nhiệt độ trong phòng duy trì 250C ± 20C.

- Độ ẩm thường xuyên duy trì 60 – 70%.

2.3.4.3. Phương pháp đánh giá

- Các chỉ tiêu theo dõi sẽ được tính toán theo các công thức sau:

Ʃ mẫu sống không nhiễm (mẫu) Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = × 100 Ʃ mẫu cấy (mẫu)

Ʃ chồi thu được (chồi) Hệ số nhân chồi (lần) = Ʃ chồi cấy ban đầu (chồi)

Ʃ số mẫu có rễ (mẫu) Tỷ lệ ra rễ x 100 = Ʃ số mẫu cấy (mẫu)

Ʃ số rễ (rễ) Số rễ (rễ/chồi) = Ʃ số chồi (chồi)

Ʃ số cây sống (cây) Tỷ lệ sống (%) x 100 = Ʃ số cây trồng (cây)

Ʃ chiều cao mẫu theo dõi (cm) Chiều cao TB (cm) = Ʃ mẫu theo dõi (mẫu)

2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm thống kê sinh học IRRIS STAT 5.0

29

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Điều tra, đánh giá thực trạng phân bố, giá trị sử dụng của của loài Sói rừng

và thu thập mẫu.

Điều tra, đánh giá thực trạng thu hái, phân bố

Nhóm thực hiện sử dụng phương pháp điều tra nhanh nông thôn PRA, tiếp

cận thông tin thông qua cán bộ ở Sở Nông nghiệp và PTNT, phòng Nông nghiệp, Chi

cục/hạt kiểm lâm và người dân địa phương ở các vùng đại diện trong tỉnh, đồng thời

kế thừa các tài liệu đã có về loài cây Sói rừng bước đầu đã xác định được 05 huyện

có sự phân bố của cây Sói rừng bao gồm: Xí Mần, Mèo Vạc, Quản Bạ, Hoàng Su Phì

và Vị Xuyên, tiếp tục phỏng vấn các cán bộ chủ chốt của 05 huyện và đã xác định

được 15 xã ở 05 huyện trên có sự phân bố cây Sói rừng và phỏng vấn bằng phiếu

điều tra đại diện 32 hộ dân, người được phỏng vấn trong độ tuổi từ 40 – 50 tuổi.

Một số kết quả nhóm điều tra đi phỏng vấn cán bộ và người dân chủ chốt:

Thông tin về nơi thu hái Sói rừng

Kết quả phỏng vấn người dân Kết quả phỏng vấn cán bộ

Kết quả phỏng vấn có 68,8% ý kiến cho rằng Có 70,6% cho rằng Sói rừng là thu hái ngoài

nguồn Sói rừng do thu hái tự nhiên, và 25% ý kiến tự nhiên và 29,4% cho rằng Sói rừng được

cho rằng do gây trồng, còn lại thu mua ở chợ thu hái do gây trồng.

Biểu đồ 1: Thông tin về nơi thu hái Sói rừng

30

Thông tin về biến động Sói rừng

Kết quả phỏng vấn người dân Kết quả phỏng vấn cán bộ

Có 53,1% cho rằng Sói rừng giảm rất nhiều, Có 78,6% ý kiến cho rằng Sói rừng giảm rất

25% giảm nhiều và ý đánh giá giảm không nhiều và nhiều so với trước đây; 21,4% cho

đáng kể hoặc không giảm chiếm 21,9% rằng giảm giảm không đáng kể.

Biểu đồ 2: Thông tin về biến động Sói rừng

Thông tin về phân bố Sói rừng

Kết quả phỏng vấn người dân Kết quả phỏng vấn cán bộ

Có 84,38% ý kiến cho rằng Sói rừng được 70,59% ý kiến cho rằng Sói rừng được phân

phân bố trong rừng tự nhiên; còn lại cho bố trong rừng tự nhiên; 23,53% cho rằng ở

rằng ở rừng trồng và ở vườn nhà rừng trồng và 5,88% ở vườn nhà.

Biểu đồ 3: Thông tin về phân bố của Sói rừng

31

Thông tin trả lời phỏng vấn về dự báo tương lai phát triển của cây Sói rừng

Kết quả phỏng vấn người dân Kết quả phỏng vấn cán bộ

Có 56,25% ý kiến dự báo tương lai diện Có 52,94% không có ý kiến đánh giá là

tích trồng Sói rừng sẽ giảm; 25% cho rằng không đổi; 41,18% cho rằng tăng lên và

tăng; còn lại cho rằng không thay đổi. 5,88% cho rằng giảm xuống.

Biểu đồ 3: Thông tin về dự báo tương lai phát triển của loài Sói rừng

Giá trị của loài Sói rừng

Sói rừng có vị đắng, cay, tính hơi ấm, hơi có độc, có tác dụng kháng khuẩn

tiêu viêm, khu phong trừ thấp, hoạt huyết chỉ thống. Chủ trị viêm phổi, viêm phế

quản, viêm ruột thừa cấp tính, viêm dạ dày ruột cấp tính, lỵ nhiễm khuẩn, phong thấp

đau nhức, đòn ngã tổn thương, gãy xương,...

Kinh nghiệm của người trong sử dụng sói rừng để chữa trị một số bệnh

thường gặp như sau: Phòng cảm mạo; Chữa các chứng viêm; Chữa đau lưng; Chữa

đòn ngã tổn thương, gãy xương, viêm khớp xương do phong thấp; Chữa bỏng....

Đặc điểm phân bố theo tuyến điều tra

Từ thông tin kết quả phỏng vấn tiến hành lập tuyến điều tra khảo sát thực địa 5

huyện, kết quả thu được ở bảng sau:

Bảng 3.1. Đặc điểm phân bố Sói rừng theo tuyến điều tra

Chiều dài Số cá thể Tần suất Cây ra TT Tuyến điều tra (km) (cây) (cây/km) hoa, quả

1 Nấm Dẩn, Xín Mần 13 3,7 3 3,5

2 Thu Tà, Xín Mần 20 5,7 0 3,5

3 Nà Chì, Xín Mần 22 4 2 5,5

4 Tả Lủng, Mèo Vạc 21 3,8 2 5,5

32

Chiều dài Số cá thể Tần suất Cây ra TT Tuyến điều tra (km) (cây) (cây/km) hoa, quả

5 Lủng Chinh, Mèo Vạc 10 3,1 1 3,2

6 Nậm Ban, Mèo Vạc 16 3,6 0 4,5

7 Tùng Vài, Quản Bạ 13 4,3 2 3

8 Cao Mã Pờ, Quản Bạ 16 4,6 0 3,5

9 Thái An, Quản Bạ 17 3,8 1 4

10 Hồ Thầu, Hoàng Su Phì 26 5,8 3 4,5

11 Nậm Ty, Hoàng Su Phì 17 3,8 2 4,5

12 Bản Péo, Hoàng Su Phì 16 4 1 4

13 Thượng Sơn, Vị xuyên 25 6,25 3 4

14 Cao Bồ, Vị xuyên 18 5,1 3 3,5

15 Thị trấn Vị xuyên 19 4,8 2 4

Tổng 66,35 25 60,7 269

Trung bình 4,42 1,7 4,05 17,93

Qua số liệu trình bày ở bảng trên cho thấy rằng, số lượng Sói rừng phân bố

trong tự nhiên còn ít, phân bố không đều trên các tuyến điều tra. Tần số xuất hiện cao

nhất là tuyến Thượng Sơn, Vị xuyên (6,25 cây/km) và thấp nhất là tuyến Lủng

Chinh, Mèo Vạc (3,1 cây/km. Trên 15 tuyến điều tra gặp 269 cây với tần số xuất

hiện trung bình là 4,42 cây/km. Thời điểm điều tra diễn ra vào mùa ra hoa,kết quả

nhưng số luợng cây ra hoa, kết quả chỉ chiếm 1,7%. Kết quả phỏng vấn người dân

cho biết, trước đây 10 năm, số lượng Sói rừng bắt gặp rất nhiều ven rừng, trên rẫy bỏ

hoang,trên rẫy lúa, rẫy ngô, rẫy sắn. Từ khi Sói rừng được thương lái thu mua, giá

tăng lên thì người dân khai thác bán hết, khai thác nhổ cả bụi, kể cả cây chưa trưởng

thành nên số lượng Sói rừng trong tự nhiên liên tục giảm. Chính tình trạng khai thác

bừa bãi và lãng phí là nguyên nhân chính làm giảm số lượng loài này trong tự nhiên.

Thu thập mẫu Sói rừng nghiên cứu

Để xác định, lựa chọn nguồn gen cây Sói rừng có giá trị cao, làm tiền đề cho

việc nhận dạng, đánh giá đa dạng di truyền, nhân giống in vitro thì việc thu thập mẫu

33

cũng là khâu quan trọng. Mẫu Sói rừng được thu thập đều trên các tuyến điều tra.

Đặc điểm các mẫu thu thập được trình bày ở bảng 3.2.

Bảng 3.2. Đặc điểm mẫu thu thập

TT Xuất xứ Đặc điểm cây

Chiều dài lá (cm) Chiều dài thân (cm) Đường kính thân (cm) Chiều rộng lá (cm)

5 Nấm Dẩn, Xín Mần 28 0,2 3,5 1

7 Thu Tà, Xín Mần 31,5 0,4 2,5 2

Nà Chì, Xín Mần 0,3 4,5 3,6 27 3

10 Tả Lủng, Mèo Vạc 0,2 26 5 4

12 Lủng Chinh, Mèo Vạc 0,3 29 5,3 5

Nậm Ban, Mèo Vạc 0,2 6,5 27 4 6

34,5 0,4 7,7 6 7

0,5 7 30 5 8

0,3 5,5 33 4 9

0,4 8 4,5 32 10

36,5 0,6 8 6,5 11 Thôn Sù Chún Phìn, Xã Tùng Vài, Quản Bạ Thôn Cao Mã, Cao Mã Pờ, Quản Bạ Thôn Séo Lủng 2 xã Thái An, Quản Bạ Xã Hồ Thầu, Hoàng Su Phì Xã Nậm Ty, Hoàng Su Phì

12 Bản Péo, Hoàng Su Phì 29 0,3 5,5 5,5

13 0,5 7 32 4 Xã Thượng Sơn huyện Vị Xuyên

14 Cao Bồ, Vị xuyên 0,32 4,5 29 5

15 Thị trấn Vị xuyên 0,4 4 4,5 28 Lá xanh tốt, không sâu bệnh Lá xanh, không sâu bệnh Lá hơi tốt, không sâu bệnh Lá xanh nhạt, không sâu bệnh Lá hơi vàng, bị sâu ăn lá non Lá xanh nhạt, không sâu bệnh Lá xanh tốt , không sâu bệnh Lá xanh tốt , không sâu bệnh Lá xanh tốt , không sâu bệnh Lá xanh tốt , không sâu bệnh Lá xanh tốt , không sâu bệnh Lá xanh tốt , không sâu bệnh Lá xanh tốt , không sâu bệnh Lá xanh nhạt, không bị sâu bệnh Lá xanh tốt , không sâu bệnh

34

TT Xuất xứ Đặc điểm cây

Chiều dài lá (cm) Chiều dài thân (cm) Đường kính thân (cm) Chiều rộng lá (cm)

30,2 0,4 5,9 4,6 Trung bình

Qua kết quả điều tra, mẫu thu thập có chiều dài thân trung bình 30,2 cm, đường

kính thân trung bình khoảng 0,4cm, chiều dài và chiều rộng lá lần lượt là 5,9 cm và

4,6 cm, các mẫu thu thập có đặc điểm lá xanh tốt và không bị sâu bệnh.

3.2. Kết quả nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng đặc điểm hình thái

3.2.1. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Xín Mần

Các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Xín Mần có chiều cao trung bình khoảng

28,8 cm, đoạn thân hình trụ thường phân nhánh, màu lục, lá mọc đối; phiến lá hình

bầu dục, dài khoảng 5,5 cm, lá có màu xanh tốt, mép lá có hình răng cưa. Gân lá phía

trên hơi lồi, phía dưới lồi nhiều. Lá Sói rừng có mùi thơm nhẹ, vị hơi hăng. Bông

kép, ít nhánh, nhánh ngắn với hoa nhỏ màu trắng không có cuống và có một nhị.

Bầu nhụy có hình trứng và không có vòi.

Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Xín Mần

Chỉ tiêu theo dõi về hình thái

Xuất xứ Thân Lá Hoa Quả

Lá mặt trên xanh

Thân phân thẫm, mặt dưới Thời điểm Thời điểm

nhánh, màu lục, xanh nhạt, mép lá quan sát cây quan sát cây Nấm Dần

thân hình trụ chưa có hoa chưa có quả

có răng cưa, phiến lá hình bầu dục

Bông kép, ít

Thu Tà nhánh, nhánh ngắn với hoa nhỏ Thân phân nhánh, nhỏ màu xanh Thời điểm quan sát cây chưa có quả màu trắng Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục

không có

35

cuống và có

một nhị

Thời điểm quan sát cây Thời điểm quan sát cây Nà Chì Thân phân nhánh, nhỏ màu xanh chưa có hoa chưa có quả Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục

a) Nấm Dần b) Thu Tà c) Nà Chì

Hình 3.1. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Xín Mần

3.2.2. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Mèo Vạc

Mẫu Sói rừng thu tại huyện Mèo Vạc có chiều cao trung bình khoảng 27,3 cm,

đoạn thân có hình trụ chưa phân nhánh lá hình bầu dục, dài khoảng 9,5 cm, lá có màu

lục nhạt, mép lá có răng cưa. Quả nhỏ chưa chín có màu xanh, hình gần tròn đường

kính 3-4 mm.

Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Mèo Vạc

Chỉ tiêu theo dõi về hình thái

Xuất xứ Thân Lá Hoa Quả

Tả Lủng Thân màu lục, thân hình trụ Thời điểm quan sát cây chưa có hoa Quả nhỏ, chưa chín có màu xanh Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục

Lủng Chinh Thân phân nhánh, nhỏ màu xanh Thời điểm quan sát cây chưa có quả Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục Bông kép, ít nhánh, nhánh ngắn với hoa nhỏ

36

màu trắng không có cuống và có một nhị

Nậm Ban

Thân phân nhánh, nhỏ màu xanh Thời điểm quan sát cây chưa có hoa Thời điểm quan sát cây chưa có quả Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục

a) Tả Lủng b) Lủng Chinh c) Nậm Ban

Hình 3.2. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Mèo Vạc

3.2.3. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Quản Bạ

Cây Sói rừng có chiều cao trùng bình 32,5 cm, thân nhẵn, các mấu hơi phồng.

Nhánh cây tròn, không có lông, với các lá mọc đối, phiến dài hình bầu dục hay hình

ngọn giáo, chiều dài 7-15 cm và rộng 2-8 cm với 5-7 cặp gân bên. Mép lá có răng

cưa nhọn và thô, kèm với các tuyến. Cuống lá dài 5-8 mm. Quả chín mọng nhỏ, hình

gần tròn đường kính 4-5 mm, có màu đỏ gạch.

Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Quản Bạ

Chỉ tiêu theo dõi về hình thái

Xuất xứ Thân Lá Hoa Quả

Tùng Vài Thân màu lục, thân hình trụ Thời điểm quan sát cây chưa có hoa Thời điểm quan sát cây chưa có quả Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục

37

Cao Mã Pờ Thời điểm quan sát cây chưa có hoa Thân phân nhánh, nhỏ màu xanh Thời điểm quan sát cây chưa có quả Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục

Thái An Thân phân nhánh, nhỏ màu xanh Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục Quả nhỏ, chưa chín có màu xanh, quả chín có màu đỏ gạch. Bông kép, ít nhánh, nhánh ngắn với hoa nhỏ màu trắng không có cuống và có một nhị

a) Tùng Vài b) Cao Mã Pờ c) Thái An

Hình 3.3. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Quản Bạ

3.2.4. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Hoàng Su Phì

Cây Sói rừng có chiều cao khoảng 34 cm, thân nhẵn, các mấu hơi phồng.

Nhánh cây tròn, không có lông, với các lá mọc đối, phiến dài hình bầu dục hay hình

ngọn giáo, chiều dài 7–12 cm và rộng 2–6 cm với 5-7 cặp gân bên. Mép lá có răng

cưa nhọn và thô, kèm với các tuyến. Cuống lá dài 5–8 mm.

Bảng 3.6. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Hoàng Su

Phì

Chỉ tiêu theo dõi về hình thái

Xuất xứ Thân Lá Hoa Quả

Hồ Thầu Thân màu lục, thân hình trụ Thời điểm quan sát cây chưa có hoa Thời điểm quan sát cây chưa có quả Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa,

38

phiến lá hình bầu dục

Nậm Ty

Thời điểm quan sát cây chưa có hoa Thời điểm quan sát cây chưa có quả Thân phân nhánh, nhỏ màu xanh Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục

Bản Péo

Thời điểm quan sát cây chưa có hoa Thời điểm quan sát cây chưa có quả Thân phân nhánh, nhỏ màu xanh Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng cưa, phiến lá hình bầu dục

a) Hồ Thầu b) Nậm Ty c) Bản Péo

Hình 3.4. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Hoàng Su Phì

3.2.5. Đặc điểm mẫu cây Sói rừng thu thập được tại huyện Vị Xuyên

Cây Sói Rừng thu thập tại Huyện Vị Xuyên là loài cây nhỏ, cao trung bình

khoảng 1,2 m; đốt phồng to, nhánh tròn, không lông, mọc đối. Lá mọc đối, có phiến

dài hình bầu dục, dài 7- 13cm, rộng 2 – 4 cm, đầu nhọn, mép có răng nhọn, gân phụ

5 cặp; cuống ngắn 5-10mm.

Bảng 3.7. Đặc điểm hình thái các mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Vị Xuyên

Chỉ tiêu theo dõi về hình thái

Xuất xứ

Thân

Lá

Hoa

Quả

Thượng Sơn

Thân màu lục, thân hình trụ

Thời điểm quan sát cây chưa có hoa

Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng

Thời điểm quan sát cây

39

cưa, phiến lá hình bầu dục

chưa có quả

Thân phân nhánh

Thời điểm quan sát

Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng

Thời điểm quan sát cây

Cao Bồ

nhỏ, màu xanh lục

cây chưa có hoa

cưa, phiến lá hình bầu dục

chưa có quả

Bông kép, ít nhánh,

Lá mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh nhạt, mép lá có răng

nhánh ngắn với hoa nhỏ màu

Thời điểm quan sát cây

Thân phân nhánh nhỏ, màu xanh

Thị trấn Vị Xuyên

cưa, phiến lá hình bầu dục

chưa có quả

trắng không có cuống và có một nhị

a) Thượng Sơn b) Cao Bồ c) Thị trấn Vị Xuyên

Hình 3.5. Mẫu Sói rừng thu thập tại huyện Vị Xuyên

Theo Dược điển Việt Nam V, loài Sói rừng được mô tả như sau:

Đoạn thân hình trụ thường phân nhánh, màu lục, dài 10 cm đến 15 cm, đường

kính 0,3 cm đến 1,3 cm, mang lá mọc đối; phiến lá hình bầu dục, dài 7 cm đến 18

cm, rộng 2 c đến 7 cm, mép lá có răng cưa nhọn, cuống lá ngắn 0,5 cm đến 0,8 cm, lá

có màu lục nhạt. Mùi thơm nhẹ, vị hơi hăng. Dược liệu sau khi cắt đoạn phơi khô là

các đoạn thân lá dài từ 3 cm đến 5 cm, bên ngoài có màu xanh lục tối hoặc nâu tối có

các nếp nhăn dọc hiện rõ, rải rác có các nốt sần nhô lên. Mặt cắt thân có tủy hoặc lỗ

rỗng ở giữa [32].

Mặt cắt ngang tiết diện hơi tròn. Quan sát dưới kính hiển vi thấy: Bần cấu tạo

bởi nhiều lớp tế bào hình chữ nhật bị ép dẹt thành hàng đồng tâm và dãy xuyên tâm.

Mô mềm vỏ cấu tạo bởi các tế bào hình đa giác hay hình trứng thành mỏng, xếp

không đều. Sau mô mềm là sợi xếp thành vòng tròn. Phần libe-gỗ: Bó chồng mạch

40

hở rất phát triển xếp thành vòng tròn sít nhau. Trong cùng là mô mềm ruột cấu tạo

bởi các tế bào hình tròn hay hình đa giác, thành mỏng, có kích thước lớn. Rải rác

trong mỏ mềm vỏ và ruột có các tế bào cứng [32].

Gân lá: Gân phía trên hơi lồi, phía dưới lồi nhiều. Biểu bì trên và dưới) là một

hàng tế bào hình chữ nhật nhỏ xếp đều đặn, phía ngoài phủ một lớp cutin mỏng. Hạ

bì gồm một lớp tế bào hình gần tròn nhỏ xếp đều đặn. Mô mềm cấu tạo bởi các tế

bào thành mỏng hình đa giác hay hình trứng, kích thước không đều. Rải rác trong mô

mềm có các đám tế bào cứng. Giữa gân lá có hai bó libe-gỗ lớn nằm đối xứng nhau

qua trục giữa của gân lá. mỗi bó có một cung mô cứng gồm các tế bào có thành dày

hoá gỗ, phía trên là cung mạch gỗ, ở giữa là libe [32].

Phiến lá: Biểu bì trên và dưới là một hàng tế bào hình chữ nhật tương tự phần

gân lá nhưng có kích thước nhỏ hơn. Lớp tế bào mô dậu quan sát không rõ. Mô mềm

gồm những tế bào có kích thước lớn, thành mỏng [32].

Bông kép, ít nhánh, nhánh ngắn với hoa nhỏ màu trắng không có cuống và có

một nhị. Bầu nhụy có hình trứng và không có vòi [32].

Qủa của cây Sói rừng nhỏ, khi chín có màu đỏ gạch, vỏ nhẵn mọng, quả gần

tròn đường kính khoảng 4mm [32].

Như vậy theo đánh giá sơ bộ ban đầu về đặc điểm hình thái lá, thân, hoa và

quả của mẫu thu thập thuộc 5 huyện Xín Mần, Mèo Vạc, Quản Bạ, Hoàng Su Phì và

Vị Xuyên của tỉnh Hà Giang cho kết quả các mẫu thu thập là cây Sói rừng.

3.3. Kết quả nhận dạng mẫu nguồn gen cây Sói rừng bằng chị thị DNA

3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của mẫu Sói rừng nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là 15 mẫu lá của cây Sói rừng được thu thập tại 15 xã của

05 huyện thuộc Tỉnh Hà Giang (bảng 3.8).

Bảng 3.8. Danh sách 15 mẫu lá Sói rừng trong nghiên cứu

STT Huyện Xã, TT Kí hiệu

1 Nấm Dẩn SR1

2 Xín Mần Thu Tà SR2

3 Nà Chì SR3

4 Tả Lủng SR4 Mèo Vạc 5 Lủng Chinh SR5

41

STT Huyện Xã, TT Kí hiệu

Nậm Ban 6 SR6

Tùng Vài 7 SR7

Quản Bạ Cao Mã Pờ 8 SR8

Thái An 9 SR9

Tân Thành 10 SR10

Bắc Quang Thượng Bình 11 SR11

Đức Xuân 12 SR12

Thượng Sơn 13 SR13

Vị xuyên Cao Bồ 14 SR14

TT Vị Xuyên 15 SR15

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sử dụng CTAB

của P. Doyle and Doyle (1987) có một số cải tiến nhỏ để tiến hành tách chiết ADN

các mẫu Sói rừng nghiên cứu kết quả được thể hiện trong hình 3.6.

Hình 3.6. kết quả tách chiết DNA tổng số của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu

ADN của 15 mẫu lá của cây Sói rừng được thu thập từ 15 xã của 05 huyện

thuộc tỉnh Hà Giang sau khi tách chiết đều cho nồng độ và độ tinh sạch cao, các băng

gọn sắc nét đảm bảo cho các bước thí nghiệm tiếp theo.

3.3.2. Kết quả PCR của mẫu Sói rừng nghiên cứu

Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi ITS4/ITS5 kết quả thu được cho thấy

các mẫu lá thuộc 15 mẫu Sói rừng đều cho băng đơn hình với kích thước khoảng 730

bp (hình 3.7). Kết quả đảm bảo để thực hiên bước nghiên cứu giải trình tự tiếp theo.

42

Hình 3.7. Kết quả PCR của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu

với cặp mồi ITS4/ITS5; M: Marker generuler 1kb plus DNA

3.3.3. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA của mẫu Sói rừng nghiên cứu

Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS4/ITS5 sau khi tinh sạch được phân tích trực

tiếp trên máy giải trình tự ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biotech) của

công ty Macrogen (Hàn Quốc) Trình tự của 15 mẫu Sói rừng trong nghiên cứu được

so sánh với trình tự gen tham chiếu đã được công bố mã số trên NCBI thông qua

phần mềm MEGA v6.06.

Số liệu thu được trong bảng 3.4 của các mẫu Sói rừng có độ dài nucleotit là

phù hợp với kết quả kiểm tra kích thước băng PCR ở hình 3.7. Kết quả ở bảng 3.4

cũng cho thấy, do có sự mất đoạn (InDel) hay thêm đoạn (InSert) ở một số vị trí trên

đoạn gen nên số lượng nucleotit tổng số của mỗi đoạn trình tự có sự dao động giữa

các mẫu nghiên cứu. Độ dài nucleotit của các mẫu dao động từ 709nu (SR10) đến

734nu (SR7, SR8, SR9 và SR14). Các mẫu SR5, SR13 có độ dài nucleotit là 733nu;

mẫu SR15 có độ dài nucleotit là 732nu; các mẫu SR1, SR4 và SR6 có độ dài

nucleotit là 731nu; các mẫu SR2, SR3 có độ dài nucleotit là 730nu; mẫu SR11 có độ

dài nucleotit là 727nu; mẫu SR12 có độ dài nucleotit là 716nu (Phụ lục 1).

Bảng 3.9. Độ dài trình tự của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu

STT Kí hiệu Tổng số Nucleotide STT Kí hiệu Tổng số Nucleotide

1 SR1 731 9 SR9 734

2 SR2 730 10 SR10 709

3 SR3 730 11 SR11 727

4 SR4 731 12 SR12 716

43

SR5 5 733 13 SR13 733

SR6 6 731 14 SR14 734

SR7 7 734 15 SR15 732

SR8 8 734

3.3.4. Kết quả phân tích đa dạng di truyền, xác định mối quan hệ di truyền giữa 15

mẫu Sói rừng nghiên cứu

Số liệu thu được ở bảng 3.10 cho thấy có sự tương đồng khá cao giữa 15 trình

tự của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu. Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide cao nhất

là 99,86% (giữa cặp mẫu SR1 - SR3 và SR13 - SR14). Hệ số tương đồng về trình tự

nucleotide thấp nhất là 62,60% (giữa cặp mẫu SR1 - SR10 và SR6 - SR10). Kết quả

so sánh sự tương đồng di truyền giữa 2 mẫu tham chiếu MH270480.1 Chloranthus

erectus và KP317601.1 Sarcandra glabra với 15 mẫu nghiên cứu cho thấy: 15 mẫu

Sói rừng có hệ số tương đồng về trình tự nucleotide với mẫu tham chiếu Chloranthus

erectus dao động từ 59,21% (mẫu SR11 và Chloranthus erectus) đến 90,82% (mẫu

SR2, SR3 và Chloranthus erectus). 15 mẫu Sói rừng có hệ số tương đồng về trình tự

nucleotide với mẫu tham chiếu Sarcandra glabra dao động từ 66,17% (mẫu SR10 và

Sarcandra glabra) đến 99,46% (mẫu SR8; SR9 và Sarcandra glabra).

44

Bảng 3.10: Hệ số tương đồng di truyền giữa 15 mẫu Sói rừng

nghiên cứu và 2 mẫu tham chiếu

Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại của 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu với mẫu

tham chiếu MH270480.1 Chloranthus erectus và KP317601.1 Sarcandra glabra

Cây phát sinh loài được xây dựng dựa vào phần mềm Mega 6.0 theo phương

pháp Maximum likelihood, kết quả từ 15 mẫu Sói rừng nghiên cứu được phân làm 3

nhóm chính:

Nhóm thứ I: bao gồm 3 mẫu Sói rừng là SR10, SR11 và SR12) có hệ số tương

đồng về trình tự nucleotide dao động từ 95,64% (SR11 và SR12) đến 98,04% (SR10

và SR12). Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide giữa các mẫu nghiên cứu trong

nhóm này với mẫu tham chiếu Sarcandra glabra (dao động từ 66,17% đến 68,99%) cao

45

hơn mẫu tham chiếu Chloranthus erectus (dao động từ 59,21% đến 60,28%).

Nhóm thứ II: gồm 7 mẫu giống là SR7, SR8, SR9, SR13, SR14, SR15 và

SR5. Các mẫu trong nhóm này có hệ số tương đồng về trình tự nucleotide dao động

từ 94,32% (giữa mẫu SR7 - SR9 và SR9 - SR14) đến 99,86% (giữa mẫu SR13 và

SR14). Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide giữa các mẫu nghiên cứu trong nhóm

này với mẫu tham chiếu Sarcandra glabra (dao động từ 91,66% đến 95,39%) cao hơn

mẫu tham chiếu Chloranthus erectus (dao động từ 72,92% đến 77,16%).

Nhóm thứ III: gồm 5 mẫu giống là SR1, SR2, SR3, SR4 và SR6 có hệ số

tương đồng về trình tự nucleotide dao động từ 98,36% (giữa mẫu SR2 và SR4) đến

99,86% (giữa mẫu SR1 và SR3). Hệ số tương đồng về trình tự nucleotide giữa các

mẫu nghiên cứu trong nhóm này với mẫu tham chiếu Chloranthus erectus (dao động

từ 90,15% đến 90,82%) cao hơn mẫu tham chiếu Sarcandra glabra (dao động từ

86,12% đến 87,31%).

Kết quả thu được ở hình 3.8 cũng phù hợp với các kết quả so sánh trình tự các

nucleotid vùng gen lục lạp của 15 mẫu Sói rừng khi phân tích sắp cột thẳng hàng

(alignments) trình tự DNA vùng gen được giải mã cùng với trình tự tham chiếu đã

được công bố trên GenBank. Như vậy dựa vào trình tự nucleotide nhân với marker

ITS4/ITS5 thu được 7 mẫu giống SR7, SR8, SR9, SR13, SR14, SR15 và SR5 tương

đồng cao về trình tự nucleotide với mẫu tham chiếu Sarcandra glabra (dao động từ

91,66% đến 95,39%). 5 mẫu giống là SR1, SR2, SR3, SR4 và SR6 tương đồng cao

về trình tự nucleotide với mẫu tham chiếu Chloranthus erectus (dao động từ 90,15%

đến 90,82%).

3.4. Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro cây Sói rừng

3.4.1. Chọn vật liệu khởi đầu

Căn cứ vào đặc điểm hình thái cùng với kết quả nghiên cứu đánh giá đa dạng

di truyền (mục 3.2.3) tôi lựa chọn mẫu Sói rừng có xuất xứ Thái An, Quảm Bạ làm

vật liệu ngân giống phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo

mẫu vô trùng

Khử trùng mẫu là giai đoạn tiên quyết, là nền tảng tạo nên sự thành công của

quá trình nuôi cấy in vitro. Quá trình này cần đảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ mẫu

46

sống cao, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, mô nuôi cấy sinh trưởng tốt. Chất khử trùng HgCl2

với nồng độ 0,1% là hóa chất phổ biến, phù hợp khử trùng bề mặt các đối tượng

thực vật vào mẫu dạng thân gỗ. Gốc Hg2+ có hoạt tính khử trùng mạnh. Hg2+ gây thoái

hóa tổ chức, tạo thành các hợp chất protein rất dễ tan làm tê liệt chức năng của các

nhóm thiol (-SH), các hệ thống men cơ bản và oxi hóa khử của tế bào; Hg2+ có thể liên

kết với các protein và mô, làm tê liệt và phá hủy tế bào nấm, khuẩn nhanh chóng.

Trong thí nghiệm này chúng tối tiến hành khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2

0,1% với khoảng thời gian khác nhau: 3 phút, 5 phút, 10 phút và 15 phút. Mẫu đối

chứng khử trùng bằng nước cất vô trùng. Chồi vô trùng bề mặt được cấy chuyển vào

môi trường MS không chứa chất điều hòa sinh trưởng. Kết quả nghiên cứu được

trình bày trong Bảng 3.11 và Hình 3.9. (Chi tiết thành phần MS xem phụ lục 2).

Bảng 3.11. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1%

đến khả năng tạo mẫu vô trùng (sau 4 tuần nuôi cấy)

Tỷ lệ mẫu sống Thời gian Chất khử Tổng số mẫu không nhiễm, Công thức khử trùng trùng (mẫu) phát sinh chồi (phút) (%)

CT1 (ĐC) 90 0,0 0

CT2 90 7,8 3

CT3 90 62,2 5 HgCl2 0,1 %

CT4 90 44,4 10

CT5 90 24,4 15

CV% 4,2

2,5 LSD0,05

Với kết quả phân tích số liệu LSD0,05 bằng 2,5 và CV% bằng 4,2 cho thấy các

công thức thực sự khác nhau với độ tin cậy 95%.

Kết quả cho thấy CT1 (đối chứng) chỉ xử lý bằng nước cất vô trùng toàn bộ

mẫu nghiên cứu đều bị nhiễm. Khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 3 phút

47

tỷ lệ mẫu sống không nhiễm được cải thiện, tuy nhiên khá thấp chỉ đạt 7,8%. Tăng

thời gian khử trùng lên 5 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm cao đạt 62,2%. Tiếp

tục tăng thời gian khử trùng lên 10 phút và 15 phút kết quả tỷ lệ mẫu sống không

nhiễm giảm dần do thời gian tiếp xúc với HgCl2 thời gian dài mẫu bị chết nhiều. Như

vậy khi khử trùng mẫu Sói rừng bằng dung dịch HgCl2 0,1% thời gian thích hợp là

trong 5 phút.

Hình 3.9. Kết quả khử trùng mẫu đoạn thân Sói rừng bằng HgCl2 0,1%

3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng

nhân nhanh chồi Sói rừng

3.4.3.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng

Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực

vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi vì vậy để tăng hệ số nhân chồi người ta đã bổ sung

thêm một số chất có trong nhóm cytokinin trong môi trường nuôi cấy.

Trong thí nghiệm này chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng

nhân nhanh chồi Sói rừng, mẫu được đưa vào môi trường có bổ sung BAP với nồng

độ từ 0 - 3mg/l. Theo dõi mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả nghiên cứu được trình

bày trong bảng 3.12.

48

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng

nhân nhanh chồi Sói rừng (sau 4 tuần nuôi cấy)

Hệ số Hệ số Hệ số Nồng nhân nhân nhân Công độ Số mẫu chồi lần chồi lần chồi lần Hình thái chồi thức BAP 1 2 3 (CT) (mg/l) (lần) (lần) (lần)

CT1 0 90 1,0 1,0 1,03 Chồi xanh (ĐC)

Chồi và hệ lá xanh,

CT2 0.5 90 1,0 1,02 1,78 sinh trưởng phát triển

tốt

Chồi và hệ lá xanh,

CT3 1 90 1,0 1,12 2,16 sinh trưởng phát triển

tốt

Chồi và hệ lá xanh,

CT4 1.5 90 1,12 1,65 3,51 sinh trưởng phát triển

tốt

Chồi xanh nhạt, mọng CT5 2 90 1,41 1,45 3,22 nước

Chồi xanh nhạt, mọng CT6 3 90 1,38 1,43 2,87 nước

0,24 LSD0,05

CV% 1,4

Với giá trị LSD00.05 đạt 0,24 các công thức thí nghiệm có sự sai khác nhau có

ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.

CT1 (ĐC) khi không bổ sung chất kích sinh trưởng không có hiện tượng xuất

hiện chồi mới qua 3 lần cấy chuyển. Trên các môi trường có bổ sung BAP, đều ghi

nhận có hiệu quả tăng sinh chồi. Khi bổ sung BAP có nồng độ (1 ÷ 3 mg/l) hệ số hân

49

chồi tăng dần và đạt cao nhất ở CT4 tương ứng 3,51 lần. Tiếp tục tăng nồng độ BAP

lên 2mg/l và 3 mg/l hệ số nhân chồi có xu hướng giảm đồng thời chồi có hiện tượng

chồi mới bị mọng nước.

Kết quả thu được có thể được giải thích như sau: BAP là một trong các

cytokinin có vai trò trong việc hoạt hóa quá trình phân bào, nhờ đó có tác dụng tái

sinh và phân hóa chồi cho cây. Khi tăng dần nồng độ BAP trong môi trường nuôi cấy

thì hệ số nhân chồi tăng. Nhưng khi tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 2 mg/l không cho

kết quả cao hơn đồng thời có xu hướng giảm do hàm lượng BAP cao có thể gây độc

cho mẫu, từ đó gây ức chế khả năng tạo chồi cho mẫu. Kết quả nghiên cứu trên đã

xác định được nồng độ BAP thích hợp nhất để nhân nhanh chồi Sói rừng là 1,5 mg/l

tương ứng hệ số nhân chồi đạt 3,51 lần. Kết quả này được sử dụng cho thí nghiệm

tiếp theo. Hình 3.10 thể hiện hệ số nhân chồi và chất lượng chồi đạt tốt nhất ở nồng

nồng BAP 1,5 mg/l

CT1 (ĐC) CT4: BAP (1,5mg/l)

Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cây Sói rừng

3.4.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với Kinetin đến hệ số nhận

chồi Sói rừng

Nồng độ BAP 1,5mg/l tốt nhất ở thí nghiệm 1 được kết hợp với Kinetin với

dãy nồng độ khác nhau. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với

Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng được thể hiện ở bảng 3.13.

50

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi

sau 4 tuần nuôi cấy (sau 4 tuần nuôi cấy)

Hệ số Hệ số Hệ số Nồng Nồng nhân nhân nhân Công độ độ Số mẫu chồi chồi chồi lần Hình thái chồi thức BAP kinetin lần 1 lần 2 3 (CT) (mg/l) (mg/l) (lần) (lần) (lần)

Chồi và hệ lá CT1 1,5 0 90 1,12 1,65 3,51 xanh, sinh trưởng (ĐC) phát triển tốt

Chồi và hệ lá

CT2 1,5 0,2 90 1,13 1,72 3,93 xanh, sinh trưởng

phát triển tốt

Chồi và hệ lá

CT3 1,5 0,4 90 1,13 1,75 4,42 xanh, sinh trưởng

phát triển tốt

Chồi và hệ lá

CT4 1,5 0,6 90 1,15 1,81 4,72 xanh, sinh trưởng

phát triển tốt

Chồi xanh, mọng CT5 1,5 0,8 90 1,22 1,83 4,57 nước

Chồi xanh, mọng CT6 1,5 1,0 90 1,25 1,81 4,16 nước

0,14 LSD0,05

CV% 1,9

Từ kết quả bảng 3.13 cho thấy với giá trị LSD.0.05 đạt 0,14 thì các công thức

có sự sai khác nhau có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%, hệ số nhân chồi cao nhất ở CT4 với

nồng độ BAP 1,5 mg/l kết hợp với Kinetin nồng độ 0,6 mg/l đạt hệ số nhân chồi 4,72

lần. Tiếp tục tăng nồng độ kinetin lên 0,8 mg/l và 1,0 mg/l hệ số nhân chồi có xu

hướng giảm đồng thời chồi có hiện tượng bị mọng nước. Sự kết hợp giữa nồng độ

BAP và Kinetin quá lớn sẽ làm giảm hệ số nhân chồi. Như vậy, nồng độ thích hợp là

51

BAP 1,5 mg/l kết hợp kinetin 0,6 mg/l. Kết quả này được sử dụng cho thí nghiệm

tiếp theo.

Hình 3.11 cho thấy hệ số nhân chồi cây Sói rừng thay đổi theo chiều hướng

tích cực khi sử dụng tổ hợp BAP 1,5 mg/l kết hợp kinetin 0,6 mg/l.

CT1 (ĐC): BAP (1,5mg/l) CT4: BAP 1,5mg/l) + Kinetin (0,6 mg/l)

Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với Kinetin

đến hệ số nhân chồi cây Sói rừng

3.4.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP,

Kinetin và NAA đến hệ số nhân chồi

Trong việc tạo chồi, auxin cũng có tác dụng tích cực khi phối hợp với

cytokinin ở nồng độ thích hợp. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh việc tạo chồi có

hiệu quả khi phối hợp hai nhóm auxin và cytokinin hơn là chỉ sử dụng nhóm

cytokinin một cách riêng rẽ. Theo Murashige (1980) quá trình phân hoá chồi phụ

thuộc vào tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Nếu tỷ lệ

cytokinin/auxin cao kích thích sự hình thành chồi và ngược lại sẽ kích thích sự hình

thành rễ. Để tìm ra tỷ lệ phối hợp tối ưu cho môi trường nhân nhanh, chúng tôi đã

tiến hành nuôi cấy mẫu trên môi trường có bổ sung tổ hợp BA 1,5 mg/l và Kinetin

0,6 mg/l (công thức cho hệ số nhân chồi cao tốt nhất) phối hợp với NAA ở các nồng

độ là 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,4mg/; 0,5 mg/l. Kết quả theo dõi sau 4 tuần nuôi

cấy được thể hiện qua bảng 3.14.

52

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với NAA đến

hệ số nhận chồi (sau 4 tuần nuôi cấy)

Hình thái chồi Số mẫu Công thức (CT) Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) Nồng độ kineti n (mg/l) Hệ số nhân chồi lần 1 (lần ) Hệ số nhân chồi lần 2 (lần ) Hệ số nhân chồi lần 3 (lần )

Chồi và hệ lá

CT1 xanh, sinh 1.5 0,6 0 90 1,15 1,81 4,72 (ĐC) trưởng phát

triển tốt

Chồi và hệ lá

xanh, sinh CT2 1.5 0,6 0,1 90 1,16 1,83 4,95 trưởng phát

triển tốt

Chồi và hệ lá

xanh, sinh CT3 1.5 0,6 0,2 90 1,16 1,85 5,85 trưởng phát

triển tốt

Chồi và hệ lá CT4 1.5 0,6 0,3 90 1,19 1,88 5,42 phát triển xanh

Chồi xanh, CT5 1.5 0,6 0,4 90 1,22 1,85 4,86 mọng nước

Chồi xanh, CT6 1.5 0,6 0,5 90 1,25 1,87 4,78 mọng nước

0,93 LSD0,05

CV% 1,4

Với kết quả phân tích số liệu LSD0,05 bằng 0,93 và CV% bằng 1,4 cho thấy

các công thức không có sự khác nhau, cho nên việc sử dụng chất điều hòa sinh

trưởng NAA ở các nồng độ khác nhau không ảnh hưởng đến hệ số nhân chồi của

mẫu nuôi cấy.

53

Kết quả bảng 3.14 cho thấy các công thức có bổ sung thêm NAA cho hệ số

nhân chồi cao hơn so với công thức đối chứng (công thức 1) chỉ bổ sung BAP và

kinetin. Kết quả sau 4 tuần nuôi cấy: Các công thức thí nghiệm còn lại cho hệ số

nhân đạt từ 4,86 lần đến 5,85 lần. Trong đó công thức 3 với nồng độ NAA bổ sung là

0,2 mg/l cho hệ số nhân đạt cao nhất 5,85 lần. Các công thức thí nghiệm 2,4, 5, 6 cho

hệ số nhân lần lượt đạt 4,95 lần; 5,42 lần; 4,86; và 4,78 lần. Khi nồng độ NAA qua

ngưỡng tối thích ở công thức 3 thì hệ số nhân chồi có xu hướng giảm dần.

Từ kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đã xác định được nồng độ NAA tốt nhất

để phối hợp với tổ hợp BA và kinetin cho nhân nhanh in vitro chồi Sói rừng là 0,2

mg/l.

CT1 (ĐC): BAP (1,5mg/l) + Kinetin CT3: BAP (1,5mg/l) + Kinetin (0,6 mg/l)

(0,6 mg/l) + NAA (0,2 mg/l)

Hình 3.12. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với NAA

đến đến hệ số nhận chồi cây chồi Sói rừng

3.4.3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP,

Kinetin và IBA đến hệ số nhân chồi

Để tiếp tục cải thiện môi trường nâng cao hệ số nhân chồi và chất lượng chồi,

chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp cả 3 chất điều hòa sinh trưởng

(BAP, Kinetin, IBA) trong môi trường nhân chồi. Kết quả nghiên cứu được thể hiện

trong Bảng 3.15.

54

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP, Kinetin với IBA

đến hệ số nhận chồi sau 4 tuần nuôi cấy

Hình thái chồi Số mẫu Công thức (CT) Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ kinetin (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) Hệ số nhân chồi lần 1 (lần) Hệ số nhân chồi lần 2 (lần) Hệ số nhân chồi lần 3 (lần)

1,5 0,6 0 90 1,15 1,81 4,72 CT1 (ĐC)

CT2 1,5 0,6 0,1 90 1,17 1,83 4,14

CT3 1,5 0,6 0,2 90 1,18 1,85 5,99

CT4 1,5 0,6 0,3 90 1,19 1,98 5,56

CT5 1,5 0,6 0,4 1,21 1,88 4,99 90

CT6 1,5 0,6 0,5 1,25 1,86 4,87 90

LSD0,05 CV% 0,12 1,3 Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng phát triển tốt Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng phát triển tốt Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng phát triển tốt Chồi và hệ lá xanh, sinh trưởng phát triển tốt Chồi có hiện tượng bị thủy tinh thể Chồi có hiện tượng bị thủy tinh thể

Với kết quả phân tích số liệu LSD0,05 bằng 0,12 và CV% bằng 1,3 cho thấy các

công thức thực sự khác nhau với độ tin cậy 95%.

Kết quả cho thấy các công thức có bổ sung thêm IBA cho hệ số nhân chồi cao

hơn so với công thức đối chứng (công thức 1) chỉ bổ sung BAP và Kinetin. Sau 4

tuần nuôi cấy cho thấy: Công thức ĐC cho hệ số nhân đạt 4,72 lần. Các công thức thí

nghiệm còn lại cho hệ số nhân đạt từ 4,87 lần đến 5,99 lần. Trong đó công thức 3 với

nồng độ IBA bổ sung là 0,2 mg/l cho hệ số nhân đạt cao nhất 5,99 lần. Các công thức

thí nghiệm 2,4, 5, 6 cho hệ số nhân lần lượt đạt 4,99lần; 4,96 lần;5,56 và 4,97 lần.

Khi nồng độ IBA qua ngưỡng tối thích ở công thức 3 thì hệ số nhân chồi có xu

55

hướng giảm dần. Từ kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đã xác định được nồng độ

IBA tốt nhất để phối hợp với tổ hợp BA và kinetin cho nhân nhanh in vitro chồi Sói

rừng là 0,2 mg/l. Mô sẹo cũng tạo ra trong các môi trường chứa Kinetin với mức độ

khác nhau. Hình 3.13 thể hiện chất lượng chồi và hệ số nhận chồi in vitro đạt kết quả

cao nhất khi sử dụng công thức môi trường: MS có bổ sung BAP (1,5mg/l) + kinetin

(0,6 mg/l) + IBA (0,2 mg/l).

CT3: BAP (1,5 mg/l) + Kinetin CT1 (ĐC): BAP (1,5 mg/l) + Kinetin

(0,6 mg/l) + IBA (0,2 mg/l) (0,6 mg/l)

Hình 3.13. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin với IBA

đến khả năng nhân nhanh chồi Sói rừng

So sánh giữa các môi trường có bổ sung thêm IBA và NAA, chúng tôi nhận

thấy các công thức môi trường có bổ sung IBA đều cho kết quả (hệ số nhân chồi) cao

hơn so với các công thức môi trường tương ứng có bổ sung NAA ở cùng nồng độ.

Chứng tỏ IBA là auxin thích hợp hơn khi kết hợp với tổ hợp cytokinin (BAP +

kinetin) cho nhân nhanh chồi Sói rừng.

Như vậy môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro cây Sói rừng là

MS có bổ sung BAP (1,5mg/l) + kinetin (0,6 mg/l) + IBA (0,2 mg/l).

3.4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh đến khả năng

ra rễ chồi Sói rừng

3.4.4.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi Sói rừng

Ra rễ là bước cuối cùng của gian đoạn nhân giống in vitro. Chất kích thích

sinh trưởng được dùng chủ yếu của giai đoạn này thuộc nhóm auxin. Các chồi tạo

56

thành đạt tiêu chuẩn sẽ được tách ra đưa vào mỗi trường kích thích tạo rễ. Môi

trường ra rễ được bổ sung với các hàm lượng NAA khác nhau. Kết quả nghiên cứu

ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ của chồi Sói rừng được thể hiện

ở bảng 3.16.

Bảng 3.16. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA

đến khả năng ra rễ của chồi Sói rừng (sau 4 tuần nuôi cấy)

Công thức (CT) Số rễ trung bình trên cây (rễ) Hình thái và chiều dài rễ Nông độ NAA (mg/l) Tổng số mẫu (mẫu) Tỷ lệ ra rễ (%)

CT 1 90 0 0,76 Rễ mảnh, dài, vàng 6,66

CT 2 90 0,25 1,84 Rễ mảnh, dài, vàng 91,11

CT 3 90 0,5 3,05 Rễ mảnh, dài, vàng 100

CT 4 90 0,75 2,62 Rễ mảnh, dài, vàng 100

CT 5 90 1,0 2,78 Rễ mảnh, dài, vàng 82,22

0,1 LSD0,05

CV% 1,7

Kết quả phân tích cho giá trị LSD0,05 =0,1, CV%=1,7 cho thấy số rễ trung

bình ở các công thức khác nhau có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%.

Để thiết lập môi trường thích hợp cho tạo rễ, chúng tôi đã sử dụng 5 công thức

khác nhau, bổ sung NAA (0 - 1 mg/l). Ở công thức CT1 (đối chứng) không bổ

sung NAA tỷ lệ ra rễ và số rễ tương ứng 6,66 và 0,76 điều này cho thấy auxin

nội sinh có trong mẫu ít nên việc hình thành rễ in vitro trên đối tượng này không

cao. Khi bổ sung NAA 0,25 mg/l ở CT2 tỷ lệ tạo rễ tăng lên đạt 91,11% tương

ứng số rễ 1,84. Hiệu quả thí nghiệm cao nhất ở CT3 và CT4 với nồng độ NAA

0.5 mg/l và 0,75 mg/l tương ứng tỷ lệ ra rễ đạt 100%, số rễ hình thành 3,05 rễ và

2,62 rễ. Khi nồng độ NAA vượt qua ngưỡng tối thích ở CT3 (0,5 mg/l) thì số rễ

có xu hướng giảm dần. Kết quả này thích hợp với lý thuyết về sự tác động của

auxin lên sự hình thành và phát triển của rễ. Các nhà nghiên cứu cho rằng nồng

độ auxin quá cao có tác động ngăn cản sự phát triển của rễ (De Klerk, 1999).

57

CT1 (ĐC): NAA 0,0 mg/l CT3: NAA 0,5 mg/l

Hình 3.14. Ảnh hưởng của NAA đến kết quả ra rễ chồi Sói rừng

3.4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi

Sói rừng

Bảng 3.17. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng

ra rễ của chồi Sói rừng (sau 4 tuần nuôi cấy)

Công thức (CT) Nông độ IBA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ trên cây (rễ) Hình thái và chiều dài rễ Tổng số mẫu (mẫu)

CT 1 90 0 6,66 0,76 Rễ mập, ngắn

CT 2 90 0,25 100 5,67 Rễ mập, ngắn

CT 3 90 0,5 100 6,15 Rễ mập, ngắn

CT 4 90 0,75 100 5,96 Rễ mập, ngắn

CT 5 90 1,0 100 3,61 Rễ mập, ngắn

0,18 LSD0,05

CV% 1,7

Cùng với NAA, IBA là chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp điển hình của

nhóm auxin. Chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả

năng tạo rễ chồi Sói rừng in vitro. Tương tự như thí ngiệm NAA, IBA được đưa vào

58

môi trường với nồng độ 0 - 1,0 mg/l. Kết quả thí nghiệm sau 4 tuần nuôi cấy được

trình bày trong bảng 3.17.

Kết quả phân tích cho giá trị LSD0,05 =0,18, CV%=1,7 cho thấy số rễ trung

bình ở các công thức khác nhau có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%.

Kết quả bảng 3.17 cho thấy: Khi bổ sung IBA vào môi trường thí nghiệm cho

kết 100% có sự đáp ứng tạo rễ in vitro. Tuy nhiên số lượng rễ hình thành/mẫu cấy ở

các nồng độ khác nhau là khác nhau.

Trong môi trường ra rễ chứa IBA, rễ xuất hiện sau 7 - 10 ngày nuôi cấy chồi

trong môi trường. Tỷ lệ chồi ra rễ tăng dần và tỷ lệ với nồng độ IBA và đạt cao nhất là

100%, số rễ trung bình là 4,15 ở nồng độ IBA (0,5 mg/l). Sau đó, tỷ lệ ra rễ giảm dần ở

nồng độ IBA 0,75 - 1,0 mg/l. Trong môi trường bổ sung IBA (0,25 - 1,0 mg/l) tỷ lệ

chồi ra rễ đều cao hơn so với môi trường đối bổ sung NAA (0,25 - 1,0 mg/l).

So sánh giữa các môi trường nuôi cấy có IBA và NAA, chúng tôi nhận

thấy các môi trường có bổ sung NAA đều cho kết quả (số lượng rễ hình thành)

kém hơn so với các môi trường tương ứng có bổ sung IBA ở cùng nồng độ.

Chứng tỏ IBA là chất kích thích tạo rễ thích hợp hơn cho nuôi cấy tạo rễ in vitro

cây Sói rừng. Nồng độ IBA tối ưu là 0,5 mg/lIBA cho số rễ trung bình đạt 6,15

rễ/chồi. IBA cũng đã được chứng minh là auxin hiệu quả nhất cho việc giâm

hom đối tượng này (Le Hong En, 2016).

CT1 (ĐC): IBA 0,0 mg/l CT3: IBA 0,5 mg/l

Hình 3.15. Ảnh hưởng của IBA đến kết quả ra rễ chồi Sói rừng

3.4.5. Nghiên cứu đưa cây ra nhà kính

Sau 4 tuần nuôi cấy, các bình chứa cây con in vitro đã ra rễ hoàn chỉnh được đưa

ra cảm ứng với môi trường ngoài 10 - 15 ngày. Sau đó tiến hành rửa sạch môi trường,

xếp gọn gàng trên rổ có lót báo ẩm để tránh cây bị gãy ỏng, mất nước. Ngâm cây

59

khoảng 3 phút trong dung dịch Ridomil (nồng độ 3g/l) để diệt trừ nấm bệnh trên cây, để

ráo nước và cấy vào các bầu chứa giá thể đã chuẩn bị trước theo các công thức. Kết quả

thể hiện ở bảng 3.18.

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống

của cây Sói rừng in vitro sau 8 tuần theo dõi

Biến động chiều Công thức Giá thể Tỷ lệ sống (%) cao TB/cây (cm)

CT1 Đất 100% 75,74 5,72

CT2 Đất + Trấu hun (7:3) 67,38 4,54

½ Đất + ¼ trấu hun+ ¼ CT3 90,74 7,06 xơ dừa

2,4 0,26 LSD0.05

CV% 1,4 0,2

Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng,

nhiệt độ, ẩm độ nên khi chuyển ra đất với các điều kiện hoàn toàn khác hẳn như dinh

dưỡng thấp, ánh sáng cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp nên cây con dễ bị

stress, dễ mất nước và mau bị héo. Vì vậy Thí nghiệm được bố trí trong điều kiện độ

ẩm, sánh sáng, có lưới che giảm nhiệt độ nên nhìn chung các công thức có tỷ lệ sống

khá cao. Tỷ lệ dao động từ 75,74% đến 90,74%.

CT1: Đất CT2: Đất + Trấu hun (7:3) CT3: ½ Đất + ¼ trấu hun+

¼ xơ dừa

Hình 3.16. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sói rừng

60

Trong 3 công thức thí nghiệm, CT3: ½ Đất + ¼ trấu hun+ ¼ xơ dừa thích hợp

hơn cho cây Sói rừng sau giai đoạn in vitro tương ứng tỷ lệ sống 90,74% qua 8 tuần

theo dõi.

Chỉ tiêu về biến động chiều cao TB/cây (cm) là chỉ tiêu khách quan để đánh giá

hiệu quả việc ra ngôi cây Sói rừng và sự phù hợp của giá thể sử dụng. CT3 cũng cho

biến động chiều cao TB/cây đạt cao nhất. Như vậy khi ra ngôi cấy Sói rừng có thể sử

dụng giá thể ½ Đất + ¼ trấu hun+ ¼ xơ dừa sẽ có tỷ lệ sống cao, đồng thời biến động

chiều cao lớn.

Cho đến nay, một số nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng đã được công bố.

Ở Trung Quốc, S. glabra được nhân giống bằng giâm hom. Cây 2 năm tuổi cho

tỷ lệ hom ra rễ đạt 88,7% sử dụng hom nhúng vào dung dịch 200mg/L ABT-1 trong

30 phút (Qiu, 2012; Zhu et al., 2010); 82% khi xử lý với dung dịch 200mg/L IBA

(Liu et al., 2008) .

Zhu et al., (2010) đã nghiên cứu tạo rễ in vitro trên môi trường MS, kết quả

NAA không có tác dụng cải thiện ra rễ. Môi trường tốt nhất cho ra rễ là 1/2MS+IBA

0.2 mg/L+sucrose30 g/L hoặc 1/4 MS+IBA 0.2 mg/L+sucrose 30 g/L.

Zhu et al., (2007) đã thu được mẫu cấy vô trùng bằng cách nhúng mẫu trong

cồn 75% trong 30 giây, sau đó bằng HgCl2 0.1% trong 10 phút. Tiếp đó rửa bằng

nước vô trùng và nhúng vào dung dịch 120 mg/l rifampicin trong 4 ngày; Cuối cùng

mẫu được nhúng vào HgCl2 0.1% và rửa bằng nước vô trùng và cấy vào môi trường

tái sinh chồi.

Le Hong En et al., (2016) đã nghiên cứu nhân giống Sói rừng bằng giâm hom.

Tác giả đã sử dụng IBA, IAA, NAA để nghiên cứu tác dụng của chất kích thích ra rễ.

Nồng độ IBA 1-1,5% cho ra rễ tốt nhất. Hom bánh tẻ cho ra rễ tốt hơn các loại hom

khác. Bùi Văn Trọng và cs (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa

sinh trưởng tới sự hình thành rễ của hom cây Sói rừng (Sarcandra glaba (Thunb.)

Nakai.) tại Lâm Đồng. Nhóm tác giả đã sử dụng NAA ở nồng độ 1% cho kết quả

giâm hom Sói rừng tốt nhất đạt 86.67%, hom sống và ra rễ, số lượng rễ trung bình là

5.08 rễ/hom, chiều dài rễ trung bình là 3,68 cm so với đối chứng (66,67%; 3,9; 3,65

cm, tương ứng).

61

Kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước trên đây cho thấy, môi trường nhân

nhanh chồi cho hệ số nhân chồi, môi trường tạo rễ cho tỷ lệ tạo rễ khác nhau trong

các nghiên cứu đã công bố. Hầu hết, các tác giả nước ngoài không đề cập đến hiện

tượng chồi bị thủy tinh thể khi tái sinh ban đầu trong môi trường có bổ sung BAP.

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng

thích hợp tái sinh chồi. Trong nghiên cứu nhân giống cây Sói rừng chúng tôi thu

được hệ số nhân giống đạt 5,99 lần trong thời gian 4 tuần nuôi cấy. Hiện nay các

nghiên cứu về nhận giống In vitro cây Sói rừng còn hạn chế. Nghiên cứu của chúng

tôi thay thế cho các quy trình nhận giống truyền thống, đáp ứng được yêu cầu về chất

lượng và số lượng cây giống. Từ kết quả các bước nhân giống in vitro, chúng tôi đưa

ra quy trình nhân giống cây Sói rừng như sau:

Bước 1. Chọn vật liệu khởi đầu cho nhân giống

Đoạn thân bánh tẻ của cây mẹ (2 năm tuổi) sinh trưởng khỏe, không biểu hiện

sâu bệnh được thu thập và sử dụng để tái sinh chồi.

Bước 2. Khử trùng mẫu và tái sinh chồi

Chồi đỉnh của cây được thu thập từ vườn mẫu được rửa nhiều lần dưới vòi

nước. Sau đó ngâm trong nước xà phòng loãng 10 phút và rửa loại bỏ xà phòng. Mẫu

được khử trùng bằng cồn 70o trong 1 phút và rửa bằng nước cất vô trùng để loại bỏ

cồn. Sau đó, mẫu tiếp tục được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút,

và rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần để loại bỏ HgCl2. Đoạn thân được cắt bằng dao,

panh cấy vô trùng và nuôi cấy trong bình nuôi cấy chứa môi trường tái sinh chồi MS

+ sucrose (30 g/l) + agar (10 g/l).

Bước 3. Giai đoạn nhân nhanh chồi

Chồi dài trên 0,5 cm từ môi trường tái sinh sau 4 tuần nuôi cấy được chuyển

sang môi trường nhân nhanh chồi MS + sucrose (30 g/l) + agar (6 g/l) + BAP (1,5

mg/l) + kinetin (0,6 mg/l) + IBA (0,2 mg/l).

Bước 4. Tạo rễ và tái sinh cây hoàn chỉnh từ chồi.

Sau 4 tuần nuôi cấy, chồi dài trên 1,5 cm có trên 3 lá được cấy chuyển sang môi

trường tạo rễ MS/2 + sucrose (15 g/l) + agar (6 g/l) + IBA (0,5 mg/l) + 0,1 g/l Than

hoạt tính.

62

Bước 5. Chuyển cây ra nhà kính

Bình nuôi có cây hoàn chỉnh (hơn 3 rễ, 3 lá) được đưa ra cảm ứng với môi

trường ngoài 10 – 15 ngày. Sau đó rửa loại bỏ môi trường nuôi cấy và cấy cây vào

bầu đất chưa giá thể: 1/2Đất + ¼ Trấu hun + ¼ Xơ dưa.

Hình ảnh mô tả các bước nhân giống cây Sói rừng từ đoạn thân bánh tẻ được

thể hiện ở hình 3.17.

B A

C D

Hình 3.17. Hình ảnh mô tả các bước nhận giống in vitro từ cây Sói rừng

A: Chồi Sói rừng tái sinh trong môi trường tái sinh.

B: Nhân nhanh chồi Sói rừng trong môi trường nhân nhanh.

C: Tạo rễ cây hoàn chỉnh trong môi trường ra rễ.

D: Cây Sói rừng ra ngôi trong bầu chưa giá thể : 1/2Đất + ¼ Trấu hun + ¼ Xơ

dừa ở nhà lưới.

63

Giá thành cây giống được tạo ra từ quy trình nhân giống in vitro sẽ cao hơn cây

giống được tạo ra từ các biện pháp truyền thống (giâm hom, gieo hạt), tuy nhiên sự

dụng quy trình nhận giống in vitro đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn vì có thể sản

xuất cây giống với số lượng lớn, đống nhất, mang các đặc tính tốt, đảm bảo chất

lượng cây giống.

64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1.Kết luận

- Điều tra thu thập được 15 mẫu Sói rừng thuộc 5 huyện: Xín Mần, Mèo vạc,

Quản bạ, Hoàng Su Phì và Vị Xuyên của tỉnh Hà Giang.

- Đánh giá sơ bộ về đặc điểm hình thái 15 mẫu thu thập được là cây Sói rừng:

Chỉ tiêu theo dõi về hình thái

Thân Lá Hoa Quả

Bông kép, ít Lá mặt trên xanh nhánh, nhánh Quả nhỏ, hình Các mẫu thẫm, mặt dưới Thân phân nhánh, ngắn hơi tròn, chưa thu thập xanh nhạt, mép có màu lục, thân với hoa nhỏ màu chín có màu lá có răng cưa, hình trụ trắng không có xanh, quả chín phiến lá hình bầu cuống và có có màu đỏ gạch. dục một nhị

Hình ảnh

- Đã giải trình tự và xác định được 15 đoạn trình tự của 15 mẫu lá Sói rừng

được thu thập từ 15 xã của 05 huyện thuộc tỉnh Hà Giang có hệ số tương đồng về

trình tự nucleotide với mẫu tham chiếu Chloranthus erectus dao động từ 59,21%

(mẫu SR11 và Chloranthus erectus) đến 90,82% (mẫu SR2, SR3 và Chloranthus

erectus). 15 mẫu Sói rừng có hệ số tương đồng về trình tự nucleotide với mẫu tham

65

chiếu Sarcandra glabra dao động từ 66,17% (mẫu SR10 và Sarcandra glabra) đến

99,46% (mẫu SR8; SR9 và Sarcandra glabra).

- Quy trình nhân giống cây Sói rừng bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào từ

đoạn thân bánh tẻ của cây 2 năm tuổi đã được thiết lập. Khử trùng mẫu trong dung

dịch HgCl2 (0,1%) trong 5 phút, tỷ lệ mẫu mẫu sống không nhiễm đạt 62,2%. Tái

sinh chồi trong mồi trường MS không chứa chất điều hòa sinh trưởng. Nhân nhanh

chồi trong môi trường MS + BA (1,5 mg/l) + kinetin (0,6 mg/l) + IBA (0,2 mg/l) +

sucrose (30 g/l). Hệ số nhân chồi đạt 5,99 lần sau 4 tuần nuôi cấy. Tái sinh rễ cây

hoàn chỉnh trong môi trường MS/2 + IBA (0,5 mg/l) + than hoạt tính (0,1 g/l) +

sucrose (15 g/l). Tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 100% sau 4 tuần nuôi cấy. Cây hoàn chỉnh

được trồng trong bầu chứa ½ Đất + ¼ trấu hun+ ¼ xơ dừa. Tỷ lệ cây sống đạt

90,74%, biến động chiều cao đạt 7,06 cm sau 8 tuần nuôi trồng.

2. Kiến nghị

Đề nghị nghiên cứu đồng thời ảnh hưởng của nhiều yếu tố đến hiệu quả thí

nghiệm trong quy trình nhận giống

Đề nghị Quy trình nhân giống cây Sói rừng bằng công nghệ nuôi cấy mô tế

bào đã xây dựng có thể áp dụng để nhân nhanh, sản xuất cây giống chất lượng cao

phục vụ sản xuất.

66

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Quỳnh Anh (2013), “Nghiên cứu ứng dụng cây Sói rừng (Sarcandra

GlaBra (Thunb) Nakai) ở Cao Bằng để hỗ trợ điều trị một số bệnh ung thư”,

Khoa học và công nghệ Cao Bằng.

2. Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (2013), Đề án quy hoạch phát triển cây

dược liệu toàn quốc đến năm 2020, tầm nhìn 2030.

3. Đỗ Huy Bích (2011), Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập III, NXB

Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.

4. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam (Bộ mới), tập II, NXB Y học,

Hà Nội

5. Võ Văn Chi (1996), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội.

6. Vũ Văn Dũng, Nguyễn Ngọc Chính (1994), Báo cáo các nhóm cây Lâm sản

ngoài gỗ của miền Bắc Việt Nam, Tài liệu Viện Điều tra Quy hoạch rừng.

7. Nguyễn Quang Hưng (2008). Nghiên cứu đánh giá thực trạng gây trồng một số

loài cây Lâm sản ngoài gỗ chủ yếu ở vùng núi phía bắc làm cơ sở đề xuất các

giải pháp phát triển bền vững, luận văn Thạc sĩ, ĐH Lâm nghiệp 2008.

8. Phạm Hoàng Hộ (2006), Cây có vị thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ.

9. Mai Hoàng Oanh (2016), Nghiên cứu đặc điểm hình thái và xác định một số

trình tự gen phân bố cây Sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai), Luận văn

Thạc sỹ Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Khoa học.

10. Bùi Văn Trọng, Nguyễn Cao Xuân Viên, Nguyễn Thanh Nguyên (2014), “Ảnh

hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng tới sự hình thành rễ của hom cây sói

rừng ( Sarcandra Glaban (Thunb.) Nakai.) tại Lâm Đồng ”, Tạp chí Viện dược

liệu Hà Nội, tập 19, số 6/2014, tr. 75-81.

11. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Phạm Kim Ngọc, Trần Văn Minh,

Nguyễn Thị Phương Thảo (2009), Cơ sở công nghệ sinh học – tập ba công nghệ

sinh học tế bào, NXB Giáo dục Việt Nam .

67

12. Lê Duy Thành, Tạ Toàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2005), Di truyền học,

NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.

13. Phạm Hồng Sơn (2006), Giáo trình kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử , Nhà

xuất bản Đại học Huế, Huế.

14. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2009), Công nghệ sinh học tập

2-Công nghệ sinh học tế bào, Nxb Giáo dục.

15. Mai Thị Hải Yến (2010), Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh

học của cây Sói rừng, Luận văn thạc sỹ dược học, Học viện quân y.

Tiếng anh

16. Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W. (2003),

“Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of

basal angiosperms”, J. Evol. Biol, (6), pp. 558-576.

17. Chase M. W., Nicolas S., Mike W., James M. D., Rao P. K., Nadia H., and

Vincent S. (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term

goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp. 1889-1895

18. Collons, G.G. and Symons, R.H. (1992), Plant Mol.Biol.Rep.,10,233.

19. De Klerk G.J., Der Krieken W.V., De Jong J.C. (1999), “Review the formation

of adventitious roots: New concepts, new possibilities”, In Vitro Cellular &

Developmental Biology - Plant, 35, pp. 189-199.

20. FAO (2000): Non-wood News.Rome, 2000.

21. Harvey M., Botha F.C., (1996), “Use of PCR-based methodologies for the

determination of DNA diversity between Saccharum varieties”, Euphytica, (89),

pp. 257-265.

22. Kang M., Tang AZ., Liang G., Yi X., Liu J. (2008), “Study on the apoptosis of

nasopharyngeal carcinoma cell line administrated with Sarcandra glabra

extracts in vivo and its mechanism”, Zhong Yao Cai. Vol.31 (10), pp. 1529-1533.

23. Kress W. J., Erickson D. L. (2008), “DNA barcodes: Genes, genomics, and

bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp. 2761-2762.

68

24. Liu RL, Zhu Y, Si J., Gao Y (2008), “Study on cutting and propagational

technology of Sarcandra glabra”, Anhui Agricultural Science Bulletin, 18, pp. 129-

130.

25. Roman B., Alfaro C., Torres A. M., Moreno M. T., Satovic Z., Pujadas A.,

Rubiales D. (2003), “Genetic relationships among Orabache species as revealed

by RAPD analysis”, Annals of Botany, (91), pp. 637-642.

26. Shaw J., Lickey E.B., Schilling E. E., Small R.L. (2007),” Comparison of whole

chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic

studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III. Amer. J. Bot, (94), pp.

275-288.

27. Qiu CS., (2012), “Test on cutting propagation of Sarcandra glabra (Thunb.)

Nakai”, Anhui Agricultural Science Bulletin, 19, pp. 44-45.

28. Van B.C., Higgins W. E., Dressler R. L., Whitten W. M., Soto Arenas M. A.,

Culham A., Chase M. W. (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae

(Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers

(ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana (15), pp.96114.

29. Zhu S. Y., Zhang H. Y., Yang Z. H., Zhang M. Y., (2010), “Study on rooting

culture of Sarcardra glabra (Thunb.) Nakai tube plantlet”, Medicinal Plant,

1(8), pp. 22-25.

30. Zhu S., Liu T., Fang Z., Xia K., Zeng S., Silva J. A. T., Zhang M., (2011), “

Micropropagation and pharmacological analysis of a medicinal Herb

Sarcandraglabra”, Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnology,

5(1), pp. 16-19.

31. Zhu Shu-ying, Lu Song-gui, Liang Cheng-ye, Zeng Song-jun, Chen Zhi-lin,

Zhang Ming-yong (2007), “A protocol for explant sterilization of Sarcandra

glabra in tissue culture”, Journal of Fujian Forestry Science and Technology,

2007-04.

32. Tài liệu trang Web: https://duocdienvietnam.com/download-duoc-dien-viet-nam-

v/

Phụ lục

Phụ lục 1: Kết quả so sánh trình tự nucleotit của 15 mẫu Sói rừng với mẫu tham

chiếu MH270480.1 Chloranthus erectus và KP317601.1 Sarcandra glabra

Phụ lục 2: Thành phần môi trường MS

THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG MS

Nồng độ Dung dịch mẹ Nồng độ trong dung dịch mẹ (g/200 ml) (mg/l) Dung tích dùng cho 1 lít môi trường

1900 170 19 1,7 {20 ml 1650 (x10) 16,5

370 3,7 MS1: KNO3 KH2PO4 NH4NO3 MgSO4

(x 20) { 6,64 {10 ml 440 MS2: CaCl2.2H2O

6,2 0,124

22,3 0,338

0,025 0,5 mg

0,025 (x20) 0,5 mg {10 ml

8,6 0,213

0,25 5 mg MS3 : H3BO3 MnSO4.4H2O CoCl2.6H2O CuSO4.7H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O

KI 0,83 16,6 mg

MS4: FeSO4 27,8 0,556 {10 ml Na2EDTA 37,3 (x20) 0,746

MS5: Myo-Inositol 100 2

Thiamine.HCl 0,1 2 mg

Pyridoxine.HCl 0,5 (x20) {10 ml 10 mg

Acid nicotic 0,5 10 mg

Glycine 2 40 mg

Phụ lục 3: Chăm sóc cây giai đoạn sau in vitro

Che giảm ánh sáng

Sử dụng lưới đen loại 3kg/100m2 . Vào vụ hè che 2 lớp lưới đen, giảm 50%

cường độ ánh sáng trong suốt thời kỳ ra ngôi, đảm bảo cường độ ánh sáng khoảng

10.000 – 12.000lux.

Cách che: Căng lưới đen cách mặt luống 1,5-2m.

Tưới nước

Trong 2 tuần đầu tiên cây còn nhỏ yếu nên tưới nước giữ ẩm cho cây bằng vòi

phun sương tự động hoặc dùng bình phun tay. Hàng ngày phun đều cho ẩm toàn bộ

cây và giá thể vào buổi sáng và chiều mát. Khi cây đã khỏe và phát triển tốt thì có

thể dùng ô doa để tưới nước cho cây, 2-3 ngày tưới 1 lần duy trì độ ẩm 60- 65%.

Tưới nước vào sáng sớm hoặc chiều mát.

Bón phân

Khi cây bén rễ hồi xanh (sau 2 tuần) sử dụng phân bón lá Đầu trâu 502 (N:P:K

= 30:12:10) cho cây với liều lượng 10ml/bình 8 lít nước, 7 ngày phun một lần để bổ

sung dinh dưỡng cho cây, giúp cây sinh trưởng phát triển tốt.

Phòng trừ sâu bệnh

Bệnh thối nũn phổ biến ở Sừng in vitro giai đoạn cây còn nhỏ, sử dụng

Ridomil liều lượng 200g/100 lít nước hoặc Daconil với liều lượng 250g/100 lít nước,

định kỳ 7 ngày phun 1 lần.

Nhện, sử dụng Pegasus 500EC liều lượng 8- 10ml/bình 8lít hoặc Ortus 5SC

liều lượng 10ml/bình 8lít. Phun thuốc vào chiều mát.

Ngoài ra có thể sử dụng một số loại thuốc BVTV khác theo hướng dẫn của ngành

Bảo vệ Thực vật.

Tiêu chuẩn cây xuất vườn

a) Sói rừng 2 tháng tuổi

b) Sói rừng 3 tháng tuổi

c) Sói rừng đủ điều kiện xuất vườn

Hình 3.17. Sói rừng giai đoạn sau in vitro

Sau ra ngôi khoảng 4 tháng cây Sói rừng đạt tiêu chuẩn: tươi khỏe, xanh tốt,

không dị dạng, sạch bệnh, có chiều cao cây từ 10 -15 cm; 4 - 6 lá và có ≥ 6 rễ/cây,

dài rễ 2 - 4 cm thì có thể trồng ra ruộng sản xuất.

Phụ lục 4: Phiếu điều tra phòng vấn cán bộ chủ chốt và hộ gia đình

PHIẾU THU THẬP THÔNG TIN LIÊN QUAN ĐẾN LOÀI SÓI RỪNG

PHỎNG VẤN CÁN BỘ CHỦ CHỐT

PHẦN A: THÔNG TIN CHUNG NGƯỜI ĐƯỢC PHỎNG VẤN

Tên người được phỏng vấn:…………………………………. - Tuổi:…………………

- Chức vụ/Lĩnh vực phụ trách: …………………………………………

- Đơn vị công tác: ……………………………………………………

- Dân tộc:…………………………………………. …………………

- Trình độ………………………………………….…………………

- Số điện thoại liên hệ: …………………………………………………

Ngày phỏng vấn: …….. /……/……….

Người phỏng vấn:…………………………………………

PHẦN B: THÔNG TIN VỀ LOÀI SÓI RỪNG

1. Ông/bà cho biết về hiện trạng gây trồng Sói rừng ở địa phương?

Khu vực phân bố Diện tích Năng suất Phương thức trồng/tự nhiên

Ý kiến khác:….……………………………………………………………………… ………………………………………………………………………….....................

Mức độ phong phú Nơi có thể thu thập mẫu Đặc điểm khu rừng (nhiều/ít)

2. Ông/bà cho biết việc phát triển, gây trồng loài Sói rừng ở địa phương được thực hiện từ hình thức nào? (tự gây trồng, dự án cung cấp, doanh nghiệp đầu tư,…):

………………………………………………………………………………………...

……………………………………………………………………………………......

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………..

………………………………………………………………………………………...

3. Nguồn giống Sói rừng gây trồng được lấy từ chủ yếu từ những nguồn nào?:

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………..

………………………………………………………………………………………...

4. Ông/bà cho biết các thông tin về các biện pháp kỹ thuật được áp dụng gây trồng hiện nay tại địa phương?

- Về mật độ trồng: ……………………………………………………………………..

………………………………………………………………………………………...

-Về thời vụ trồng: ……………………………………………………………………..

………………………………………………………………………………………...

- Về phương thức xử lý thực bì: ………………………………………………………

………………………………………………………………………………………...

- Về kỹ thuật trồng cây: ………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………...

- Về kỹ thuật chăm sóc, quản lý bảo vệ: ………………………………………………

………………………………………………………………………………………...

- Về kỹ thuật khai thác, thu hái: ……………………………………………………….

………………………………………………………………………………………...

5. Ông/bà cho biết thông tin về các chính sách phát triển loài cây Sói rừng tại địa phương?

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

6.Ông/bà cho biết những thông tin về thuận lợi và khó khăn trong việc phát triển loài Sói rừng tại địa phương?

TT Các nhân tố Thuận lợi khó khăn

1 Điều kiện sinh thái (Đất đai, khí hậu)

2 Kỹ thuật nhân giống/ nguồn giống

3 Kỹ thuật trồng, chăm sóc, thu hoạch

4 Sơ chế, bảo quản

5 Thị trường/giá cả

Khác

6

7. Ông/bà cho biết các thông tin về nhu cầu thị trường sản phẩm của loài Sói rừng hiện nay tại địa phương?

- Giá cả các trên thị trường?

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………..

………………………………………………………………………………………...

- Dạng sản phẩm tiêu thụ trên thị trường?

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

- Sản lượng tiêu thụ/năm?

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

- Đối tượng tiêu thụ chủ yếu?

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

- Hình thức tiêu thụ sản phẩm?

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

8. Ông/bà cho biết giống loài Sói rừng hiện nay tại địa phương được lấy từ chủ yếu từ những nguồn nào?:

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

9. Ông/bà cho biết các thông tin về các phương thức trồng loài Sói rừng đang được áp dụng hiện nay tại địa phương?

………………………………………………………………………………………..

………………………………………………………………………………………..

10. Ông/bà cho biết các loại hình cây giống Sói rừng hiện nay được đưa vào gây trồng tại địa phương?

+ Cây nhân giống từ gieo hạt

+ Cây nhân giống từ giâm hom

+ Cây nhân giống từ nuôi cấy mô

+ Cả 03 loại hình trên

11. Ông/bà cho biết thông tin về cơ sở sản xuất cây giống Sói rừng (nếu có) hiện nay tại địa phương?

- Quy mô, diện tích:……………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………...

- Công suất sản xuất:…………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………...

- Hình thức vườn ươm:………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………….....

- Loài cây sản xuất chủ yếu:…………………………………………………………

………………………………………………………………………………………...

- Loại hình cây giống sản xuất (cây hạt, cây hom, cây mô):…………………………

………………………………………………………………………………………...

- Hình thức cung ứng giống:………………………………………………………….

………………………………………………………………………………………...

……………………………………………………………………………………......

12. Ông/bà cho biết một số thông tin về tiềm năng phát triển Sói rừng tại địa phương?

- Những chính sách/quy hoạch phát triển Sói rừng:

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

- Về nhu cầu sử dụng Sói rừng tại địa phương?

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

- Về nguồn vốn đầu tư cho phát triển Sói rừng?

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

- Về thị trường tiêu thụ sản phẩm cây Sói rừng? (thời điểm thu mua, số lượng, giá cả)

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………..

- Về khoa học và công nghệ cho phát triển Sói rừng ?

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

11. Ông/bà cho biết nhu cầu sử dụng các sản phẩm từ cây Sói rừng tại địa phương?

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

13. Ông/bà cho biết thông tin về nhu cầu loại hình cây giống Sói rừng (hom, mô) được sử dụng để phục vụ gây trồng hiện nay tại địa phương?

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

14. Ông/bà có nhận định gì về khả năng phát triển loài Sói rừng trong tương lai (về diện tích gây trồng, loại hình giống, đối tượng có nhu cầu…)?

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

15. Đề xuất của Ông/bà để phát triển loài Sói rừng bền vững trong giai đoạn tới?

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

Xin trân trọng cảm ơn!

Người phỏng vấn

(Ký, ghi rõ họ tên)

PHIẾU THU THẬP THÔNG TIN LIÊN QUAN ĐẾN LOÀI SÓI RỪNG

Phỏng vấn người dân

PHẦN A: THÔNG TIN CHUNG NGƯỜI ĐƯỢC PHỎNG VẤN

Tên người được phỏng vấn:…………………………………. - Tuổi:…………………

- Dân tộc:………………………………………….…………………….…………

- Trình độ………………………………………….…………………….…………

- Địa chỉ: ………………………………………….…………………….…………

- Số điện thoại liên hệ: ………………………………………………… ….……

Ngày phỏng vấn: …….. /……/……….

Người phỏng vấn:…………………………………………

PHẦN II: THÔNG TIN VỀ SÓI RỪNG

STT Câu hỏi Trả lời

Ghi chú [__] 1. Có [__] 2. Không 1 Ông/bà (hay gia đình ông/bà) có biết về cây Sói rừng dùng làm dược liệu không?

2 Ông/bà có thể cho biết Sói rừng

thường được dùng để làm gì?

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9 10. 11. 12 13. 14. 15.

[__] 1. Tự nhiên [__] 2. Gây trồng

4

3 Ông/bà thường thu hái cây Sói rừng từ những nguồn nào? Lưu ý: Đánh dấu vào nhiều phương án và ghi chú nguồn nào là chủ yếu? Theo ý kiến của ông/bà, các loài Sói rừng thu hái từ địa phương so với 5 năm/10 năm trước đây biến động như thế nào?

5

[__] 1. Giảm rất nhiều [__] 2. Giảm nhiều [__] 3. Giảm không đáng kể [__] 4. Không giảm [__] 5. Tăng lên Tại sao? 1. ………………………………………… 2. ………………………………………… 3……………………………………………. 4……………………………………………. 5…………………………………………… 6……………………………………………… 7. …………………………………………… 8. …………………………………………… 9. …………………………………………… 10. …………………………………………… 11. …………………………………………… 12. ……………………………………………

Theo ông/bà, ở địa phương mình những khu vực nào còn nhiều cây Sói rừng Lưu ý: Điều tra viên đề nghị người trả lời cho biết rõ tên cụ thể các khu vực

6 Ông/bà có thể cho biết mục đích chủ yếu của gia đình mình trong việc thu hái/gây trồng cây Sói rừng ?

7 Ông/bà cho biết một số thông tin về các loại sản phẩm cây Sói rừng chủ yếu bán ra thị trường?

8 Ông/bà cho biết Sói rừng chủ yếu được trồng theo hình thức/phương thức trồng nào? [__] 1. Để chữa bệnh [__] 2. Để bán cho thầy lang [__] 3. Để bán cho tư thương [__] 4. Cả 3 mục đích trên [__] 5. Không ý kiến 1. Từ sản phẩm tươi 2. Từ sản phẩm khô 3. Sản phẩm đã qua chế biến 4. Sản phẩm khác 1. Mọc tự nhiên 2. Trồng thuần loài 3. Trồng ở vườn nhà

9 Ông bà thường thu hái cây Sói rừng

vào lúc nào?

10 Ông/bà cho biết các kỹ thuật trồng Sói rừng đang được áp dụng ở địa phương?

11 Ông/bà cho biết kỹ thuật/kinh

nghiệm chăm sóc cây Sói rừng ? (Có bón phân không? Phân gì?...)

12 Ông/bà nghĩ như thế nào về nhu cầu sử dụng Sói rừng ở địa phương sau 5/10 năm nữa?

13 Để có thể khuyến khích người dân

tham gia phát triển cây Sói rừng tại địa phương, theo ông/bà thì cần phải làm thế nào?

14 Ông/bà cho biết thị trường tiêu thụ các cây Sói rừng ở địa phương? Bán ở đâu? bán cho ai? giá cả như thế nào?

4. Trồng dưới tán 5. Trồng xen với cây nông nghiệp 1.Mùa hạ a.sáng 2.Mùa xuân b. trưa 3.Mùa thu c. chiều 4.Mùa đông d. tối 4.Quanh năm e. Lúc nào cũng được 1. Trồng không bón phân 2. Trồng thâm canh 3. …………………………………………….. 4. …………………………………………….. 5. …………………………………………….. ……………………………………………….. ……………………………………………….. ……………………………………………….. ……………………………………………….. [__] 1. Tăng lên [__] 2. Giảm xuống [__] 3. Không thay đổi [__] 4. Không ý kiến ……………………………………………….. ……………………………………………….. ……………………………………………….. ……………………………………………….. ……………………………………………….. ……………………………………………….. ……………………………………………….. ……………………………………………….. ……………………………………………….

15. Ông/bà có thể cho biết thêm một số thông tin về loài cây Sói rừng ?

Nơi phân bố chính và Đặc điểm hình thái Công dụng thời gian thu hái

16. Ông/bà có thể cho biết thêm về các kiến thức, kinh nghiệm của ông/bà trong việc

khai thác, chế biến, gây trồng, nhân giống Sói rừng ?

Lượng thu Giá bán Những kiến thức, kinh nghiệm DT trồng hoạch

16. Ông/bà cho biết các thông tin về các biện pháp kỹ thuật được áp dụng gây trồng hiện nay tại địa phương?

- Về mật độ trồng: ……………………………………………………………………..

………………………………………………………………………………………...

-Về thời vụ trồng: ……………………………………………………………………...

………………………………………………………………………………………...

- Về phương thức xử lý thực bì: ………………………………………………………

………………………………………………………………………………………...

- Về kỹ thuật trồng cây: ………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………...

- Về kỹ thuật chăm sóc, quản lý bảo vệ: ………………………………………………

………………………………………………………………………………………...

- Về kỹ thuật khai thác, thu hái: ……………………………………………………….

………………………………………………………………………………………...

17. Ông/bà cho biết những thông tin về thuận lợi và khó khăn trong việc phát triển loài Sói rừng tại địa phương?

1 Điều kiện sinh thái (Đất đai, khí hậu)

2 Kỹ thuật nhân giống/ nguồn giống

3 Kỹ thuật trồng, chăm sóc, thu hoạch

4 Sơ chế, bảo quản

5 Thị trường/giá cả

18. Ông/bà cho biết nhu cầu sử dụng giống Sói rừng để gây trồng?:

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

19. Đề xuất của Ông/bà để phát triển loài Sói rừng bền vững trong giai đoạn tới?

- Diện tích hộ muốn trồng (m2):………………………………………………………

- Cung cấp giống...........................................................................................................

- Hướng dẫn kỹ thuật trồng............................................................................................

- Thu mua sản phẩm........................................................................................................

- Các đề xuất khác:

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

Xin trân trọng cảm ơn!