Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ TRANG NGHIÊN CỨ U NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY THỔ NHÂN SÂM (Talinum crassifolium Willd)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ TRANG NGHIÊN CỨ U NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY THỔ NHÂN SÂM (Talinum crassifolium Willd)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ TÂM

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2016

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiê ̣n dướ i sự hướ ng dẫn củ a PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung

thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Trang

ii

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS

Nguyễn Thị Tâm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên đã

tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và

hoàn thành luận văn này.

Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo và các anh chi ̣ kỹ thuật viên tại phòng thí

nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học trường đại học Sư Phạm

Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn thạc sĩ.

Trong thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ tại phòng thí nghiệm Công

nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm Nghiệp - Đại học Nông

Lâm Thái Nguyên, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện, các

kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ

hướng dẫn tôi làm các thí nghiệm của luận văn thạc sĩ.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa học -

Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Khoa ho ̣c sự số ng và các thầy cô

giáo, cán bộ trong Khoa, đặc biệt là sự quan tâm, giúp đỡ của các anh chị kỹ

thuâ ̣t viên phòng thí nghiệm khoa Khoa ho ̣c sự số ng.

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khuyến

khích, động viên tạo động lực để tôi hoàn thành luận văn này.

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi

mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có

thể làm tốt hơn.

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Nguyễn Thị Trang

iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan ...................................................................................................... i

Lời cảm ơn ........................................................................................................ ii

Mục lục ............................................................................................................. iii

Danh mục các từ và chữ viết tắt ........................................................................ v

Danh mục bảng................................................................................................. vi

Danh mục hình ................................................................................................ vii

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ...................................................... 3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4

1.1. Giới thiệu về cây Thổ nhân sâm ................................................................ 4

1.1.1. Đặc điểm phân loại và hình thái cây Thổ nhân sâm ............................ 4

1.1.2. Đặc điểm phân bố cây Thổ nhân sâm .................................................. 5

1.1.3. Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Thổ nhân sâm ................................ 5

1.1.4. Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của cây Thổ nhân sâm ........ 6

1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................... 8

1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................ 9

1.2.2. Vai trò của một số chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy

mô tế bào thực vật ....................................................................................... 11

1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro ....................... 15

1.3.1. Giai đoạn I - Cấy gây ......................................................................... 15

1.3.2. Giai đoạn II - Nhân nhanh ................................................................. 15

1.3.3. Giai đoạn III - Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất ..................................... 16

1.4. Một số thành tựu nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi

cấy mô tế bào thực vật..................................................................................... 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

iv

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 21 2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu ..................................... 21 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................ 21 2.1.2. Hoá chất, thiết bị ................................................................................ 21 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................................... 21 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 21 2.2.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy ........................................................... 21 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro ........................................................... 22 2.2.3. Đưa cây ra môi trường tự nhiên ......................................................... 24 2.3. Điều kiện thí nghiệm ................................................................................ 26 2.4. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 26 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 27 3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng hạt ............................................................ 27

3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng ............................................................ 27 3.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch javel 60% đến hiệu quả khử trùng .............................................. 28

3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm trong ống nghiệm ..................................................................................... 31

3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm ..................................................................... 31 3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp kinetin đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm ........................................... 34 3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA tới khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm ................................................................. 36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ chồi cây Thổ nhân sâm ............................................................................................ 38 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm ............................. 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 43

v

DNA : Deoxyribonucleic acid

PHỤ LỤC ....................................................................................................... 47 DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

BAP : 6 - benzyl amino purine

CT : Công thức

CS : Cộng sự

ĐC : Đối chứng

IAA 3 - indol acetic acid :

IBA 3 - indol butyric acid :

Kinetin 6 - furfuryl- aminopurine :

MS : Murashighe và Skoog, 1962

NAA α - naphthalene acetic acid :

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2,4 - D 2,4 - dichlorophenoxy acetic acid :

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm bằng HgCl2 0,1% .............. 28

Bảng 3.2. Kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm bằng javen 60% ................ 29

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân chồi Thổ

nhân sâm ....................................................................................... 32

Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết

hợp kinetin đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm .................... 34

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến khả

năng nhân nhanh chồi Thổ nhân sâm .......................................... 36

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của của IBA đến khả năng ra rễ chồi Thổ nhân sâm ........ 38

Bảng 3.7. Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm ..................... 40

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây Thổ nhân sâm ngoài tự nhiên ................................................. 4

Hình 3.1: Kết quả khử trùng hạt bằng HgCl2 0,1% và dung dịch javel 60% ......... 30

Hình 3.2: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân nhanh

chồi Thổ nhân sâm ....................................................................... 33

Hình 3.3: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp kinetin đến khả

năng nhân nhanh chồi Thổ nhân sâm ........................................... 36

Hình 3.4: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến khả

năng nhân chồi cây Thổ nhân sâm ............................................... 37

Hình 3.5: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Thổ nhân sâm ... 39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.6: Cây con trồng trong các giá thể khác nhau sau 30 ngày ............... 41

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Theo lịch sử y học cổ truyền của Trung Quốc từ 3000 năm trước Công

nguyên, nhân sâm đã được nói đến như là một thần dược trong “Thần nông

bản thảo” của vua Thần Nông.

Sâm là tên gọi khái quát chỉ một số loại cây thân thảo mà củ và rễ được

sử dụng làm thuốc từ rất lâu đời tại nhiều nước châu Á, thuộc nhiều chi họ

khác nhau nhưng chủ yếu là các loại thuộc chi Sâm [2].

Cây nhân sâm có tên khoa học là Panax Gingseng C.A Mey. Củ sâm

có rất nhiều hình dạng, tư thế giống con người, do đó được gọi là nhân sâm.

Nhân sâm thuộc họ Araliaceae là một loại dược phẩm quý hiếm có ở nhiều

nơi như: Nhật Bản, Trung Quốc, Hoa Kỳ và đặc biệt ở Hàn Quốc. Dân Hàn

Quốc coi nhân sâm là tặng phẩm của trời đất. Đông y coi nhân sâm là vị

thuốc đứng đầu các vị thuốc theo thứ tự: Sâm, Nhung, Quế, Phụ. Có rất

nhiều loại sâm, để phân biệt thường người ta gọi thêm tên địa phương hoặc

màu sắc vào tên gọi [2].

Ở Việt Nam có các giống sâm như: Sâm Ngọc Linh, Sâm Bố Chính,

Đảng Sâm, Tây Dương Sâm [2].

Thổ nhân sâm (Talinum crassifolium Willd) còn được gọi là Thổ cao ly

sâm hay Đông dương sâm, sâm thảo, thuộc họ rau sam - Portulacaceae [2].

Thổ nhân sâm gồm nhiều thành phần hóa học khác nhau, trong đó có saponin

tetracyclic nhóm Damavan gọi chung là gingsenosid. Ngoài ra, còn có

saponin với aglicon là acid oleanolic, các vitamin B1, vitamin B2,

phytosterol, tinh dầu, đường, tinh bột. Thổ nhân sâm có tác dụng bổ dưỡng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

toàn thân, suy nhược thần kinh, cơ thể hao tổn, tăng sức lực cho người già,

2

người mới ốm dậy, kém ăn mất ngủ, hay quên. Theo một số nghiên cứu, do

nhân sâm chứa nhiều chất chống oxy hóa nên có thể phòng ngừa một số bệnh

như: Ung thư, bệnh tim mạch, thần kinh, chống căng thẳng, tăng sức đề kháng

chống lại nhiễm trùng. Tác dụng của nhân sâm rất tốt nhưng phải biết dùng

phù hợp với từng đối tượng và theo liều lượng khuyến cáo. Đông y coi Thổ

nhân sâm là nhân sâm của người nghèo vì nó chứa nhiều công dụng giống

nhân sâm mà giá thành rẻ và sẵn có trong tự nhiên [2].

Hiện nay, với những kinh nghiệm sử dụng dược liệu của người dân và

việc khai phá rừng một cách ồ ạt đã làm cho nguồn tài nguyên thực vật suy

giảm nghiêm trọng trong đó có những cây thuốc quý hiếm.

Chính vì vai trò quan trọng của cây Thổ nhân sâm nên việc nhân giống

chúng là rất cần thiết. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa

chọn đề tài: “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Thổ nhân sâm” (Talinum

crassifolium Willd).

2. Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được môi trường thích hợp cho nhân giống cây Thổ nhân sâm

trong ống nghiệm.

3. Nội dung nghiên cứu

3.1. Nghiên cứu khử trùng hạt tạo mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm.

3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng

đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm trong

ống nghiệm.

3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ chồi Thổ nhân

sâm trong ống nghiệm.

3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và

phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu xác định được môi trường thích hợp cho nhân

giống cây Thổ nhân sâm bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh

giá được tác động của các chất kích thích sinh trưởng, thành phần môi trường

nuôi cấy và thời gian khử trùng mẫu cấy, bổ sung thêm dữ liệu cho việc

nghiên cứu các loại cây dược liệu khác.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu đảm bảo cung cấp được số lượng lớn cây giống có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chất lượng cao, đồng đều cho sản xuất không phụ thuộc vào mùa vụ.

4

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây Thổ nhân sâm

1.1.1. Đặc điểm phân loại và hình thái cây Thổ nhân sâm

Thổ nhân sâm có tên khoa học là: Talinum crassifolium Willd (Talinum

patens L., Talinum panicuiatum Gaertn). Ngoài ra, cây Thổ nhân sâm còn một số

tên gọi khác: Sâm cao ly, Thổ sâm cao ly, Giả nhân sâm, Sâm thảo, Sâm đất [31].

Thổ nhân sâm thuộc giới thực vật (Plantae), ngành Ngọc Lan

(Magnoliophyta), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), bộ Cẩm Chướng (Caryophyllales),

họ Rau Sam (Portulacaceae), chi Sâm mùng tơi (Talinum) [34].

Thổ nhân sâm là cây thân thảo, sống hằng năm, cao 30-50 cm, thân

hình trụ nhẵn, phân cành ngay từ gốc [8].

Lá mọc so le, dày gần như không có cuống hoặc cuống rất ngắn, hình

bầu dục hoặc hình trứng, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, gân lá mờ, hai mặt

nhẵn gần như cùng màu, phiến lá dày, lá dài 5 - 7cm, rộng 2,5 - 3,5cm [8].

Cụm hoa là một chùy kép mọc ở đầu cành, gồm nhiều hoa nhỏ

đường kính ước 6mm, tràng 5 cánh hoa màu tím đỏ nhạt, đài có hai răng

nhỏ, tràng năm cánh nhọn, nhị nhiều, bầu thượng hình cầu [8].

Quả nhỏ, hình cầu, khi chín màu đỏ nâu; hạt dẹt, rất nhỏ, màu đen

nhánh, trên mặt hơi nổi vân. Củ gần giống củ nhân sâm [8].

Mùa ra hoa tháng 6-7, có quả tháng 9-10 [8].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.1: Cây Thổ nhân sâm ngoài tự nhiên [31]

5

1.1.2. Đặc điểm phân bố cây Thổ nhân sâm

Thổ nhân sâm có nguồn gốc từ Trung Mỹ, du nhập vào Việt Nam

khoảng năm 1909, sau đó mọc hoang khắp nơi, ra hoa quanh năm [8].

Thổ nhân sâm cũng mọc hoang và được trồng làm cảnh ở một số tỉnh

của Trung Quốc như: Triết Giang, Giang Tô, An Huy, Quảng Tây, Quảng

Đông, Tứ Xuyên, người ta gọi cây này với tên Thổ nhân sâm, Thổ cao ly sâm,

v.v… và cũng dùng làm thuốc bổ thay sâm [6], [8].

Ở Việt Nam, Thổ nhân sâm là cây trồng tự nhiên để làm thuốc, lấy rau

ăn và trồng làm cảnh. Cây gặp nhiều ở các tỉnh: Thái Nguyên, Bắc Kạn, Hà

Giang, Tuyên Quang, Hòa Bình, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hải Phòng, Nghệ

An…[6].

1.1.3. Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Thổ nhân sâm

Thổ nhân sâm ưa đất ẩm nhưng nhiều ánh nắng, rất dễ trồng, có thể thu

hoạch lá quanh năm. Khi thu hoạch thì cắt nhánh để đâm chồi, cho ra lứa rau

sâm khác. Ngoài ra, rau sâm còn được trồng trong các chậu kiểng vì cây cho

ra hoa bé xinh, phớt hồng rất đẹp [8].

Thổ nhân sâm có thể trồng từ rễ củ hoặc từ hạt. Có thể trồng trong

vườn, trong chậu cảnh hay thùng xốp. Cây mọc khỏe, sau 2 - 3 tháng có thể

hái ngọn và lá làm rau ăn, sau một năm có thể thu hoạch củ, nếu để lâu năm

củ sẽ to hơn. Lá và cành non dùng để nấu với thịt, tôm… Nấu canh rau vị

thơm mát dễ chịu gần giống rau mùng tơi [13].

 Nguồn giống từ hạt

Hạt giống sau khi thu hái được xử lý bằng nước ấm (2 sôi + 3 lạnh) ngâm

trong nước khoảng 6 - 8 giờ, vớt ra để ráo, dùng que nhọn chọc lỗ sâu 1cm rồi

cho hạt vào (2 - 3 hạt/lỗ), lấp kín đất, dùng lưới che nắng cho luống gieo [13].

 Nguồn giống từ hom

Chọn hom: hom được lấy từ thân hoặc củ cây mẹ, lấy từ đoạn gốc đến hết

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

phần bánh tẻ của thân, hạn chế lấy phần ngọn quá non, dễ bị thối gốc khi giâm.

6

Dùng dao hay kéo sắc để cắt hom. Hom được cắt từ thân có chiều dài

khoảng 10 - 20cm và ít nhất trên mỗi hom có 3 - 4 mắt lá, tỉa bớt lá trên hom

còn chừa khoảng 1/3 lá, đem giâm vào luống. Thường xuyên tưới ẩm. Sau khi

giâm 15 - 20 ngày hom giâm bắt đầu ra rễ thì đem trồng [13].

Cách trồng bằng hạt: Cây không kén đất, đất nào cũng mọc được trừ

những nơi ngập úng. Đất cày bừa lên thành luống cao 20 - 25cm, bón lót 10 -

15 tấn/ha phân chuồng, rạch thành hàng cách nhau 20cm. Hạt gieo theo hàng,

sau tỉa bớt, giữa các cây cách nhau khoảng cách 10 - 15cm. Đất trồng pha trộn

theo tỷ lệ: 80% đất thịt + 10% tro trấu hoặc rơm mục + 10% phân chuồng ủ

hoai. Thường xuyên tưới nước giữ ẩm cho đất, đặc biệt vào mùa nắng hạn.

Thường xuyên làm cỏ, xới xáo, vun gốc, bón thúc bằng nước phân chuồng,

nước giải hoặc đạm pha loãng. Kết hợp nhổ cỏ dại và phòng trừ sâu xám ăn lá

và chồi non. Thổ nhân sâm ra hoa quả hàng năm, mùa ra hoa tháng 6 - 7, mùa

ra quả tháng 9 - 10. Khi quả chín cần thu hoạch kịp thời nếu không quả sẽ bị

tách làm hạt bị rụng. Đem phơi cả quả, khi khô đập lấy hạt rồi phơi hạt trong

nắng yếu cho khô. Hạt tốt là những hạt có màu đen nhánh, bóng. Bảo quản

trong lọ sành, để nơi khô ráo [13].

Thổ nhân sâm thường dùng củ. Loại cây một năm đã có thể thu hoạch rễ

củ, nhưng tốt nhất là sau ba năm. Nếu dùng ngay cắt rễ con bỏ đầu để cả vỏ

thái miếng sấy nhẹ lửa (60 - 700C) cho khô. Nếu để lâu, đồ chín, bỏ rễ con, để

cả củ (hoặc thái miếng), sấy nhẹ lửa cho khô. Lúc mới đào rễ có màu hồng đẹp.

Đem phơi hay sấy khô và để lâu sẽ có màu đen xám. Khi dùng thái mỏng, tẩm

nước gừng hoặc nước đường, đồ chín. Lá thu hoạch quanh năm [13].

1.1.4. Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của cây Thổ nhân sâm

Nghiên cứu về thành phần hóa học trong cây Thổ nhân sâm, người ta

đã phát hiện có các chất phitosterol, saponin, flavonoid, tannin, steroid và

các chất vô cơ kali, natri, canxi, magie, sắt. Rễ chứa I-hexacosanol, I-

octacosanol, I-triacontanol, campestrol, stigmasterol, jo-sitostero, rễ còn có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

dẫn xuất phenolic [6].

7

Theo y học hiện đại, người ta đã nghiên cứu chất octacosanol trong cây

Thổ nhân sâm có tác dụng chống siêu vi gây bệnh Herp, các viêm nhiễm ngoài

da, hỗ trợ chữa bệnh Parkinson, bệnh tim và làm hạ Cholesterol máu [31].

Theo y học cổ truyền, Thổ nhân sâm có vị ngọt, tính bình, có tác dụng

bổ trung ích khí, nhuận phế sinh tân [10].

Thổ nhân sâm thường dùng chữa suy nhược ốm yếu, thể hư ra nhiều

mồ hôi, tỳ hư tiêu chảy, đái dầm, kinh nguyệt không đều, thiếu sữa…[6].

Theo kinh nghiệm, nhân dân ta thường dùng lá Thổ nhân sâm nấu ăn

cho mát, để giải nhiệt, dễ tiêu hóa, nhuận tràng. Lá Thổ nhân sâm giã nát

dùng ngoài để chữa các vết loét, ung nhọt. Củ dùng làm thuốc bổ, chữa suy

nhược cơ thể, chữa ho, người ra nhiều mồ hôi, đái dầm, kinh nguyệt không

đều, thiếu sữa, ngày dùng 20 - 30g sắc uống trong ngày. Có thể dùng rễ Thổ

nhân sâm thái nhỏ, hãm với nước sôi làm trà uống hàng ngày [31].

Trên thế giới nhiều nước dùng Thổ nhân sâm làm thuốc bổ. Tại

Indonesia còn dùng chữa các bệnh về gan thận và làm thuốc tăng kích dục.

Tại Dominique nước cốt sắc từ lá Thổ nhân sâm dùng chữa đau cổ [31].

* Một số bài thuốc theo kinh nghiệm dân gian

Bài 1: Chữa tiểu tiện nhiều, hỗ trợ đái tháo đường

Thổ nhân sâm 60g, kim anh tử 60g, các vị trên cho vào ấm đổ 550 ml

nước, sắc nhỏ lửa còn 250 ml nước chia 2 lần uống trong ngày, 5 ngày một liệu

trình [6].

Bài 2: Bổ khí huyết - chữa khí huyết yếu, người xanh gầy, thở yếu, hồi

hộp, ít ngủ, kém ăn, mệt mỏi

Thổ nhân sâm 40g, sắc nước uống trong ngày, cho vào ấm đổ 400ml

nước, sắc nhỏ lửa còn 150 ml nước chia 2 lần uống trong ngày, 10 ngày một

liệu trình [6].

Bài 3: Chữa đại tiện lỏng do tỳ hư

Thổ nhân sâm 30g, đại táo 15g, cho vào ấm đổ 550 ml nước, sắc uống

thay trà trong ngày [6]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

8

Bài 4: Hỗ trợ điều trị ho lâu ngày

Thổ nhân sâm, hà thủ ô trắng, thông thảo, mỗi vị 20g, gà một con nhỏ

tương đương với 400g. Cách chế biến: Cho các nguyên liệu trên rửa sạch cho

vào nồi hầm gà thêm khoảng 80 phút đến khi nước canh có màu trắng sữa, khi

gà chín nhừ, hớt bỏ bớt mỡ, múc gà ra một bát to, đổ hết nước hầm lên, bổ

sung thêm muối và hạt tiêu [6].

Bài 5: Chữa mồ hôi trộm

Thổ nhân sâm 60g, dạ dày lợn nửa cái. Cách chế biến: Dạ dày làm sạch

để ráo, cho vào nồi hầm Thổ nhân sâm, khi dạ dày chín nhừ bổ sung thêm

muối và hạt tiêu [6].

Bài 6: Người mới ốm dậy, sau phẫu thuật

Sườn lợn 300g, hoàng kỳ 200g, Thổ nhân sâm 200g. Xương sườn lợn

luộc qua rồi vớt bỏ bọt, hoàng kỳ sắc kỹ lấy nước, đun nhỏ lửa và om kỹ, khi

đạt độ nhừ cho Thổ nhân sâm vào đun tiếp 5 - 10 phút, nêm gia vị vừa đủ ăn

với cơm, mỗi tuần có thể ăn 2 - 3 bữa [6].

Bài 7: Chữa táo bón

Lá Thổ nhân sâm, rau đay, mùng tơi, liều vừa đủ nấu canh cua ăn

thường xuyên [6].

1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những

năm 80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân

giống vô tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây

sạch bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo…[7].

Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp

dụng và đã nhân được khoảng 500 triệu cây giống trong 1 năm ở các công

ty giống cây trồng khác nhau. Dự kiến trên thị trường cây giống, kỹ thuật

nuôi cấy mô thu được khoảng 15 tỉ USD/năm và tốc độ tăng trưởng của thị

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trường này hàng năm vào khoảng 15% [7].

9

Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi

cấy in vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các

đối tượng khác nhau như: Cây rừng, cây lương thực, thực phẩm, cây ăn

quả, hoa, cây cảnh, cây dược liệu…[7].

Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện nay đã bị chặt phá

do nhiều nguyên nhân khác nhau. Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây

rừng phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống đồi núi trọc của nhà nước,

hàng loạt quy trình nhân giống in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu

nhằm tạo ra lượng lớn cây giống có chất lượng tốt [7].

Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung

cho tất cả các loại nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi

sinh vật, trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Cho đến nay,

nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem là giải pháp công nghệ quan trọng

trong công nghệ sinh học nói chung. Trên môi trường nhân tạo, từ các mô

hoặc các cơ quan thực vật ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và

chỉ trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu

trúc di truyền và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau [7].

1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1.1. Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là

tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Haberlandt

lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật

đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn

chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào

là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền

cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế

bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

năng của tế bào [16].

10

1.2.1.2. Sự phân hóa và phản phân hóa

Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều

cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác

nhau. Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên

(tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành

nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó,

từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào

chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau [3].

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào

mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào

có thể biểu thị:

Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng

chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong

trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào

phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào,

ngược lại với sự phân hóa tế bào.

phân hóa tế bào

tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa

phản phân hóa tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa,

ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có

một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng

mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào

11

khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài

hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức

chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích

thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [3].

1.2.2. Vai trò của một số chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế

bào thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng là chất có vai trò quan trọng trong việc điều

chỉnh các quá trình sinh trưởng, phát triển và các hoạt động sinh lí của cơ thể.

Các chất điều hòa sinh trưởng của thực vật bao gồm các phytohoocmon và

chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp nhân tạo. Chất điều hòa sinh trưởng của

thực vật được chia làm 2 nhóm có tác dụng đối kháng về sinh lý, đó là các

chất kích thích sinh trưởng và các chất ức chế sinh trưởng. Các chất được sử

dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu thuộc nhóm các chất kích

thích sinh trưởng gồm: Auxin, giberelin, cytokinin [23].

1.2.2.1. Auxin

Năm 1880, người ta đã phát hiện ra bao lá mầm của cây lúa rất nhạy

cảm với ánh sáng. Nếu chiếu sáng một phía thì gây ra quang hướng động,

nhưng nếu che tối hoặc bỏ đỉnh sinh trưởng thì hiện tượng trên không xảy ra.

Đỉnh ngọn bao lá mầm là nơi tiếp nhận kích thích ánh sáng, đã sinh ra một

chất nào đấy liên quan đến hiện tượng trên.

Năm 1935, các nhà khoa học cũng tách được chất có hoạt tính tương tự

chất kích thích sinh trưởng từ nấm Rhyzopus và xác định được bản chất hóa

học là IAA, gọi là auxin [33].

Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng chủ yếu và quan trọng của

tất cả các loài thực vật từ bậc thấp tới bậc cao. Thuộc nhóm auxin gồm có:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

IAA, NAA, IBA và 2,4 - D [23].

12

IAA được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, và cả vi

khuẩn. Ở thực vật bậc cao, IAA được tổng hợp chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn và

được vận chuyển xuống dưới [23].

Auxin có tác dụng sinh lý đến quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt

động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng

của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt,… [23].

Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào, đặc biệt giãn theo

chiều ngang của tế bào làm tế bào to về chiều ngang, vì vậy làm cho các bộ

phận của cây to về chiều ngang. Hiệu quả đặc trưng của auxin là tác động lên

sự giãn của thành tế bào: IAA gây ra sự giảm pH trong thành tế bào, hoạt hóa

enzyme phân hủy các polisacarit liên kết giữa các sợi xenluloz làm cho chúng

lỏng lẻo và tạo điều kiện cho thành tế bào giãn ra dưới tác dụng của áp suất

thẩm thấu của không bào trung tâm. Ngoài ra auxin cũng kích thích lên thành

tế bào đặc biệt là các xenluloz, pectin, hemixenluloz…. [23].

Auxin còn ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào. Tuy nhiên ảnh hưởng của

auxin lên sự giãn và sự phân chia tế bào phụ thuộc vào mối tác động tương hỗ

với các phytohoocmon khác (giberelin, cytokinin). Auxin còn có tác dụng hoạt

hóa quá trình sinh tổng hợp các chất như protein, xenluloz, pectin và kìm hãm

sự phân giải chúng, nhờ thế có thể kéo dài tuổi thọ của các cơ quan, đồng thời

làm tăng quá trình vận chuyển nước, muối khoáng, chất hữu cơ ở trong cây,

đặc biệt về các cơ quan sinh sản và cơ quan dự trữ của cây [23].

Auxin gây ra tính hướng động của cây (tính hướng quang và tính hướng

địa). Bằng phương pháp sử dụng nguyên tử đánh dấu cho thấy IAA phóng xạ

được phân bố nhiều hơn ở phần khuất sáng cũng như ở phần dưới của bộ phận

nằm ngang và gây nên sự sinh trưởng không đều ở hai phía cơ quan, do đó gây

ra hiện tượng tính hướng động của các cơ quan, bộ phận của cây [23].

Auxin gây hiện tượng ưu thế ngọn, hiện tượng ưu thế ngọn là một

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hiện tượng phổ biến ở trong cây. Khi chồi ngọn hoặc rễ chính sinh trưởng sẽ

13

ức chế sinh trưởng của chồi bên và rễ bên. Ðây là một sự ức chế tương quan

vì khi loại trừ ưu thế ngọn bằng cách cắt chồi ngọn và rễ chính thì cành bên

và rễ bên được giải phóng khỏi ức chế và lập tức sinh trưởng. Hiện tượng

này được giải thích rằng auxin được tổng hợp chủ yếu ở ngọn chính và vận

chuyển xuống dưới làm cho các chồi bên tích luỹ nhiều auxin nên ức chế

sinh trưởng. Khi cắt ngọn chính, lượng auxin tích luỹ trong chồi bên giảm sẽ

kích thích chồi bên sinh trưởng. Auxin kích thích sự hình thành rễ của cây.

Sự hình thành rễ phụ của các cành giâm, cành chiết có thể chia làm ba giai

đoạn: Giai đoạn đầu là phản phân hóa tế bào trước tầng phát sinh, tiếp theo

là xuất hiện mầm rễ và cuối cùng mầm rễ sinh trưởng thành rễ phụ chọc

thủng vỏ và ra ngoài. Ðể khởi xướng sự phản phân hóa tế bào mạnh mẽ thì

cần hàm lượng auxin khá cao. Các giai đoạn sinh trưởng của rễ cần ít auxin

hơn và có khi còn gây ức chế [23].

Nguồn auxin này có thể là nội sinh, có thể xử lý ngoại sinh. Vai trò của

auxin cho sự phân hóa rễ thể hiện rất rõ trong nuôi cấy mô. Trong kỹ thuật nhân

giống vô tính, sử dụng auxin để kích thích sự ra rễ là cực kỳ quan trọng [23].

Auxin kích thích sự hình thành, sự sinh trưởng của quả và tạo quả

không hạt [23].

Auxin kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả của cây, vì nó ức chế sự hình thành

tầng rời ở cuống lá, hoa, quả vốn được cảm ứng bởi các chất ức chế sinh

trưởng. Vì vậy, phun auxin ngoại sinh có thể giảm sự rụng lá, tăng sự đậu quả

và hạn chế rụng nụ, quả non làm tăng năng suất. Cây tổng hợp đủ lượng auxin

sẽ ức chế sự rụng hoa, quả, lá [23].

Trong nuôi cấy mô auxin thường được dùng để kích thích sự phân chia

tế bào và sinh trưởng của mô sẹo. Những auxin thường được dùng trong nuôi

cấy là IBA, IAA, 2,4 - D [23].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.2.2.2. Cytokinin

14

Năm 1963, người ta đã tách được cytokinin tự nhiên ở dạng kết tinh từ

hạt ngô gọi là zeatin và có hoạt tính tương tự kinetin. Sau đó, người ta đã phát

hiện cytokinin có ở trong tất cả các loại thực vật khác nhau và là một nhóm

phytohoocmon quan trọng ở trong cây. Trong các loại cytokinin thì 3 loại sau

đây là phổ biến nhất: kinetin, 6-benzin- aminopurin và zeatin tự nhiên [23].

Tính chất đặc trưng của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào

mạnh mẽ. Vì vậy, người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia

tế bào, nguyên nhân là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp axit

nucleic và protein dẫn đến kích sự phân chia tế bào [23].

Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan của

thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Người ta đã chứng minh rằng sự cân

bằng giữa tỷ lệ auxin (phân hóa rễ) và cytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa

quyết định trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro cũng

như trên cây nguyên vẹn. Nếu tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự

ra rễ, còn tỷ lệ cytokinin cao hơn auxin thì kích thích ra chồi. Ðể tăng hệ số

nhân giống, người ta thường tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi

cấy ở giai đoạn tạo chồi. Ở trong cây, cytokinin được tổng hợp chủ yếu ở rễ

nên rễ phát triển mạnh thì hình thành nhiều cytokinin và kích thích chồi trên

mặt đất hình thành nhiều [23].

Cytokinin kìm hãm quá trình già hóa của các cơ quan và của cây

nguyên vẹn. Nếu như lá tách rời được xử lý cytokinin thì duy trì được hàm

lượng protein và chlorophil trong thời gian lâu hơn và lá tồn tại màu xanh lâu

hơn. Hiệu quả kìm hãm sự già hóa, kéo dài tuổi thọ của các cơ quan có thể

chứng minh khi cành giâm ra rễ thì rễ tổng hợp cytokinin nội sinh và kéo dài

thời gian sống của lá lâu hơn. Hàm lượng cytokinin nhiều làm cho lá xanh lâu

do nó tăng quá trình vận chuyển chất dinh dưỡng về nuôi lá. Trên cây nguyên

vẹn khi bộ rễ sinh trưởng tốt thì làm cho cây trẻ và sinh trưởng mạnh, nếu bộ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

rễ bị tổn thương thì cơ quan trên mặt đất chóng già [23].

15

Cytokinin trong một số trường hợp ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt

và của củ. Vì vậy, nếu xử lý cytokinin có thể phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của

hạt, củ và chồi ngủ [32].

Ngoài ra, cytokinin còn có mối quan hệ tương tác với auxin, cytokinin

làm yếu hiện tượng ưu thế ngọn, làm phân cành nhiều. Cytokinin còn ảnh

hưởng lên các quá trình trao đổi chất như quá trình tổng hợp axit nucleic,

protein, chlorophil, ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý của cây [23].

Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào,

kích thích phát sinh chồi nách, kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh, tăng

cường phát sinh chồi phụ [32].

1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro

Theo Nguyễn Hoàng Lộc (2007), quy trình nhân giống vô tính in vitro

được thực hiện theo ba giai đoạn [5].

1.3.1. Giai đoạn I - Cấy gây

Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải bảo đảm những

yêu cầu: Tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh.

Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỉ lệ sống cao và môi trường

dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh [5].

1.3.2. Giai đoạn II - Nhân nhanh

Ở giai đoạn này, người ta kích thích tạo cơ quan phụ hoặc các cấu trúc

khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh.

Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa

cơ quan, đặc biệt là chồi như: (1) Bổ sung riêng rẽ hoặc tổ hợp chất kích thích

sinh trưởng phù hợp. Tăng tỉ lệ auxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo

rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh chồi. (2) Đảm bảo điều kiện nhiệt độ,

ánh sáng phù hợp.

Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức

nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối ưu [5]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

16

1.3.3. Giai đoạn III - Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất

Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo

rễ, huấn luyện thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh

và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Quá trình thích

nghi ở đây là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh lí và giải phẫu của bản

thân cây non đó. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần, trong thời

gian này cây phải được chăm sóc và bảo vệ trước những yếu tố bất lợi như

mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô, nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện

tượng thối nhũn, cháy lá do nắng [5].

1.4. Một số thành tựu nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi

cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô thực vật được áp dụng ngày càng rộng rãi trên thế giới và

trong nước. Trên thế giới, hiện nay có hàng loạt các công ty về nhân giống in

vitro cây trồng thương mại với quy mô lớn. Kỹ thuật nuôi cấy mô đã thực sự

mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật [18].

Ở Việt Nam, từ những năm 1960 công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực

vật đã du nhập vào nước ta bắt đầu tại miền Nam. Đến đầu những năm 1970

đã có tại miền Bắc. Hiện nay, các hướng nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào

thực vật phát triển mạnh. Nhân giống thương mại với quy mô lớn đã được áp

dụng như nhân nhanh giống đu đủ [20], nhân nhanh giống khoai tây sạch

bệnh [19],…Ngoài ra còn sử dụng để nhân nhanh các loài cây trồng, các loài

hoa như hoa Loa Kèn [22], hoa Đồng Tiền [12].

Đối với tài nguyên cây thuốc, việc bảo tồn có ý nghĩa hết sức quan

trọng. Cây thuốc không chỉ có giá trị trực tiếp để chữa bệnh và chăm sóc sức

khỏe, nếu biết bảo tồn và khai thác hợp lí thì đó còn là nguồn thu nhập trong

phạm vi gia đình và cộng đồng địa phương. Hiện nay, nhiều loại cây thuốc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

quý hiếm đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Với những ưu điểm nổi trội

17

của nhân giống in vitro, nhiều nhà nghiên cứu đã công bố nhiều thành tựu

nhân giống cây thuốc quý, nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây Lô hội

bằng phương pháp nuôi cấy in vitro của tác giả Nguyễn Thị Kim Thanh và

Dương Huyền Trang (2008) đã cho thấy, để tạo vật liệu khởi đầu in vitro cây

Lô hội nên sử dụng mẫu ở vụ xuân, khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút

cho hiệu quả khử trùng cao (68,5%). Môi trường MS bổ sung BAP 2,5mg/l

cho hệ số nhân chồi cao (5,3 lần/ 3 tuần), chất lượng chồi tốt. Bổ sung than

hoạt tính 1,5 - 2g/l cho khả năng ra rễ đạt cao nhất, tỷ lệ ra rễ đạt 100%, chất

lượng rễ tốt. Giá thể thích hợp cho cây là cát mịn, tỷ lệ sống cao (81,4%) cây

sinh trưởng phát triển tốt [17].

Nhóm nghiên cứu Lê Tiến Vinh và CS (2014) đã nghiên cứu quy trình

nhân giống in vitro cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), kết quả cho

thấy: Trên môi trường MS + GA3 1,0 mg/l đã nhận được 40,43% hạt Đan

sâm nảy mầm sau 2 tuần. Đoạn thân (kích thước 2-3 cm và có một cặp lá) cắt

từ cây Đan sâm nảy mầm được sử dung làm vật liệu nhân nhanh. Hệ số nhân

chồi đạt cao nhất (5,05 chồi/mẫu) sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS +

BAP, NAA, IAA, IBA 0,5 mg/l đều có ảnh hưởng tích cực đến sự hình thành

rễ của chồi in vitro. Môi trường ra rễ thích hợp nhất là môi trường MS có bổ

sung IAA 0,75 mg/l, cho tỷ lệ ra rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt 6,19 rễ/cây

sau 4 tuần nuôi cấy. Cây in vitro trên môi trường ra rễ 30 ngày là thích hợp để

chuyển ra ngoài vườn ươm. Trên giá thể chứa 50% xơ dừa và 50% cát, tỷ lệ

sống đạt 100%, cây sinh trưởng phát triển tốt [21].

Tam thất là cây dược liệu quý có tác dụng hóa ứ, cầm máu, tiêu sưng,

giảm đau. Tác giả Vũ Thị Bạch Phượng và CS (2013) đã tiến hành nghiên cứu

nuôi cấy in vitro nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa của cây Thổ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tam thất và xác định được rễ in vitro của cây Thổ tam thất có hoạt tính kháng

18

oxi hóa cao nhất, trong rễ in vitro có chứa nhóm hợp chất saponin và

flavonoid, đồng thời xác định được NAA 2,0 mg/l thích hợp cho sự tạo rễ ở

cây Thổ tâm thất [9].

Nhóm tác giả Nguyễn Thanh Tùng và CS (2010) nghiên cứu nhân

giống in vitro cây Qua lâu (Trichosanthes kirilowii), đã cho thấy, hạt Qua lâu

được khử trùng bằng javel trong 5 phút, sau đó cấy lên môi trường MS cơ bản

bổ sung kinetin 1,5 mg/l. Sau 4 tuần nuôi cấy, tỷ lệ hạt không nhiễm có nảy

mầm đạt 87,9%. Đỉnh sinh trưởng và chồi bên in vitro được cấy lên môi

trường nhân nhanh có bổ sung BAP, kinetin, NAA và nước dừa riêng rẽ hay

kết hợp. Kết quả nhân chồi tốt nhất đạt được khi nuôi cấy chồi bên trên môi

trường MS bổ sung BAP 1,0 mg/l và 20% nước dừa (19,87 chồi/chồi bên).

Chồi in vitro tạo rễ trên môi trường 1/2 MS không bổ sung chất kích thích sinh

trưởng (5,67 rễ/chồi). Cây in vitro đạt tiêu chuẩn được chuyển ra đất sau 4

tuần nuôi cấy. Cây con được trồng trên giá thể đất thịt và cát (1:1) cho tỷ lệ

sống sót cao nhất đạt 77,5% [15].

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ và bạc nitrat (AgNO3)

lên sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro của

Nguyễn Việt Cường và CS (2013) cho thấy dịch chiết chuối ở nồng độ 10 g/l,

tảo spirulina ở nồng độ 5 mg/l và nước dừa ở tỉ lệ 5% tăng cường sự sinh

trưởng và phát triển của sâm Ngọc Linh. Dịch chiết khoai tây ức chế khả năng

sinh trưởng của sâm Ngọc Linh in vitro. Riêng AgNO3 làm tăng khả năng sinh

trưởng và phát triển in vitro của cây sâm Ngọc Linh ở nồng độ 2,0 mg/l [1].

Nhóm nghiên cứu của Ngô Thanh Tài (2013) đã tiến hành nghiên cứu tác

động của ánh sáng đèn LED lên khả năng tăng sinh mô sẹo và sự hình thành cây

hoàn chỉnh từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh và nhận thấy mô sẹo tăng sinh

cao nhất khi được nuôi cấy dưới ánh sáng đèn LED vàng, ánh sáng đèn LED đỏ

và LED xanh dương được kết hợp với tỉ lệ 6R + 4B thích hợp cho sự hình thành

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cây con từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh nuôi cấy in vitro [11].

19

Sharma G.J. và CS (2005) đã dùng cồn 70% để khử trùng bề mặt

thân rễ cây địa liền và cây ngải máu, sau đó, sử dụng NaClO 1% hoặc

HgCl2 0,2% trong 15 phút để diệt nấm và vi khuẩn bám trên mẫu [29].

Dương Tấn Nhựt và CS (2011) tiến hành khử trùng lá cây Sâm Ngọc

Linh bằng Cồn 70% trong 30 giây và HgCl2 trong 5 phút thu được tỷ lệ

mẫu sạch cao [25].

Behera k.k. và CS (2010) sử dụng BAP 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l để

cảm ứng chồi cây nghệ vàng [24].

Jala a. và CS (2012) nghiên cứu trên cây Giảo cổ lam cho thấy khi

kết hợp BAP 1 mg/l và NAA 0,1 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 6,8

chồi/mẫu sau 80 ngày nuôi cấy [26].

Sen a. và CS (2010) khi chuyển cây nghệ in vitro sang đất vườn và

cát với tỷ lệ 1:1 cho kết quả 93% cây vi giống sinh trưởng và phát triển

bình thường trong môi trường tự nhiên [28].

Shahinozzaman m và CS (2013) chuyển cây con tái sinh in vitro

sang chậu nhựa có chứa hỗn hợp đất vườn và phân ủ với tỷ lệ 1:1 và được

làm thích nghi. Kết quả cho thấy cây con in vitro cho tỷ lệ sống cao [30].

Nayak s. và CS (2010) nghiên cứu nhân giống trên cây Địa liền cho

thấy, ở trong môi trường MS kết hợp BAP (1,0 - 5,0 mg/l) cho kết quả

nhân chồi tốt nhất ở BAP 1,0 mg/l với hệ số nhân chồi là 5,0 ± 0,3 chồi và

chiều cao chồi là 10,2 ± 0,3 cm. Khi bổ sung BAP từ 1,0 - 3,0 mg/l và IBA

từ 0,5 - 1,0 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất ở BAP 1,0 mg/l và IBA 0,5

mg/l với 11,5 ± 0,5 chồi và chiều cao chồi là 10,8 ± 0,6 cm [27].

Đối với cây Thổ nhân sâm hiện nay các tài liệu nghiên cứu còn rất hạn

chế. Việc nghiên cứu, bảo tồn và phát triển các loại dược liệu nhất là dược

liệu hoang dại trong thiên nhiên là rất cần thiết, đồng thời là một trong những

lĩnh vực phát triển mạnh đi cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thực vật. Hy vọng trong thời gian tới sẽ có các nghiên cứu tìm hiểu sâu hơn

20

để có thể xác định được đầy đủ hàm lượng của các hợp chất hóa học, tác dụng

dược liệu của cây Thổ nhân sâm. Từ đó làm cơ sở cho việc phát triển, bảo tồn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

và ứng dụng nhiều hơn của cây Thổ nhân sâm trong y học.

21

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu: Hạt Thổ nhân sâm thu ngoài tự nhiên tại huyện Ba

Bể - tỉnh Bắc Kạn.

2.1.2. Hoá chất, thiết bị

* Hoá chất

Các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường cơ

bản MS gồm khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin (Murashige và Skoog, 1962).

- Hóa chất khử trùng: HgCl2 (Biobasic, Canada); Javen, cồn…

- Chất điều hòa sinh trưởng: BAP, kinetin, IBA (Sigma, Đức).

- Hóa chất khác: đường sucrose, agar (Hạ Long, Việt Nam)…

* Thiết bị

Dụng cụ và thiết bị dùng trong thí nghiệm: Bình tam giác 250ml, 500 ml,

bông, giấy làm nút, giấy thấm, bộ đồ cấy: dao cấy, que cấy, đĩa cấy, tủ cấy vô

trùng (Esco, Đức), nồi hấp khử trùng (Nuarie, Mỹ), tủ sấy (Memmer, Đức)…

2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8/2015 - tháng 4/2016 tại phòng

thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm

nghiệp - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

- Sử dụng môi trường MS bố sung agar 6g/l + đường sucrose 30g/l.

- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin và cytokinin

bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

- Giá trị PH của môi trường nuôi cấy trước khi sử dụng là: 5,6 - 5,8.

22

- Thể tích môi trường nuôi cấy trong mỗi bình nuôi cấy là 50 - 70

ml/bình.

- Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121ºC, áp suất 1,1 atm

trong 20 phút.

2.2.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro

2.2.2.1. Khử trùng hạt

Lựa chọn hạt Thổ nhân sâm mẩy, chắc, đều nhau rửa hạt bằng nước

sạch nhiều lần. Lắc hạt trong xà phòng loãng trong 5 phút rồi rửa lại dưới vòi

nước sạch. Khử trùng box cấy và buồng cấy bằng đèn UV trong khoảng thời

gian 45 - 60 phút, khử trùng bộ đồ cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn.

Hạt được đưa vào trong box cấy để khử trùng. Hạt khử trùng sơ bộ bằng dung

dịch cồn 70 % trong 2 phút sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 3 lần.Tiếp

theo, khử trùng bằng HgCl2 0,1% và javel 60%.

* Khử trùng hạt bằng HgCl2 0,1%

Hạt sau khi khử trùng sơ bộ được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong

khoảng thời gian 2, 3, 4, 5 phút, sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 3 - 5

lần. Với công thức đối chứng hạt không được lắc trong cồn 70 % và HgCl2

0,1%. Sau khi khử trùng, hạt được cấy lên môi trường MS bổ sung đường

sucrose 30 g/l, agar 6,0 g/l, pH = 5,8.

* Khử trùng hạt bằng javel 60%

Hạt sau khi khử trùng sơ bộ được khử trùng bằng javel 60% trong

khoảng thời gian 10, 15, 20, 25 phút. Sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng

3 - 5 lần. Với công thức đối chứng hạt không được lắc trong cồn 70 % và

javen 60%. Sau khi khử trùng, hạt được cấy lên môi trường MS bổ sung đường

sucrose 30 g/l, agar 6,0 g/l, pH = 5,8.

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 lần

nhắc lại, 150 hạt/công thức.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Đánh giá kết quả sau 20 ngày nuôi cấy. Theo dõi các chỉ số sau:

23

+ Tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm.

+ Tỉ lệ hạt nhiễm.

+ Tỉ lệ hạt chết.

+ Hình thái mầm.

2.2.2.2. Nghiên cứu môi trường nuôi cấy

Sau khi vào mẫu hạt thành công, thu được các cây con nảy mầm từ hạt.

Các đoạn thân mang chồi nách của các cây con nói trên được sử dụng làm vật

liệu cấy trên môi trường nhân nhanh. Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu

cho nhân nhanh và tạo rễ Thổ nhân sâm, chúng tôi đã bố trí các thí nghiệm

thăm dò môi trường nuôi cấy. Tất cả các công thức môi trường nuôi cấy đều

sử dụng nền môi trường MS cơ bản có bổ sung đường sucrose 30 g/l + agar

6,0 g/l và chất kích thích sinh trưởng có nồng độ thay đổi.

(1) Môi trường nhân chồi

Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ BAP, tổ hợp BAP + kinetin, tổ hợp

BAP + IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi.

Các đoạn thân mang chồi nách được cấy lên môi trường nhân chồi bổ

sung BAP với nồng độ 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l; 2,5 mg/l.

Nồng độ BAP thích hợp nhất trong thí nghiệm trên sẽ được kết hợp

với kinetin với nồng độ 0,25 mg/l; 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 2,0 mg/l.

BAP kết hợp với IBA với nồng độ: 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5mg/l. Đối

chứng là môi trường MS cơ bản không bổ sung kích thích sinh trưởng. Các

công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Mỗi công thức bố trí 5

lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 mẫu, cấy 5 - 7 chồi/ bình. Kết quả được đánh

giá sau 8 tuần nuôi cấy. Theo dõi các chỉ số sau:

+ Khả năng bật chồi: Số chồi/ mẫu.

+ Chiều cao chồi.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

+ Chất lượng chồi:

24

Chồi sinh trưởng tốt: Chồi mập, lá xanh .

Chồi sinh trưởng trung bình: Chồi hơi gầy, lá xanh.

Chồi sinh trưởng kém: Chồi gầy, lá xanh nhạt hoặc xoăn, chồi bị dị dạng.

(2) Môi trường tạo cây hoàn chỉnh (môi trường tạo rễ)

Những chồi tạo ra trên môi trường nhân nhanh có từ 4 - 5 lá được cấy

chuyển sang môi trường tạo rễ bổ sung chất kích thích sinh trưởng IBA với

nồng độ 0,5 mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l. Các công thức được bố trí theo

kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn. Mỗi công thức bố trí 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc

lại 10 mẫu, cấy 5 - 7 chồi/ bình. Kết quả được đánh giá sau 4 tuần nuôi cấy.

Theo dõi các chỉ số sau:

+ Tỉ lệ chồi ra rễ.

+ Số rễ trung bình.

+ Chiều dài rễ.

+ Chất lượng rễ:

Rễ tốt: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu vàng

Rễ trung bình: Bề mặt rễ trơn nhẵn, màu trắng.

Rễ kém: Bề mặt rễ sùi, rễ xốp, màu trắng.

2.2.3. Đưa cây ra môi trường tự nhiên

Vật liệu là cây Thổ nhân sâm con sau nuôi cấy mô. Chọn cây có bộ rễ

dài, khỏe, lá xanh, đang thời kì sung sức để đưa ra môi trường tự nhiên. Giá

thể là đất thịt trung bình, cát và trấu hun.

Đất thịt mang tính chất trung gian giữa đất cát và đất sét. Tuỳ theo tỷ lệ

cát và sét trong đất thịt mà sẽ thiên về hướng có tỷ lệ lớn. Ví dụ: Nếu đất thịt

nhẹ thì ngả về phía đất cát, còn đất thịt nặng thì ngả về đất sét. Nhìn chung đất

thịt nhẹ và đất thịt trung bình có chế độ nước, nhiệt, không khí điều hoà thuận

lợi cho các quá trình lý hoá xảy ra trong đất. Mặt khác, cày - bừa, làm đất

cũng nhẹ nhàng. Đa số cây trồng sinh trưởng và phát triển thuận lợi trên loại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đất này. Vì vậy nông dân thường ưa thích đất thịt nhẹ và thịt trung bình [4].

25

Phương pháp ra cây: Trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên,

thường tiến hành huấn luyện để cây quen dần với điều kiện môi trường bên

ngoài bằng cách: đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên,

không cho ánh sáng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cấy. Thời gian này kéo dài

khoảng 10 ngày, tăng dần cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả

năng thích nghi của cây. Sau đó, các bình cây được mở nắp, đổ nước vào

ngâm 15 phút, lắc nhẹ để thạch rời ra khỏi rễ, dùng panh gắp nhẹ các cây ra

khỏi bình không để dập nát. Rửa sạch phần thạch bám vào vì đó thường là

môi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển hoặc côn trùng tấn công. Sau

đó để cây chỗ dâm mát rồi đem trồng vào giá thể.

Tạo bầu cấy cây: Dùng bầu nilon có đường kính 7,0 x 11 cm, có đục lỗ

dưới đáy. Thành phần ruột bầu chính là các loại giá thể: (1) Đất thịt trung

bình, (2) đất thịt trung bình + cát (2:1); (3) đất thịt trung bình + trấu hun (2:1).

Xử lí bầu: Trước khi cấy 1 - 2 ngày, bầu đất được xử lí khử trùng nấm

bệnh bằng dung dịch thuốc tím 0,1% (hòa thuốc tím vào nước và dùng ô doa

tưới lên bề mặt bầu cho thấm sâu). Chế độ chăm sóc cây con trong giá thể:

Trong 2 - 3 ngày đầu tưới nước sạch bằng cách phun sương 4 lần/ngày (giữ

độ ẩm giá thể khoảng 75% - 80%). Trời rét phải che nilon tránh rét và tránh

thoát nước nhanh. Nilon phải đục lỗ thoáng khí. Sau 5 ngày có thể bỏ nilon

che để cây đủ ánh sáng, thoáng khí. Tưới nước bằng bình phun 2 - 3 lần/ngày.

Sau 10 ngày tưới cây bằng dung dịch MS pha loãng với tỉ lệ 1/10, ngày 1 lần.

Sau khi cây sống, ra rễ mới, lá mới là có thể đưa ra đồng ruộng.

Các công thức được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 5 lần

nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 cây/công thức.

Đánh giá kết quả sau khi ra cây 4 tuần. Theo dõi các chỉ số sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

+ Tỉ lệ cây sống.

26

+ Chiều cao cây.

2.3. Điều kiện thí nghiệm

Các thí nghiệm in vitro được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, các

yếu tố vật lí như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được duy trì ổn định.

- Nhiệt độ từ 25 - 270C

- Ánh sáng: Các mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn Neon với cường độ

chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10 – 12 giờ/ngày.

- Môi trường MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng sinh trưởng

(BAP, kinetin, IBA); pH môi trường 5,6 - 5,8.

- Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút ở áp

suất 1atm.

2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng toán thống kê để xác định các chỉ số thống kê như: Trung bình

mẫu, phương sai, độ lệch chuẩn và sai số trung bình mẫu với n ≥ 30, α = 0,05.

Các số liệu được xử lí trên máy vi tính bằng chương trình Excel [14]. Các

phương pháp được sử dụng là phương pháp so sánh hai mẫu độc lập, nhiều

mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis và phương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

pháp phân tích phương sai một nhân tố, phân tích phương sai hai nhân tố.

27

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng hạt

Vô trùng mẫu cấy là bước đầu tiên có vai trò quyết định trong sự

thành công của quá trình nuôi cấy in vitro. Nguồn mẫu Thổ nhân sâm đưa

vào là các hạt được lấy ngoài tự nhiên chứa nhiều loại vi sinh vật. Vì vậy,

cần lựa chọn phương pháp khử trùng thích hợp để loại bỏ hoàn toàn mầm

bệnh khỏi mẫu trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy.

3.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng

HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng

Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2

0,1% với các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy được

trình bày trong bảng 3.1.

Kết quả bảng 3.1 cho thấy, khi không sử dụng hóa chất khử trùng thì toàn

bộ hạt đã bị nhiễm sau thời gian 20 ngày nuôi cấy. Khi tăng thời gian khử trùng

từ 2 - 5 phút thì tỉ lệ hạt nhiễm giảm từ 43,88% xuống 13,64 % còn tỉ lệ hạt chết

tăng từ 10,18% đến 24,66%, đặc biệt ở công thức 5 lên đến 32,14%.

Khi sử dụng HgCl2 0,1% khử trùng hạt với thời gian tăng dần từ 2 - 3

phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm tăng tương ứng từ 45,94% đến

71,78%, mầm mập, xanh bình thường. Tiến hành tăng thời gian khử trùng lên

4 và 5 phút thì tỉ lệ hạt nảy mầm lại giảm tương ứng lần lượt là 59,42% và

54,22%, mầm gầy, vàng.

Chúng tôi đã sử dụng phương pháp so sánh nhiều mẫu độc lập theo tiêu

chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis. Kết quả phân tích cho thấy tỉ lệ hạt

nảy mầm không nhiễm ở các công thức thực sự khác nhau ở độ tin cậy 95%.

Sử dụng hàm Anova Single Factor để phân tích phương sai một nhân tố (thời

gian khử trùng trong HgCl2 0,1%) nhằm tìm nguyên nhân của sự sai khác

trên, kết quả cho thấy F > F crit. Vì vậy, tỉ lệ hạt nảy mầm ở các công thức

khác nhau là do khác nhau về thời gian xử lí HgCl2 0,1% Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

28

Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm bằng HgCl2 0,1%

(sau 20 ngày nuôi cấy)

Tổng số mẫu/CT (mẫu) Tỉ lệ hạt nhiễm (%) Tỉ lệ hạt chết (%) Công thức Hình thái mầm Tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm (%) Thời gian khử trùng (phút)

1 150 0 100 0 0 (ĐC)

mập, 150 45,94 ± 2,43 43,88 ± 2,24 10,18 ± 2,8 CT 2 2 XBT

mập, CT 3 150 71,78 ± 1,32 16,72 ± 1,81 11,50 ± 1,4 3 XBT

gầy, CT 4 150 59,42 ± 1,75 15,92 ± 1,50 24,66 ± 1,61 4 vàng

gầy, 5 CT 5 150 54,22 ± 1,83 13,64 ± 0,82 32,14 ± 1,7 vàng

(Ghi chú: XBT: xanh bình thường)

Kết quả bảng 3.1 cho thấy khi hạt tiếp xúc với HgCl2 0,1% với thời

gian thích hợp sẽ cho tỉ lệ mẫu sạch cao, còn thời gian tiếp xúc quá lâu thì tỉ lệ

hạt chết nhiều. Công thức 3 là công thức thích hợp nhất trong thí nghiệm với

thời gian khử trùng là 3 phút cho tỉ lệ hạt nảy mầm cao đạt 71,78%, sai khác

có ý nghĩa với đối chứng và tỉ lệ hạt chết không quá cao đạt 11,50%, chồi

mầm mập, màu xanh bình thường.

3.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung

dịch javel 60% đến hiệu quả khử trùng

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

javel 60% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy được trình bày trong bảng 3.2

29

Bảng 3.2. Kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm bằng javen 60%

(sau 20 ngày nuôi cấy)

Tỉ lệ hạt nhiễm (%) Tỉ lệ hạt chết (%) Công thức Hình thái mầm Tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm (%) Thời gian khử trùng (phút) Tổng số mấu/ CT (mẫu)

150 0 0 100 0 1 (ĐC)

CT 2 10 150 43,74 ± 2,44 45,56 ± 2,54 10,7 ± 2,5

CT 3 15 150 70,02 ± 0,52 18,32 ± 1,56 11,66 ± 1,35

CT 4 20 150 58,46 ± 1,77 17,12 ± 1,07 24,42 ± 1,27

CT 5 25 150 51,56 ± 2,00 14,04 ± 0,84 34,40 ± 1,58 mập, XBT mập, XBT gầy, vàng gầy, vàng

(Ghi chú: XBT: xanh bình thường)

Sử dụng hàm Anova Single Factor để phân tích phương sai một nhân tố

(thời gian khử trùng trong javel 60% ) kết quả cho thấy F > F crit. Vì vậy, tỉ lệ

hạt nảy mầm ở các công thức khác nhau là do khác nhau về thời gian xử lí

javel 60%. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, khi không sử dụng hóa chất khử trùng

thì toàn bộ hạt đã bị nhiễm sau thời gian 20 ngày nuôi cấy. Trong bảng trên

chỉ tiêu tỷ lệ hạt nảy mầm không nhiễm là quan trọng nhất. Sử dụng javel

60% khử trùng hạt với thời gian tăng dần từ 10 - 15 phút thì tỉ lệ hạt nảy

mầm cũng tăng tương ứng từ 43,74% đến 70,02%, mầm mập, xanh bình

thường. Tiến hành tăng thời gian khử trùng lên 20 và 25 phút thì tỉ lệ hạt nảy

mầm lại giảm tương ứng lần lượt là 58,46% và 51,56%, mầm gầy, vàng. Mặt

khác, khi tăng thời gian khử trùng từ 10 - 20 phút thì tỉ lệ hạt chết tăng từ

10,7% đến 24,42%, đặc biệt ở công thức 5 lên đến 34,40%. Điều này chứng

tỏ, khi hạt tiếp xúc với javel 60% với thời gian thích hợp sẽ cho tỉ lệ hạt nảy

mầm cao, chất lượng mầm tốt, còn thời gian tiếp xúc với hóa chất khử trùng

càng lâu thì tỉ lệ hạt chết càng cao, chất lượng mầm giảm. So sánh hai mẫu

độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis. Kết quả phân tích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

30

cho thấy sự sai khác về tỷ lệ hạt nảy mầm không nhiễm ở công thức 3 và công

thức 5 là thực sự có ý nghĩa, độ tin cậy 95%.

Vì vậy Công thức 3 là công thức tốt nhất trong thí nghiệm với thời

gian khử trùng là 15 phút cho tỉ lệ hạt nảy mầm cao đạt 70,02% và tỉ lệ hạt

chết không quá cao đạt 11,66%, chồi mầm mập, màu xanh bình thường.

Qua các số liệu thu được ở bảng 3.1, 3.2 ta thấy: Các hóa chất khử

trùng khác nhau thì cho tỉ lệ hạt nảy mầm không nhiễm, tỉ lệ nhiễm, tỉ lệ

chết, hình thái mầm khác nhau rõ rệt.

So sánh kết quả khử trùng hạt cho thấy khử trùng hạt bằng HgCl2

0,1% trong 3 phút cho hiệu quả khử trùng tốt hơn với tỷ lệ hạt nảy mầm

không nhiễm 71,78% và tỷ lệ chết 11,50%. Khử trùng hạt bằng javel 60%

trong thời gian 15 phút cho tỷ lệ hạt nảy mầm không nhiễm 70,02%; tỷ lệ

chết 11,66%. Tuy nhiên, sự chênh lệch hiệu quả khử trùng giữa hai công thức

này không đáng kể. Thủy ngân là một kim loại nặng rất độc. Do vậy, nên sử

dụng dung dịch javen 60% để khử trùng mẫu vật. Công thức khử trùng phù

hợp là: Trong cồn 70% trong 2 phút rồi rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Sau đó

khử trùng trong javen 60% trong 15 phút và được rửa lại nhiều lần bằng nước cất

vô trùng trước khi cấy lên môi trường.

Khử trùng bằng HgCl2 0,1% Khử trùng bằng dung dịch javel 60%

Hình 3.1. Kết quả khử trùng hạt bằng HgCl2 0,1% và dung dịch javel 60%

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(sau 20 ngày)

31

3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng

đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm

trong ống nghiệm

Nhân nhanh chồi là giai đoạn gia tăng số lượng chồi trong một thời

gian ngắn. Đây là giai đoạn quan trọng quyết định số lượng cây trong quá

trình nuôi cấy in vitro. Số chồi/mẫu càng cao thì khả năng nhân giống càng

lớn. Số chồi/mẫu chịu ảnh hưởng lớn của yếu tố tác động là các chất kích

thích sinh trưởng. Mục tiêu nghiên cứu của giai đoạn này là tìm ra môi

trường phù hợp để có số chồi/mẫu và chất lượng chồi là tốt nhất cho đối

tượng nghiên cứu.

3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng

nhân chồi Thổ nhân sâm

Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, phân hóa chồi bất định. Do

cytokinincó khả năng tổng hợp axit nucleic và protein. BAP là một loại

cytokinin thường được sử dụng để nhân nhanh chồi trong nuôi cấy in vitro.

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm thăm dò nồng độ BAP lần lượt là: 0,0mg/l;

0,5mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l, sử dụng đoạn thân mang chồi nách khoảng

1cm làm vật liệu cấy trên môi trường nhân nhanh. Theo dõi kết quả trong 4 tuần

và 8 tuần nuôi cấy. Kết quả nuôi cấy được trình bày trong bảng 3.3 và hình 3.2.

Kết quả bảng 3.3 cho thấy các công thức có bổ sung BAP cho hệ số

nhân chồi cao hơn so với công thức đối chứng (công thức 1) không bổ sung

BAP. Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy: Công thức 1 cho số chồi/mẫu đạt

1,46 chồi. Các công thức thí nghiệm còn lại cho số chồi/mẫu đạt từ 1,82 chồi

đến 2,60 chồi. Trong đó công thức 4 với nồng độ BAP bổ sung là 1,5 mg/l

cho số chồi/mẫu cao nhất là 2,60 chồi. Các công thức thí nghiệm 2, 3, 5, 6 cho

số chồi/mẫu lần lượt là 1,82 chồi; 1,94 chồi; 1,98 chồi và 1,51 chồi. Khi nồng

độ BAP qua ngưỡng tối thích ở công thức 4 thì số chồi/mẫu có xu hướng

giảm dần ở công thức 5 và 6. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

32

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm

Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Chiều cao chồi (cm) Tổng số mấu/CT (mẫu) Số chồi/mẫu (chồi) Chất lượng chồi

Sau 4 tuần

1 (ĐC) 0 50 1,1 ± 0,17 1,88 ± 0,06 ++

CT 2 0,5 50 1,6 ± 0,07 1,54 ± 0,08 ++

CT 3 1,0 50 1,72 ± 0,07 1,44 ± 0,07 +++

CT 4 1,5 50 2,24 ± 0,19 1,32 ± 0,05 +++

CT 5 2,0 50 1,66 ± 0,10 1,24 ± 0,03 ++

CT 6 2,5 50 1,37 ± 0,09 1,11 ± 0,03 +

Sau 8 tuần

1 (ĐC) 0 50 1,46 ± 0,29 2,47 ± 0,13 ++

CT 2 0,5 50 1,82 ± 0,18 2,21 ± 0,31 ++

CT 3 1,0 50 1,94 ± 0,17 1,98 ± 0,02 +++

CT 4 1,5 50 2,60± 0,22 1,86 ± 0,09 +++

CT 5 2,0 50 1,98 ± 0,19 1,63 ± 0,14 ++

CT 6 2,5 50 1,51 ± 0,15 1,49 ± 0,12 +

(Ghi chú: chồi tốt: + + +, Chồi trung bình: + +, Chồi kém: +)

Kết quả bảng 3.3 còn cho thấy, khi bổ sung BAP thì chiều cao chồi

giảm dần so với công thức đối chứng (không bổ sung BAP). Chiều cao chồi

giảm từ 2,21 cm ở công thức 2 đến 1,49 cm ở công thức 6, trong khi công

thức đối chứng chồi đạt chiều cao là 2,47 cm. So sánh hai mẫu độc lập theo

tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis (công thức đối chứng và công

thức 2). Kết quả phân tích cho thấy sự sai khác về chiều cao chồi là không có

ý nghĩa, độ tin cậy 95%. Do đó, lựa chọn công thức đối chứng hoặc công thức

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2 đều cho sự sinh trưởng của chồi tốt.

33

Chất lượng chồi ở thí nghiệm được đánh giá từ mức kém đến mức tốt.

Trong đó, công thức 2, công thức 5 (nồng độ BAP là 0,5 mg/l, 2,0 mg/l) có

chất lượng chồi không khác biệt so với công thức 1 (công thức đối chứng -

không bổ sung BAP); công thức 3, 4 cho chồi chất lượng cao hơn đối chứng

và được đánh giá ở mức tốt; công thức 6 khi nồng độ BAP ở mức cao là 2,5

mg/l cho chất lượng chồi kém (chồi gầy, lá vàng nhạt, xoăn).

Phân tích phương sai một nhân tố kết quả cho thấy F > F crit. Vì vậy,

số chồi/mẫu ở các công thức khác nhau là do khác nhau về hàm lượng BAP

bổ sung vào môi trường. Nếu xét đồng thời các chỉ tiêu (số chồi/mẫu, chiều

cao chồi và chất lượng chồi) thì chỉ tiêu số chồi/mẫu được coi là ưu tiên trong

giai đoạn nhân nhanh. Do đó có thể kết luận: công thức 4 (bổ sung BAP 1,5

mg/l vào môi trường nền MS + đường sucrose 30 g/l + agar 6,0 g/l) là thích

hợp nhất trong thí nghiệm, cho số chồi/mẫu đạt 2,60 chồi, sự sinh trưởng của

chồi đảm bảo, chất lượng chồi tốt.

Công thức bổ sung BAP nồng độ 1,5 mg/l vào môi trường nền được

chọn để sử dụng trong nghiên cứu các thí nghiệm nhân nhanh tiếp theo (BAP

kết hợp với kinetin; BAP kết hợp với IBA).

Đối chứng BAP 1,5mg/l

Hình 3.2: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến khả năng nhân nhanh chồi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Thổ nhân sâm (sau 8 tuần nuôi cấy)

34

3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp

kinetin đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm

Kinetin là một chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin, nguồn

gốc từ dịch chiết ADN biến tính. Kinetin được xem như một chất kích thích

nhân tạo đầu tiên của nhóm này được tách chiết và nghiên cứu.

Chúng tôi tiến hành thăm dò ảnh hưởng của môi trường bổ sung tổ hợp

BAP và kinetin đến khả năng tạo chồi và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm.

Các môi trường thí nghiệm có bổ sung BAP 1,5 mg/l và kinetin với

nồng độ khác nhau 0,0 mg/l; 0,25 mg/l; 0,5mg/l; 1,0mg/l; 2,0 mg/l được theo

dõi sau 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy, kết quả thể hiện qua bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp

kinetin đến khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm

Tổng số mấu/CT (mẫu) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Công thức Nồng độ kinetin (mg/l) Chất lượng chồi Nồng độ BAP (mg/l)

Sau 4 tuần

1,5 0 50 1,64 ± 0,08 2,02 ± 0,02 ++ 1 (ĐC)

1,5 0,25 1,87 ± 0,03 1,80 ± 0,03 ++ CT 2 50

50

1,5 1,5 0,5 1,0 2,96 ± 0,10 1,79 ± 0,10 1,90 ± 0,10 1,61 ± 0,09 +++ ++ CT3 CT4 50

1,5 2,0 1,70 ± 0,10 1,56 ± 0,04 + CT5

50 Sau 8 tuần

1,5 0 1,76 ± 0,11 2,60 ± 0,10 ++ 1 (ĐC) 50

1,5 0,25 1,91 ± 0,04 2,10 ± 0,10 ++ CT 2 50

1,5 0,5 3,18 ± 0,07 2,05 ± 0,12 +++ CT3 50

1,5 1,0 2,14 ± 0,14 1,81 ± 1,13 ++ CT4 50

1,5 2,0 1,90 ± 0,28 1,76 ± 0,10 + CT5 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(Ghi chú: chồi tốt: + + +, Chồi trung bình: + +, Chồi kém: +)

35

Qua bảng 3.4 cho thấy, khi bổ sung BAP 1,5 mg/l và kinetin từ 0,0

mg/l - 1,5 mg/l ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Thổ nhân Sâm.

Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 2 nhân tố (nồng độ BAP và

nồng độ kinetin) và theo bảng xử lý số liệu ở trang 49-50 cho thấy nồng độ

BAP không ảnh hưởng tới số chồi/mẫu và chiều cao chồi còn hàm lượng

kinetin ảnh hưởng tới số chồi/mẫu và chiều cao chồi.

Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy cho thấy: Công thức 1 cho số chồi/mẫu đạt

1,76 chồi. Khi tăng nồng độ kinetin từ 0,25 mg/l - 2,0 mg/l cho số chồi/mẫu

tương ứng là 1,91 chồi; 3,18 chồi; 2,14 chồi và 1,90 chồi. Trong đó công thức

3 với nồng độ kinetin bổ sung là 0,5 mg/l cho số chồi/mẫu cao nhất là 3,18

chồi. Khi nồng độ kinetin qua ngưỡng tối thích ở công thức 3 thì số chồi/mẫu

có xu hướng giảm dần ở công thức 4 và 5.

Kết quả bảng 3.4 còn cho thấy, khi bổ sung kinetin với nồng độ tăng dần từ

0,25mg/l - 2,0 mg/l thì chiều cao chồi giảm dần so với công thức đối chứng. Chiều

cao chồi giảm từ 2,10 cm ở công thức 2 đến 1,76 cm ở công thức 5, trong khi

công thức đối chứng chồi đạt chiều cao là 2,60 cm. Tuy nhiên, công thức đối

chứng và công thức 3 sự sai khác chiều cao chồi là không có ý nghĩa, do đó lựa

chọn công thức đối chứng hoặc công thức 3 đều cho sự sinh trưởng của chồi tốt.

Chất lượng chồi công thức 2, công thức 4 (nồng độ kinetin là 0,25 mg/l,

1,0 mg/l) có chất lượng chồi không khác biệt so với công thức 1 (công thức

đối chứng - không bổ sung kinetin); công thức 3 cho chồi chất lượng cao hơn

đối chứng và được đánh giá ở mức tốt; công thức 5 khi nồng độ kinetin ở mức

cao là 2,0 mg/l cho chất lượng chồi kém (chồi gầy, lá vàng nhạt, xoăn).

Nếu xét đồng thời các chỉ tiêu (số chồi/mẫu, chiều cao chồi và chất

lượng chồi) thì chỉ tiêu số chồi/mẫu được coi là ưu tiên trong giai đoạn nhân

nhanh. Sự sai khác số chồi/mẫu ở công thức 3 so với công thức 5 thực sự có ý

nghĩa. Do đó có thể kết luận: Công thức 3 (bổ sung BAP 1,5 mg/l + kinetin

0,5 mg/l vào môi trường nền MS + đường sucrose 30 g/l + agar 6,0 g/l) là

thích hợp nhất trong thí nghiệm, cho số chồi/mẫu đạt 3,18 chồi, sự sinh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trưởng của chồi đảm bảo, chất lượng chồi tốt.

36

Đối chứng BAP 1,5 mg/l +kinetin 0,5mg/l

Hình 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp kinetin đến khả năng nhân

nhanh chồi Thổ nhân sâm (sau 8 tuần nuôi cấy)

3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA tới

khả năng nhân chồi Thổ nhân sâm

Hàm lượng BAP tối ưu ở thí nghiệm 3 (BAP 1,5 mg/l) sẽ được kết

hợp với IBA với các nồng độ khác nhau để nghiên cứu khả năng nhân

nhanh chồi cây Thổ nhân sâm. Kết quả sau 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy được

thể hiện trong bảng 3.5 và hình 3.4.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với IBA

đến khả năng nhân nhanh chồi Thổ nhân sâm

Công thức Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Nồng độ BAP (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) Chất lượng chồi Tổng số mấu/CT (mẫu) Sau 4 tuần

1,5 0 50 1,16 ± 0,15 1,84 ± 0,07 ++

1 (ĐC) CT 2 CT3 CT4 1,5 1,5 1,5 0,5 1,0 1,5 1,73 ± 0,04 1,71 ± 0,08 1,94 ± 0,04 1,66 ± 0,06 1,52 ± 0,15 1,43 ± 0,03 ++ +++ + 50 50 50 Sau 8 tuần

1,5 0 50 1,36 ± 0,21 2,38 ± 0,26 ++

1,91 ± 0,05 2,18 ± 0,13 2,36 ± 0,19 2,06 ± 0,20 1,72 ± 0,09 1,87 ± 0,13 0,5 1,0 1,5 50 50 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1 (ĐC) CT 2 CT3 CT4 1,5 ++ 1,5 +++ + 1,5 (Ghi chú: chồi tốt: + + +, Chồi trung bình: + +, Chồi kém: +)

37

Sử dụng phương pháp phân tích phương sai 2 nhân tố (nồng độ BAP và

nồng độ IBA) và theo bảng xử lý số liệu ở trang 50 - 51 cho thấy nồng độ

BAP không ảnh hưởng tới số chồi/mẫu và chiều cao chồi; hàm lượng IBA

ảnh hưởng tới số chồi/mẫu còn không ảnh hưởng tới chiều cao chồi.

Xét chỉ tiêu số chồi/mẫu ta thấy ở công thức 1 (công thức đối chứng)

cho số chồi/mẫu 1,36 chồi. Khi giữ nguyên BAP 1,5 mg/l và nồng độ IBA

tăng 0,5 mg/l - 1,0 mg/l số chồi/mẫu tăng 1,91 chồi - 2,36 chồi, chất lượng

chồi tăng từ trung bình đến tốt. Khi tăng nồng độ IBA lên 1,5 mg/l số

chồi/mẫu giảm xuống còn 1,72 chồi, chất lượng chồi kém. Công thức 3 cho số

chồi/mẫu cao nhất 2,36 chồi. Sự sai khác số chồi/mẫu ở công thức 3 so với

công thức 1 thực sự có ý nghĩa, chiều cao chồi ở mức trung bình 2,06 cm và

chất lượng chồi tốt. Vậy công thức 3 với BAP 1,5 mg/l + IBA 1,0 mg/l bổ

sung vào môi trường nền MS + đường sucrose 30 g/l + agar 6,0 g/l là công

thức thích hợp nhất trong thí nghiệm.

Đối chứng BAP 1,5 mg/l + IBA 1,0 mg/l

Hình 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến khả năng

nhân chồi cây Thổ nhân sâm (sau 8 tuần nuôi cấy)

Sau khi nghiên cứu kết quả ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh

trưởng đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi Thổ nhân sâm

trong ống nghiệm thì môi trường thích hợp nhất cho sự nhân chồi và sinh

trưởng của cây Thổ nhân sâm trong ống nghiệm là: MS cơ bản + đường

sucrose 30g/l + agar 6,0g/l + BAP 1,5mg/l + kinetin 0,5 mg/l. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

38

3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ chồi

cây Thổ nhân sâm

Trước khi đưa cây Thổ nhân sâm ra trồng ngoài vườn ươm, chồi Thổ

nhân sâm phải trải qua giai đoạn tạo rễ nhờ việc bổ sung chất kích thích sinh

trưởng thuộc nhóm auxin. IBA là một trong những chất gây hiệu ứng rõ nét

nhất đối với sự phân hóa tế bào đã được kiểm chứng, đó là khả năng phát sinh

rễ. Đây là một trong những giai đoạn quan trọng, quyết định thành công của

cả quá trình nghiên cứu, chồi Thổ nhân Sâm phải có rễ mới có khả năng tự

hút chất dinh dưỡng ngoài môi trường tự nhiên để sinh trưởng và phát triển.

Để kích thích sự ra rễ chồi Thổ nhân sâm trong nuôi cấy, chúng tôi bố

trí các công thức thí nghiệm thăm dò IBA ở các nồng độ khác nhau lần lượt

0,0 mg/l; 0,5mg/l; 1,0 mg/l; 1,5 mg/l; 2,0 mg/l. Theo dõi kết quả trong 2 tuần,

4 tuần nuôi cấy. Kết quả nuôi cấy được trình bày trong bảng 3.6 và hình 3.5.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của của IBA đến khả năng ra rễ chồi Thổ nhân sâm

Công thức Tỉ lệ chồi ra rễ (%) Chiều dài rễ (cm) Số rễ trung bình (rễ/chồi) Chất lượng rễ Nồng độ IBA (mg/l) Tổng số mấu/ CT (mẫu)

Sau 2 tuần

1 (ĐC) CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 0 0,5 1,0 1,5 2,0 50 50 50 50 50 25,02 ± 1,30 1,46 ± 0,17 1,28 ± 0,09 52,54 ± 1,10 2,08 ± 0,30 1,74 ± 0,08 56,02 ± 1,84 2,73 ± 0,13 1,86 ± 0,05 2,12 ± 0,08 70,02 ± 1,39 3,02± 0,24 51,98 ± 1,84 2,58 ± 0,16 1,78 ± 0,07 ++ +++ +++ ++ +

Sau 4 tuần

(Ghi chú: Rễ tốt: +++, Rễ trung bình: ++, Rễ kém: +

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1 (ĐC) CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 0 0,5 1,0 1,5 2,0 50 50 50 50 50 30,38 ± 0,41 1,62 ± 0,11 1,58 ± 0,06 60,06 ± 0,06 2,34 ± 0,23 1,86 ± 0,06 65,36 ± 1,32 2,92 ± 0,05 2,08 ± 0,14 80,16 ± 0,80 4,02 ± 0,09 2,56 ± 0,07 54,90 ± 0,33 2,71 ± 0,09 1,91 ± 0,01 ++ +++ +++ ++ +

39

Qua bảng 3.6 cho thấy, sau 4 tuần nuôi cấy tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung

bình và chiều dài rễ ở tất cả các công thức tương đối ổn định. Ở công thức

1(đối chứng) tỷ lệ ra rễ 30,38%. Khi tăng nồng độ IBA từ 0,5 mg/l - 1,5 mg/l

tỷ lệ ra rễ tăng dần từ 60,06% - 80,16%. Trong đó, cao nhất là công thức 4 với

nồng độ IBA 1,5 mg/l tương ứng với tỷ lệ ra rễ là 80,16%. Khi tăng nồng độ

IBA lên 2,0 mg/l tỷ lệ ra rễ giảm còn 54,90% và số rễ trung bình cũng giảm

xuống 2,71 cm, chất lượng rễ kém. Như vậy nồng độ IBA quá cao đã làm ức

chế tỷ lệ ra rễ. Chiều dài rễ tăng theo nồng độ IBA từ 0,5 mg/l - 1,5 mg/l

tương ứng 1,86 cm; 2,08 cm; 2,56 cm và giảm xuống 1,91 cm khi nồng độ

IBA 2,0 mg/l. Sự sai khác về số rễ trung bình giữa các công thức so với công

thức đối chứng là không có ý nghĩa. Tỷ lệ ra rễ ở công thức 4 (IBA 1,5 mg/l)

cao nhất, số rễ trung bình 4,02, chiều dài rễ 2,56 cm và chất lượng rễ tốt nhất

là công thức phù hợp cho sự ra rễ chồi Thổ nhân sâm.

Đối chứng IBA 1,5 mg/l IBA 1,5 mg/l

Hình 3.5. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Thổ nhân sâm

(sau 4 tuần nuôi cấy)

3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng

và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm

Lựa chọn giá thể phù hợp để ra cây ngoài vườn ươm là một khâu phải

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thực hiện tỉ mỉ và thận trọng. Giá thể phù hợp là giá thể cho tỉ lệ cây sống cao,

40

cây sinh trưởng, phát triển tốt. Vì vậy, thành công của giai đoạn này có ý nghĩa

quan trọng quyết định tới hiệu quả nhân giống.

Để nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng và

phát triển cây Thổ nhân sâm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 3 loại giá

thể là: Đất thịt trung bình; Đất thịt trung bình + cát (2:1); Đất thịt trung

bình + trấu hun (2:1). Qua 4 tuần theo dõi đánh giá, kết quả thu được thể

hiện trong bảng 3.7 và hình 3.9.

Bảng 3.7. Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát

triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm (sau 4 tuần)

Tổng số Công Tỉ lệ cây Chiều cao Giá thể cây/CT thức sống (%) cây (cm) (cây)

1 (ĐC) Đất thịt trung bình 150 64,18 ± 0,96 12,76 ± 0,81

Đất thịt trung bình + cát CT 2 150 75,98 ± 0,55 13,66 ± 0,67 (2:1)

Đất thịt trung bình + trấu CT 3 150 87,52 ± 1,67 14,12 ± 0,91 hun (2:1)

Bảng 3.7 thể hiện kết quả ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh

trưởng và phát triển của cây con. Đất thịt trung bình cho tỷ lệ cây sống

64,18%; giá thể đất thịt trung bình + cát (2:1) cho tỷ lệ cây sống 75,98% và

cao nhất là giá thể đất thịt trung bình + trấu hun (2:1) với tỷ lệ cây sống

87,52%. So sánh nhiều mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal

và Wallis cho kết quả sai khác về chiều cao cây trong các thí nghiệm không

có ý nghĩa. Vì vậy, đánh giá ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng

và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm thì chỉ tiêu tỷ lệ cây sống là

quan trọng nhất. Công thức 3 với giá thể là đất thịt trung bình + trấu hun (2:1)

là công thức thích hợp (tỷ lệ cây sống là 87,52%, chiều cao cây 14,12cm) cho

sự sinh trưởng và phát triển của cây Thổ nhân sâm ngoài vườn ươm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

41

Đất thịt trung bình + trấu hun (2:1) Đất thịt trung bình + Cát (2:1)

Đất thịt trung bình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.6. Cây con trồng trong các giá thể khác nhau sau 30 ngày

42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1. Công thức khử trùng phù hợp đối với hạt Thổ nhân sâm là: Trong

cồn 70% trong 2 phút rồi rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Sau đó khử trùng

trong javen 60% trong 15 phút và được rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng

trước khi cấy lên môi trường.

2. Môi trường thích hợp nhất cho sự nhân chồi và sinh trưởng của cây

Thổ nhân sâm trong ống nghiệm là: MS cơ bản + đường sucrose 30g/l + agar

6,0g/l + BAP 1,5mg/l + kinetin 0,5 mg/l.

3. Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo rễ của chồi Thổ nhân sâm trong

ống nghiệm là: MS cơ bản + đường sucrose 30g/l + agar 6/l + IBA 1,5 mg/l.

4. Giá thể thích hợp cho cây con sau in vitro là đất thịt trung bình +

trấu hun (2:1) cho tỷ lệ sống đạt 87,52%.

2. Đề nghị

- Tiếp tục nghiên cứu thêm ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh

trưởng khác đến khả năng nhân nhanh chồi của cây Thổ nhân sâm.

- Nghiên cứu thêm giá thể thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển

cây con in vitro.

- Ứng dụng môi trường thích hợp vào nhân giống cây Thổ nhân sâm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh cây Thổ nhân sâm.

43

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Việt Cường, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Bá Nam, Hà Thị Mỹ

Ngân, Lê Kim Cương, Nguyễn Phúc Huy, Dương Tấn Nhựt (2013),

“Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ và bạc nitrat (AgNO3)

lên sự sinh trưởng và phát triển của cây sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis Ha ET Grushv.) nuôi cấy in vitro”, Báo cáo khoa học - Hội

nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học tự nhiên và

công nghệ, tr. 727-731.

2. Nguyễn Thúy Dần (2007), Giáo trình dược liệu, NXB Hà Nội.

3. Trịnh Đình Đạt (2009), Công nghệ sinh học (công nghệ di truyền), tập 4,

NXB giáo dục.

4. Nguyễn Thế Đặng, Đặng Văn Minh, Nguyễn Thế Hùng (2007), Giáo

trình vật lý đất, NXB Nông nghiệp Hà Nội.

5. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình nhập môn công nghệ sinh học,

NXB Đại học Huế.

6. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học.

7. Nguyễn Hoàng Nghĩa (1997), Bảo tồn nguồn gen cây trồng, NXB

Nông nghiệp Hà Nội.

8. Minh Phúc (2013), Thảo dược quý và phương thuốc chủ trị, NXB Y học.

9. Vũ Thị Bạch Phượng, Quách Ngô Diễm Phương, Bùi văn Lệ (2013),

“Nghiên cứu nuôi cấy in vitro nguồn nguyên liệu có hoạt tính oxi hóa của

cây Thổ tam thất (Gynura pseudochina (L) DC)”, Báo cáo khoa học -

Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học tự

nhiên và công nghệ, tr.1006 - 1010.

10. Hoàng Văn Sỹ (2010), Cẩm nang về lý luận và chẩn trị y học cổ truyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

phương Đông, NXB Y học.

44

11. Ngô Thanh Tài, Nguyễn Bá Nam, Hồ Thanh Tâm, Hà Thị Mỹ Ngân,

Dương Tấn Nhựt (2013), “Nghiên cứu tác động của ánh sáng đèn LED

lên khả năng tăng sinh mô sẹo và sự hình thành cây hoàn chỉnh từ phôi

vô tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha ET Grushv.)”, Báo

cáo khoa học - Hội nghị khoa học công nghệ sinh học toàn quốc, NXB

Khoa học tự nhiên và công nghệ, tr. 1038 - 1042.

12. Trần Tế, Đoàn Nhân Ái, Trương Thị Bích Phượng (2008), “Nghiên cứu

sản xuất cây hoa Đồng Tiền bằng kỹ thuật nhân giống in vitro”, Tạp chí

Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 6(4B),

tr.905 -913.

13. Nguyễn Đức Toàn (2002), Thuốc đông y - cách sử dụng - chế biến - bảo

quản, NXB Y học, Hà Nội.

14. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lí thống kê kết quả nghiên

cứu thực nghiệm trong nông lâm ngư nghiệp trên máy vi tính, NXB

Nông nghiệp, Hà Nội.

15. Nguyễn Thanh Tùng, Phạm Thi Diễm Thi, Trương Thị Bích Phượng (2010),

“Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Qua lâu (Trichosanthes kirilowii)”, Tạp

chí công nghệ sinh học, 8 (3B), Đại Học Huế, tr. 1231 - 1239.

16. Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở Công nghệ sinh học - Tập 3,

NXB Giáo dục.

17. Nguyễn Thị Kim Thanh, Dương Huyền Trang (2008), “Nghiên cứu kỹ

thuật nhân giống vô tính cây Lô hội bằng phương pháp nuôi cấy in

vitro”, Tạp chí khoa học và phát triển, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 6(6),

tr. 514 - 521.

18. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng,

NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

19. Nguyễn Việt Thắng, Ngô Đức Thiện (2000), Kỹ thuật trồng khoai tây,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

NXB Nông nghiệp.

45

20. Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển, “Vi nhân giống

cây đu đủ”, Báo cáo khoa học 2002, NXB Khoa học và Kỹ thuật.

21. Lê Tiến Vinh, Ninh Thị Thảo, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy,

Nguyễn Thị Phương Thảo (2014), “Quy trình nhân giống in vitro cây

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge)”, Tạp chí khoa học và phát triển.

22. Đỗ Năng Vịnh, Lê Thị Thu Về (1999), “Nhân giống hoa Loa Kèn mới”,

Báo cáo khoa học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr. 889 - 895.

23. Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội.

TIẾNG ANH

24. Behera K. K., Pani D. and Shahoo S. (2010), “Effect of plant growth

regulator on in vitro multiplucation of turmeric (Curcumar longa

L.cv.Ranga)”, International Journal of Biological Technology, 1(1): 16 - 23.

25. Duong Tan Nhut, Nguyen Phuc Huy, Vu Quoc Luan, Nguyen Van

Binh, Nguyen Ba Nam, Le Nu Minh Thuy, Dang Thi Ngoc Ha, Hoang

Xuan Chien, Trinh Thi Huong, Hoang Van Cuong, Le Kim Cuong and

Vu Thi Hien (2011), “Shoot regeneration and micropropagation of

Panax vietnamensis Ha et Grushv. from ex vitro leaf-derived callus”,

African Journal of Biotechnology, 10(84):19499 - 19504.

26. Jala A. and Patchpoonporn W. (2012), “Effect of BA, NAA and 2,4-D

on micropropagation of Jiaogulan (Gynostemma pentaphyllum

makino)”, International Transaction Journal of Enginneering,

Management, Applied Sciences & Technologies, 3(4): 363 - 370

27. Nayak S., Parida R. and Mohanty S. (2011), “Evaluation of genetic

fidelity of in vitro propagated greater Galangal (Alpinia galanga L.)

using DNA based markers”, International Journal of Plant, Animal

and Environmental Sciences, 1(3): 124 - 133.

28. Sen A., Goyal A.K., Ganguly K. and Mishra T. (2010), “In vitro

multiplication of Curcuma Longa Linn.- an important medicinal

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

zingiber”, Journal of Plant Science, 4: 21 - 24.

46

29. Sharma G.J., Sinha S.K. and Chirangini P. (2005), “In vitro propagation

and microrhizome induction in Kaempferia galanga Linn. and Kaempferia

rotunda Linn.”, Indian Journal of Biotechnology, 4: 404 - 408.

30. Shahinozzaman M., Faruq M. O., Azad M. A. K. and Amin M. N.

(2013), “Studies on in vitro propagation of an important medicinal

plant - Curcuma zedoaria Roscoe using rhizome explants”, Persian

Gulf Crop Protection Available online, 2( 4): 1- 6.

TRANG WEB

31. http://sotayyhoc.com/tin-tuc-y-hoc/cay-tho-cao-ly-sam.html

32. https://vi.wikipedia.org/wiki/Cytokinin

33. https://vi.wikipedia.org/wiki/Auxin

34. http://yduochoaviet.com/thuoc-bo-nguon-goc-thao-moc/891-cay-tho-cao-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ly-sam.html

47

PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog,1962)

Thành phần khoáng đa lượng

Nồng độ (mg/l) 1650 NH 4NO3

1900 KNO3

CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4

Thành phần khoáng vi lượng

440 370 170 Nồng độ (mg/l) 23,3 8,6 6,2 0,83 0,25 0,025 0,025 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O

Na2EDTA FeSO47H2O

Vitamin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Thiamin HCl Nicotinic Axit Pyridoxine HCl Glyxine 37,3 27,8 Nồng độ (mg/l) 0,1 0,5 0,5 2,0

48

Phụ lục 2: Kết quả xử lí số liệu

1. Nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến khả năng khử trùng hạt Thổ nhân sâm Anova: Single Factor

SUMMARY Groups

Count

Variance

CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5

Sum 0 5 5 229,7 5 358,9 5 297,1 5 271,1

Average 0 45,94 71,78 59,42 54,22

0 29,508 8,722 15,362 16,852

ANOVA

Source of Variation

SS

df

MS

F

F crit

P-value 4,48689E-

17 2,866081

Between Groups Within Groups

15139,53 281,776

4 3784,8836 268,644853 20

14,0888

Total

15421,31

24

Qua kết quả phân tích trên cho thấy F > F crit nên thời gian xử lý HgCl2 0,1% ảnh

hưởng đến kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm.

2. Nghiên cứu ảnh hưởng của javen 60% đến khả năng khử trùng hạt Thổ nhân sâm

Anova: Single Factor

SUMMARY Groups

Count

Sum Average Variance 0 29,778 1,357 15,678 20,043

0 43,74 70,02 58,46 51,56

5 0 5 218,7 5 350,1 5 292,3 5 257,8

CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 ANOVA

Source of Variation

SS

df

MS

F

F crit

P-value 4,44E-

17 2,866081

14382,4776 267,424

4 3595,619 268,9078 20

13,3712

Between Groups Within Groups Total

14649,9016

24

Qua kết quả phân tích trên cho thấy F > F crit nên thời gian xử lý javen 60% ảnh hưởng

đến kết quả khử trùng hạt Thổ nhân sâm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

49

3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng chồi Thổ nhân sâm 3.1. Phân tích chỉ tiêu số chồi/ mẫu Anova: Single Factor

SUMMARY Groups

Count

CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6

Sum Average Variance 0,433 1,46 0,15942 1,822 0,14152 1,938 0,25105 2,6 0,17492 1,978 0,1105 1,51

5 7,3 5 9,11 5 9,69 13 5 5 9,89 5 7,55

ANOVA

Source of Variation

SS

df

MS

F

P-value

F crit

4,00454 0,008772196 2,6206541

Between Groups 4,239507 5,08164 Within Groups

5 0,847901 24 0,211735

Total

9,321147

29

Qua kết quả phân tích trên cho thấy F > F crit nên số chồi/mẫu khác nhau là do sự khác

nhau về hàm lượng BAP khác nhau.

3.2. Phân tích chỉ tiêu chiều cao chồi

Anova: Single Factor SUMMARY Groups

Count

CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6

5 12,33 5 11,05 9,9 5 9,3 5 8,13 5 7,45 5

Sum Average Variance 0,08378 2,466 0,4905 2,21 0,002 1,98 0,043 1,86 0,10438 1,626 0,073 1,49

ANOVA

Source of Variation

SS

df

MS

F

P-value

F crit

Between Groups 3,29330667 3,18664 Within Groups

5 0,658661 4,960671 0,002932 2,620654 24 0,132777

Total

6,47994667

29

Qua kết quả phân tích trên cho thấy F > F crit nên chiều cao chồi khác nhau là do sự khác

nhau về hàm lượng BAP khác nhau.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

50

4. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với kinetin đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng chồi Thổ nhân sâm 4.1. Phân tích chỉ tiêu số chồi/ mẫu

Anova: Two-Factor Without Replication

SUMMARY

Count

Sum Average Variance

2,1 2,36 2,264 2,096 2,076

0,34 0,348 0,45548 0,41708 0,60788

10,5 5 5 11,8 5 11,32 5 10,48 5 10,38

BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l

1,76 1,912 3,18 2,14 1,904

0,063 0,00652 0,022 0,098 0,40108

5 5 5 5 5

8,8 9,56 15,9 10,7 9,52

Kinetin 0,0 mg/l Kinetin 0,25 mg/l Kinetin 0,50 mg/l Kinetin 1,0 mg/l Kinetin 1,5 mg/l

ANOVA

Source of Variation

df

MS

F

P-value

F crit

Rows Columns

SS 0,3186 6,63

4 0,07966 0,623599 1,6575 12,97595 4

0,652364098 3,0069173 6,76053E-05 3,0069173

Error

2,0438

16 0,12774

Total

8,9924

24

F rows (BAP) < F crit (BAP) nên hàm lượng BAP không ảnh hưởng tới số chồi/ mẫu. F colum (kinetin) > F crit (kinetin) nên hàm lượng kinetin ảnh hưởng tới số chồi/ mẫu.

Qua kết quả phân tích trên cho thấy: 4.2. Phân tích chỉ tiêu chiều cao chồi Anova: Two-Factor Without Replication

SUMMARY

BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l

Count 5 5 5 5 5

Sum Average Variance 2,02 10,1 2,1 10,5 2,06 10,3 1,96 9,8 2,18 10,9

0,062 0,05 0,35175 0,133 0,237

Kinetin 0,0 mg/l Kinetin 0,25 mg/l Kinetin 0,50 mg/l Kinetin 1,0 mg/l Kinetin 1,5 mg/l

13 5 5 10,5 5 10,25 9,05 5 8,8 5

2,6 2,1 2,05 1,81 1,76

0,055 0,05 0,07 0,083 0,053

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

df

F

P-value

F crit

MS 0,0344 0,49746927 8,0571222

0,737937735 3,00691728 0,000931169 3,00691728

ANOVA Source of Variation Rows Columns Error

SS 0,1376 2,2286 1,1064

4 4 0,55715 16 0,06915

24

3,4726

F rows (BAP) < F crit (BAP) nên hàm lượng BAP không ảnh hưởng tới chiều cao chồi. F colum (kinetin) > F crit (kinetin) nên hàm lượng kinetin ảnh hưởng tới chiều cao chồi.

51

Total Qua kết quả phân tích trên cho thấy: 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp với IBA đến khả năng nhân chồi và sự sinh trưởng chồi Thổ nhân sâm 5.1. Phân tích chỉ tiêu số chồi/ mẫu Anova: Two-Factor Without Replication

SUMMARY

Count Sum Average

Variance

BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l

4 7,4 4 6,92 4 8,1 4 6,75 4 7,6

1,85 0,836666667 0,0236 1,73 2,025 0,249166667 1,6875 0,057291667 1,9 0,246666667

IBA 0,0 mg/l IBA 0,5 mg/l IBA 1,0 mg/l IBA 1,5 mg/l

5 6,8 5 9,55 5 11,8 5 8,6

1,36 1,91 2,364 1,72

0,228 0,0155 0,18748 0,047

P-value

F crit

F

MS df 4 0,07327 0,543129648 0,70737376 3,259166727 3 0,873778333 6,477070001 0,0074447 3,490294821

ANOVA Source of Variation Rows Columns Error

SS 0,29308 2,62134 1,61884 12 0,134903333

Total

4,53326 19

F rows (BAP) < F crit (BAP) nên hàm lượng BAP không ảnh hưởng tới số chồi/

F colum (IBA) > F crit (IBA) nên hàm lượng IBA ảnh hưởng tới số chồi/ mẫu.

Qua kết quả phân tích trên cho thấy: mẫu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

52

5.2. Phân tích chỉ tiêu chiều cao chồi

Anova: Two-Factor Without Replication

SUMMARY

Sum Average Variance Count 0,0025 2,025 8,1 4 4 8,02 0,1601 2,005 2,2875 0,577292 4 9,15 2,375 0,229167 9,5 4 1,925 0,009167 7,7 4

BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l

5 11,9 5 10,9 5 10,3 5 9,35

2,38 2,18 2,064 1,87

0,332 0,087 0,21248 0,0845

IBA 0,0 mg/l IBA 0,5 mg/l IBA 1,0 mg/l IBA 1,5 mg/l

ANOVA

df

F

MS

F crit 3,259167 3,490295

Source of Variation Rows Columns Error

SS 0,61318 0,68394 2,25074

P-value 4 0,153295 0,817305 0,538273 3 0,227978 1,215485 0,346339 12 0,187562

Total

3,54786

19

F rows (BAP) < F crit (BAP) nên hàm lượng BAP không ảnh hưởng tới chiều cao chồi. F colum (IBA) < F crit (IBA) nên hàm lượng IBA không ảnh hưởng tới chiều cao chồi.

Qua kết quả phân tích trên cho thấy: 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ chồi Thổ nhân sâm 6.1. Phân tích chỉ tiêu tỷ lệ chồi ra rễ Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average Variance

CT 1

5

151,9

30,38

0,832

CT 2

5

300,3

60,06

0,018

CT 3

5

326,8

65,36

8,648

CT 4

5

400,8

80,16

3,228

CT 5

5

274,5

54,9

0,55

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ANOVA

Source of

Variation

SS

df

MS

F

P-value

F crit

1,13E-

Between Groups

6609,026

4 1652,257

622,272

20 2,866081402

Within Groups

53,104

20

2,6552

Total

6662,13

24

Qua kết quả phân tích trên cho thấy F > F crit nên nồng độ IBA ảnh hưởng đến tỷ lệ

chồi ra rễ.

53

6.2. Phân tích chỉ tiêu số rễ trung bình

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average Variance

5

8,1

1,62

0,057

CT 1

5

11,7

2,34

0,263

CT 2

5

14,6

2,92

0,012

CT 3

5

20,1

4,02

0,047

CT 4

5

13,53

2,706

0,04308

CT 5

ANOVA

Source of Variation

SS

df

MS

F

P-value

F crit

8,76E-

Between Groups

15,42294

4 3,855736 45,67542

10 2,866081

Within Groups

1,68832

20 0,084416

Total

17,11126

24

Qua kết quả phân tích trên cho thấy F > F crit nên nồng độ IBA ảnh hưởng đến số rễ

trung bình của chồi Thổ nhân sâm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

54

6.3. Phân tích chỉ tiêu chiều dài rễ

Anova: Single Factor SUMMARY Groups

Count

Sum Average Variance

CT 1

7,9

1,58

0,017

5

CT 2

9,3

1,86

0,01675

5

CT 3

5 10,38

2,076

0,09888

CT 4

12,8

2,56

0,023

5

CT 5

9,57

1,914

0,00048

5

ANOVA

Source of Variation

SS

df

MS

F

P-value

F crit

Between Groups

2,6138

4

0,6534 20,928832

6,4E-07

2,866081

Within Groups

0,6244

20

0,0312

Total

3,2382

24

Qua kết quả phân tích trên cho thấy F > F crit nên nồng độ IBA ảnh hưởng đến chiều

dài rễ của chồi Thổ nhân sâm.

7. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm 7.1. Phân tích chỉ tiêu tỷ lệ cây sống

Anova: Single Factor

SUMMARY Groups

Count

Average

CT 1 CT 2 CT 3

Variance 4,577 1,502 13,992

64,18 75,98 87,52

Sum 5 320,9 5 379,9 5 437,6

ANOVA

Source of Variation

SS

df

MS

F

F crit

P- value

3E-08 3,885293835

Between Groups Within Groups

1361,945333 80,284

2 680,9726667 101,78456 12 6,690333333

1442,229333

14

Total Qua kết quả phân tích trên cho thấy F > F crit nên giá thể ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của cây Thổ nhân sâm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

55

7.2. Phân tích chỉ tiêu chiều cao cây

Anova: Single Factor SUMMARY Groups

Count

Average

CT 1 CT 2 CT 3

Sum 5 63,8 5 68,3 5 70,6

12,76 13,66 14,122

Variance 3,313 2,278 4,12892

ANOVA

df

P-value

F crit

F

MS 2,39874 0,7403579 0,49752 3,885293835

Source of Variation Between Groups Within Groups

SS 4,79748 38,87968

2 12 3,23997333

Total

43,67716

14

Qua kết quả phân tích trên cho thấy F< F crit nên giá thể không ảnh hưởng đến chiều cao cây Thổ nhân sâm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn