Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa (Oryza sativa L.)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRƯƠNG KIM OANH

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA

PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN TỪ

CÂY LÚA (Oryza sativa L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Thái Nguyên - 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRƯƠNG KIM OANH

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA

PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN TỪ

CÂY LÚA (Oryza sativa L.)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số ngành: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Tiến Dũng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Thái Nguyên – 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của

riêng tôi và nhóm nghiên cứu được sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn

Tiến Dũng. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và

chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu

trách nhiệm về nội dung luận văn của mình.

Thái Nguyên, ngày 02 tháng 11 năm 2019

Học viên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Trương Kim Oanh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân

thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Tiến Dũng đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt

tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn.

Tôi xin cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái

Nguyên và các thầy cô giáo trong trường đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi

học tập và thực hiện luận văn.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh

học – Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm đã truyền dạy kiến

thức và kỹ năng cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường, tạo điều kiện

thuận lợi để tôi có thể thực hiện tốt đề tài nghiên cứu của mình.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp cùng

tập thể lớp Công nghệ sinh học K25, nhóm sinh viên trong phòng thí nghiệm

Sinh học phân tử - Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm,

những người đã luôn sát cánh bên tôi, giúp đỡ, động viên và góp ý cho tôi

trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài này.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 02 tháng 11 năm 2019

Học viên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Trương Kim Oanh

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1

1.2. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2

1.3. Ý nghĩa của luận văn .................................................................................. 2

1.3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3

1.1. Vai trò của cây lúa ...................................................................................... 3

1.2.Tổng quan về promoter ............................................................................... 5

1.2.1. Khái niệm về promoter............................................................................ 5

1.2.2. Phân loại promoter .................................................................................. 6

1.2.3. Điều hòa gene ở sinh vật nhân chuẩn ..................................................... 8

1.2.4. Ứng dụng promoter trong công nghệ gene thực vật ............................. 13

1.2.5. Vai trò của yếu tố điều hòa Cis ............................................................. 15

1.3. Vai trò hạt phấn trong nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng thích ứng với

biến đổi khí hậu ............................................................................................... 16

1.4. Phương pháp chuyển gene ở thực vật qua Agrobacterium ...................... 18

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 21

2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ............................................................... 21

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu: .......................................................................... 21

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 21

2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 21

2.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 21

2.2.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 21

2.3. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu ..................................................... 21

2.3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 21

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

2.3.2. Hóa chất................................................................................................. 22

2.3.3. Thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 23

2.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 23

2.4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn. .............. 23

2.4.2. Nội dung 2: Tách dòng promoter chuyên biệt hạt phấn và thiết kế

vector chuyển gene. ......................................................................................... 23

2.4.3. Nội dung 3: Đánh giá hoạt động của promoter trên cây mô hình

Arabidopsis. ..................................................................................................... 23

2.5. Phương pháp nghiên cứu. ......................................................................... 23

2.5.1. Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn ................................... 23

2.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ................................................... 24

2.5.3. Phương pháp khuyếch đại DNA tổng số bằng kỹ thuật PCR ..................... 25

2.5.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ................................................. 26

2.5.5. Phương pháp thiết kế vector tách dòng promoter ................................. 26

2.5.6. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến ............... 27

2.5.7. Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp ....................................... 27

2.5.8. Phương pháp tách chiết plasmid ........................................................... 28

2.5.9. Phương pháp định lượng DNA ............................................................. 29

2.5.10. Phương pháp xác định trình tự ............................................................ 30

2.5.11. Thiết kế vector biểu hiện GUS ............................................................ 30

2.5.12. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium ................................ 31

2.5.13. Phương pháp chuyển gene trên cây Arabidopsis ................................ 32

2.5.14. Phương pháp đánh giá hoạt động của promoter ............................... 33

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 34

3.1. Sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn lúa ................................................... 34

3.2. Tách dòng và thiết kế vector .................................................................... 36

3.3. Kết quả nghiên cứu chuyển gene và phân tích biểu hiện gen GUS ......... 38

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

4.1. Kết luận .................................................................................................... 42

4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 43

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

PHỤ LỤC ....................................................................................................... 43

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TỪ VIẾT TẮT VIẾT ĐẦY ĐỦ

Cauliflower mosaic virus CaMV

RNA polymerases ARN pol

Transcription factor TF

TATA box binding protein TBP

Cis regulatory element CRE

Intron mediate enhancement IME

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Auxin response factors ARF

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện bất lợi . 16

Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 22

Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR ...................................................... 25

Bảng 2.3. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid ......................................... 28

Bảng 3.1. Các gene chuyên biệt hạt phấn lúa và vùng promoter tương ứng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

trong nghiên cứu .............................................................................................. 35

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình thái hoa và hạt phấn Arabidopsis trong điều kiện stress nhiệt

độ cao. ............................................................................................................. 18

Hình 2.1. Sơ đồ miêu tả phản ứng BP ghép nối gene và vector tách dòng .... 27

Hình 2.2. Sơ đồ miêu tả phân tử DNA tham gia vào phản ứng LR ................ 31

Hình 3.1. Bản đồ nhiệt thể hiện mức độ biểu hiện của các gene RMP ở hạt

phấn.. ............................................................................................................... 36

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% để

sàng lọc khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR201 và vector

chuyển gene pKGWFS7 .................................................................................. 38

Hình 3.3. Cấu trúc vector chuyển gene mang promoter RMP ........................ 38

Hình 3.4. Kết quả phân tích cây chuyển gene bằng PCR với cặp mồi GUS-

F/GUS-R .......................................................................................................... 39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.5. Biểu hiện của gene GUS ở cụm hoa cây chuyển gene ................... 41

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Ngày nay, khoa học kĩ thuật phát triển vượt bậc gắn liền với đời sống

con người, hiện diện trong mọi lĩnh vực với mục đích nâng cao chất lượng

cuộc sống. Công nghệ sinh học ra đời đánh dấu bước tiến mới nhất trong nỗ

lực lâu dài chinh phục tự nhiên của con người trước những biến đổi khí hậu

diễn biến bất thường như nắng nóng, lạnh, lũ lụt, hạn hán diễn ra với mức độ

ngày càng thường xuyên và gay gắt hơn, ảnh hưởng nghiêm trọng đến con

người và sinh vật trên Trái Đất. Nước ta là một nước nông nghiệp truyền

thống, vì vậy việc phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học được tập trung

chủ yếu vào nông – lâm – ngư nghiệp, với mục đích đưa nền nông nghiệp

nước ta trở thành nền nông nghiệp hiện đại, ứng dụng khoa học kĩ thuật vào

sản xuất để tăng chất lượng, năng suất sản phẩm, giảm thiểu sức lao động của

con người. Một trong những đối tượng nghiên cứu nhiều nhất của Công nghệ

sinh học ứng dụng trong nông nghiệp là cây lúa – loại cây có tầm quan trọng

trong phát triển sản xuất nông nghiệp. Nhiều nghiên cứu cho thấy hạt phấn –

chính là mục tiêu cho nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng thích ứng với biến

đổi khí hậu. Hạt phấn là cơ quan sinh sản quan trọng của cây trồng, liên quan

trực tiếp đến năng suất. Hạt phấn thường rất nhạy cảm với điều kiện ngoại

cảnh của môi trường, đặc biệt là nhiệt độ. Quá trình hình thành và phát triển

của hạt phấn được kiểm soát bởi nhiều gene với các vai trò khác nhau. Kết

quả phân tích cơ sở dữ liệu microarry từ các mẫu lúa đã xác định được 1080

gene biểu hiện chuyên biệt cho hạt phấn, trong đó có 410 gene biểu hiện ở

giai đoạn đầu hình thành bào tử (early-microspore) và 672 gene ở giai đoạn

hạt phấn trưởng thành (late pollen). Đến nay đã có nhiều gene liên quan đến

quá trình phát triển của hạt phấn lúa được xác định và đánh giá như OsSCP,

OsCP1, OSIPA [40]. Promoter là trình tự nucleotide nằm trước gene phía đầu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

5’ tính từ điểm khởi đầu phiên mã (TTS), đóng vai trò quan trọng trong việc

điều khiển hoạt động phiên mã của gene để tổng hợp protein, nó được xem

như một trong những yếu tố chủ đạo trong nghiên cứu biểu hiện gene. Vì vậy

việc phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn có ý

nghĩa vô cùng quan trọng trong công tác nghiên cứu và chọn tạo giống tăng

khả năng chống chịu stress của môi trường. Xuất phát từ những lý do trên tôi

tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và đánh giá hoạt động của promoter

chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa (Oryza sativa L.)".

1.2. Mục đích nghiên cứu

Phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ

cây lúa (Oryza sativa L.) nhằm cung cấp các thông tin về promoter chuyên

biệt hạt phấn để phục vụ cho công tác nghiên cứu, chọn tạo giống cây trồng

thích ứng với biến đổi khí hậu.

1.3. Ý nghĩa của luận văn

1.3.1. Ý nghĩa khoa học

Đề tài tạo cơ sở lý luận cho việc chọn lọc, phục tráng để nâng cao tiềm

năng di truyền của các giống lúa chịu hạn trong sản xuất, phục vụ nghiên cứu

chọn tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn

gene lúa chịu hạn ở mức phân tử bằng cách điều khiển gene liên quan đến hạt

phấn dựa trên các thông tin về promoter chuyên biệt hạt phấn.

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt

phấn từ cây lúa (Oryza sativa L) góp phần nâng cao hiệu quả công tác bảo tồn

và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất cao, có khả năng thích

ứng với stress của môi trường, phù hợp với điều kiện canh tác lúa vùng khô

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

hạn và cơ cấu sản xuất lúa chịu stress như nắng nóng, nhiệt độ cao ở Việt Nam.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vai trò của cây lúa

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng có khả năng thích

nghi rất tốt với điều kiện khí hậu khô nóng rất khắc nghiệt được trồng chủ yếu

ở Châu Á, đặc biệt là khu vực Đông Nam Á trong đó có Việt Nam. Lúa gạo là

nguồn lương thực chủ yếu nuôi sống hàng tỷ người trên thế giới [25]. Sản

lượng lúa gia tăng trong thời gian qua đã mang lại an ninh lương thực cho con

nguời, đặc biệt đối với dân nghèo: gạo là nguồn cung cấp thức ăn chủ yếu.

Các nước nghèo thường dùng gạo là nguồn lương thực chính, khi thu nhập

tăng lên mức tiêu thụ gạo có xu hướng giảm xuống, thay thế bằng các loại

thức ăn cung cấp nhiều protein và vitamin hơn. Bangladesh và Thái Lan có

mức tiêu thụ gạo cao nhất vào những năm 1960 (tương đương 180

kg/người/năm), đến năm 1988 giảm xuống còn khoảng 150 kg. Ở Việt Nam

hiện nay mức tiêu thụ gạo bình quân vẫn còn ở mức cao, khoảng 120

kg/người/năm. Tuy nhiên có thể nói, trên khắp thế giới, ở đâu cũng có dùng

đến lúa gạo hoặc các sản phẩm từ lúa gạo. Khoảng 40% dân số trên thế giới

lấy lúa gạo làm nguồn lương thực chính. Trên thế giới có hơn 110 quốc gia có

sản xuất và tiêu thụ gạo với các mức độ khác nhau. Lượng lúa được sản xuất

ra và mức tiêu thụ gạo cao tập trung ở khu vực Châu Á.

Lúa là cây trồng thân thiết, lâu đời nhất của nhân dân ta và nhiều dân tộc

khác trên thế giới, đặt biệt là các dân tộc ở Châu Á. Mặc dù năng suất lúa ở

các nước Châu Á còn thấp nhưng do diện tích sản xuất lớn nên Châu Á vẫn là

nguồn đóng góp rất quan trọng cho sản lượng lúa trên thế giới (trên 90%).

Các quốc gia dẫn đầu về sản lượng lúa theo thứ tự là Trung Quốc, Ấn Độ,

Indoniesia, Bangladesh, Việt Nam, Thái Lan và Myanmar, tất cả đều nằm ở

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Châu Á. Như vậy, có thể nói Châu Á là vựa lúa quan trọng nhất thế giới. Gạo

là thức ăn giàu dinh dưỡng. So với lúa mì, gạo có thành phần tinh bột và

protein thấp hơn, nhưng năng lượng tạo ra cao hơn do chứa nhiều chất béo

hơn. Ngoài ra, nếu tính trên đơn vị 1 hecta, gạo cung cấp nhiều calo hơn lúa

mì do năng suất lúa cao hơn nhiều so với lúa mì. Giả sử một người trung bình

cần 3200 calo mỗi ngày thì một hecta lúa có thể nuôi 2055 người/ngày hoặc

5,63 người/năm, trong khi lúa mì chỉ nuôi được 3,67 người /năm, bắp 5,3

người/năm. Hơn nữa, trong gạo lại có chứa nhiều acid amin, thiết yếu như:

Lysine, Threonine, Methionine, Tryptophan… hơn hẳn lúa mì. Đối với một số

quốc gia như Việt Nam, Thái Lan, Miến Điện (Myanmar), Ai Cập lúa gạo

chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân, không phải chỉ là

nguồn lương thực mà còn là nguồn thu ngoại tệ để đổi lấy thiết bị, vật tư cần

thiết cho sự phát triển của đất nước. Điều này chỉ rõ vị trí của lúa gạo trong cơ

cấu lương thực thế giới và trong đời sống kinh tế quốc tế.

Việt Nam là một trong những nước có nghề truyền thống trồng lúa nước

cổ xưa nhất thế giới. Nông nghiệp trồng lúa vừa đảm bảo an ninh lương thực

quốc gia, vừa là cơ sở kinh tế sống còn của đất nước. Dân số nước ta đến nay

hơn 90 triệu người, trong đó dân số ở nông thôn chiếm gần 80% và lực lượng

lao động trong nghề trồng lúa chiếm khoảng 70% lực lượng lao động cả nước.

Điều đó cho thấy lĩnh vực nông nghiệp trồng lúa thu hút đại bộ phận lực

lượng lao động cả nước, đóng vai trò rất lớn trong nền kinh tế quốc dân. Bên

cạnh đó, ưu thế lớn của nghề trồng lúa còn thể hiện rõ ở diện tích canh tác

trong tổng diện tích đất nông nghiệp cũng như tổng diện tích trồng cây lương

thực. Ngành trồng trọt chiếm 4/5 diện tích đất canh tác trong khi đó lúa giữ vị

trí độc tôn, gần 85% diện tích lương thực. Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp

và phát triển Nông thôn, diện tích trồng lúa khoảng 7,8 triệu ha tập trung ở 2

vùng trồng lúa chính là đồng bằng sông Cửu Long (5,29 triệu ha) và đồng

bằng sông Hồng (2,51 triệu ha) với sản lượng lúa cả năm 2014 ước tính đạt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

44,84 triệu tấn, năng suất bình quân đạt 57,4 tạ/ha [2]. Như vậy bên cạnh sự

thu hút về nguồn lực con người thì sự thu hút nguồn lực đất đai cũng lại

khẳng định rõ vị trí của lúa gạo trong nền kinh tế quốc dân. Trong những năm

gần đây, Việt Nam có tổng sản lượng lúa hàng năm đứng thứ 5 trên thế giới,

nhưng lại là nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 2 thế giới hiện nay với sản

lượng gạo xuất khẩu bình quân trên dưới 4 triệu tấn/năm. Thái Lan luôn là

nước xuất khẩu gạo dẫn đầu thế giới, cao hơn Việt Nam cả về số lượng và giá

trị, do có thị trường truyền thống rộng hơn và chất lượng gạo cao hơn. Mỹ,

Ấn Độ, Pakistan cũng là những nước xuất khẩu gạo quan trọng, sau Việt

Nam. Hiện nay, Việt Nam đứng hàng thứ 6 thế giới về diện tích gieo trồng

lúa. Hạt gạo Việt Nam chẳng những đủ bảo đảm yêu cầu về an ninh lương

thực trong nước mà còn góp phần rất quan trọng trong thị trường lúa gạo thế

giới [2].

1.2.Tổng quan về promoter

1.2.1. Khái niệm về promoter

Promoter là trình tự nucleotide cần thiết để ARN pol bám vào khởi động

quá trình phiên mã. Trình tự này nằm ngay trước vị trí (+1) ở các hệ gene của

prokaryotes (sinh vật nhân sơ). Trong khi đó promoter ở hệ gene của

eukaryotes (sinh vật nhân chuẩn) thường gồm vị trí nhận biết bởi ARN pol và

các trình tự đặc biệt nhận biết bởi yếu tố phiên mã. Đó là do phiên mã trên

gene của sinh vật nhân sơ có thể xảy ra ngay khi một mình ARN pol bám vào

promoter trong khi điều này hầu như không xảy ra với các gene của sinh vật

nhân chuẩn [6].

Trình tự cơ bản của promoter (code promoter) thường gồm các

nucleotide ở vị trí -10 đến vài nucleotide sau +1 đối với gene ở sinh vật nhân

sơ hoặc gồm các nucleotide ở vị trí - 40 đến + 20 đối với gene của sinh vật

nhân chuẩn. Hầu hết các trình tự gene sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn đều có

chứa một đoạn ngắn giàu A- T gọi là hộp TATA. Hộp TATA thường ở vị trí -

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

10 ở promoter sinh vật nhân sơ nhưng phân bố ở vị trí - 25 ở promoter sinh

vật nhân chuẩn. Khi promoter chỉ có trình tự cơ bản thì mức độ phiên mã xảy

ra rất thấp, tuy nhiên sẽ tăng lên rất nhiều khi có thêm trình tự nằm phía trước

trình tự cơ bản. Trình tự thứ hai này thường nằm ở vị trí - 35 đối với gene sinh

vật nhân sơ, hoặc vị trí - 70 đến - 90 ở gene sinh vật nhân chuẩn [6].

Promoter của gene ở sinh vật nhân chuẩn mã hóa cho protein được nhận

biết bởi ARN pol II khi mà hầu hết các yếu tố phiên mã đã có mặt ở promoter.

Phiên mã ở sinh vật nhân chuẩn cũng đòi hỏi các trình tự tăng cường enhancer

đặc thù cho từng gene hoặc nhóm gene, có thể nằm phía trước, sau hoặc ngay

trong gene để tăng cường mức độ phiên mã trên promoter [6].

1.2.2. Phân loại promoter

a. Promoter không đặc hiệu

Promoter không đặc hiệu hay còn gọi là promoter cơ định (constitutive

promoter) tham gia điều khiển quá trình biểu hiện gene ở tất cả hoặc hầu như

tất cả các loại mô khác nhau trong tất cả hay hầu như mọi giai đoạn phát triển

của sinh vật. CaMV35S promoter điều khiển sự biểu hiện ARN 35S được

phân lập từ virut khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus – CaMV) là một ví dụ

điển hình của nhóm promoter này. CaMV là một pararetrovirus của các thực

vật thuộc họ cải. Hệ gene của virus này là một phân tử DNA vòng sợi kép có

kích thước 8kb với ba quãng ngắt là sợi đơn, hai bản phiên mã mARN chính

(19S và 35S) và sáu khung đọc mở được mã hóa bởi DNA. Sự phiên mã xảy

ra từ tiểu nhiễm sắc thể vòng và không tiếp hợp trong nhân của tế bào thực

vật và DNA virion được tổng hợp trong tế bào chất thông qua sự phiên mã

ngược của mARN 35S. CaMV35S promoter là trình tự có kích thước vào

khoảng 350 bp nằm ở phía đầu của mARN 35S ( -343 đến +8, với vị trí Cap ở

+1), trong đó khoảng 250 bp gối lên 3% đoạn kết thúc của gene V1, khung

đọc mở cuối cùng trong 6 khung đọc mở lớn. Có 3 vùng trên promoter,

promoter trung tâm chứa hộp TATA (vị trí từ - 46 đến +8) và hai vùng chính

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

khác có chức năng tăng cường. Vùng A (- 90 đến – 46) chủ yếu cần cho biểu

hiện ở rễ và vùng B (- 343 đến – 90) cần cho biểu hiện ở lá [14], [28], [30].

Tiểu vùng của vùng B (B1 đến B5) có thể được nhận dạng dựa trên những

tương tác khác biệt với những nhân tố phiên mã khác nhau. Tuy nhiên, vùng

B hoàn chỉnh cho phép biểu hiện đa dạng hơn so với trường hợp kết hợp các

tiểu vùng. Vai trò của các vùng khác nhau trên CaMV35S promoter trong việc

gây bệnh của CaMV mới được nghiên cứu trong thời gian gần đây [36], [46].

Các nghiên cứu cho thấy việc loại bỏ hộp TATA làm mất khả năng gây

nhiễm. Hai vùng tăng cường tách biệt liên quan đến khả năng gây nhiễm đã

được xác định là (- 207 đến – 150) và (- 95 đến – 56). Vùng tăng cường thậm

chí có thể hoạt động theo hướng ngược chiều [4].

b. Promoter đặc hiệu

Promoter đặc hiệu chuyên biệt (specific promoter) với các yếu tố Cis

chuyên biệt điều khiển gene hoạt động ở mẫu mô nhất định. Sự biểu hiện đặc

hiệu là sự biểu hiện các sản phẩm của gene giới hạn ở một hoặc một vài mô

(hạn chế về không gian – spatial limitation) hoặc ở một vài giai đoạn phát

triển (đặc hiệu thời gian – temporal limitation). Cần nhấn mạnh rằng không có

một promoter hoàn toàn đặc hiệu: các promoter dường như hoạt động ở một

số mô, trong khi ở một số mô khác không hoặc chỉ hoạt động yếu. Hiện tượng

này được biết đến là sự biểu hiện yếu. Promoter đặc hiệu mô (tissue specific

promoter): Các loại promoter đặc hiệu mô chỉ điều khiển biểu hiện gene ở

những mô nhất định, ví dụ promoter đặc hiệu rễ [18], promoter đặc hiệu bó

mạch thực vật, promoter đặc hiệu hoa. Thuộc nhóm promoter này có

promoter điều khiển biểu hiện gene mã hóa sucrose synthase. Sucrose

synthase là một trong những enzyme quan trọng tham gia vào mọi hoạt động

sống của tế bào. Ở lúa, người ta đã phát hiện được ba gene cùng mã hóa cho

sucrose synthase (Rsuc 1, Rsuc2, Rsuc3) [48]. Tuy nhiên mức độ biểu hiện

của các gene này ở các mô là khác nhau. Gene Rsuc2 không có tính đặc hiệu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

mô cao. Gene Rsuc3 đặc hiệu cao ở hạt [31]. Chỉ có gene Rsuc1 biểu hiện đặc

hiệu ở bó mạch, rễ, mầm. Kích thước của gene Rsuc1 là 8167 bp, trong đó

kích thước của vùng 5’ tương đối lớn, chiếm khoảng 3kp. Promoter của Rsuc1

chứa các trình tự đặc trưng của một promoter như hộp TATA, hộp

CCAAT…và các trình tự đặc hiệu, quyết định sự biểu hiện gene đặc hiệu bó

mạch như hộp ASL, hộp GAGA…[47].

c. Promoter cảm ứng

Là promoter cảm ứng với môi trường (environmentally inducible

promoter) chỉ điều khiển gene hoạt động trong các điều kiện nhất định. Chẳng

hạn trong các điều kiện cực đoan (stress) như hạn, nhiệt độ quá cao hoặc quá

thấp, oxy hóa cao, nồng độ muối quá cao…các gene chống chịu thường biểu

hiện với tốc độ rất nhanh. Vì vậy vấn đề khởi động sự phiên mã cũng như cấu

trúc promoter của chúng và các protein tham gia vào việc điều khiển biểu hiện

gene thông qua việc nhận biết và hoạt hóa quá trình khởi động phiên mã được

đặc biệt quan tâm [4].

Để nâng cao hiệu quả, các nhà khoa học đã sàng lọc promoter theo các

hướng điều khiển khác nhau tùy mục đích nghiên cứu, bao gồm: (i) promoter

cảm ứng (inducible promoter) chỉ điều khiển gene hoạt động trong điều kiện

nhất định; (ii) promoter cơ định (constitutive promoter) điều khiển gene hoạt

động liên tục ở tất cả các mẫu mô; (iii) Promoter chuyên biệt (specific

promoter) điều khiển gene hoạt động ở mẫu mô nhất định. Trong số các nhóm

trên, promoter cơ định như 35S, actin hay ubiqutin được sử dụng phổ biến

nhất [17]. Tuy nhiên những promoter này thường tạo ra kiểu hình không

mong muốn do hoạt động không định hướng của gene gây ra. Vì thế để khắc

phục điều này các nhà khoa học có xu hướng sử dụng các promoter chuyên

biệt để điều khiển các gene ở các mô, bộ phận theo chủ đích [35].

1.2.3. Điều hòa gene ở sinh vật nhân chuẩn

Hoạt động của gene chịu sự kiểm soát của những cơ chế, ta gọi đó là sự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

điều hòa gene. Những hệ thống điều hòa của các sinh vật nhân sơ và sinh vật

nhân chuẩn có phần nào khác nhau. Nguyên lý chung của sự điều hòa là sự

tổng hợp của một mARN nào đó xảy ra khi sản phẩm của gene là cần thiết và

nó bị kìm hãm khi sản phẩm này là không cần thiết, gọi là cơ chế điều hòa mở

- đóng. Ở các sinh vật nhân chuẩn thì sự đóng hoàn toàn của một gene là hết

sức phổ biến [8].

Tế bào sinh vật nhân chuẩn gồm có hai kiểu phổ biến là những đơn bào

sống tự do như nấm men, tảo và những tế bào ở trong mô có tổ chức. Nhóm

sau khác với nhóm trước và khác với sinh vật nhân sơ ở chỗ môi trường của

các tế bào trong mô thường không có biến đổi lớn theo thời gian. Khi đã biệt

hóa, các tế bào ổn định và sản sinh ra những chất nhất định hoặc với tốc độ

không đổi hoặc phản ứng thích hợp với những thay đổi của môi trường như

hormone và sự thay đổi nhiệt độ. Những sinh vật nhân chuẩn đơn bào sống tự

do và các sinh vật nhân sơ thì chung các đặc điểm điều hòa nhất định mặc dù

tổ chức hệ gene khác nhau. Nói chung, sự điều hòa gene ở sinh vật nhân

chuẩn có một số điểm sai khác đáng chú ý so với sinh vật nhân sơ. Thứ nhất,

ở sinh vật nhân chuẩn thường chỉ có kiểu polypeptide đơn được dịch mã từ

một phân tử mARN hoàn chỉnh, mARN đa gene chỉ có ở sinh vật nhân sơ, do

vậy mà những kiểu operon bắt gặp ở sinh vật nhân sơ không tìm thấy ở sinh

vật nhân chuẩn. Thứ hai, DNA của sinh vật nhân chuẩn liên kết với các histon

tạo thành chất nhiễm sắc và với nhiều protein phi histon, chỉ có một phần nhỏ

là DNA trần, khác với ở sinh vật nhân sơ, một vài protein có mặt trong nhiễm

sắc thể cuộn gập nhưng hầu hết lại tự do. Vì vậy mà những yếu tố điều hòa có

thể tác động trực tiếp lên DNA sinh vật nhân sơ lại không thể xảy ra trên sinh

vật nhân chuẩn. Thứ ba, một phần đáng kể DNA của sinh vật nhân chuẩn bao

gồm những đoạn ngắn nucleotitde được lặp lại hàng trăm đến hàng triệu lần,

một số ít đoạn được lặp lại nối tiếp, nhưng đa số các đoạn lặp lại là không nối

tiếp (phân tán). Trong khi đó ở sinh vật nhân sơ chỉ chứa một vài đoạn lặp lại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

không kể các gene rARN, tARN và một số đoạn nhất định của các gene khởi

đầu. Thứ tư, một phần lớn các đoạn base ở sinh vật nhân chuẩn không được

dịch mã, gọi là các intron. Thứ năm, các sinh vật nhân chuẩn có những cơ chế

nhằm sắp xếp lại các đoạn DNA nhất định theo một cách có kiểm soát và để

làm tăng số lượng bản sao của các gene đặc trưng khi cần thiết, điều này thì ít

có ở sinh vật nhân sơ. Thứ sáu, mối tương quan giữa các base và các acid

amine thường không đồng tuyến tính ở sinh vật nhân chuẩn, các intron có mặt

ở hầu hết các gene và ARN thì thường phải được biến đổi trước khi bắt đầu

dịch mã. Thứ bảy là ở sinh vật nhân chuẩn ARN được tổng hợp trong nhân và

phải được vận chuyển qua màng nhân ra tế bào chất để sử dụng và điều này

thì không xảy ra ở sinh vật nhân sơ [8].

Điều hòa biểu hiện gene ở sinh vật nhân chuẩn là quá trình điều hòa

phiên mã và điều hòa dịch mã với các bước cơ bản sau:

1. Tổng hợp ARN tiền thân

2. Cải biến sau phiên mã

3. Phân giải mARN

4. Tổng hợp protein

5. Cải biến sau dịch mã

6. Hướng đích và vận chuyển

7. Phân giải protein

Điều hòa phiên mã

ARN pol xúc tác cho quá trình phiên mã nhưng sự hoạt động của

enzyme này chịu sự phụ thuộc của một số nhân tố khác, trong đó có một số

loại protein đặc biệt gọi là nhân tố phiên mã, thuật ngữ tiếng Anh là

“transcription factor” (TF). Đoạn DNA tham gia vào quá trình điều hoà biểu

hiện gene, có cấu trúc gồm hai phần đối xứng nhau, được gọi là trình tự cis.

Trình tự này nằm ở phần điều hành, là nơi tiếp nhận các protein điều hoà

(nhân tố trans). Đặc điểm cấu tạo chung của nhân tố trans là chúng bao gồm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

hai vùng cấu trúc: vùng chịu trách nhiệm gắn nhân tố trans vào trình tự cis và

vùng tác động lên sự phiên mã. Các vùng cấu trúc chức năng này là độc lập

với nhau. Ngoài hai vùng chính kể trên, nhiều nhân tố trans còn có một số

vùng phụ khác. Nhân tố trans gắn vào trình tự cis của DNA nhờ các liên kết

yếu và nó tác động lên sự phiên mã, làm khởi sự phiên mã và đạt tốc độ cao.

Nhân tố trans có thể là một hormone hay một protein điều hoà. Hoạt động của

ARN pol gắn liền với trạng thái của promoter, là kết quả của sự tương tác trực

tiếp giữa các loại TF khác nhau. Có một số TF khi tương tác với promoter thì

đóng vai trò thúc đẩy, một số khác thì lại có tác dụng kìm hãm sự hoạt động

của polymerase. Cũng có nhiều promoter gắn liền với các vùng DNA hoặc có

tác dụng thúc đẩy quá trình phiên mã gọi là yếu tố tăng cường, hoặc có tác

dụng kìm hãm quá trình phiên mã gọi là yếu tố kìm hãm. Yếu tố tăng cường

có thể nằm ngay trước promoter hoặc nằm cách hàng ngàn base về phía trước

hoặc phía sau promoter mà vẫn thực hiện được chức năng của mình, còn yếu

tố kìm hãm dù nằm cách xa promoter thì vẫn gây tác dụng. Các TF cũng có

thể tương tác với các yếu tố tăng cường, do vậy ta có thể coi tác động của TF

đến ARN pol là khâu đầu tiên trong quá trình điều hòa phiên mã [29].

Ở sinh vật nhân chuẩn có tới 3 loại ARN pol. ARN pol II xúc tác cho

quá trình tổng hợp mARN. Hoạt động của ARN pol II chịu sự tác động của

hai nhóm nhân tố phiên mã: các nhân tố phiên mã chung, liên quan đến hầu

hết các gen của ARN pol II theo kiểu tác động lên hộp TATA hoặc với các

nhân tố khác hay lên chính ARN pol, và các nhân tố phiên mã gene đặc hiệu -

chúng bám vào các trình tự base đặc hiệu như kiểu hộp GC hoặc hộp CAAT

có trong promoter của động vật có vú, hoặc vào các yếu tố tăng cường. ARN

pol II nhận biết các vùng điều hòa hoạt đông cis gồm một promoter và một

hoặc nhiều enhancer, promoter chứa vị trí mở đầu và hộp TATA, các

enhancer thì nằm cách xa gen đích đôi khi được gọi là vị trí hoạt hóa ngược

dòng (upstream activation site). Nghiên cứu ở sinh vật nhân chuẩn bậc cao,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

bao gồm cả động vật có vú cho thấy rằng ARN pol hoạt động được là do sự

trợ giúp của ít nhất 6 nhân tố phiên mã chung được ký hiệu là TF II A, B, D,

E, F và H (TF II = TF fol pol II), trong đó TF II D đã được nghiên cứu kĩ nhất

gồm nhiều tiểu phần polypeptide, trong đó quan trọng nhất là loại protein có

khả năng bám vào hộp TATA, viết tắt là TBP (TATA box binding protein).

TBP bám vào hộp TATA và kéo theo các phần còn lại theo nó. ARN

polymerase II cùng với tất cả các nhân tố phiên mã trên tạo thành phức hệ

khởi đầu phiên mã [8]. ARN pol I xúc tác cho quá trình tổng hợp rARN. Các

gen rARN mang những đoạn lặp kế tiếp trên trên một hoặc nhiều nhiễm sắc

thể. ARN pol I phiên mã một bản phiên mã sơ cấp, sau đó bẻ gãy thành hai

tiểu đơn vị 28s và 5,8s. Phức hợp tiền khởi đầu phiên mã ở các promoter của

ARN pol I đơn giản hơn nhiều so với của ARN pol II, bao gồm pol I và hai

nhân tố phiên mã có tên là SL1 và UBF (upstream binding factor) có chức

năng bám ở phía trước. Bản thân pol I và SL1 không thể tự bám vào promoter

được, UBF bám vào một nhân tố kiểm soát nằm ở phía trước là UCE

(upstream control element) của promoter rARN. Nhờ vậy mà SL1 gắn được

vào phức hệ, làm cho pol I bám được chặt hơn và tạo ra phức hệ tiền khởi đầu

phiên mã. ARN pol III phiên mã các tARN và các ARN nhỏ khác (5s rARN,

snARNs). Giống như promoter của ARN pol I, promoter của ARN pol III

cũng không có hộp TATA [8].

Sau khi được phiên mã, phân tử tiền thân mARN ở sinh vật nhân chuẩn

phải trải qua ba thay đổi cơ bản trước khi được dùng làm khuôn để tổng hợp

protein. Trước tiên, mARN được gắn mũ m7G vào đầu 5’, gắn đuôi polyA

vào đầu 3’ và cắt nối intron - exon thành phân tử mARN hoàn chỉnh. Phản

ứng methyl hóa tạo cấu trúc mũ giúp cho ribosome nhận biết được phân tử

mARN và bám vào nó. Cấu trúc mũ còn giúp bảo vệ đầu 5’ của mARN không

bị phân cắt bởi exonuclease. Phản ứng gắn đuôi polyA (≈200A ) vào các phân

tử mARN ở sinh vật nhân chuẩn xảy ra trong nhân tế bào, khi bị chuyển ra tế

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

bào chất thì đuôi này bị ngắn dần, tuy nhiên trong thực tế không phát hiện

được đuôi polyA nào ngắn hơn 30A. Do đó đuôi polyA ngắn nhất để phân tử

mARN không bị phân hủy có thể là 30A. Đặc biệt để đảm bảo độ bền vững

của đuôi, các nucleotide còn được thêm vào. Nói chung việc thay đổi độ dài

đuôi polyA được kiểm soát rất chặt chẽ. Các mARN sinh vật nhân chuẩn khá

bền vững. Các mARN kém bền do chúng mang các đoạn nucleotide đặc biệt

tại đầu 3’ kích thích sự phân hủy mARN. Khi đoạn nucleotide giàu A và U ở

vùng 3’ không dịch mã của phân tử mARN kém bền được ghép với một số

phân tử mARN bền vững khác thì những phân tử này trở nên kém bền do đuôi

poly A bị cắt ngắn rất nhanh. Như vậy đoạn nucleotide giàu AU kích thích sự

phân hủy mARN thông qua việc giảm độ dài đuôi polyA. Ngoài ra, một số

mARN có chứa vị trí đặc hiệu ở đầu 3’ được nhận biết bởi endonuclease.

Thông thường, các protein giữ vai trò chủ đạo kiểm soát quá trình phiên mã

cũng như dịch mã, tuy nhiên hoạt động của một số gene lại được điều khiển

bởi các ARN có kích thước nhỏ 21 - 27 nucleotide được hình thành khi số

lượng mARN của gene đích tăng quá mức trong tế bào gọi là miARN sẽ tạo

ra phức phân cắt mARN hoặc ức chế ribosome tổng hợp protein.

Điều hòa dịch mã

Ở sinh vật nhân sơ, số lần dịch mã của hầu hết các phân tử mARN đều

giống nhau, chỉ có sự thay đổi nhỏ từ gene này tới gene khác. Ở sinh vật nhân

chuẩn, sự dịch mã đôi khi được điều hòa gồm các kiểu kiểm soát một phân tử

mARN không được dịch mã khi chưa nhận được tín hiệu, điều hòa thời gian

sống của một phân tử mARN nhất định, điều hòa tốc độ tổng hợp toàn bộ

protein [8].

1.2.4. Ứng dụng promoter trong công nghệ gene thực vật

Promoter đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển gene nói chung

và chuyển gene ở thực vật nói riêng. Việc chuyển gene ở các giống cây có ý

nghĩa kinh tế thường rất khó, vì vậy cần phải thử nghiệm tiềm năng biểu hiện

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

của gene chỉ thị chọn lọc với các promoter khác nhau. Nhiều promoter được

dùng trong chuyển gene thực vật đã được nghiên cứu và sử dụng có hiệu quả.

Promoter 35s của virus khảm CaMV hoặc PiMV và promoter NOS thường

được sử dụng. Promoter 35s có tiềm năng cao và thường được sử dụng nhiều

trong các thiết kế vetor chuyển gene. Các promoter cảm ứng có vai trò đối với

quá trình biểu hiện các gene chuyển nạp trong những điều kiện cảm ứng như

các gene chống lại quá trình oxy hóa giúp cho cây chống lại các stress hiếu

khí hay gene kháng kháng sinh tạo ra do nhiệt độ để chọn các đột biến trong

việc tạo ra tín hiệu ở chu trình chuyển hóa các chất dưới tác dụng của nhiệt.

Một số các promoter cảm ứng khác cũng được nghiên cứu promoter sốc nhiệt,

chuỗi khởi động cảm ứng nitrate từ gen nitrite reductase [10] và các promoter

cảm ứng hormone.

Do các mối quan tâm ngày càng nhiều về việc sử dụng thực vật như là hệ

thống mẫu để phát triển sinh học phân tử, nhiều gene và các chuỗi khởi động

liên quan được mô tả. Các gene này được biểu hiện trong các loại mô hay

trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây như các gene biểu hiện ở hạt

phấn, ở hoa [48], ở rễ và ở thân [14].

Các nghiên cứu về gen ubiquitin ở thực vật đã phát hiện ra một số lượng

lớn các nhóm promoter có sự biểu hiện mạnh ở thực vật. Polybiquitin

promoter được phân lập và xác định đặc tính từ cây ngô, cây thuốc lá, cây

hướng dương, khoai tây, cà chua, lúa, mía đường và đậu tương. Đa số các

promoter này điều khiển ở mức độ cao hơn so với promoter CaMV35s trong

quá trình biểu hiện ở các loài thực vật chuyển gene. Do gene Ubiquitin được

biểu hiện ở hầu hết các mô thực vật trong điều kiện tự nhiên, nên promoter

ubiquitin đã được sử dụng để biểu hiện gene trong các loại thực vật chuyển

gene đặc biệt là giữa các loài gần gũi. Sự biểu hiện mạnh của promoter

ubiquitin được chi phối bởi sự xuất hiện của các đoạn intron, những đoạn chủ

yếu định vị trong vùng 5’ không dịch mã của gene ubiquitin [34], [44]. Các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

đoạn intron gần với bộ ba khởi đầu dịch mã là những nhân tố cis quan trọng,

là nguyên nhân gây ra sự tăng cường gián tiếp có liên quan đến intron (intron

– mediate enhancement - IME) của quá trình biểu hiện gene ở thực vật…[15].

Ngày nay ubiquitin promoter và actin promoter của lúa thường được sử dụng

để biểu hiện gene ở cây một lá mầm. Trong đó ubiquitin promoter được thử

nghiệm trong quá trình điều khiển biểu hiện gene ở cây ngô, lúa, đậu

tương…[27], [34].

1.2.5. Vai trò của yếu tố điều hòa Cis

Yếu tố điều hòa cis định vị trên vùng điều hòa của promoter, là vị trí

nhận biết của yếu tố phiên mã, tham gia điều hòa biểu hiện của gene đáp ứng

với các điều kiện bất lợi [3]. Việc phát hiện ra yếu tố điều hòa cis (cis

regulatory element, CRE) nằm trong trình tự của promoter của gene được coi

là một thành công trong việc giải mã toàn bộ cơ chế điều hòa phiên mã của

gene. Rất nhiều kết quả thu được gần đây đã khẳng định sự tham gia của CRE

trong con đường dẫn truyền tín hiệu điều khiển các quá trình sinh học diễn ra

trong tế bào. Nhiều nghiên cứu liên quan đến CRE đã cung cấp những dẫn

liệu khá đầy đủ về chức năng của chúng vào sự phát triển của cây trồng. Một

số yếu tố điều hòa cis quan trọng đã được tìm ra như ABRE cảm ứng

với ABA, MYBRS và MYCRS đáp ứng hạn, DRE và LTRE cảm ứng với

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

nhiệt độ… (Bảng 1.1).

Bảng 1.1. Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện

bất lợi [3].

Yếu tố

điều hòa

Trình tự bảo thủ

Chức năng

cis

ABRE

CCACGTGG

Tham gia vào quá trình đáp ứng với ABA.

MYBRS

(A/C)ACC(A/T)A(A/C)C

Tham gia vào quá trình đáp ứng hạn.

Tham gia vào quá trình đáp ứng sớm với điều

MYCRS

CACATG

kiện hạn và cảm ứng với ABA.

Liên quan đến sự đáp ứng với điều kiện

DRE

TACCGACAT

mặn, hạn và nhiệt độ thấp.

ACCGACA;CCGAAA;

Yếu tố đáp ứng nhiệt độ thấp, điều hòa

LTRE

GTCGAC

đáp ứng điều kiện lạnh.

Đặc trưng của các promoter hoạt động cảm ứng stress là có mang các

yếu tố hoạt hóa cis (cis-acting element) đóng vai trò là vị trí liên kết với nhân

tố phiên mã (được kích hoạt bởi các tín hiệu stress) để điều hòa biểu hiện của

các gen liên quan Các yếu tố hoạt hóa cis đáp ứng điều kiện stress được chia

thành 3 nhóm, bao gồm (1)nhóm liên quan tới con đường điều hòa phụ thuộc

hormone ABA như yếu tố cis ABRE (chứa motif –T/CACGTGG với trình tự

lõi ACGT), MYCRS (trình tự nhận biết MYC - CANNTG), MYBRS (trình tự

nhận biết MYB – A/TAACCA và C/TAACG/TG)…, (2) nhóm không phụ

thuộc ABA như yếu tố cis DRE (có trình tự lõi A/GCCGAC)… và (3) liên

quan đến cả hai con đường trên như yếu tố cis NAC (có chứa trình tự lõi

CATGTG), ZFHDRS (chứa một motif bảo thủ TT/AAATT)...[3].

1.3. Vai trò hạt phấn trong nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng thích

ứng với biến đổi khí hậu

Phần lớn chúng ta đều cho rằng các cơ quan sinh trưởng thân, lá dễ bị

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ảnh hưởng bởi stress nhiệt độ và cần được nghiên cứu. Tuy nhiên, những

nghiên cứu mới đây cho thấy cơ quan sinh sản (hoa) khá nhạy cảm với stress,

đặc biệt là hạt phấn. Quá trình phát triển của hạt phấn có thể bị ngừng trệ

ngay cả khi cây ở mức độ stress nhẹ. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy, trong

điều kiện nhiệt độ cao, nhị hoa không có khả năng kéo dài do quá trình tổng

hợp auxin bị ngăn chặn, quá trình giảm phân bị rối loại, tapetum bị tổn

thương dẫn đến hạt phấn không hình thành. Cây không có khả năng kết hạt.

Nhiều nghiên cứu khác cho rằng quá trình trao đổi chất ở hạt phấn bị ảnh

hưởng nghiêm trọng khi gặp stress. Điều này đòi hỏi các nhà khoa học cần

phải hiểu rõ quá trình phát triển của hạt phấn, ảnh hưởng của điều kiện môi

trường đến quá trình này để tìm kiếm nguồn vật liệu thích hợp cho chọn tạo

giống. Các nhà khoa học đang tìm cách giúp cho cây trồng có khả năng thích

ứng mạnh mẽ hơn trong các điều kiện bất lợi. Sàng lọc gene có khả năng

chống chịu với stress nhiệt độ và đưa nó vào cây trồng là một trong những

cách tiếp cập được nhiều nhà khoa học đang tiến hành. Tuy nhiên sự tương

tác giữa nhiệt độ với các quá trình hóa sinh trong cây diễn ra rất phức tạp,

không chỉ ở một hay một nhóm gene mà còn có sự tác động qua lại giữa

chúng. Việc nâng cao sức chống chịu của cây ở giai đoạn sinh trưởng sinh

dưỡng thường dễ dàng hơn. Tuy nhiên kiểm soát gene mục tiêu để tăng cường

sức sống của hạt phấn trong điều kiện stress là cách tiếp cận mới hiện nay.

Trong khi đó promoter chuyên biệt hạt phấn lúa có tính ứng dụng cao như: (i)

tạo các dòng bất dục đực phục vụ cho sản xuất hạt lai khi promoter này kết

hợp với một gene gây bất dục như barnase hoặc bất hoạt gene liên quan đến

quá trình trao đổi chất bằng công nghệ RNAi [13]. (ii) Promoter chuyên biệt

hạt phấn cũng được ứng dụng để kiểm soát các gene liên quan đến quá trình

phát triển của hạt phấn như: tổng hợp đường, tinh bột, hoocmon sinh trưởng

nhằm tăng cường sức chống chịu của hạt phấn trong điều kiện bất lợi như hạn

hán, nóng, lạnh hay các stress của môi trường khác [38]. (iii). Ngoài ra

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

promoter này cũng là công cụ lý tưởng để nghiên cứu chức năng gene,

promoter liên quan đến quá trình phát triển hạt phấn ở thực vật [29]. Gần đây

các nhà khoa học cho rằng hạt phấn là một trong những cơ quan đặc biệt có

thể nâng cao được sức chống chịu trong các điều kiện bất lợi của thời tiết như

nắng nóng hoặc lạnh [26]. Trong nghiên cứu này tiến hành phân lập promoter

chuyên biệt hạt phấn (RMP) từ cây lúa nhằm ứng dụng cho chuyển gene tăng

cường khả năng chống chịu của hạt phấn trong các điều kiện bất lợi của môi

trường ở Việt Nam.

Hình 1.1. Hình thái hoa và hạt phấn Arabidopsis trong điều kiện stress

nhiệt độ cao.

Khi gặp nhiệt độ cao chỉ nhị không thể kéo dài (B) để đưa hạt phấn tiếp

cận với vòi nhụy như trong điều kiện bình thường (A). Hạt phấn bị chết và

không có khả năng giải phóng khỏi bao phấn (D), tuy nhiên trong điều kiện

bình thường (C) hạt phấn dễ dàng ra khỏi bao phấn. Nguồn: A, B: Sakata et

al. 2010; C, D: Nguyen Tien Dung (chưa công bố).

1.4. Phương pháp chuyển gene ở thực vật qua Agrobacterium

Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, thuộc nhóm vi khuẩn yếm khí.

Chi Agrobacterium gồm 4 loài, trong đó A. tumerfaciens có khả năng tạo ra

khối u trong tế bào thực vật thông qua một loại plasmid đặc hiệu gây nên

khối u gọi là Ti-plasmid (tumour inducing) [1], [5]. Ti-plasmid có khả năng

chuyển một số gene chúng mang vào cây trồng khi DNA vi khuẩn được hợp

nhất với nhiễm sắc thể thực vật nó sẽ tấn công vào hệ thống tế bào của thực

vật một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần

thể vi khuẩn đây được coi là hiện tượng chuyển gene tự nhiên.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Agrobacterium có 3 thành phần di truyền cần thiết cho quá trình chuyển gen:

- Vùng T-DNA: là đoạn DNA chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế

bào thực vật. Đặc điểm của vùng này là xâm nhập ổn định vào bộ gene của

cây chủ, không mã hóa cho các sản phẩm trợ giúp quá trình biến nạp, độ dài

thay đổi khác nhau ở các Ti-plasmid tự nhiên và mang rất nhiều gene có thể

biểu hiện trong quá trình chuyển hóa của tế bào thực vật [7], [12].

- Vùng gây độc Vir (Virulence Region): gồm 24 gene vir được sắp xếp

trong 8 operon từ virA đến virH, mỗi operon chứa một số gene. Vùng Vir có vai

trò kích thích việc biến nạp của T-DNA. Trong đó Vir A; B; D; G có ý nghĩa

đặc biệt quan trọng trong quá trình biến nạp ở tế bào thực vật, Vir C; E; F; H có

tác dụng làm tăng cường hiệu quả quá trình biến nạp gene [23], [24].

- Nhiễm sắc thể (NST) của Agrobacterium: Vùng Vir có vai trò chủ yếu

trong quá trình biến nạp T- DNA, tuy nhiên NST của vi khuẩn cũng rất cần

thiết đối với quá trình này. Chúng tác dụng lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, cụ

thể giúp tạo ra exopolysaccarid, chế biến và bài tiết ra ngoài (pscA/exoC,

chvA, hvB) đồng thời gắn vi khuẩn vào tế bào thực vật (tt gens) … Ngoài ra

những gen khác như mia A đóng vai trò thứ yếu hơn trong quá trình biến

nạp [24].

Cơ chế chuyển gene thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens:

Quá trình chuyển T-DNA được bắt đầu ở vị trí biên phải và kết thúc ở vị trí

biên trái. Nếu không có sự định hướng này, hiệu quả của quá trình chuyển

gene sẽ rất thấp [19]. Đoạn T-DNA mang gene muốn được chuyển, trước tiên

nó phải được hoạt hóa nhờ hoạt động của các gene vir. Hiện tượng này xảy ra

khi A. tumerfaciens bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được tiết ra từ

vết thương của cây hoặc từ tế bào nuôi cấy.

Khi nhận được các phân tử tín hiệu từ vết thương thực vật: hợp chất

phenolic (cacbolic acid), acetosyringone (AS), hydroxy acetosyringone (OH-

AS), flavonoid, đường đơn hoặc các tín hiệu khác như pH axit (pH 5 - 5,5),

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

phosphat và opine, làm dẫn dụ Agrobacterium gắn vào thành tế bào thực vật

(AS, OH-AS được tinh sạch từ môi trường nuôi cấy tế bào thuốc lá - giống

như những sản phẩm của chuyển hoá phenyl propanoid - một khâu chủ yếu

trong chu trình tạo các chất thứ cấp như lignin và các chất thơm. Những chất

này rất quan trọng đối với thực vật trong các điều kiện stress và bị thương, ta

gọi là hợp chất dẫn dụ). Trong quá trình tiếp xúc giữa tế bào thực vật và

Agrobacterium, vi khuẩn tạo ra các sợi cellulose và các sợi này kết tụ thành

bó gắn lên bề mặt tế bào thực vật. Quá trình này làm cảm ứng và hoạt hoá

các gene vùng vir. Sự thể hiện gene vir xảy ra nhờ hệ thống truyền cảm ứng

gồm các sản phẩm của virA và virG. Chính các sản phẩm protein của các

gene vir đã làm nhiệm vụ vận chuyển T-DNA. Một số bằng chứng chứng tỏ

T-DNA được vận chuyển tới nhân tế bào thực vật và gắn hoá trị vào genome

thực vật, sau đó, T-DNA được phiên mã nhờ ARN polymerase II [21], [23].

Quá trình chuyển T-DNA cho tế bào thực vật gồm ba sự kiện quan trọng:

• Sự kiện thứ nhất: Hình thành khối u là quá trình biến đổi tế bào thực

vật do xâm nhập và hợp nhất của T-ADN vào tế bào thực vật, sau đó biểu

hiện các gene trong vùng T-DNA.

• Sự kiện thứ hai: Các gene nằm trong vùng T-DNA sao chép trong các

tế bào bị xâm nhiễm và không có vai trò trong quá trình chuyển.

• Sự kiện thứ ba: Vùng DNA lạ đặt giữa các vùng biên của T-DNA có

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thể được chuyển cho tế bào cây trồng.

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu:

Cây lúa Oryza sativa L và cây mô hình Arabidopsis thaliana.

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu

Phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ

cây lúa Oryza sativa L.

2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1. Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Khoa Công nghệ sinh học và Công

nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên.

2.2.2. Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 5/2018 đến tháng 6/2019.

2.3. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu

2.3.1. Vật liệu nghiên cứu

- Vật liệu thực vật: Giống lúa Oryza sativa L. do Phòng Công nghệ tế

bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp; cây mô hình Arabidopsis,

được cung cấp bởi Trung tâm ABRC của trường Đại học Ohio State, Mỹ, và

được nuôi trồng in vitro tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa công

nghệ sinh học, trường Đại học nông lâm Thái Nguyên.

- Các vật liệu khác:

 Cấu trúc vector tách dòng pDONR201

 Hệ thống vector chuyển gene pKGWFS7 mang gene chọn lọc

kanamycin.

 Mồi sử dụng trong nghiên cứu (Bảng 2.1)

 Chủng vi khuẩn chuyển gene Ecoli DH5α của hãng Invitrogen và vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

khuẩn Agrobacterium do phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Công

nghệ Sinh học và công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái

Nguyên cung cấp.

Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu

Gene N

Primer

Sequence (5'-3')

Size

No

name

RMP1-F

AAAAAGCAGGCT AATGAATTTCATTTTCAGAGCGCAGTTGCTTG

1 RMP1

1343 bp

RMP1-R

AGAAAGCTGGGT GTTAATTAGCTAGGCTACAGGGGAGG

RMP2-F

AAAAAGCAGGCT CTTTGTAGCCCGTGGGCTGCTTTTG

2 RMP2

754 bp

RMP2-R

AGAAAGCTGGGT GGTCCCGTACGTCGCACATTTTATAGATG

attB1

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT

3 attB

attB2

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT

2.3.2. Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu được đặt mua từ các hãng

có uy tín như Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Invitrogen (Mỹ).

Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần nền khoáng B5, MS.

Chất dẫn dụ Acetosyringone (AS), chất bổ sung: Yeast extract, L-Cysteine,

trypton, sucrose, agarose… và các thành phần hóa chất trong phân tích sinh

học phân tử được liệt kê theo các hãng sản xuất sau đây:

- Merk: Na2EDTA, NaCL, Tris-HCL, CTAB, Acetosyringone.

- Wako: β-mercaptoethanol, Phenol: Cloroform: Izoamyl alcohol (25:

24: 1), Cloroform:Izoamyl alcohol (24:1), Izopropanol, Ethanol.

- Fermentas: dNTPs, MgCl2, Taq, mồi, PCR buffer.

- Sigma: Agarose, Ethidium bromide (EtBr), Hygromycin.

Môi trường được sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào và nuôi

cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm chuyển gen gồm:

- Môi trường nuôi khuẩn LB đặc

- Môi trường nuôi khuẩn LB lỏng

- Môi trường lây nhiễm RMOP

- Môi trường đồng nuôi cấy RMOP

- Môi trường chọn lọc RMOP

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

- Môi trường ra rễ

2.3.3. Thiết bị thí nghiệm

Các thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm:

- Buồng cấy vô trùng

- Máy đo pH

- Máy đo OD

- Máy ly tâm lạnh

- Máy vortex

- Bể ổn nhiệt

- Máy lắc ổn nhiệt

- Nồi hấp khử trùng

- Máy li tâm lạnh

- Máy điện di

Và các trang thiết bị khác như lò vi sóng, cân điện tử, bình trụ, bình tam

giác, ống eppendorf, đầu côn các loại, pipet, đĩa petri,…của phòng thí nghiệm

khoa công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm

Thái Nguyên.

2.4. Nội dung nghiên cứu

2.4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn.

Dựa trên kết quả phân tích dữ liệu microarray công bố về các gene biểu

hiện trên cây lúa, tiến hành lựa chọn các gene biểu hiện ở hạt phấn cho nghiên cứu.

2.4.2. Nội dung 2: Tách dòng promoter chuyên biệt hạt phấn và thiết kế

vector chuyển gene.

2.4.3. Nội dung 3: Đánh giá hoạt động của promoter trên cây mô hình

Arabidopsis.

2.5. Phương pháp nghiên cứu.

2.5.1. Nghiên cứu sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn

Dựa trên kết quả phân tích dữ liệu microarray database

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/). DNA microarray (còn gọi là DNA

chip hay gene chip) là một tấm thủy tinh hoặc nhựa trên đó có gắn các

đoạn DNA thành các hàng siêu nhỏ. Các nhà nghiên cứu sử dụng các con chip

như vậy để sàng lọc các mẫu sinh học nhằm kiểm tra sự có mặt hàng loạt trình

tự cùng một lúc. Các đoạn DNA gắn trên chip được gọi là probe (mẫu dò).

Trên mỗi điểm của chip có hàng ngàn phân tử probe với trình tự giống nhau.

Các biểu hồ sơ Rice cơ sở dữ liệu (RiceXPro) là một kho lưu trữ hồ sơ biểu

hiện gen có nguồn gốc từ phân tích microarray mô / cơ quan bao gồm toàn bộ

sự phát triển của cây lúa trong điều kiện lĩnh vực tự nhiên, cây lúa được điều

trị bằng phytohormones khác nhau, và các loại tế bào chuyên biệt / mô bị cô

lập bằng microdissection (LMD). Cơ sở dữ liệu này là một phần của dự án

phân tích phiên mã lúa bằng công nghệ microarray nhằm đặc trưng hóa cấu

hình biểu hiện của tất cả các gen dự đoán trên cây lúa và cung cấp thông tin

tham khảo có thể được sử dụng trong bộ gen chức năng. Tất cả các cấu hình

biểu thức được tạo bằng cách sử dụng một nền tảng microarray với các đầu dò

dựa trên các mô hình gen được quản lý thủ công trong RAP-DB và thông tin

trình tự cDNA có độ dài đầy đủ của lúa trong Cơ sở dữ liệu KOME . Một

số cơ sở dữ liệu microarray được quản lý, công khai nhất là: Biểu hiện gen –

NCBI bằng công cụ BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Sử dụng mẫu hạt phấn lúa tiến hành lựa chọn các gene biểu hiện chuyên

biệt ở hạt phấn sử dụng cho nghiên cứu. Gen chuyên biệt hạt phấn là những

gene biểu hiện duy nhất ở hạt phấn, dựa trên bản đồ nhiệt (heat map) biểu

hiện của gen được thể hiện thông qua màu sắc.

2.5.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Sử dụng bộ kit bộ kít DNeasy plant mini kit của hãng Qiagene để tách

chiết DNA tổng số từ hạt phấn lúa. Quy trình tách chiết được tiến hành theo

hướng dẫn của nhà sản xuất (https://www.qiagene.com/dna/geneomic-

dna/dneasy-plant-mini-kit). Các bước tiến hành như sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

- Bao phấn lúa được nghiền bằng máy TissueLyserll trong 30 giây.

- Bổ sung 400 up dung dịch AP1 (10mM Tris – HCl pH8.0; 1mM EDTA

pH8.0) và 4 µl RNase A. Mẫu được trộn đều và ủ ở 65oC trong 10 phút.

- Bổ sung 130 µl AP3, đảo đều sau đó ủ trên đá 5 phút.

- Ly tâm mẫu ở tốc độ 14,000 vòng/phút trong 5 phút.

- Chuyển toàn bộ dịch nổi sang cột lọc và ly tâm ở tốc độ 14,000

vòng/phút trong 2 phút.

- Chuyển cột lọc sang ống mới và bổ sung 650 µl dung dịch AW1, ly

tâm 1 phút ở tốc độ 8,000 vòng/phút.

- Tiếp đến bổ sung 500 up dung dịch AW2, ly tâm 1 phút ở tốc độ 8,000

vòng/phút.

- Hòa tan DNA bằng 100 µl dung dịch AE để sử dụng cho nghiên cứu.

2.5.3. Phương pháp khuyếch đại DNA tổng số bằng kỹ thuật PCR

Vùng promoter nằm phía 5’ trước mã mở đầu ATG của gene được

khuyếch đại từ DNA tổng số bằng phương pháp Gateway PCR với cặp mồi

đặc hiệu RMP (Bảng 2.1) theo thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau:

Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR

Thành phần

STT 1 2 3 4 5 6 7 8 Nước khử ion MgSO4 (25mM) dNTPs (10mM) Mồi xuôi (10pmol/µl) Mồi ngược (10pmol/µl) KOD enzim KOD plus buffer ( 1Unit/ µl) DNA khuôn ( 10 – 20 ng/µl)

Nồng độ 32 µl 4µl 5µl 1µl 1µl 1µl 5µl 1µl 50µl

Tổng thể tích

Phản ứng PCR được tiến hành theo 2 bước: bước 1, phản ứng PCR được

thực hiện với 10 chu kỳ ở điều kiện 95oC/15s, 55oC/30s và 72oC/2min sử

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

dụng cặp mồi đặc hiệu có gắn trình tự adapter attB1 và attB2; bước 2, sử dụng

10 ul sản phẩm PCR ở bước 1 làm DNA khuôn, thực hiện phản ứng ở 25 chu

kỳ theo trình tự như sau: 5 chu kỳ đầu 94oC/15s, 45oC/30s và 72oC/2min ; 20

chu kỳ sau 94oC/15s, 55oC/30s và 72oC/2min.

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE

1X có maker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.

Mẫu DNA thu được cần phải tinh sạch bằng kit tinh sạch HiGene PCR

purification của hãng Solgenet để chuẩn bị cho tách dòng.

2.5.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Quá trình tinh sạch được thực hiện theo HiGene PCR purification của

hãng Solgenet gồm các bước sau:

- Bổ sung Binding Buffer vào sản phẩm PCR, tỉ lệ 1: 1 về thể tích.

- Chuyển sang cột lọc li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút ở 4oC, loại bỏ dịch.

- Bổ sung 700µl Washing buffer, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút.

- Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml, mở nắp 3 phút cho bay cồn.

- Bổ sung 25µl nước khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vòng/phút trong 1

phút, thu dịch. Sản phẩm DNA tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel

agarose 0,8% trong TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực

tím. Bảo quản sản phẩm DNA tinh sạch trong tủ -20oC.

2.5.5. Phương pháp thiết kế vector tách dòng promoter

Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch được gắn vào vector tách dòng

pDONR201 bằng phương pháp Gateway sử dụng enzyme BP clonase. Các

bước tiến hành như sau:

- Thành phần phản ứng

+ DNA (10ng/ul): 2ul

+ Vector (75ng/ul): 1ul

+ BP clonase enzyme: 1ul

Tổng số: 4ul

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

- Ủ ở nhiệt độ phòng 1hr

- Bổ sung 0,5ul proteinase K, ủ ở 37oC trong 10 phút

- Biến nạp vào Ecoli DH5α.

Hình 2.1. Sơ đồ miêu tả phản ứng BP ghép nối gene và vector tách dòng

Nguồn: GATEWAY Cloning Technology Manual.

2.5.6. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến

Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào Ecoli DH5α theo phương

pháp shock nhiệt ở 42oC.

- Lấy tế bào khả biến từ tủ lưu giữ -800C đặt trên đá

- Trộn 2 µl DNA vào 100 µl Ecoli DH5α

- Đặt trên đá 30 phút

- Shock nhiệt ở 42oC trong 40s

- Bổ sung 900 µl môi trường LB lỏng

- Nuôi lắc ở 37oC trong 1h

- Cấy trải 100 µl dung dịch nuôi lắc trên đĩa môi trường LB đặc có

kháng sinh chọn lọc kanamycin.

- Nuôi qua đêm ở 37oC.

2.5.7. Phương pháp sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp

Để sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chúng tôi sử dụng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

phương pháp PCR các khuẩn lạc. Lựa chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc có kích

thước đồng đều sau khi nuôi qua đêm ở 37oC tiến hành PCR với cặp mồi đặc

hiệu. Phương pháp và thành phần phản ứng tương tự ở bảng 2.2, trong đó sử

dụng enzyme Taq DNA polymesase và khuẩn lạc cho phản ứng. Phản ứng

được thực hiện ở 30-35 chu kỳ. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose

0,8% và đọc kết quả dựa trên thang marker chuẩn 1kb. Lựa chọn khuẩn lạc có

kích thước đúng để tiến hành các bước tiếp theo.

2.5.8. Phương pháp tách chiết plasmid

Khuẩn lạc lựa chọn được nuôi qua đêm ở 36oC, 200v/phút trên môi

trường LB đặc (10g Bacto-tryptone, 5g yeast extract, 10g NaCl, 15g agar) có

bổ sung 100mg/l kháng sinh kanamycin để chọn lọc tế bào tái tổ hợp. Tiến

hành thu tế bào để tách plasmid.

Bảng 2.3. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid

Thành phần STT

50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8 Sol I

Sol II 0,2 NaOH, SDS 1 %

60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml Sol III H2O

Các bước tiến hành tách plasmid:

- Lấy 1ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng.

- Ly tâm 7000 v/p thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn

của dịch khuẩn.

- Bổ sung 100 µl Sol I, voltex dịch.

- Bổ sung 200 µl Sol II trộn nhẹ trong 30 giây.

- Bổ sung tiếp 1500 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.

- Bổ sung 500 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút.

- Ly tâm 12000v/p trong 15 phút, thu dịch nổi 400 µl trên sang ống

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

eppendorf mới.

- Cho 400 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -20oC trong 30 phút, ly tâm

12000 v/p trong 15 phút, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.

- Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ

cồn, làm lại hai lần.

- Làm khô mẫu trong box 30 phút.

- Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nước khử ion.

- Bổ sung RNase

- Ủ ở 370C trong 30 phút.

- Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%.

2.5.9. Phương pháp định lượng DNA

Trước khi tiến hành các thí nghiệm, DNA plasmid được kiểm tra nồng

độ bằng máy quang phổ hấp phụ và điện di trên gel agarose 1%.

Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di

chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và

cường độ thích hợp.

Cách tiến hành

- Cân 1g agarose pha trong 100ml dung dịch đệm TAE 0,5X

- Đun nóng dung dịch trong lò vi sóng từ 1-2 phút cho đến khi agarose

tan hoàn toàn sau đó để nguội khoảng 500C.

- Đặt khay đổ gel trên bề mặt phẳng, lắp khay điện di vào khay đổ gel.

- Dùng pipet 1ml hút agarose và trải dọc theo phần thanh chắn nhằm

tránh rò rỉ gel khi đổ. Tiến hành đổ phần gel còn lại từ từ, liên tục để tránh lẫn

bọt, cắm lược và để yên cho gel đông lại.

- Khi gel đã đông, cẩn thận nhấc thanh chắn và đặt gel vào bể điện di

theo đúng chiều (-) đến (+), đổ dung dịch đệm TAE 0,5X ngập bản gel rồi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

nhấc lược ra khỏi bản gel.

- Gắn bể điện di với bộ nguồn, trộn mẫu với Loading Dye 6X theo tỷ lệ

(7µl mẫu : 3µl Loading Dye) và tra mẫu vào giếng. Lưu ý, tra nhẹ nhàng,

tránh làm vỡ giếng gel.

- Đậy nắp máy điện di, cắm điện, bật công tắc máy điện di. Điện di với

dòng điện 110V trong thời gian 30 phút.

- Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyển của

thuốc nhuộm trên gel để dừng quá trình điện di, tắt công tắc nguồn.

- Mở nắp buồng điện di, lấy bản gel ra và ngâm trong dung dịch EtBr

khoảng 5 phút.

- Lấy bản gel ra đem tráng nhẹ trong nước (tránh nước xả trực tiếp vào

bản gel) rồi đưa lên máy soi UV quan sát và chụp ảnh.

2.5.10. Phương pháp xác định trình tự

Để kiểm tra hiệu quả tách dòng RMP promoter, chúng tôi gửi giải trình

tự gene. Trình tự gene được kiểm tra bằng các phần mềm Bioedict,

NCBI/Blast….

2.5.11. Thiết kế vector biểu hiện GUS

Promoter RMP sau khi tách dòng thành công sẽ được chuyển vào vector

biểu hiện pKGWFS7 có chứa gene chỉ thị GFP/GUS sử dụng enzyme LR

clonase. Toàn bộ phản LR được thực hiện theo hướng dẫn của hãng

Invitrogene. Trình tự promoter sẽ được chèn vào vùng ccdB, giới hạn bởi hai

đầu attR1 và attR2 bằng phương pháp Gateway. Các bước tiến hành như sau:

- Thành phần phản ứng:

+ pDOR201-RMP (25ng/ul): 1ul

+ pKGWFS7 (50ng/ul): 1ul

+ LR clonase enzyme: 1ul

+ Nước cất khử ion: 1ul

Tổng số: 4ul

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

- Ủ ở nhiệt độ phòng 1hr

- Bổ sung 0,5ul proteinase K, ủ ở 37oC trong 10 phút

- Biến nạp vào Ecoli DH5α.

Hình 2.2. Sơ đồ miêu tả phân tử DNA tham gia vào phản ứng LR

Nguồn: GATEWAY Cloning Technology Manual.

Sản phẩm phản ứng được biến nạp vào tế bào Ecoli DH5α bằng phương

pháp shock nhiệt và sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng PCR với cặp mồi đặt

hiệu (như trình bày ở mục trên). Tế bào Ecoli DH5α tái tổ hợp được tách

plasmid và biến nạp vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3101 bằng phương

pháp sốc nhiệt ở 37oC để sử dụng cho chuyển gene.

2.5.12. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium

- Lấy tế bào khả biến vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3101 từ tủ lưu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

giữ -80oC

- Trộn 4 µl DNA plasmid với 100 ul tế bào khả biến. Nhúng nhanh vào

Nitơ lỏng

- Chuyển sang 37oC trong 5 phút

- Bổ sung 900 µl LB lỏng , nuôi lắc ở 28oC, 200v/p, 4hr

- Cấy trải 100 µl dung dịch trên đĩa môi trường LB có kháng sinh chọn lọc

- Nuôi ở 28oC từ 3 - 4 ngày

- Sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng phương pháp PCR

2.5.13. Phương pháp chuyển gene trên cây Arabidopsis

Phương pháp được tiến hành theo Clough (1998) [19].

2.5.13.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium: dung dịch chứa

Agrobacterium (5% sucrose và 500 ul/lit chất hoạt động bề mặt Slwet L-77).

Sucrose và chất hoạt động bề mặt rất quan trọng đối với sự thành công của

phương pháp nhúng hoa.

- Lấy chủng khuẩn từ tủ lưu giữ và cấy vạch lên môi trường LB đặc có

bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 100mg/l đối với chủng A.tumerfacien

mang vector chuyển gene chứa cấu trúc pKG7-RMP1 :: GFP/GUS và pKG7-

RMP2 :: GFP/GUS; nuôi trong tủ ổn nhiệt 28ºC trong thời gian 48 giờ.

- Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào

10ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn kanamycin 50mg/l. Bình

nuôi lỏng được đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 28ºC

nuôi qua đêm. Hút 1ml dịch khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng có bổ sung kháng

sinh, nuôi qua đêm (16 - 20 giờ) nuôi lắc 200 v/p trong điều kiện 28oC. Dịch

khuẩn thu được có OD 260nm từ 0,7-1 là đủ điều kiện để biến nạp.

2.5.13.2. Biến nạp gene

Nhúng toàn bộ cụm hoa của cây Arabidopsis vào trong môi trường có

chứa vi khuẩn trong 30 giây. Cây chuyển gene được tiếp tục nuôi trong điều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

kiện 25oC 18h chiếu sáng/ngày đến khi thu hoạch quả.

2.5.13.3. Chọn lọc cây chuyển gene

Hạt thu từ cây chuyển gene được chọn lọc trên môi trường kháng sinh

kanamycin 50mg/l. Cây chuyển gene kháng kháng sinh được chuyển ra trồng

và phân tích.

2.5.14. Phương pháp đánh giá hoạt động của promoter

Phân tích biểu hiện gen chỉ thị GUS ở cụm hoa. Gen gus A. Gen mã

hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-glucuronidase là một

hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm phân giải có

màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất

trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-Gluc (5-bromo-4-

chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác

động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh chàm [9].

Khả năng hoạt động của promoter được đánh giá dựa trên biểu hiện của

gene chỉ thị GUS sau khi nhuộm bằng X-gluc theo phương pháp của Jefferson

(1987).

1. Ngâm mô trong dung dịch nhuộm. Ống microfuge hoạt động tốt cho

các mẫu mô nhỏ, nắp ống màu cam hoạt động tốt hơn cho các mẫu mô lớn hơn.

2. Hút chân không thâm nhập nhanh.

3. Ủ mô qua đêm ở 37oC.

4. Loại bỏ dung dịch nhuộm và diệp lục: rửa vài lần 50% ethanol đến khi

nhận rõ màu xanh lam đặc trưng . Ủ khoảng 12 giờ giữa mỗi thay đổi 50%

ethanol [33].

Sự có mặt của gen GUS được kiểm tra bằng PCR DNA tổng số được

tách từ hạt phấn của 14 cây chuyển gen T1 sử dụng kít DNA Plant Mini Kit

(QIAGEN, Đức) với cặp mồi đặc hiệu: GUS-F:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

5’- TTCGATAACGTGCTGATGG-3’ và GUS-R:

5’- AATAACGGTTCAGGCACAGCACA-3’. PCR theo chu trình nhiệt

94oC/2 phút, 30 chu kỳ (94o C/15 giây, 55o C/ 15 giây, 72o C/1 phút), 72o

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

C/10 phút. Sản phẩm PCR được kiểm tra điện di trên gel agarose 2%.

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Sàng lọc gene chuyên biệt hạt phấn lúa

Dựa vào kết quả phân tích 64 dữ liệu công bố trên microarray database

(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/) với các gene biểu hiện ở hạt phấn lúa chúng

tôi đã xác định được 1.080 gene chuyên biệt cho hạt phấn (gen biểu hiện duy

nhất ở hạt phấn), trong đó có 410 gene biểu hiện ở giai đoạn đầu hình thành

bào tử (early-microspore) và 672 gene ở giai đoạn hạt phấn trưởng thành (late

pollen). Từ dữ liệu này chúng tôi lựa chọn 10 gene ứng viên có biểu hiện

mạnh ở hạt phấn lúa, ký hiệu là RMP (rice microspore preferred gene) từ 1

đến 10 (Hình 3.1 và Bảng 3.1). Mức độ biểu hiện của gene được thể hiện

bằng màu sắc trên bản đồ nhiệt (heat map), dải màu từ đen đến vàng cho biết

mức độ biểu hiện gene từ thấp đến cao (Hình 3.1). Phân tích vai trò của gene

liên quan đến hạt phấn chúng tôi nhận thấy : Gene RMP1 ( Os01g0533400)

mã hóa cho protein Glycoside hydrolase 35 (GH35) có vai trò quan trọng

trong hình thành cấu trúc tế bào [43]. Hiện có khoảng 15 gene mã hóa các

protein nhóm GH35 được xác định ở cây lúa, trong đó có một số gene liên

quan đến biểu hiện ở hạt phấn như OsBgal10, OsBgal11, OsBgal15, AtGAL7

và AtGAL15 [32]. Gene RMP2 (Os04g0561900) mã hóa Peptidase S9A

protein thuộc nhóm prolyl oligopeptidase (POPs) liên quan đến quá trình tổng

hợp hormone tăng cường tính chống chịu của tế bào trong điều kiện stress

[42]. Cho tới nay đã có 23 gene mã hóa cho nhóm protein oligopeptidase

được tìm thấy trên cây Arabidopsis và cây lúa [45]. Gene RMP3

(Os12g0637100) mã hóa purple acid phosphatase thuộc nhóm protein

mettallophosphoesterase. Một số gene mã hóa protein này như OsPAPhyla,

OsPAPhylB, NtPAP12 và AtPAP10 được chứng minh có vai trò đến sự biểu

hiện của gene trong quá trình phát triển của hạt phấn ở lúa, thuốc lá và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Arabidopsis [22]. Gene RMP4 (Os12g0605900) mã hóa kinase protein có vai

trò quan trọng kiểm soát quá trình phát triển của ống phấn và biểu hiện mạnh

trong suốt quá trình phát triển của hạt phấn, xác định được 8 gene RLKs mã

hóa protein kinase ở cây Arabidopsis trong đó 6 gene biểu hiện cao ở hạt phấn

[16]. Gene RMP5 (Os06g0681100) mã hóa protein tetratricopetide liên quan

đến sự nảy mầm của hạt phấn được chứng minh biểu hiện mạnh ở các giai

đoạn phát triển của hạt phấn ngô và Arabidopsis [39]. Gene RMP6 (

Os12g0637900) mã hóa CHCH protein, vai trò của protein này ít được nghiên

cứu trên thực vật đặc biệt là ở hạt phấn [20]. Gene RMP7 (Os03g0381000)

mã hóa Aldose 1- epimerase protein được chứng minh biểu hiện ở hạt phấn

cây Arabidopsis giai đoạn trưởng thành [37]. Tuy nhiên ở lúa chưa có một

nghiên cứu nào được công bố. Gene RMP8 (Os01g0899100) mã hóa

peptidase C1A có vai trò khác nhau, tuy nhiên chưa được chứng minh ở hạt

phấn lúa cũng như các cây trồng khác. Gene RMP9 (Os04g0650200) mã hóa

lipolytic protein có vai trò khác nhau trong quá trình phát triển của hạt phấn.

Gene RMP10 (Os07g0664600) mã hóa glucose/ribitol dehydrogenease

protein có vai trò chủ yếu tăng cường khả năng chịu mặn giai đoạn nảy mầm

của hạt.

Bảng 3.1. Các gene chuyên biệt hạt phấn lúa và vùng promoter tương ứng

trong nghiên cứu

Mã số trên ngân

Kích thước vùng promoter

STT

Protein mã hóa

hàng gene

khuếch đại

RMP1

Os01g0533400

Glycoside hydrolase, family 35 protein

1,343 bp (-18 to -1,360)

RMP2

Os04g0561900

Peptidase S9A, prolyl oligopeptidase family

754 bp (-97 to -850)

RMP3

Os12g0637100

Similar to Purple acid phosphatase

1,420 bp (-14 to -1,433)

RMP4

Os12g0605900

Similar to Kinase like protein

1,294 bp (-98 to -1,391)

RMP5

Os06g0681100

Tetratricopeptide-like helical domain containing protein

1,514 bp (-144 to -1,657)

RMP6

Os12g0637900

CHCH domain containing protein

1,962 bp (-19 to -1,980)

RMP7

Os03g0381000

Similar to Aldose 1-epimerase-like protein

2,046 bp (-5 to -2,051)

RMP8

Os01g0899100

Peptidase C1A, papain family protein

2,053 bp (-2 to -2,054)

RMP9

Os04g0650200

Lipolytic enzyme, G-D-S-L family protein

1,934 bp (-5 to -1,939)

RMP10 Os07g0664600

Glucose/ribitol dehydrogenease family protein

1,924 bp (-22 to -1,946)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.1. Bản đồ nhiệt thể hiện mức độ biểu hiện của các gene RMP ở hạt phấn

Ghi chú :

Mức độ biểu hiện gene được thể hiện bằng màu sắc từ màu đen đến màu vàng.

3.2. Tách dòng và thiết kế vector

Lựa chọn 2 gen RMP1 và RMP2 để tách dòng promoter và thiết kế

vector chuyển gene nhằm đánh giá khả năng hoạt động của promoter ở hạt

phấn thông qua gene chỉ thị GUS. Toàn bộ vùng promoter (5’upstream) của

gene được khuyếch đại bằng PCR và đưa vào vector nhân dòng pDONR201

theo phương pháp Gateway. Promoter được đưa vào vector pDONR201 bằng

phản ứng BP sau đó biến nạp vào chủng Ecoli DH5α và chọn lọc trên môi

trường LB đặc bổ sung 50mg/l kháng sinh kanamycin. Kết quả sàng lọc tế

bào tái tổ hợp bằng PCR sử dụng cặp mồi RMP/attB2. Kết quả cho thấy đối

với promoter RMP1, kiểm tra ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc trên môi trường chọn

lọc bằng kháng sinh kanamycin với cặp mồi đặc hiệu RMP1-F/attB2. Kết quả

điện di trên gel thu được 2 khuẩn lạc dương tính hiển thị băng đặc hiệu có

kích thước khoảng 1,34 kb tương ứng với kích thước mong muốn của

promoter (Hình 3.2a). Để kiểm tra kết quả tách dòng, nuôi tăng sinh chủng số

2 , tách plasmid và gửi đi giải trình tự gene tại công ty COSMOGENETECH

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

(http://www.cosmogenetech.com/main.jsp) của Hàn Quốc. Kết quả giải trình

tự gene được kiểm tra trên ngân hàng gene NCBI bằng công cụ BLAST

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) và phần mềm Bioedit (http://bioedit.

software.informer.com/7.2/). Kết quả cho thấy toàn bộ trình tự promoter

RMP1 tách dòng trùng khớp với trình tự promoter của gene trên ngân hàng

gene. Tương tự tiến hành tách dòng promoter RMP2, kiểm tra ngẫu nhiên 4

khuẩn lạc trên môi trường có kháng sinh chọn lọc bằng PCR với cặp mồi đặc

hiệu RMP2-F/attB2 đã thu được cả 4 khuẩn lạc đều cho kích thước khoảng

754 bp, tương ứng với kích thước của vùng promoter RMP2 (Hình 3.2d). Tiến

hành nuôi tăng sinh khuẩn lạc số 1, tách plasmid và giải trình tự gene thu

được kết quả trùng khớp với promoter gene RMP2 trên ngân hàng gene NCBI.

Từ các kết quả này chứng tỏ đã tách dòng thành công promoter RMP1 và

RMP2, ký hiệu lần lượt là pDORMP1-1 và pDORMP2-1. Để đánh giá khả

năng hoạt động, promoter RMP1 và RMP2 được gắn vào vector chuyển gene

pKGWFS7 theo phương pháp Gateway. Bằng phản ứng LR toàn bộ trình tự

promoter được chèn vào phần ccdB giới hạn bởi hai đầu attR1 và attR2 để

điều khiển gen chỉ thị GFP và GUS hoạt động. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc tái

tổ hợp bằng PCR cho thấy, cả 3 khuẩn lạc đều dương tính với promoter

RMP1 khi sử dụng cặp mồi RMP1-F và RMP1-R (Hình 3.2b ), điều đó chứng

tỏ phản ứng ghép nối promoter RMP1 với vector pKGWFS7 đã thành công.

Tương tự, kiểm tra 4 khuẩn lạc với cặp mồi RMP2-F và RMP2-R cho thấy 3

khuẩn lạc (1,2,3) cho kích thước khoảng 754 bp tương ứng với chiều dài của

promoter RMP2, khuẩn lạc số 4 có kích thước lớn hơn 754 bp nên loại bỏ

(Hình 3.2c ). Kết quả này chứng tỏ promoter RMP1 và RMP2 đã được gắn

thành công vào vector chuyển gene pKGWFS7 điều khiển gene chỉ thị GFP

và GUS. Ký hiệu lần lượt là pKG7-RMP1 :: GFP/GUS và pKG7-RMP2 ::

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

GFP/GUS (Hình 3.3).

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% để sàng

lọc khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR201 và vector chuyển gene

pKGWFS7

Ghi chú :

(a,b) Sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi RMP1-F/attB2 (a), và

RMP1-F/R (b) cho kích thước tương ứng 1,34kb, (c,d) Sản phẩm PCR khuẩn

lạc với cặp mồi RMP2-F/R (c), và RMP2-F/attB2 (d) cho kích thước tương

ứng 754 bp. M : thang chuẩn 1kb ; 1-4 : thứ tự các khuẩn lạc được kiểm tra.

Hình 3.3. Cấu trúc vector chuyển gene mang promoter RMP

Ghi chú :

(a) Cấu trúc vector pKG7-RMP1 :: GFP/GUS (b) Cấu trúc vector

pKG7-RMP2 :: GFP/GUS ; LB : Left border, RB : right border, T35S : trình

tự kết thúc, Kam : vùng gene chọn lọc kanamycin

3.3. Kết quả nghiên cứu chuyển gene và phân tích biểu hiện gen GUS

Để đánh giá hoạt động của promoter RMP1 và RMP2, chúng tôi tiến

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

hành chuyển cấu trúc RMP1 ::GFP/GUS và RMP2 ::GFP/GUS vào cây

Arabidopsis thaliana 21 ngày tuổi thông qua vi khuẩn A.tumefaciens. Kết

quả thu được 25 cây chuyển gene RMP1 và 20 cây RMP2 thế hệ T1, trong khi

đó những cây khác không thể phát triển được trong môi trường kháng sinh

kanamycin. Những cây chuyển gen này được chuyển ra trồng trong chậu đất

để thu hoạch hạt cho các thí nghiệm sâu hơn. Đồng thời để khẳng định sự có

mặt của gen chỉ thị GUS trong `các dòng cây chuyển gen này tiến hành phân

tích ngẫu nhiên 14 cây chuyển gene bằng PCR với cặp mồi GUS-F và GUS-

R. PCR cho phép nhân bản một số lượng lớn nguyên bản một đoạn DNA

trong một thời gian ngắn. Đây là phương pháp thường được dùng trong phân

tích dòng cây chuyển gen vì độ tin cậy cao. Theo lí thuyết nếu ta cung cấp cặp

mồi đặc hiệu thì sẽ nhân chính xác được đoạn gen nằm giữa hai mồi đó. Khi

tiến hành PCR trên DNA tách từ cây đã được chuyển gen, nếu cho kết quả

đặc hiệu với cặp mồi đó thì ta có thể kết luận rằng cây đó đã mang đoạn gen

cần chuyển là gen GUS có gắn promoter đặc hiệu RMP1 và RMP2. Sau khi

tách chiết DNA, đã tiến hành điện di trên gel agarose 2% để kiểm tra và thu

được kết quả cho thấy tất cả các cây đều cho kết quả dương tính (Hình 3.4).

Hình 3.4. Kết quả phân tích cây chuyển gene bằng PCR với cặp mồi GUS-

F/GUS-R

Ghi chú :

M : marker 1kb ; (+) đối chứng dương tính ; (-) đối chứng âm tính ; từ 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

đến 7 : cây chuyển gene RMP1 ; từ 8-14 : cây chuyển gene RMP2

Phân tích biểu hiện gene GUS ở cụm hoa cho thấy mức độ biểu hiện

khác nhau ở các cây chuyển gene RMP1 và RMP2. Gene GUS biểu hiện

mạnh ở tất cả các giai đoạn phát triển của hạt phấn khi được điều khiển bởi

promoter RMP1 (Hình 3.5). Ở các cây chuyển gene RMP2 mức độ biểu hiện

của gene GUS yếu hơn (Hình 3.5). Đồng thời cây đối chứng không chuyển

gen thì hạt phấn không biểu hiện màu xanh đặc trưng do không có gen chỉ thị

RMP1 ::GFP/GUS và RMP2 ::GFP/GUS. Mặt khác ở các bộ phận khác như

lá, thân của cây được chuyển gen cũng không biểu hiện màu xanh của gen chỉ

thị GUS như ở hạt phấn. Kết quả phân tích biểu hiện gene GUS ở cụm hoa

của các cây chuyển gene hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích biểu hiện

gene RMP1 và RMP2 dựa trên cơ sở dữ liệu heat-map (Hình 3.1). Điều này

khẳng định promoter RMP1 và RMP2 hoạt động chuyên biệt ở hạt phấn của

cây.

Đ/c không chuyển gen RMP1 RMP2 Hình 3.5. Biểu hiện của gene GUS ở cụm hoa cây chuyển gene

Ghi chú :

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Màu xanh (mũi tên) là biểu hiện của gene GUS

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận

Từ các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi kết luận :

- Đã sàng lọc được 10 gene có biểu hiện chuyên biệt ở hạt phấn lúa dựa

trên bản đồ nhiệt heat-map, ký hiệu là RMP1 đến RMP10.

- Tách dòng và thiết kế thành công vector chuyển gene mang promoter

RMP1 và RMP2 có kích thước lần lượt là 1343 bp và 734 bp, ký hiệu là

pKG7-RMP1 :: GFP/GUS và pKG7-RMP2 :: GFP/GUS.

- Chuyển thành công vector chuyển gene vào cây Arabidopsis để đánh

giá hoạt động của promoter. Phân tích 14 cây chuyển gene bằng PCR đều cho

kết quả dương tính với gene GUS. Phân tích biểu hiện gene GUS. Cả hai

promoter đều hoạt động ở hạt phấn ở cây chuyển gene RMP1 và RMP2.

4.2. Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu đánh giá toàn diện về khả năng hoạt động của

promoter RMP1 và RMP2 ở cây lúa và mở rộng trên các đối tượng cây trồng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

khác trước khi đưa vào ứng dụng điều khiển các gene mục tiêu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gene ở Việt Nam. Bộ

sách chuyên khảo, NXB Khoa học và Công nghệ, Hà Nội.

2. Bộ Nông nghiệp và PTNT (2014), Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch

tháng 12 và cả năm 2014 ngành Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn,

Trung tâm tin học và thống kê, Hà Nội.

3. Chu Đức Hà, Lê Tiến Dũng (2015), “Vai trò của yếu tố điều hòa Cis trong

đáp ứng của thực vật với các điều kiện bất lợi” , Báo tạp chí sinh học,

37(3), tr. 370-383.

4. Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), “Promoter

và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật”, Tạp chí công nghệ sinh

học, 5(1), tr.118.

5. Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gene ở thực

vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

6. Võ Thị Thương Lan (2011), Sinh học phân tử tế bào và ứng dụng, NXB

Giáo Dục Việt Nam.

7. Lê Duy Thành. (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa

học và kỹ thuật, Hà Nội.

8. Lê Duy Thành, Tạ Đoàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2007), Di truyền

học , NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội.

9. Nguyễn Thị Thúy Quỳnh , Nguyễn Huy Hoàng , Hao Jen Hoang (2016)

‚“Nghiên cứu hoạt động của promoter LRR-RLK VIII điều khiển tính chống

chịu arsenic trong cây mô hình Arabidopsis”, tạp chí Công nghệ Sinh học

14(3), tr. 499-505.

10. Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (1998), Hệ thống học thực vật, NXB

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Đại học Quốc gia Hà Nội.

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 12. Aida M., Ishida T., Fukaki H., Fujisawa H., Tasaka M. (1997), “Genes

involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-

shaped cotyledon mutant, Plant Cell, 9, pp. 841 - 857.

13. Bae HK, Kang HG, Kim GJ, Eu HJ, Oh SA, Song JT, Chung IK, Eun

MY, Park SK (2010), “Transgeneic rice plants carrying RNA

interference constructs of AOS (allene oxide synthase) genes show

severe male sterility”, Plant Breed , 129, pp. 647 – 651.

14. Benfey P. N., Chua N. H. (1990), “ The cauliflower mosaic virus 35S

promoter: combinatorial regulation of transcription in plants”, Science,

250(4983), pp. 959966.

15. Bevan M., Walsh S (2005), “The Arabidopsis Genome: a foundation for

plant research”, Genome Reseearch, 15(12), pp. 1632 -1642.

16. Chang F., Gu Y., Ma H., Yang Z. (2013), “ AtPRK2 promotes ROP1

activation via RopGEFs in the control of polarized pollen tube growth”,

Mol Plant, 6, pp. 1187-1201.

17. Christensen A.H. & Quail P.H. (1996), “ Ubiquitin promoter-based

vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker

genes in monocotyledonous plants”, Transgenic Research, 5, pp. 213

- 218.

18. Conkling M. A., C. L. Cheng, Y. T. Yamamoto and H. M. Goodman

(1990), “ Isolation of transcriptionally regulated tobacco”, Plant

Physiology, 93(3), pp. 1203 -1211.

19. Clough (1998), “ Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-

mediated transformation of Arabidopsis thaliana ”, lant J., 16(6), pp.

735 - 743.

20. Darshi M.,Trinh K., Murphy A., Taylor S. (2012), “Targeting and import

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

mechanism of coiled-coil helix coiled-coil

helix domain-containing protein 3 (ChChd3) into the mitochondrial

intermembrane space”, J Biol Chem,

287, pp. 39480-39491.

21. Davis D. L., Nielsen M. T. (1999), Tobaco Production, Chemistry and

technology. B Blackwell Science, 467.

22. Dionisio G., Madsen C. K., Holm P. B., Welinder K. G., Jorgenesen M.,

Stoger E., Arcalis E., Brinch – Pedersen H. (2011), “Cloning and

characterization of purple acid phosphatase phytases from wheat

(Triticum aestivum L.), barley(Hordeum vulgage L.), maize (Zea maize

L.) and rice (Oryza sativa L.)”, Plant Physiol, 156, pp. 1087-1100.

23. Ditt R. F., Nester E. W. and Comai L. (2005), “ The plant cell defense

andAgrobacterium tumefaciens” , FEMS Microbiology letters, 247, pp.

207-213.

24. Gelvin S. B. (2003), “Agrobacterium - mediated plant transformation t he

biology behind the “Gene - jockeying” Tool”, Microbiology and

Molecular Biology Reviews, 67 (1), pp. 16 - 37.

25. Grierson C. S., Barnes S. R., Chase M. W., Clarke M., Grierson D.,

Edwards K. J., Jellis G. J., Jones D. J., Knapp S., OldroydG., Poppy G.,

Temple P., Williams R., and Bastow R., (2011), “One hundred

important questions facing plant science research”, New Phytologist,

192, pp. 6 –12.

26. Grover A., Twell D. & Schleiff E. (2016). Pollen as a target of

environmental changes, Plant Reprod, 29,

https://doi.org/10.1007/s00497-016-0285-7.

27. Hays J. B. (2002), “Arabidopsis thaliana, a versatile model system for

study of eukaryotic genome-maintenance functions”, DNA repair , 1(8),

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

pp. 579- 600.

28. Ho M. W., A. Ryan and J. Cummins (1999), “ Cauliflower mosaic viral

promoter-a recipe for disaster?”, Microbial Ecology in Health and

Disease, 11(4), pp. 194-197.

29. Honys D., Oh S. A., Renak D., Donders M., Solcova B., Johnson J. A.,

Boudova R., Twell D. (2006), “ Identification of microspore-active

promotes that allow targeted manipulation of gene expression at early

stages of microgametogenesis in Arabidospsis” , BMC Plant Biol, 6,

pp. 31.

30. Hohn T., Futterer J. (1992), Transcriptional and translational control of

gene expression in cauliflower mosaic virus”, Current opinion in

genetics & development, 2(1), pp. 90 - 96.

31. Huang J. W, J. T. Chen, W. P. Yu, L. F. Shyur, A. Y. Wang, H. Y. Sung

and J. C. Su (1996), “ Complete structures of three rice sucrose

synthase isogenes and differential regulation of their expressions”,

Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 60(2), pp. 233-239.

32. Huraba P., Honys D., Twell D., Capková V., Tupý J. (2005), “Expression

of beta-galactosidase and beta-xylosidase genes

332 during microspore and pollen development” , Planta , 220, pp.

931-940.

33. Jefferson R. (1987). GUS: Histochemical Staining with X-Gluc,

http://stockingerlab.osu.edu, ngày 26/11/2001.

34. Liu L., Y. Zhou, M. W. Szczerba, X. Li and Y. Lin (2010),

“Identification and application of a rice senescence-associated

promoter”, Plant physiology, 153(3), pp. 1239 -1249.

35. Nakashima K., Tran L.S., Van Nguyen D., Fujita M., Maruyama K.,

Todaka D., Ito Y., Hayashi N. Shinozaki K., Yamaguchi – Shinozaki

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

K. (2007), “Functional analysis of a NAC – type transcription factor

OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress – responsive gene

expression in rice”, Plant J, 1(4), pp. 617-630.

36. Noad R. J., D. S. Turner and S. N. Covey (1997), “ Expression of

functional elements inserted into the 35S promoter region of infectious

cauliflower mosaic virus replicons”, Nucleic acids research, 25(6), pp.

1123 – 1129.

37. Noir S., Brautigam A., Colby T., Schmidt J., Panstruga R. (2005), “A

reference map of the Arabidospsis thaliana mature pollen proteome”,

Biochem Biophys Res Commun, 337, pp. 1257-1266

38. Paupiere M. J., van Heusden A. W., Bovy A. G. (2014), “The metabolic

basis of pollen thermo-tolerance: perspectives for breeding”,

Metabolites, 4, pp. 889-920.

39. Safadi F., Reddy V. S., Reddy A. S. (2000), “A pollen-specific novel

calmodulinbinding protein with tetratricopeptide repeats”, J Biol Chem,

275, pp 35457-35470.

40. Swapna L., Khurana R., Kumar S.V., Tyagi A.K., Rao K.V. (2011),

“Pollen – specific expression of Oryza sativa indica pollen allergene

gene (OSIPA) promoter in rice and Arabidospsis transgenneic

systems”, Mol. Biotechnol, 48 49-50, 10.1007/s 12033-010-9347-5.

41. Tan H., Liang W., Hu J., Zhang D. (2012), “ MTR1 encodes a secretory

fasciclin glycoprotein required for male reproductive development in

rice”, Dev Cell, 22, pp. 1127-37.

42. Tan C. M., Chen R. J , Zhang J. H., Gao X. L., Li L. H., Wang P. R.,

Deng X. J., Xu Z. J. (2013), “ OsPOP5, a prolyl oligopeptidase family

gene from rice confers abiotic stress tolerance in Escherichia coli”, Int

J Mol Sci , 14, pp. 20204-20219.

43. Tanthanuch W., Chantarangsee M., Maneesan J., Ketudat-Cairns J.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

(2008), “ Genomic and expression analysis of glycosyl hydrolase

family 35 genes from rice (Oryza sativa L.)”, BMC Plant Biol, 8, pp.

84.

44. The Arabidopsis Genome Initiative (2000), “Analysis of the genome

sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana”, Nature, 408, pp.

796 - 815.

45. Tripathi L., Sowdhamini R. (2006), “ Cross geneome comparisons of

serine proteases in Arabidospsis and rice, BMC Geneomics, 7, pp. 200.

46. Turner D. S., D. G. McCallum and S. N. Covey (1996), “ Roles of the 35S

promoter and multiple overtapping domains in the pathogenicity of the

pararetrovirus cauliflower mosaic virus”, Journal of virology, 70(8),

4514.

47. Yin Y., L. Chen and R. Beachy (1997), “ Promoter elements required for

phloem- specific gene expression from the RTBV promoter in rice”,

The Plant Journal, 12 (5), pp. 1179-1188.

48. Yu W. P., A. Y. Wang, R. H. Juang, H. Y. Sung and J. C. Su (1992), “

Isolation and sequences of rice sucrose synthase cDNA and genomic

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

DNA”, Plant molecular biology, 18(1), pp. 139 -142.

PHỤ LỤC

( Bài báo khoa học )

BÁO CÁO KHOA HỌC PROCEEDINGS

“ SÀNG LỌC VÀ TÁCH DÒNG MỘT SỐ PROMOTER CHUYÊN BIỆT

HẠT PHẤN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa L.)”

HỘI NGHỊ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC TOÀN QUỐC 2018

Nguyễn Tiến Dũng*, Trần Thị Mai, Trương Kim Oanh, Nguyễn Thị Tình, Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Xuân Vũ, Nguyễn Hữu Thọ, Ngô Xuân Bình

Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phân lập và đánh giá hoạt động của promoter chuyên biệt hạt phấn từ cây lúa (Oryza sativa L.)

TRƯƠNG KIM OANH

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA

PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN TỪ

CÂY LÚA (Oryza sativa L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRƯƠNG KIM OANH

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦA

PROMOTER CHUYÊN BIỆT HẠT PHẤN TỪ

CÂY LÚA (Oryza sativa L.)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số ngành: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Tiến Dũng

Bảng 1.1. Một số yếu tố điều hòa cis quan trọng đáp ứng điều kiện

bất lợi [3].

Yếu tố

điều hòa

Trình tự bảo thủ

Chức năng

cis

Gene N

Primer

Sequence (5'-3')

Size

No

name

Bảng 3.1. Các gene chuyên biệt hạt phấn lúa và vùng promoter tương ứng

trong nghiên cứu

Mã số trên ngân

Kích thước vùng promoter

STT

Protein mã hóa

hàng gene

khuếch đại

Hình 3.1. Bản đồ nhiệt thể hiện mức độ biểu hiện của các gene RMP ở hạt phấn

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc trên gel agarose 1% để sàng

lọc khuẩn lạc tái tổ hợp với vector tách dòng pDONR201 và vector chuyển gene

pKGWFS7

19. Clough (1998), “ Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-

( Bài báo khoa học )

Nguyễn Tiến Dũng*, Trần Thị Mai, Trương Kim Oanh, Nguyễn Thị Tình, Nguyễn Văn Duy, Nguyễn Xuân Vũ, Nguyễn Hữu Thọ, Ngô Xuân Bình

Có thể bạn quan tâm

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận án Tiến Sĩ: : Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết từ cây Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)

Báo cáo thực tập: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (QUATEST 2)

Câu hỏi ôn tập môn Công nghệ sinh học nấm ăn và nấm dược liệu

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Công nghệ nông nghiệp năm 2025 - Sở GD&ĐT Cà Mau

Câu hỏi ôn tập kiểm tra học kì 2 môn Công nghệ chăn nuôi lớp 11 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Đề cương ôn tập học kì 2 môn Công nghệ nông nghiệp lớp 12 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Virus Real-time PCR

Bài giảng Công nghệ sản xuất enzym - Lê Ngọc Khánh

Đề khảo sát giữa học kì 2 môn Khoa học tự nhiên lớp 9 năm 2024-2025 có đáp án - Trường THCS Xuân Tiến (Đề số 02)

Định danh chủng vi khuẩn Bacillus subtilis R1 phân lập từ rơm có hoạt tính phân huỷ huyết khối

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Công nghệ sinh học nano năm 2021-2022

Bài giảng Công nghệ sinh học phân tử vi sinh vật - Trần Linh Thước

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Xuân Lộc, Đồng Nai

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ môi trường: Nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học theo mẻ (SBR) để xử lý nước thải sinh hoạt trong nhà cao tầng và khu dân cư quy mô tới 10000 người

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đột biến và đa hình của một số gen ở trẻ em mắc bệnh teo đường mật bẩm sinh

Đề thi kết thúc học phần học kì 2 môn Công nghệ sinh học dinh dưỡng năm 2023-2024 có đáp án

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Quản lý chất lượng sản phẩm năm 2023-2024

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt