1
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
N T
NG N N TR RN G NG
Đ TƯ NG T 4 TẠ NG N
G N NG N R
LU N ĂN T Ạ Ĩ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thái Nguyên – 5 / 2015
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
2
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NG T N
NG N N TR RN
G NG Đ TƯ NG T 4 TẠ NG
N G N NG N R
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01
LLUU NN VVĂĂNN TTHHẠẠCC SSĨĨ CCÔÔNNGG NNGGHHỆỆ SSIINNHH HHỌỌCC
N ọ : GS.TS. Chu Hoàng Mậu
Thái Nguyên – 5/2015
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
3
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấ đ
Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ đậu (Fabaceae), là cây
công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế và hàm lượng dinh dưỡng cao, lại dễ
trồng. Ngoài ra trồng cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất nhằm tăng năng
suất của các giống cây trồng khác. Ở Việt Nam, cây đậu tương được trồng cả 7
vùng nông nghiệp trên cả nước, trong đó 65% ở miền Bắc và 35% ở miền Nam.
Hiện nay năng suất và sản lượng đậu tương vẫn còn thấp và còn phải nhập khẩu
từ các nước khác để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng và làm thức ăn cho gia súc [53].
Bên cạnh những yếu tố như hạn hán, kĩ thuật canh tác thì nguyên nhân bệnh do
côn trùng, do vi khuẩn và virus gây ra cũng ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất,
chất lượng đậu tương. Hiện nay người ta đã xác định được khoảng 30 loại bệnh
hại ở cây đậu tương, trong đó có các bệnh do nhiễm virus gây tổn thất lớn cho
ngành sản xuất đậu tương [13]. Bệnh khảm lá đậu tương là bệnh hại xuất hiện
phổ biến ở cây đậu tương do Soybean mosaic virus (SMV) thuộc nhóm
Potyvirus gây ra. Đậu tương bị nhiễm SMV ở thời điểm trước khi ra hoa năng
suất có thể giảm tới 40% và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng
kém [35].
SMV có thể lan truyền trong quần thể đậu tương do rệp, hoặc do cơ học.
Hiện nay, những biện pháp thường sử dụng để ngăn chặn sự lan truyền của SMV
chỉ có tính chất phòng bệnh mà không thể chống lại triệt để. Tuy nhiên, nhờ ứng
dụng kỹ thuật RNA interference (RNAi) người ta đã tạo ra cây trồng có khả năng
kháng lại bệnh do virus bằng cách đưa ch nh gen của virus gây bệnh vào hệ gen
của cây chủ. Theo hướng nghiên cứu này, nhiều giống cây trồng chuyển gen
kháng được các loại bệnh virus khác nhau đã được tạo ra, như cây đậu chuyển
gen kháng virus BGMV (bean golden mosaic virus), cây thuốc lá chuyển gen
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV).
4
Xuất phát từ những l do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu
chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng cây
chuyển gen kháng Soybean mosaic virus”.
2. ục t êu ê c u
Tạo được dòng cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi
của SMV ở giống đậu tương DT84.
3. Nộ du ê c u
Nghiên cứu lây nhiễm A. tumefaciens mang cấu trúc RNAi vào mô nách
lá mầm hạt chín của giống đậu tương DT84. Tái sinh in vitro, chọn lọc và tạo
dòng cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi;
Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen bằng
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
kỹ thuật PCR. Xác định hiệu suất chuyển gen.
5
ươ 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. C đậu tươ
1.1.1. iá tr dinh dư ng c a đậu tương
Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung
bình khoảng 38-40%, lipid từ 18-20%, giàu vitamin và muối khoáng. Đậu tương
là loại hạt duy nhất mà giá trị của nó được đánh giá đồng thời cả protein và lipid.
Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong các loại protein thực vật. Hàm
lượng protein cao hơn cả ở cá, thịt và cao gấp hai lần hàm lượng protein có trong
các loại đậu đỗ khác [14]. Hàm lượng các axit amin có chứa lưu huỳnh như
methionin, sistein,… của đậu tương rất gần với hàm lượng của các chất này của
trứng. Hàm lượng của cazein, đặc biệt là của lizin rất cao, gần gấp rưỡi trứng. Vì
thế mà khi nói giá trị của protein ở đậu tương cao là nói hàm lượng lớn của nó cả
sự đầy đủ và cân đối của các loại axit amin cần thiết. Protein của đậu tương dễ
tiêu hóa hơn thịt và không có các thành phần tạo nên cholesteron. Không có các
dạng axit uric… Ngày nay, người ta mới biết thêm nó có chứa chất lexithin, có
tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng thêm tr nhớ và tái sinh các
mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể.
Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác
nên được coi đây là cây cung cấp dầu thực vật. Hiện nay các nước có mức sống
cao người ta lại ưa chuộng dầu thực vật hơn mỡ động vật. Lipid của đậu tương
chứa một tỷ lệ cao các axit béo chưa no có hệ số đồng hóa cao, mùi vị thơm
ngon. Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ vữa động
mạch [14]. Trong đậu tương còn có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
lượng vitamin B1 và B2, ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C… và
6
các loại muối khoáng khác [14]. Do đó mà từ hạt đậu tương người ta đã chế biến
ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại thức ăn bằng các
phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới các dạng tươi, khô, lên men…
như làm giá, sữa đậu nành, xì dầu… cho đến các sản phẩm cao cấp như đậu
tương, socola- đậu tương, bánh kẹo, pate, thịt nhân tạo… ngay như ở nước ta, từ
hàng ngàn năm nay đậu tương đã được cung cấp như một phần nhu cầu chất đạm
cho người và gia súc, thông qua các món ăn cổ truyền được chế biến từ đậu
tương, phần nào tạo ra được sự cân bằng dinh dưỡng trong khẩu phẩn thức ăn
cho người dân. Đậu tương có thể chế biến thành giò, chả cho người ăn chay.
Đậu tương còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là hạt đậu tương đen, có
tác dụng tốt cho tim mạch, gan, thận, dạ dày và ruột, làm thức ăn tốt cho người
bị bệnh đái tháo đường, thấp khớp, mới ốm dậy hoặc do lao động quá sức. Các
chất lexithin và cazein có trong đậu tương có thể dùng riêng hoặc phối hợp để
làm thuốc bổ dưỡng.
Bột đậu tương sau khi đã ép lấy dầu, bã dùng làm nguyên liệu chế biến
thức ăn tinh hỗn hợp giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm theo hướng công nghiệp.
Thân lá cây đậu tương có thể dùng làm thức ăn gia súc gia cầm rất tốt. Ở nhiều
nước phát triển người ta còn dùng đậu tương vào các ngành công nghiệp khác
như chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất
đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không.
Đậu tương còn có khả năng t ch lũy chất đạm của khí trời để tự túc và làm
giàu đạm cho đất nhờ sự cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần ở bộ rễ. Trong điều
kiện thuận lợi, các vi khuẩn nốt sần này có thể t ch lũy được một lượng đạm
tương đương từ 20- 25 kg ure/ha. Do vậy có thể nói mỗi nốt sần như một “nhà
máy đạm tý hon”, bởi vậy nên trồng đậu tương không những tốn t phân đạm mà
còn làm cho đất tốt lên, có tác dụng tích cực trong việc cải tạo bồi dưỡng đất
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
[14].
7
1.1.2. Đặc đ sinh học
Cây đậu tương (Glycine max (L) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae), có
nguồn gốc từ cây đậu tương hoang dại (Glycine ussuriensis) dạng thân leo, sống
hàng năm được phát hiện ở Trung Quốc, Nhật Bản, và Triều Tiên. Chúng có rất
nhiều chủng khác nhau, thích nghi với điều kiện khí hậu từ ôn đới đến nhiệt đới
[14].
Rễ cây đậu tương khác với rễ cây hoà thảo là có rễ chính và rễ phụ. Rễ
chính có thể ăn sâu 30-50cm và có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ
phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm2. Trên
rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần. Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng
nốt sần ít hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, kh hậu và kỹ thuật trồng [14].
Trong điều kiện đất chua quá hoặc kiềm quá nốt sần hình thành kém. pH thích
hợp cho sự hình thành của nốt sần là 6-7, vì vậy việc lựa chọn đất trồng đậu
tương th ch hợp rất quan trọng. Điều kiện dinh dưỡng cũng ảnh hưởng rất lớn
đến sự phát triển của nốt sần. Nhìn chung bón đầy đủ NPK thì nốt sần phát triển
mạnh, bón P2O5 có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của nốt sần, còn hiệu quả kali
không rõ lắm. Bón đạm không thích hợp ức chế sự hình thành và phát triển của
nốt sần. Nốt sần ở rễ đậu tương thường tập trung ở tầng đất 0-20cm, từ 20-30cm
nốt sần ít dần và nếu sâu hơn nữa thì có ít hoặc không có. Nốt sần đóng vai trò
chính trong quá trình cố định đạm khí trời cung cấp cho cây. Lượng đạm cung
cấp cho cây khá lớn khoảng 30-60 kg/ha. Nốt sần có thể dài l cm, đường kính 5 -
6 mm, mới hình thành có màu trắng sữa, khi tốt nhất có màu hồng. Quan hệ giữa
vi sinh vật nốt sần với cây đậu tương là mối quan hệ cộng sinh: cây cung cấp
chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoạt động, ngược lại vi khuẩn lại tổng hợp nitơ tự
do của không khí chuyển sang dạng đạm hữu cơ cây có thể sử dụng được [14].
Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
nhỏ. Thân khi còn non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu
8
nâu nhạt, màu sắc của thân khi còn non có liên quan chặt chẽ với màu sắc của
hoa sau này. Nếu thân lúc còn non màu xanh thì hoa màu trắng và nếu khi còn
non thân có màu t m thì hoa có màu t m đỏ. Thân có trung bình 14-15 lóng, các
lóng ở ph a dưới thường ngắn, các lóng ở ph a trên thường dài (vì những lóng
phía trên phát triển từ ngày 35-40 trở đi vào lúc cây đang sinh trưởng nhanh nên
lóng thường dài). Tuỳ theo giống và thời vụ gieo mà chiều dài lóng có sự khác
nhau thường biến động từ 3 - 10 cm. Cây đậu tương trong vụ hè thường có lóng
dài hơn vụ xuân và vụ đông. Chiều dài của lóng góp phần quyết định chiều cao
của thân. Thân cây đậu tương thường cao từ 0,3 m - 1,0 m. Những giống thân
nhỏ lóng dài dễ bị đổ hay mọc bò thường làm thức ăn cho gia súc. Những giống
thân to thường là thân đứng và có nhiều hạt và chống được gió bão. Toàn thân có
một lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cả cuống lá.
Thực tế cũng có giống không có lông tơ. Những giống có mật độ lông tơ dày,
màu sẫm có sức kháng bệnh, chịu hạn và chịu rét khoẻ. Ngược lại những giống
không có lông tơ thường sinh trưởng không bình thường, sức chống chịu kém.
Thân có lông tơ nhiều ít dài ngắn, dày thưa là một đặc điểm phân biệt giữa các
giống với nhau. Từ lúc mọc đến khi cây có 5 lá thật (3 lá kép) khoảng 25-30
ngày sau khi gieo, thân sinh trưởng với tốc độ bình thường [14].
Về quá trình phát triển của cây đậu tương, khi cây đã có 6-7 lá thật (4-5 lá
kép) thân bắt đầu phát triển mạnh, tốc độ mạnh nhất vào lúc ra hoa rộ. Sự khác
biệt của cây đậu tương với cây trồng khác là khi cây ra hoa rộ lại là lúc thân cành
phát triển mạnh nhất. Đây là giai đoạn 2 quá trình sinh trưởng sinh dưỡng và
sinh trưởng sinh thực cạnh tranh nhau dẫn đến khủng hoảng thiếu dinh dưỡng,
cho nên cần phải cung cấp đầy đủ dinh dưỡng trước khi vào thời kỳ này và tạo
điều kiện cho bộ rễ phát triển thuận lợi. Trong kỹ thuật chăm sóc ta phải xới vun
kết hợp với bón thúc phân cho đậu tương vào giai đoạn 3-5 lá kép, lúc cây có
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
đầy đủ hoa thì sinh trưởng chậm dần rồi dừng hẳn.
9
Cây đậu tương có 3 loại lá: lá mầm, lá nguyên, lá kép. Lá mầm mới mọc
có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh.
Hạt giống to thì lá mầm chứa nhiều dinh dưỡng nuôi cây mầm, khi hết chất dinh
dưỡng lá mầm khô héo đi, cho nên trong kỹ thuật trồng đậu tương nên làm đất
tơi nhỏ và chọn hạt to cây sẽ mọc khoẻ, sinh trưởng tốt. Lá nguyên xuất hiện sau
khi cây mọc từ 2-3 ngày và mọc phía trên lá mầm. Lá đơn mọc đối xứng nhau.
Lá đơn to màu xanh bóng là biểu hiện cây sinh trưởng tốt. Lá đơn to xanh đậm
biểu hiện của một giống có khả năng chịu rét. Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện
cây sinh trưởng không bình thường. Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét.
Lá kép mọc so le, lá kép thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng
nâu. Cũng có giống khi quả chín lá vẫn giữ được màu xanh, những giống này
thích hợp trồng làm thức ăn gia súc. Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ. Lá có
nhiều hình dạng khác nhau tuỳ theo giống, những giống lá nhỏ và dài chịu hạn
khoẻ nhưng thường cho năng suất thấp. Những giống lá to chống chịu hạn kém
nhưng thường cho năng suất cao hơn. Nếu 2 lá kép đầu to và dày thường biểu
hiện giống có khả năng chống chịu rét. Số lượng lá kép nhiều hay ít, diện tích lá
to hay nhỏ chi phối rất lớn đến năng suất và phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng.
Các lá nằm cạnh chùm hoa nào giữ vai trò chủ chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho
chùm hoa ấy. Nếu vì điều kiện nào đó làm cho lá bị úa vàng thì quả ở vị tr đó
thường bị rụng hoặc lép. Các nhà chọn giống đậu tương đưa ra cơ sở để nâng cao
năng suất đậu tương là tăng cường quá trình quang hợp và muốn quang hợp với
hiệu quả cao thì phải chọn những cây có bộ lá nhỏ, dày, thế lá đứng và lá có
dạng hình trứng. Số lá nhiều to khoẻ nhất vào thời kỳ đang ra hoa rộ. Khi phiến
lá phát triển to, rộng, mỏng, phẳng, có màu xanh tươi là biểu hiện cây sinh
trưởng khoẻ có khả năng cho năng suất cao [14]
Hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại cánh bướm. Màu sắc của
hoa thay đổi tuỳ theo giống và thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng. Đa phần
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
các giống có hoa màu tím và tím nhạt. Các giống đậu tương có hoa màu trắng
10
thường có tỷ lệ dầu cao hơn các giống màu tím. Hoa phát sinh ở nách lá, đầu
cành và đầu thân. Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1-10 hoa và
thường có 3-5 hoa. Hoa đậu tương ra nhiều nhưng tỷ lệ rụng rất cao khoảng 30%
có khi lên tới 80% [14]. Hoa đậu tương thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính trong
hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy. Đài
hoa có màu xanh, nhiều bông. Các cánh hoa vươn ra khỏi lá đài từ ngày hôm
trước và việc thụ phấn xẩy ra vào sáng ngày hôm sau lúc 8-9 giờ sáng trước khi
nụ hoặc hoa chưa nở hoàn toàn. Mùa hè hoa thường nở sớm hơn mùa đông và
thời gian nở hoa rất ngắn sáng nở chiều tàn. Hoa đậu tương thường thụ phấn
trước khi hoa nở và là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chiếm trung bình
0,5 - 1%. Thời gian bắt đầu ra hoa sớm hay muộn, dài hay ngắn tuỳ thuộc vào
giống và thời tiết khác nhau. Giống chín sớm sau mọc trên dưới 30 ngày đã ra
hoa và giống chín muộn 45-50 ngày mới ra hoa. Thời gian ra hoa dài hay ngắn
theo giống và theo thời vụ. Có những giống thời gian ra hoa chỉ kéo dài 10-15
ngày. Kết quả nghiên cứu cho thấy thời kỳ hoa rộ thường từ ngày thứ 5 đến ngày
thứ 10 sau khi hoa bắt đầu nở. Hoa trong đợt rộ mới tạo quả nhiều, còn trước và
sau đợt hoa rộ thì tỷ lệ đậu quả thấp. Điều kiện thích hợp cho sự nở hoa là ở nhiệt độ 25-28oC, ẩm độ không khí 75-80%, ẩm độ đất 70-80%. Căn cứ vào
phương thức ra hoa người ta chia các giống đậu tương làm 2 nhóm: (i) Nhóm ra
hoa hữu hạn: Thuộc những giống sinh trưởng hữu hạn, hướng ra hoa theo trình
tự từ trên xuống dưới và từ ngoài vào trong. Những giống này thường cây thấp
ra hoa tập trung, quả và hạt đồng đều. (ii) Nhóm ra hoa vô hạn: Thuộc những
giống sinh trưởng vô hạn, có hướng ra hoa theo trình tự từ dưới lên trên và từ
trong ra ngoài. Những giống này thường ra hoa rất phân tán, quả chín không tập
trung và phẩm chất hạt không đồng đều. Trong thực tế, những giống hoa tập
trung nếu gặp điều kiện bất thuận, hoa sẽ rụng nhiều nên thất thu nặng. Còn
những giống thời gian ra hoa dài tuy quả chín không tập trung nhưng nếu bị rụng
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vào một đợt thì hoa sẽ ra tiếp đợt sau nên không thất thu nặng.
11
Số quả biến động từ 2 đến 20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể đạt tới 400
quả trên một cây. Một quả chứa từ 1 tới 5 hạt, nhưng hầu hết các giống quả
thường từ 2 đến 3 hạt. Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, có chiều dài từ 2 tới
7 cm hoặc hơn. Quả có màu sắc biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu hoặc
đen. Màu sắc quả phụ thuộc vào sắc tố caroten, xanthophyll, màu sắc của lông,
sự có mặt của các sắc tố antocyanin. Lúc quả non có màu xanh nhiều lông (có
khả năng quang hợp do có diệp lục) khi ch n có màu nâu. Hoa đậu tương ra
nhiều nhưng tỷ lệ đậu quả thấp 20-30%. Ví dụ trong vụ xuân 1 cây có thể có 120
hoa nhưng chỉ đậu 30-40 quả là cao, trên một chùm 5-8 hoa chỉ đậu 2- 3 quả.
Những đốt ở phía gốc thường quả ít hoặc không có quả, từ đốt thứ 5-6 trở lên tỷ
lệ đậu quả cao và quả chắc nhiều. Trên cành thường từ đốt 2-3 trở lên mới có
quả chắc, những quả trên đầu cành thường lép nhiều. Sau khi hoa nở được 2
ngày thì cánh hoa héo và rụng, ngày thứ 3 đến ngày thứ 5 sau hoa nở đã hình
thành quả và 7 -8 ngày sau là thấy nhân quả xuất hiện. Trong 18 ngày đầu quả
lớn rất nhanh sau đó chậm dần, vỏ dày lên và chuyển từ màu xanh sang màu
vàng. Hạt lớn nhanh trong vòng 30-35 ngày sau khi hình thành quả. Hạt có nhiều
hình dạng khác nhau: Hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt vv... Hạt to nhỏ khác
nhau tuỳ theo giống, khối lượng một nghìn hạt thay đổi từ 20-400g trung bình từ
l00g-200g. Rốn hạt của các giống khác nhau thì có màu sắc và hình dạng khác
nhau, đây là một biểu hiện đặc trưng của các giống [14].
1.1.3. T uất đậu tươ t ê t v ệt N
Hiện nay có 45% diện tích trồng đậu tương và 55% sản lượng đậu tương
của thế giới nằm ở Mỹ. Nước Mỹ sản xuất 75 triệu tấn đậu tương năm 2000,
trong đó hơn một phần ba được xuất khẩu. Các nước sản xuất đậu tương lớn
khác là Brazil, Argentina, Trung Quốc và Ấn Độ. Phần lớn sản lượng đậu tương
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
của Mỹ hoặc để nuôi gia súc, hoặc để xuất khẩu, mặc dù tiêu thụ đậu tương ở
12
người trên đất nước này đang tăng lên. Dầu đậu tương chiếm tới 80% lượng dầu
ăn được tiêu thụ ở Mỹ [66].
Theo ước tính của Bộ Nông nghiệp Mỹ, tổng sản lượng đậu tương thế giới
năm 2011/12 đạt 236,03 triệu tấn, giảm 28,71 triệu tấn so với sản lượng 264,74
triệu tấn do sản lượng giảm ở Brazil (-10,00 triệu tấn), ở Mỹ (-7,44 triệu tấn), ở
Achentina (-8,00 triệu tấn), ở Trung Quốc (-1,60 triệu tấn), ở Ấn Độ (-1,2 triệu
tấn) và ở Paragoay (-4,37 triệu tấn). Sản lượng đậu tương năm 2011/12 ước tính
đạt (đơn vị: triệu tấn): Brazil 65,50; Mỹ 83,17; Achentina 41,00; Trung Quốc
13,50; ấn Độ 11,00; Paragoay 4,00; Canađa 4,25 và các nước khác 13,61.Tổng
xuất khẩu đậu tương trên thế giới năm 2011/12 ước đạt 90,54 triệu tấn, giảm so
với 92,64 triệu tấn của năm 2010/11. Trong đó, xuất khẩu của các nước ước tính
đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin 36,70; Mỹ 36,74; Achentina 7,80; Paragoay 3,10;
Canađa 2,80 và các nước khác 3,40 [54].
Tổng sản lượng đậu tương thế giới năm 2012- 2013 dự báo đạt 260,46
triệu tấn, điều chỉnh giảm 6,70 triệu tấn (-2,51%) so với dự báo đưa ra hồi tháng
7/2012, song tăng 24,43 triệu tấn (+10,35%) so với sản lượng 236,03 triệu tấn
của năm 2011- 2012, trong đó sản lượng của mỹ sẽ tiếp tục giảm 9,91 triệu tấn (-
11,91%). Sản lượng đậu tương năm 2012- 2013 của các nước dự báo đạt (đơn vị:
triệu tấn): Braxin 81,00; Mỹ 73,27; Achentina 55,00; Trung Quốc 12,60; ấn Độ
11,40; Paragoay 8,10; Canađa 4,50 và các nước khác 14,59. Tổng xuất khẩu đậu
tương trên thế giới trong năm 2012- 2013 dự báo đạt 93,97 triệu tấn, tăng so với
90,54 triệu tấn của năm 2011- 2012. Xuất khẩu đậu tương của các nước trong
năm 2012- 2013 dự báo đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin 37,60; Mỹ 30,21;
Achentina 13,50; Paragoay 5,40; Canađa 3,00 và các nước khác 4,26. (Oilseeds:
World Markets and Trade, August 2012) NVT [54].
Theo dự báo của Bộ Nông nghiệp Mỹ, tổng sản lượng đậu tương thế giới
năm 2012/13 sẽ đạt 258,13 triệu tấn, điều chỉnh giảm 2,33 triệu tấn (-0,89%) so
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
với dự báo hồi tháng 8/2012, song tăng 21,04 triệu tấn (+8,88%) so với 237,09
13
triệu tấn của năm 2011/12. Diện t ch đậu tương toàn cầu dự báo đạt 108,12 triệu
ha, tăng so với 102,10 triệu ha của năm 2011/12; năng suất đậu tương dự báo sẽ
đạt bình quân 2,39 tấn/ha, tăng so với 2,32 tấn/ha của năm 2011/12. Sản lượng
đậu tương năm 2012/13 của các nước dự báo đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin
81,00; Mỹ 71,69; Achentina 55,00; Trung Quốc 12,60; ấn Độ 11,40; Paragoay
8,10; Canađa 4,40 và các nước khác 13,94 [54].
Mặc dù có lịch sử phát triển lâu đời ở nước ta, nhưng trải qua một thời
gian dài cây đậu tương vẫn chiếm một vị trí rất khiêm tốn trong nền sản xuất
nông nghiệp nước ta. Năm 1976, diện t ch đậu tương chỉ đạt gần 40 ngàn ha,
năng suất 5,2 tạ/ha, sản lượng 20,7 ngàn tấn. Năm 1995 có diện tích lớn nhất đạt
121,1 ngàn ha, năng suất 10,3 tạ/ha, sản lượng 125,5 ngàn tấn [65].
Trong những năm gần đây do điều kiện thời tiết không thuận lợi đã khiến
sản lượng đậu tương nước ta giảm đáng kể cụ thể năm 2013 giảm 3% so với năm
2012, xuống còn 168 nghìn tấn. Mưa bão nặng nề và kéo dài suốt năm đã khiến
năng suất cây trồng và diện t ch thu hoạch đậu tương (Bảng 1.1 và Hình 1.4). Quy
mô sản xuất nhỏ lẻ so với các loại cây trồng khác ch nh là nguyên nhân khiến
ngành đậu tương vẫn không đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ trong nước. Tổ chức
USDA dự báo nếu điều kiện thời tiết thuận lợi, diện t ch gieo trồng đậu tương năm
2013 và 2014 lần lượt đạt 120 nghìn và 130 nghìn héc-ta, với mức sản lượng tăng
nhẹ khoảng 176 và 192 nghìn tấn. Khả năng cạnh tranh của đậu tương so với ngô
vẫn còn thấp do sản lượng t nh trên mỗi héc-ta trồng đậu tương thấp hơn so với
trồng ngô. Khu vực trồng đậu tương ch nh tập trung ở vùng Đồng bằng sông
Hồng, miền Bắc nước ta [65]. Theo USDA, sản lượng đậu tương trong những năm
tới sẽ tăng và đạt được mục tiêu mà Ch nh phủ đã đề ra trong Quy hoạch Tổng thể
cho ngành hạt có dầu là 350 nghìn héc-ta diện t ch trồng trọt và 700 nghìn tấn sản
lượng vào năm 2020. Tuy nhiên, năng suất nhìn chung vẫn còn thấp và việc mở
rộng diện t ch trồng trọt của ngành chưa cao, trong đó nguyên nhân ch nh là khả
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
năng cạnh tranh của cây đậu tương.
14
Bảng 1.1. n n ng ản lượng đậ ương 11-2015 [65]
2011 2012 2013 2014* 2015*
Diện t ch (nghìn ha) 181,1 119,6 117,8 120 130
Năngsuất (tấn/ha) 1,47 1,45 1,43 1,47 1,48
N uồ : Tổ ụ T ố ê V ệt N m (GSO), B N ệ v P t t N t , * ố
ệu USD
Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam, *số liệu d báo
Tổng sản lượng(nghìn tấn) 266,9 173,7 168,4 176,4 192,4
1.1. Diện t ch trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2011-2015) [65]
1.2. Bệ d SMV t ê c đậu tươ
1.2.1. Bệnh khảm trên cây đậu tương
Soybean mosaic virus (SMV) là nhân tố biotic gây bệnh khảm ở cây đậu
tương, xảy ra ở tất cả các vùng sản xuất đậu tương trên thế giới. Triệu chứng
biểu hiện bệnh do SMV là khác nhau với từng vật chủ, chủng virus, tuổi cây
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
nhiễm và môi trường. Giống nhiễm nặng nhất thì còi cọc yếu ớt đôi khi bị lùn,
15
không có lông, và không có hạt. Lá chét mọc lên có màu xanh đậm, nhạt sau đó
có thể bị nổi rộp hoặc phồng lên, đặc biệt dọc theo gân chính lá. Lá chính của
một số giống có thể thấy các vùng hoại tử tổn thương, tiếp theo là hiện tượng
vàng lá và rụng lá. Các triệu chứng trên lá này gần giống các triệu chứng khi đậu
tương bị ngộ độc thuốc diệt cỏ 2,4D.
Hạt giống từ cây bị nhiễm bệnh có thể bị đốm nâu hoặc đen, tùy thuộc vào
màu sắc rốn hạt. Hạt có thể nhỏ hơn và nảy mầm kém hơn so với hạt của cây
không bị nhiễm. Những vết lốm đốm không thể hiện sự có mặt của virus cũng
như không phải tất cả các hạt đều chứa virus và không phải tất cả các hạt từ cây
nhiễm virus đều lốm đốm.
Bệnh khảm đậu tương lần đầu tiên được phát hiện ở Mỹ vào năm 1900 và
đến nay virus khảm đã có mặt hầu hết ở các vùng trồng đậu tương trên thế giới
[35]. Việt Nam cũng đã công bố phát hiện loại virus này từ năm 1994, chủ yếu
tập trung ở những vùng trồng đậu tương lớn, như khu vực trung du, miền núi
Bắc Bộ, khu vực đồng bằng Sông Hồng và Tây Nguyên [2], [11]. SMV gây thiệt
hại đáng kể về năng suất, thậm chí một số trường hợp tổn thất có thể lên đến
94% tổng sản lượng đậu tương. Những cây bị nhiễm SMV thường sinh trưởng
chậm, hình thái lá, thân, quả bị biến dạng, khi bị nhiễm ở giai đoạn muộn sẽ làm
giảm sản lượng và chất lượng hạt [35], [36]. SMV là một hình que cong queo
gồm chuỗi RNA đơn. Nhiều chủng virus đã được xác định dựa trên các phản ứng
trên một tập hợp các giống khác nhau. Tại hoa kỳ, SMV được phân loại thành 9
chủng và các chủng hiện nay đã được biết từ G1 đến G7, G7a, và C14. Có thể có
các chủng khác tồn tại, đặc biệt ở Trung Quốc và Nhật Bản [65].
SMV có thể lan truyền trong quần thể đậu tương nhờ rệp và hiện nay
người ta biết đến t nhất có 32 loài rệp thuộc 15 chi khác nhau truyền SMV một
cách không ổn định. Kết quả cây bị nhiễm bệnh do lan truyền qua hạt đóng một
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
vai trò quan trọng trong nghiên cứu bệnh về SMV. Những cây như vậy là nguồn
16
truyền chính cho SMV. Trong hầu hết các giống đậu tương, sự lan truyền bệnh
qua hạt ở một vài giống trong khi ở các giống khác có thể lên đến 75% [65]
1.2.2. Đặc điểm c a SMV
SMV sinh ra ở thể vùi trong tế bào cây bệnh. Thể vùi có dạng hình múi
khế hay hình chong chóng [11]. Thời gian tồn tại của virus trong cây bệnh là 2-5 ngày, nhiệt độ mất hoạt tính là 55-700C. Khi bị chiếu tia cực tím virus bị mất hoạt
tính trong hai giờ. Nhiệt độ thích hợp để virus nhân lên trong tế bào cây bệnh là 21-260C. SMV có thể tồn tại và lan truyền qua hạt giống. Trong hạt giống virus có
thể tồn tại được hai năm. Ngoài ra, virus có thể lan truyền trong quần thể đậu
tương qua loài rệp Aphis. SMV có phạm vi ký chủ rộng và gây hại trên 30 loài cây
trồng đặc biệt là những cây họ đậu. Bệnh phát triển mạnh trên những cây đậu
tương trồng vào vụ đông vào giai đoạn cây ra hoa và hình thành quả. Bệnh gây hại
nặng ở những ruộng đậu tương chăm sóc kém, bón nhiều đạm hoặc bón phân
không cân đối.
Khi bị bệnh lá đậu tương thường có những phần xanh nhạt, đậm và biến
vàng xen kẽ, lá nhăn nheo, mép lá cong xuống, các đốt thân co ngắn, cây chùn lại,
phát triển chậm. Lá non ở ngọn khảm lá mạnh và biến dạng. Số lượng nốt sần trên
cây bệnh thường giảm so với cây khoẻ nên vai trò cố định đạm giảm, rễ cây bệnh
thường bị thối đen. Ở những giống mẫn cảm cây có thể chết. Bệnh gây hại trên quả
làm quả thường lép, vỏ mầu nâu, nhăn nheo biến dạng, sần sùi và có vị đắng. Cây bị nhiễm bệnh thể hiện triệu chứng rõ nhất ở nhiệt độ 10-200 còn dưới 150C và trên 300C cây thường mất triệu chứng [11], [49], [58].
SMV thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae gây bệnh khảm lá đậu tương,
được phát hiện lần đầu tiên bởi Clinton (1915), Gardener và Kendrick (1921) tại
Hoa Kỳ. Chúng có dạng hình sợi mềm với chiều dài khoảng 750nm, đường kính
khoảng 11-15nm [48]. Hệ gen của SMV là RNA dạng sợi đơn dương, phân tử
lượng 3,25 x 106 kDa, tổng k ch thước bộ gen khoảng 10,4 Kb. Hệ gen của
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
SMV gồm các gen mã hóa 3066 amino acid, gồm 10 chuỗi polypeptid: P1
17
proteinase (P1), Helper component proteinase (HC-pro), Protein P3 (P3), 6 kDa
protein 1(6K1), Cytoplasmic inclusion protein (CI), 6 kDa protein 2 (6K2),
Protein liên kết hệ gen virus (VPg), Nuclear inclusion protein A (NIa), Nuclear
inclusion protein B (NIb), Capsid protein (CP). Hệ gen của SMV gồm các gen
mã hóa cho 3066 amino acid, gồm 10 chuỗi polipeptid và được mô phỏng theo
sơ đồ ở hình 1.2.
Hình 1.2. Cấu trúc hệ gen của SMV [48]
HC-Pro: là thành phần trợ giúp và protease; CI: là protein hình trụ;
NIb là RNA polymerase phụ thu c RNA; P1, P3, và NIa là protease;
CP: là protein vỏ c a virus; VPg: là protein liên kết
Hạt SMV được tạo thành từ khoảng 2000 tiểu đơn vị tạo nên lớp vỏ
protein (coat protein) sắp xếp theo kiểu xoắn ốc xung quanh hệ gen RNA virus
[16]. Gen CP ở SMV có k ch thước 807 nucleotide, vùng mã hóa gồm 804
nucleotide mã hóa 267 amino acid, và từ amino acid thứ 33 đến 264 trong CP
được gọi là vùng Poty- coat [37]. Trong nghiên cứu của Lò Thị Mai Thu (2014),
trình tự đoạn gen CP phân lập từ SMV dòng SL1 và SL2 có k ch thước 720
nucleotide, mã hóa 240 amino acid và vùng Poty- coat của protein có 208 amino
acid [16].
1.3. ng ng ậ RNAi ong o đậ ương n g n ng
1.3.1. Cơ chế ức chế gen c a RNAi
Năm 1998, hai nhà khoa học Mỹ là Andrew Fire và Craig Mello đã công bố phát
hiện của họ về một cơ chế có thể làm suy biến RNA thông tin (mRNA) được sao
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
mã từ một gen xác định và họ gọi đó là “RNA can thiệp”.
18
Cơ chế này được kích hoạt khi các phân tử RNA kép (dsRNA) xuất hiện trong tế
bào. Khi đó chuỗi dsRNA kích hoạt “cỗ máy” sinh hoá, làm suy biến các phân tử
mRNA được sao mã di truyền từ ADN không biểu hiện được chức năng giải mã,
cho ra chuỗi protein tương ứng. Đặc biệt, can thiệp RNA với chuỗi dsRNA ngắn
trực tiếp có thể thực hiện trong các tế bào động vật có vú mà không gây nên các
hiệu ứng không đặc hiệu. Từ đó, các ứng dụng của công nghệ RNAi có thể được
sử dụng để xác định và đánh giá chức năng của hàng ngàn gene trong hệ gen có
tiềm năng tham gia vào các kiểu hình của bệnh. Mặt khác, công nghệ RNAi sẽ
cung cấp một phương tiện hiệu quả để ngăn chặn biểu hiện của một gen cụ thể
có liên quan đến bệnh tật [25].
Hình 1.3 mô tả cơ chế RNAi phân hủy RNA. Các phần tử quan trọng
tham dự vào cơ chế can thiệp RNA này là hai enzymes, Dicer và Argonaute, và
những RNA k ch thước nhỏ (si RNA) được tạo ra từ RNA sợi đôi (ds RNA). Khi
có sự xâm nhập của chuỗi xoắn kép RNA vào tế bào, Dicer lập tức cắt những
chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotides, gọi là
siRNA có tiêu hao một phân tử ATP. Sau khi bị cắt ngắn bởi Dicer, chuỗi kép
RNA can thiệp được tách ra làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn RNA với
đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất được chọn để tiếp tục liên kết
với Argonaute. Quá trình lựa chọn chuỗi đơn RNA này xảy ra trong phức hệ
RISC (RNA-induced silencing complex), trong đó có chứa Argounaute và
Helicase. Phức hệ RISC sau đó thu nhận các phân tử phiên mã mRNA của tế bào
có trình tự tương đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn siRNA lúc này đang có
mặt trong phức hệ RISC.
Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các base tương đồng với trình
tự của siRNA, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA.
Phức hệ RISC sẽ cắt mRNA, làm phân tách phân tử mRNA mà không giải mã
nên không có protein nào được tổng hợp hay nói cách khác làm cho RNA bị suy
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
thoái [63].
19
1.3. Cơ chế RNAi phân hủy RNA [55].
RNAi đóng vai trò rất quan trọng trong việc chống lại sự xâm nhiễm của
các virus vào cơ thể vật chủ, đặc biệt là các sinh vật bậc thấp. Bên cạnh đó RNAi
còn đưa ra nhiều ứng dụng thú vị trong kỹ thuật gen tạo ra những cơ hội mới
trong nghiên cứu sinh học y dược, kỹ thuật gen và chăm sóc sức khỏe. Khám phá
ra RNAi không chỉ cung cấp cho chúng ta một công cụ thí nghiệm mạnh mẽ mới
để nghiên cứu chức năng của các gene mà còn có nhiều tiềm năng trong những
ứng dụng tương lai của can thiệp RNA trong y học, sinh học...
Dựa vào hoạt động của cơ chế RNAi, có thể tiến hành thiết kế các vector
chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng ức chế hoạt động của gen ngoại
lai, nhằm tạo giống cây chuyển gen kháng bệnh virus hữu hiệu.
1.3.2. Phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens được ứng dụng rộng
rãi để chuyển một hay nhiều gen vào cây trồng do nhiều đặc t nh ưu việt của hệ
thống chuyển gen này. A.tumefaciens là loài vi khuẩn đất, gram (-), gây bệnh ung
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
thư ở thực vật, chủ yếu lấy nhiễm thực vật qua các vết thương [11]. Có thể
20
truyền bệnh từ loài này sang loài khác. Thực vật bị thương sẽ ứa ra một hợp chất
amino acid, trong đó đường và acid vô cơ là những yếu tố thu hút vi khuẩn xâm
nhiễm bằng cách hóa hướng động. A.tumefaciens có khả năng chuyển một đoạn
DNA từ Ti plasmid (tumor-inducing plasmid) vào tế bào thực vật. Ti plasmid -
một phân tử DNA mạch vòng, sợi kép có trọng lượng phân tử bằng 3-5% so với
trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn. Ti plasmid có k ch thước
khoảng 200 kb, trong tế bào chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập gồm
4 vùng tương đồng: A, B, C và D. Ti plasmid không được dùng trực tiếp trong
các thí nghiệm chuyển gen do một số nhược điểm: có k ch thước lớn, mang các
gen gây khối u, không thể tự nhân lên… Vì vậy, các nhà khoa học đã cải tiến Ti
plasmid, cắt bỏ hầu hết các gen không cần thiết và thay vào đó là các gen chỉ thị
cho chọn lọc, gen đánh dấu và các promoter thích hợp để Ti plasmid có thể nhân
lên và biểu hiện trong E.coli, A.tumefaciens và tế bào thực vật. Các vector được
sử dụng có hiệu quả trong chuyển gen thông qua A.tumefaciens là: vector liên
hợp và vector nhị thể.
Vector (cointegrate) liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn
chức năng của một vector thông thường khác của E. coli, và thường gồm những
phần sau: i) Một vị trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen
of interest = GOI), thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli;
ii) Gen chỉ thị có t nh kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli
và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật; iv) Đoạn
khởi đầu của E. coli, không hoạt động ở A. tumefaciens. Như vậy, vector liên
hợp thực chất là vector lai có chỗ cho GOI đi nhờ như một hành khách vào trong
tế bào thực vật [1], [12] .
Hệ vector nhị thể (binary vector) đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid
thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA. Khắc phục tình trạng
khó nhân bản trong A. tumefaciens, loại vector nhị thể được thiết kế bao gồm các
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
phần như sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở
21
E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực
vật.; iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển
gen thông qua A. tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp; v) Đoạn T –
DNA ngoại biên (border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có. Ngoài
ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển.
Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản. Loại
vector vận tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T – DNA và một plasmid hỗ
trợ có gen vir đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmid hỗ
trợ được cải biến từ các Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích
tế bào thực vật phát triển thành khối u nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập
vào tế bào thực vật [1], [13], [38].
Quá trình chuyển DNA vào thực vật
Đoạn T- DNA muốn được chuyển, trước tiên nó phải được hoạt hoá.
Chính hoạt động của các gen vir đóng vai trò này. Hiện tượng này xảy ra khi
A.tumefaciens bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được tiết ra từ vết
thương của cây hoặc từ tế bào nuôi cấy hay protoplast. Đầu tiên là sự hoạt động
của các sản phẩm được tạo ra từ gen virA. Potein này nằm ở màng trong của tế
bào A.tumefaciens, đóng vai trò như một chất thụ cảm đối với acetosyringon có
trong môi trường. Tín hiệu này sẽ được truyền dẫn qua sự hoạt hoá gen virG.
Protein virG sau đó lại gắn vào gen chỉ huy nằm sát gen khởi động thuộc các gen
vir khác nhau. Bằng cách như vậy, protein của gen virG đã được hoạt hoá làm
tăng quá trình hoạt hoá của ch nh nó đồng thời làm giảm quá trình này của các
operon B, C, D và E. Trong tiến trình chuyển T-DNA, ở giai đoạn đầu xuất hiện
các vết cắt Ti-plasmid tại hai trật tự biên, ở vị trí giữa bazơ nitơ thứ ba và thứ tư
của mạch đơn nằm ph a dưới. Từ đó một mạch đơn T-DNA được giải phóng ra
khỏi Ti-plasmid và thay thế vào đó là một mạch đơn mới được tổng hợp theo
chiều 5‟ – 3‟, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải. Điều này giải thích tại sao
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
đầu biên phải cần thiết cho quá trình chuyển T-DNA vào thực vật. Trong quá
22
trình di chuyển, sợi đơn DNA phải chui qua rất nhiều màng trước khi vào được
đến nhân tế bào thực vật. Vì vậy, để giữ được tình trạng nguyên vẹn thì T- DNA
sợi đơn được gắn với virE. Sản phẩm của gen vir B nằm trên màng tế bào vi
khuẩn có nhiệm vụ chuyển trực tiếp DNA sợi đơn sang tế bào thực vật. Sau khi
T-DNA chui được qua màng tế bào, chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với
DNA nhân thực vật ở những vị trí ngẫu nhiên. Tại đó các gen trên T- DNA dưới
sự điều khiển của gen thực vật bắt đầu sản sinh ra auxin và cytokinin. Đây là các
hợp chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục và dẫn đến hình thành các khối u
[13]. Nhờ đặc điểm này người ta có thể loại bỏ khả năng gây hại của T-DNA
bằng cách thay thế các gen tạo khối u (oncogens) nằm trong hai đầu vùng biên
bằng các gen mong muốn.
1.3.3. Nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus bằng kỹ thuật RNAi
RNAi là một hiện tượng phổ biến xảy ra ở sinh vật nhân chuẩn và đóng
vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như điều hoà sự phát triển, tổ
chức lại nhiễm sắc thể và đặc biệt là quá trình kháng virus. Gần đây, RNAi được
xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại các bệnh do virus gây ra ở
thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi
đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật [27]. Tính hiệu
quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của
virus (gen mã hoá protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp...) có khả năng kháng
lại ch nh virus đó đã được chứng minh bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo
cây trồng kháng các loại virus khác nhau như: Potato virus Y PVY [49],[51]
cucumber mosaic virus CMV, Plum pox potyvirus PPV [39] Tobaco mosaic
virus TMV và Potato virus Y PVY [51], Cho đến nay, đã có một số loại cây
trồng chuyển gen kháng bệnh virus được công nhận và trồng thương mại như:
Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã được
công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; B đao chuyển gen kháng ba
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
loại virus Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow
23
mosaic virus, đã được công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen
kháng Cucumber mosaic virus, được công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài
ra rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai
đoạn khảo nghiệm để được công nhận là giống cây trồng thương mại như: Sắn
chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển
gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng
thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato
leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses
(Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet potato feathery mottle virus
(Potyvirus)...[44].
Đối với cây đậu tương, đã có một vài nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
chuyển gen trong việc nâng cao tính chống chịu bệnh đã đạt được kết quả. Năm
2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra được một dòng cây đậu chuyển gen kháng
virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với t nh kháng lên đến 93%. Lim và
đtg (2007) nghiên cứu chuyển gen HC-pro vào cây đậu tương đã nhận thấy rằng,
cây chuyển gen khi bị lây nhiễm SMV sau 2 tuần triệu chứng nhiễm bệnh khảm
lá do SMV biến mất và lượng SMV đã giảm đáng kể, tuy nhiên HC-Pro của
SMV đã gây biến đổi hình thái lá và giảm sự tạo hạt ở các cây đậu tương chuyển
gen. Các nhà khoa học Việt Nam trong những năm gần đây đã quan tâm vào việc
nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen, tập trung vào hướng cải thiện, nâng
cao khả năng chịu hạn, kháng bệnh. Việc tạo cây chuyển gen kháng virus đã mở
ra một triển vọng mới trong nghiên cứu tạo giống đậu tương kháng virus tại Việt
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Nam.
24
ươ 2
T L Ệ Ư NG
2.1. ật ệu c ất t t v đ đ ê c u
2.1.1. Vật liệu
Giống đậu tương DT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp tạo ra từ tổ hợp
lai DT-80/ĐH4 (DT96) bằng phương pháp lai hữu tính kết hợp gây đột biến thực nghiệm bằng tác nhân gamma Co60 trên dòng lai F3-D333. Giống DT84 có hạt
vàng, hạt tròn, to đẹp, là giống đậu tương hiện nay đang được trồng phổ biến ở
nhiều nơi vì có khả năng cho năng suất cao và chống đổ tốt, nhưng dễ nhiễm
bệnh.
Chủng vi khuẩn A.tumerfacien tái tổ hợp mang vector pK7GW-CPi-SMV
do Đề tài B2013-TN04-05 cung cấp.
2.1.2. Hóa chất v thiết b
Hóa chất được sử dụng cho chuyển gen gồm: sucrose, MES, vitamin B5,
L-cysteine, sodium thiosulfate, AS, DTT, GA3, BAP, MES, L-pyroglutamic
acid, bato pepton, yeast extra, NaCl, trypton, EDTA, marker DNA 1kb, các loại
kháng sinh: cefotaxime,rifamicin, kanamycin…và một số hóa chất khác.
Các thiết bị dùng trong phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật, như: tủ cấy vô
trùng, nồi hấp, tử sấy, bình nuôi cấy, máy nuôi lắc, nồi hút, máy đo pH, cân điện
tử…Một số thiết bị dùng trong phân tích sinh học phân tử: máy li tâm, máy PCR,
máy điện di Powerpac300, máy chụp ảnh, máy soi gel và một số trang thiết bị
khá
2.1.3. Đ a điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm chuyển gen ở đậu tương thông qua A.tumefacien được tiến
hành trên trang thiết bị của Phòng thí nghiệm công nghệ tế bào, Khoa Sinh- Kỹ
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư Phạm- Đại học Thái Nguyên.
25
Th nghiệm phân t ch cây chuyển gen được thực hiện tại Phòng công nghệ
ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viên Hàn lâm Khoa học Công nghệ
Việt Nam.
2.2. P ươ ê c u
2.2.1. Phương pháp tái sinh cây đậu tương từ nách lá mầm
Phương pháp tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm hạt ch n được tiến
hành dựa trên phương pháp của Olhoft và cộng sự (2001), Nguyễn Thu Hiền
(2011) [6], [42]. Các môi trường đều được chuẩn pH và khử trùng, thành phần
các loại môi trường sử dụng cho tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín
được trình bày ở bảng 2.1. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3
lần lặp lại. Các thí nghiệm của phần nuôi cây mô tế bào thực vật đựơc thực hiện
trong phòng nuôi cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 250C ± 2, cường độ chiếu sáng 2000 lux.
2.2.2. ươ v u u c ầ v t c đậu
tươ c u e
Tạo nguyên liệu v cảm ứng tạo đa chồi
Hạt đậu tương DT84 ch n được chọn lựa những hạt tốt, chất lượng cao,
loại bỏ các hạt kém chất lượng, đem rửa sạch, để khô sau đó đem khử trùng bằng
kh Clo. Kh clo được tạo ra bằng cách lấy 20ml Javen rồi bổ sung 5ml HCL
đậm đặc đặt trong bình kín có tủ hốt.
Sau khi khử trùng hạt được cho nảy mầm trên môi trường GM, sau 4-5
ngày cắt lấy phần lá mầm, tách đôi hai lá mầm, cắt bỏ một nửa lá mục đ ch là
loại bỏ đỉnh sinh trưởng và khi nuôi cấy ở giai đoạn sau sẽ không mất nhiều diện
t ch và môi trường. Phần còn lại chứa nách lá mầm sẽ được đặt lên môi trường
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
tạo đa chồi (SIM).
26
B ng 2.1. Thành phần các loại môi trường tái sinh in vitro
Thành phần Loại môi
trường
GM 3,052 g/l muối B5 + 20 g/l sucrose + 6 g/l agar, pH = 5,8
Bổ sung: 1 mg/l vitamin B5
CCM 0,316 g/l muối B5 + 3,9 g/l MES + 30 g/l sucrose + 5 g/l agar, pH =
5,4
Bổ sung: 1 mg/l vitamin B5 + 0,2 mM AS + 400 mg/l L-cysteine +
158 mg/l Sodium thiosulfate + 154 mg/l DTT + 0,25 mg/l GA3 +
BAP
SIM 3,052 g/l muối B5 + 0,59 g/l MES + 30 g/l sucrose, pH = 5,6
Bổ sung: 1 mg/l vitamin B5 + BAP
SEM 4,3 g/l MS + 0,59 g/l MES + 30 g/l sucrose + 6 g/l agar, pH = 5,6.
Bổ sung: 1 mg/l vitamin B5 + 50 mg/l L-asparagine + 100 mg/l L-
pyroglutamic acid + IAA + GA3
RM 1,58 g/l MS + 0,59 g/l MES + 20 g/l sucrose + 6 g/l agar, pH = 5,6.
Bổ sung: IBA + 1 mg/l vitamin B5
Kéo d i chồi v tạo cây ho n chỉnh
Các cụm chồi được tạo ra từ quá trình nuôi cấy trên môi trường SIM được
chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM. Đánh giá khả năng kéo dài của chồi
sau 2 tuần dựa trên việc theo dõi và thống kê số chồi kéo dài/cụm nuôi cấy cũng
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
như chất lượng chồi.
27
Khi các chồi đạt chiều cao từ 4-5 cm, chọn những chồi khỏe chuyển sang
môi trường ra rễ RM. Khi cây in vitro có 3 lá, có bộ rễ đảm bảo (thường sau 2
tuần nuôi cấy) sẽ thực hiện việc ra cây. Cây được lấy ra khỏi bình nuôi cấy một
cách nhẹ nhàng, rửa sạch phần agar bám quanh gốc và rễ, sau đó cây được đặt
trên giá thể ra cây. Cây sống sót trên giá thể được đưa ra trồng trên chậu đất có
bổ sung phân bón và trồng trong điều kiện nhà lưới.
Chuyển gen v o nách lá mầm hạt chín thông qua A. tumefacien
Dựa trên quy trình tái sinh đã được hoàn thiện tiến hành chuyển gen thông
qua nách lá mầm hạt ch n, các bước thực hiện theo sơ đồ hình 2.1. Hạt đậu tương
ch n sau khi được khử trùng, nảy mầm, tách và thu phần lá mầm (tương tự như
tạo nguyên liệu nuôi cấy in vitro trong quy trình tái sinh cây) sẽ được gây tổn
thương bằng mũi dao nhọn từ 7-8 lần vào phần nách lá mầm. Lá mầm đã bị tổn
thương được nhiễm khuẩn Agrobacterium chứa gen quan tâm.
Mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có OD600 đạt 0,6-1trong
thời gian 30 phút. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium bằng cách lấy
một khuẩn lạc mang cấu trúc CPi ( SMV) nuôi trong môi trương 15ml LB lỏng
có bổ sung kháng sinh rifamycin và spectinomycin, bình lỏng được cho vào tủ lắc 117 vòng 280C nuôi qua đêm (16-20h), sau đó tiếp tục bổ sung 1ml LB lỏng
nuôi khỏe thêm 1-2h đến khi OD600 đạt 0,6-1.
Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu thấm khô sau đó đặt mẫu đã lây nhiễm
lên mặt môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc. Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 250C trong thời gian là 4- 5 ngày.
Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp được cho vào trong môi trường
cảm ứng tạo chồi (SIM lỏng) có bổ sung 500 mg/l cefotaxim lắc với thời gian là
10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng. Cắt phần chồi chính trên
các mảnh lá mầm và cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
cefotaxim. Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có
28
bổ sung 500 mg/l cefotaxim và kháng sinh th ch hợp. Sau 2 tuần, các cụm chồi
sống được trên môi trường chọn lọc sẽ được chuyển sang môi trường kéo dài
chồi (SEM) có bổ sung 500 mg/l cefotaxim và kháng sinh th ch hợp. Khi các
chồi đạt k ch thước từ 3-5 cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ (RM).
2.2.4. ươ ọc tử
P t ết DN tổ ố
DNA tổng số từ các mẫu lá non được tách chiết theo phương pháp của
Saghai và cộng sự (1984) [47] với thành phần đệm chiết ở bảng 2.2.
B ng 2.2. Thành phần dung dịch đệm tách DNA tổng số
STT Nồ độ gốc Nồ độ sử dụng
1 Tris-HCl 1M, pH 8 100 mM
2 NaCl 5M 1,4M
3 EDTA 0,5M, PH 8 50 mM
4 CTAB 2% (w/v)
5 Nước khử ion
Các bước tiến hành:
(1) Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bột đã nghiền cho vào ống Eppendorf 1,5 ml. Thêm 700µl dung dịch đệm tách, đảo đều và ủ ở 65oC trong
90 phút.
(2) Bổ sung 700µl hỗn hợp Chloroform : Isoamyl alcohol (tỷ lệ 24:1) vào mỗi
ống, đảo đều sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
(3) Hút 500 µl dịch nổi pha trên sang ống eppendorf khác, bổ sung 500 µl isopropanol lạnh. Để mẫu trong tủ -20oC trong 30 phút.
29
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hình 2.1. Sơ đồ chuyển gen ở đậu tương qua nách lá mầm nhờ A. tumefaciens [8]
30
(4) Ly tâm thu 13000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút để thu tủa DNA, sau đó rửa tủa bằng cồn 70oC.
(5) Loại bỏ cồn, làm khô tủa ở điều kiện nhiệt độ phòng và hòa tan DNA trong nước khử ion vô trùng và bảo quản ở -20oC.
Ki m t m ợ v tinh sạch c a DNA bằ ện di
Điện di kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8%. Sản
phẩm điện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh
sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của
DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
Khuế ạ ạn gen CPi-SMV
DNA tổng số tách chiết từ lá đậu tương được sử dụng làm khuôn cho phản
ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sử có mặt của gen chuyển trong
các dòng đậu tương. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,0%.
Khuếch đại đoạn gen CPi-SMV bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu
SMV-CPi-Fi/SMV-CPi-Ri có trình tự nucleotide thể hiện ở bảng 2.3. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR bào gồm: biến tính ở 940C trong 3 phút; mỗi chuỗi phản ứng 35 chu kì với biến tính ở 940C trong 1 phút, gắn mồi ở 570C trong 45 giây, tổng hợp chuỗi polynucleotid ở 720C; hoàn tất tổng hợp ở 720C trong 5 phút và kết thúc phản ứng ở 40C.
2.3. Trình tự nucleotide của cặp mồi PCR khuếch đại đoạn CPi
Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide c t ư c
đ N
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
SMV-CPi-Fi 5‟- CACCGCAGCAGAAGCTTACA - 3‟ 294 bp SMV-CPi-Ri 5‟ - GCCCAAAAGAGTGTGCATGT - 3‟
31
Thành phần phản ứng PCR nhân bản đoạn gen CPi (SMV-BYMV) được
trình bày ở bảng 2.4.
B ng 2.4. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen CPi
STT Thành phần Th tích (µl)
Nước khử ion 8,6µl 1
Master Mix 12,5µl 2
SMV-CPi-Fi (10pmol/µl) 0,7µl 3
SMV-CPi-Ri (10pmol/µl) 0,7µl 4
DNA khuôn (10 – 20 ng/µl) 2,5µl 5
Tổng Tổng thể tích 25µl
2.2.5. c đ ệu uất c u e
Hiệu suất chuyển gen được t nh theo công thức:
Số dòng cây chuyển gen dương t nh với PCR
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hiệu suất chuyển gen = (%) Tổng số mẫu biến nạp
32
ươ 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N
3.1. t u c u cấu t c CPi v ố đậu tươ T 4
Vector chuyển gen pK7GW-CPi-SMV có cấu trúc gồm promoter 35S,
đoạn gen CPi-SMV, các gen kháng kháng sinh CmR, Km và chứa accs điểm cắt
của một số loại enzyme giới hạn (Hình 3.1).
Hình 3.1. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV) [15]
P35S: Promoter CaMV35S; attB1 và attB2: các vị trí tái tổ hợp trong phản ứng LR; LB: left T-DNA border; RB: right T-DNA border; T35S: terminator 35S; Kan: gen kháng
kanamycin; CmR: gen kháng chloramphenicol; CPi: vị t í ạn CPi chèn vào; vị trí cắt gi i hạn c e zyme t ứng; T35R, P35SF2, Fi, Ri: vị trí bám mồ t ứng.
Tiến hành chuyển cấu trúc CPi -SMV vào giống đậu tương DT84 bằng kĩ
thuật tái sinh đa chồi và chuyển gen gián tiếp thông qua A. tumefacien qua nách
lá mầm ở đậu tương theo phương pháp của Olhoft và cộng sự (2001) [42]. Các
nghiên cứu quy trình tái sinh đậu tương chủ yếu sử dụng hai phương pháp là tái
sinh đa chồi và tái sinh qua phôi soma. Tuy nhiên phương pháp tái sinh qua phôi
soma được nghiên cứu trên nhiều giống đậu tương khác nhau và cho thấy một số
hạn chế, đó là nguồn nguyên liệu khó thu thập, thời gian tái sinh kéo dài (8
tháng), quy trình tương đối phức tạp. Trong khi đó phương pháp tái sinh qua đa
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
chồi có nhiều ưu điểm hơn: chủ động được nguồn nguyên liệu, ít phụ thuộc vào
33
thời vụ, rút ngắn thời gian tạo cây (3 tháng), đồng thời việc khử trùng nguyên
liệu cũng tiến hành khá đơn giản. Có nhiều công trình nghiên cứu chuyển gen
công bố gần đây đã thành công bằng việc sử dụng phương pháp này [40], [41],
[43], [45].
Hạt đậu tương DT84 được khử trùng bằng khí clo trong 16 giờ trong bình
thủy tinh ở tủ hút (Hình 3.2).
A B
A: Hạt khử trùng bằng khí Clo trong t hút; B:Hạt sau khi khử trùng
Hình 3.2. Giai đoạn khử trùng hạt đậu tương DT84
Hạt sau khi khử trùng được cho nảy mầm trên môi trường GM từ 4-5
ngày, sau đó cắt lấy phần lá mầm để tạo nguyên liệu cho biến nạp. Lá mầm được
tách làm đôi sau đó loại đỉnh sinh trưởng và gây tổn thương bằng dao nhọn và
kim châm để tạo đa chồi (Hình 3.4). Kết quả tạo đa chồi ảnh hưởng đến hiệu suất
chuyển gen.
Hình 3.3. Hạt đậu tương DT84 nảy mầm trên môi trường GM chuẩn bị nguyên
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
liệu biến nạp (A: Hạt nảy mầm t ê m t ng GM;B: Hạt DT84 sau 4-5 ngày tuổi)
34
Sau khi gây tổn thương mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có
OD600 đạt 0,6-1 trong thời gian 30 phút và sau đó chuyển mẫu sang môi trường
đồng nuôi cấy (Hình 3.4).
: N mầm B: mầm tổ t m t ị uy
C: u ế ạ uy m t ồng nuôi cấy
3.4. Lây nhiễm A. tumefaciens tái tổ hợp qua nách lá mầm
Mẫu biến nạp được chuyển sang môi trường cảm ứng tạo đa chồi chọc lọc
trên SIM lần 1 và SIM lần 2, sau đó chuyển sang môi trường kéo dài chồi (Hình
3.5).
3.5. Mẫu biến nạp nuôi cấy trên môi trường cảm ứng tạo đa chồi,
ứng tạ ồi và chọn lọc trên SIM lần 2; C: Kéo dài chồi)
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
kéo dài chồi và chọn lọc (A: Cảm ứng tạ ồi và chọc lọc trên SIM lần 1; B: Cảm
35
Mỗi mẫu sau khi biến nạp được chọn lọc trên môi trường có bổ sung
kháng sinh, những mẫu sống sót qua 2 lần chọn lọc được chuyển sang môi
trường ra rễ sau đó đem trồng trên giá thể trong nhà lưới (Hình 3.6).
A
B
Hình 3.6. A: Ra rễ ên mô ường RM; B: Ra cây và trồng trong chậu ở
n lưới [ 39]
Đồng thời với thí nghiệm chuyển gen qua nách lá mầm thông qua A.
tumefaciens thí nghiệm, ở lô đối chứng 1 (ĐC1)- lá mầm đậu tương không được
chuyển gen và cấy trên môi trường có kháng sinh, và ở lô đối chứng 2 (ĐC2) với
lá mầm đậu tương không được chuyển gen cấy trên môi trường không có kháng
sinh. Kết quả biến nạp, tạo đa chồi và kéo dài chồi trên môi trường chọn lọc
bằng kháng sinh được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1 là kết quả biến nạp cấu trúc
pK7GW-CPi-SMV vào giống đậu tương DT84 ở ba lần thí nghiệm lặp lại ngẫu
nhiên là 285 mẫu, số mẫu tạo đa chồi là 144, số mẫu kéo dài chồi là 91. Trong
đó mẫu ĐC1 với 35 mẫu nhưng không còn mẫu nào sống sau khi cho tái sinh
trên môi trường tạo đa chồi có bổ sung kháng sinh do không có gen chọn lọc, các
cây chết dần qua các dần chọn lọc và kết quả không có cây nào được trồng ra
ngoài giá thể. Mẫu ĐC2 với 82 mẫu thu được 33 mẫu tạo đa chồi trên môi
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
trường cảm ứng SIM, và 27 mẫu kéo dài chồi.
36
B ng 3.1. Kết quả biến nạp cấu trúc pK7GW-CPi-SMV, tạo đa chồi và kéo dài
chồi ở giống đậu tương DT84 nhờ A. tumefacien qua nách lá mầm
Lô thí nghiệ v Số mẫu bi n n p Số mẫu t đ Số c ồ d
đố c chồi
ĐC1 35 0 0
ĐC2 82 33 27
1 75 34 23
2 90 65 40
3 120 45 28
Tổng 1, 2, 3 285 144 91
Kết quả theo d i cho thấy, ở lô th nghiệm chuyển gen, số cây tạo rễ là 45,
số cây đem ra trồng trong chậu ở nhà lưới là 45 và số cây sống sót là 5. Còn ở lô
đối chứng ĐC2 số cây ra rễ 21, số cây trồng trên giá thể là 21 và số cây sống sót
là 12 cây (Bảng 3.2).
B 3.2. Kết quả tạo rễ, ra cây và số cây sống sót trong tự nhiên
Lô thí nghiệ Số cây ra r Số c đư c ố c ố t
v đố c t ồ t t t ư
c ậu tự ê
ĐC2 21 21 12
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
Th nghiệm 45 45 5
37
3.2. t c d đậu tươ c u e t ệ T
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
DNA tổng số từ mẫu lá đậu tương giống DT84 được tách chiết theo
phương pháp của Saghai Maroof và cộng sự (1984) [49] và điện di kiểm tra trên
gel agarose, kết quả được thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ mẫu lá của các
dòng cây chuyển gen và đối chứng giống DT84
1- : Đố ứ uy e - : m u y uy e ố - : m u y
uy e ố - : m u y uy e ố - : m u y uy e ố
- : m u y uy e ố
Kết quả thể hiện trên hình 3.6 cho thấy DNA tổng số tách chiết được đảm
bảo về hàm lượng và chất lượng cho việc tiến hành các phản ứng PCR nhân bản
cấu trúc CPi- SMV trong cây đậu tương chuyển gen.
3.2.2. Kết quả nhân bản đoạn gen CPi- SMV từ các d ng cây đậu tương
chuyển gen T0
Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các dòng cây đậu tương
chuyển gen, kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/ SMV-CPi-Ri
được sử dụng để nhân đoạn gen CPi - SMV từ DNA hệ gen. Kết quả PCR nhân
bản đoạn gen CPi –SMV từ DNA tổng số của 5 dòng đậu tương chuyển gen và
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
cây đối chứng có nguồn gốc từ giống DT84 được trình bày ở hình 3.8.
38
3. . Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc
CPi -SMV trong các dòng cây đậu tương chuyển gen và đối chứng
( : e , WT: y ố ứ uy e (+): plasmid pK7GW-CPi-
SMV: ố ứ , , , , : y u t uy e ở t ế ệ T )
Hình 3.8 cho thấy có 4 dòng dương t nh với PCR và đoạn DNA thu được
có k ch thước khoảng 294 bp xuất hiện ở các làn chạy số 1, 2, 4 và 5, trong khi
đó cây đối chứng không chuyển gen (WT) không xuất hiện đoạn DNA ở k ch
thước này.
Các dòng cây đậu tương chuyển gen dương t nh với PCR ở thế hệ T0 của
giống DT84 được ký hiệu là: T84-01, T84-02, T84-04 và T84-05. Kết quả này cho
thấy cấu trúc CPi-SMV đã được chuyển thành công vào giống đậu tương DT84.
3.2.3. Hiệu suất chuyển gen giống đậu tương DT84
Hiệu suất chuyển gen ở thế hệ T0 được t nh bằng tỷ lệ cây dương t nh với
PCR trong tổng số mẫu biến nạp, kết quả thể hiện ở bảng 3.3.
3.3. Hiệu suất chuyển gen ở thế hệ T0
ố ẫu ố c ố t ố c dươ t ệu uất
t t ư v R c u e
tự ê
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
285 5 4 1,40
39
Bảng 3.3 cho thấy, trong tổng số 285 mẫu biến nạp có 5 cây sống sót
trong môi trường tự nhiên (chiếm tỷ lệ 1,75%) và có 4 cây dương t nh với PCR.
Như vậy hiệu suất chuyển gen CPi ở giống đậu tương DT84 là 1,40%.
3.3. T uậ t u ê c u
3.3.1. Khả n ng tạo thực vật chuyển gen kháng virus bằng kỹ thuật RNAi
Hệ gen của SMV là RNA sợi đơn dương. Sự ức chế RNA ngoại lai bằng
cơ chế RNAi chỉ xảy ra khi có sự tương đồng cao giữa các siRNA và gen đ ch
(RNA của virus). Mặt khác, hiệu quả kháng virus của cây chuyển gen phụ thuộc
rất nhiều vào vai trò và chức năng gen của virus trong mục đ ch phân hủy, vì vậy
lựa chọn vùng gen nào để thiết kế cấu trúc RNAi được cho là khâu quan trọng
đưa đến khả năng thành công của kỹ thuật RNAi. Phân tích trình tự của CP của
SMV cho thấy có sự khác biệt lớn về k ch thước và trình tự amino acid, nhưng
lại có sự tương đồng cao về trình tự ở đầu C của CP. Chính vì vậy đầu 3‟ của gen
CP của SMV là sự lựa chọn để thiết kế đoạn gen CPi của SMV (CPi-SMV). Gen
CP là gen đặc trưng nhất ở các Potyvirrus, mã hóa protein CP và được chia
thành ba vùng: vùng đầu N, vùng lõi và vùng đầu C. Chức năng của CP thể hiện
trong sự nhân lên, capsid hóa, di chuyển của virus từ tế bào đến tế bào và trong
sự truyền virus của rệp [52]. Vùng Poty- coat của CP ở SMV có 232 amino acid
từ amino acid thứ 33 đến 264 [37]. Trong nghiên cứu này, đoạn CPi-SMV được
sử dụng để thiết kế vector chuyển gen gồm 294 nucleotide. RNAi được xem là
một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật [27]. Trong đó, cấu
trúc RNAi có chứa trình tự gen lặp lại đảo chiều của virus mục tiêu được sử
dụng để chuyển vào cây. Cấu trúc này sẽ được biểu hiện thành RNA sợi đôi
dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen và k ch th ch cơ chế
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. Vì vậy, kỹ thuật chuyển
40
gen dựa trên cơ chế can thiệp RNA đã được ứng dụng để tạo giống cây trồng
kháng lại virus. Nhiều giống cây trồng kháng được các loại bệnh virus khác nhau
đã được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen RNAi. Năm 2004, Baulcombe đã công
bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trog việc
kháng lại virus ở thực vật [27].
Ứng dụng công nghệ RNAi trong việc tạo cây chuyển gen kháng virus là
một lĩnh vực rất mới mẻ và được cả thế giới quan tâm. Việc tạo cây chuyển gen
kháng virus đã mở ra một triển vọng mới trong tạo thực phẩm sạch và an toàn
cho môi trường.
T nh hiệu qủa của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã
hoá protein của virus (CP, Rep...) có khả năng kháng lại ch nh virus đó đã được
chứng minh bằng thực tế. Nhiều giống cây trồng kháng virus đã được tạo ra
bằng kỹ thuật này. Năm 2007, Bonfim và đtg đã tạo ra được một dòng đậu
tương chuyển gen kháng virus Bean golden mosaic virus với t nh kháng lên đến
93% [28]. Furutani và đtg (2007) đã thành công tạo cây đậu tương biến đổi gen
kháng SMV bằng kỹ thuật RNAi [30].
Cho đến nay đã có nhiều loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus
được công nhận và trồng thương mại như: đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm
vòng (papaya ringspot virus, PRSV); b đao chuyển gen kháng ba loại
virus Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow
mosaic virus, ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, …
Ngoài ra còn rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác
đang trong giai đoạn khảo nghiệm để gen được công nhận là giống cây trồng
thương mại như: khoai mì chuyển gen kháng African cassava mosaic
virus (Begomovirus); bắp chuyển kháng Maize steak virus (Mastrevirus); khoai
tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); lúa chuyển gen
41
kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); khoai lang chuyển gen kháng Sweet
potato feathery mottle virus (Potyvirus)…. [44].
Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus mới chỉ đang
được bắt đầu. Từ việc tổng kết các công trình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
RNAi trong thực tiễn, Đỗ Năng Vịnh (2007) đã khẳng định RNAi là một kỹ
thuật mạnh mẽ và có triển vọng to lớn trong việc ứng dụng tạo cây chuyển gen
kháng virus và là kỹ thuật có thể chủ động tạo ra các giống cây trồng kháng các
Sự can thiệp RNAi đưa ra nhiều ứng dụng thú vị trong kỹ thuật gen. Các
phân tử RNAi có khả năng gây bất hoạt được đưa vào tế bào và k ch hoạt bộ máy
can thiệp RNAi để phá hủy các phân tử mRNA có trình tự nucleotide tương đồng.
Kỹ thuật này đã trở thành một dụng cụ nghiên cứu quan trọng trong ngành sinh
học và y sinh dược học. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để có thể tạo ra
nhiều hơn nữa các giống cây trồng, đặc biệt cây đậu tương có khả năng kháng lại
các loại bệnh do virus gây ra để giảm thiệt hại về năng suất đem lại lợi ch kinh tế
cao cho người nông dân, và giảm được số lượng đậu tương nhập khẩu ở nước ta.
Mọi người hy vọng là kỹ thuật này sẽ được sử dụng trong cả lĩnh vực y học lâm
sàng lẫn ngành nông nghiệp.
bệnh do virus gây ra ở thực vật [21].
3.3.2. Khả n ng chuyển gen đậu tương qua nách lá mầm
Trong chuyển gen ở cây đậu tương, những khó khăn thường gặp trong
biến nạp và tái sinh cây chuyển gen, như: hàm lượng protein trong tế bào và mô
lớn nên dễ nhiễm khuẩn vệ tinh không mong muốn, hạt giống khó bảo quản và
nhanh mất khả năng nảy mầm; khó khăn về mùa vụ sinh thái làm giảm khả năng
tái sinh, sinh trưởng phát triển và sinh sản bình thường của cây biến đổi gen. Để
khắc phục những khó khăn riêng nói trên cần tính toán, khảo sát nồng độ và chủng
loại kháng sinh phù hợp với từng giống sao cho vừa bảo đảm mẫu tái sinh không
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
bị nhiễm khuẩn và nấm lại vừa bảo đảm khả năng tái sinh của tế bào và mô tiếp
42
nhận. Đặc điểm về mùa vụ sinh thái là do yếu tố di truyền của mỗi giống đã được
xác lập qua chọn lọc tự nhiên nên khó có thể thay đổi. Để khắc phục trong nghiên
cứu tái sinh cây đậu tương biến đổi gen có thể lựa chọn giải pháp tính toán thời
gian biến nạp và tái sinh sao cho trùng khớp với thời gian sinh thái của mỗi giống
là tốt nhất. Nhìn chung, đối với cây đậu tương, nghiên cứu tái sinh cây chuyển gen
và ra cây trồng vào vụ xuân hay xuân hè là thích hợp và có thể cho hiệu quả tạo
cây chuyển gen có tỷ lệ sống là cao nhất. Ngoài ra có thể sử dụng buồng sinh
trưởng để chủ động điều tiết nhiệt độ và thời gian chiếu sáng cũng là một giải
pháp kỹ thuật được chấp nhận [17].
Về hiệu suất chuyển gen, hai giống đậu tương ĐT12 và DT84 đã được
Nguyễn Thu Hiền (2011) thử nghiệm chuyển gen gus. Hiệu suất chuyển gen
được kiểm tra ở giai đoạn hạt thu được là 7,8% đối với giống ĐT12 và 4,3 % với
giống DT84. Lò Thị Mai Thu đã chuyển thành công cấu trúc CPi (SMV-BYMV)
vào hai giống đậu tương ĐT12 và DT2008. Thu được 5 dòng cây đậu tương
chuyển gen ở thế hệ T0 từ giống ĐT12 và 19 dòng cây chuyển gen từ giống
DT2008 dương t nh với phản ứng PCR, hiệu suất chuyển gen đạt lần lượt là
1,35% và 2,24%. Hiệu suất chuyển gen GmEXP1 vào cây đậu tương trong
nghiên cứu của Lò Thanh Sơn ở giai đoạn đánh giá T0 đạt 0,53%.
Trong nghiên cứu của chúng tôi việc chuyển cấu trúc CPi (SMV) vào
giống đậu tương DT84 đã được tiến hành và thành công với hiệu suất chuyển
gen được kiểm tra ở giai đoạn T0 là 1,4%. So với những nghiên cứu chuyển gen
vào các giống đậu tương trước thì hiệu suất chuyển gen này còn thấp, vì vậy việc
tăng hiệu suất chuyển gen lên cao hơn là một việc làm cần thiết. Sự thành công
trong việc tạo cây chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tần số biến nạp,
tác nhân chọn lọc, khả năng tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh từ các loại tế bào
và mô tiếp nhận của từng giống, ảnh hưởng của môi trường tái sinh đối với từng
loại mô... Đối với phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens thì hiệu
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
suất chuyển gen không những phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến thực vật
43
mà còn phụ thuộc vào các yếu tố liên quan đến vi khuẩn như: kiểu di truyền của
cây, độ khỏe của mẫu, thời gian cảm ứng, chủng vi khuẩn và dạng Ti-plasmid,
hoạt tính của nhóm gen vir, mật độ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, thao tác xử lí
mẫu trước khi chuyển gen. Trong nhóm các yếu tố liên quan đến thực vật ảnh
hưởng đến hiệu suất chuyển gen thì khả năng tiếp nhận gen và tái sinh của mô
đ ch được quan tâm hơn cả. Cho tới nay đã có nhiều thử nghiệm thành công
trong chuyển gen nhờ vi khuẩn A.tumefaciens và tái sinh cây đậu tương biến đổi
gen từ các loại mô đ ch khác nhau nhưng trong đó hiệu suất cao nhất được nhắc
đến là chuyển gen qua nách lá mầm hạt chín [42], [43]. Vector tái tổ hợp
pk7GW-SMV-CPi chuyển thành công gen đ ch trên cây thuốc lá được sử dụng
để chuyển vào cây đậu tương. Mô tiếp nhận gen chuyển được chúng tôi sử dụng
là nách lá mầm hạt chín của giống đậu tương DT84.
Ưu thế của nách lá mầm hạt ch n ch nh là đặc điểm tái sinh đa chồi (hệ số
tạo chồi cao) mà những mô khác không có. Sự tái sinh của nách lá mầm sau khi
loại bỏ chồi mầm và gây tổn thương để phát sinh chồi bên là rất cao. Mỗi nách lá
mầm có khả năng tái sinh hai hay nhiều chồi bên nên có thể tái sinh tạo nhiều
cây chuyển gen thuộc mỗi dòng, từ đó nâng cao được hiệu suất tạo cây biến đổi
gen. Hơn nữa, việc tạo và thu nhận nguyên liệu cho biến nạp cũng rất dễ dàng
thực hiện bằng cách cho hạt đã khử trùng nảy mầm trên môi trường MS. Sau 4 -
5 ngày gieo hạt, tiến hành tách đôi lá mầm, loại bỏ rễ mầm và chồi mầm là đã
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
sẵn sàng nguyên liệu biến nạp với số lượng lớn.
44
ẾT L N Đ NG
1. t uậ
1.1. Cấu trúc pK7GW-SMV-CPi đã được chuyển thành công vào giống đậu
tương DT84 qua nách lá mầm hạt chín thông qua A.tumerfacien và nhận được 5
dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0.
1.2. Các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 được xác định là dương
tính với phản ứng PCR chiếm 80% và băng DNA thu được có k ch thước khoảng
294 bp.
1.3. Hiệu suất chuyển gen ở thế hệ T0 của giống đậu tương DT84 là 1,4%.
2. Đ
Tiếp tục chọn lọc, phân tích các dòng đậu tương chuyển gen kháng SMV
ở thế hệ T1 và các thế hệ tiếp theo phục vụ công tác chọn giống đậu tương có
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
khả năng kháng virus.
45
T L ỆU THAM KHẢO
T ệt
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, (1997), Công nghệ sinh học th c v t
trong cải tiến giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
2. Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào
(1999), C y u t . Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Nguyễn Danh Đông (1971), Sâu bệnh hạ u t v ện pháp phòng trừ,
Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
4. Chu Hoàng Hà, Đỗ Xuân Đồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê Văn Sơn,
Lê Trần Bình (2011), “Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh đốm vòng ứng
dụng cơ chế RNAi”, H i thảo Quốc gia bệnh hại th c v t Việt nam, tr. 316–326.
5. Chu Hoàng Hà, Nguyễn Minh Hùng, Bùi Chi Lăng, Lê Trần Bình (2004), “Đánh
giá t nh đa dạng của các dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ của Việt Nam
thông qua tách dòng, xác định và so sánh trình tự gen mã hoá protein vỏ (CP)”,
Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(4), tr. 451-459.
6. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn, (2011),
“Nghiên cứu khả năng tái sinh và biến nạp gen qua nách lá mầm của hai giống
đậu tương (Glycine max L.) DT12 và DT84 bằng te um”, Tạp chí
Công nghệ sinh học,8(38), tr. 1305–1310
7. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2012),
“Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc biểu hiện gen mã hóa
kháng nguyên bề mặt của virus H5N1 phục vụ sản xuất vaccine thực vật”, Tạp
chí khoa học công nghệ Đại học Thái nguyên, 89(1), tr. 123-127.
8. Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng
Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), “Phát triển hệ thống tái sinh in vitro ở
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
46
cây đậu tương (Glycine max L. Merril) phục vụ chuyển gen”, Tạp chí khoa học
và công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 52(4), tr. 82-88.
9. Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Phân l p, tạ t biế m ở gen P5CS liên
qu ến tính chịu hạn và thử nghiệm chuy v y u t V ệt Nam,
Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên.
10. Khuất Hữu Khanh (2006), Kỹ thu t gen, nguyên lí và ứng dụng. Nxb
Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr. 56-57.
11. Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh cây chuyên khoa, Nxb Nông nghiệp, Hà
Nội.
12. Nguyễn Đức Thành (2003), Chuy n gen ở th c v t, Nxb Khoa học kỹ thuật,
tr. 28-29.
13. Nguyễn Quang Thạch, (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị
Phương Thảo (2005). Giáo trình công nghê sinh họ ệ Nxb
Nông Nghiệp - Hà Nội, tr. 35-37.
14. Phạm Văn Thiều, (2002), C y u t ĩ t u t trồng và chế biến sản phẩm,
Nxb Nông nghiệp Hà Nội, tr. 15-26.
15. Lò Thị Mai Thu (2014), Phân l ạn gen CP từ Soybean mosaic virus và
phát tri n vector chuy n gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạ y u t
chuy n gen kháng bệnh, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên.
16. Lò Thị Mai Thu, Hoàng Hà, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu
(2014), „„Đặc điểm của đoạn gen mã hóa coat protein phân lập từ soybean
mosaic virus, Tạp chí sinh học, 36(se), tr. 283-292.
17. Lò Thanh Sơn, Nghiên cứu ặ m và chuy e G EXP ê qu ến s
phát tri n b rễ y u t (G y e m x ( ) e ), Luận án tiến sĩ sinh
học, Đại học Thái Nguyên.
18. Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình
(2008), “Tạo cây thuốc lá kháng bệnh virus khảm dưa chuột bằng kỹ thuật
RNAi”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6 (4A), tr. 679 – 687.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
47
19. Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Lê Trần Bình (2009), “Xác định virus gây
bệnh khảm dưa chuột (Cucumber mosaic virus – CMV) trên cây thuốc lá tại Cao
Bằng và Hà Tây thông qua tách dòng và giải trình tự gen mã hóa protein MP và
CP”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 47 (3), tr. 1-7.
20. Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà , Lê Trần Bình (2009), “Cây thuốc lá chuyển gen
mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời hai loại virus gây bệnh khảm”, Tạpchí
Công nghệ Sinh học, 7 (2), tr. 241-249.
21. Đỗ Năng Vịnh (2007), “Công nghệ can thiệp RNAi (RNAi) gây bất hoạt gen và
tiềm năng ứng dụng to lớn”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5 (3), tr 265-275.
22. Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu, Lê Trần
Bình (2009), “Thiết kế vector cấu trúc RNAi mang gen của virus gây bệnh xoăn
lá cà chua”, H i nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, tr. 473 - 477.
23. Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu, Lê Trần
Bình (2011), “So sánh t nh kháng bệnh xoăn vàng lá của các dòng cà chua
chuyển gen mang cấu trúc RNAi đơn gen và đồng thời hai gen của Tomato
yellow leaf curl Vietnam virus”, H i thảo Quốc gia Bệnh hại th c v t Việt Nam
2011, tr. 290 – 299.
24. Nguyễn Thị Hải Yến (2012), Nghiên cứu tạo cây cà chua kháng bệ x ă v
lá do virus bằng kỹ thu t chuy n gen, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện Công nghệ
Sinh học - VAST.
25. Can thiệp RNA v i cu c sống, tạp chí KH&CN Nghệ An số 12-2012.
T
26. Bartel D. P.
(2004), “MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism
andfunction”, Cell., 116, pp. 281–297.
27. Baulcombe D. (2004), “RNA silencing in plants”, Nature, 431, pp. 356-363.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
48
28. Bonfim K., Faria J. C., Nogueira, E. O., Mendes E. A., Aragão F. J.
(2007),“RNAi-mediated resistance to Bean golden mosaic virus in genetically
engineered common bean (Phaseolus vulgaris)”, Mol. Plant Microbe Interact,
20, pp. 717 – 726.
29. FAO/WHO (1990) Expert consultation on protein quality evaluation.
Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome.
30. Furutani N., Yamagishi N., Hidaka S., Shizukawa Y., Kanematsu S., Kosaka Y.
(2007), “Soybean mosaic virus resistance in transgenic soybean caused by post-
transcriptional gene silencing”, Breed. Sci., 57, pp. 123–128.
31. Gary Stacey, (2008), Genetics and genomics of soybean, Springer.
32. Gottula J., Fuchs M., (2009), “Toward a quarter century of pathogen-derived
resistance and practical approaches to plant virus disease control”. Adv Virus
Res. 75, pp. 161-83.
33. Hammond S. M., Bernstein E., Beach D., Hannon G. J. (2000), “An
RNAdirected nuclease mediates post - transcriptional gene silencing in
Drosophila cells”, Nature, 404, pp. 293 – 296
34. Hartman G. L., Sinclair J. B., Rupe J. C. (1999), Compendium of Soybean
Diseases, Fourth Edition, The American Phytopathological Society Press,
Minnesota, USA.
35. Hinchee M. A. W., Conner W. D. V., Newell C. A., McDonnell R. E.,. Sato S. J,
Gasser C. S., Fischhoff D. A., Re D. B., Fraley R. T., Horsch R. B. (1988),
“Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA
transfer”, Nat. Biotechnol., 6, pp. 915–922.
36. Hill J., Bailey T. B., Benner H. I., Tachibana H., Durand D. P. (1987), “Soybean
mosaic virus: Effects of primary disease incidence on yield and seed quality”,
Plant Disease, 71, pp. 237-239.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
49
37. Jayaram C., Hill J. H., Miller W. A. (1992), “Complete nucleotide sequences of
two soybean mosaic virus strains differentiated by response of soybean
containing the Rsv resistance gene”, J. Gen. Virol., 73, pp. 2067-2077.
38. Matthews P.R., Wang M.B., Waterhouse P.M., Thornton S., Fieg S.J.,
Gubler F.,
Jacobsen
J.V.
(2001), “Marker gene elimination
from
transgenic barley, using co-transformation with adjacent „twin T-DNAs‟
on stDNAard Agrobacterium transformation vector”. Mol Breed 7: pp.
195- 202.
39. Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005), “Hairpin RNA-
mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and
predictable resistance to the virus”. Transgenic Res. 14(6), pp. 989-994.
40. Olhoft P.M et al., (2007), “A novel Agrobacterium rhizogenes- mediated
transfomation method of soybean [Glycine max (L) Merrill] using primary-node
explants from seedings”, I V t e Dev B -Plant, 43, pp. 536–549
41. Olhoft, P.M.
and D.A. Somers.,
(2001),
“L-Cysteine
increases
Agrobacteriummediated T-DNA delivery
into soybean cotyledonarynode
cells”. Plant Cell Rep. 20, pp.706–711.
42. Olhoft, P.M. and D.A. Somers (2007), Soybean. In: Pua, E.C. and M.R. Davey
(eds.) Biotechnology in Agriculture and Forestry. 61, pp. 3–27.
43. Paz, M.M., H., Shou., Z. Guo Z., Zhang., A.K., Banerjee and Wang K.,
(2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacterium- mediated
soybean transformation using the cotyledonary node explant”. Euphytica
136, pp.167–179.
44. Reddy D. V. R., Sudarshana M. R., Fuchs M., Rao N. C. and Thottappilly G.,
2009. “Genetically Engineered Virus-Resistant Plants in Developing Countries:
Current Status and Future Prospects”. Advances in Virus Research 75, pp. 185-
220.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
50
45. Ren- Gao X., Hong-Feng X and Zhang R., (2006), “A multi-needle-assised
transfomation of soybean cotyledonary node cells”, Biotechnol Lett, 28, pp.
1551– 1557
46. Ren GX, Zhang B, Hong FX (2007) “Overexpression of a NTR1 in
transgenic soybean confers tolerance to water stress”. Plant Cell Tiss
Organ Cult 9: pp.177-183.
47. Saghai M. M. A., Soliman K. M., Jorgenser R. A., Allard R. W., ( 1984),
“Ribisomal DNA space –
length polymorphism
in barley: Mendelian
inheritance, chrommosomal location and population dynamics”, Proc Natl Acad
Sci USA, 81, pp. 8014-8018.
48. Smith NA., Singh SP., Wang MB., Stoutjesdijl PA., Green AG., Waterhouse
PM., (2000), Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature 407, pp.
319-320.
49. Sun ZN., Yin GH., Song YZ., An HL., Zhu CX., Wen FJ., (2010), “Bacterially
Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco
Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect
Tobacco from Viral Infection”. Appl Biochem Biotechnol, 162 (5), pp. 1517
50. Urcuqui I. S., Haenni A. L., and Bernardi F., (2001), “Potyvirus proteins: a
wealth of functions”. Virus Research 74: pp. 157-175.
51. Waterhouse PM., Graham MW., Wang MB., (1998), “Virus resistance and gene
silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and
antisense RNA”. Proc Natl Acad Sci USA 95(23), pp.13959-13964.
Internet
52. http://xttm.agroviet.gov.vn/Site/viVN/76/tapchi/67/112/5022/Default.aspx
53. https://books.google.com.vn/books?Genetics+and+genomics+of -
soybean
54. www.gso.gov.vn
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
51
55. http://www.hcmbiotech.com.vn/print.php?id=1388&p=news&f1=title_vn&f2=d
etail_vn
56. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
57. http://www.mekonginfo.org
58. http://www.tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Bệnh_khảm_vàngậu_nành)
59. http://tiennong.vn/vn/bh/benh-kham-kham-vo-hat-dau-tuong-soybean-mosaic-
virus_131.aspx
60. http://m.tribenhtri.vn/item/gia-tri-dinh-duong-cua-cay-dau-tuong
61. http://www.intechopen.com/books/howtoreference/a-comprehensive-survey-of-
international-soybean-research-genetics-physiology-agronomy-and-nitrogen-
relationships/gene-duplication-and-rna-silencing-in-soybean
62. http://soydiseases.illinois.edu/index.cfm?category=diseases&disease=79
63. http://www.vietrade.gov.vn/nong-sn-khac/4258-nganh-u-tng-vit-nam-nm-2013-
va-mt-s-d-bao.html.
64. http://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90%E1%BA%ADu_t%C6%B0%C6%A1ng.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
