Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tách dòng và thiết kế vector chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6 từ cây Arabidopsis thaliana

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MA THỊ THU LỆ

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR

CHUYỂN GENE CHỊU HẠN AtYUCCA6

TỪ CÂY Arabidopsis thaliana

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MA THỊ THU LỆ

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE CHỊU HẠN AtYUCCA6 TỪ CÂY Arabidopsis thaliana

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số ngành: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Tiến Dũng

2. GS TS. Ngô Xuân Bình

Thái Nguyên - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu.

Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng quy tắc. Kết quả trình bày trong

luận văn được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng được ai

công bố trước đây.

Thái Nguyên, ngày 2 tháng 8 năm 2019

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Ma Thị Thu Lệ

ii

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn, em đã nhận được sự giúp

đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân.

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Tiến Dũng và

GS TS. Ngô Xuân Bình đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình

thực hiện và hoàn thành luận văn này.

Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến các cán bộ, giảng viên khoa Công nghệ sinh học

- Công nghệ thực phẩm Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện

thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này.

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình,

người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và

thực hiện đề tài.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Em xin chân thành cảm ơn!

iii

LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................ iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ................................... v DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................... vi DANH MỤC BẢNG BIỂU .................................................................... vii MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề .......................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................... 2 3. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .......................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 3 1.1. Ảnh hưởng của hạn đối với thực vật .............................................. 3 1.2. Đáp ứng hạn của thực vật ............................................................... 6 1.3. Nhóm gene chịu hạn AtYUCCA và đặc điểm của gene chịu hạn AtYUCCA6 ..................................................................................................... 11 1.4. Những kết quả nghiên cứu về chuyển gene chịu hạn ................... 13 1.4.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gene chịu hạn ......................... 13 1.4.2. Những kết quả nghiên cứu về chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6 ...................................................................................... 15 1.5. Phương pháp chuyển gene ở thực vật qua Agrobacterium .......... 16 Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 18 2.1. Đối tượng, phạm vi, vật liệu nghiên cứu ...................................... 18 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................ 18 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................... 18 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................ 18 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu .............................................................. 18 2.2.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................. 18 2.3. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu .......................................... 18 2.3.1. Vật liêu nghiên cứu ................................................................ 18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

iv

2.3.2. Hóa chất và trang thiết bị nghiên cứu .................................... 19 2.4. Nội dung nghiên cứu .................................................................... 21 2.4.1. Nội dung 1: Sàng lọc gen chịu hạn AtYUCCA6 ................... 21 2.4.2. Nội dung 2: Tách dòng gen AtYUCCA6 .............................. 21 2.4.3. Nội dung 3: Thiết kế vector chuyển gen AtYUCCA6 .......... 22 2.4.4. Nội dung 4: Nghiên cứu chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana .............................................................................................. 22 2.5. Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 22 2.5.1. Sàng lọc gene chịu hạn AtYUCCA6 ..................................... 22 2.5.2. Tách dòng gene AtYUCCA6 ................................................. 22 2.5.3. Phương pháp thiết kế vector chuyển gene AtYUCCA6 ........ 28 2.5.4. Phương pháp chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana ....... 29 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 33 3.1. Phân tích gene AtYUCCA6 trên cơ sở dữ liệu database ............. 33 3.2. Tách dòng gene AtYUCCA6 ....................................................... 34 3.3. Gắn vào vector chuyển gene ........................................................ 39 3.4. Tạo cây Arabidopsis chuyển gene AtYUCCA6 ........................... 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................. 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 45 PHỤ LỤC ................................................................................................ 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

v

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

ABA : Axit abxixic

BR : Brassinosteroid

DREB : Dehydration - responsive element binding

ERF : Ethylene - responsive factor

FMOs : Monooxygenease flavin

GPCRs : G-protein-couple receptor

IAA : Indole-3-acetic acid

PBS : pBluescript)

RAV : Related to ABI3/VP1

RLKs : Eceptor-like kinase

ROS : Reactive oxygene species

T6P : Trehalose - 6 - phosphate

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Trp : Tryptophan

vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Sơ đồ đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn ......................... 8

Hình 1.2. Sơ đồ chuyển đổi Trp thành IAA có sự tham gia của YUCs .... 11

Hình 2.1. Sơ đồ tạo cây A. thaliana chuyển gen ....................................... 30

Hình 3.1. Vị trí của gen AtYUCCA6 (At5g25620) trên nhiễm sắc thể số 5

................................................................................................... 33

Hình 3.2 . Cấu trúc gen AtYUCCA6. ......................................................... 33

Hình 3.3. Biểu hiện của gene AtYUCCA6 ở cây Arabidopsis thaliana .... 34

Hình 3.4 . Trình tự vùng mã hóa của gen AtYUCCA6 và trình tự protein

tương ứng. ................................................................................. 35

Hình 3.5. Hình vẽ cấu trúc vector nhân dòng và vector chuyển gene

AtYUCCA6. ............................................................................. 37

Hình 3.6. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc mang gene AtYUCCA6 bằng PCR và

enzyme giới hạn. ....................................................................... 38

Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gene tách dòng AtYUCCA6 với cặp mổi

ngược M13. ............................................................................... 38

Hình 3.8. Kết quả giải trình kiểm tra kết quả thiết kế vector chuyển gen

AtYUCCA6 .............................................................................. 40

Hình 3.9. Kết quả phân tích cây chuyển gen bằng PCR sử dụng cặp mồi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

AtYUCCA6-F và pER8-R. ....................................................... 42

vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1. Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu ............................ 19

Bảng 2.2. Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ............. 19

Bảng 2.3. Trang thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu .......................... 21

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ...................................... 23

Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng PCR .................................................. 24

Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ................................................ 24

Bảng 2.7. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid .................................... 26

Bảng 3.1. Kết quả chọn lọc cây chuyển gen AtYUCCA6 trên môi trường

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

kháng sinh kanamycin ................................................................ 41

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Hạn hán là một trong những yếu tố thách thức nền an ninh lương thực thế giới

vào thế kỉ 21. Trong bối cảnh biến đổi khí hậu toàn cầu, ở Việt Nam, hạn hán xảy ra

ngày càng thường xuyên hơn, ở nhiều vùng rộng lớn, với mức độ và thời gian khác

nhau gây thiệt hại to lớn đối với kinh tế xã hội, đặc biệt là sản xuất nông nghiệp. Vấn

đề càng trở nên cấp thiết khi hầu hết đất canh tác bị hạn lại tập trung ở vùng sâu vùng

xa - nơi mà cuộc sống của người dân còn nhiều thiếu thốn, chủ yếu dựa vào sản phẩm

nông nghiệp. Vì vậy, việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gene có tính chịu hạn

cao có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong việc giữ vững và nâng cao năng suất cây

trồng, góp phần xóa đói giảm nghèo, ổn định xã hội.

Trong cơ thể thực vật, hạn hán gây ra nhiều phản ứng, từ việc thay đổi biểu

hiện gene, trao đổi chất trong tế bào cho đến những thay đổi lớn liên quan đến mức

sinh trưởng và năng suất cây trồng. Ở mức độ phân tử, yếu tố môi trường bất lợi làm

gia tăng mức độ biểu hiện và tích lũy của hàng loạt các gene đáp ứng điều kiện hạn,

bao gồm các gene liên quan đến tổng hợp chất điều hòa thẩm thấu, các gene mã hóa

cho các protein, các phân tử tín hiệu và các yếu tố phiên mã [37]. Trong đó, các yếu

tố phiên mã được nghiên cứu nhiều bởi hoạt động của chúng gây tác động đến sự

biểu hiện của hàng loạt các đáp ứng với điều kiện bất lợi của môi trường.

AtYUCCA6 là một gene thuộc họ gene YUCCA mã hóa cho protein nhóm flavin

monooxyenases có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp auxin - hormone sinh

trưởng có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng của tế bào và cơ thể thực vật.

Auxin kích thích sự phát triển của rễ, thúc đẩy sự hấp thụ và vận chuyển nước trong

cây, giúp cây vượt qua điều kiện hạn hán, bất lợi [30]. Nhiều bài báo Quốc tế đã chỉ

rằng sự có mặt và tăng cường biểu hiện của gene AtYUCCA6 làm tăng khả năng chịu

hạn của cây do thúc đẩy tổng hợp auxin trong cơ thể thực vật [45, 32]. Tuy nhiên,

cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có một công trình nào nghiên cứu phân lập có hệ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thống gene AtYUCCA6.

2

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tách dòng và thiết kế

vector chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6 từ cây Arabidopsis thaliana”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập, tách dòng và thiết kế thành công vector chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6.

- Nghiên cứu chuyển gene và đánh giá biểu hiện của gene trên cây Arabidopsis thaliana.

3. Đối tượng nghiên cứu

- Gen chịu hạn AtYUCCA6 từ cây Arabidopsis thaliana.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

* Về mặt khoa học

- Việc tách dòng và phát triển thành công vector chuyển gene thực vật mang cấu

trúc gene AtYUCCA6 góp phần khẳng định cơ sở khoa học của kỹ thuật chuyển gene

trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây.

- Toàn bộ nghiên cứu là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và

giảng dạy.

* Về mặt thực tiễn

- Kết quả thiết kế vector chuyển gene thực vật mang gene AtYUCCA6 liên quan

đến tính chịu hạn của cây là vật liệu quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thuật chuyển gene trong cải thiện khả năng chịu hạn của thực vật.

3

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Ảnh hưởng của hạn đối với thực vật

Hạn đối với thực vật là khái niệm đựợc dùng để chỉ trạng thái thiếu nước do

môi trường gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn sống, làm ảnh

hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Môi trường khô hạn gây

ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới

phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển [4]..

Hạ 4].ối với thực ác yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới sinh trưởng và

năng suất cây trồng. Hạn làm thay đổi nhiều quá trình sinh lý và có thể làm bi 4].ối

với thực ác yếu tố môi tH 4].ối với thực ác yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới

sinh trưởng và năng suất câng mưa, giảm lượng ẩm trong không khí, suy kiệt dòng

chảy sông suối, hạ thấp mực nước ao hồ, mực nước trong các tầng chứa nước dưới

đất, … Xét trên mối quan hệ giữa hạn với thực vật, hạn của môi trường được chia

làm hai kiểu: Hạn đất và hạn không khí [3].

- Hạn đất: Hạn đất xuất hiện khi không có mưa trong thời gian dài, khi cây

không thể hút đủ nước bù đắp lại lượng nước mất đi qua con đường thoát hơi nước,

dẫn tới sự mất cân bằng nước trong cây và cây có dấu hiệu bị khô héo.

- Hạn không khí: Hạn không khí xuất hiện khi độ ẩm tương đối của không khí

giảm xuống quá thấp, gia tăng gradient hơi nước giữa không gian bên trong lá dưới

khí khổng và không gian ngay bên ngoài lá, thoát hơi nước tăng nhanh, gây nên sự

mất cân bằng nước trong mô cây và cây bị héo

a. Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật.

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng chống chịu của thực vật

trước các điều kiện phi sinh học. Nhiệt độ cao, hạn và nồng độ muối cao là những

yếu tố gây hại lớn nhất, ảnh hưởng nghiêm trọng đến thực vật. Nhiệt độ cao ảnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

hưởng trực tiếp đến cấu trúc protein, màng sinh chất và làm ngừng các quá trình

4

quang hợp, hô hấp nội bào và thậm chí có thể gây chết tế bào hàng loạt. Trong khi

đó, hạn và mặn làm giảm thế nước của thực vật, làm tế bào không thể phát triển, phá

vỡ các protein trong tế bào, gây mất cân bằng ion dẫn đến các hoạt động trao đổi chất

bị đình trệ, quang hợp bị ức chế và có thể gây chết tế bào [2].

b. Ảnh hưởng của hạn đến sự sinh trưởng và hấp thu nước

Đáp ứng đầu tiên của thực vật đối với điều kiện bất lợi gây ra bởi hạn là ngừng

sinh trưởng. Sự hạn chế sinh trưởng của chồi trong điều kiện hạn làm giảm nhu cầu

trao đổi chất của thực vật và kích thích các quá trình sinh tổng hợp các hợp chất bảo

vệ, điều chỉnh thẩm thấu. Sự ngưng sinh trưởng ở rễ cho phép mô phân sinh của rễ

vẫn thực hiện chức năng và phát triển nhanh chóng khi điều kiện bất lợi giảm. Hạn

chế sự phát triển rễ bên cũng là một cách thức đáp ứng hạn, điều này thúc đẩy sự sinh

trưởng của rễ chính, giúp tăng cường khả năng hấp thu nước từ các tầng đất sâu hơn.

Nước sẵn có trong tế bào bị giảm do thiếu hụt nước từ rễ lên lá, gây ra bởi sự

đóng khí khổng. Quá trình dẫn truyền nước trong cây giảm làm giảm nhu cầu dinh

dưỡng của chồi, nó cũng cản trở sự dẫn truyền trong mạch gỗ và có thể hình thành

một đáp ứng thích nghi. Điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một cách đối phó với hạn

của thực vật. Sự tổng hợp các chất tan như polyol và proline trong điều kiện bất lợi

giúp thực vật ngăn chặn sự mất nước và các chất này đóng vai trò quan trọng trong

việc duy trì sức trương của tế bào [3]. Sự thay đổi trong sinh trưởng cùng với việc

giảm hoạt động của cơ quan quang hợp do sự tiếp xúc với điều kiện bất lợi trước đó

dẫn đến sự biến đổi trong sự phân chia nguồn carbon giữa các tế bào/mô sản xuất và

tế bào/mô tích trữ. Vì vậy, các phân tử carbohydrate cung cấp cho quá trình sinh trưởng

trong điều kiện bình thường bây giờ được dùng cho sinh trưởng rễ hoặc để tổng hợp các

chất điều chỉnh thẩm thấu [1].

c. Ảnh hưởng của hạn đến quang hợp

Sự thiếu hụt nước đã làm tăng cường tổng hợp ABA khiến cho khí khổng đóng

lại. Điều này làm giảm hàm lượng CO2 trong mô lá và cản trở quá trình quang hợp.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Sự cản trở quá trình quang hợp sẽ mất đi và quang hợp sẽ phục hồi nếu khí khổng

5

mở ra khi điều kiện trở lại bình thường. Một vài loài thực vật đã sử dụng sản phẩm

của quang hợp để điều chỉnh thẩm thấu, điều này giúp ngăn cản sự mất sức trương

của tế bào.

Sự hạn chế CO2 do kéo dài thời gian đóng khí khổng trong điều kiện bất lợi dẫn

đến sự tích lũy các hợp chất làm giảm khả năng vận chuyển electron, điều này có thể

làm giảm các phân tử oxy và tăng cường các dạng ROS (reactive oxygene species).

ROS là các phân tử hóa học chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp vỏ ngoài cùng như

superoxide, hydropeoxide, hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS trong tế bào gây

tác động trực tiếp đến các phân tử lớn như axit nucleic (DNA và RNA), protein và

lipid. Các phân tử bị oxy hóa bởi ROS có thể bị biến đổi cấu trúc và cơ chế tổng hợp,

gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn đến sai hỏng hoặc mất chức năng,

thậm chí gây chết tế bào [3].

d. Ảnh hưởng của hạn đến hô hấp nội bào

Sinh trưg của hạn đến hô hấp nội bàoc chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp 2 đưh

trưg của hạn đến hô hấp nội bào2 thh trưg của hạn đến hô hấp nội bệ số hô hấp được

điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp - ATP, nưg của

hạn đến hô hấp nội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng

sản phẩm của hô hấp hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS trong tế bào gt triển

của thực vật). Trong điều kiện hạn, các quá trình này bị ảnh hưởng và dẫn đến sự tăng

cường hô hấp. Bên cạnh đó, sự tăng cường hô hấp cũng là do sự kích hoạt các quá

trình đòi hỏi nhiều năng lượng như tổng hợp các chất điều chỉnh thẩm thấu và chống

oxi hóa xảy ra trong điều kiện hạn [1].

e. Ảnh hưởng của hạn đến hormone

Hormone thcủa hạn đến hormonenội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá

trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất

ROS trong tế bào gt triển của tàm khí khổng đóng lại và cản trở quá trình sinh trưởng

của thực vật, vì vậy nó cho phép thực vật thích ứng với điều kiện hạn [1]. Ở lúa mne

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thcủa hạn đến hormonenội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng

6

sử dụng sản phẩm của hô hấp hydroxyhống chịu hạn. Kết quả theo dõi 9-cis-

epoxycarotenoid dioxygenease (NCED3), mhạn đến hormonenội bệ số hô hấp được

điều chỉnh bởi các A. thaliana trong điana, mhạn đến hormonenội bệ số hô hấp được

hiong[34]. Bên c điana, mhạn đến hormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến

đổi khi thực vật chống chịu với hạn. Ở lúa mì, khả năng chống chịu hạn đã được hỗ

trợ bởi sự giảm hàm lượng indole-3-acetic acid (IAA) ormo. Tuy nhiên, có m(IAA)

ormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai đoạn

đầu tiếp xúc với hạn, sau đó giúp thực vật tập chống chịu với hạn ở giai đoạn sau [2].

S2]. nhiên, có m(IAA) ormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực

vật chốsuốt giai đoạn đầu tiếp xúc với hạn, sau đó giúp thực vật tập chcytokinin cũng

gihiên, có m(IAA) ormonenộ1]. gihiên, có m(IAA) ormonenội bệ số hô hượng auxin

cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai đoạn đầu tiếp Cytokinin đư có m(IAA)

ormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai có sự

tăng cường biểu hiện của gene ipt liên quan đm(IAA) ormonenội bệ số hôn dẫn đến

những đáp ứng hạn. Cytokinin cũng gây ng hạnnenội bệ số hô hượng auxin cũng có

sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai có sự tăng cường biểu hiện của đó giúp thực vật

tậchịu hạn của A.thaliana đưhalianan cũ..

Brassinosteroid (BR) cũng đã được báo cáo rằng có khả năng bảo vệ thực vật

chống lại nhiều yếu tố bất lợi phi sinh học. BR làm tăng cường khả năng hấp thu nước

và ổn định màng cũng như làm giảm sự rò rỉ ion khỏi màng ở lúa mì khi chống chịu

với hạn.

1.2. Đáp ứng hạn của thực vật

Tính chịu hạn của những thực vật ở cạn hạn sinh có bản chất di truyền, thể hiện ra

ở các thích nghi về hình thái và sinh lý. Một số giảm thiểu sự thoát hơi nước nhờ có

lớp cutin dày, khí khổng nằm sâu, thân mọng nước, lá có thể tiêu giảm, sử dụng nước

hiệu quả bằng cách tiến hành quang hợp theo con đường CAM. Một số ngừng sinh

trưởng cho đến khi điều kiện trở lại bình thường. Một số có chu kỳ sinh dưỡng ngắn,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

chỉ trong vài tuần. Khi có mưa, đất ẩm, hạt giống của chúng nảy mầm. Chúng sinh

7

trưởng và phát triển thật nhanh chóng, hình thành hạt trước khi mùa khô hạn đến [3].

Thực vật có những cơ chế đáp ứng giúp chúng tăng cường tính chống chịu đối với

các điều kiện bất lợi trên. Hệ thống mô hình xử lý hạn cho cây mô hình A. thaliana

đã được Amal Harb và cs thiết kế để nghiên cứu những thay đổi của cây khi bị hạn.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, thực vật đáp ứng với yếu tố bất lợi qua ba giai đoạn:

giai đoạn ban đầu là giai đoạn đánh giá điều kiện, tiếp đó thực vật đáp ứng tập chống

chịu và cuối cùng sẽ hình thành một cân bằng mới [25]. Thực vật đáp ứng với điều

kiện bất lợi từ môi trường qua 2 con đường: phụ thuộc ABA và không phụ thuộc

ABA. Theo các con đường đó các tín hiệu bất lợi từ môi trường được tế bào tiếp nhận

và được dẫn truyền đến nhân theo hai con đường hoặc thông qua ABA hoặc không

thông qua ABA. Các yếu tố phiên mã gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gene

liên quan đến tính chống chịu. Các đáp ứng này sẽ bị mất dần khi điều kiện bất lợi

mất đi [6].

Thực vật cảm nhận các yếu tố bất lợi, hay các tác nhân từ môi trường nói chung

thông qua hàng loạt các thụ thể bề mặt tế bào như các serine/threonine-like receptor

kinase, được gọi chung là các receptor-like kinase (RLKs), các thụ thể liên kết với

kênh ion (ion chanel-linked receptor), các G-protein-couple receptor (GPCRs) và các

thụ thể histidine kinase. Các kênh Ca2+ cho phép Ca2+ được chuyển vào tế bào chất

khi được kích hoạt bởi các yếu tố bất lợi. Vì vậy các kênh này hoạt động như các các

thụ thể liên kết với kênh ion của yếu tố bất lợi. GPCRs là một nhóm thụ thể màng

khác. Trong điều kiện bất lợi, chúng kích hoạt các enzyme phospholipase C hoặc D

và chuyển hóa thành các tín hiệu [9].

Các thụ thể nội bào ABA, PYR/RCAR, là các tín hiệu của yếu tố bất lợi gây ra

bởi hạn, thông qua kích hoạt serine/threonine kinase SnRK2 trong đáp ứng với ABA

[73]. Do sự tổng hợp ABA dẫn đến tăng cường đáp ứng với điều kiện bất lợi, thụ thể

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

ABA có thể được coi là một thiết bị cảm biến yếu tố bất lợi.

8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 1.1. Sơ đồ đáp ứng của thực vật trong điều kiện hạn [1]

9

Trong quá trình tiếp nhận tín hiệu bất lợi từ môi trường không thông qua ABA,

đường là một hợp chất quan trọng. Các hexokinase là thiết bị cảm biến đường ở thực

vật, chúng đóng vai trò ngăn chặn sự biểu hiện các gene liên quan đến quá trình quang

hợp khi hàm lượng hexose trong tế bào lá cao [4]. Trehalose - 6 - phosphate (T6P) là

một phân tử đường tín hiệu, có chức năng điều chỉnh quá trình sinh trưởng, phát triển

và làm tăng hàm lượng sucrose trong thời kỳ ra hoa. Sự tăng cường biểu hiện của

T6P ở ngô trong thời kỳ ra hoa giúp cải thiện năng suất trong điều kiện hạn. ROS là

sản phẩm của các quá trình trao đổi chất trong điều kiện bất lợi, cũng là những phân

tử tín hiệu quan trọng [1]. Các tín hiệu oxi hóa được chuyển qua tín hiệu trung gian

thứ hai như Ca2+ hoặc phosphatidic acid (PA) - kích hoạt protein kinase

serine/threonine và mitogene - activated protein kinase (MAP) dẫn đến sự phiên mã

của các gene đóng vai trò quan trọng trong tập chống chịu.

 Cơ chế truyền tín hiệu

Các tín hiệu được các thụ thể tiếp nhận sau đó truyền lại cho các phân tử tín

hiệu thứ hai như các protein kinase, các phosphatase (serine/threonine phosphatases),

các phospholipid như phosphoinositides. ROS, Ca2+, nitric oxide, cAMP và các phân

tử đường đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu [1]. Trong điều kiện

bất lợi gây ra bởi những yếu tố khác nhau có nhiều phân tử tín hiệu giống nhau. Điều

này chỉ ra rằng các con đường đáp ứng các điều kiện bất lợi khác nhau có thể xảy ra

nhờ những chất truyền tín hiệu chung. Các phân tử protein kinase kích hoạt phân chia

tế bào thông qua quá trình phosphoryl hóa các protein và là một trong các cơ chế

chính của quá trình truyền tín hiệu.

Hàm lượng canxi trong tế bào chất tăng trong điều kiện bất lợi. Ca2+ trong tế

bào chất tăng lên chủ yếu từ ngoài vào tế bào qua màng hoặc được huy động từ nguồn

dự trữ trong tế bào, cụ thể là từ không bào. Một vài kênh cảm ứng Ca2+ như

calmodulin (CaM) hay CaM - binding protein đã được tìm thấy trong tế bào tham gia

truyền tín hiệu đến nhân thông qua các tín hiệu như phospholipase hay Ca2+ -

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

dependent kinase [4].

10

 Điều khiển phiên mã trong biểu hiện gene

Một số lượng lớn các gene được tìm ra liên quan đến các đáp ứng với điều kiện

bất lợi [34]. Microarray DNA cung cấp thông tin có ý nghĩa lớn trong việc phân tích

biểu hiện của toàn bộ hệ gene và đã được sử dụng để nghiên cứu các mô hình biểu

hiện gene ở các đáp ứng với hạn hoặc mặn ở một số loài thực vật. [37, 29, 26, 23].

Các gene tăng cường biểu hiện trong điều kiện hạn bao gồm các gene liên quan đến

tổng hợp các chất điều hòa thẩm thấu, các gene mã hóa cho các protein LEA,

aquaporin, các phân tử tín hiệu và các yếu tố phiên mã. Trong đó, các gene mã hóa

cho các yếu tố phiên mã được quan tâm nhiều bởi các yếu tố phiên mã hoạt động như

những công tắc tác động đến hàng loạt các gene đáp ứng với điều kiện bất lợi [11].

Có hơn 100 yếu tố phiên mã mà sự biểu hiện của chúng được tăng cường khi tiếp xúc

với điều kiện hạn, chúng đã được tìm ra bằng phân tích toàn bộ hệ phiên mã ở cây

A.thaliana tiếp xúc với hạn [35]. Hạn làm tăng cường mức độ biểu hiện của các gene,

được điều khiển bởi các yếu tố phiên mã thuộc họ bZIP, AP2/ERF, HD-ZIP, MYB,

Bhlh, NAC, NFY, EAR và ZPT2 [44]. Những yếu tố phiên mã này được kích hoạt

bởi các tín hiệu hạn. Do hạn xảy ra cùng với sự tăng lên về hàm lượng ABA, một vài

yếu tố phiên mã được kích hoạt bởi ABA. Những các yếu tố phiên mã đáp ứng ABA

(ABFs) chủ yếu thuộc họ bZIP và kết hợp với các yếu tố đáp ứng ABA (ABRE) trong

các promoter của các gene đáp ứng hạn [44, 26]. Trong khi đó, sự hoạt động của một

số gene mã hóa yếu tố phiên mã họ CBF/DRE, NAC và ZF-HD lại không phụ thuộc

ABA. Tuy nhiên, một vài nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt động của các gene mã hóa yếu

tố phiên mã thuộc họ AP2/ERF được điều khiển qua cả 2 con đường phụ thuộc ABA

và không phụ thuộc ABA. APETALA2/ethylene response element - binding protein

(AP2/EREBP) là họ yếu tố phiên mã chính trong các họ yếu tố phiên mã ở A.thaliana,

gồm 147 gene, chiếm 9% các yếu tố phiên mã [17]. Ở thực vật bậc cao, có gần 200

gene yếu tố phiên mã AP2 đã được báo cáo. Dựa vào sự có mặt của một hoặc hai AP2

- DNA, họ gene này được chia thành 4 phân họ: AP2, DREB, ERF, RAV. Phân họ

AP2 mã hóa cho các protein có hai AP2 domain và các protein này liên quan đến các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

quá trình sinh trưởng như phát triển các mô phân sinh, các bào quan và sự phát triển

11

hoa. Các phân họ DREB (dehydration - responsive element binding), ERF (ethylene

- responsive factor) và RAV (related to ABI3/VP1) mã hóa cho các protein chứa một

AP2 domain và các thành viên trong phân họ gene này liên quan đến hệ thống truyền

tín hiệu [38, 20].

1.3. Nhóm gene chịu hạn AtYUCCA và đặc điểm của gene chịu hạn AtYUCCA6

AtYUCCA6 là một gene thuộc họ YUCCA trên NST số 5 của các cây thuộc họ

Arabidopsis thaliana, mã hóa protein monooxygenease flavin (FMOs). FMOs tham

gia xúc tác cho một giai đoạn quan trọng trong việc tổng hợp axit lndole-3-acetic

(IAA) - một loại auxin chính trong cơ thể thực vật, từ tiền chất tryptophan (Trp) . Gần

đây, một con đường hai bước chuyển đổi Trp thành IAA đã được đề xuất là con đường

sinh tổng hợp IAA chính trong thực vật (Hình 1.2).

Hình 1.2. Sơ đồ chuyển đổi Trp thành IAA có sự tham gia của YUCs [32]

Trp đầu tiên được loại bỏ nhóm amin chuyển thành indole-3-pyruvate (IPA)

bởi họ aminotransferases TAA1. Sau đó, các monooxygeneases có chứa flavin trong

họ YUC xúc tác cho việc sản xuất IAA bằng cách sử dụng IPA làm chất nền [44].

Phản ứng xúc tác YUC là bước giới hạn tốc độ trong quá trình sinh tổng hợp auxin.

Gene YUC đã được xác định trong tất cả các bộ gene thực vật đã được giải trình tự,

cho thấy rằng quá trình sinh tổng hợp auxin qua trung gian YUC phổ biến và cần thiết

đối với sự phát triển của thực vật. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức

gene YUC trong cây dạ yến thảo, thuốc lá, và cây lúa dẫn đến sự sản sinh quá mức

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

auxin [32, 31, 27, 16].

12

Trong cây Arabidopsis, có 11 gene YUC. Việc ngừng hoạt động của một

gene trong họ YUC không gây ra những thay đổi lớn trên cơ thể thực vật do có sự

tương tác trong sản phẩm của các gene YUC. Tuy nhiên, việc bất hoạt đồng thời

YUC1 và YUC4 sẽ gây ra những biểu hiện rõ rệt, ức chế sự phát triển của mạch dẫn

và hoa. Những nghiên cứu về đột biến gene YUC đã chứng minh rằng sự tổng hợp

auxin là quan trọng trọng mọi quá trình phát triển chính của cây, bao gồm sự phát

triển phôi, tăng trưởng cây con, kéo dài rễ, hình thành mô và phát triển hoa. Đặc

biệt những đột biến trong gene YUC gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất ở cây lúa,

ngô, dạ yến thảo. Điều này cho thấy hoạt động của gene YUC rất cần thiết cho sự

phát triển của cây trồng.

Sự tăng cường khả năng chống hạn của cây còn được thực hiện nhờ hoạt động

của gen AtYUCCA6 kiểm soát các gốc tự do oxy hóa trong cây, thúc đẩy cây thích

ứng với điều kiện stress và làm chậm sự chết tế bào. ROS ( Reactive oxygene species)

- gốc tự do oxy hóa là những sản phẩm trung gian được tạo ra trong các quá trình sinh

hóa của tế bào thực vật. Ở mức độ nhất định, sự có mặt của gốc tự do là tín hiệu cần

thiết thông báo sự phát triển và phát triển của ổn định của cây trồng và kích hoạt

các phản ứng chống lại stress. Trong điều kiện hạn hán, sự tăng ROS trong tế bào

thực vật là tín hiệu điều chỉnh việc đóng khí khổng, từ đó hạn chế sự thoát hơi nước

của cây giúp cây thích nghi với điều kiện bất lợi. Tuy nhiên, sự tích lũy nồng độ

ROS cao lại gây độc và gây chết tế bào đặc biệt các tế bào trung gian trong con

đường tổng hợp auxin. Vì vậy, việc kiểm soát sự gia tăng ROS ở một nồng độ nhất

định có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh những thay đổi phát triển do stress

gây ra. Trong tế bào thực vật, nhiều enzyme và hợp chất có chức năng loại bỏ các

gốc tự do ROS như superoxide dismutase, catalase, ascorbate peroxidase, GSH

peroxidase và Trx peroxidase (peroxiredoxin, PrxR). Chúng rất quan trọng cho quá

trình giải độc ROS, chẳng hạn như NTRC chloroplast-localized có khả năng thu

nhận H2O2 giúp bảo vệ diệp lục trong bảo quan lục . Đối với gene AtYUCCA6, do

sản phẩm của gene có hoạt tính khử thiol - redutase nên có thể tham gia kích hoạt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

hệ thống oxi hóa khử, giúp kiểm soát ROS gia tăng ở mức độ nhất định [38].

13

1.4. Những kết quả nghiên cứu về chuyển gene chịu hạn

1.4.1. Tình hình nghiên cứu chuyển gene chịu hạn

1.4.1.1. Trên thế giới

Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào chuyển các gene chịu hạn ở lúa nước.

Chống chịu khô hạn là tính trạng phức tạp, bị ảnh hưởng bởi sự thể hiện đồng thời cả

một hệ thống gene mục tiêu và bị ảnh hưởng bởi các yếu tố về môi trường, vật lý, hóa

học. Điều này làm cho những tiến bộ nhất định về biến đổi di truyền tính chống chịu

khô hạn xảy ra rất chậm chạp. Chiến lược có hiệu quả đã được ghi nhận là làm gia

tăng lượng đường dễ hòa tan, các hợp chất cần thiết thông qua tiếp cận với kỹ thuật

chuyển nạp gene. Những hợp chất đó là: proline, trehalose, betaine và mannitol, đóng

vai trò như những thể bảo vệ thẩm thấu (osmoprotestants); trong vài trường hợp,

chúng ổn định được các phân tử chức năng dưới điều kiện bị stress. Protein LEA (late

embryogenesis abundant) cũng được chú ý trong điều kiện bị stress do thiếu nước

[4]. Sự thể hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của nó cho thấy

vai trò bảo vệ cây chống chịu sự kiện mất nước. Ví dụ, gene HVA1 mã hóa nhóm

protein 3 LEA của cây lúa mạch (Hordeum vulgare L.). Người ta đã chuyển nạp gene

này thành công vào cây lúa để tăng cường tính chống chịu khô hạn và chống chịu

mặn trong điều kiện ở nhà lưới [2].

Những năm gần đây, do sự phát triển không ngừng của công nghệ sinh học

cùng với sự ra đời của các chỉ thị phân tử đặc biệt là ở lúa, các nhà khoa học đã thiết

lập được một số bản đồ phân tử cho các tính trạng số lượng như chịu hạn, chịu úng,

chịu phèn. Đối với đặc tính chống chịu hạn bằng sử dụng chỉ thị phân tử như SSR,

AFLP, RFLP, SNP,... các QTL kháng hạn đã được định vị ở nhiều loại cây trồng khác

nhau cũng như cây lúa [2].

Phương pháp phân tích sự đóng góp của các tính trạng có liên quan, với mô

hình QTL (quantitative trait loci). Phương pháp tiếp cận này phù hợp với hầu hết các

loài cây trồng chủ yếu như cây lúa, nhờ bản đồ di truyền với nhiều marker phân tử

ADN phủ kín trên nhiễm sắc thể.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

1.4.1.2. Ở Việt Nam

14

Ở nước ta, việc nghiên cứu, đánh giá chọn tạo các giống cây chịu hạn mà điển

hình là các giống lúa đã có từ những năm thập kỉ 90. Cho đến nay, đã có rất nhiều

các giống lúa chịu hạn được các nhà khoa học chọn tạo ra thông qua chọn tạo giống

truyền thống cũng như ứng dụng công nghệ sinh học. Tại Việt Nam, nghiên cứu lập

bản đồ QTL kháng hạn ở giống lúa nương sử dụng chỉ thị phân tử do tổ chức

Rockefeller tài trợ đã được tiến hành tại phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, viện

Công nghệ Sinh học, viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, viện Bảo vệ Thực vật,

trường Đại học Nông nghiệp [2]. Chương trình tuyển chọn và phát triển giống lúa cạn

cải tiến LC93-1 phục vụ sản xuất lượng thực ở vùng cao của Viện Bảo Vệ Thực Vật

Từ Liêm, Hà Nội với phương pháp chọn lọc từ tập đoàn lúa cạn IRRI nhập nội, năm

1993 đã chọn được giống LC93-1 có thời gian sinh trưởng 115 - 125 ngày, năng suất

3 - 4 tấn/ha, chịu hạn khá, chất lượng gạo tốt, thích hợp cho vùng đồng bào dân tộc

nghèo ở vùng cao. Nghiên cứu chọn giống lúa chống chịu khô hạn của Viện Cây

lương thực thực phẩm với phương pháp thu thập nguồn vật liệu giống lúa cạn chịu

hạn địa phương và các dòng lúa cải tiến nhập nội từ IRRI với phương pháp lai hữu

tính kết hợp với gây đột biến để tạo ra các tổ hợp lai có khả năng chịu hạn khá và

năng suất cao như CH2, CH3, CH133, CH5 trồng rộng rãi ở vùng Trung du miền núi

phía Bắc, Trung bộ, Đông Nam bộ và Tây Nguyên. Ở Việt Nam, cho đến nay kỹ thuật

nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi để đánh giá khả năng chống

chịu và chọn dòng chống chịu như chịu hạn mang lại hiệu quả cao. Tác giả Đinh Thị

Phòng (2001) bằng các phương pháp thổi khô mô sẹo của các giống lúa CR203,

CH133, Lốc, X11, C70 đã thu được 271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng

chịu hạn. Tác giả đã chọn tạo được giống DR1, DR2 cho năng suất cao, ổn định, có

khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn giống gốc [2]. Nguyễn Thị Thu Hoài (2005)

khi nghiên cứu về khả năng chịu hạn của các giống lúa cạn địa phương đã kết luận

rằng khả năng chịu mất nước và tốc độ sinh trưởng của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô

của các giống nghiên cứu có sự sai khác rõ rệt, giống BC12 là giống chịu hạn tốt nhất

so với các giống nghiên cứu [3]. Bên cạnh lúa nước, việc chuyển các gene chịu hạn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

còn được thực hiện thành công ở khoai tây, đậu tương...Đối với gene chịu hạn

15

AtYUCCA6, cho đến nay ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nghiên cứu có hệ thống

liên quan đến việc phân lập gene này.

1.4.2. Những kết quả nghiên cứu về chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6

Mặc dù một số con đường sinh tổng hợp auxin đã được xác định, tuy nhiên

bản chất của cơ chế sinh tổng hợp auxin có liên quan đến hoạt động của AtYUCCA6

chưa được làm sáng tỏ. Nghiên cứu của Kim (2011) đã cho thấy trong cây có đột biến

AtYUCCA6 hàm lượng auxin cao hơn nhiều lần so với kiểu hoang dã, hơn nữa, quá

trình già hóa của cây bị đột biến bị kìm hãm [27].

Hệ thống các đột biến gene AtYUCCA6 liên quan đến tính chịu hạn của thực

vật rất đa dạng, gần đây nhiều nhà khoa học quan tâm đến việc phát hiện, phân lập

và nghiên cứu hoạt động của chúng trong các điều kiện bất lợi của môi trường, hướng

đến việc cải thiện khả năng chống chịu của thực vật bằng chuyển gene.

Năm 2015, Cha và cộng sự đã chuyển gene AtYUCCA6 thành công trên

cây khoai tây và phân tích biểu hiện của cây chuyển gene. Trong nghiên cứu này,

những cây khoai tây trồng trong đất 3 tuần tuổi đã bị rút nước trong 1014 ngày

và các triệu chứng héo ở lá được ghi lại định kỳ. Các triệu chứng héo lớn hơn

đáng kể ở lá của cây dại so với lá của các dòng biểu hiện quá mức AtYUCCA6.

Mặt khác, sự tăng trưởng của cây khoai tây dại bị ức chế nhiều hơn so với cây

biểu hiện quá mức AtYUCCA6 khi kiểm tra phản ứng của cây với stress oxy hóa

nguyên phát trên môi trường chứa Methyl viologene (MV) - chất xúc tác cho

việc sản xuất ROS và thúc đẩy stress oxy hóa trong thực vật. Kết quả nghiên

cứu cho thấy sự biểu hiện quá mức ATYUCCA6 giúp làm giảm tỷ lệ mất nước,

kiểm soát tích lũy ROS dưới áp lực hạn hán và oxy hóa, tăng khả năng chịu hạn

của những cây khoai tây chuyển gene [16]

Những kết quả nghiên cứu của Jeong Im Kim và cộng sự (2011) sau phân tích

cây hoa hồng chuyển gene AtYUCCA6 cho thấy sự biểu hiện quá mức của gene

AtYUCCA6 dẫn đến gia tăng hàm lượng auxin, làm trì hoãn sự hóa già của cây. Ngoài

ra, các gene trong họ YUCCA được chuyển thành công vào cây ăn quả như

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

đào…nhằm hạn chế sự mềm của quả khi chín [27].

16

Mặc dù trên thế giới có nhiều nghiên cứu về gene AtYUCCA6, tuy nhiên cho

đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu hệ thống liên quan đến việc phân lập

gene này.

1.5. Phương pháp chuyển gene ở thực vật qua Agrobacterium

Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, thuộc nhóm vi khuẩn yếm khí. Chi

Agrobacterium gồm 4 loài, trong đó A. tumerfaciens có khả năng tạo ra khối u trong

tế bào thực vật thông qua một loại plasmid đặc hiệu gây nên khối u gọi là Ti-

plasmid (tumour inducing) [3,2]. Ti-plasmid có khả năng chuyển một số gene

chúng mang vào cây trồng khi ADN vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực

vật nó sẽ tấn công vào hệ thống tế bào của thực vật một cách có hiệu quả và sử

dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn đây được coi là hiện

tượng chuyển gene tự nhiên. Agrobacterium có 3 thành phần di truyền cần thiết

cho quá trình chuyển gene:

- Vùng T-ADN: là đoạn ADN chuyển từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào

thực vật. Đặc điểm của vùng này là xâm nhập ổn định vào bộ gene của cây chủ,

không mã hóa cho các sản phẩm trợ giúp quá trình biến nạp, độ dài thay đổi khác

nhau ở các Ti-plasmid tự nhiên và mang rất nhiều gene có thể biểu hiện trong quá

trình chuyển hóa của tế bào thực vật [22].

- Vùng gây độc Vir (Virulence Region): gồm 24 gene vir được sắp xếp trong 8

operon từ virA đến virH, mỗi operon chứa một số gene. Vùng Vir có vai trò kích thích

việc biến nạp của T-ADN. Trong đó Vir A; B; D; G có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong

quá trình biến nạp ở tế bào thực vật, Vir C; E; F; H có tác dụng làm tăng cường hiệu

quả quá trình biến nạp gene [22].

- Nhiễm sắc thể (NST) của Agrobacterium: Vùng Vir có vai trò chủ yếu trong

quá trình biến nạp T- ADN, tuy nhiên NST của vi khuẩn cũng rất cần thiết đối với

quá trình này. Chúng tác dụng lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, cụ thể giúp tạo ra

exopolysaccarid, chế biến và bài tiết ra ngoài (pscA/exoC, chvA, hvB) đồng thời gắn

vi khuẩn vào tế bào thực vật (tt genes) … Ngoài ra những gene khác như mia A đóng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

vai trò thứ yếu hơn trong quá trình biến nạp [22].

17

Cơ chế chuyển gene thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens: Quá

trình chuyển T-ADN được bắt đầu ở vị trí biên phải và kết thúc ở vị trí biên trái. Nếu

không có sự định hướng này, hiệu quả của quá tình chuyển gene sẽ rất thấp [8]. Đoạn

T-ADN mang gene muốn được chuyển, trước tiên nó phải được hoạt hóa nhờ hoạt

động của các gene vir. Hiện tượng này xảy ra khi A. tumerfaciens bắt đầu tiếp xúc

với hợp chất chứa phenol được tiết ra từ vết thương của cây hoặc từ tế bào nuôi cấy.

Khi nhận được các phân tử tín hiệu từ vết thương thực vật: hợp chất phenolic

(cacbolic acid), acetosyringone (AS), hydroxy acetosyringone (OH-AS), flavonoid,

đường đơn hoặc các tín hiệu khác như pH axit (pH 5 - 5,5), phosphat và opine, làm

dẫn dụ Agrobacterium gắn vào thành tế bào thực vật (AS, OH-AS được tinh sạch từ

môi trường nuôi cấy tế bào thuốc lá - giống như những sản phẩmcủa chuyển hoá

phenyl propanoid - một khâu chủ yếu trong chu trình tạo các chất thứ cấp như lignin

và các chất thơm. Những chất này rất quan trọng đối với thực vật trong các điều kiện

stress và bị thương, ta gọi là hợp chất dẫn dụ). Trong quá trình tiếp xúc giữa tế bào

thực vật và Agrobacterium, vi khuẩn tạo ra các sợi cellulose và các sợi này kết tụ

thành bó gắn lên bề mặt tế bào thực vật. Quá trình này làm cảm ứng và hoạt hoá các

gene vùng vir. Sự thể hiện gene vir xảy ra nhờ hệ thống truyền cảm ứng gồm các sản

phẩm của virA và virG. Chính các sản phẩm protein của các gene vir đã làm nhiệm

vụ vận chuyển T-ADN. Một số bằng chứng chứng tỏ T-ADN được vận chuyển tới

nhân tế bào thực vật và gắn hoá trị vào geneome thực vật, sau đó, T-ADN được phiên

mã nhờ ARN polymerase II [18,16].

Quá trình chuyển T-ADN cho tế bào thực vật gồm ba sự kiện quan trọng:

• Sự kiện thứ nhất: Hình thành khối u là quá trình biến đổi tế bào thực vật do

xâm nhập và hợp nhất của T-ADN vào tế bào thực vật, sau đó biểu hiện các gene

trong vùng T-ADN.

• Sự kiện thứ hai: Các gene nằm trong vùng T-ADN sao chép trong các tế bào

bị xâm nhiễm và không có vai trò trong quá trình chuyển.

• Sự kiện thứ ba: Vùng ADN lạ đặt giữa các vùng biên của T-ADN có thể được

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

chuyển cho tế bào cây trồng.

18

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, phạm vi, vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Cây Arabidopsis thaliana, gen AtYUCCA6.

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu

Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen AtYUCCA6 từ cây Arabidopsis thaliana.

2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm, khoa Công nghệ Sinh học và công

nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

- Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2018 đến tháng 7/2019.

2.3. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu

2.3.1. Vật liêu nghiên cứu

- Vật liệu thực vật: Giống Arabidropsis thaliana.

- Các vật liệu khác:

+ Cấu trúc vector tách dòng pBluescript-pUBQ14 mang gen chọn lọc ampicilin

+ Vector chuyển gen pER8 mang gen chọn lọc kanamycin.

Các vật liệu trên được cung cấp bởi giáo sư Park Soon Ki, Trường Đại học

Quốc gia Kyungpook, Hàn Quốc cung cấp trong khuôn khổ hợp tác với Trường Đại

học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên.

+ Chủng vi khuẩn Ecoli DH5α, vi khuẩn chuyển gen GV3101 do phòng thí nghiệm

Sinh học phân tử, khoa Công nghệ Sinh học và công nghệ Thực phẩm, trường Đại

học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên cung cấp.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

+ Mồi sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.1

19

Bảng 2.1. Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự (5’-3’)

AtYUC6-NF TTGGCGGCCGCATGGATTTCTGTTGGAAGAG

AtYUC6-SR TCAACTAGTTCAATTCCCACCACAATCACTCTC

PER8-R ACG TTG TCG AAA CCG ATG ATA CGG

2.3.2. Hóa chất và trang thiết bị nghiên cứu

- Hóa chất

Bảng 2.2. Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên hóa chất Hãng sản xuất

Thermo Fisher 1 GenJET gel Extraction Kit, 50 preps Scientific

GenJET PCR Purification Kit, 50 preps, Code Thermo Fisher 2 K0701 Scientific

3 Vector tách dòng pBluescript Promega

4 Vector chuyển gen pER8 Promega

5 DNAase/Rnase- Free Distilled Water UltraPure

FastDigest HindIII 2500 reactons; Code Thermo Fisher 6 FD0505 Scientific

FastDigest BamHI 2500 reactons; Code Thermo Fisher 7 FD0055 Scientific

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Thermo Fisher 8 IPTG, dioxane - free, 5g; Code R0392 Scientific

20

Thermo Fisher 9 X-gal,1g, Code R0404 Scientific

GeneJET Plasmid miniprep Kit, 50 preps, Thermo Fisher 10 Code: K0502; Scientific

11 Tris Base Merck

12 Acid Acetic Merck

13 EDTA Merck

14 Loading Dye Merck

15 Agarose Bioneer

16 Ethidium bromide Merck

Thermo Fisher 17 Taq polymerase 1U/µl Scientific

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Thermo Fisher 18 dNTP mix - R0192 Scientific

21

- Trang thiết bị

Bảng 2.3. Trang thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu

STT Thiết bị Nguồn gốc xuất xứ

1 Máy lọc nước Pall Co - UK

2 Bể rửa sóng siêu âm Jeiotech - korea

3 Bể ổn nhiệt Techne - OSI

4 Máy ly tâm Eppendorf - CHLB Đức

5 Máy chụp ảnh gel Gel Logic 1500 - Kodak - USA

6 Máy cất nước Canada Bio Water system - Pall Co.UK

7 Tủ lạnh -200C Super freezer Eco130 - Ficchtti - Italy

8 micro pipette Thermo Labsystem - Finland

9 Cân điện tử TE 214S - Startorius Germany

Và các trang thiết bị khác như lò vi sóng, pipet, bình trụ, bình tam giác... của

phòng thí nghiệm khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

2.4. Nội dung nghiên cứu

2.4.1. Nội dung 1: Sàng lọc gen chịu hạn AtYUCCA6

Sàng lọc gen chịu hạn AtYUCCA6 nhờ công cụ hỗ trợ trực tuyến.

2.4.2. Nội dung 2: Tách dòng gen AtYUCCA6

- Thiết kế cặp mồi đặc hiệu

- Tách chiết RNA tổng số từ Arabidopsis

- Tổng hợp cDNA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

- Khuếch đại gen AtYUCCA6 bằng PCR

22

2.4.3. Nội dung 3: Thiết kế vector chuyển gen AtYUCCA6

- Cắt gen AtYUCCA6 và vector pBS bằng cùng loại enzyme.

- Cắt nối gen AtYUCCA6 vào pBS bằng enzyme T4 ligase.

- Biến nạp vào E.coli.

- PCR kiểm tra khuẩn lạc.

- Cắt enzyme kiểm tra kết quả.

- Giải trình tự gen.

2.4.4. Nội dung 4: Nghiên cứu chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana

- Vector mang gen AtYUCCA6 sẽ được chuyển vào cây Arabidopsis thaliana

bằng vi khuẩn Agrobacterium.

- Chọn lọc cây chuyển gen.

- Đánh giá sự có mặt của gen AtYUCCA6 bằng PCR.

2.5. Phương pháp nghiên cứu

2.5.1. Sàng lọc gene chịu hạn AtYUCCA6

Dựa trên kết quả phân tích dữ liệu công bố trên thư viện microarry về các gene

liên quan đến tính chống chịu hạn ở cây trồng bằng công cụ hỗ trợ trực tuyến

(https://seqviewer.arabidopsis.org) để lựa chọn gen nghiên cứu.

2.5.2. Tách dòng gene AtYUCCA6

2.5.2.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số

RNA tổng số được tách từ nụ hoa cây Arabidopsis thaliana bằng bộ Kit Rneasy

Plant Mini của hảng Quiagen. Các bước tiến hành như sau:

- Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng bằng máy nghiền bi 270 vòng/giây.

- Thêm 1ml Trizon Regents, đảo nhẹ đều trong 5 phút.

- Thêm 200 µl C: I (24 clorofom :1 isoamyl), đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

- Ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút ở 40C. Thu 500µl dịch nổi,cho vào ống

eppendort loại 1,5 ml.

- Bổ sung 500 µl isopropanol 40C cho vào ống, đảo đều trong 15 phút ở 250C

(Hoặc ủ qua đêm ở -200C).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

- Li tâm 10.000 vòng/15 phút. Thu cặn ở đáy của ống eppendorf.

23

- Bổ sung 700 µl cồn 70%, li tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa, thực

hiện hai lần.

- Làm khô RNA bằng mở nắp ống eppendorf trong box vô trùng khoảng 15 -

20 phút.

- Bổ sung 50 µl H2O khử ion có bổ sung DEPC 0,01% ủ ở nhiệt độ 550C trong

15 phút cho tan RNA. Voltex để RNA tan hoàn toàn.

Nồng độ RNA tổng số được đo bằng máy quang phổ kế Biorad Specphotometer ở

bước sóng OD260/280.

2.5.2.2. Phương pháp tạo cDNA từ mRNA tổng số

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA

STT Thành phần Thể tích

1 RNA tổng số 5 µl

2 Oligo DT 1 µl

3 DEPC Water 6 µl

Tổng 12 µl

- Ủ ở 650C trong 5 phút sau đó cho ngay vào đá lạnh.

- Bổ sung: Reaction Buffer 4 µl; RibolockTM Rnase Trizone Regents 1µl;

dNTP 2 µl; RTase 1µl.

- Đặt vào máy PCR theo chu trình nhiệt: 250C trong 15 phút; 420C trong 60

phút; 700C trong 5 phút.

2.5.2.3. Phương pháp nhân gen AtYUUCA6 bằng kỹ thuật PCR

cDNA của gen AtYUCCA6 được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

hiệu theo thành phần phản ứng và chu trình nhiệt như sau:

24

Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng PCR

STT Thành phần Nồng độ

1 Nước khử ion 13µl

2 Đệm PCR 10X 2.5µl

3 MgCl2 (25mM) 2µl

4 dNTPs (10mM) 2.5µl

5 Mồi xuôi (10pmol/µl) 1µl

6 Mồi ngược (10pmol/µl) 1µl

7 KOD plus ( 1Unit/ µl) 1µl

8 cDNA khuôn ( 10 - 20 ng/µl) 2µl

Tổng thể tích 25µl

Bảng 2.6. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

Bước Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ

Biến tính 1 94 5 phút 1

Biến tính 2 94 2 phút

Gắn mồi 3 55 30 giây 25

Kéo dài chuỗi 4 72 2 phút

Hoàn tất kéo dài 5 72 10 phút 1

Kết thúc phản ứng 6 4 ∞

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong TAE 1X có

maker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.

Mẫu DNA thu được cần phải tinh sạch bằng bộ Kit PCR purification của hãng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

SoldGenet.

25

2.5.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification của hãng

SoldGenet gồm các bước sau:

- Bổ sung Binding Buffer vào sản phẩm PCR, tỉ lệ 1: 1 về thể tích.

- Chuyển sang cột lọc li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút ở 4oC, loại bỏ dịch.

- Bổ sung 700µl Washing buffer, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút.

- Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml, mở nắp 3 phút cho bay cồn.

- Bổ sung 25µl nước khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút,

thu dịch. Sản phẩm DNA tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong

TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Bảo quản sản phẩm

DNA tinh sạch trong tủ -200C.

2.5.2.5. Phương pháp thiết kế vector tách dòng gene AtYUCCA6

Đoạn gene AtYUCCA6 sau khi tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pBS

(pBluescript) có chứa promoter UBQ14. Các bước tiến hành như sau:

- Cắt đồng thời gen AtYUCCA6 và vector pBS bằng hai enzyme AscI và SpeI

- Tinh sạch và thu nhận sản phẩm cắt bằng kit tinh sạch DNA

- Tiến hành phản ứng ghép nối để tạo cấu trúc pBS::AtYUCCA6. Tổng thể tich 10ul.

+ 3ul DNA khuân (vector pBS)

+ 1ul DNA gene AtYUCCA6

+ 1ul T4 ligase buffer

+1 ul T4 ligase

+ 4ul nước cất khử trùng

Phản ứng ghép nối được ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng

2.5.2.6. Phương pháp biến nạp vector tách dòng vào tế bào khả biến

Vector pBS::AtYUCCA6 được biến nạp vào tế bào Ecoli DH5α theo phương

pháp shock nhiệt

- Lấy tế bào khả biến từ tủ lưu giữ -800C đặt trên đá

- Trộn 2ul DNA vào 100ul DH5α=

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

- Đặt trên đá 30 phút

26

- Shock nhiệt ở 42oC trong 40s

- Bổ sung 900ul môi trường LB lỏng

- Nuôi lắc ở 37oC trong 1h

- Cấy trải 100ul dung dịch nuôi lắc trên đĩa môi trường LB đặc có kháng sinh

chọn lọc Ampicilin

- Nuôi qua đêm ở 37oC.

2.5.2.7. Phương pháp chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp

Để chọn lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp chúng tôi sử dụng phương pháp

PCR các khuẩn lạc. Lựa chọn ngẫu nhiên 16 khuẩn lạc có kích thước đồng đều sau

khi nuôi qua đêm ở 37oC tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu. Phương pháp và thành

phần phản ửng tương tự ở bảng 2.5, trong đó sử dụng enzyme Taq DNA polymesase

và khuẩn lạc cho phản ứng. Phản ứng được thực hiện ở 30-35 chu kỳ. Sản phẩm PCR

được điện di trên gel agarose 0,8% và đọc kết quả dựa trên thang marker chuẩn 1kb.

Lựa chọn khuẩn lạc có kích thước đúng để tiến hành các bước tiếp theo.

2.5.2.8. Phương pháp tách chiết plasmid

Khuẩn lạc lựa chọn được nuôi qua đêm ở 37oC, 200v/phút trên môi trường LB

lỏng có bổ sung kháng sinh. Tiến hành thu tế bào để tách plasmid.

Bảng 2.7. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid

STT Thành phần

Sol I 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8

Sol II 0,2 NaOH, SDS 1 %

Sol III 60 ml potassium acetate 5M; 11,5 ml glacial acetic acid; 28,5 ml H2O

Các bước tiến hành tách plasmid:

- Lấy 1ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong LB lỏng.

- Ly tâm 7000 v/p thu tế bào, có thể lặp lại 5 lần để thu hết cặn khuẩn của ... ml

dịch khuẩn.

- Bổ sung 100 µl Sol I, voltex dịch.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

- Bổ sung 200 µl Sol II trộn nhẹ trong 30 giây.

27

- Bổ sung tiếp 1500 µl Sol III trộn nhẹ trong 30 giây.

- Bổ sung 500 µl chloroform : isoamin (24 : 1) trộn đều trong 3 phút.

- Ly tâm 12000v/p trong 15 phút, thu dịch nổi 400 µl trên sang ống eppendorf mới.

- Cho 400 µl isopropanol 100% để ở nhiệt độ -20oC trong 30 phút, ly tâm 12000

v/p trong 15 phút, loại bỏ phần dịch lỏng, thu cặn.

- Cho 500 µl cồn 70% vào, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, sau đó loại bỏ cồn,

làm lại hai lần.

- Làm khô mẫu trong box 30 phút.

- Hòa tan sản phẩm trong 50 µl nước khử ion.

- Bổ sung RNase

- Ủ ở 370C trong 30 phút.

- Kiểm tra sản phẩm tách plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8%.

2.5.2.9. Phương pháp định lượng DNA

Trước khi tiến hành các thí nghiệm, DNA plasmid được kiểm tra nồng độ bằng

máy quang phổ hấp phụ và điện di trên gel agarose 1%.

Các đoạn DNA có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di

chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng điện trường có điện thế và cường độ

thích hợp.

 Chuẩn bị

- Máy điện di

- Loading dye

- Ethidium Bromide

- TAE 0,5X

- Agarose

- Marker

 Cách tiến hành

- Cân 1g agarose pha trong 100ml dung dịch đệm TAE 0,5X

- Đun nóng dung dịch trong lò vi sóng từ 1-2 phút cho đến khi agarose tan

hoàn toàn sau đó để nguội khoảng 500C.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

- Đặt khay đổ gel trên bề mặt phẳng, lắp khay điện di vào khay đổ gel.

28

- Dùng pipet 1ml hút agarose và trải dọc theo phần thanh chắn nhằm tránh rò

rỉ gel khi đổ. Tiến hành đổ phần gel còn lại từ từ, liên tục để tránh lẫn bọt, cắm lược

và để yên cho gel đông lại.

- Khi gel đã đông, cẩn thận nhấc thanh chắn và đặt gel vào bể điện di theo

đúng chiều (-) đến (+), đổ dung dịch đệm TAE 0,5X ngập bản gel rồi nhấc lược ra

khỏi bản gel.

- Gắn bể điện di với bộ nguồn, trộn mẫu với Loading Dye 6X theo tỷ lệ (7µl

mẫu: 3µl Loading Dye) và tra mẫu vào giếng. Lưu ý, tra nhẹ nhàng, tránh làm vỡ

giếng gel.

- Đậy nắp máy điện di, cắm điện, bật công tắc máy điện di. Điện di với dòng

điện 110V trong thời gian 30 phút.

- Khi máy đã chạy hết thời gian cài đặt hoặc quan sát độ di chuyển của thuốc

nhuộm trên gel để dừng quá trình điện di, tắt công tắc nguồn.

- Mở nắp buồng điện di, lấy bản gel ra và ngâm trong dung dịch EtBr khoảng

5 phút.

- Lấy bản gel ra đem tráng nhẹ trong nước (tránh nước xả trực tiếp vào bản

gel) rồi đưa lên máy soi UV quan sát và chụp ảnh.

2.5.2.10. Phương pháp xác định trình tự DNA

Trình tự gene được gửi đi giải trình tự tại công Ty COSMOGENO của Hàn

Quốc và được kiểm bằng công cụ BLAST trên ngân hàng gene NCBI và phần mềm

BioEdit 5.0.

2.5.3. Phương pháp thiết kế vector chuyển gene AtYUCCA6

2.5.3.1. Thiết kế vector chuyển gene AtYUCCA6

Gen AtYUCCA6 tách dòng thành công được chuyển vào vector biểu hiện gene

pER8 bằng phương pháp enzyme cắt. Các bước tiến hành như sau:

- Cắt vector tách dòng pBS:: AtYUCCA6 bằng enzyme AscI và SpeI

- Cắt mở vòng vector biểu hiện pER8 bằng enzyme AscI và SpeI

- Tinh sạch và thu nhận sản phẩm cắt bằng kít tinh sạch DNA

- Tiến hành phản ứng ghép nối để tạo cấu trúc pER8::AtYUCCA6. Tổng thể tích

10ul

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

+ 3ul DNA khuôn (vector pER8)

29

+ 1ul DNA gene AtYUCCA6

+ 1ul T4 ligase buffer

+1 ul T4 ligase

+ 4ul nước cất khử trùng

Phản ứng ghép nối được ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng

Sản phẩm phản ứng được biến nạp vào tế bào E.coli DH5 α bằng phương pháp

shock nhiệt và sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng PCR với cặp mồi đặt hiệu (như

trình bày ở mục trên). Tế bào DH5 α tái tổ hợp được tách plasmid và biến nạp vi

khuẩn Agrobacterium để sử dụng cho chuyển gen vào cây trồng.

2.5.3.2. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium

- Lấy tế bào khả biến vi khuẩn Agrobacterium chủng GV3101 từ tủ lưu giữ -80oC

- Trộn 4ul DNA plasmid với 100 ul tế bào khả biến

- Nhúng nhanh vào Nitơ lỏng - Chuyển sang 37oC trong 5 phút

- Bổ sung 900 ul LB lỏng - Nuôi lắc ở 28oC, 200v/p, 4hr

- Cấy trải 100ul dung dịch trên đĩa môi trường LB có kháng sinh chọn lọc - Nuôi ở 28oC từ 3-4 ngày

- Sàng lọc dòng tế bào tái tổ hợp bằng phương pháp PCR

2.5.4. Phương pháp chuyển gen trên cây Arabidopsis thaliana

2.5.4.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium

- Lấy chủng khuẩn từ ống giữ chủng và cấy vạch lên môi trường LB đặc có bổ

sung các kháng sinh chọn lọc rifamicin 100mg/l, spectinomycin 100mg/l đối với

chủng A.tumerfacien mang vector chuyển gen chứa cấu trúc pER8-CBF1; nuôi trong

tủ ổn nhiệt 28ºC trong thời gian 48 giờ.

- Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 10ml

LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc như khi nuôi ở môi trường LB đặc.

Bình nuôi lỏng được đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 28ºC nuôi

qua đêm. Hút 1ml dịch khuẩn cho vào 50 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh, nuôi qua đêm (16 - 20 giờ) nuôi lắc 200 v/p trong điều kiện 28oC. Dịch khuẩn thu được có

OD260nm từ 0,7-1 là đủ điều kiện để biến nạp.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

2.5.4.2. Tạo cây Arabidopsis thaliana chuyển gen

30

Hạt A. thaliana đã được xử lý này mầm A. tumefaciens được nuôi trong môi trường LB 48 giờ

Gieo và chăn sóc trong điều kiện ngày ngắn đến khi ra hoa Ly tâm thu cặn và hòa tan cặn trong dung dịch đồng nuôi cấy

Nhúng hoa trong 30 giây

Cây A. thaliana nở hoa

+

Dung dịch đồng nuôi cấy + vi khuẩn A. tumefaciens

Trồng, chăm sóc trong nhà lưới tới khi có quả

Hút chân không trong 30 giây

Hạt A. thaliana chuyển gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 2.1. Sơ đồ tạo cây A. thaliana chuyển gen

31

Cây A. thaliana được trồng trong điều kiện ngày ngắn (8 giờ sáng/ 16 giờ tối)

tới khi cây ra hoa. Sau đó, tiến hành chuyển gen vào hoa theo phương pháp nhúng

hoa [16]. Hoa được ngâm trong dụng dịch đồng nuôi cấy (MS/2 pH 5,7, BAP 44 mM,

sucrose 5%) có OD = 0,8 trong 30 giây, hút chân không 30 giây. Sau đó cây được đặt

trong bình kín 3 ngày. Cứ 6 ngày chuyển gen lặp lại một lần. Khi quả trên cây chín

tiến hành thu hạt và xử lý này mầm ở 4oC trong 5 ngày trước khi gieo.

2.5.4.3. Phương pháp chọn lọc và phân tích cây chuyển gen

Sau khi có được hạt cây A. thaliana chuyển gen đem gieo trên môi trường

MS/10 có bổ sung kháng sinh kanamycin 50mg/l, theo dõi số cây sống, số cây chết.

Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu

của gen AtYUCCA6 bằng PCR.

Những cây A. thaliana sống sót trên môi trường chọn lọc được chuyển ra bầu

nhận theo phương pháp CTAB theo quy trình các bước như sau:

đất, chăm sóc đến khi ra hoa, tiến hành thu mẫu lá, tách ADN. DNA tổng số được thu

- Bước 1: chuẩn bị mẫu:

Mẫu lá khử trùng bằng cồn 70o (dùng bông gòn thấm cồn và lau đều trên cả hai bề

mặt lá) , dùng kéo cắt lấy phần thịt lá ở hai bên và bỏ phần gân lá ở giữa. Phần thịt lá

được gói trong giấy nhôm và ngâm nitơ lỏng trong thời gian 10 phút. Sau đó, nghiền kỉ

mẫu bằng cối và chày đã được khử trùng bằng cách ngâm nitơ lỏng.

- Bước 2: phá vỡ màng tế bào và màng nhân: nghiền 2,2, ml bột mịn với 1 ml

dịch trích EB (extraction buffer). Tiếp tục cho 50ml dung dịch SDS 10% vào túp, sau

đó lắc nhẹ túp.

- Bước 3: ủ mẫu ở nhiệt độ 65oC trong 30 phút, trong quá trình ủ khoảng 5 phút

đảo nhẹ túp để trộn mẫu.

- Bước 4: li tâm mẫu với vận tốc 13000rpm trong 10 phút

- Bước 5: tủa DNA bằng cách hút 800ml phần dung dịch trong ở phía trên cho

vào túp mới, sau đó cho 800ml dung dịch isopropanol vào tiến hành ủ trong khoảng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

30 phút ở -20oC. Sau đó, tiến hành li tâm với vận tốc 13000rpm trong 10 phút.

32

- Bước 6: hòa tan tủa: li tâm xong, phần dịch trong được bỏ vào một cái hộp mũ

có chứa nước và thu phần kết tủa. Hòa tan tủa DNA trong 400ml TE,

- Bước 7: tạo phức với CTAB: Cho thêm vào túp 400ml CTAB và ủ ở 65oC

trong 15 phút, khoảng 5 phút đảo ngược ống túp để trộn đều.

- Bước 8: bỏ protein và các phức hợp: cho thêm vào túp 800ml

Chloroform/Isoamylalcohol lắc đều và li tâm với vận tốc 13000rpm trong 5 phút.

- Bước 9: tủa DNA: Sau khi ly tâm ta tiến hành hút 500ml phần dịch trong ở

phía trên cho qua một túp 2,2ml mới, thêm vào túp này 1ml Ethanol 96% ủ ở nhiệt

độ phòng trong vòng 15 phút. Sau đó, li tâm ở 13000rpm trong 10 phút. Ethanol 96%

được sử dụng kết hợp với muối để tránh gây hại cho DNA.

- Bước 10: rửa DNA: Li tâm xong đổ bỏ phần dịch trong ở phía trên vào hộp

mũ có chứa nước, thu lấy phần kết tủa ở phía dưới. Sau đó, tiến hành rửa kết tủa với

ethanol 70% để loại bỏ muối ra khỏi DNA. Phần kết tủa được rửa 2 lần với ethanol

70% (không gây hại cho DNA do ở nồng độ thấp). Mỗi lần rửa cho 400ml ethanol

70% vào túp, lắc nhẹ và đem li tâm trong 5 phút với vận tốc 13000rpm, sau đó loại

bỏ ethanol.

- Bước 11: phơi khô DNA: Tiến hành phơi khô DNA qua đêm ở nhiệt độ phòng.

- Bước 12: hòa tan DNA: DNA sau khi phơi khô, được hòa tan trong 50ml nước.

Sau đó, tiến hành pha loãng dung dịch DNA trên: hút 90ml nước cho vào một túp

1,5ml mới, sau đó hút 10ml dung dịch DNA cho vào túp chứa 90ml nước, lắc nhẹ.

Túp 1,5ml này được đem đi đo OD. Dung dịch DNA còn lại trong túp 2,2ml là 40ml

được dùng để chạy điện di.

DNA tổng số thu được được sử dụng cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

của gen AtYUCCA6.

33

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân tích gene AtYUCCA6 trên cơ sở dữ liệu database

Gene AtYUCCA6 mã hóa cho protein nhóm flavin monooxygenases có vai trò

quan trọng trong quá trình tổng hợp auxin. Gene AtYUCCA6 nằm trên nhiễm sắc thể

số 5 (hình 3.1), kích thước 3719 bp, vùng mã hóa 1,25kb, có 5 exon và 4 intron mã

hóa cho 434 amino axit (TAIR, https://seqviewer.arabidopsis.org, hình 3.2). Gene

biểu hiện ở tất cả các bộ phận của cây. Trong đó mạnh nhất ở cơ quan sinh sản như

cụm hoa, hạt phấn (hình 3.3).

Hình 3.1. Vị trí của gene AtYUCCA6 (At5g25620) trên nhiễm sắc thể số 5

(Wease et al. 2017)

Hình 3.2. Cấu trúc gen AtYUCCA6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

(Ghi chú Ex: exon, Int: intron, 3’UTR, 5’UTR: vùng không mã hóa)

34

Hình 3.3. Biểu hiện của gene AtYUCCA6 ở cây Arabidopsis thaliana

3.2. Tách dòng gene AtYUCCA6

Dựa trên kết quả phân tích chúng tôi tiến hành tách dòng gene AtYUCCA6 để

ứng dụng cho chuyển gene. Từ nụ hoa của cây Arbidopsis thaliana, tiến hành tách

mRNA tổng số, nồng độ mRNA được đo bằng phương pháp đo OD 260/280 nm. 1

μg mRNA được sử dụng làm khuôn tạo cDNA. cDNA sau khi được tổng hợp tiếp tục

được dùng làm khuôn cho phản ứng nhân gen AtYUCCA6. Bằng phản ứng trùng hợp

chuỗi (PCR) với cặp mồi đặc hiệu AtYUCCA6NotI-F và AtYUCCA6SepI-R toàn bộ

chiều dài 1,25kb trình tự gene mã hóa (coding sequences-CDS, hình 3.4 ) được

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

khuếch đại trên khuôn cDNA.

35

Hình 3.4 . Trình tự vùng mã hóa của gen AtYUCCA6 và trình tự protein tương ứng

Ghi chú: Trình tự in đậm gạch chân biểu thị vị trí mồi xuôi và mồi ngược sử dụng

trong nghiên cứu

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kít của hãng Solgenet

(http://www.solgenet.com) để sử dụng cho tách dòng gene. Sử dụng vector tách dòng

pBluescript (pBS) mang promoter UBQ14 đã được chèn sẵn vào vị trí giữa AscI và

NotI. Gene AtYUCCA6 được đưa vào vị trí giữa hai enzyme NotI và SpeI sau khi được

cắt và nối bằng enzyme T4 DNA ligase (Hình 3.5A). Sản phẩm nối được biến nạp

vào tế bào vi khuẩn Ecoli DH5α bằng phương pháp biến nạp ( 42°C, 30 giây), nuôi

trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampiciclin với nồng độ

100mg/ l. Sau khoảng 16h nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC, chúng tôi kiểm tra ngẫu nhiên

16 khuẩn lạc bằng kỹ thuật PCR tại chỗ với cặp mồi AtYUCCA6NotI-F và M13. Kết

quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% cho thấy tất cả đều dương tính với

băng vạch có kích thước khoảng 1,25kb tương ứng với kích thước của đoạn gene

AtYUCCA6 (Hình 3.6A). Trong đó khuẩn lạc số 8 và 13 cho 1 băng duy nhất rõ nét

tương ứng với kích thước của gen. Khuẩn lạc số 3, 4 và 10 cho băng rất mờ, các

khuẩn lạc còn lại xuất hiện băng phụ có kích thước lớn hơn kích thước của gen do

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

quá trình gắn nối sai giữa gen và vector tạo nên. Các khuẩn lạc này bị loại bỏ. Để

36

kiểm tra chính xác, chúng tôi nuôi tăng sinh khuẩn lạc số 8 và số 13, tách DNA

plasmid và cắt bằng enzyme giới hạn NotI và SpeI. Kết quả điện di cho thấy trên bản

gel có hai phân đoạn DNA với kích thước khoảng 4 kb và 1,25kb. Trong đó kích

thước của vector tách dòng pBS mang promoter UBQ14 là 4 kb và gene AtYUCCA6

là 1,25 kb (Hình 3.6 B).

Để kiểm tra cấu trúc gen AtYUCCA6, chúng tôi tiến hành giải trình tự gene và

so sánh trình tự gen nhận được với trình tự genne gốc trên ngân hàng NCBI bằng

công cụ Blast. Kết quả giải trình tự gene với cặp mồi M13 (-40) cho thấy gene

AtYUCCA6 có độ tương đồng 100% với trình tự gốc và trình tự amino axit được bảo

toàn. Hình 3.7 thể hiện một phần kết quả tách dòng gene AtYUCCA6 được kiểm tra

bằng công cụ Blast trên ngân hàng gene (NCBI) với mồi ngược M13 (-40) cung cấp

bởi công ty COSMOGENETECH. Trình tự gene AtYUCCA6 bắt đầu từ vị trí 381,

xen giữa vị trí từ 375 đến 380 là trình tự enzyme SpeI (ACTAGT) nối giữa gene

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

AtYUCCA6 và vector pBS (Hình 3.7).

37

Hình 3.5. Hình vẽ cấu trúc vector nhân dòng và vector chuyển gene AtYUCCA6.

(A)-vector nhân dòng pBluescipt được cắt mở vòng và chèn đoạn gene pUBQ14-

AtYUCCA6 tại vị trí enzyme cắt giới hạn AscI và SpeI trong vùng MCS.

(B)-vector chuyển gene pER8 được chèn cấu trúc pUBQ14-AtYUCCA6 có gene chỉ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thị chọn lọc kanamycin trong vùng RB và LB.

38

(A)

(B) 4 kb

1,25k 1,25k

Hình 3.6. Kết quả kiểm tra khuẩn lạc mang gene AtYUCCA6 bằng PCR và enzyme

giới hạn.

(A)-PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi M13 và AtYUCCA6. Mũi tên chỉ đoạn khuếch

đại kích thước khoảng 1,25kb tương ứng với kích thước mong muốn khi điện di trên

gel agarose 1%.

Kết quả cho thấy tất cả các khuẩn lạc đều dương tính với băng vạch 1,25 kb tương

ứng với kích thước gen AtYUCCA6

(B)- Khuẩn lạc số 8 và 13 được kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn NotI và SpeI cho

kích thước tương ứng với gene AtYUCCA6 và vector tách dòng pBS.

Kết quả cả hai khuẩn lạc 8 và 13 đều dương tính với băng vạch có kích thước 4 kb

tương ứng với kích thước vector pBs và băng vạch 1,25 kb tương ứng kích thước gen

AtYUCCA6.

spe

I

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gene tách dòng AtYUCCA6 với cặp mổi ngược M13 (-40)

39

Trình tự nucleotid trong hộp màu đỏ là vị trí enzyme cắt SpeI nối giữa gene

AtYUCCA6 và vector pBluescript tương ứng.

Từ các kết quả thu được chúng tôi khẳng định gene AtYUCCA6 được tách dòng

thành công, ký hiệu là pBS-UBQ14: AtYUCCA6.

3.3. Gắn vào vector chuyển gene

Sau khi tách dòng thành công, gene AtYUCCA6 được đưa sang vector chuyển

gene pER8 kích thước 11,9kb có các vị trí enzyme cắt giới hạn AscI và SpeI. Cắt đồng

thời pBS::pUBQ14-AtYUCCA6 và pER8 vector với enzyme AscI và SpeI và ghép nối

bằng enzyme T4 DNA ligase theo sơ đồ mô tả ở hình 3.5A và 3.5B. Phản ứng ghép

nối được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α và nuôi cấy trải trên đĩa thạch có

kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l. Kết quả kiểm tra ngẫu nhiên 8 khuẩn lạc

bằng PCR sử dụng cặp mồi AtYUCCA6-F và pER8-R cho thấy cả 8 khuẩn lạc đều cho

kết quả dương tính với kích thước gene tương ứng khoảng 1,25kb (Hình 3.8A). Khuẩn

lạc số 1, 3 và 6 được nuôi tăng sinh và kiểm tra bằng enzyme cắt AscI và SpeI. Kết

quả điện di sản phẩm cắt plasmid từ 3 khuẩn lạc trên đều thu được 2 băng có kích

thước khoảng 11,9 kb và 2,25 kb tương ứng với kích thước của vector pER8 và cấu

trúc pUBQ14-AtYUCCA6 (Hình 3.8B) chứng tỏ gene AtYUCCA6 được chèn thành

công vào vector chuyển gene pER8. Ký hiệu lần lượt là pER8: pUBQ14-AtYUCCA6-1,

3 và 6. Để đánh giá khả năng biểu hiện gene trên cây cây mô hình Arabidopsis, chúng

tôi tiến hành đưa vector chuyển pER8: pUBQ14-AtYUCCA6-1 vào chủng vi khuẩn

GV3101. Kết quả kiểm tra ngẫu nhiên 4 khuẩn lạc trên môi trường kháng sinh rifampicin,

spectinomycin và genetamycin cho thấy hầu hết các khuẩn lạc đều dương tính với cặp

mồi pER8-R cho kích thước gene khoảng 1,25kb tương ứng với gene AtYUCCA6 (Hình

3.8C). Từ các kết quả trên chứng tỏ gene AtYUCCA6 đã được gắn vào vector chuyển

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

gene và biến nạp vào vi khuẩn sẵn sàng cho các thí nghiệm chuyển gene.

40

(A) (C)

(B) 11,9

kb 2,25 1,25 1,25

Hình 3.8. Kết quả kiểm tra thiết kế vector chuyển gen AtYUCCA6

(A)- Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi AtYUCCA6-F và pER8-R trong Ecoli

(B)- Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn AscI và SpeI.

(C)- Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi AtYUCCA6-F và pER8-R trong

Agrobacterium GV3101

3.4. Tạo cây Arabidopsis chuyển gene AtYUCCA6

Sau khi tách dòng và thiết kế thành công vector chuyển gen pER8-pUBQ14:

AtYUCCA6, để kiểm tra khả năng biểu hiện của gen AtYUCCA6 sau khi được gắn

với promoter tăng cường , chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên cây mô hình

Arabidopsis thaliana. Cấu trúc vector chuyển gen pER8-pUBQ14: AtYUCCA6

được chuyển vào cây Arabidopsis thaliana thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens bằng phương pháp nhúng cụm hoa [16]. Hoa được ngâm trong dụng

dịch đồng nuôi cấy (MS/2 pH 5,7, BAP 44 mM, sucrose 5%) có OD = 0,8 trong

30 giây, hút chân không 30 giây. Sau đó cây được đặt trong bình kín 3 ngày. Cứ 6

ngày chuyển gen lặp lại một lần. Khi quả trên cây chín tiến hành thu hạt và xử lý

này mầm ở 4oC trong 5 ngày trước khi gieo. Hạt của cây chuyển gen T0 được chọn

lọc trên môi trường kháng sinh kanamycin nồng độ 50mg/l. Sau 7 ngày chúng tôi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

thống kê tỷ lệ cây sống ở bảng 3.2:

41

Bảng 3.1. Kết quả chọn lọc cây chuyển gen AtYUCCA6 trên môi trường kháng

sinh kanamycin

Số hạt chọn lọc Cây T1 chuyển gen trên môi trường kanamycin 50mg/l sau 7 ngày Cây chuyển gen To (hạt) Số cây chết Số cây sống Tỷ lệ chọn lọc

(%) (cây) (cây)

500 414 86 17,2 1

500 398 102 20,4 2

500 404 96 19,2 3

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy trong tổng số 1500 hạt được chọn lọc với 3 lần

thí nghiệm, có 284 cây sống, hiệu quả chuyển gen dựa trên gene kháng kháng sinh

kanamycin đạt 18,9% . Điều đó chứng tỏ bước đầu chuyển gen đã thành công.

Để đánh giá cây chuyển gen, chúng tôi chuyển 50 cây chuyển gen kháng

kanamycin ra trồng và kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng PCR. Kĩ thuật PCR

cho phép nhân bản một số lượng lớn nguyên bản một đoạn DNA trong một thời gian

ngắn. Đây là phương pháp thường được dùng trong phân tích dòng cây chuyển gen

vì độ tin cậy cao. Theo lí thuyết nếu ta cung cấp cặp mồi đặc hiệu thì sẽ nhân chính

xác được đoạn gen nằm giữa hai mồi đó. Khi tiến hành PCR trên DNA tách từ cây đã

được chuyển gen, nếu cho kết quả đặc hiệu với cặp mồi đó thì ta có thể kết luận rằng

cây đó đã mang đoạn gen cần chuyển.

Kết quả kiểm tra ngẫu nhiên 15 cây chuyển gen với cặp mồi AtYUCCA6-F và

pER8-R cho thấy 13/15 cây cho bằng vạch có kích thước khoảng 1,25kb tương ứng

với kích thước của gen AtYUCCA6 chuyển vào. 2/15 cây không xuất hiện băng vạch

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

có kích thước tương ứng với gen AtYUCCA6 (hình 3.9).

M (+) (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

+ + + + + + + + - - + + + + +

1,25kb

42

Hình 3.9. Kết quả phân tích cây chuyển gen bằng PCR sử dụng cặp mồi

AtYUCCA6-F và pER8-R.

Ghi chú:

M: thang chuẩn 1kb;

(+) đối chứng dương: plasmid pER8-AtYUCCA6

(-) đối chứng âm: plasmid của cây không chuyển gen

Từ 1 đến 15 là thứ tự cây chuyển gen AtYUCCA6.

Theo kết qủa trên hình 3.9 trong 15 mẫu Arabidopsis thaliana chuyển gen có

13 mẫu cho kết quả dương tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu

AtYUCCA6-F và pER8-R ( các mẫu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15), thu được

sản phẩm có kích thước 1,25 kb tương ứng với kích thước gen AtYUCCA6 theo lý

thuyết. Bước đầu chứng tỏ các mẫu này đã mang gen AtYUCCA6.

Trong 15 mẫu có 2 mẫu cho kết quả âm tính với PCR ( mẫu 9, 10 ). Đối chứng

dương là plasmid pER8-AtYUCCA6 làm khuôn mẫu. Đối chứng âm là sản phẩm

PCR sử dụng khuôn mẫu là plasmid tách chiết từ lá Arabidopsis thaliana không

chuyển gen, đều cho kết quả âm tính. Như vậy, kết quả dương tính với phản ứng

PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu AtYUCCA6-F và pER8-R của 15 cây Arabidopsis

thaliana đã chuyển gen chứng tỏ đây là những cây Arabidopsis thaliana có mang

cấu trúc gen cần chuyển.

Một số nghiên cứu trước đây đã tiến hành đánh giá khả năng chịu hạn của cây

chuyển gene AtYUCCA6 cho kết quả rất khả quan. Kim và cộng sự (2013) tạo cây

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

khoai tây chuyển gene siêu biểu hiện AtYUCCA6 dưới sự điều khiển của promoter

43

PT cho khả năng chịu hạn cao hơn cây đối chứng khoảng 12 ngày [30]. Tương tự Ke

và cộng sự (2015) [31] đã sử dụng vector pCAMBIA2300 mang promoter cảm ứng

SWPA2 để tạo cây hướng dương chuyển gen AtYUCCA6. Kết quả cho thấy cây

chuyển gene sinh trưởng nhanh hơn và chống chịu với điều kiện hạn hơn cây đối

chứng khoảng 6 ngày. Park và cộng sự (2019) [38] tạo cây đậu tương chuyển gen

AtYUCCA6 sử dụng cấu trúc vector pPZP-p35S: AtYUCCA6 cho thấy cây chuyển

gen có khả năng chịu hạn sau 14 ngày thiếu nước. Từ các kết quả nghiên cứu trên cho

thấy gene AtYUCCA6 có khả năng ứng dụng cao để tạo cây chuyển gene chịu hạn.

Trong nghiên cứu này chúng tôi thiết kế vector sử dụng promoter cơ định Ubiqutin

14 ( UBQ14) điều khiển gene AtYUCCA6 nhằm ứng dụng tạo cây chuyển gene chịu

hạn ở Việt Nam. Promoter Ubiquitin có vai trò tương tự như promoter 35S hiện được

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

nhiều nhà khoa học sử dụng trong các nghiên cứu chuyển gen.

44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Dựa trên cơ sở dữ liệu database, gen AtYUCCA6 được lựa chọn nghiên cứu có

kích thước 3719bp, vùng gen mã hóa có chiều dài 1,25kb biểu hiện mạnh ở cơ quan

sinh sản (hoa, hạt phấn) của cây.

Gen AtYUCCA6 được tách dòng thành công bằng vector tách dòng pBluescript.

Kết quả tách dòng được kiểm tra bằng giải trình tự gen đảm bảo độ chính xác 100%.

Vector chuyển gene pER8::pUBQ14-AtYUCCA6 đã được thiết kế thành công

với promoter UBQ14 và gen chọn lọc kanamycin.

Cấu trúc chuyển gen pER8:pUBQ14-AtYUCCA6 được chuyển thành công vào

cây Arabidopsis thaliana. Tỷ lệ cây chuyển gen trên môi trường kháng kanamycin

đạt 18,9%.

2. Kiến nghị

Cần triển khai tiếp các thí nghiệm chuyên gen pUBQ14-AtYUCCA6 trên cây

mô hình và đánh giá khả năng biểu hiện của gen được chuyển AtYUCCA6 dưới sư

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

dưới sự khiển của promoter pUBQ14 trong điều kiện hạn.

45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gene ở Việt Nam, Bộ sách

chuyên khảo, Nxb Khoa học và Công nghệ.

2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với

thiệt hại do môi trường của cây lúa, Nxb Nông nghiệp Tp.HCM.

3. Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gene ở thực

vật, Giáo trình cho Cao học Nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp Hà Nội.

4. Nguyễn Như Khanh (2009), Sinh lý thực vật, Nxb Giáo Dục, Hà Nội.

5. Trần Thị Phương Liên (1998), “Cơ chế phân tử tính chịu hạn của thực vật”,

Tạp chí Khoa học và Phát triển.

6. Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết và ứng

dụng công nghệ gene trong chọn tạo giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

7. Ong Xuân Phong, Nguyễn Văn Mã (2014), Một số biến đổi sinh lý ở hạt nảy

mầm và cây non đậu tương trong điều kiện nhiệt độ thấp, Tạp chí Khoa học và Phát

triển, số 7: 1114-1119.

8. Hoàng Minh Tấn (2006), Giáo trình Sinh lý thực vật, NXB Đại học Sư Phạm.

9. Trần Văn Tựa, Nguyễn Trung Kiên, Đỗ Tuấn Anh, Đặng Đình Kim (2011).

Nghiên cứu khả năng chống chịu và hấp thu chì, kẽm của Dương xỉ Ptreris vittataL.

Tạp chí khoa học và công nghệ. 101 - 109.

10. Lê Duy Thành (2001). Cơ sở di tryền chọn giống thực vật, NXB Khoa học

và kỹ thuật, Hà Nội.

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

11. Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M (1997).

GeneGenGenes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-

shaped cotyledon mutant. Plant Cell 9: 841-857.

12. Bartels, D. and Sunkar R. (2005). Drought and salt tolerance in plants,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Critical reviews in plant sciences, 24 (1), pp. 23-58.

46

13. Bhargava, S. and Sawant K.(2013). Drought stress adaptation: metabolic

adjustment and regulation of genegengene expression. Plant Breeding, 132 (1), pp.

21-32.

14. Blum, A.(2005). Drought resistance, water-use efficiency, and yield

potential—are they c ompatible, dissonant, or mutually exclusive, Crop and Pasture

Science, 56 (11), pp. 1159-1168.

15. Collins W. K; Hawks S. N.Jr, (1993). Principles of hte Flue - cured

Tobaco Production. N.C. State Univesity 2nd Ed. 300.

16. Cha, J.-Y. et al. (2015).A novel thiol-reductase activity

of Arabidopsis ATYUCCA6 confers drought tolerance independently of auxin

biosynthesis.nature Commun. 6: 8041 doi: 10.1038 / ncomms9041

17. Chaves, M., Flexas J., and Pinheiro C. (2009). Photosynthesis under

drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell, Annals of

botany, 103 (4), pp. 551-560.

18. Davis D. L.; Nielsen M. T. (1999).Tobaco Production, Chemistry and

technology. B Blackwell Science . 467.

19. Ding Z. S., Zhao M., Jing Y. X., Li L. B. and Kuang T. Y. (2006).

“EfficientAgrobacterium, Mediated transformation of Rice by Phosphomannose

Isomerase/Mannose selection”,Plant Molecular Biology Reporter, (24), pp.29)5-303.

20. Ditt R. F., Nester E. W. and Comai L. (2005). The plant cell defense

andAgrobacterium tumefaciens.FEMS Microbiology letters, 247, pp. 207-213.

21. Feng, J.-X., Liu D., et al. (2005).An annotation update via cDNA sequence

analysis and comprehensive profiling of developmental, hormonal or environmental

responsiveness of the Arabidopsis AP2/EREBP transcription factor genegengene

family, Plant molecular biology, 59 (6), pp. 853-868.

22. Gelvin S. B. (2003).“Agrobacterium - mediated plant transformation the

biology behind the “GeneGenGene - jockeying” Tool”, Microbiology and Molecular

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Biology Reviews, 67 (1), pp.16-37.

47

23. Guo, H. and Ecker J.R. (2004). The ethylene signaling pathway: new

insights, Current opinion in plant biology, 7 (1), pp. 40-49.

24. Hao, D., Ohme-Takagi M., and Sarai A.(1998). Unique mode of GCC box

recognition by the DNA-binding domain of ethylene-responsive elementbinding

factor (ERF domain) in plant, Journal of Biological Chemistry, 273 (41), pp. 26857-

26861.

25. Harb, A., Krishnan A., Ambavaram M.M., and Pereira A. (2010). Molecular

and physiological analysis of drought stress in Arabidopsis reveals early responses

leading. Plant Physiol, pp 1254 - 1271.

26. Hayano-Kanashiro, C., Calderón-Vázquez C., Ibarra-Laclette E., HerreraEstrella

L., and Simpson J.(2009). Analysis of genegengene expression and physiological

responses in three Mexican maize landraces under drought stress and recovery irrigation,

PLoS One, 4 (10), pp. e7531

27. Jeong Im Kim , ( 2011) YUCCA6 over-expression demonstrates auxin

function in delaying leaf senescence in Arabidopsis thaliana. J Exp Bot 21/4/2011

28. K. S. Mysore, R. P. Tuori, and G.B, Martin (2001).Arabidopsis gengeneome

sequence as a tool for functional gengeneomics in tomato, GenGeneome Biol 2. 1086

- 1186.

29. Kaspar TC, Taylor HM and Shibles RM(1984). Taproot elongation rates of

Soybean cultivars in the glasshouse and their relatio to field rooting depth. Crop Sci

24: 916 - 920.

30. Kepinski S và Leyser O. (2005) The Arabidopsis F-box protein TIR1 is an

auxin receptor. Nature 435: 446-451

31. Kim, J.I, Baek, D, Park, H.C, Chun, H.J, Oh, D.H, Lee, M.K, Cha,

J.Y, Kim, W.Y, Kim, M.C, Chung, W.S, Bohnert, H.J, Lee, S.Y, Bressan, R.A, Lee,

S.W, Yun, D.J. (2013) Overexpression of Arabidopsis YUCCA6 in potato results in

high-auxin developmental phenotypes and enhanced resistance to water deficit. Mol

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Plant.6(2):337-349.

48

32. Kim, J.I., Sharkhuu, A., Jin, J.B., Li, P., Jeong, J.C., Baek, D., Lee, S.Y.,

Blakeslee, J.J., Murphy, A.S., Bohnert, H.J., et al. (2007). yucca6, a dominant

mutation in Arabidopsis, affects auxin accumulation and auxin-related phenotypes.

Plant Physiol. 145, 722-735.

33. Le, M.Q., Pagter M., and Hincha D.K (2015). Global changes in

genegengene expression, assayed by microarray hybridization and quantitative RT-

PCR, during acclimation of three Arabidopsis thaliana accessions to sub-zero

temperatures after cold acclimation, Plant molecular biology, 87 (1-2), pp. 1-

34. Lee, M., Jung, J.H., Han, D.Y., Seo, P.J., Park, W.J., and Park, C.M. (2011).

Activation of a flavin monooxygenase gene YUCCA7 enhances drought resistance in

Arabidopsis. Planta. 235, 923-938.

35. Lee, M., Jung, J.H., Han, D.Y., Seo, P.J., Park, W.J., and Park, C.M. (2011).

Activation of a flavin monooxygenase gene YUCCA7 enhances drought resistance in

Arabidopsis. Planta. 235, 923-938.

36. Mashiguchia, K., Tanaka, K., Sakaic, T., Sugawaraa, S., Kawaideb, H.,

Natsumeb, M., Hanadaa, A., Yaenoa, T., Shirasua, K., Yaod, H., et al. (2011). The

main auxin biosynthesis pathway in Arabidopsis. Proc. Natl Acad. Sci. U S A. 108,

18512-18517.

37. Paponov, I.A, Teale, W.D, Trebar, M., Blilou I., Palme, K. (2005) The PIN

auxin efflux facilitators: evolutionary and functional perspectives. Trends Plant Sci

10: 170-177

38. Park, J.S, Kim, H.J, Cho, H.S, Jung, H.W, Cha, J.Y, Yun, D.J, Oh,

S.W, Chung, Y.S. (2019) Overexpression of AtYUCCA6 in soybean crop results in

reduced ROS production and increased drought tolerance. Plant Biotech Rep (13),

161-168

39. Ross, J.J., Tivendale, N.D., Reid, J.B., Davies, N.W., Molesworth, P.P.,

Lowe, E.K., Smith, J.A., and Davidson, S.E. (2011). Reassessing the role of YUCCAs

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

in auxin biosynthesis. Plant Signal Behav. 6, 437-439

49

40. Van der Graaff, E., Boot, K., Granbom, R., Sandberg, G., and Hooykaas,

P.J.J. (2003). Increased endogenous auxin production in Arabidopsis thaliana causes

both earlier described and novel auxin-related phenotypes. J. Plant Growth Regul.

22, 240-252.

41. Won, C., Shen, X., Mashiguchi, K., Zheng, Z., Dai, X., Cheng, Y.,

Kasahara, H., Kamiya, Y., Chory, J., and Zhao, Y. (2011). Conversion of tryptophan

to indole-e-acetic acid by Tryptophan aminotransferases of Arabidopsis and

YUCCAs in Arabidopsis. Proc. Natl Acad. Sci. U S A. 108, 18518-18523.

42. Woo, Y., Park, H., Su’udi, M., Yang, J., Park, J., Back, K., Park, Y., and

An, G. (2007). Constitutively wilted 1, a member of the rice YUCCA gene family, is

required for maintaining water homeostasis and an appropriate root to shoot ratio.

Plant Mol. Biol. 65, 125-136.

43. Yunde zhao (2014), Auxin biosynthesis, Arabidopsis book.

44. Zhao, Y. (2012). Auxin biosynthesis: a simple two-step pathway converts

tryptophan to indole-3-acetic acid in plants. Mol.Plant. 5, 334-338.

45. Zhao, Y., Christensen, S.K., Fankhauser, C., Cashman, J.R., Cohen, J.D., Weigel,

D., and Chory, J. (2001). A role for flavin monooxygenase-like enzymes in auxin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

biosynthesis. Science. 291,306-309.

50

PHỤ LỤC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

51

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

52

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

53

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

54

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

55

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

56

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn

57