Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tinh sạch các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus phân lập ở Việt Nam

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÝ THỊ BÍCH HẠNH

TINH SẠCH CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP

CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG BACILLUS

PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Đỗ Thị Tuyên

ii

THÁI NGUYÊN - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dƣới đây là do tôi và nhóm

cộng sự nghiên cứu tại phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ

sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ

tháng 5 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015.

Thái Nguyên, ngày 06 tháng 11 năm 2015

Học viên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Lý Thị Bích Hạnh

iii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS.

Đỗ Thị Tuyên, Phó trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công

nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã định

hƣớng nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất, thiết bị,

thời gian cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài này.

Tôi xin cảm ơn các anh chị cán bộ Phòng Công nghệ sinh học enzyme,

Viện Công nghệ sinh học đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình

nghiên cứu cũng nhƣ chia sẻ những kinh nghiệm chuyên môn.

Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh các thầy cô giáo tại

trƣờng Đại Học Khoa học, Đại học Thái Nguyên, các thầy cô trong Viện

Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo

điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình bạn bè đã giúp

đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận

văn này.

Hà Nội, Tháng 5 năm 2015

Học viên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Lý Thị Bích Hạnh

iv

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

APS Ammonium presulphate

AFC Antifungal compound

B. subtilis Bacillus subtilis

BCF Biological Control Fungi

CFU Connoly-Forming unit

DEAE-cellulose Dimethylaminoethyl-cellulose

ĐC Đối chứng

F. oxysporum Fusarium oxysporum

kDa Kilo Dalton

LB Luria – Bertani

PDA Potato Dextrose agar

M Marker

MIC Minimal Inhibitory Concentration

FTIR Fourirer ransform infrared spectroscopy

TLC Thin Layer Chromatography

Pr Protein

R. solani Rhizoctonia solani

SDS Sodium doecyl sulfate

TB

TEMED Trung bình N, N, N’, N’, - Tetramethyl ethylene diamine

TN Thí nghiệm

v/v Volume/volume (thể tích/ thể tích)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

w/v Weight/volume (khối lƣợng/thể tích)

v

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. iii

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. iv

MỤC LỤC ......................................................................................................... v

DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ vii

DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vii

MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1

2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................ 2

3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3

1.1. Khái quát về chất đối kháng sinh trƣởng nấm .......................................... 3

1.2. Vai trò của vi khuẩn B. subtilis trong kiểm soát sinh học ......................... 5

1.2.1. Đại cƣơng về vi khuẩn B. subtilis ........................................................... 5

1.2.2. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính kháng nấm .................................. 6

1.3. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm trên thế giới ... 8

1.4. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm tại Việt Nam ..... 13

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................ 16

2.1. Vật liệu và hóa chất .................................................................................. 16

2.1.1. Chủng giống .......................................................................................... 16

2.1.2. Hóa chất................................................................................................. 16

2.1.3. Các loại đệm và dung dịch .................................................................... 16

2.1.4. Môi trƣờng ............................................................................................ 17

2.1.5. Thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 18

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 18

2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh và thu nhận dịch ngoại bào .................. 18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính ức chế sinh trƣởng nấm ..................... 19

vi

2.2.3. Thử hoạt tính kháng nấm bằng khoanh giấy lọc ................................... 20

2.2.4. Phƣơng pháp tủa muối amonium sulfate .............................................. 20

2.2.5. Phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose ............................... 20

2.2.6. Phƣơng pháp sắc ký lọc gel Biogel P100.............................................. 21

2.2.7. Xác định hàm lƣợng protein tổng số ..................................................... 23

2.2.8. Điện di SDS - PAGE ............................................................................. 23

2.2.9. Đánh giá tính chất lý hóa của protein tinh sạch .................................... 25

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 27

3.1. Hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS ........ 27

3.1.1. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào đối với nấm F. oxysporum .... 27

3.1.2. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào đối với nấm R. solani ........... 29

3.2. Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm ............................................... 31

3.2.1. Tủa protein bằng muối amonium sulfate .............................................. 31

3.2.1. Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE – cellulose ..................... 31

3.2.2. Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm qua sắc ký lọc gel Biogel P100 .. 35

3.3. Đánh giá tính chất của protein tinh sạch .................................................. 39

3.3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ........................................................................ 40

3.3.2. Ảnh hƣởng của proteinase K ................................................................. 41

3.3.3. Khả năng ức chế sợi bào tử nấm ........................................................... 43

3.3.4. Hoạt tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein với nấm R.solani

và F. oxysporum .............................................................................................. 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 48

1. Kết luận ....................................................................................................... 48

2. Đề nghị ........................................................................................................ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

PHỤ LỤC

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc chủng B.subtilis AS trên môi trƣờng PDA ....... 5

Hình 2.1. Quy trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng B. subtilis AS .... 22

Hình 2.2. Đƣờng chuẩn Brardford .................................................................. 23

Hình 3.1. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS đối

với nấm F. oxysporum sau 5 ngày. ................................................................. 28

Hình 3.2. Hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS

đối với nấm R. solani sau 3 ngày. ................................................................... 30

Hình 3.3. Sắc ký đồ các phân đoạn qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE-

cellulose ........................................................................................................... 32

Hình 3.4. Điện di đồ các phân đoạn protein tinh sạch qua cột DEAE –

celulose ........................................................................................................... 33

Hình 3.5. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A, D) và R. solani (B, C)

...................................................................................................34_Toc434515732

Hình 3.6. Sắc ký đồ các phân đoạn proteintinh sạch có hoạt tính kháng nấm

sau khi qua cột Biogel P100 ............................................................................ 36

Hình 3.7. Điện di đồ các phân đoạn protein có hoạt tính kháng nấm qua cột

Biogel P100 ..................................................................................................... 36

Hình 3.8. Các phân đoạn protein tinh sạch có hoạt tính kháng nấm qua cột

Biogel P100,. .................................................................................................. 38

Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A) ...... 40

Hình 3.10. Ảnh hƣởng của proteinase K đến hoạt tính kháng nấm F. oxysporum

(A) và nấm R. solani (B) .................................................................................. 42

Hình 3.11. Khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử F. oxysporum của protein

tinh sạch từ chủng B. subtilis AS. ................................................................... 44

Hình 3.12. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch từ chủng B.

subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm F. oxysporum ........................................ 45

Hình 3.13. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch từ chủng B.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm nấm R. solani. ....................................... 46

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần các loại đệm và dung dịch .......................................... 17

Bảng 2.2. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật .................................. 17

Bảng 2.3. Danh sách các thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng ............................ 18

Bảng 2.4. Thành phần gel cô và gel tách ........................................................ 24

Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis AS lên sinh

trƣởng của F. oxysporum ................................................................................ 28

Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis AS lên sinh

trƣởng của nấm R. solani ................................................................................ 29

Bảng 3.3. Tóm tắt quá trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng B. subtillis

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

AS qua các bƣớc tinh sạch .............................................................................. 39

1

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài

Hàng năm, các bệnh cây trồng đã gây ra những tổn thất to lớn cho sản

xuất nông nghiệp. Theo tổ chức nông lƣơng liên hợp quốc (FAO, 2004), thiệt

hại trong nông nghiệp do các bệnh vi nấm gây ra đến 537,3 triệu tấn các loại

nông sản chủ yếu, chiếm khoảng 11,6% tổng sản lƣợng nông nghiệp trên thế

giới. Trong đó chiếm 83% là bệnh do vi nấm gây ra, chủ yếu là các bệnh nhƣ:

đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sƣơng… đặc biệt bệnh do nấm Fusarium và

Rhizoctonia gây ra chiếm tỉ lệ tƣơng đối lớn.

Hiện nay, các biện pháp hóa học vẫn đƣợc sử dụng rất phổ biến và rộng

rãi với một lƣợng rất lớn vì nó mang lại hiệu quả phòng trừ cao, rẻ tiền. Tuy

nhiên bên cạnh đó, nó cũng gây ra những tác hại rất to lớn đến môi trƣờng và

sức khỏe con ngƣời, tạo ra sự kháng thuốc với nhiều loại bệnh hại. Vì vậy gây

nên nhiều khó khăn trong công tác phòng trừ bệnh.

Để khắc phục những nhƣợc điểm do biện pháp hóa học gây ra nhƣ trên,

hiện nay trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam, việc sử dụng các chế phẩm sinh

học thay thế một phần thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh cây trồng do

vi sinh vật gây ra đang là xu hƣớng chủ yếu. Chế phẩm sinh học diệt nấm có

nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng có tác dụng tích cực đối với nông nghiệp, ƣu

việt hơn so với việc dùng thuốc hóa học. Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ

vi khuẩn để diệt nấm gây hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài

cho ngƣời sản xuất nhƣ: làm tăng năng suất của cây trồng, giảm chi phí đầu

tƣ, làm đất không bị bạc màu, thân thiện với môi trƣờng sinh thái, không ảnh

hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời và vật nuôi, góp phần quan trọng trong

việc phát triển nền nông nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu quả.

Vi khuẩn Bacillus theo nhiều tài liệu đã công bố đƣợc biết đến với vai

trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh cây trồng. Chúng có khả năng sinh

tổng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác nhau nhƣ các chất kháng sinh,

2

lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin và fengycin. Một số chủng

Bacillus subtilis đã đƣợc ứng dụng để kiểm soát bệnh cây trồng do nấm gây ra.

Việc nghiên cứu phòng trừ nấm bệnh cây trồng bằng các chế phẩm sinh

học đã đƣợc hình thành và phát triển ở Việt Nam nhƣng vẫn còn nhiều hạn

chế. Các chế phẩm dƣới dạng tinh sạch tách chiết từ vi sinh vật mới nghiên

cứu chủ yếu ở trong phòng thí nghiệm và quy mô sản xuất thử nên giá thành

còn cao. Các sản phẩm trên thị trƣờng chủ yếu là các sản phẩm có chứa tế bào

vi sinh vật đối kháng nên thời gian hữu hiệu ngắn hiệu quả không cao. Mặt

khác, các sản phẩm sử dụng tế bào mang nguy cơ gây bệnh rất lớn cho con

ngƣời. Vì vậy, để phát triển sản phẩm sinh học đạt độ tinh sạch cao để phòng

chống nấm bệnh cây trồng là một vấn đề rất cấp thiết. Trong quá trình nghiên

cứu, chúng tôi đã phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng B. subtilis AS có khả

năng ức chế mạnh các nấm gây bệnh cây trồng nhƣ F. oxysporum và R.

solani. Xuất phát từ những lý do trên và tình hình nghiên cứu ở Việt Nam,

chúng tôi đã thực hiện đề tài luận văn: "Tinh sạch các hợp chất thứ cấp có

hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus phân lập ở Việt Nam" .

2. Mục tiêu của đề tài

- Tinh sạch hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng nấm F. oxysporum và

R. solani từ chủng B. subtilis AS.

- Đánh giá tính chất lý hóa của hợp chất đƣợc tinh sạch.

3. Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá khả năng ức chế sinh trƣởng và phát triển của dịch lọc ngoại

bào vi khuẩn B. subtilis AS đối với hai chủng nấm F. oxysporum và R. solani.

- Tách chiết và tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm từ dịch lọc

ngoại bào vi khuẩn B. subtilis AS.

- Đánh giá sự ảnh hƣởng của nhiệt độ, proteinase K, ức chế sợi tử bào nấm

và nồng độ ức chế tối thiểu lên hoạt tính kháng nấm của protein tinh sạch đƣợc.

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái quát về chất đối kháng sinh trƣởng nấm

Chất đối kháng sinh trƣởng nấm (Antifungal – compounds, AFC) là

những chất có khả năng ức chế sự sinh trƣởng hoặc tiêu diệt sự phát triển của

các loại nấm.Các chất này đã đƣợc ứng dụng để phòng và chữa trị các bệnh

do nấm gây ra, đặc biệt là các loại nấm gây bệnh hại trên cây trồng nhƣ lạc, cà

chua, đậu tƣơng, cây cà phê và nhiều loại cây khác. Các protein và peptide có

hoạt tính kháng nấm đều đƣợc tách chiết phần lớn từ động vật, thực vật, vi

khuẩn và nấm. Năm 1993, Lijima và cộng sự đã xác định đƣợc protein chống

nấm Candida albicans, Shizosaccharomyces pombe có trong hemolymph của

ấu trùng Sarcophaga (2,5 mg protein tinh khiết thu đƣợc từ 10ml hemolymph

với nồng độ ức chế sự tăng trƣởng 50% là 30 pg/ml) [25].

Hoạt tính kháng nấm cũng đƣợc phát hiện ở thực vật nhƣ tính kháng

nấm của heme preoxidase từ cây mây Acoru peroxidase có vai trò trong việc

ức chế các sợi nấm của Phaseolina macrophomina, Fusarium moniliforme và

trichosporium vesiculosum [23]. Một chất ức chế protease cysteine đƣợc công

bố có khả năng kháng nấm từ hạt kê. Chất này ức chế mạnh hoạt động của

nấm T. reesei một loại nấm gỗ, nồng độ tối thiểu để ức chế sự tăng trƣởng của

sợi nấm hay bào tử nảy mầm là 1 µg/ml (250mg/đĩa). Ngoài ra chúng còn ức

chế một số loại nấm gây hại thực vật khác nhƣ: Claviceps, Helminthosprium,

Curvularia, Alternaria và các loài thuộc chi Fusarium [27].

Một protein kháng nấm đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Bacillus

amyloliquefaciens MET0908 có khả năng kiểm soát sự sinh trƣởng của nấm

Colletotrichum lagenarium gây bệnh trên dƣa hấu. Protein này còn có thể

hoạt động đƣợc trên vách tế bào C. lagenarium [28].

Đặc biệt hoạt chất kháng nấm còn đƣợc phân lập từ quả thể của nấm

hypsizygus marmoreus là Hypsin một protein chịu nhiệt ức chế sự tăng trƣởng

4

của sợi nấm trong các loài nấm khác nhau bao gồm Mycosphaerella

arachidicola, Physalospora piricola, F. oxyproum, và Botrytis cinerea với giá

trị IC50 tƣơng ứng là 2,7; 2,5; 14,2 và 0,06 µM [33].

Trong các nguồn trên thì các chất AFC tách chiết từ vi khuẩn thuộc các

chi Bacillus đƣợc quan tâm nhiều hơn cả bởi tính phổ biến và thuận lợi trong

tinh sạch. Các chủng Bacillus có rất nhiều đặc tính tốt nhƣ: dễ nuôi cấy, phổ

biến, sinh trƣởng nhanh trong môi trƣờng lỏng, cho nhiều bào tử và đặc biệt

chúng có khả năng tổng hợp nhiều chất đối kháng sinh trƣởng nấm.

Các protein và peptide có khả năng kháng nấm đƣợc phân loại theo

nhiều cách khác nhau, dựa vào cơ chế tác động có thể phân thành 3 loại đó là

loại tác động vào vách tế bào nấm: (1) ức chế sự tổng hợp chitin và glucan,

loại tác động vào màng tế bào nấm: (2) các chất gắn dính hay ức chế sự tổng

hợp ergosterol của nấm và (3) loại tác động vào quá trình tổng hợp protein và

acid nucleic của nấm. Dựa vào cấu trúc hoặc chức năng, các protein và

peptide có khả năng kháng nấm đƣợc phân loại thành nhiều lớp khác nhau,

chẳng hạn nhƣ chitinase và chitinase-like protein [14], [34], ribonuclease

[39], chất ức chế protease [27].

Peptide kháng nấm đầu tiên đƣợc tách chiết từ chủng Bacillus là iturin

và bacillomycin. Chúng có cấu trúc peptidolipid mạch vòng và có khả năng

kháng nấm và tan huyết [35]. Bacillus cũng chính là đối tƣợng vi khuẩn đƣợc

quan tâm nghiên cứu nhiều nhất hiện nay, chủng này sinh tổng hợp rất nhiều

các polypeptide có hoạt tính kháng nấm và có tiềm năng trong việc kiểm soát

các bệnh hại cây trồng do nấm gây ra cũng nhƣ trong sản xuất các chế phẩm

sinh học phòng trừ nấm.

5

1.2. Vai trò của vi khuẩn B. subtilis trong kiểm soát sinh học

1.2.1. Đại cương về vi khuẩn B. subtilis

Chủng B. subtilis đƣợc phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941)

bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chủng đƣợc sử dụng để phòng bệnh

lị cho bệnh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Đến năm 1949, khi Henry và các

cộng sự tách đƣợc chủng thuần khiết của B. subtilis thì chúng mới đƣợc dùng

để điều trị bệnh về rối loạn tiêu hóa. Ngày nay, vi khuẩn B. subtilis đã trở nên

phổ biến và đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học, thực phẩm… và đặc biệt là

kiểm soát sinh học trong nông nghiệp.

Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn B. subtilis thuộc:

Giới: Bacteria

Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli

Bộ: Bacillales

Họ: Bacillacea

Chi: Bacillus

Loài: B.subtilis

Hình 1.1. Hình thái khuẩn lạc chủng B.subtilis AS

trên môi trƣờng PDA

Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đƣờng ruột,

chúng đƣợc phân bố hầu hết trong tự nhiên nhƣ: cỏ khô, bụi đất, nƣớc …

phần lớn chúng tồn tại trong đất trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu CFU/g.

B. subtilis là trực khuẩn hình que, hai đầu tròn, Gram dƣơng, kích

thƣớc từ 0,5- 0,8 µm x 1,8-3µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động

8-12 lông. Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm ở giữa tế bào. Kích thƣớc từ

6

0,8-18µm. Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid,

có khả năng chịu nhiệt, chịu ấm, tia tử ngoại, phóng xạ.

Điều kiện phát triển nuôi cấy là môi trƣờng hiếu khí , nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu là 37oC. Mặc dù là vi khuẩn hiếu khi nhƣng B. subtilis có khả năng phát

triển trong môi trƣờng thiếu oxi. pH thích hợp nhất khi nuôi cấy với pH=7,0-

7,4. Trên môi trƣờng thạch đĩa, khuẩn lạc chủng có dạng hình tròn, rìa răng

cƣa không đều, có tâm sẫm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đƣờng kính

3-5mm. Sau 1-4 ngày thì bề mặt nhẵn và chuyển sang màu hơi sẫm. Trên môi

trƣờng thạch nghiêng chủng dễ mọc tạo thành màu xám rìa gợn sóng. Trên

môi trƣờng lỏng chủng phát triển làm đục môi trƣờng, tạo màng nhăn, lắng

cặn lại nhƣ vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên.

1.2.2. Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính kháng nấm

Chủng Bacillus

Vi khuẩn Bacillus theo nhiều tài liệu đã công bố đƣợc biết đến với vai

trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh cây trồng. Chúng có khả năng sinh

tồng hợp nhiều hợp chất kháng nấm khác nhau nhƣ các chất kháng sinh,

lipopeptide, bacillomycin, iturin, mycosubtilin và fengycin [29], [46], [47],

[50]. Một số chủng B. subtilis đã đƣợc ứng dụng để kiểm soát bệnh cây trồng

do nấm gây ra, chúng có phổ biến trong đất, chịu đƣợc nhiệt độ cao, sinh

trƣởng nhanh trong môi trƣờng lỏng và có nhiều bào tử.

Rất nhiều loài thuộc chi Bacillus đã đƣợc biết đến với khả năng sinh

tổng hợp đa dạng về chức năng và cấu trúc các chất chuyển hóa thứ cấp. Việc

sản xuất các chất chuyển hóa có hoạt tính đối kháng vi sinh vật là một trong

những yếu tố quyết định đến khả năng kiểm soát các bệnh hại cây trồng.

Những chất chuyển hóa có thể là hợp chất ribosome nhƣ subtilin [63],

subtilosin A [12], và sublancin [48]. Các peptide kháng sinh nhỏ không phải

từ ribosome nhƣ họ surfactin: surfactin và lichenysin; họ kháng sinh iturin:

7

iturin A, C, D, và E, bacillomycin D, F, L, và mycosubtilin; họ kháng sinh

fengycin: fengicin và plipastatin; các aminopolyol nhƣ zwittermycin A [54].

Trong chi Bacillus thì B. subtilis là loài có khả năng sinh tổng hợp

nhiều loại hoạt chất có hoạt tính đối kháng vi sinh vật. Loài này thƣờng tổng

hợp các loại peptide kháng sinh nhỏ không phải từ ribosome (<2.000 Da) có

hoạt tính kháng nấm, chẳng hạn nhƣ iturin [57], [19], surfactin [16], [10],

fengycin, bacilysin [41], [38], bacillomycin [49], mycosubtilin [50], và

mycobacillin [56], B. subtilis hầu nhƣ cũng sinh tổng hợp ra rất nhiều loại

protein [44], [39]. Tuy nhiên, một số ít trong tổng số các loại protein trên đã

đƣợc công bố là có hoạt tính kháng nấm.

Chủng Pseudomonas

Các chủng pseudomonas sinh tổng hợp nhiều chất đối kháng sinh

trƣởng nấm khác nhau. Nhiều chủng sinh tổng hợp các chất kháng sinh nhƣ

phenazine, 2, 4- diacetylphloroglucinol, pyrrolnitrin, pyoluteorin, hoặc

siderophore. Chủng p. syringae sinh tổng hợp syringomycin, syringostatin và

syringotoxin, có hoạt tính kháng nấm. Syringomycin là các lipodepsipeptide

nhỏ và trong số các peptide kháng nấm vi khuẩn tiềm năng đã đƣợc phát hiện

ra. Syringomycin-E (SE) là peptide phổ biến nhất. SE diệt nấm A. favus, A.

fumigatus, A. niger, F. moniliforme,và F. oxysponim,giá trị LD95 đạt 7,8

µg/ml đối với A. flavus và các giá trị LD95 với 1,9 µg/ml đối với các chủng

nấm khác [55], [20].

Một số nghiên cứu cho thấy các chủng Pseudomonas fluorescens có

khả năng đối ức chế, sinh tổng hợp nhiều chất ức chế với Phytophthora

capsici mầm bệnh thối rữa cổ rễ ở cây tiêu đen ức chế tới 72% sự phát triển

hệ sợi của Phytophthora capsici đƣợc quan sát thấy trong các thí nghiệm nuôi

cấy kép.

8

Chủng Pseudomonas sp. Đƣợc phân lập từ lá cây ô liu, có khả năng sản

xuất endophyte chống lại một số loại nấm gây bệnh. Chúng ức chế 86% sự

tăng trƣởng của nấm R. solani sau 5 ngày và giảm mạnh sự lây nhiễm trên

khoai tây. Đây có thể là một tác nhân trong việc bảo vệ cây trồng chống lại

bệnh nấm [21].

Chủng Burkholderia

Chủng Burkholderia cepacia là một vi sinh vật đất phổ biến và rất

nhiều chủng đã đƣợc biết đến sinh tổng hợp ra lƣợng lớn các chất đối kháng

sinh trƣởng nấm nhƣ cepacin, pyrrolnitrin, xylocandin (còn đƣợc gọi là

cepacidine) là các glycopeptide từ Bur. cepacia và có tác dụng cộng hƣởng

hơn là amphotericin B và hoạt động kháng nhiều nấm gồm cadida sp., A.

Niger, Cryptococcus neoformans, F. oxyporum [36].

Một số hợp chất kháng nấm C. gloeosporioides từ chủng Burkholderia

cepacia B23. Hợp chất kháng nấm đƣợc xác định là pyrrolnitrin rất bền nhiệt

từ dịch lên men ngoại bào của chủng Bur. cepacia B23 bằng phƣơng pháp

TLC. Dịch lên men ngoại bào từ chủng Bur. cepacia B23 ức chế sự phát triển

hệ sợi và và nảy mầm của bào tử nấm C. gloeosporioides từ 41% - 100%.

Năm 2013, Salgado và cộng sự đã nghiên cứu, chọn lọc từ bộ sƣu tập

gồm 15 chủng Bur. tropica từ các vùng khác nhau ở Mexico, xác định chủng

Bur. tropica Mto431 có khả năng ức chế sự sinh trƣởng nhiều loại nấm gây

bệnh thực vật. Hợp chất bay hơi siderophore đƣợc xác định trong dịch lên men

ngoại bào từ nấm, cụ thể trong 4 ngày đối với các loại nấm C. gloeosporioides,

S.rolfssi và 7 ngày đối với các nấm F. oxyporum, F. culmorum.

1.3. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm trên thế giới

Hàng năm trên thế giới bệnh hại cây trồng đã gây ra những tổn thất lớn

cho ngành nông nghiệp. Tính đến năm 2005 khoảng 14% các khoản thiệt hại

trên thế giới hoàn toàn là từ các bệnh hại cây trồng gây ra. Trong đó hơn 50%

9

là do nấm gây ra với hàng tỷ euro thiệt hại mỗi năm [9]. Trong đó các loại

bệnh hại cây trồng thì bệnh do nấm F. oxysporum và R. solani gây ra, nấm

bệnh gây chết héo mạch dẫn và bệnh thối thân, thối rễ, lở cổ rễ ở nhiều loại

cây rau quả và cây lƣơng thực lạc, cà chua, khoai tây, đậu tƣơng … [28].

Việc sử dụng ngày càng nhiều các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học

trong nông nghiệp sẽ ảnh hƣởng tiêu cực đến môi trƣờng, dẫn đến mất cân

bằng trong quần thể vi sinh vật có ích, tạo môi trƣờng bất lợi đối với các sinh

vật có ích phát triển, và tạo điều kiện để nấm bệnh, các loại côn trùng có hại

kháng thuốc hơn, đồng thời cũng tiêu diệt các loại thiên địch có ích. Dƣ lƣợng

thuốc diệt nấm, thuốc trừ sâu hóa học còn lại trên sản phẩm nông nghiệp và

trên đất sẽ làm ô nhiễm nguồn nƣớc ngầm, gây ra các tác hại nghiêm trọng

đối với sức khỏe của ngƣời và vật nuôi. Vì vậy một số nƣớc phát triển, thuốc

diệt nấm có nguồn gốc hóa học bị hạn chế hoặc cấm sử dụng [22].

Hiện nay trên thế giới, việc sử dụng các chế phẩm sinh học thay thế

một phần thuốc hóa học để phòng trừ một số bệnh do vi nấm gây ra đang là

hƣớng chủ yếu. các chế phẩm sinh học diệt nấm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối

kháng để diệt nấm gây hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài cho

ngƣời sản xuất.

Vì vậy mà các nhà khoa học quan tâm đặc biệt tới việc nghiên cứu và

sản xuất các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh, các nghiên cứu đều tập

trung mạnh về hóa sinh, di truyền và bản chất của các hợp chất di vi sinh vật

tạo ra có khả năng hạn chế sự sinh trƣởng và phát triển của các loài vi sinh vật

có hại.

Kumar và cộng sự (2009) đã phân lập đƣợc chủng B.subtilis MTCC

8114 trong một số mẫu đất vƣờn, hoạt tính vòng ức chế nấm khi thử nghiệm

bằng phƣơng pháp cấy chấm điểm là 14-16mm và 22-14mm bằng phƣơng

pháp khuếch tán vòng trên thạch đối với nấm Microsporum fulvum và

10

Trichophyton. Sau khi tối ƣu môi trƣờng nuôi cấy đã tìm ra đƣợc nguồn dinh dƣỡng là dịch chiết bột đậu tƣơng, pH 7,0, nhiệt độ 370C và thời gian lên men

48 giờ là điều kiện thích hợp cho sản xuất kháng sinh của chủng vi khuẩn này.

Phân tích dữ liệu phổ FITR đã xác định hợp chất thuộc nhóm pedtide kháng

nấm, nồng độ ức chế tối thiểu MIC của kháng sinh kháng nấm là 135-145

µg/ml [30].

Bệnh thán thƣ do nấm bệnh colletotrichum gloeosporioides gây ra làm

giảm năng suất và chất lƣợng đến nhiều loại cây trồng nhƣ hồ tiêu, quất, xoài

và nhiều loài cây trồng khác, gây tổn thƣơng nặng nề đến lợi ích thƣơng mại

trên thế giới. Trong quá trình phân lập một số chủng vi khuẩn từ đất, Kim và

cộng sự (2010) đã tìm ra đƣợc chủng B.subtilis CMB32 có tiềm năng trong

việc kiểm soát chủng nấm bệnh C.gloeosporioides, sử dụng phƣơng pháp

khối phổ MALDI-TOF để phân tích, kết quả đã cho thấy chủng B.subtilis

CMB32 có khả năng sinh tổng hợp ra 3 loại peptide kháng nấm: inturin ,

fengycin và surfactin A [29].

Mendizabal và cộng sự (2012) đã tìm ra chủng CPA-8 có khả năng

kiểm soát bệnh thối rễ do nấm bệnh monilinia spp gây ra trên cây đào. Thí

nghiệm ức chế sự tăng trƣởng bằng cách sử dụng hoạt chất từ dịch nuôi cấy tế

bào đƣợc chiết xuất bằng butanol đã cho thấy kết quả ức chế mạnh đối với

nấm M.laxa và M.fructicola. Hoạt chất kháng nấm từ chủng B.subtilis CPA-8

đã đƣợc xác định là fengycin, giống liopeptide và có hoạt tính kháng nấm

mạnh [43].

Yiu-Kowk và cộng sự (2012) đã phân lập đƣợc chủng B.subtilis D1/2 từ

đất canh tác có khả năng ức chế nấm F. graminearum. Hoạt tính kháng nấm

của chủng vi khuẩn này do một loại polypeptide ngoại bào và đã xác định là

fengycin. Ứng dụng chủng vi khuẩn trên trồng ngô và lúa mì để kiểm soát bệnh

thối tai và tàn rụi đầu đã đƣợc đã đƣợc kiểm soát hoàn toàn, trên cây ngô thì

bệnh thối tai đã giảm đi một nửa. Mặc dù chƣa kiểm soát đƣợc triệt để trên cây

11

ngô, nhƣng có thể thấy chủng B.subtilis D1/2 có tiểm năng rất lớn trong việc

kiểm soát bệnh hại cây trồng và sản xuất chế phẩm kháng nấm [61].

Năm 2012 , Malfnovan và cộng sự khi sử dụng phƣơng pháp sắc ký

lỏng khối phổ đã phát hiện tới 8 loại hợp chất polypeptide mạch vòng có hoạt

tính kháng nấm trong dịch chiết ngoại bào của chủng B. subtilis HC8. Dựa

vào thời gian lƣu và khối lƣợng phân tử, đã xác định đƣợc các hợp chất kháng

nấm này chủ yếu thuộc 3 họ kháng sinh lớn đó là iturin, fengycin và surfactin.

Trong đó thì họ kháng sinh fengycin cho kết qủa tác động mạnh nhất đến việc

ức chế sự phát triển của nấm đối kháng. Chủng B. subtilis HC8 đƣợc xác định

là chủng đầu tiên có khả năng sinh tổng hợp ngoại bào cả 3 họ kháng sinh lớn,

đây là chủng vi khuẩn có tiềm năng rất lớn trong kiểm soát dịch bệnh hại cây

trồng. [42].

Tan và cộng sự (2013) đã phân lập đƣợc vi khuẩn B. subtilis B25 từ đất

vùng rễ chuối, thí nghiệm cho thấy chủng B25 có khả năng đối kháng mạnh

mẽ đối với nấm Fusarium. Ngoài ra chúng còn có khả năng ức chế tốt đối với

các nấm corynespora casiicola, Alternaria solani, Botrytis cinerea … Sau khi

soi dƣới kính hiển vi điện tử cho thấy protein kháng nấm của B. subtilis B25

có khả năng ức chế mạnh đối với nấm dẫn đến sợi nấm sƣng lên, biến dạng,

bất thƣờng [58].

Năm 2013, khi quan sát hình thái và phân tích dữ liệu phân tử, bao gồm

cả trình tự gen 16S rDNA và gyraseA (gyrA) các mẫu vi khuẩn đƣợc lấy từ

bùn Gomsohang và Mohang ở đảo Jeju Hàn Quốc, Ji và cộng sự đã phân lập

đƣợc chủng Bacillus amyloliquefaciens CNU114001 có hoạt tính đối kháng

đáng kể đối với các loại nấm gây bệnh. Bằng sắc ký cột silica gel, sắc ký lớp

mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao, đã xác định đƣợc hoạt chất kháng nấm là

iturin. Các hoạt chất bán tinh khiết hạn chế đáng kể sự phát triển của nấm sợi

gây bệnh (Alternaria, Botrytics cinema, Colletotrichum orbiculare, Penicillium

digitatum, Pyricularia grisea và Sclerotinia sclerotiorum) ở 200 độ ppm. Dịch thô

12

của hoạt chất này có khả năng chống thối dƣa chuột trong phòng thí nghiệm,

và cho thấy khả năng chống lại nấm mốc xám ở cà chua, dƣa chuột và bí đỏ

trong điều kiện nhà kính [26].

Năm 2014, Guo và cộng sự khi nghiên cứu vi khuẩn B. subtilis NCD-2

để sản xuất fengycin đã thấy rằng chúng có khả năng đối kháng mạnh mẽ với

nấm Phytopathogenic, và có chức năng nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học

tuyệt đối với các bệnh do nấm ở cây bông. Nghiên cứu của Guo đã chứng

minh rằng fengycin là một loại polipeptide có hoạt tính kháng nấm chính

đƣợc sản xuất bởi B. subtilis NCD-2. Những hợp chất này đóng vai trò quan

trọng trong việc ức chế và kiểm soát bệnh do nấm R. solani gây ra [24].

Nghiên cứu mới đây nhất của Christopher và cộng sự (2015) đã phân

lập đƣợc vi khuẩn B. subtilis OH131.1 là một chất đối kháng của nấm F.

graminearum, một mầm bệnh gây nên bệnh bạc lá lúa mì. Bộ gen của vi

khuẩn B. subtilis OH131.1 đƣợc giải trình tự có hoạt tính trong việc kiểm soát

sinh học [18].

Ngoài ra trên thế giới, đã có nhiều chế phẩm từ các hoạt chất vi sinh vật

đƣợc thƣơng mại hóa. Điển hình là Ballad – một chế phẩm từ chủngB.

pumilus (Stain QST 2808) của hãng AgraQuest, là sản phẩm năm 2005, có thể

sử dụng cho khoai tây, đậu tƣơng, ngũ cốc… Chủng B. pumilus sinh tổng hợp

một chất đƣờng amoni chống nấm mà ngăn sự hình thành các tế bào mới và

làm rối loạn trao đổi chất tế bào, dẫn đến phá hủy tế bào và diệt thể gây bệnh

cây trồng. Ballad cũng tạo ra các rào cản vi khuẩn trên bề mặt lá, ngăn cản thể

gây bệnh nhƣ nấm gây rỉ sắt và mốc sƣơng từ khi hình thành trên thực vật.

Thuốc này có phổ sử dụng rộng. Đƣợc ghi vào danh sách chất kiểm

soát gỉ sắt (rỉ sắt trên cây đậu tƣơng, Châu Á), mốc sƣơng, mốc lông tơ và

bệnh bạc lá.

13

1.4. Tình hình nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ nấm tại Việt Nam

Ở Việt Nam, các nghiên cứu tập trung nhiều vào việc sản xuất các chế

phẩm phòng trừ nấm gây bệnh cây trồng dùng làm thuốc bảo vệ thực vật. Hầu

hết các nghiên cứu đã thực hiện tập trung vào sản xuất các sản phẩm sinh học

chứa các chủng nấm đối kháng (chủ yếu là các chủng Trichoderma) hoặc vi

khuẩn đối kháng (chứa B. subtilis). Các chế phẩm thƣơng mại phần lớn chứa

các chủng nấm đối kháng ở dạng phân bón.

Việc ứng dụng các vi sinh vật đối kháng nấm bệnh cây đã đƣợc thực

hiện rất sớm ở Việt Nam và đạt đƣợc những thành tựu to lớn nhƣ sử dụng vi

sinh vật đối kháng nấm nhƣ một sinh vật chức năng trong sản xuất phân bón

hữu cơ vi sinh, các chế phẩm lên men xốp sử dụng nhóm vi nấm

Trichoderma. Có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm

Trichoderma để phòng trừ nấm bệnh cây trồng [8].

Nghiên cứu các biện pháp sinh học phòng chống nấm bệnh cây đã đƣợc

quan tâm và thực hiện ở một số cơ sở nghiên cứu trong nƣớc trong những

năm vừa qua: Viện Công nghệ sinh học và Viện sinh học nhiệt đới (Viện KH

CNVN), Viện bảo vệ thực vật và Viện Thổ nhƣỡng và nông hóa (Bộ NN

PTNT), Đại học Nông lâm Tp HCM, Đại học Cần thơ.

Các công bố cho thấy, các nhóm vi sinh vật nhƣ Trichoderma [5],

Bacillus [6], Pseudomonas [7], và Serratia [4] đã đƣợc phân lập, tuyển chọn

và đƣợc đánh giá là những tác nhân tiềm tàng cho phát triển các chế phẩm

sinh học để phòng chống nấm bệnh cây.

Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học cùng Bộ

NN&PTNT đã nghên cứu và tạo ra chế phẩm BCF từ 3 chủng vi sinh vật

Bacillus, Burkhodelia và Pseudomonas phân lập từ đất ở Việt Nam. Đƣa ra 3

dạng dịch, bột và tinh sạch để ứng dụng diệt nấm bệnh cây trồng Fusarium và

Rhizoctonia. Trong điều kiện in vivo chế phẩm dạng lỏng 1%, dạng bột 0,1%

14

và dạng tinh sạch là 30 μg/ml đã ức chế đƣợc hơn 80% sự sinh trƣởng và phát

triển của chủng nấm Fusarium và Rhizoctonia. Trong điều kiện nhà lƣới, chế

phẩm BCF dùng ở nồng độ 2 – 2,5% có hiệu quả giảm tỷ lệ bệnh khô vằn,

bệnh héo vàng trên ngô và đậu tƣơng. Chế phẩm đã đƣợc thử nghiệm thành

công trong việc kiểm soát nấm trên cây hồ tiêu tại Bình Phƣớc và Bà Rịa –

Vũng Tàu [3].

Biện pháp sinh học để phòng trừ nấm R. solani bằng cách dùng nấm

đối ức chế Trichoderma viride đã đƣợc nhóm nghiên cứu của Nguyễn Kim

Vân thử nghiệm cho thấy nấm Trichoderma viride có hiệu lực ức chế cao nấm

R. solani trong điều kiện phòng thí nghiệm và thí nghiệm bán đồng ruộng là

giảm mức độ thiệt hại của nấm R. solani gây bệnh thối cải bắp [5].

Có thể sử dụng chế phẩm sinh học nấm đối ức chế Trichoderma viride

để phòng trừ bệnh lở cổ rễ hại cây trồng cạn, hiệu quả phòng trừ bệnh cao

86% trên cây cà chua và 78% trên cây dƣa chuột trong điều kiện thí nghiệm

chậu vại [1].

Năm 2011 Đỗ Thị Tuyên và cộng sự đã tinh sạch đƣợc protein có hoạt

tính kháng nấm từ chủng B. subtilis XL62. Các phân đoạn sau khi tinh sạch

có hoạt tính kháng nấm tƣơng đối mạnh và có khối lƣợng phân tử khoảng 21

kDa trên điện di đồ SDS-PAGE. Protein kháng nấm này có hoạt tính ức chế

mạnh sự sinh trƣởng và phát triển của nấm F. oxysporum và R. solani. Protein

tinh sạch từ chủng B. subtilis XL62 có hoạt tính kháng nấm mạnh đối với

chủng nấm F. oxysporum, hoạt tính kháng nấm này vẫn còn duy trì khi ủ ở 800C, thậm chí là 1000C trong 15 phút [2].

Đặc biệt trong những năm qua, chế phẩm antiforhis có tác dụng phòng

chống bệnh thối rễ, lở cổ rễ cây trồng do nấm F. oxysporum và R. solani có

nguồn gốc từ trong đất đã đƣợc phát triển trên cơ sở sử dụng hỗn hợp các

chủng P. sluorescens, P. cholororaphis và chủng B. pumilus tại phòng Vi sinh

15

vật đất, Viện công nghệ sinh học. Chế phẩm đã đƣợc khảo nghiệm trên diện

hẹp trong trong điều kiện in vitro tại Viện bảo vệ thực vật (Bộ NN  PTNT);

kết quả cho thấy chế phẩm antiforhis cho hiệu quả giảm bệnh gần bằng hoặc

tƣơng đƣơng các hóa chất diệt nấm, tùy theo từng chất. Kết quả khảo nghiệm

trên đồng ruộng cũng cho thấy, việc tƣới chế phẩm antiforhis có tác dụng làm

giảm tỷ lệ cây con và cây trồng bị chết do bệnh thối rễ trên cây ăn quả các

loại, cây cải bắp, cây cà chua, cây ớt ngọt [6].

Trong thời gian qua, tại Phòng Vi sinh vật đất (Viện CNSH), một số

chủng vi khuẩn thuộc nhóm Burkholderia và Chryseomonas đã đƣợc phân lập

từ các mẫu vật khác nhau ở Việt Nam. Thử khả năng đối kháng nấm F.

oxysporum và R. solani của các chủng này đã đƣợc tiến hành. Kết quả cho

thấy, các chủng này có khả năng sinh tổng hợp các chất ngoại bào với hoạt

tính ức chế sinh trƣởng hay nảy mầm của bào tử nấm rất mạnh.

Nhƣ vậy, trên thị trƣờng Việt Nam, các loại sản phẩm sinh học phòng

trừ bệnh nấm R. solani và F. oxysporum chủ yếu là các sản phẩm có chứa

nấm đối kháng. Các nghiên cứu phòng trừ nấm bệnh cây bằng các tác nhân

sinh học đã đƣợc hình thành và phát triển ở Việt Nam tuy nhiên vẫn còn nhiều

hạn chế.

16

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu và hóa chất

2.1.1. Chủng giống

Chủng vi khuẩn B. subtilis AS đƣợc phân lập ở Việt Nam do Phòng

công nghệ sinh học enzyme, Viện công nghệ sinh học cung cấp.

Chủng nấm bệnh F. oxysporum và R. solani từ bộ sƣu tập giống của

phòng bệnh cây, Viện bảo vệ thực vật, Từ Liêm, Hà Nội cung cấp.

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất sử dụng phòng thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết. Các hóa

chất nhƣ: DEAE (Heledelberg, Đức), SDS (Sigma, Mỹ), APS, TEMED, D-

glucose (Merck, Đức), màng lọc minisart (Biotech, Việt Nam), agar (Việt

Nam), cao nấm men, pepton đƣợc mua từ ICN (Mỹ). Một số nguyên liệu

dùng thay thế nguồn carbon và nito nhƣ tinh bột khoai tây đƣợc mua ở thị

trƣờng (Việt Nam).

2.1.3. Các loại đệm và dung dịch

Các loại đệm và dung dịch sử dụng trong thí nghiệm đƣợc pha theo các

bài báo đã đƣợc công bố và nồng độ đƣợc tóm tắt ở bảng 2.1.

17

Bảng 2.1. Thành phần các loại đệm và dung dịch

Dung dịch Thành phần, nồng độ

Dung dịch Bradford stock 100 ml 95% ethanol, 350g serva blue G, 200

ml 88% phosphoric acid

Dung dịch Bradford working 425 ml H20, 15 ml 95% ethanol, 30 ml 88%

phosphoric acid, 30 ml dung dịch bradford

gốc.

Đệm điện di protein 20 mM Tris-HCl, 192 mM glycine; 0,1%

SDS; pH 8,8

Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 Dung dịch A

Đệm 0,5 M Tris-HCl; pH 6,8 Dung dịch B

30%acrylamide; 0,8% bis-acrylamide Dung dịch C

10% SDS Dung dịch D

Dung dịch APS 10% ammonium persulfate

Đệm Potasium phosphate 1M K2HPO4 1 M, KH2PO4 1M, pH 6,8

2.1.4. Môi trường

Thành phần một số môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật sử dụng trong

nghiên cứu đƣợc pha theo bảng 2.2

Bảng 2.2. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật

Môi trƣờng Thành phần (g)

LB lỏng(g/L) 10 peptone; 5cao nấm men, 10 NaCl

LB rắn(g/L) 10 peptone; 5cao nấm men, 10 NaCl, 20 agar

PDA(g/L) 20 khoai tây, đun sôi cách thủy 2 giờ thu dịch chiết; 20 D-

glucose, 20 agar

NYD(g/L) 10 D-glucose, 8 cao thịt, 5 cao nấm men

18

2.1.5. Thiết bị thí nghiệm

Các thiết bị thuộc phòng Công nghệ sinh học enzyme, Viện công nghệ

sinh học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam (Bảng 2.3) đƣợc sử dụng

trong nghiên cứu.

Bảng 2.3. Danh sách các thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng

Thiết bị Hãng sản xuất (nƣớc)

Bể ổn nhiệt VS-1205 Vision (Hàn Quốc)

Box cấy vi sinh vật Clean Bench (TTCG công nghệ) Việt Nam

TCV.02-1

Cân phân tích BL150S Sartorius (Thụy Sỹ)

Hệ thống điện di đứng Biometra (Đức)

Lò vi sóng National

Máy ly tâm lạnh MIKRO22 Hettich (Đức)

Máy nuôi lắc Certomat HK Sartorius (Đức)

Máy quang phổ UV2500 Labomed (Mỹ)

Máy Vortex OSI Rotolab (Đức)

Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật)

Pipet (10 µl, 100 µl, 1000 µl) Eppendorf (Đức)

Sanyo (Nhật)

Tủ ấm MIR-162 Tủ lạnh 40C GR-N45VTV Toshiba (Nhật)

Deawoo (Hàn Quốc)

Tủ lạnh (-20oC) CVF-280 Tủ lạnh (-84oC) MDF-192 Sanyo

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh và thu nhận dịch ngoại bào

Chủng giống vi khuẩn chọn lọc B. subtilis AS đƣợc nuôi trong bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trƣờng LB lỏng, chủng giống đƣợc nuôi ở 300C

19

200 rpm trong 24 giờ. Sau đó chủng giống đƣợc tiếp chuyển sang bình

1000ml chứa 250ml môi trƣờng NYD với tỉ lệ 3-5% (v/v), chủng đƣợc nuôi 300C, 200 rpm, thời gian lên men 5 ngày. Nhƣ vậy, chủng B. subtilis AS đƣợc

nuôi trong môi trƣờng NYD có thành phần nhƣ sau (g/l): 10 D-glucose, 8 cao thịt, 5 cao nấm men, pH 7,0 – 7,5; nhiệt độ 300C.

2.2.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sinh trưởng nấm

Dịch protein sau khi lên men 5 ngày sẽ đƣợc ly tâm để loại bỏ sinh khối

của tế bào tốc độ li tâm 12000 vòng trong vòng 20 phút bỏ tủa thu dịch tiếp

theo tế bào còn sót lại đƣợc loại sạch bằng cách lọc qua màng lọc vi khuẩn

minispore ( 20 µm).

Cách tiến hành:

Mẫu thí nghiệm: Dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn B.subtilis AS sau

khi li tâm loại bỏ tế bào và lọc bằng màng lọc vi khuẩn đƣợc bổ sung vào môi trƣờng PDA ở 500C theo từng nồng độ thử nghiệm. Sau đó đƣợc đổ vào đĩa

petri để ráo mặt thạch, đặt nấm F. oxysporum và R. solani vào giữa đĩa.

Mẫu đối chứng: Làm tƣơng tự nhƣng thay dịch nuôi cấy bằng môi

trƣờng nuôi cấy, đặt nấm F. oxysporum và R. solani vào giữa đĩa.

Sau đó gói đĩa bằng giấy báo đặt đĩa vào tủ ấm 28-300C sau 3 ngày đối

với nấm R. solani và 5 ngày với nấm F. oxysporum đo đƣờng kính vòng nấm

thử nghiệm và nấm đối chứng phát triển trên đĩa thạch, tính khả năng ức chế

theo công thức sau:

I (%) = (SĐC-SST) / SĐC x100

Trong đó:

I là phần trăm ức chế sinh trƣởng nấm

SĐC là diện tích tản nấm trên môi trƣờng PDA không chứa dịch lọc tế bào

SST là diện tích tản nấm trên môi trƣờng PDA chứa dịch lọc tế bào

20

2.2.3. Thử hoạt tính kháng nấm bằng khoanh giấy lọc

Bổ sung 10 ml môi trƣờng PDA có bổ sung 0,1% ampicillin đổ vào đĩa

petri để ráo mặt thạch, đặt nấm thử nghiệm vào giữa đĩa. Sau đó đặt các

khoanh giấy lọc có đƣờng kính 0,5 cm vào đĩa thạch. Tiếp theo hút 20µl protein tinh sạch nhỏ vào các khoanh giấy lọc, đặt đĩa vào tủ nuôi 300C ủ

trong 3 ngày đến 5 ngày kiểm tra, mẫu đối chứng âm là đệm potasium

photphate 20 mM, pH 6,8.

2.2.4. Phương pháp tủa muối amonium sulfate

Cơ sở của phƣơng pháp này là dựa vào sự khác nhau về khả năng kết

tủa của các protein ở một nồng độ muối xác định (tính theo % nồng độ bão

hòa) để loại bỏ bƣớc đầu protein tạp trong dịch protein thô ban đầu. Các loại

muối có thể đƣợc dùng là muối (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 nhƣng muối tốt

nhất là muối (NH4)2SO4 vì nó không làm hại mà còn có tác dụng làm ổn định

(làm bền) hầu hết các loại protein. Hơn nữa chi phí cho loại muối này thấp và phổ biến. Độ hòa tan của nó rất lớn (bão hòa 767 g/l ở 250C).

Dịch protein thô đƣợc tủa muối amonium sulfate ở các nồng độ bão hòa

lần lƣợt là 30% và 70%. Các bƣớc tủa và ly tâm đƣợc thực hiện ở 40C.

Sau khi tủa amonium sulfate 70% ly tâm thu tủa protein, tủa này đƣợc

hòa trong đệm potasium phosphate 20 mM, pH6,8 và đƣợc thẩm tích để loại

muối. Sau khi đã thẩm tích loại muối thì tiếp tục cho lên cột DEAE-cellulose

tinh sạch.

2.2.5. Phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose

Phƣơng pháp này là dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các

protein, hay phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nƣớc hoặc dung dịch

đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion ở đây là DEAE

(diethylaminoethyl) cellulose mang điện tích dƣơng.

21

Trong hỗn hợp protein với dung dịch đệm có pH tƣơng ứng, các protein

sẽ trở nên tích điện. Các protein mang điện tích sẽ bị các nhóm tích điện trái

dấu của chất trao đổi ion kéo lại và bám trên cột sắc ký. Sau đó, dùng dung

dịch đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8 chứa NaCl 1M để đẩy protein ra

khỏi chất trao đổi ion.

Gel DEAE-cellulose đã đƣợc hoạt hóa sẵn đƣợc nhồi vào cột có kích

thƣớc (2,6 x 60) cm, rửa và cân bằng cột trong đệm potasium phosphate 20

mM pH 6,8 có chứa 0,1 M NaCl. Protein sau khi tủa muối đƣợc đƣa lên cột

và đẩy ra bằng đệm potasium phosphate 20 mM; pH 6,8 có chứa 1 M NaCl,

tốc độ dòng chảy 25ml/giờ. Thu 30 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 1,5ml.

Hàm lƣợng protein đƣợc xác định cho mỗi phân đoạn, lựa chọn các phân đoạn

có hàm lƣợng protein cao và xác định hoạt tính kháng nấm. Các phân đoạn có

hoạt tính kháng nấm cao nhất sẽ đƣợc tập trung lại để đƣa lên cột Biogel P100

tinh sạch.

2.2.6. Phương pháp sắc ký lọc gel Biogel P100

Phƣơng pháp lọc gel là một trong những ký thuật sắc ký cột đƣợc dùng

phổ biến trong tách chiết và tinh sạch protein. Cơ sở của phƣơng pháp lọc gel

là dựa sự khác nhau về kích thƣớc, hình dạng phân tử lƣợng của protein có

trong hỗn hợp. Biogel P100 là một polyacrylamide trong đó phân tử của

chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang tạo thành sàng phân tử bởi hệ

thống lỗ lƣới xốp.

Các phân đoạn có hoạt tính kháng nấm mạnh sau khi qua cột DEAE –

celulose có hoạt tính kháng nấm mạnh tiếp tục đƣợc đƣa lên cột Biogel P100.

Cột có kích thƣớc (2,6x60) cm đƣợc cân bằng với đệm 20 mM potasium

phosphate pH 6,8. Điều kiện sắc ký: Tốc độ dòng chảy 25 ml/giờ, thể tích mỗi

phân đoạn 1,5 ml.

22

Quá trình tách chiết và tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm đƣợc

tóm tắt theo sơ đồ hình 2.1

Dịch lên men

Dịch nổi

Thử hoạt tính kháng nấm F. oxyporum và R. solani

Ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút. Dich sau lên men đƣợc lọc lọc qua màng minispore 0,2 µm

Tủa muối amonium sulfate 30%

Li tâm 12000 vòng/15 phút thu dịch

Xác định hàm lƣợng protein

Tủa muối amonium sulfate 70%

Li tâm 12000 vòng/20 phút thu tủa

Tinh sạch qua cột DEAE

Tủa đƣợc hòa vào đệm potasium phophate 20 mM,Xác định hàm lƣợng protein lƣợng Xác định hàm protein; Thử hoạt tính kháng nấm F. oxyporum và R. solani

Rửa cân bằng cột bằng dung dịch đệm potasium phophate 20 mM có chứa 0,1 M NaCl. Đƣa 5 ml dịch lên cột, thu dịch protein bằng đệm trên có chứa 1 M NaCl

Tinh sạch qua cột Biogel P100

lƣợng Xác định hàm protein; Thử hoạt tính kháng nấm F. oxyporum và R. solani

Rửa cân bằng cột bằng dung dịch đệm potasium photphate 20 mM pH 6,8. Đƣa 5 ml dịch lên cột. Dùng đệm potasium photphate 20 mM pH 6,8 để thu 20 phân đoạn protein mỗi phân đoạn 1 ml.

Protein tinh sạch

- Thử hoạt tính kháng nấm F. oxysporum và R. solani - Kiểm tra điện di SDS- PAGE của protein tinh sạch. - Xác định hàm lƣợng protein - Đánh giá tính chất lí hóa của hoạt chất tinh sạch.

Hình 2.1. Quy trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng B. subtilis AS

23

2.2.7. Xác định hàm lượng protein tổng số

Hàm lƣợng protein đƣợc xác định theo phƣơng pháp Bradford (1976)

[15], dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với coomassie Brilliant

Blue sẽ hình thành phức hợp màu xanh có khả năng hấp phụ ánh sáng mạnh

nhất ở bƣớc sóng 595 nm, cƣờng độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong

dung dịch.

Hàm lƣợng protein tổng số đƣợc xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein

0.7

0.6

y = 3.2213x + 0.0275 R² = 0.9919

)

0.5

m n

0.4

0.3

5 9 5 (

D O

0.2

0.1

0

0

0.05

0.15

0.2

0.1 Hàm lƣợng BSA (mg/ml)

từ dung dịch albumin huyết thanh bò 1 mg/ml (Hình 2.3).

Hình 2.2. Đƣờng chuẩn Brardford

2.2.8. Điện di SDS - PAGE

Điện di protein trên gel polyacrylamide 12,5 % theo Laemmli (1970)

[32], Sự phân tách các protein bằng điện di gel polyacrylamide SDS (SDS-

PAGE) không phải dựa vào sự tích điện bên trong của các polipeptide mà

dựa vào khối lƣợng phân tử. Sodium dodecysulfate (SDS) là một chất hoạt

tính bề mặt có điện tích âm (anion), làm biến tính protein bằng cách bao phủ

xung quanh polypeptide chính của phân tử protein. Trong điện di protein,

SDS sẽ cung cấp một mạng lƣới điện tích âm dọc suốt theo chiều dài

polypeptide. Nhƣ vậy với sự có mặt của SDS và một yếu tố khử, các

24

polypeptide trở nên duỗi thẳng và tích điện âm. Khi điện di, dƣới tác dụng của

dòng điện một chiều các phân tử protein tích điện âm sẽ di chuyển đến cực

dƣơng và đƣợc phân tách thành các băng khác nhau theo khối lƣợng của mỗi

phân tử. Thành phần gel điện di đƣợc thể hiện nhƣ (Bảng 2.4).

Bảng 2.4. Thành phần gel cô và gel tách

Gel tách (µl) Gel cô (µl) Thành phần

1940 1180 H2O

Dung dịch A 1500 0

Dung dịch B 0 500

Dung dịch C 2500 300

SDS 10% 60 20

Ammonium persulfate 10% 24 10

TEMED 7 5

Tổng 6031 2015

Quy trình nhuộm bạc:

Bản gel đƣợc rửa trong 100 ml dung dịch 1 (50% (v/v) methanol, 5%

(v/v) acetic acid, 50 µl formaldehyde), lắc trong 20 phút. Sau đó rửa lại trong

100 ml dung dịch 2 (50% (v/v) methanol) trong 10 phút. Tiếp tục rửa trong

100 ml nƣớc cất trong 10 phút. Bản gel ngâm trong 100 ml dung dịch 3

(0,02% Na2S2O3) trong 1 phút. Sau đó rửa bằng 100 ml nƣớc cất trong 1 phút.

Nhuộm bản gel bằng cách lắc trong 50 ml dung dịch 4 (1% AgNO3) trong tối

20 phút. Rửa bằng nƣớc cất trong 1 phút. Cuối cùng thực hiện phản ứng hiện

màu bằng 100 ml dung dịch 5 (2% Na2CO3 + 50µl formaldehyde) đến khi

hiện băng, phản ứng đƣợc dừng bằng dung dịch 6 (5% acid acetic) [13].

25

2.2.9. Đánh giá tính chất lý hóa của protein tinh sạch

2.2.9.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm

Protein kháng nấm sau khi tinh sạch qua cột Biogel P100 đem đi sốc nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau nhƣ: 40oC, 50oC, 60oC, 80oC, trong thời gian

30 phút. Dịch protein sau khi sốc nhiệt đƣợc bổ sung 20 µl vào khoanh giấy

lọc, mẫu đối chứng là 20 µl đệm potasium photphate 20 mM pH 6,8. Các

khoanh giấy đƣợc đặt vào đĩa thạch nuôi cấy các chủng nấm F. oxyporum và

nấm R. solani sau 3- 5 ngày kiểm tra khả năng ức chế sinh trƣởng của nấm.

2.2.9.2. Ảnh hưởng của Proteinase K lên hoạt tính kháng nấm

Dịch protein sau khi tinh sạch đƣợc bổ sung proteinase K vào ở các

nồng độ khác nhau nhƣ: 0,5; 1; 2; 2,5; 4; 5 µg, mẫu đối chứng là 20 µl µM/L

K2HPO4, KH2PO4, pH 6,8. Sau khi đƣợc xử lý với proteinase K thì dịch

protein đƣợc bổ sung 20 µl vào các khoanh giấy lọc đƣợc đặt vào đĩa nuôi cấy chủng nấm F. oxyporum và nấm R. solaniđặt vào tủ 28oC nuôi sau 3- 5 ngày

kiểm tra khả năng ức chế sinh trƣởng của nấm.

2.2.9.3. Khả năng ức chế của protein lên sợi bào tử nấm

- Mẫu thí nghiệm: Cho dịch protein vào ống eppendorf 80 µl thêm 80

µl 0,2% glucose và bổ sung thêm 40 µl nấm F. oxyporum trộn đều trong

ống eppendorf .

- Mẫu đối chứng: làm tƣơng tự nhƣng thay dịch protein bằng đệm

potasium photphate 20 mM pH 6,8.

Sau đó hút 100 l mẫu thí nghiệm và 100 µl mẫu đối chứng cho vào 2 ống eppendorf ủ ở nhiệt độ 28 – 30oC theo dõi quan sát sự nảy mầm của bào

tử nấm trên kính hiển vi điện tử 24 giờ đến 48 giờ.

26

2.2.9.4. Hoạt tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein với nấm

R. solani và F. oxysporum

Protein tinh sạch có khối lƣợng phân tử là 45 kDa đƣợc tập trung lại để

thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với nấm F. oxysporum và R.

solani bằng phƣơng pháp ức chế theo nồng độ bổ sung. Đặt đĩa nấm vào tủ 28oC nuôi 3-5 ngày kiểm tra đo đƣờng kính ức chế sinh trƣởng nấm.

27

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS

Chủng B. subtilis AS đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng NYD và nuôi lắc trong bình tam giác 1000 ml chứa 250 ml môi trƣờng NYD ở điều kiện 37oC,

200 vòng/phút thời gian lên men 5 ngày. Dịch lên men chủng B. subtilis AS

đƣợc li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch nổi, dịch li tâm đƣợc lọc

qua màng lọc minisart 0,20 µm, thu dịch lọc vô khuẩn. Dịch lọc ngoại bào

đƣợc tiến hành thử hoạt tính ức chế nấm F. oxysporum và R. solani theo

phƣơng pháp ức chế theo nồng độ bổ sung.

3.1.1. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào đối với nấm F. oxysporum

Khi đánh giá sự tác động của dịch lọc tế bào với nồng độ khác nhau lên

sự sinh trƣởng và phát triển của nấm F. oxyporum (Hình 3.1 và Bảng 3.1). Trên

môi trƣờng PDA chứa 10%, 20%, 30% và 50% dịch lọc ngoại bào B. subtilis

AS, nấm F. oxysporum bị ức chế phát triển, sợi nấm thay đổi màu so với nồng

độ thử. Cụ thể ở nồng độ 10% dịch lọc tế bào chủng B. subtilis AS có thể bị ức

chế 35% sự sinh trƣởng của nấm F. oxysporum trong thời gian 5 ngày. Tuy

nhiên ở những nồng độ cao hơn, dịch lọc tế bào chủng B. subtilis AS thể hiện

tác động lớn tới hoạt tính ức chế sinh trƣởng nấm. Cụ thể ở nồng độ 20% với

nấm F. oxysporum bị ức chế 67%, ở nồng độ 50% nấm F. oxysporum bị ức chế

đến 93%, sợi nấm mất hình thái thông thƣờng và bị đổ xẹp.

28

Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis AS lên sinh trƣởng của

F. oxysporum

Nồng độ Sinh trƣởng Hoạt tính Hình thái sợi nấm, đặc điểm

dịch lọc (%) nấm (Ø : cm) ức chế (%) phát triển

9 0 Sợi bông màu tím nhạt 0

7,25 ± 0,35 35 ± 6,33 Sợi bông màu tím nhạt 10

5,15 ± 0,21 67 ± 2,70 Sợi bông màu trắng hồng nhạt 20

3,2 ± 0,28 87 ± 2,23 Sợi bông màu trắng hồng nhạt 30

2,4 ± 0,14 93 ± 0,84 Sợi bông tàn lụi 50

Đ/C 10% Đ/C 20%

Đ/C 30% Đ/C 50%

Hình 3.1. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS đối với nấm

F. oxysporum sau 5 ngày.

29

3.1.2. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào đối với nấm R. solani

Đánh giá sự tác động của dịch lọc tế bào với nồng độ khác nhau lên khả

năng sinh trƣởng và phát triển của nấm R. solani (Hình 3.2 và Bảng 3.2), Trên

môi trƣờng PDA chứa 10%, 20%, 30% dịch lọc tế bào chủng B. subtilis AS,

nấm R. solani đã bị ức chế khả năng sinh trƣởng và phát triển. Ở nồng độ

10% sau 2 ngày ức chế 32%. Tuy nhiên ở nồng độ cao hơn, dịch lọc tế bào

của chủng B. subtilis AS thể hiện sự tác động khác biệt khá rõ rệt đến hoạt

tính ức chế sinh trƣởng nấm. Cụ thể ở nồng độ 20% với nấm R. solani đã ức

chế đƣợc 61%. Ở nồng độ 50% nấm R. solani bị ức chế đến 95% và có dấu

hiệu tàn lụi từ ngày thứ 4.

Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis AS lên sinh trƣởng của

nấm R. solani

Nồng độ Sinhtrƣởng Hoạt tính ức Hình thái sợi nấm, đặc

dịch lọc (%) nấm (Ø : cm) chế (%) điểm phát triển

0 9 0 Sợi bông, màu trắng nâu

10 7,4 ± 0,14 32 ± 2,58 Sợi bông, màu trắng nâu

20 5,6 ± 0,21 61 ± 2,96 Sợi bông, màu nâu nhạt

30 4,3 ± 0,21 77 ± 2,28 Sợi bông, màu trắng

50 2,1 ± 0,14 95 ± 0,73 Sợi bông, màu trắng, tàn lụi

30

Đ/C 10% Đ/C 20%

Đ/C 30% Đ/C 50%

Hình 3.2. Hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS đối với

nấm R. solani sau 3 ngày.

Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với một số kết quả nghiên cứu trên

thế giới. Rezuanul và cộng sự (2012) đã nghiên cứu dịch lọc ngoại bào của

chủng B. subtilis C9 có khả năng ức chế sự phát triển của nấm F.oxysporum ở

nồng độ 2 mg/ml đạt 63,8% và ức chế sự phát triển của nấm R.solani đƣợc

32,3% ở nồng độ 2mg/ml [53].

Nghiên cứu mới đây nhất của Ali và cộng sự (2014) khi nghiên cứu về

chủng Bacillus sp. RMB7 cho thấy dịch lọc có khả năng ức chế > 70% sự

sinh trƣởng và phát triển của nấm R. solani [11].

Từ những số liệu thu đƣợc cho thấy chủng B. subtilis AS có tiềm năng

lớn cho nghiên cứu phát triển phòng và chống nấm bệnh cây trồng đối với

nấm F. oxysporum và R. solani .

Từ kết quả trên chúng tôi tiếp tục tinh sạch protein có hoạt tính kháng

nấm bằng cách tủa amonium sulfate 30%; amonium sulfate 70%, tinh sạch qua

31

cột sắc ký trao đổi ion DEAE; sắc ký lọc gel Biogel P100 để nhằm tạo ra

protein có độ tinh sạch cao đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát bệnh hại

cây trồng. Quá trình tinh sạch các hoạt chất kháng nấm từ chủng B. subtilis AS

đƣợc tiến hành dựa theo phƣơng pháp của Li và cộng sự có sự cải tiến [37].

3.2. Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm

3.2.1. Tủa protein bằng muối amonium sulfate

Protein đƣợc tủa bằng muối amonium sulfate ở các nồng độ muối là

30% và 70%. Dịch protein đƣợc tủa muối amonium sulfate bão hòa ở nồng độ

30%. Hòa tan muối từ từ vào dung dịch protein và khuấy nhẹ trong 1 giờ ở 40C. Dịch sau khi tủa muối đƣợc ly tâm 12000 vòng/ 15 phút, thu dịch trong.

Dịch protein thô này đƣợc tiếp tục tủa muối amonium sulfate ở nồng độ 70%, hòa tan muối từ từ vào dịch protein trong khoảng 1 giờ ở 40C, bảo quản ở 40Cqua đêm, ly tâm 12000 vòng/20 phút thu tủa. Tủa thu đƣợc hòa vào

trong đệm potasium phosphate 20 mM pH6,8 và thẩm tích trong vòng 24 giờ

để loại muối amonium sulfate, sau đó dịch protein tiếp tục tinh sạch bằng sắc

ký cột.

3.2.1. Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE – cellulose

Tổng thể tích là 5 ml dịch protein sau khi thẩm tích (hàm lƣợng protein

đạt 2,98 mg/ml) đƣa lên cột sắc ký trao đổi ion DEAE – celulose, sử dụng

đệm potasium photphate 20 mM có chứa 1 NaCl để đẩy protein ra khỏi cột.

Chúng tôi thu đƣợc 30 phân đoạn mỗi phân đoạn 1,5 ml, các phân đoạn này

sẽ đƣợc đo hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp Braford. Kết quả trên sắc ký

đồ cho thấy hàm lƣợng protein sau khi qua cột DEAE – celulose tập trung cao

ở các phân đoạn 7 đến 15 và có một đỉnh cao nhất ở phân đoạn 10 hàm lƣợng

protein đạt đƣợc 2,75 mg/ml (Hình 3.3).

32

3

2.5

) l

m / g m

2

( n

1.5

i e t o r p g n ợ ƣ

1

l

m à H

0.5

0

0

5

10

15

20

25

30

Các phân đoạn tinh sạch

Hình 3.3. Sắc ký đồ các phân đoạn qua cột sắc ký

trao đổi ion DEAE-cellulose

Điện di kiểm tra các phân đoạn protein từ phân đoạn 1 – 15 tƣơng ứng

với hàm lƣợng protein đạt từ 0,06 mg/ml đến 2,75 mg/ml trên điện di SDS-

PAGE (Hình 3.4). Kết quả cho thấy từ phân đoạn 1 đến phân đoạn 6 các băng

protein đều tập trung ở trên 66 kDa (Hình 3.4A). Các phân đoạn từ 7- 11 đều

xuất hiện rất nhiều băng protein đậm và xuất hiện 3 băng protein đậm nhất có

kích thƣớc phân tử đạt tƣơng ứng là 14 kDa,  21 kDa và  45 kDa.Từ phân

đoạn 12- 15 (Hình 3.4B) một số băng protein có kích thƣớc phân tử nhỏ đã

không xuất hiện. Nhƣ vậy chúng tôi sẽ tiếp tục sử dụng các phân đoạn từ 7-15

để tinh sạch thu đƣợc các protein có hoạt tính kháng nấm.

33

kDa

66

45

35

25

14

9 10 11 M 12 13 14 15DN M 1 2 3 4 5 6 7 8 DN

A B

Hình 3.4. Điện di đồ các phân đoạn protein tinh sạch qua cột DEAE – celulose

các phân đoạn protein từ phân đoạn 1 đến phân đoạn 8 (A); các phân đoạn protein

từ phân đoạn 9 đến phân đoạn 15 (B); DN: Dịch protein lên cột DEAE-celulose;

M: marker

Phân đoạn 7-15 tiếp tục đƣợc thử hoạt tính kháng nấm F. oxysporum và

R. solani trên đĩa thạch bằng khoanh giấy lọc. Kết quả trên hình (Hình 3.5)

cho thấy các phân đoạn đều thể hiện hoạt tính kháng nấm, trong khi đó mẫu

đối chứng âm chứa đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8 thì nấm vẫn phát

triển bình thƣờng còn ở các mẫu đối chứng dƣơng và các phân đoạn tính sạch

qua cột DEAE có chứa dịch protein tinh sạch đều có khả năng ức chế sự phát

triển của nấm rất tốt, đặc biệt là có khả năng ức chế mạnh đối với nấm F.

oxysporum.

34

A

B

C D

Hình 3.5. Hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A, D) và R. solani (B, C) của các phân đoạn từ 8 -15. Đ/C (-): đệm potasium phosphate 20 mM pH6,8;

Đ/c (+) dịch lên cột.

35

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số kết quả

nghiên cứu của thế giới. Li và cộng sự (2009) đã tinh sạch protein có hoạt tính

kháng nấm từ chủng B. subtilis B29 sắc ký đƣợc tiến hành trên cột DEAE –

cellulose cột có kích thƣớc 2,5 × 50 cm cân bằng cột bằng potasium

phosphate 20 mM pH 6, các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE thu đƣợc 1 đỉnh

protein cao nhất và 3 đỉnh phụ có hoạt tính kháng nấm [37].

Năm 2013 Tan và cộng sự tiến hành tinh sạch protein từ chủng B.

subtilis B25 trên cột DEAE, các phân đoạn tinh sạch trên sắc ký đồ thu đƣợc

4 đỉnh protein, trong đó đỉnh thứ 3 có hàm lƣợng protein kháng nấm khá cao,

còn các đỉnh còn lại có hàm lƣợng kháng nấm thấp hơn, đỉnh thứ 3 tiếp tục

đƣợc đƣa lên cột Biogel P100 để tinh sạch [58].

Nghiên cứu của Đỗ Thị Tuyên và cộng sự (2011) sau khi tinh sạch

protein từ chủng B. subtilis XL62, protein đƣợc phân tách thành 3 đỉnh rõ rệt

trên sắc ký đồ trao đổi ion DEAE-cellulose các phân đoạn này đƣợc thử hoạt

tính kháng nấm từ đỉnh 1 (phân đoạn 5- phân đoạn 11) đều có hoạt tính

kháng nấm [3].

Từ những số liệu thu đƣợc cho thấy các phân đoạn có hoạt tính kháng

nấm mạnh sẽ đƣợc tiếp tục đƣa lên cột Biogel P100 để tinh sạchcác protein có

hoạt tính kháng nấm.

3.2.2. Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm qua sắc ký lọc gel Biogel P100

Các phân đoạn protein tinh sạch sơ bộ qua cột DEAE từ phân đoạn 7

đến phân đoạn 15 đƣợc tập trung lại có hàm lƣợng protein tổng số đạt 12,46

mg và đƣa lên cột Biogel P100. Sử dụng đệm potasium phosphate 20 mM pH

6,8 thu 10 phân đoạn bằng mỗi phân đoạn 1,5 ml.

Kết quả trên sắc ký đồ các phân đoạn qua cột Biogel P100 (Hình 3.6)

cho thấy thu đƣợc 2 đỉnh tƣơng ứng ở phân đoạn 2 có hàm lƣợng protein đạt

0,93 mg/ml (P1) và phân đoạn 6 có hàm lƣợng protein đạt 0,61 mg/ml (P2).

36

1

) l

P1

0.8

m / g m

(

0.6

0.4

0.2

n i e t o r p g n ợ ƣ l

0

m à H

0

2

4

6

8

10

-0.2

Các phân đoạn tinh sạch

P2

Hình 3.6. Sắc ký đồ các phân đoạn proteintinh sạch có hoạt tính kháng nấm

sau khi qua cột Biogel P100

Các phân đoạn từ 1- 8 đƣợc kiểm tra trên điện di SDS – PAGE và

nhuộm bạc sử dụng protein chuẩn của Fermentas. Protein thu đƣợc khá sạch ở

phân đoạn 1 đến phân đoạn 4 có khối lƣợng phân tử khoảng 45 kDa và các

phân đoạn từ 5 – 8 có khối lƣợng phân tử 14 kDa (Hình 3.7).

kDa kDa

66 66 45 45 45

35 25 35 25

18 14 18 14 14

5 6 7 8 M M 1 2 3 4

Hình 3.7. Điện di đồ các phân đoạn protein có hoạt tính kháng nấm qua cột Biogel

P100, các phân đoạn từ 1 đến phân đoạn 4 có khối lƣợng phân tử 45 kDa còn các

phân đoạn từ 5 đến phân đoạn 8 có khối lƣợng phân tử 14 kDa.

37

Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với một số nghiên cứu trên thế

giới. Liu và cộng sự (2007) đã tách chiết đƣợc một protein bacisubin từ chủng

B. subtilis B-916 có khối lƣợng phân tử 41,9 kDa có hoạt tính kháng nấm trên

hai chủng nấm F. oxysporum và R. solani [39].

Năm 2009 Li và cộng sự đã tách chiết và tinh sạch đƣợc protein kháng

nấm F. oxyporum và nấm R. solanitừ chủng B. subtilis B29 có khối lƣợng

phân tử 42,3 kDa [37].

Nghiên cứu mới đây của Tan và cộng sự (2013) tinh sạch đƣợc chủng

B. subtilis B25 có khả năng kháng nấm F. oxyporum có khối lƣợng phân tử

khoảng 40 kDa [58].

Năm 2011 Đỗ Thị Tuyên và cộng sự đã tinh sạch đƣợc protein có hoạt

tính kháng nấm từ chủng B. subtilis XL62 độ sạch và khối lƣợng phân tử

đƣợc đánh giá trên gel điện di 12,5% polyacrylamide nhuộm bạc sử dụng

thang protein chuẩn (Fermentas) protein thu đƣợc khá sạch có khối lƣợng

phân tử khoảng 21 kDa [3].

38

A

B

Hình 3.8. Các phân đoạn protein tinh sạch có hoạt tính kháng nấm qua cột Biogel

P100, hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A) và nấm R. solani (B). Các phân đoạn

từ phân đoạn 1 đến phân đoạn 8, Đ/C - : đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8;

Đ/C +: protein tinh sạch lên cột.

Dịch protein tinh sạch các phân đoạn từ 1- 8 đƣợc thử hoạt tính kháng

nấm F. oxyporum và R. solani. Đĩa PDA đƣợc bổ sung 0,1% ampicillin, đặt

các khoanh giấy lọc có thấm 20 µl dịch protein tinh sạch ở các phân đoạn khác nhau, ủ 3 – 5 ngày ở 30oC. Các phân đoạn tinh sạch từ 1 - 4 có hoạt tính

kháng nấm mạnh với nấm F. oxysporum và R. solani, đặc biệt đối với nấm F.

oxysporum (Hình 3.8).

39

Các phƣơng pháp tách chiết protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng

B. subtillis AS đều giống các phƣơng pháp tách chiết protein kháng nấm khác

đã công bố [60], [45]. Các phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose

và sắc ký lọc gel Biogel P100 đều đƣợc dùng để tách chiết protein có hoạt

tính kháng nấm [34], [39].

Bảng 3.3. Tóm tắt quá trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng B. subtillis AS

qua các bƣớc tinh sạch

Hoạt tính Hoạt tính Các phân Hiệu suất kháng Protein tổng số (mg) kháng nấm đoạn (%) nấm R. F. oxyporum solani

Dịch

protein 2,980 ± 0,000878 100 + +

thô

DEAE 1,841 ± 0,001317 62 + +

Biogel 1,045 ± 0,000659 35 + + P100

Nhƣ vậy là qua 3 bƣớc tinh sạch bằng tủa amonium sulfate 30- 70%,

cột sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose và cột sắc ký lọc gel Biogel P100 đã

thu đƣợc hai băng protein có khối lƣợng phân tử 14 kDa và 45 kDa có hoạt

tính kháng nấm F. oxysporum khá mạnh.

3.3. Đánh giá tính chất của protein tinh sạch

Tính chất lí hóa của protein sau khi đƣợc tinh sạch cần đƣợc làm sáng

tỏ nhằm cung cấp những số liệu cần thiết làm cơ sở khoa học cho việc điều

chế và sử dụng chúng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng protein tinh

sạch có kích thƣớc phân tử 45 kDa để thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu

ảnh hƣởng của nhiệt độ và proteinase K lên hoạt tính kháng nấm của protein

40

này, và nghiên cứu khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm F.

oxysporum, khả năng ức chế của nồng độ tối thiểu (MIC) của protein tinh

sạch với nấm F. oxysporum và nấm R. solani.

3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Dịch protein tinh sạch của chủng B. subtillis AS đƣợc xử lý với các nhiệt độ khác nhau nhƣ: 40oC; 50oC; 60oC; 80oC trong thời gian 30 phút, sau

đó protein tinh sạch đƣợc bổ sung 20 µl vào các khoanh giấy lọc đặt nấm F.

oxysporum và nấm R. solani vào giữa các khoanh giấy chứa protein thử

nghiệm (Hình 3.9).

A B

Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A)

và nấm R. solani (B), Đ/C (+): mẫu không xử lý nhiệt; Đ/C (-): đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8; 1-4: mẫu xử lý sốc nhiệt 40oC; 50oC; 60oC; 80oC,

trong thời gian 30 phút.

Kết quả cho thấy khi ủ protein ở các điều kiện nhiệt độ từ 40oC; 50oC; 60oC; 80oC trong thời gian từ 30 phút thì protein tinh sạch vẫn còn hoạt tính

kháng nấm với cả hai chủng nấm F. oxysporum và R. solani còn mẫu đối

chứng âm là đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8 thì sợi nấm vẫn phát

41

triển bình thƣờng. Điều đó chứng tỏ nhiệt độ không làm ảnh hƣởng đến hoạt

tính kháng nấm của protein chủng B. subtilis AS.

Kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứu ở trên thế giới cũng

nhƣ nghiên cứu ở Việt nam.Trên thế giới cũng có nhiều công bố về protein

kháng nấm bền nhiệt nhƣ LP-1 tách chiết từ chủng B. subtilis TG26 (Liu et

al., 1999), hay peptid BTL từ chủng Bacillus B_TL2, protein kháng nấm từ chủng này vẫn giữ nguyên 100% hoạt tính sau khi xử lý ở điều kiện 1000C

trong thời gian 15 phút [62].

Một số protein bền nhiệt nhƣ B. subtilis B29I khi ủ ở nhiệt độ 80oC

trong 10 phút vẫn có hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (Li et al., 2009).

Protein kháng nấm từ chủng B.subtilis XL62 cũng có hoạt tính kháng nấm khá mạnh khi ủ ở nhiệt độ 80oC thậm chí 100oC trong 15 phút [3].

3.3.2. Ảnh hưởng của proteinase K

Dịch protein tinh sạch từ chủng B. subtillis AS đƣợc xử lý với proteinase

K, protein tinh sạch đƣợc bổ sung proteinase K với các nồng độ từ 0,5 – 4 µg vào khoanh giấy lọc, đặt vào tủ 30oC sau 3- 5 ngày kiểm tra (Hình 3.10).

Kết quả trên cho thấy những mẫu thử nghiệm khi đƣợc ủ proteinase K

không ảnh hƣởng đến khả năng kháng nấm F. Oxysporum và R. solani của

protein tinh sạch. Cụ thể khi bổ sung 50 µg protein ủ trong proteinase K ở các

nồng độ 0,5 µg; 1µg; 1,5µg; 2 µg; 2,5 µg; 4 µg thì protein vẫn có hoạt tính

kháng nấm khá mạnh đối với nấm F. oxysporum, còn với mẫu đối chứng đệm

potasium phosphate 20 mM pH6,8 thì sợi nấm vẫn phát triển bình thƣờng.

42

A

và nấm R. solani (B). Đ/C (-): đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8; Đ/C (+) : mẫu

không xử lý với proteinase K; 1: proteinase K 0,5µg; 2-7 : mẫu xử lý với proteinase K

ở các nồng độ: 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 4 µg.

B Hình 3.10. Ảnh hƣởng của proteinase K đến hoạt tính kháng nấm F. oxysporum (A)

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh proteinase K (EC 3.4.21.64) là một

serine protease. Proteinase K thƣờng đƣợc dùng phổ biến trong sinh học phân

tử để cắt hoặc thủy phân các phân tử protein. Trong nghiên cứu này

proteinase K đƣợc ủ với các protein tinh sạch ở nồng độ 0,5- 4g/ml. Các số

43

liệu cho thấy proteinase K không ảnh hƣởng đến khả năng ức chế nấm F.

oxysporum và R. solani. Nhƣ vậy các protein có hoạt tính kháng nấm không

bị ảnh hƣởng bởi proteinase K. Có thể nguyên nhân là do các protein có hoạt

tính kháng nấm đã bị thủy phân ra các dạng peptid có hoạt tính kháng nấm

cùng với khối lƣợng phân tử nhỏ.

Chitarra và cộng sự (2003) đã công bố hợp chất có hoạt tính kháng nấm

từ chủng B. subtilis YM 10-20 rất bền nhiệt. Sau khi ủ ở 70C và 100C trong

1 giờ, nấm P. Roqueforti vẫn bị ức chế. Hơn thế nữa hợp chất có hoạt tính

kháng nấm đã đƣợc chứng minh là không bị ức chế bởi các enzyme thủy phân

bao gồm nhƣ các pronase E, proteinase K và chymotrypsin [17].

Nhƣ vậy có thể kết luận protein chủng B. subtilis AS khá bền nhiệt đối

với proteinase K, nó không ảnh hƣởng đến hoạt tính kháng nấm F.

oxysporumvà R. solani của protein tinh sạch.

3.3.3. Khả năng ức chế sợi bào tử nấm

Protein tinh sạch nồng độ 80 µg đƣợc ủ với bào tử sợi nấm F.

oxysporum từ 24 giờ đến 48 giờ, và mẫu đối chứng đệm potasium phosphate

20 mM pH6,8 đƣợc ủ với bào tử nấm sau đó quan sát trên kính hiển vi điện tử

(Hình 3.11).

Kết quả quan sát trên kính hiển vi điện tử (Hình 3.11) cho thấy sợi nấm

đƣợc ủ với đệm potasium phosphate sau 24 giờ và 48 giờ (Hình 3.11 A, B) thì

sợi nấm vẫn phát triển bình thƣờng, còn ở (Hình 3.11 C, D) sau khi ủ 80 µg

protein tinh sạch với sợi bào tử nấm F. oxysporum sau 24 giờ thì sợi nấm bắt

đầu có hiện tƣợng co ngắn lại và đến 48 giờ thì sợi nấm đã bị protein ức chế

làm cho mất khả năng nảy mầm.

44

A B

C D

Hình 3.11. Khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử F. oxysporum của protein tinh

sạch từ chủng B. subtilis AS quan sát trên kính hiển vi quang học. Bào tử nấm F.

oxysporum sau 24 giờ (A) và 48 giờ (B); bào tử nấm đƣợc ủ với 80 µg protein tinh

sạch sau 24 giờ (C) và 48 giờ (D).

Kết qủa này cũng phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới. Theo

Liu và cộng sự năm 2007, bacisubin đƣợc tách chiết từ B. subtilis B-916 ức

chế mạnh sự nảy mầm bào tử của các chủng nấm Alternaria and Botrytis [39].

Năm 2009 Li và cộng sự cũng tìm ra protein có hoạt tính kháng nấm từ

chủng B29I có khả năng ức chế sự nảy mầm sợi bào tử nấm F. oxysporum cụ

thể bào tử nấm đƣợc ủ với 72 mg protein trong thời gian 24 giờ thì sợi bào tử

45

nấm đã bị protein làm cho ức chế, sợi nấm co ngắn lại, còn sợi nấm không ủ

với protein thì phát triển bình thƣờng sợi nấm dài [40].

Tan và cộng sự (2013) cũng nghiên cứu về khả năng ức chế sợi bào tử

nấm, protein từ chủng B.subtilis B25 có khả năng ức chế sợi bào tử của nấm

F. oxysporum làm cho sợi bào tử nấm sƣng lên, biến dạng, bất thƣờng [58].

3.3.4. Hoạt tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein với nấm R.

solani và F. oxysporum

Từ những kết quả thu đƣợc khi tinh sạch protein, chúng tôi tiếp tục

nghiên cứu đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của hoạt chất tinh sạch

thu đƣợc, cũng nhƣ thử nghiệm lại hoạt tính đối kháng với cả hai loại nấm F.

oxysporum và R. solani theo phƣơng pháp ức chế theo nồng độ bổ sung.

Hình 3.12. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch từ chủng

B. subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm F. oxysporum

46

Hình 3.13. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch từ chủng

B. subtilis AS lên hoạt tính kháng nấm nấm R. solani.

Trong nghiên cứu xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein

tinh sạch chúng tôi bổ sung protein ở các nồng độ 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml và

0,9 mg/ml vào các đĩa thạch PDA và xác định hoạt tính ức chế nấm

F.oxysporum và nấm R. solani theo đƣờng tròn đồng tâm sau 3-5 ngày nuôi

cấy (Hình 3.12 và Hình 3. 13).

Đã xác định khả năng ức chế nấm F.oxysporum và nấm R. solani ở

nồng độ protein có hoạt tính kháng nấm đƣợc tách chiết từ chủng B. subtilis

AS là 0,6 mg/ml đến 0,9 mg/ml. Ở nồng độ 0,6 mg/ml, protein có hoạt tính

kháng nấm này đã ức chế đƣợc 85% sự sinh trƣởng và phát triển của nấm R.

solani và 96% sự sinh trƣởng và phát triển của nấm F.oxysporum. Khi nồng

độ hoạt chất tăng lên 0,7 mg/ml thì hoạt chất ức chế đƣợc 89% đối với nấm R.

solani và 97% đối với nấm F.oxysporum. Hoạt tính nồng độ ức chế tối tối

thiểu (MIC) của protein có hoạt tính kháng nấm này là 0,9 mg/ml, ở nồng độ

47

(MIC) này protein đã ức chế 98% và 95% sự sinh trƣởng và phát triển của

nấm F.oxysporum (Hình 3.12) và nấm R. solani (Hình 3.13). Nhƣ vậy các kết

quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với một số tác giả đã công bố.

Nhƣ vậy các kết quả nghiên cứu phù hợp với một số tác giả đã công bố

nhƣ: nồng độ ức chế tối thiểu của phenazine-1-carboxylic acid (PCA) đối với

Sclerotium rolfsii NCIM 1084 là 29 mg/ml [52].

Năm 2009 Li và cộng sự đã nghiên cứu khả năng ức chế nồng độ tối

thiểu(IC50) của protein có hoạt tính kháng nấm B29I có khả năng ức chế sự

sinh trƣởng và phát triển của nấm F.oxysporum và R. solani tƣơng ứng là 45

và 112 µmol/L [37].

Kumar và cộng sự (2009) đã tìm ra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) một

chất kháng sinh có hoạt tính kháng nấm đƣợc tách chiết từ chủng B. subtilis

MTCC-8114 là 135 và 145 µg/ml tƣơng ứng đối với nấm Microsporum

fulvum và Trichophyton [30].

48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1. Dịch lên men của chủng B. subtilis AS với nồng độ 20% đã ức chế

đƣợc hơn 60% sự sinh trƣởng và phát triển của hai chủng nấm F. oxysporum

và R. solani, đặc biệt ở nồng độ 50% đã làm cho hạch của chủng nấm F.

oxysporum mất khả năng nảy mầm.

2. Đã tinh sạch đƣợc protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng B.

subtilis AS có kích thƣớc phân tử là 14 kDa và 45 kDa. Hiệu suất tinh sạch

đạt 62%.

3. Protein tinh sạch có kích thƣớc phân tử 45 kDa từ chủng B. subtilis AS khá bền với nhiệt độ khi đƣợc xử lý ở nhiệt độ 80oC trong 30 phút vẫn

không làm ảnh hƣởng đến khả năng kháng nấm.

4. Proteinase K không ảnh hƣởng đến hoạt tính kháng nấm F.

oxysporum với nồng độ ủ từ 0,5- 4 µg. Protein tinh sạch làm cho sợi bào tử

nấm co ngắn lại và mất khả năng nảy mầm khi bảo tử nấm đƣợc xử lý với

protein ở nồng độ 80 µg/ml trong 24 giờ và 48 giờ.

5. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein tinh sạch là 0,9 mg/ml,

ức chế nấm F. oxysporum và R. solani tƣơng ứng đạt 98% và 95%.

2. Đề nghị

Hoàn thiện quy trình tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm ở quy

mô lên men lớn ứng dụng tạo sản phẩm sinh học có khả năng kháng nấm

phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững.

49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Đỗ Tấn Dũng (2007), Nghiên cứu bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani) hại

một số cây trồng Hà Nội năm 2005 – 2006, Tạp chí Bảo vệ thực vật,

1/2007.

2. Đỗ Thị Tuyên, Lê Đình Quyền, Quyền Đình Thi, Nguyễn Ngọc Dũng

(2011), “Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus

subtilis XL62”, Tạp chí Công Nghệ Sinh Học, 3, tr. 1811- 4989.

3. Lê Thanh Hoàng, Lê Đình Quyền, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi,

Nguyễn Ngọc Dũng, Đoàn Thị Thanh (2012), “Thử nghiệm chế phẩm

BCF phòng trừ một số nấm hại cây trồng trong điều kiện nhà lƣới và đồng

ruộng”. Tạp chí Bảo vệ thực vật, 3, tr. 26-31.

4. Lê Hồng Minh, Phạm Việt Cƣờng, Nguyễn Thị Kim Cúc (2005), Tách

dòng và giải trình tự gen PhlD mã hóa cho 2,4- diacetylphloroglucinol từ

Serratia marcescens kháng Fusarium oxysporum. In: Những vấn đề

nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học, Hội nghị

toàn quốc, tr. 1315 – 1317. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

5. Nguyễn Kim Vân (2003), “Nghiên cứu các chủng nấm Rhizoctonia solani

Kuhn gây hại cải bắp và bƣớc đầu khảo sát biện pháp phòng trừ”, Tạp chí

Bảo vệ thực vật, 192, tr. 18-21.

6. Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Minh Anh (2007), Khả năng phân hủy sợi

nấm và mối quan hệ di truyền từ chủng Bacillus sp. TD67. In: Tuyển tập

Hội thảo Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Nxb

Khoa học và Kỹ thuật.

7. Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Phan Thị Hoài Anh,

Nguyễn Ngọc Dũng (2006), “Nghiên cứu cơ chế kháng nấm Fusarium

oxysporum gây bệnh ở cây trồng của một số chủng vi khuẩn Pseudomonas

huỳnh quang chọn lọc”, Tạp chí Sinh học, 28, tr. 77 – 81.

50

8. Trƣơng Thanh Giản (1995), “Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sản xuất

thuốc trừ sâu bệnh bằng các chế phẩm vi khuẩn và nấm”, Đề tài nghiên cứu.

Viện Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn.

Tài liệu Tiếng Anh

9. Agrios G.N. (2005), “Plant Pathology. 5th Edn”. Elsevier Academic Press.

10. Ali M.I, Asif S., Ahmad A., Jamal A., Jaffri S.A. (2010), “Evaluation of

ipopeptide (susfactin) production by bacillus subtilis”, Biomedica, 26, pp.

34 – 38.

11. Ali S., Hameed S., Imran A., Iqbal M., Lazarovits G. (2014), “Genetic,

physiological and biochemical chracterization of Bacillus sp. train RMB7

exhibiting plant growth promoting and broad spectrum antifungal

activities”, Microb Cell Fact, 13, pp. 144.

12. Babasaki K., Takao T., Shimonishi Y., Kurahashi K. (1985), “Subtilosin

A, a new antibiotic peptide produced by Bacillus subtilis 168: isolation,

structural analysis, and biogenesis”, J Biochem, 98(3), pp. 585-603.

13. Bassam B.J., Caetano-Anolles G., and Gresshoff P.M. (1991), “Fast and

sensitive silver staining of DNA in polyacylamide gels”, Analytical

biochemistry, 196(1), pp. 80 – 83.

14. Benhamou N., Broglie K., Broglie R., chet I. (1993), “Antifungal effect of bean

endochitinase on Rhizoctonia solani: ultrastructural changes and cytochemical

aspect of chitin breadown”, Can j Microbiol, 39(3), pp. 318 – 328.

15. Bradford M.N. (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation

of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye

binding”, Anal Biochem, 72, pp. 248-254.

51

16. Carrillo C., Teruel J.A., Aranda F.J., Ortiz A. (2003), “Molecular

mechanism of membrane premeabilization by the peptide antibiotic

surfactin”, Biochim Biophys Acta, 1611(1-2), pp. 91 – 97.

17. Chitarra G.S., Breeuwer P., Nout M.J., Van Aelst A.C., Rombouts F.M.,

Abeet (2003), “An antifungal compound produced by Bacillus subtilis

YM 10-20 inhibits germination of Penicillium roqueforti conidiospores”,

J Appl Microbiol, 94(2), pp. 159 – 166.

18. Christopher A., David A., Michael J., Alejandro P. (2015), “Genomic

analysis of Bacillus subtilis OH 131.1 and co-culturing with Cryptococcus

flavescens for control of Fusarium head bligh”, Plant Gene, 2, pp. 1 – 9.

19. Christopher A.D., David A.S., Neil PP., Stenven F.V. (2011), “Cyclic

lipopeptide profile of three Bacillus subtilis strains; antagonists of fusarium

head blingt”, The Journal of Microbiology, 49(4), pp. 603 – 609.

20. De Lucca A.J., Jack T.J., Takemoto J., Vinyard B., Peter J., Navarro E.,

Walsh T.J. (1999), “Fungal lethality, binding, and cytotoxicity of

syringomycin-E”, Antimicrob Agents Chemother, 43, pp. 371-373.

21. Elkahoui S., Djébali N., Yaich N., Azaiez S., Hammami, Essid R., Limam

F. (2015), “Antifungal activity of volatile compounds-producing

Pseudomonas P2 strain against Rhizoctonia solani”, World J Microbiol

Biotechnol, 31(1), pp. 175-185.

22. Gerhardson B. (2002), “Biological substitutes for pesticides”, Trends

Biotechnol, 20, pp. 338-343.

23. Ghosh M. (2006), “Antifungal properties of haem peroxidase from Acorus

calamus”, Ann Bot 98(6), pp. 1145-1153.

24. Guo Q., Dong W., Li S., Lu X., Wang P., Zhang X., Wang Y., Ma P.

(2014), “Fengycin produced by Bacillus subtilis NCD-2 plays a major role

52

in biocontrol of cotton seedling damping-off disease”, World J Microbiol

Biotechnol, 29(1), pp. 155-164.

25. Iijima R., Kurata S., Natori S. (1993), “Purification, characterization and

cDNA cloning of an antifungal protein from the hemolymph of

Sarcophaga peregrina (flesh fly)”, J Biol Chem, 268(16), pp. 12055-

12062.

26. Ji S.H., Paul N.C., Deng J.X., Kim Y.S., Yun B.S., Yu S.H. (2013),

“Biocontrol activity of Bacillus amyloliquefaciens CNU114001 against

fungal plant disease”, Mycobiology, 41(4), pp. 234-42.

27. Joshi B.N., Sainani M.N Fau – Bastawade K.B., Bastawade K.B Fau –

Gupta V.S. (1998), “Cysteine protease inhibitor from pearl millet: a new

class of antifungal protein”, World J Microbiol Biotechnol, 11(1), pp.

125-133

28. Kim P.I., Chung K.C. (2004) “Production of an antifungal protein for

control of Colletotrichum lagenarium by Bacillus amyloliquefaciens

MET0908”, FEMS Microbiol Lett, 234(1), pp. 177-183.

29. Kim P.I., Ryu J., Kim Y.H., Chi Y.T. (2010), “Production of

Biosurfactant Lipopeptides Iturin A, Fengycin, and Surfactin A from

Bacillus subtilis CMB32 for Control of Colletotrichum gloeosporioides”,

J Microbiol Biotechnol, 20, pp. 138-145.

30. Kumar A., Saini P., Shrivastava J.N. (2009), “Production of peptide

antifungal antibiotic and biocontrol activity of Bacillus subtilis”, Indian J

Exp Biol, 47(1), pp. 57-62.

31. Kumar A., Saini P., Shrivastava J.N. (2009), “Production of peptide

antifungal antibiotic andbiocontrol activity of Bacillus subtilis”, Indian J

Exp Biol, 47(1), pp. 57-62.

53

32. Laemmli U.K. (1970), “Cleavage of structure proteins during the

assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature, 227, pp. 680-685.

33. Lam S.K., Ng T.B. (2001), “Isolation of a novel thermolabile

heterodimeric ribonuclease with antifungal and antiproliferative activies

from roots of the sanchi ginseng panax notoginseng”, Biochem Biophys

Res commun, 285(2), pp. 419 – 423.

34. Lam Y.W., Wang H.X., Ng T.B. (2000), “A robust cysteine-deficient

chitinase-like antifungal protein from inner shoots of the edible chive

Allium tuberosum”, Biochem Biophys Res Commun, 279(1), pp. 74-80.

35. Latoud C., Peypoux F., Michel G., Genet R., Morgat J. (1986),

“Interactions of antibiotics of the iturin group with human erythrocytes”,

Biochem Biophys Acta, 35, pp. 526-535.

36. Lee C., Kim S., Hyun B. (1994), “Cepacidine A, a novel antifungal

antibiotic produced by Pseudomonas cepacia. I. Taxonomy, production,

isolation, and biological actity”, J Antibiot, 47, pp. 1402 -1405.

37. Li J., Yang Q., Zhao L., Zhang S., Wang Y., Zhao X. (2009), “Purification

and charracterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis

strain B29”, Journal of Zhejiang University Science B, 10(4), pp. 264-272.

38. Li L., Ma M., Huang R., Qu Q., Li G., Zhang K., Lu K., Niu X., Luo J. (2012),

“Induction of chlamydospore formation in fusarium by cyckic lipopeptide

antibiotics from bacillus subtilis C2”, J Chem Ecol, 38(8), pp. 966 – 974.

39. Liu Y., Chen Z., Ng T.B., Zhang J., Zhou M., Song F., Lu F., Liu Y.

(2007), “Bacisubin, an antifungal protein with ribonuclease nd

hemagglutinating activities from Bacillus subtilis strain B-916”, Peptides,

28(3), pp. 553-559.

54

40. Liu Y., Xu Q., Chen Z. (1999), “Purification and characterization of

antifugal peptide LP-1”, Acta microbiologica Sinnica, 39(5), pp. 553 – 559.

41. Loeffler W., Tschen J.S.M., Vanittanakom N., Kulger M., Knorpp E.,

Hsieh T.F., Wu T.G. (1986), “Antifungal effects of bacilysin and

fengycin from bacillus subtilis F29-3. A comparison with activities of

other bacillus antibiotics”, J Phytopathol, 115(3), pp. 204 – 213

42. Malfanova N., Franzil L., Lugtenberg B., Chebotar V., Ongena M. (2012),

“Cyclic lipopeptide profile of the plant-beneficial endophytic bacterium

Bacillus subtilis HC8”, Arch Microbiol, 191(11), pp. 839-899,.

43. Mendizabal V.Y., Zeriouh H., Vinas I., Torres R., Usall J., Vicente A.,

Garcia A.P., Teixido N. (2012), “Biological control of peach brown rot

(Monilinia spp.) by bacillus subtilis CPA -8 is based on production of

fengycin-like lipopeptides”, Eur J Plant Pathol, 132, pp. 609 – 619.

44. Moyne A.L., Cleveland T.E., Tuzun S. (2004), “Molecular

characterization and analysis of operon encoding the antifungal

lipopeptide bacillomycin D”, FEMS, Microbiol Lett, 234(1), pp. 43 – 49.

45. Ngai P.H.K., Zhao Z., Ng T.B. (2005), “Agrocybin,an antifungal peptide from

the edible mushroom Agrocybe cylindrecea”, Peptides, 26(2), pp. 191 – 314.

46. Ongena M., Jacques P. (2008), “Bacillus lipopeptides: versatile weapons

for plant disease biocontrol”, Trends in Microbiology, 16, pp. 115-125.

47. Ongena M., Jacques P., Touré Y., Destain J., Jabrane A., Thonart P.

(2005), “Involvement of fengycin-type lipopeptides in the multifaceted

biocontrol potential of Bacillus subtilis”, Applied Microbiology and

Biotechnology, 69, pp. 29-38.

48. Paik S.H., Chakicherla A., Hansen J.N. (1998), “Identification and

characterization of the structural and transporter genes for, and the chemical

55

and biological properties of, sublancin 168, anovel lantibiotic produced by

Bacillus subtilis 168”, J Biol Chem, 273(36), pp. 23134-23142.

49. Peypoux F., Beson F., Michel G. (1980), “Characterization of a new

antibiotic of iturin group bacilloycin D”, J Antibiot, 33(10), pp. 1146 – 1149.

50. Peypoux F., Pommier MT., Marion D., Ptak M., Das B.C., Michel G.

(1986), “Revised structure of mycosubtilin, a lipidolipid antibiotic from B.

subtilis”, J Antibiot, 39(5), pp. 636 – 641.

51. Peypoux F., Pommier M.T., Marion D., Ptak M., Das BC., Michel G.

(1986), “Revised structure of mycosubtilin, a lipidolipid antibiotic from

B. subtilis”, J Antibiot, 39(5), pp. 636 – 641.

52. Ran MR., Sarode P.D., Chaudhari B.L., Chincholkar S.B. (2007),

“Detection, isolation and identification of phenazine-1-carboxylic acid

produced by biocontrol strains of pseudomonas aeruginosa”, Jscien Indus

Res, 66, pp. 627-631.

53. Rezuanul Islam, Yong Tae Jeong, Yong Se Lee, and Chi Hyun Song

(2012), “Isolation and Identification of Antifungal Compounds

from Bacillus subtilis C9 Inhibiting the Growth of Plant Pathogenic

Fungi”, Mycobiology, 40(1), pp. 59-66.

54. Sarangi N.P., AthukoralamW.G., Dilantha F., Khalid Y.R. (2009),

“Identification of antifungal antibiotics of Bacillus species isolated from

different microhabitats using polymerase chain reaction and MALDI-TOF

mass spectrometry”, Can J Microbiol, 55, pp. 1021-1032.

55. Seger A., bachman R.C., Ballio A., Bossa F., Grgurina I., Lacobellis N.S.,

Marino G., Pucci P., Simmaco M., Takemoto J.Y. (1989), “The struc ture

of syringomcins A1, E, and G”, FEBS Lett, 255, pp. 27 – 31.

56

56. Sengupta S., Banerjee A.B., Bose S.K. (1971), “γ-Glutamyl and D-or L-

peptide linkages in mycobacillin, a cyclic peptide antibiotic”, Biochem J,

121, pp. 839 – 846.

57. Stein T. (2005), “Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and

specific functions”, Mol Microbiol, 56(4), 845 – 857.

58. Tan Z., Lin B., Zhang R. (2013) “A novel antifungal protein of Bacillus

subtilis B25”, Springerplus, 2, pp. 543.

59. Tenorio S., Tinoco R., Vazquez-Duhalt R. (2013) “Identification of volatile

comprounds produced by the bacterium Bukholderia tropica that inhibit the

growth of fungal pathogens”, Bioengineered, 4(4), pp. 236-243.

60. Wang H., Ng T.B. (2002), “Isolation of cicadin, a novel and potent

antifungal peptide from juvenile cicadas”, Peptides, 23(1), pp. 7 – 11.

61. Yiu-Kwok C., Marc E.S., Lana M.R., Terry C., Wayne A.M., Charles S.

(2012), “Identification of lipopeptide antibiotics of a bacillus subtilis

isolate and their control of Fusarium graminearum dises in maize and

wheat”, Bio Control, 54(3), 567 – 574.

62. Zhang B., Xie C., Yang X. (2008) “Anovel small antifungal peptide from

Bacillusstrain B-TL2 isolated from tobacco stems”, Peptides, 29(3), pp. 350-

355.

63. Zuber P., Nakano M.M., Mahariel M.A. (1993), “Petide antibiotics. In

Bacillus subtilis and other gram – positive bacteria”, American Society of

Microbiology, pp. 897 – 916.

PHỤ LỤC

Bảng P1. Bảng đo hàm lƣợng protein qua cột DEAE – celulose

OD 1 OD 2 OD TB mg/ml Phân đoạn Hàm lƣợng OD2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

0,045 0,047 0,048 0,054 0,059 0,062 0,067 0,126 0,735 0,912 0,855 0,738 0,512 0,102 0,093 0,085 0,085 0,074 0,073 0,071 0,069 0,066 0,065 0,057 0,053 0,048 0,045 0,038 0,031 0,028

0,047 0,048 0,050 0,052 0,059 0,060 0,065 0,289 0,806 0,915 0,841 0,731 0,508 0,121 0,102 0,086 0,085 0,073 0,072 0,071 0,067 0,066 0,064 0,053 0,054 0,046 0,044 0,032 0,029 0,029

0,046 0,048 0,049 0,053 0,059 0,061 0,066 0,208 0,771 0,914 0,848 0,735 0,510 0,112 0,098 0,086 0,085 0,074 0,073 0,071 0,068 0,066 0,065 0,055 0,054 0,047 0,045 0,035 0,030 0,029

Hàm lƣợng OD1 0,005588 0,006209 0,00652 0,008382 0,009935 0,010866 0,012419 0,030736 0,219808 0,274759 0,257063 0,220739 0,150574 0,023285 0,020491 0,018007 0,018007 0,014592 0,014281 0,01366 0,013039 0,012108 0,011798 0,009314 0,008072 0,00652 0,005588 0,003415 0,001242 0,00031 Hàm lƣợng ODTB 0,006209 0,005899 0,0590 0,006364 0,0636 0,00652 0,007141 0,0683 0,00683 0,007762 0,008072 0,0807 0,009935 0,009935 0,0993 0,010245 0,010556 0,1056 0,011798 0,012108 0,1211 0,081341 0,056038 0,5604 0,24185 0,230829 2,3083 0,275691 0,275225 2,7523 0,252717 2,5489 0,25489 0,218566 0,219652 2,1965 0,149333 0,149953 1,4995 0,029183 0,026234 0,2623 0,023285 0,021888 0,2189 0,018317 0,018162 0,1816 0,018007 0,018007 0,1801 0,014281 0,014437 0,1444 0,013971 0,014126 0,1413 0,01366 0,1366 0,01366 0,012419 0,012729 0,1273 0,012108 0,012108 0,1211 0,011487 0,011642 0,1164 0,008072 0,008693 0,0869 0,008382 0,008227 0,0823 0,005899 0,006209 0,0621 0,005278 0,005433 0,0543 0,001552 0,002484 0,0248 0,000621 0,000931 0,0093 0,000621 0,000466 0,0047

Bảng P2. Bảng đo hàm lƣợng protein qua cột Biogel P100

Hàm Hàm Hàm Phân OD 1 OD 2 ODTB lƣợng lƣợng lƣợng mg/ml đoạn OD1 OD2 OD TB

1 0,365 0,0361 0,20055 0,104936 0,002825 0,054 0,5388

2 0,306 0,345 0,3255 0,086619 0,098727 0,093 0,9267

3 0,296 0,287 0,2915 0,083514 0,08072 0,082 0,8212

4 0,222 0,178 0,2 0,06054 0,04688 0,054 0,5371

5 0,195 0,184 0,1895 0,052158 0,048743 0,050 0,5045

6 0,223 0,221 0,222 0,060851 0,06023 0,061 0,6054

7 0,143 0,131 0,137 0,036014 0,032288 0,034 0,3415

8 0,112 0,106 0,109 0,026389 0,024527 0,025 0,2546

9 0,033 0,025 0,029 0,001863 -0,00062 0,001 0,0062

10 0,022 0,023 0,0225 -0,00155 -0,00124 -0,001 -0,0140

Bảng P3. Khả năng nồng độ ức chế tối thiểu của chủng B. subtilis AS lên

hoạt tính kháng nấm R. solani

nấm TN R. solani

mẫu TN d0 (cm) d1 (cm) % ức chế

ĐC 9 4,5 0

600 3,5 1,75 84

700 3 1,5 89

800 2 1 95

Bảng P4. Khả năng nồng độ ức chế tối thiểu của chủng B. subtilis AS lên

hoạt tính kháng nấm F. oxysporum

nấm TN F.oxysporum

mẫu TN d0 (cm) d1 (cm) % ức chế

ĐC 9 4,5 0

600 1,8 0,9 96

700 1,6 0,8 97

800 1,3 0,65 98