Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống CYP264B1 để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-------------------

TRẦN THỊ MAI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI

TÁI TỔ HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA

MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-------------------

TRẦN THỊ MAI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI TÁI TỔ

HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA

MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÝ THỊ BÍCH THỦY

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dƣới đây là do tôi và nhóm

cộng sự nghiên cứu tại phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học –

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ tháng 5 năm

2014 đến tháng 5 năm 2015.

Thái Nguyên, ngày…. tháng …..năm 201…

Học viên

Trần Thị Mai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Lý

Thị Bích Thủy – Nghiên cứu viên phòng Sinh hóa thực vật – Viên Công nghệ sinh

học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã định hƣớng nghiên cứu,

hƣớng dẫn và tạo điều kiện về kinh phí, hóa chất và thiết bị trong suốt thời gian tôi

thực hiện luận văn tại phòng.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN. Đoàn Hữu Thanh và các cô chú, anh

chị cán bộ phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm

Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và đóng góp

nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy cô giáo

trong nhà trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, các thầy cô trong Viện

Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều

kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập.

Tôi cũng xin cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia

(NAFOSTED) đã cung cấp kinh phí để chúng tôi thực hiện nghiên cứu này trong đề

tài mã số 106-NN.02-2013.57.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè những

ngƣời đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và

thực hiện luận văn này.

Bằng tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày…. tháng …..năm 201…

Học viên

Trần Thị Mai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

CÁC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Giải thích

µg Micro gram

µM Micromol

µl Microlit

AdR Adrenodoxin reductase

Adx Adrenodoxin

APS Amonium persulphate

bp Base pair

CYP Cytochrome P450

CPR Cytochrcome P450 reductase

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

FAD Flavin adenin dinucleotid

Fdx Ferredoxin

FdR Ferredoxin reductase

Fldx Flavodoxin

FMN Flavin mononucleotide

GCMS Gas chromatography mass spectometry

HPLC High pressure liquid chromatography

IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside

kDa Kilo dalton

KppG Kali phosphate glycerol

LB Lysogeny broth

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

NMR Nuclear Magnetic Resonance

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

PCB Polychlorinate biphenyl

PCR Polymerase chain reaction

SDS – PAGE Sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide

gel electrophoresis

TB Terrific Broth

TLC Thin layer chromatography

v/p Vòng/phút

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................ i

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... II

MỤC LỤC ..................................................................................................................... V

DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ VII

DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... IX

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3

1.1 Cytochrome P450 ........................................................................................... 3

1.1.1 Định nghĩa và phân loại ...................................................................... 3

1.1.2 Cấu trúc của cytochrome P450 ........................................................... 5

1.1.3. Cơ chế xúc tác của cytochrome P450 ............................................... 8

1.1.4 Ứng dụng của cytochrome P450 ........................................................ 8

1.2 Nghiên cứu về CYP264B1 ............................................................................. 10

1.3 Hợp chất sesquiterpene .................................................................................. 13

1.3.1 Định nghĩa và nguồn gốc .................................................................... 13

1.3.2 Phân loại sesquiterpene ...................................................................... 13

1.3.3 Vai trò và ứng dụng của sesquiterpene .............................................. 15

1.4 Hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cytochrome P450 ...... 16

1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa sesquiterpene

trên thế giới và ở Việt Nam ........................................................................... 19

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 20

2. 1 Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 20

2.1.1 Vật liệu ............................................................................................... 20

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm ............................................................................. 21

2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 22

2.1.4 Dung dịch và đệm .............................................................................. 22

2.1.5 Môi trƣờng .......................................................................................... 23

2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 24

2.2.1 Nuôi cấy E.coli ................................................................................... 24

2.2.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli bằng phƣơng pháp sốc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nhiệt .................................................................................................. 24

2.2.3 Kiểm tra sự có mặt của gene CYP264B1, AdR và Adx .................... 25

2.2.4 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene ...................................................... 27

2.2.5. Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone ....................................... 30

2.2.6 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ƣu ............................. 30

2.2.7 Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene ....................................... 32

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 34

3.1 Nhân dòng plasmid pETC4AA và kiểm tra sự có mặt của gene mã hóa

CYP264B1, AdR và Adx............................................................................... 34

3.2 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene .................................................................. 35

3.2.1 Khả năng biểu hiện gene CYP264B1 ................................................. 35

3.2.2 Khả năng biểu hiện của Adx .............................................................. 36

3.3 Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone của hệ xúc tác tế bào

C43DE3/CYP264B1-AdR-Adx .................................................................... 38

3.4 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ƣu ......................................... 39

3.4.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng lên khả năng chuyển hóa cơ chất .. 39

3.4.2 Ảnh hƣởng của mật độ tế bào lên khả năng chuyển hóa cơ chất ....... 41

3.4.3 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng chuyển hóa cơ chất ............... 42

3.4.4 Ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến khả năng chuyển hóa cơ chất ............ 44

3.4.5 Lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp để chuyển hóa .......................... 45

3.5 Sử dụng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA để chuyển hóa một số hợp chất

sesquiterpene ................................................................................................. 47

3.5.1 Kết quả chuyển hóa longipinene ........................................................ 48

3.5.2 Kết quả chuyển hóa isolongifolene .................................................... 50

3.5.3 Tinh sạch và nhận dạng sản phẩm chuyển hóa .................................. 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................................ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 55

PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 60

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên hình Nội dung Trang

1.1 Cách gọi tên enzyme P450 3

Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử của hệ thống cytochrome 5

P450 1.2

7 1.3 Cấu trúc không gian của Cytochrome P450cam

Cấu tạo nhân heme của enzyme cytochrome P450 8 1.4

Sắp xếp của gene mã hóa CYP264B1 và terpene cyclase 10

1.5 GeoA trên cụm 2 gene của myxobacterium Sorangium

cellulosum So ce56

Cấu trúc của nhóm sắt-lƣu huỳnh 11 1.6

Cấu trúc nhóm FAD 12 1.7

Một số sesquiterpene phổ biến 13 1.8

Một số Sesquiterpene mạch thẳng 14 1.9

1.10 Một số sequiterpene mạch vòng đơn 14

1.11 Một số sesquiterpene đa vòng 15

Plasmid pET C4AA 20 2.1

Sơ đồ nghiên cứu đề tài 24 2.2

Kết quả điện di sản phẩm PCR colony 34 3.1

Cấu trúc đa gene trên vector pETC4AA 35 3.2

Phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng 400-500 nm của dịch 36

chiết tế bào C43DE3/pETC4AA sau 24 giờ cảm ứng 3.3

Kết quả điện di protein ngoại bào 37 3.4

Phân tích khả năng biểu hiện Adx với kháng thể đặc hiệu 38

3.5 bằng kỹ thuật Western blot.

Sắc ký đồ HPLC phân tích kết quả chuyển hóa nootkatone 39

bằng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA 3.6

Chuyển hóa glycerol bởi tế bào vi sinh vật 43 3.7

Cấu trúc của longipinene và isolongifolene 47 3.8

Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa longipinene 49 3.9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3.10 Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa isolongifolene 50

Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa longipinene (a) và cấu 51

3.11 trúc dự đoán bởi GCMS (b)

Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa isolongifolene (a) và cấu 52

3.12 trúc dự đoán bởi GCMS (b)

3.13 Cấu trúc phân tử của 15-hydroxy longipinene 52

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng Nội dung Trang

Danh sách thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm

2.1 21

Danh sách các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm

2.2 22

Danh sách các dung dịch và đệm chính sử dụng trong thí nghiệm

Danh sách các môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm

2.3 2.4 23

2.5 26 Thành phần phản ứng PCR

2.6 26 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Thành phần gel co và gel tách

2.7 29

2.8 31 Bố trí thí nghiệm xác định môi trƣờng tối ƣu

40 Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả 3.1 năng chuyển hóa cơ chất

Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ tế bào đến khả năng 42 3.2 chuyển hóa cơ chất

Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng 44 3.3 chuyển hóa cơ chất

Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến khả năng 45 3.4 chuyển hóa cơ chất

3.5 Kết quả lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp để chuyển hóa 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Sesquiterpene là nhóm hợp chất terpene phổ biến ở thực vật, có công thức

phân tử là C15H24. Các dẫn xuất oxy hóa của chúng thƣờng có hoạt tính sinh dƣợc

học, tính chất hƣơng liệu hoặc là chất trung gian để tổng hợp các hợp chất có giá trị

[11]. Tuy nhiên, trong tự nhiên các dẫn xuất oxy hóa của sesquiterpene thƣờng tồn

tại với hàm lƣợng rất nhỏ so với tiền chất sesquiterpene của chúng. Việt Nam là một

quốc gia có hệ thực vật phong phú và đa dạng nên việc khai thác nguồn

sesquiterpenes từ cây cỏ trong nƣớc có ý nghĩa rất thiết thực.

Để tạo ra những dẫn xuất oxy hóa có giá trị, phản ứng oxy hóa chọn lọc bằng

con đƣờng hóa học thƣờng đòi hỏi điều kiện phản ứng khắc nghiệt, chi phí cao và

tạo ra nhiều chất thải độc hại ảnh hƣởng đến môi trƣờng. Ngƣợc lại, các chất xúc

tác sinh học, đặc biệt là enzyme cytochrome P450 (CYP/P450) có thể thực hiện

phản ứng này ở điều kiện nhẹ nhàng [47]. Tuy nhiên, để thực hiện chức năng xúc

tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông

qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện tử,

gọi là các redox partner [13]. Để khắc phục điều này, xu hƣớng nghiên cứu gần đây

về P450 là tạo ra hệ xúc tác tế bào từ vi sinh vật tái tổ hợp mang đồng thời gene mã

hóa P450 và các redox partner của nó. Giải pháp này có lợi thế là có thể tận dụng

nguồn cofactor nội sinh của tế bào chủ, các enzyme thực hiện chức năng chuyển

hóa cơ chất trong môi trƣờng tự nhiên nên bền vững và không đòi hỏi quá trình tinh

sạch tốn k m.

Trong nghiên cứu trƣớc, CYP264B1 - một enzyme cytochrome P450 có nguồn

gốc từ vi khuẩn myxobacteria Sorangium cellulosum Soce56 đã đƣợc phát hiện có

khả năng chuyển hóa nhiều hợp chất sesquiterpenes. Hệ thống vận chuyển điện tử

cho enzyme này cũng đã đƣợc xác định, bao gồm NADPH và 2 protein vận chuyển

điện tử là AdR (Adrenodoxin reductase) và Adx (Adrenodoxin). Đặc biệt,

CYP264B1 có khả năng hydroxyl hoá chọn lọc một số hợp chất (nootkatone và / -

ionone) ở vị trí mà cho đến nay rất khó thực hiện đƣợc bởi các quá trình chuyển hóa

sinh học khác. Các dẫn xuất này đều có tính chất thú vị hơn so với các chất ban đầu

nhƣ tăng hoạt tính kìm hãm sự phát triển của một số dòng tế bào ung thƣ (dẫn xuất

của nootkatone), hay có thể sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp carotenoids (dẫn

xuất của / -ionone) [26]. Vì vậy, CYP264B1 có tiềm năng rất lớn trong việc

chuyển hóa các hợp chất sesquiterpene thành các dẫn xuất có đặc tính sinh học mới.

Nhằm mục đích xây dựng hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp để chuyển hóa

các hợp chất sesquiterpene, nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh hóa thực vật - Viện

Công nghệ sinh học đã thiết kế vector tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho CYP264B1

và 2 redox partner của nó, đƣợc điều khiển bởi promoter T7. Trên cơ sở đó, chúng

tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng h c c c i i h

ên h h ng ch n h h ch i n

2. Mục tiêu của đề tài

- Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống

CYP264B1.

- Ứng dụng hệ xúc tác này để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene.

3. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu sử dụng h xúc tác t chuy n h cơ ch t

+ Nhân dòng plasmid và kiểm tra sự có mặt của gene bằng kỹ thuật PCR

colony và giải trình tự gene.

+ Kiểm tra khả năng biểu hiện gene bằng phƣơng pháp đo nồng độ

CYP264B1 và kiểm tra khả năng biểu hiện Adx bằng phƣơng pháp western blot.

+ Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone bằng phƣơng pháp HPLC.

+ Tối ƣu điều kiện chuyển hóa nootkatone.

- Tách chi t và nhận dạng sản phẩm chuy n hóa

+ Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene và phân tích sản phẩm chuyển

hóa bằng kỹ thuật GCMS.

+ Tinh sạch sản phẩm chuyển hóa bằng sắc ký cột selicagel.

+ Nhận dạng cấu trúc sản phẩm bằng kỹ thuật NMR.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cytochrome P450

1.1.1 Định nghĩ v hân ại

* Định nghĩ

Cytochrome P450 (thƣờng viết tắt là CYP hay P450) thuộc họ enzyme

monooxygenease có nhóm heme - thiolate trong trung tâm hoạt động, hấp thụ bƣớc

sóng cực đại rất điển hình ở 450 nm khi chúng ở trạng thái khử và tạo phức hợp với

CO (cacbon monooxit) [13].

P450 có mặt trong hầu hết các sinh vật, từ eukaryote đến prokaryote, thậm chí

cả ở virus [20]. P450 xúc tác phản ứng oxy hóa khử nhiều loại hợp chất nội sinh và

ngoại sinh. Số lƣợng P450 cao nhất ở thực vật, ở ngƣời có 57 enzyme P450 [13].

E.coli không có enzyme P450 nào.

Tên gọi của các enzyme cytochrome P450 đƣợc quy định bởi chữ CYP, theo

sau nó là một số thứ tự Ả Rập chỉ họ gen, tiếp đó là một chữ cái viết hoa chỉ phân

họ và một số Ả Rập chỉ một gen riêng biệt. Ví dụ: CYP106A2, CYP264B1,

CYP260A1.

Hình 1.1. Cách gọi tên enzyme P450

* Phân loại

Hiện nay đã có hơn 11000 P450 khác nhau đã đƣợc tách dòng từ động vật,

thực vật, vi nấm, vi khuẩn và những động vật bậc cao khác [33].

Để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn

điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc

một vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner. Do P450 rất đa dạng

trong tự nhiên nên các redox partner của chúng cũng rất phong phú.

Dựa vào các kiểu redox protein tham gia vào chu i vận chuyển điện tử,

Hannemann và cộng sự đã phân loại P450 thành 10 nhóm khác nhau.

- Nhóm 1: bao gồm hầu hết hệ thống P450 ở vi khuẩn và ở ty thể của tế bào

nhân chuẩn. Hệ thống thuộc nhóm này gồm 3 protein riêng biệt: một enzyme

reductase (FdR) chứa nhóm ngoại FAD có vai trò chuyển điện tử từ NAD(P)H cho

thành viên thứ 2 là một ferredoxin (Fdx) chứa cụm sắt - lƣu huỳnh, đến lƣợt

ferredoxin lại chuyển điện tử đến enzyme cytochrome P450 để enzyme này thực

hiện chức năng xúc tác.

- Nhóm 2: bao gồm một enzyme cytochrome P450 và một cytochrome P450

reductase (CPR) phụ thuộc NADPH của mạng lƣới nội chất. CPR là một enzyme

chứa 2 nhóm ngoại FAD và FMN có vai trò chuyển điện tử từ NADPH tới P450.

- Nhóm 3: mới chỉ tìm thấy duy nhất ở vi khuẩn Citrobacter braakii. Hệ thống

này bao gồm một Flavodoxin (Fldx) chứa nhóm ngoại FMN và một enzyme

cytochrome cytochrome mới là P450cin.

- Nhóm 4: đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn cổ Sulfolobus solfataricus, bao gồm một

Fdx và một enzyme có tên gọi 2-oxoacid ferredoxin oxidoreductase.

- Nhóm 5: bao gồm một enzyme reductase phụ thuộc NAD(P)H và một enzyme

cytochrome P450 dung hợp với ferredoxin (Fdx-P450).

- Nhóm 6: bao gồm một enzyme flavoprotein reductase phụ thuộc NAD(P)H và

một protein dung hợp flavodoxin-P450 (Fldx-P450).

- Nhóm 7: bao gồm một enzyme phthalate oxygenase dung hợp với P450

(PFOR-P450).

- Nhóm 8: bao gồm 1 enzyme P450 dung hợp với protein vận chuyển điện tử

tƣơng tự ở tế bào nhân chuẩn là diflavin reductase (CPR-P450).

- Nhóm 9: bao gồm một enzyme nitric oxide reductase (P450nor) sử dụng

NADH làm chất cho điện tử. P450nor xúc tác phản ứng phụ thuộc vào và không

phụ thuộc vào các protein vận chuyển điện tử khác.

- Nhóm 10: bao gồm các P450 không phụ thuộc vào protein vận chuyển điện

tử nhƣ: allene oxide synthase, fatty acid hydroperoxide lyase, divinyl ether

synthase, prostacyclin synthase và thromboxane synthase [13].

Hình 1.2. Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử của hệ thống cytochrome P450 ở

microsome (A),mitochondria (B), vi khuẩn (C) và (D).

Trong đó:

CPR: NADPH-P450 reductase

FDX: ferredoxin

FDR:NAD(P)H-ferredoxin

ADX: Adrenodoxin

reductase

RH: Cơ chất

ADR: NADPH -

ROH: Sản phẩm.

adrenodoxin reductase

1.1.2 c củ cytochrome P450

P450 là một họ enzyme gồm nhiều isozyme có khối lƣợng phân tử khoảng 45-

60 kDa, trong phân tử có chứa một nhân heme ở dạng Fe protoporphyrin IX và một

chu i polypeptide.

Cấu trúc bậc I của P450 cho thấy trình tự amino acid trong phân tử của m i

chu i isozyme thƣờng có thể khác nhau rất nhiều (có trƣờng hợp khác đến 70%),

hơn nữa đoạn amino acid đầu N thƣờng không giống nhau giữa các P450. Sự khác

biệt về trình tự amino acid của các isozyme trong cùng loài dao động từ 30% đến

hơn 95%. M i isozyme đƣợc mã hóa bởi một gene riêng biệt và sự khác biệt về

trình tự amino acid trong phân tử là do trình tự của các nucleotide trong gene mã

hóa protein quy định [6].

Đến nay ngƣời ta đã biết đƣợc 1200 cấu trúc bậc I của P450. Các trình tự

amino acid của các P450 cũng nhƣ trình tự của các nucleotide mã hóa chúng đƣợc

lƣu trong GenBank. Trung tâm hoạt động của P450 chứa Fe protoporphyrin IX, liên

kết bởi lực hydro kỵ nƣớc. Vị trí thứ 5 của vòng porphyrin liên kết với aminothiol

thƣờng của gốc cysteine. Vị trí thứ 6 gắn với một phân tử nƣớc có khả năng trao

đổi. Mặc dù có sự khác biệt về trình tự amino acid nhƣng một số cấu trúc đƣợc bảo

toàn ở tất cả các isozyme, ví dụ nhƣ gốc cysteine gắn với heme bao giờ cũng ở gần

đầu carboxyl.

Trong số những cytochrome đã đƣợc tách chiết, cytochrome P450cam là enzyme P450 đầu tiên đƣợc mô tả cấu trúc bậc I một cách hoàn chỉnh bởi Poulos và

cộng sự [2]. Hình dạng tổng thể của P450cam tƣơng tự nhƣ một hình lăng trụ tam giác với đƣờng kính cực đại khoảng 60 Ǻ.

Hình 1.3. Cấu trúc không gian của Cytochrome P450cam

Vùng liên kết hem đƣợc mô tả bằng màu đen.

Một nguyên tử sắt hình cầu ở trung tâm của heme

Cấu trúc bậc II của P450 cũng đã đƣợc nghiên cứu, kết quả cho thấy cả chu i

-helix và phiến β đều tồn tại trong phân tử enzyme này. Sự khác biệt trong cấu trúc

không gian của trung tâm hoạt động của P450 là nguyên nhân cho sự đặc hiệu cơ

chất của các isozyme.

Vào đầu những năm 1990, ngƣời ta đã xác định đƣợc cấu trúc của một số enyme

cytochrome P450 gồm có P450BM3 (CYP102), P450terp (CYP108), P450eryF

(CYP107) và P450nor (CYP55) [6]. Cho đến nay những chuyên gia nghiên cứu cấu

trúc tinh thể đã xác định đƣợc cấu trúc của một số P450 của vi khuẩn.

Mặc dù sự tƣơng đồng về trình tự của các enzyme P450 thuộc cùng một phân

họ chỉ dƣới 20%, nhƣng các enzyme này lại có sự tƣơng đồng lớn về phƣơng thức

cuộn xoắn và hình học. Nhìn chung, có khoảng 13 chu i xoắn và 4 phiến β trong

một phân tử protein P450. Cấu trúc trung tâm bảo thủ của P450 đƣợc tạo nên bởi 1

bó gồm 4 chu i xoắn xung quanh nhân heme (3 chu i xoắn song song là D, L, I-

helix và một chu i xoắn ngƣợc là E-helix). Nhóm heme định vị giữa chu i I-helix

xa và một chu i L-helix gần và liên kết với phân tử cystein liền kề tạo thành một

vùng khoanh chứa đoạn trình tự amino acid bảo thủ của P450 là FxxGx(H/R)xCxG.

Phân tử cystein liền kề là tuyệt đối bảo thủ và nằm trên liên kết “thứ năm” của

nguyên tử sắt. Đặc biệt, phân tử cysterin tạo thành 2 liên kết hydrogen với các bộ

nhóm amide gần kề [9]. Chu i xoắn dài I-helix tạo thành 1 bức tƣờng giữa khoang

chứa nhóm hem và trình tự amino acid tín hiệu (A/G)-Gx(E/D)T tập trung ở giữa

các chu i xoắn. Chu i xoắn I-helix cũng chứa phân tử threonine có tính bảo thủ cao

định vị ở trung tâm hoạt động và đƣợc tin rằng có tham gia vào quá trình xúc tác

[13], [29], [17]. Dựa vào trình tự amino acid của các thành viên của nhóm CYP2 và

P450cam, Gotoh và cộng sự đã cho rằng có 6 vùng tham gia vào việc nhận biết cơ chất. Các vùng protein này đƣợc xem là rất linh hoạt và chuyển động theo sự liên

kết với cơ chất trƣớc khi sẵn sàng cho phản ứng xúc tác [36], [9].

Hình 1.4. Cấu tạo nhân heme của enzyme cytochrome P450

Trong đó: nguyên tử sắt (III) protoporphyrin-IX

liên kết với một phối tử cysteine ở gần

1.1.3 ơ ch c c củ cytochrome P450

Có hơn 20 phản ứng khác nhau đƣợc xúc tác bởi các enzyme P450 nhƣ phản

ứng hydroxyl hóa liên kết C-H, N-dealkyl hóa, N-hydroxyl hóa, O-dealkyl hóa, S-

oxy hóa và epoxy hóa. Trong đó, phản ứng phổ biến nhất đƣợc thực hiện bởi các

enzyme này là phản ứng monooxy hóa: một nguyên tử oxy đƣợc chuyển vào cơ

chất (RH) và nguyên tử oxy còn lại đƣợc khử thành nƣớc [28].

RH + O2 + NAD(P)H + H+→ ROH + H2O + NAD(P)+

Ngoài phân tử oxi, hệ thống enzyme này còn cần có NAD(P)H cung cấp H2

cho phản ứng. Cơ chế của phản ứng này đƣợc Coon và cộng sự đã tìm ra và mô tả

chi tiết vào năm 1979 [29].

Cơ chất muốn chuyển hóa đƣợc cần phải gắn vào enzyme P450 (ở dạng oxi

hóa) tạo thành một h n hợp enzyme - cơ chất. Sau đó một điện tử từ pyridine

nucleotide dạng khử đƣợc chuyển đến hợp chất này nhờ phân tử cytochrome P450 –

reductase. Phức hệ enzyme cơ chất bị khử này lại gắn với một phân tử oxi và tiếp nhận điện tử thứ hai. Qua sự chuyển điện tử (e-) nội phân tử, phân tử oxi đƣợc hoạt

hóa sau khi một phân tử nƣớc tách ra thì nguyên tử oxi thứ hai đƣợc gắn vào cơ

chất. Sau đó là sự tái lập lại cytochrome P450 dạng oxi hóa.

1.1.4 Ứng dụng của cytochrome P450

Hiện nay, các enzyme P450 đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu về nhiều

lĩnh vực: hóa sinh, y dƣợc học, sinh lý học, hóa học nội bào, công nghệ sinh

học và môi trƣờng.

Bộ gen của con ngƣời có 57 gen mã hóa cho P450, trong đó hơn một phần

tƣ các enzyme này tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất xenobiotics,

P450 còn tham gia vào quá trình tổng hợp sterol, vitamin, acid béo và

eicosanoids. Chính vì vậy, P450 có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp

dƣợc phẩm đặc biệt là trong nghiên cứu chế tạo thuốc chữa bệnh. Ngoài ra,

P450 còn xúc tác cho phản ứng hydroxyl hóa các hydrocarbon béo, các hợp

chất có khối lƣợng phân tử lớn hơn và phức tạp hơn nhƣ hydrocarbons

polyaromatic (PAHs); các hợp chất halogen nhƣ polychlorinated biphenyls

(PCBs), chất thải từ thuốc nổ quân sự và thuốc diệt cỏ [45]. Nhiều loại P450

còn đƣợc nghiên cứu phục vụ cho các ứng dụng xử lý sinh học.

Do khả năng thực hiện nhiều phản ứng khác nhau trên nhiều nhóm cơ chất

khác nhau, đặc biệt là khả năng oxy hóa chọn lọc ở các vị trí allyl, liên kết đôi hoặc

thậm chí cả ở liên kết C-H không đƣợc hoạt hóa và rất khó thực hiện bởi xúc tác

hóa học, nên cytochrome P450 có tiềm năng ứng dụng to lớn trong việc chuyển hóa

các hợp chất tự nhiên thành các sản phẩm có giá trị [7]. Ngoài ra, P450 có thể ứng

dụng trong xử lý môi trƣờng để chuyển hóa các chất độc hại thành các chất thân

thiện hơn hay ứng dụng để tạo các biosensor nhằm phát hiện sự có mặt của một chất

nào đó trong mẫu nghiên cứu. Trên thực tế, P450 đƣợc ứng dụng nhiều nhất để sản

xuất thuốc, vitamin, hƣơng liệu, nƣớc hoa hay thuốc trừ sâu. Chẳng hạn, P450 đã

đƣợc ứng dụng thành công ở qui mô công nghiệp trong việc sản xuất pravastatin -

thuốc có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol, dùng để điều trị cho những bệnh

nhân bị xơ vữa động mạnh. Pravastatin đƣợc chuyển hóa từ compactin bởi

CYP105A3 thông qua sự hydroxyl hóa carbon ở vị trí 6β. Một ví dụ khác nữa là

ứng dụng của P450 trong sản xuất cortisol từ 11-deoxycortisol bởi P450 qua phản

ứng hydroxyl hóa ở vị trí 11-β, đã đƣợc sản xuất bởi công ty Schering AG

(Germany) ở qui mô công nghiệp [39].

Trong chuyển hóa các hợp chất terpene, sự thêm vào bộ khung carbon một

hoặc một vài nhóm hydroxyl làm thay đổi đáng kể các tính chất nhƣ khả năng hòa

tan, hoạt tính sinh học hay tăng đặc tính mùi của hợp chất đó. Chẳng hạn một dạng

đột biến của P450cam có thể xúc tác phản ứng oxi hóa monoterpene (þ)-a-pinene

thành (þ)-cis-verbenol hoặc h n hợp của (þ)-verbenone và (þ)-cis-verbenol.

Verbenol và verbenone là các pheromones hoạt động chống lại rất nhiều loại bọ

cánh cứng do đó có thể sử dụng trong chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp.

Sinh tổng hợp sesquiterpene albaflavenone có hoạt tính kháng sinh đƣợc thực hiện

bởi (CYP170A1) qua hai bƣớc oxy hóa allyl hợp chất epi-isozizaene [51]. Sự

hydroxyl hóa chọn lọc „regio‟ valencene ở vị trí allyl C2 bởi CYP109B1 tạo ra

nootkatone, một hợp chất có giá trị trong công nghiệp thực phẩm và hƣơng liệu.

1.2 Nghiên cứu về CYP264B1

CYP264B1 là một enzyme cytochrome P450 có trọng lƣợng phân tử xấp xỉ 47

kDa, có nguồn gốc từ vi khuẩn myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56.

Năm 2007, trình tự toàn bộ genome của vi khuẩn này đƣợc công bố. Thông tin trình

tự đã chỉ ra rằng, vi khuẩn này có tất cả 21 P450s. Sau đó, gene mã hóa cho toàn bộ

các enzyme P450 này, trong đó có CYP264B1, đã đƣợc tách dòng bởi nhóm nghiên

cứu của GS. Rita Bernhardt trƣờng đại học Tổng hợp Saarland.

Trên genome của myxobacterium Soce, gene mã hóa cho CYP264B1 nằm ở vị

trí locus sce8551 ngay tiếp sau gene mã hóa cho một enzyme terpene cyclase

GeoA ở vị trí locus sce8552 (NCBI). Khoảng cách giữa 2 gene này rất gần, chỉ là

63 bp. Khoảng cách này gợi ý rằng 2 gene CYP264B1 và terpene cyclase GeoA

dƣờng nhƣ nằm trên cùng 1 operon và cùng nhau tham gia vào quá trình tổng hợp

terpenoid trong So ce65 [16].

Hình 1.5. Sắp xếp của gene mã hóa CYP264B1 và terpene cyclase GeoA trên cụm

2 gene của myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56

 Hệ thống chuyển điện tử cho CYP264B1

Hầu hết các P450 đều cần điện tử từ NADPH hoặc NADH và nhận điện tử

gián tiếp thông qua các đối tác vận chuyển điện tử (gọi là các redox partner) –

thƣờng có bản chất protein [13]. Các đối tác vận chuyển điện tử có thể cùng nguồn

gốc (autologous electron transfer) với enzyme P450 hoặc khác nguồn gốc

(heterologous electron transfer ) với enzyme P450. Trong nghiên cứu trƣớc, khả

năng chuyển điện tử cho CYP264B1 bởi các redox protein có cùng nguồn gốc

myxobacterium So ce56 (bao gồm 8 ferredoxin (Fdx) và 2 feredoxin reductase

(FdR) đã đƣợc thử nghiệm [10]. Kết quả là đã tìm ra 2 cặp redox protein có thể

chuyển điện tử cho CYP264B1 là Fdx2-FdR_B và Fdx8-FdR_B. Tuy nhiên, khi thử

khả năng chuyển điện tử của các redox protein có nguồn gốc từ tuyến thƣợng thận

bò là Adx (Adrenal ferredoxin) và AdR (Adrenodoxin reductase) cho CYP264B1,

TS. Lý Thị Bích Thủy và cộng sự đã nhận thấy rằng khả năng vận chuyển điện tử

của cặp protein này hiệu quả hơn nhiều. Chính vì vậy, Adx và AdR đã đƣợc sử

dụng làm đối tác vận chuyển điện tử cho CYP264B1 [26].

Adx có 128 amino acid, thuộc nhóm protein ferredoxin chứa nhóm sắt-lƣu

huỳnh (2Fe-2S), có khả năng vận chuyển điện tử từ NADPH tới enzyme cytochrom

P450 và thông qua một enzyme ferredoxin reductase. Trong nghiên cứu về

CYP264B1, Adx đƣợc sử dụng ở dạng đã đƣợc cắt ngắn bớt (truncated protein) 3

amino acid ở đầu N và 19 amino acid đầu C, là dạng bền vững hơn nhƣng vẫn giữ

nguyên hoạt tính so với dạng nguyên bản.

Hình 1.6. Cấu trúc của nhóm sắt-lƣu huỳnh [33]

AdR có 492 amino acid, là một enzyme thuộc nhóm mitochondrial

flavoprotein, có coenzyme là FAD. Enzyme này là protein chuyển điện tử đầu tiên

trong hệ thống mitochrondrial P450. Nhóm FAD coenzyme nhận 2 electron từ

NADPH và chuyển cùng một lúc hai điện tử này cho protein vận chuyển điện tử

tiếp theo là Adx [34].

Hình 1.7. Cấu trúc nhóm FAD [34]

M t s ặc tính thú vị của CYP264B1:

Do gene mã hóa cho CYP264B1 nằm thành cụm với enzyme terpene cyclase

nên enzyme này đã đƣợc dự đoán là có khả năng chuyển hóa một nhóm hợp chất

terpenoid nào đó. Sau khi sàng lọc một số nhóm terpenoid khác nhau nhƣ:

monoterpene, sesquiterpene, diterpene, steroid, ketone và aroma, các tác giả đã xác

định đƣợc CYP264B1 có khả năng hydroxy hóa nhiều hợp chất thuộc nhóm

sesquiterpene và sesquiterpenoid (nhƣ nootkatone, valencene, -longipinene,

clovene, humulene, isolongifolene-9-one) và norisoprenoids (nhƣ -ionone và β-

ionone). Hơn nữa, CYP264B1 có khả năng hydroxyl hóa cơ chất rất chọn lọc chỉ ở

một vị trí. Cụ thể, khi chuyển hóa ionone (β và -ionone), CYP264B1 chỉ hydroxyl

hóa ở vị trí là nguyên tử C3, tạo thành 3-OH-ionone. Sản phẩm 3-OH-ionone có thể

sử dụng làm chất trung gian để tổng hợp các carotenoid nhƣ astaxanthin, zeaxanthin

hay axit deoxyabscisic [24]. Khi chuyển hóa nootkatone, CYP264B1 tác động chủ

yếu tới vị trí C13 để tạo thành 13-OH-nootkatone. Đây là sản phẩm đƣợc xác định là

làm tăng khả năng kìm hãm một số dòng tế bào ung thƣ so với cơ chất ban đầu của

nó là nootkatone.Trong tổng hợp hóa học, phản ứng oxi hóa chọn lọc rất quan trọng

do loại bỏ đƣợc khả năng hình thành các sản phẩm phụ. Đặc biệt, CYP264B1 có

khả năng hydroxyl hóa ở vị trí mới. Cụ thể, sản phẩm hydroxyl hóa của CYP264B1

là 3-OH-β-ionone và 13-OH-nootkatone chƣa đƣợc quan sát thấy ở bất kỳ hệ thống

chuyển hóa sinh học nào [26].

1.3 Hợp chất sesquiterpene

1.3 Định nghĩ v ng ồn g c

* Định nghĩ

Sesquiterpene là nhóm hợp chất terpene gồm ba đơn vị isoprene, có công thức

phân tử là C15H24 [31].

* Nguồn g c

Sesquiterpene rất phổ biến trong thực vật, đặc biệt là trong thành phần của tinh

dầu. Chẳng hạn nhƣ isocaryophyllene chiếm 19,22% trong tinh dầu ngải cứu, β-

selinen chiếm 68,54% trong tinh dầu lá cúc tần...

Hình 1.8. Một số sesquiterpene phổ biến

1.3.2 hân ại sesquiterpene

Mặc dù cơ sở hóa học của sequiterpene đã có từ thế kỷ 19, nhƣng những

nghiên cứu hóa học về sesquiterpene chỉ đƣợc thực sự thúc đẩy với tốc độ nhanh

chóng bởi những công trình đầu tiên của Wallach, Semmler và nhất là của Ruzicka

song song với sự phát triển của các phƣơng pháp hiện đại để tách chiết, tinh chế,

xác định cấu trúc và tổng hợp [4].

Có khoảng 1000 sequiterpene thuộc khoảng 100 khung. Với số lƣợng chiếm

khoảng một phần tƣ tổng số các chất terpenoid tự nhiên mà ta biết ngày nay, các

sesquiterpene là nhóm chất terpenoid lớn nhất. Ở đây ta chỉ đề cập đến những

khung chính hoặc những loại chất lý thú về phƣơng diện thực tiễn [15].

 Sesquiterpene mạch thẳng

Điển hình của nhóm sesquiterpene này là β-farnesene chiếm 2,3% trong tinh

dầu cỏ hôi trị bệnh viêm xoang, trị gàu, rong huyết…

Hình 1.9. Sesquiterpene mạch thẳng

 Sesquiterpene mạch vòng đơn

- Curcumen có trong dầu nghệ, có tác dụng diệt khuẩn, làm vết thƣơng chóng thành

sẹo, chữa loét tá tràng.

- Zingiberen là thành phần chủ yếu của dầu gừng, có 2 nối đôi liên hợp có thể nhận

biết bằng quang phổ hấp thụ hoặc bằng hydro hóa với Na/ancol.

Hình 1.10. Một số sequiterpene mạch vòng đơn

 Sesquiterpene đa vòng

Một hợp chất rất lý thú, phổ biến khá rộng và biến hóa bất thƣờng là

caryophyllen. Ngƣời ta đặt tên cho nó là chất „tung hứng‟ vì phải tốn rất nhiều công

sức để xác định đƣợc cấu trúc của nó. Isocaryophyllen chiếm 19,22 % trong tinh

dầu ngải cứu [51]. Ngoài ra, nhóm này còn có rất nhiều hợp chất quan trọng nhƣ:

isolongifolene, cadinene, selinene…

Hình 1.11. Một số sesquiterpene đa vòng

1.3.3 Vai trò và ứng dụng của sesquiterpene

Sesquiterpene là những hợp chất thuộc nhóm terpene chứa 3 đơn vị isoprene

với công thức phân tử là C15H24. Đây là nhóm hợp chất phổ biến trong tinh dầu thực

vật đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau nhƣ thuốc, gia vị, nƣớc hoa và

hƣơng liệu [11], [8]. Ở thực vật, các sesquiterpene bảo vệ thực vật khỏi sự tấn công

của côn trùng, vi khuẩn, nấm, giúp chữa lành vết thƣơng, tạo hƣơng thơm để hấp

dẫn côn trùng đến thụ phấn [31]. Rất nhiều cây cỏ là thảo dƣợc chứa sesquiterpene

đã đƣợc khai thác từ lâu trong y học nhƣ tinh dầu gừng (sesquiterpene:

zingiberene), tinh dầu Rái (sesquiterpene: germacrene D, caryophyllene) [1]. Một số

sesquiterpene có tác dụng kháng ung thƣ, kháng khuẩn, chống viêm, chống oxi hóa

nhƣ: β-elemene (từ cây R.zedoariae), β-caryophyllene (có mặt trong tinh dầu nhiều

cây thực vật bậc cao) [23], [22].

Các dẫn xuất oxy hóa của sesquiterpene thƣờng có hoạt tính sinh dƣợc học

bao gồm kháng sinh, kháng nấm, kháng virus, ung thƣ. Trong số các hợp chất

sesquiterpene, albaflavenone và punctantins B có tính kháng sinh mạnh phổ rộng,

solavetivone và rufuslactone có khả năng kháng nấm, zerumbone và costunolide có

khả năng ức chế sự phát triển của virus, zerumbone có khả năng ức chế sự phát triển

của khối u và tế bào ung thƣ [51], [44], [25], [50]. Nhiều dẫn xuất của sesquiterpene

nhƣ norpatchoulenol, nootkatone đƣợc sử dụng làm hƣơng liệu, công nghiệp thực

phẩm và nƣớc hoa. Do tƣơng đồng về cấu trúc của bộ khung carbon, các dẫn xuất

hydroxyl hóa của sesquiterpene có nhiều giá trị vì chúng có thể đƣợc dùng làm chất

trung gian để tổng hợp các dẫn xuất hoặc hợp chất mới có giá trị cao, chẳng hạn

nhƣ sesquiterpene lactone. Costunolide đƣợc tổng hợp từ gemarcrene A thông qua

dẫn xuất hydroxyl hóa hợp chất này. Costunolide lại là chất trung gian để tổng hợp

parthenolide, một chất đƣợc sử dụng rộng rãi để chữa chứng đau nửa đầu và chống

viêm khớp [23].

1.4 Hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cytochrome P450

Để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn

điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc

một vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner.

Nhƣ vậy, hầu hết các P450 không thể độc lập thực hiện chức năng xúc tác mà

cần phải đi cùng với một chu i vận chuyển điện tử. Đây chính hạn chế lớn nhất cản

trở việc ứng dụng P450 trong thực tế. Thứ nhất, NAD(P)H là những chất có giá

thành cao; thứ hai, việc chuyển hóa cơ chất cần đồng thời cả P450 và các redox

partner của nó vì vậy việc ứng dụng ở qui mô lớn là không khả thi. Mặc dù các nhà

nghiên cứu đã cố gắng tìm kiếm giải pháp thay thế NAD(P)H bằng nguồn điện tử

khác, nhƣ sử dụng peroxide H2O2. Tuy nhiên, phƣơng pháp đó ít có ý nghĩa ứng

dụng thực tế do enzyme không bền và hiệu quả truyền điện tử k m [46], [39]. Cũng

chính vì sự phụ thuộc vào cofactor này của P450s mà cho đến nay ứng dụng của

P450 trong công nghiệp thƣờng đƣợc thực hiện thông qua hệ thống chuyển hóa tế

bào, thƣờng là các chủng vi sinh vật tự nhiên. Chẳng hạn, việc chuyển hóa

compactin thành pravastatin bởi CYP105A3 đƣợc thực hiện thông qua quá trình lên

men chủng Streptomyces carbophilus hay sản xuất cortisol từ 11-deoxycortisol bởi

P450lun nhờ lên men chủng Curvularia lunata [39].

Để mở rộng hơn khả năng ứng dụng của P450, sử dụng hệ xúc tác tế bào vi

sinh vật tái tổ hợp biểu hiện đồng thời gene mã hóa cho P450 và các redox partner

của nó, là một giải pháp thƣờng đƣợc lựa chọn hiện nay [46]. Giải pháp này có lợi

thế là có thể tận dụng nguồn cofactor nội sinh của tế bào chủ, các enzyme thực hiện

chức năng chuyển hóa cơ chất trong môi trƣờng tự nhiên nên bền vững và không

đòi hỏi quá trình tinh sạch tốn k m. Trong số các vi sinh vật hay đƣợc sử dụng

trong công nghiệp, E. coli là vật chủ đƣợc sử dụng nhiều nhất do chúng có thời gian

sinh trƣởng ngắn, năng suất biểu hiện cao, chi phí cho sản xuất thấp và dễ dàng thao

tác điều khiển.

Để đồng biểu hiện, gene mã hóa P450 và các redox partner có thể đƣa m i

gene này vào một vector riêng rồi biến nạp vào E. coli. Các vector này cần chứa

gene kháng kháng sinh khác nhau và vùng khởi đầu sao ch p tƣơng thích với nhau

để có thể cùng tồn tại trong tế bào chủ. Hannermann và công sự đã thiết kế hệ thống

chuyển hóa steroid nhờ E. coli. Trong nghiên cứu này, vector pACYC FHH2 mang

gene mã hóa CYP106A2 từ Bacillus megaterium ATCC 13368 đƣợc đồng biến nạp

với vector pBAR Twin chứa gene mã hóa cho AdR và Adx vào E. coli JM109, sau

đó đồng biểu hiện để chuyển hóa 11 -deoxycorticosterone thành 15β-hydroxy-11-

deoxycorticosterone [13].

Gần đây, thay vì đƣa vào các vector độc lập, ngƣời ta chỉ sử dụng một vector

trong đó gene mã hóa P450 và các redox protein đƣợc sắp xếp dƣới dạng cấu trúc

multicistronic. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là đảm bảo tất cả các gene đƣợc đồng

biểu hiện trong cùng một tế bào, giảm chi phí nghiên cứu và tạo đƣợc dòng tế bào

bền vững. Girhard và cộng sự đã thành công trong việc xây dựng hệ xúc tác tế bào

E. coli tái tổ hợp với multicistronic vector, biểu hiện CYP109B1 và các redox

partner của nó để chuyển hóa valencene thành nootkatone. Chuyển hóa camphor

thành dẫn xuất 5-exo-hydroxycamphor cũng đƣợc thực hiện nhờ tế bào E. coli tái tổ

hợp chứa cấu trúc tricistronic của P450cam - putidaredoxin (Pd)-putidaredoxin

reductase (PdR). Trong một nghiên cứu khác, E.coli tái tổ hợp chứa cấu trúc

tristronic của CYP27A1- Adrenodoxin reductase - Adrenodoxin cũng đƣợc xây

dựng để chuyển hóa cholesterol và vitamin D3. Nghiên cứu gần đây của Ringle và

cộng sự cũng xây dựng hệ xúc tác E. coli tái tổ hợp với multicistronic vector chứa

gene mã hóa CYP264A1 từ myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56 với

redox partner là Adrenodoxin và E. coli reductase. Hệ thống này đƣợc áp dụng

thành công để chuyển hóa 4-methyl-3-phenyl-coumarin thành 4-hydroxymethyl-3-

phenyl-coumarin [37].

M t s ư i m và hạn ch của h xúc tác t bào:

Ưu điểm:

- Có thể thực hiện phản ứng xúc tác ở điều kiện nhẹ nhàng trong khi các phản

ứng chuyển hóa bằng con đƣờng hóa học lại đòi hỏi điều kiện khắc nghiệt, chi phí

cao và tạo ra nhiều chất thải độc hại làm ảnh hƣởng đến môi trƣờng.

- Enzyme thực hiện chức năng chuyển hóa trong môi trƣờng tự nhiên nên bền

vững và không đòi hỏi quá trình tinh sạch tốn kém (tinh sạch 3 protein).

- Không cần cung cấp các cofactor từ bên ngoài cho phản ứng oxi hóa khử khử

mà sử dụng luôn nguồn cofactor nội sinh của tế bào chủ.

- So với các phƣơng pháp sử dụng enzyme cố định trên giá thể thì việc sử

dụng hệ xúc tác tế bào có ý nghĩa vƣợt trội về độ bền vững và giá thành.

- So với phƣơng pháp hóa học thì hệ xúc tác sinh học dựa trên hệ thống P450

có nhiều khả năng tạo ra những dẫn xuất mới hơn.

Hạn chế:

- Quy trình phức tạp hơn việc sử dụng enzyme xúc tác.

- Xuất hiện các khả năng và sản phẩm không mong muốn do có nhiều loại

enzyme khác có mặt trong hệ xúc tác [26].

1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa

sesquiterpene trên thế giới và ở Việt Nam

 Tình hình nghiên cứu trên th giới

Cho đến nay, ngoài CYP264B1, mới chỉ có premnaspirodiene oxygenease là

một enzyme cytochrome P450 từ cây Hyoscyamus muticus đƣợc biết đến có khả

năng chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene [44]. Tuy nhiên việc sử dụng

enzyme P450 có nguồn gốc vi khuẩn s có nhiều lợi thế hơn các enzyme có nguồn

gốc thực vật do chúng thƣờng có hoạt tính cao hơn và không liên kết màng [45].

CYP264B1 là loại P450 có nguồn gốc từ vi khuẩn myxobacteria. Chính vì vậy,

CYP264B1 có ƣu thế lớn trong việc chuyển hóa các hợp chất sesquiterpene.

 Tình hình nghiên cứu tại Vi t Nam

Ở nƣớc ta, việc chuyển hóa hợp chất sesquiterpene đã đƣợc nghiên cứu từ

trƣớc tuy nhiên các nghiên cứu này thƣờng tập trung vào chuyển hóa bằng con

đƣờng hóa học, chƣa có nghiên cứu nào sử dụng chất xúc tác sinh học mà đặc biệt

là các enzyme cytochrome P450. Nghiên cứu về P450 ở trong nƣớc mới chỉ tập

trung vào: tách chiết P450, nghiên cứu về ảnh hƣởng của thuốc, chất độc hại, dịch

chiết thảo dƣợc lên hệ thống cytochrome P450 ở ngƣời và động vật thực nghiệm

hay nghiên cứu về phát hiện đột biến một số gene CYP gây rối loạn chuyển hóa

steroid hormone ở ngƣời [3].

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2. 1 Vật liệu nghiên cứu

Vậ i

- Plasmid biểu hiện pETC4AA đƣợc cung cấp bởi phòng Sinh hóa thực vật –

Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Plasmid pETC4AA đƣợc xây dựng dựa trên vector pET17b (phụ lục I), chứa gene

mã hóa CYP264B1, gene mã hóa Adrenodoxin (Adx) và gene mã hóa Adrenodoxin

reductase (AdR).

Hình 2.1. Plasmid pET C4AA

- Chủng E.coli TOP10F‟để nhân dòng gene.

- Chủng E.coli C43DE3 để biểu hiện gene từ hãng Invitrogen.

- Cặp mồi sử dụng để đọc trình tự gene và PCR colony.

Tên mồi Trình tự

Mồi C4-F (18nu) atatacatatgactcgac

Mồi C4-R (16 nu) acaaaagcttctagt

Mồi AdR-F (18 nu) atataccatgggcactca

Mồi Adx-R (18 nu) tgcagaattcttaaggta

- Các sesquiterpene: longipinene, isolongifolene và nootkatone đƣợc đặt mua từ

hãng Sigma-Aldrich.

- Sản phẩm chuyển hóa in vitro các sesquiterpene bởi CYP264B1 đƣợc cung

cấp bởi phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.

- Kháng thể đặc hiệu của Adx đƣợc cung cấp bởi nhóm nghiên cứu của GS. Rita

Bernhardt - Trƣờng Đại học Tổng hợp Saarland, CHLB Đức.

Thi ị hí nghi

Bảng 2.1. Danh sách thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm

Tên thiết bị Hãng sản xuất

Bể ổn nhiệt VS-1205CW Trung Quốc

Bốc cấy vi sinh vật Laminar LB-1234 Sartorius (Thụy Sỹ)

Cân phân tích BL150S Wealtec (Đài Loan)

Hệ thống chụp ảnh gel Dolphin-Doc CCD Đài Loan

CAMERA 201

Hệ thống điện di đứng Biometra (Đức)

Hệ thống điện di ngang Mupid Nhật

Máy đo pH-827 Metrohm (Thụy Sỹ)

Lò vi sóng Nhật

Hettich (Đức)

Máy ly tâm lạnh MIKRO22 Máy nuôi lắc Certomat® HK Sartorius (Đức)

Eppendorf (Đức)

Máy PCR Thermocycler Personal Máy lắc ổn nhiệt ProvocellTM Esco (Mỹ)

Máy quang phổ UV2500 Labomed (Mỹ)

Máy Vortex OSI Rotolab (Đức)

Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật)

Pipet (10 µl, 100 µl, 1000 µl) Eppendorf (Đức)

Sanyo (Nhật)

Reetech

Tủ ấm MIR-162 Tủ lạnh (-20oC) Tủ lạnh (-84oC) Sanyo (Nhật)

Việt Nam

Tủ cấy Tủ lạnh 40C GR-N45VTV Toshiba (Nhật)

2.1.3 H ch

Bảng 2.2. Danh sách hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm

Hóa chất Hãng sản xuất

Trung Quốc KH2PO4

Trung Quốc K2HPO4

Italy Na2S2O4

IPTG Merck (Đức)

Glycerol Merck (Đức)

(2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin Sigma Alrich

Agarose Rockland (Mỹ)

2.1.4 D ng ịch v

Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm chính sử dụng trong thí nghiệm

Dung dịch Thành phần, nồng độ

Đệm điện di protein 20 mM Tris-HCl, 192 mM glycine; 0,1% SDS;

pH 8,8

Đệm mẫu 1 MTris–HCl (pH 6.8); 40% glycerol; 20% SDS,

8%β-mercaptoethanol; 0.1% bromphenol blue

Lysis buffer 1M kali phosphate, pH 7,4; 10% glycerol; 0.1 mM

PMSF; 300 mM NaCl

Đệm TBS

50 mM Tris–HCl pH 7.4; 200 mM NaCl; 0.1% Tween 20

Đệm PBS

10 mM potassium phosphatebuffer pH 7.4; 150 mM NaCl

Đệm Kpp 50mM ; pH 7,4; 4% glycerol

Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8

Dung dịch APS 10% ammonium persulfate

Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl; pH 6,8

Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide

Dung dịch D 10% SDS

Dung dịch nhuộm PAGE 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue, 30% (v/v)

methanol, 10% (v/v) acetic acid

Dung dịch tẩy PAGE 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid

5 Môi ường

Bảng 2.4. Danh sách các môi trƣờng sử dụng trong thí nghiệm

Môi trƣờng Thành phần

LB lỏng 1% (w/v) tryptone; 0,5% (w/v) yeast extract; 1% NaCl

LB rắn 1% (w/v) tryptone; 0,5% (w/v) yeast extract; 1% NaCl; 1,5%

(w/v) agar

TB 1,2% (w/v) tryptone; 2,4% (w/v) yeast extract; 0,4% (v/v)

glycerol ; 0,17M KH2PO4; 0,72M K2HPO4.3H2O

KppG 0,17M KH2PO4; 0,72M K2HPO4.3H2O; 4% glycerol

2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu

Đề tài đƣợc tiến hành theo sơ đồ nghiên cứu sau :

Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu đề tài

2.2.1 N ôi c c i

E.coli bảo quản ở -84oC đƣợc cấy vạch trên đĩa môi trƣờng LB đặc để hoạt hóa, ủ ở 37oC qua đêm. Một khuẩn lạc riêng r trên đĩa thạch đƣợc nuôi trong môi trƣờng LB lỏng, lắc 200 v/p ở 37oC qua đêm. Các chủng tái tổ hợp đƣợc nuôi trong

môi trƣờng LB có chứa 100 µg/ml ampicillin.

2.2.2 i n nạ i i h v E.coli ằng hương h c nhi

Chuẩn bị tế bào khả biến:

Khuẩn lạc E. coli đƣợc cấy chuyển vào 3 ml môi trƣờng LB lỏng, lắc 200 v/p

ở 37oC qua đêm. Sau đó, tiếp giống 1% dịch tế bào nuôi cấy qua đêm vào môi trƣờng LB lỏng mới, nuôi lắc 200 v/p ở 37oC. Khi mật độ quang của dịch nuôi

OD600nm đạt 0,4 - 0,7, dịch nuôi cấy đƣợc đặt trong đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 4000 v/p ở 4oC trong 5 phút để thu tế bào. Tế bào đƣợc rửa lần 1 trong dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh và vô trùng, ủ đá lạnh 15 phút và ly tâm 4000 v/p ở 4oC trong 5

phút thu tế bào. Tiếp theo tế bào đƣợc rửa lần 2 trong dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh và vô trùng, ủ đá lạnh khoảng 1 giờ và ly tâm 4000 v/p ở 4oC trong 5 phút.

Cuối cùng, tế bào đã qua xử lý đƣợc hòa trong dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh và vô

trùng có chứa 15% glycerol. Dịch h n hợp tế bào và glycerol đƣợc chia nhỏ ra các ống 50 µl/ống eppendorf, dùng biến nạp ngay hoặc bảo quản ở trong tủ -80oC có thể

sử dụng trong 1 đến 3 tháng.

Biến nạp plasmid vào E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt: Lấy tế bào khả biến tƣơi hoặc từ -80oC đƣợc giã đông từ từ trong đá khoảng

30 phút. Bổ sung 1 µl plasmid tái tổ hợp vào ống eppendorf chứa 50 µl dịch tế bào

khả biến, đảo nhẹ nhàng, ủ trong đá khoảng 30 phút. H n hợp đƣợc sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây, lấy mẫu ra và đặt ngay vào trong đá lạnh khoảng 10 phút. Bổ sung 250 µl LB lỏng, nuôi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1 giờ. Cấy trải 100 µl dịch biến nạp trên đĩa thạch LB có bổ sung 100µg/ml ampicillin, ủ ở 37oC qua đêm.

2.2.3 Ki c ặ củ g n CYP264B1, AdR và Adx

Sự có mặt của gene CYP264B1 đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR colony,

sau đó giải trình tự để khẳng định chắc chắn sự có mặt của cả 3 gene CYP264B1,

AdR và Adx.

* hương h R colony

Chuẩn bị thành phần phản ứng PCR nhƣ bảng 2.5, đặt trong đá. Tiếp theo

dùng đầu pipet nhỏ (hoặc tăm đã khử trùng) chạm vào khuẩn lạc E. coli rồi nhúng

vào ống PCR đã chứa các thành phần phản ứng. Lúc này trong thành phần phản ứng

đã có thêm một số tế bào E. coli. Ống phản ứng đƣợc đƣa vào máy PCR và bắt đầu

chu trình nhiệt nhƣ ở bảng 2.6. Khi nhiệt độ đạt 94ºC, tế bào E. coli bị phá vỡ và

giải phóng DNA. Dƣới nhiệt độ này, DNA bị biến tính và tháo xoắn, tạo điều kiện

cho việc tiếp xúc với mồi để có thể sao ch p gene đích.

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

2 Buffer 10 X chứa MgCl2 15 mM

dNTP 5 mM 0,5

Mồi xuôi 10 pM 0,5

Mồi ngƣợc 10pM 0,5

Taq-polymerase 1U/1µl 0,5

16 H2O khử ion vô trùng

Tổng thể tích 20

Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian

Biến tính 4 phút 94

Tổng hợp kéo Biến tính 45 giây 94

dài 35 chu Bắt cặp 35 giây 50

kỳ, m i chu Kéo dài 1 phút 72 kỳ gồm:

Kết thúc phản ứng 8 phút 72

Sau khi kết thúc phản ứng, lấy 8 µl sản phẩm PCR điện di trên gel agarose

(0,8%) để kiểm tra.

* Nhân dòng và tách plasmid

M i khuẩn lạc đơn mọc trên đĩa biến nạp đƣợc nhặt nuôi trong ống falcon

chứa 3 ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung 100µg/ml ampicillin, nuôi lắc 200 v/p ở 37oC qua đêm. Lấy 1,5 ml dịch nuôi ly tâm 12000 v/p trong 10 phút, loại dịch nuôi,

thu tủa tế bào. Tủa tế bào đƣợc bổ sung 150 µl Sol I, trộn đều bằng máy lắc rung

(vortex) tạo thể đồng nhất. Bổ sung tiếp 150 µl Sol II, đảo trộn nhiều lần và để yên

trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Bổ sung thêm 150 µl Sol III, lắc đều, giữ yên trong 5

phút. Thêm 450 µl h n hợp dung dịch chloroform : isoamyl alcohol (24:1), trộn

đều, để nhiệt độ phòng trong 5 phút sau đó đem ly tâm 12500 v/p trong 10 phút ở 4oC, thu dịch nổi bên trên chuyển sang 1 ống eppendorf mới. Dịch nổi đƣợc bổ sung 320 µl isopropanol, trộn đều, ủ ở -20oC trong 1 giờ. Ly tâm 12.500 v/p trong 10 phút ở 4oC, thu tủa plasmid. Tủa plasmid đƣợc rửa bằng 500 µl cồn 70% để loại

muối và isopropanol, ly tâm 12000 v/p trong 10 phút. Tủa plasmid sau đó làm khô

bằng đèn sợi đốt và hòa tan trong 50 µl TE (pH 8,0) + RNase hoặc RNase + H2O cất tiêm, sau đó ủ ở 37oC trong 1 giờ. Điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel 0,8 % agarose, bảo quản ở -20oC.

* Đọc trình t nucleotid

Plasmid tái tổ hợp đƣợc gửi đi đọc trình tự. Gene mã hóa cho CYP264B1

đƣợc đọc trình tự với cặp mồi C4 F và C4 R. Gene mã hóa cho AdR và Adx đƣợc

đọc trình tự với cặp mồi AdR-F, Adx-R. Đoạn DNA đích đƣợc đọc trình tự

nucleotid theo nguyên lý sanger cải tiến dựa trên các dideoxy.

2.2.4 Ki khả năng i hi n g ne

* N ôi i hi n

Một khuẩn lạc đơn E. coli C43DE3 mang plasmid tái tổ hợp pETC4AA đƣợc cấy vào môi trƣờng LB lỏng chứa 100µg/ml ampicillin và nuôi lắc 200 v/p ở 37oC

qua đêm. Sau đó dòng tế bào đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng TB với tỉ lệ 1% và tiếp tục đƣợc nuôi lắc 200 v/p ở 37ºC. Khi mật độ quang của môi trƣờng OD600nm

đạt giá trị từ 0,8-1 thì bổ sung 1mM β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) để cảm

ứng biểu hiện gene, đồng thời bổ sung 0,5 mM deltaaminolevulinic acid (δ-Ala) để h trợ tổng hợp nhân heme của CYP264B1. Tiếp tục nuôi lắc 200 v/p ở 30oC trong

24 giờ. Tế bào đƣợc thu nhận bằng ly tâm 6000 v/p trong 5 phút để kiểm tra khả

năng biểu hiện gene.

* Ki m tra khả năng i u hi n của gen CYP264B1 bằng hương h nồng

Sau 24 giờ cảm ứng IPTG, tế bào C43DE3/pETC4AA đƣợc thu bằng ly tâm

6000 v/p trong 15 phút, sau đó đƣợc rửa và hòa trong đệm Lysis buffer. Phá vỡ

bằng phƣơng pháp siêu âm và ly tâm 20000 v/p trong 30 phút để thu dịch chiết

protein thô và lắc vài lần. Natri dithionite s khử nguyên tử Fe trong nhân heme.

Lúc này, sục khí CO với tốc độ 1 bọt khí/giây trong 30 giây để nguyên tử Fe tạo

phức với CO, sau đó đo phổ hấp thụ UV-Vis của dịch này bằng máy đo quang phổ

trong dải bƣớc sóng 200 - 700 nm.

Xác định nồng độ CYP264B1 theo công thức của Omura và Sato (1964):

Trong đó: CP450 là nồng độ P450 (mM)

∆A450-490 = A450 – A490 lần lƣợt là cƣờng độ hấp thụ ánh sáng tại bƣớc

sóng 450 và 490nm

fd là độ pha loãng

là hệ số tắt (91mM-1 x cm-1)

d là độ dày của cuvet (thƣờng bằng 1 cm)

* Ki m tra khả năng i u hi n Adx bằng Western blot

Tế bào sau 24 giờ cảm ứng bằng IPTG đƣợc thu nhận từ 100 μl môi trƣờng

nuôi cấy, hòa vào 100 μl đệm mẫu và đun sôi 10 phút trong nồi đun cách thủy. Sau

đó, 12 μl mẫu sau biến tính đƣợc phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamid, sử

dụng thang protein chuẩn của PEQLAB (Erlangen, Germany) [20].

Quá trình phân tách trên gel polyacrylamide diễn ra nhƣ sau:

Đổ gel: Bản gel đƣợc đổ hai lớp, lớp dƣới là gel tách đƣợc đổ cách mặt trên 2

cm, để đông 30 phút, cài lƣợc rồi đổ tiếp lớp gel co ở trên, để 30 phút cho gel đông

hoàn toàn và ổn định. Thành phần gel nhƣ bảng 2.7.

Bảng 2.7. Thành phần gel co và gel tách

Thành phần Gel tách (µl) Gel co (µl)

1940 1180 H2O

Dung dịch A 1500 0

Dung dịch B 0 500

Dung dịch C 2500 300

SDS 10% 60 20

Ammonium persulfate 10% 24 10

TEMED 7 5

6031 2015 Tổng thể tích

Biến tính protein: 5 µl mẫu điện di đƣợc trộn với 5 µl đệm tra mẫu protein 5x

và 20 µl nƣớc cất khử trùng, mix đều rồi biến tính ở 95ºC trong 5 -10 phút, sau đó

lập tức cho ngay vào tủ 4ºC.

Điện di: Bản điện di đƣợc lắp vào hệ thống điện di, đổ ngập bản điện di bằng

đệm điện di protein. M i giếng trên bản điện di đƣợc tra 10 µl mẫu protein đã biến

tính và chạy với hiệu điện thế cƣờng 80 V cho lớp gel co và 100 V cho lớp gel tách

trong vòng 120 phút. Sau điện di bản gel đƣợc tách khỏi phiến kính rồi nhuộm bằng

h n hợp coomassie brilliant blue, methanol, acetic acid.

Protein sau khi phân tách đƣợc chuyển lên màng hybond™ECL™

nitrocellulose (Amersham, GE Healthcare, UK) bằng thiết bị chuyển màng (Trans-

Blot SD, Bio-Rad), sau đó ủ màng trong dung dịch 3% sữa skimed milk trong đệm

TBS qua đêm nhằm ngăn không cho kháng thể tƣơng tác không đặc hiệu với màng

lai. Tiếp theo rửa màng 3 lần (10 phút/lần) trong đệm TBS 1X rồi phủ màng bằng

kháng thể 1 (là kháng thể đa dòng thu đƣợc từ huyết thanh thỏ sau khi tiêm Adx

tinh sạch - đƣợc cung cấp từ nhóm nghiên cứu của GS. Rita Bernhardt, pha loãng

100 lần trong đệm TBS và ủ trong 2 giờ. Tiếp theo rửa màng 3 lần bằng đệm TBS,

rồi phủ màng bằng kháng thể 2 (là kháng thể kháng IgG thỏ có gắn chỉ thị

peroxidase, pha loãng 2000 lần trong TBS, lắc ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Sau

khi rửa màng 3 lần (m i lần 5 phút) bằng đệm PBS, hiện màu với dung dịch hiện

màu chứa 5 mg 4-chloro-1-naphtol đƣợc hòa trong 2 ml ethanol và 10 μl 30% H2O2

trong 25 ml PBS.

2.2.5 Ki khả năng ch n h n k n

Tế bào E.coli tái tổ hợp đƣợc nuôi biểu hiện trong môi trƣờng TB. Sau 24 giờ

cảm ứng biểu hiện bằng 1mM IPTG, tế bào đƣợc thu nhận bằng ly tâm 4000 v/p

trong 5 phút, sau đó đƣợc rửa và hòa trong đệm Kpp chứa 4% glycerol (KppG).

Chuyển hóa cơ chất đƣợc thực hiện trong đệm này: bổ sung nootkatone vào dịch

nuôi cấy tế bào với nồng độ 200 µM. Quá trình chuyển hóa đƣợc thực hiện trong máy lắc ổn nhiệt ở điều kiện 30oC, 200 v/p.

Khả năng chuyển hóa nootkatone của hệ xúc tác tế bào E.coli C43DE3/pET

C4AA đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC).

* Sắc ký lỏng cao áp (HPLC)

Trong nghiên cứu này, sản phẩm chuyển hóa nootkatone đƣợc gửi đi phân

tích bằng phƣơng pháp HPLC tại công ty VNDAT.

Quy trình:

Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đƣợc sử dụng để phân tích các sản phẩm chuyển

hóa của nootkatone. 1 ml sản phẩm chuyển hóa đƣợc chiết với 2 thể tích

chloroform. Cho bay hơi hết dung môi bằng hút chân không rồi hòa tan trong 200

mM acetonitrile và phân tích bởi hệ thống HPLC-UV sử dụng cột pha đảo C18 và

một hệ dung môi chứa acetonitrile/nƣớc (55:45) với tốc độ chảy 1 ml/phút. Sản

phẩm phân tích đƣợc theo dõi ở bƣớc sóng 254 nm.

2.2.6 X c ịnh iề ki n ch n h n k n i ư

* Xác định môi trường tối ưu

Tế bào C43DE3/pETC4AA đƣợc nuôi qua hai giai đoạn: Giai đoạn (1) nuôi

biểu hiện và giai đoạn (2) chuyển hóa cơ chất. Để xác định đƣợc môi trƣờng chuyển

hóa tối ƣu, đề tài sử dụng môi trƣờng LB và TB cho giai đoạn (1), trong giai đoạn

(2) vẫn sử dụng hai môi trƣờng này và bổ sung thêm môi trƣờng KppG.

Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ bảng 2.8:

Bảng 2.8. Bố trí thí nghiệm xác định môi trƣờng tối ƣu

Thí nghiệm Môi trƣờng biểu hiện Môi trƣờng chuyển hóa

LB – LB LB LB

LB – KppG LB KppG

TB – TB TB TB

TB – KppG TB KppG

Sản phẩm chuyển hóa của 4 thí nghiệm trên đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp

HPLC. Môi trƣờng tốt nhất là môi trƣờng chuyển hóa cơ chất nhiều nhất.

* Xác định mật độ tế bào tối ưu

Để xác định đƣợc mật độ tế bào tối ƣu cho chuyển hóa, tế bào sau khi đƣợc

cảm ứng biểu hiện ở giai đoạn 1 s đƣợc thu lại bằng ly tâm, xác định khối lƣợng tế

bào và chuyển sang môi trƣờng chuyển hóa sao cho có các mật độ tế bào khác nhau:

10 g/l, 15 g/l, 20 g/l, 25 g/l. Thực hiện chuyển hóa cơ chất và so sánh lƣợng sản

phẩm tạo thành. Mật độ tế bào tốt nhất là mật độ mà ở đó lƣợng sản phẩm tạo ra

nhiều nhất.

* Xác định nhiệt độ chuyển hóa tối ưu

Để xác định nhiệt độ tối ƣu cho chuyển hóa, tế bào sau khi cảm ứng biểu hiện

ở giai đoạn 1 s đƣợc chuyển sang môi trƣờng chuyển hóa với mật độ tế bào tối ƣu và nuôi trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 25oC, 30oC, 37oC. Thực hiện

chuyển hóa cơ chất và so sánh lƣợng sản phẩm tạo thành. Nhiệt độ tế bào tốt nhất là

nhiệt độ mà ở đó cơ chất đƣợc chuyển hóa nhiều nhất.

* Xác định tốc độ lắc tối ưu cho chuyển hóa nootkatone

Để xác định tốc độ lắc tối ƣu cho chuyển hóa nootkatone, tế bào sau khi cảm

ứng biểu hiện s đƣợc chuyển sang môi trƣờng chuyển hóa với mật độ tế bào tối ƣu

và lắc với các tốc độ lắc khác nhau: 100 v/p, 120 v/p, 150 v/p, 180 v/p và 200 v/p ở

nhiệt độ tối ƣu. Thực hiện chuyển hóa cơ chất và so sánh lƣợng sản phẩm tạo

thành. Tốc độ lắc tối ƣu là tốc độ cho lƣợng sản phẩm chuyển hóa nhiều nhất.

* Xác định nồng độ cơ chất thích hợp cho chyển hóa nootkatone

Để xác định đƣợc nồng độ cơ chất tối ƣu chi chuyển hóa nootkatone, tế bào

sau khi cảm ứng biểu hiện đƣợc chuyển sang môi trƣờng chuyển hóa với mật độ tế

bào tối ƣu và bổ sung cơ chất với các nồng độ khác nhau: 100 µM, 150 µM, 200

µM, 250 µM, 300 µM, tiếp tục lắc ở tốc độ và nhiệt độ tối ƣu.

7 h n h h ch i n

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chuyển hóa 2 sesquiterpene là longipinene và

isolongifolene. Thí nghiệm chuyển hóa sử dụng những điều kiện đã tối ƣu cho

chuyển hóa nootkatone. Sản phẩm chuyển hóa đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp

GC – MS, tinh sạch bằng sắc ký cột selicagel và nhận dạng cấu trúc bằng phƣơng

pháp NMR.

* Nhận dạng sản phẩm chuy n hóa bằng sắc ký khí ghép kh i ph (Gas

chromatographymass spectrometry - GCMS)

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) đƣợc sử dụng để phân tích độ tinh sạch và

nhận dạng sản phẩm chuyển hóa dựa vào sự so sánh thời gian lƣu với các mẫu

chuẩn và phổ khối so với ngân hàng phổ khối. Sản phẩm chuyển hóa của

longipinene và isolongifolene trong nghiên cứu này đƣợc phân tích tại công ty

VNDAT.

Trong thí nghiệm này, chƣơng trình nhiệt độ sử dụng để phân tích các sản

phẩm chuyển hóa sesquiterpene nhƣ sau: Bắt đầu ở 50°C, giữ trong 1 phút. Sau đó,

tăng lên 150°C với tốc độ 4°C/phút. Tiếp tục tăng lên 300°C với tốc độ 15°C/phút,

giữ trong 5 phút. Sau đó, giảm xuống 50°C với tốc độ 15°C/phút.

* Tinh sạch sản phẩm chuy n hóa bằng c t silicagel

Trong nghiên cứu này, cột silicagel đƣợc sử dụng để tinh sạch các sản phẩm

chuyển hóa của longipinene và isolongifolene. Cột có kích thƣớc 2x40 cm và sử

dụng các hat selicagel có kích thƣớc 35-70 µm.

Quy trình:

- Chuẩn bị mẫu: 1 lít môi trƣờng chuyển hóa đƣợc chiết với 2 lít ethyl acetate.

Pha ethyl acetate chứa sản phẩm chuyển hóa đƣợc tách riêng bằng bình quả lê, sau

đó đƣợc cô đặc bằng máy cô quay chân không.

- Xác định hệ dung môi thích hợp bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC):

Bản sắc ký silicagel 60 F254 đƣợc dung làm pha tĩnh. Pha động là h n hợp dung

môi n-hexan : ethyl acetate với các tỷ lệ khác nhau. Nhỏ 5µl mẫu sau khi cô đặc lên

bản sắc ký, để khô. Bản sắc ký đƣợc nhuộm với dung dịch gồm 1% (w/v) vanillin; ethanol : H2SO4 (95:5). Sau đó làm hiện màu ở nhiệt độ 110oC. Hệ dung môi thích hợp là hệ dung môi cho sự phân tách rõ ràng giữa các sản phẩm chuyển hóa. Hệ

dung môi thích hợp trong nghiên cứu này là n-hexan : ethyl acetate (95:5).

- Tinh sạch: Mẫu chuyển hóa (đã đƣợc cô đặc ở trên) đƣợc hòa vào ethyle

acetate sao cho thể tích đƣa lên cột là 3 ml. Sử dụng hệ dung môi n-hexan : ethyl

acetate (95:5). Mẫu phân tách qua cột đƣợc thu thành các phân đoạn với thể tích 10

ml/1 phân đoạn. Sự có mặt của mẫu trong các phân đoạn đƣợc kiểm tra bằng

phƣơng pháp TLC với mẫu đối chứng dƣơng là sản phẩm chuyển hóa in vitro bởi

CYP264B1. Các phân đoạn có chứa sản phẩm đƣợc kiểm tra độ tinh khiết bằng

phƣơng pháp GCMS. Các phân đoạn chứa sản phẩm tinh khiết s đƣợc tập hợp lại

và cô đặc lại bằng máy cô quay chân không trƣớc khi gửi phân tích bằng phƣơng

pháp NMR.

* Nhận dạng c u trúc bằng phương h c ng hưởng từ hạt nhân (Nuclear

magnetic resonance - NMR)

Sản phẩm tinh sạch của chuyển hóa của longipinene đƣợc gửi đến công ty

VNDAT để phân tích cấu trúc.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nhân dòng plasmid pETC4AA và kiểm tra sự có mặt của gene mã hóa

CYP264B1, AdR và Adx

Plasmid pETC4AA đƣợc biến nạp vào E. coli TOP10F‟ để nhân dòng. Chủng tái tổ hợp đƣợc trải trên môi trƣờng LB đặc chứa 100µg/ml ampicillin và ủ ở 37oC

trong 16 giờ. Để lựa chọn khuẩn lạc mang plasmid pETC4AA, một số khuẩn lạc

mọc trên đĩa thạch đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR colony nhờ cặp mồi đặc

hiệu (C4-F và C4-R) để nhân gene mã hóa cho CYP264B1. Kết quả trên hình 3.1

cho thấy khuẩn lạc đƣợc lựa chọn có chứa đoạn gene có kích thƣớc tƣơng tự kích

thƣớc của gene mã hóa CYP264B1 (1257 bp).

Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR colony

Giếng 1,2,3: Sản phẩm PCR colony 3 khuẩn lạc

Giếng 4: Marker Smart Ladder (Eurogentec)

Các khuẩn lạc sau đó đƣợc nuôi lắc 200 v/p trong môi trƣờng LB lỏng qua

đêm để tách plasmid. Để khẳng định chắc chắn plasmid tái tổ hợp pETC4AA đã

đƣợc nhân dòng và các gene không có điểm đột biến nào, plasmid đƣợc gửi đi đọc

trình tự với 2 cặp mồi: cặp mồi 1 (C4-F và C4-R) để nhân đoạn gene CYP264B1 và

cặp mồi 2 (AdR-F và Adx-R) để nhân đoạn gene AdR-Adx có kích thƣớc 1716 bp.

Kết quả đọc trình tự cho thấy các trình tự gene mã hóa cho CYP264B1 (1257 bp),

AdR (1386 bp), Adx (330 bp) không có điểm đột biến nào (Phụ lục II).

Ngoài ra, trong plasmid pETC4AA, 3 gene mã hóa đƣợc đƣa vào vùng trình tự

tạo dòng và đƣợc sắp xếp theo thứ tự CYP264B1- AdR- Adx. Để sự dịch mã cả 3

gene thực hiện đƣợc, trƣớc trình tự khởi đầu của m i gene (đầu 5‟) đều đƣợc thêm

vào trình tự vùng liên kết ribosome (ribosome binding sites - rbs). Cấu trúc đa gene

trên plasmid pETC4AA đƣợc minh họa trên hình 3.2.

Hình 3.2. Cấu trúc đa gene trên vector pETC4AA

Plasmid này sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli C43(DE3). Dịch biến nạp đƣợc trải trên môi trƣờng LB đặc chứa 100µg/ml ampcillin và đƣợc ủ ở 37oC trong

16 giờ để hình thành những khuẩn lạc đơn. Các khuẩn lạc này s đƣợc sử dụng để

biểu hiện gene và chuyển hóa cơ chất.

3.2 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene

Trong plasmid pETC4AA, 3 gene đƣợc sắp xếp theo thứ tự CYP264B1- AdR-

Adx. Vì vậy, trong phần này chúng tôi chỉ kiểm tra khả năng biểu hiện gene của

CYP264B1 và Adx.

3.2.1 Khả năng i u hi n gene CYP264B1

Quá trình nuôi cấy tế bào E. coli C43DE3 mang plasmid tái tổ hợp pETC4AA

đƣợc mô tả trong phần phƣơng pháp. Sau 24 giờ cảm ứng IPTG, tế bào đƣợc thu

nhận bằng ly tâm 6000 v/p trong 15 phút, sau đó đƣợc rửa và hòa trong đệm Lysis

buffer. Tiếp theo tế bào đƣợc phá vỡ bằng phƣơng pháp siêu âm và ly tâm 20000

v/p trong 30 phút để thu dịch chiết protein thô. Để đo hàm lƣợng CYP264B1, dịch

chiết thô đƣợc bổ sung natri dithionite (1mg/ml) nhằm khử nguyên tử Fe trong nhân

heme, sục khí CO với tốc độ 1 bọt khí/giây trong 30 giây để nguyên tử Fe tạo phức

với CO, sau đó đo phổ hấp thụ UV-Vis của dịch này.

Hình 3.3 thể hiện phổ hấp thụ ánh sáng của dịch chiết thô với đỉnh đặc trƣng

ở 450 nm. Nồng độ của CYP264B1 trong dịch đƣợc xác định theo công thức của

Omura và Sato (1964). Kết quả cho thấy CYP264B1 đƣợc biểu hiện với hàm lƣợng

579 nmol/l môi trƣờng nuôi cấy.

Hình 3.3. Phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng 400-500 nm của dịch chiết tế bào

C43DE3/pETC4AA sau 24 giờ cảm ứng.

Đƣờng kẻ đỏ: Phổ hấp thụ ở lần đo 1

Đƣờng kẻ đen: Phổ hấp thụ ở lần đo 2 sau 30s.

3.2.2 Khả năng i u hi n của Adx

Để kiểm tra khả năng biểu hiện Adx, tế bào sau 24 giờ cảm ứng bằng IPTG

đƣợc thu nhận bằng ly tâm, protein trong tế bào đƣợc giải phóng và biến tính bằng

phƣơng pháp đun sôi trong đệm mẫu chứa SDS và mecarptoethanol nhƣ mô tả trong

phần phƣơng pháp. Protein sau khi đƣợc phân tách trên trên gel polyacrylamide

(Hình 3.4) đƣợc chuyển lên màng lai để kiểm tra phản ứng với kháng thể đặc hiệu

của Adx bằng phƣơng pháp Western blot (hình 3.5).

Kết quả phân tích trên gel polyacrylamide trên hình 3.4 cho thấy mẫu protein

ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy tế bào E. coli C43DE3 mang plasmid

pETC4AA (giếng số1) và từ dịch nuôi cấy tế bào E. coli C43DE3 mang plasmid

pET17b (giếng số 2) đều xuất hiện rất nhiều băng tạo thành dải, băng có kích thƣớc

phân tử dƣới 15 kDa rất mờ, khó phân biệt đƣợc với bên đối chứng. Để kiểm tra

chính xác sự biểu hiện của gen Adx, chúng tôi kiểm tra khả năng liên kết với kháng

thể đặc hiệu kháng Adx bằng kỹ thuật Western blot.

Hình 3.4. Kết quả điện di protein ngoại bào

Giếng 1: Mẫu protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy tế bào E. coli C43DE3

mang plasmid pETC4AA

Giếng 2: Mẫu protein ngoại bào thu từ dịch nuôi cấy tế bào E. coli C43DE3 mang

plasmid pET17b (đối chứng âm)

Giếng 3: Thang protein chuẩn

Kết quả phân tích khả năng liên kết với kháng thể đặc hiệu kháng Adx trên

hình 3.5 cho thấy: ở giếng số 2 (mẫu xử lý với kháng thể Adx của protein ngoại bào

thu đƣợc từ dịch nuôi cấy tế bào C43DE3/pET17b-mẫu đối chứng âm) không xuất

hiện băng nào, trong khi ở đƣờng chạy số 3 (mẫu xứ lý với kháng thể của protein

ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy tế bào C43DE3/pETC4AA) xuất hiện 1 băng

màu đen đặc trƣng, đúng với kích thƣớc của Adx (12 kDa) bắt cặp đặc hiệu với

kháng thể kháng Adx.

Hình 3.5. Phân tích khả năng biểu hiện Adx với kháng thể đặc hiệu bằng kỹ thuật

Western blot

Giếng 1: Thang protein chuẩn của PEQLAB (Erlangen, Germany);

Giếng 2: Mẫu protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy tế bào C43DE3

mang plasmid pET17b (đối chứng âm);

Giếng 3: Mẫu protein ngoại bào thu đƣợc từ dịch nuôi cấy tế bào C43DE3

mang plasmid tái tổ hợp pETC4AA.

3.3 Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone của hệ xúc tác tế bào

C43DE3/CYP264B1 – AdR - Adx

Khả năng chuyển hóa của hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp

C43DE3/CYP264B1-AdR-Adx đƣợc kiểm tra thông qua chuyển hóa nootkatone

(một sesquiterpene keton là chất thơm quan trọng trong tinh dầu họ cam quýt).

Chuyển hóa in vitro bởi CYP264B1 đã đƣợc chỉ ra ở nghiên cứu trƣớc đây. Sản

phẩm chuyển hóa nookatone là 13-hydroxy nootkatone [26].

Để kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone, tế bào C43DE3/pETC4AA và

C43DE3/pET17b đƣợc nuôi biểu hiện và chuyển hóa nhƣ trong phần phƣơng pháp.

Sau 24 giờ, dịch nuôi cấy đƣợc chiết với 2 lần thể tích chloroform. Dịch chiết

chloroform đƣợc làm khô rồi hòa tan trong 1 thể tích acetonitrile và phân tích bằng

HPLC trên cột C18 (Macherey-Nagel CC125/4 Nucleodur 100-5) với hệ dung môi

acetonitrile : H2O (55:45), sử dụng 13-hydroxy-nootkatone làm chuẩn [28]. Kết quả

đƣợc thể hiện trên hình 3.6.

a b

Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC phân tích kết quả chuyển hóa nootkatone

bằng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA

Hình a - Chuyển hóa bằng hệ xúc tác tế bào C43DE3 mang plasmid pET17b

Hình b - Chuyển hóa bằng hệ xúc tác tế bào C43DE3 mang plasmid

pETC4AA.

Kết quả phân tích bằng HPLC cho thấy: Khi chuyển hóa nootkatone bằng hệ

tế bào C43DE3/pET17b (chuyển hóa đối chứng), chỉ thấy xuất hiện sản phẩm phụ

có thời gian lƣu là 3 phút (hình 3.6a), đây có thể là sản phẩm chuyển hóa

nootkatone bởi enzyme oxygenase vốn có trong tế bào E. coli. Ở hệ xúc tác tế bào

C43DE3/pETC4AA thấy xuất hiện thêm sản phẩm mới không quan sát thấy ở

chuyển hóa đối chứng và có thời gian lƣu tƣơng tự với chất chuẩn 13-hydroxy-

nootkatone tinh khiết. Do đó, có thể khẳng định hệ xúc tác tế bào đã chuyển hóa

thành công nootkatone thành 13-hydroxy-nootkatone.

3.4 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ƣu

3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng củ ôi ường lên khả năng ch n h cơ ch t

Các thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng lớn tới sự

sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật cũng nhƣ khả năng tạo enzyme của chúng.

Chẳng hạn pH của môi trƣờng có thể ảnh hƣởng đến tính thấm của màng, hoạt động

chuyển hoá cơ chất, hoạt tính enzyme và sự hình thành ATP. Nguồn dinh dƣỡng

nhƣ carbon, nitơ cũng đƣợc vi sinh vật sử dụng một cách có chọn lọc. Khả năng sử

dụng đối với từng nguồn dinh dƣỡng cũng khác nhau ở các vi sinh vật khác nhau.

Đối với E. coli, nguồn carbon ƣa thích nhất là glucose, nguồn nitơ là protein và các

sản phẩm phân huỷ của protein nhƣ peptone, cao nấm men.

Để hệ xúc tác chuyển hóa cơ chất hiệu quả thì việc nghiên cứu lựa chọn môi

trƣờng nuôi cấy thích hợp là rất cần thiết. Quá trình nuôi cấy tế bào để chuyển hóa

cơ chất có thể đƣợc chia thành 2 giai đoạn: (1) Nuôi cấy tế bào và biểu hiện gene;

(2) Bổ sung và chuyển hóa cơ chất. Giai đoạn 1 cần lựa chọn môi trƣờng tối ƣu để

E. coli có thể phát triển và biểu hiện lƣợng lớn các enzyme cần thiết. Giai đoạn 2

cần lựa chọn môi trƣờng tối ƣu để hệ xúc tác chuyển hóa đƣợc cơ chất nhiều nhất.

Trong nghiên cứu này, ở giai đoạn 1 chúng tôi sử dụng 2 môi trƣờng phổ biến

nhất trong nuôi cấy E. coli là TB và LB. Ở giai đoạn 2, chúng tôi vẫn tiếp tục sử

dụng 2 môi trƣờng TB và LB và bổ sung thêm một môi trƣờng khác thƣờng dùng

trong chuyển hóa cơ chất bởi hệ xúc tác tế bào E. coli là đệm Kpp chứa 4% glycerol

(gọi là KppG), bổ sung 250 µM nootkatone. Sau 24 giờ, dịch nuôi cấy đƣợc chiết

với 2 thể tích chloroform và đem phân tích bằng HPLC.

Kết quả chuyển hóa cơ chất ở 4 điều kiện khác nhau đƣợc thể hiện trên bảng 3.1.

Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng

đến khả năng chuyển hóa cơ chất

Ký hiệu Môi trƣờng Môi trƣờng Nồng độ sản phẩm

biểu hiện chuyển hóa (µM)

LB - LB LB 5 ± 6 LB

LB - KppG LB 30 ± 4 KppG

TB - TB TB 7 ± 3 TB

TB - KppG TB 120 ± 7 KppG

Kết quả trên bảng 3.1 cho thấy: Khi môi trƣờng nuôi cấy biểu hiện và chuyển

hóa cơ chất đều là TB hoặc LB thì lƣợng sản phẩm tạo thành rất nhỏ, không đáng

kể. Khi thay thế môi trƣờng chuyển hóa cơ chất là KppG thì lƣợng sản phẩm tạo ra

tăng lên rõ rệt. Theo Ringle và cộng sự (2012), khi nuôi cấy trong môi trƣờng TB

hoặc LB, enzyme tryptophanase trong E. coli s sử dụng tryptophan để sản sinh ra

indole – một hợp chất thơm dị vòng. Hợp chất này có thể kìm hãm hoạt động của

enzyme cytochrome P450 dẫn đến enzyme không thể chuyển hóa đƣợc cơ chất [37].

Chính vì vậy, trong các nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E. coli tái tổ hợp dựa

trên hệ thống cytochrome P450, ngƣời ta thƣờng không sử dụng môi trƣờng TB và

LB cho giai đoạn chuyển hóa cơ chất. Thay vào đó, ngƣời ta thƣờng sử dụng KppG,

với glycerol là nguồn dinh dƣỡng duy nhất, làm môi trƣờng để thực hiện chuyển

hóa. Trong môi trƣờng này, các tế bào E. coli có xu hƣớng trở về trạng thái nghỉ,

chúng sử dụng glycerol làm nguồn carbon chủ yếu cho hoạt động hô hấp (hình 3.7),

do đó đảm bảo đƣợc việc tái tạo NADPH để cung cấp cho phản ứng của P450 [49].

Nhờ đó, tế bào có khả năng chuyển hóa cơ chất hiệu quả hơn.

Bảng 3.1 cũng cho thấy: Sử dụng môi trƣờng TB ở giai đoạn nuôi cấy biểu

hiện cho lƣợng sản phẩm tạo thành cao hơn hẳn so với môi trƣờng LB (120 µM so

với 30 µM). Lí do là vì khi nuôi cấy trong môi trƣờng TB, các tế bào E.coli phát

triển tốt hơn, thể hiện ở mật độ tế bào cao hơn hẳn so với khi nuôi cấy trong môi

trƣờng LB. Điều này cũng có nghĩa là lƣợng protein đƣợc biểu hiện ở môi trƣờng

TB cao hơn hẳn ở môi trƣờng LB.

Từ khảo sát trên, chúng tôi lựa chọn môi trƣờng TB là môi trƣờng nuôi cấy

biểu hiện và môi trƣờng KppG để chuyển hóa cơ chất cho các thí nghiệm khảo sát

tiếp theo.

3.4.2 Ảnh hưởng của mậ t bào lên khả năng ch n hóa cơ ch t

Nhƣ nghiên cứu ở phần 3.4.1: Tế bào đƣợc nuôi cấy biểu hiện trong môi

trƣờng TB cho mật độ tế bào cao hơn và do đó hiệu quả chuyển hóa cơ chất cũng

tốt hơn nhiều so với môi trƣờng LB. Nhƣ vậy, mật độ tế bào có liên quan mật thiết

tới khả năng chuyển hóa cơ chất. Mật độ tế bào thấp s dẫn tới lƣợng enzyme sản

sinh ra không nhiều vì vậy lƣợng cơ chất đƣợc chuyển hóa cũng thấp. Nếu mật độ tế

bào quá cao cũng có thể làm giảm khả năng chuyển hóa cơ chất do tế bào thiếu hụt

dinh dƣỡng và oxi. Ngoài ra, mật độ tế bào cao cũng dẫn đến sự lãng phí về nguyên

vật liệu nuôi cấy cũng nhƣ nguồn cơ chất đƣa vào. Để xác định mật độ tế bào thích

hợp cho sự chuyển hóa cơ chất, chúng tôi sử dụng môi trƣờng TB để nuôi cấy biểu

hiện, sau 24 giờ cảm ứng, tế bào đƣợc thu nhận bằng ly tâm và chuyển sang môi

trƣờng KppG với các mật độ khác nhau (10 g/l, 15 g/l, 20 g/l, 25 g/l) để chuyển hóa

cơ chất. Quá trình chuyển hóa cơ chất đƣợc thực hiện trong máy lắc ổn nhiệt ở điều kiện 30oC, 200 v/p, 250 µM nootkatone. Sau 24 giờ, dịch nuôi cấy đƣợc chiết với 2

thể tích chloroform và đem phân tích bằng HPLC.

Kết quả khảo sát đƣợc trình bày ở bảng 3.2. M i thí nghiệm đƣợc lặp lại 3

lần. Giá trị biểu diễn trên đồ thị là giá trị trung bình thu đƣợc từ 3 lần thực hiện

khác nhau.

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của mật độ tế bào

đến khả năng chuyển hóa cơ chất

Mật độ tế bào (g/l) 10 15 20 25

Nồng độ sản phẩm (µM) 50 ± 5 110 ± 2 169 ± 4 165 ± 7

Kết quả cho thấy:

Giai đoạn đầu, nồng độ sản phẩm tạo thành tăng khi mật độ tế bào tăng. Cụ

thể: với mật độ tế bào là 10 g/l, 15 g/l và 20 g/l thì lƣợng sản phẩm tạo thành tƣơng

ứng là 50 µM; 110 µM và 169 µM. Tuy nhiên, nồng sản phẩm tạo thành chỉ đạt cao

nhất là 169 µM khi mật độ tế bào đạt 20 g/l. Tiếp tục tăng mật độ tế bào lên 25 g/l

thì nồng độ sản phẩm lại có xu thế giảm. Nhƣ vây, trong thí nghiệm này, mật độ tế

bào thích hợp nhất để chuyển hóa nootkatone là 20 g/l. Chúng tôi sử dụng mật độ

này cho các thí nghiệm khảo sát tiếp theo.

3.4.3 Ảnh hưởng của nhi n khả năng ch n hóa cơ ch t

Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng chuyển hóa cơ chất thể hiện ở 2 mặt:

(1) ảnh hƣởng đến khả năng biểu hiện protein/enzyme và (2) ảnh hƣởng đến hoạt

động xúc tác chuyển hóa cơ chất của enzyme đó.

Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng và phát triển của vi

sinh vật cũng nhƣ hoạt động xúc tác của các enzyme trong vi sinh vật đó. Về khía

cạnh enzyme học, m i một enzyme hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ tối ƣu nhất định. Ở

nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ƣu: khi nhiệt độ tăng, động năng của enzyme và cơ

chất tăng làm chúng chuyển động nhanh hơn và va chạm nhiều hơn, các phức

emzyme-cơ chất hình thành nhiều hơn, do đó phản ứng xảy ra nhanh hơn. Tuy

nhiên, nếu nhiệt độ quá cao, enzyme bị biến tính mất đi cấu hình phù hợp với cơ

chất dẫn đến mất hoạt tính xúc tác. Về khía cạnh vi sinh vật, các vi sinh vật thƣờng

là các sinh vật đơn bào nên chúng thƣờng rất mẫn cảm với sự biến đổi của nhiệt độ

trong phạm vi nhiệt độ thấp, các phản ứng xúc tác nhờ enzyme s tăng khi nhiệt độ

tăng, do đó hoạt động trao đổi chất s tăng lên và vi sinh vật s sinh trƣởng nhanh

hơn. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng lên đến một mức độ nhất định thì nhiệt độ càng

tăng, hoạt động xúc tác của các enzyme trong tế bào giảm dẫn đến tốc độ sinh

trƣởng của vi sinh vật giảm.

Mặt khác, khả năng biểu hiện protein ngoại lai trong tế bào dị chủng

(heterologous host) có sự khác biệt rất lớn so trong các tế bào tự nhiên của protein

đó. Ngoài nguyên nhân do sự khác nhau về mặt khả năng mã (codon usage) giữa tế

bào dị chủng và tế bào tự nhiên thì môi trƣờng nội bào chính là yếu tố có ảnh hƣởng

lớn đến khả năng biểu hiện protein. Trong tế bào dị chủng, môi trƣờng nội bào khác

nhau (chẳng hạn pH, áp suất thẩm thấu), nên sự tƣơng tác với môi trƣờng và cơ chế

cuộn xoắn sau dịch mã thay đổi làm thay đổi mức độ biểu hiện của protein. Chính

vì vậy, thông thƣờng khi biểu hiện protein, ngƣời ta thƣờng giảm nhiệt độ nuôi cấy tế bào xuống dƣới nhiệt độ tối ƣu cho vi sinh vật phát triển, chẳng hạn dƣới 37οC

đối với nuôi cấy E. coli. Giải pháp này có tác dụng làm tăng khả năng cuộn xoắn

chính xác của protein ngoại lai, giảm sự tác động phân hủy của các protease nội bào

do đó làm tăng mức độ biểu hiện protein [40], [38], [48].

Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.3. M i thí nghiệm đƣợc lặp

lại 3 lần. Giá trị biểu diễn trên đồ thị là giá trị trung bình thu đƣợc từ 3 lần thực

hiện khác nhau.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ

đến khả năng chuyển hóa cơ chất

Nhiệt độ (oC) 25 30 37

Nồng độ sản phẩm (µM) 100 ± 5 170 ± 7 85 ± 3

Kết quả trên bảng cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về nồng độ sản phẩm ở các nhiệt độ khác nhau. Ở nhiệt độ 25oC, nồng độ sản phẩm chỉ đạt 100 µM nhƣng khi tăng nhiệt độ lên 30oC thì nồng độ sản phẩm đạt 170 µM. Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ lên 37oC thì khả năng chuyển hóa cơ chất giảm xuống, nồng độ sản phẩm là 85 µM. Nhƣ vậy, trong các nhiệt độ thử nghiệm, 30oC là nhiệt độ tối ƣu nhất cho

chuyển hóa nootkatone của hệ xúc tác tế bào E.coli C43DE3/pETC4AA

3.4.4 Ảnh hưởng của t c lắc n khả năng ch n hóa cơ ch t

Một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và

phát triển của vi sinh vật là oxy. E. coli là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, nó có thể

hô hấp hiếu khí khi có mặt oxi. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng trong quá

trình tạo sinh khối, sự thông khí có ảnh hƣởng đang kể đến hàm lƣợng và hiệu suất

tạo sinh khối. Tuy nhiên hàm lƣợng oxi hòa tan trong nƣớc thƣờng rất ít. Do đó,

trong quá trình nuôi cấy cần cung cấp lƣợng oxy phù hợp sao cho tốc độ hòa tan nó

bằng tốc độ tiêu thụ của vi sinh vật. Tốc độ lắc ảnh hƣởng tới khả năng cung cấp

oxi cho tế bào E.coli vì quá trình lắc chính là quá trình thông khí. Khi tăng cƣờng

cung cấp oxy thì mật độ tế bào s tăng theo. Do đó, làm tăng lƣợng protein đƣợc

biểu hiện. Ngoài ra, tốc độ lắc còn ảnh hƣởng tới sự tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào,

do đó ảnh hƣởng đến khả năng chuyển hóa cơ chất. Vì vậy, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu ảnh hƣởng của tốc độ lắc đến khả năng chuyển hóa cơ chất.

Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện trên bảng 3.4. M i thí nghiệm đƣợc lặp lại

3 lần. Giá trị biểu diễn trên đồ thị là giá trị trung bình thu đƣợc từ 3 lần thực

hiện khác nhau.

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ lắc

đến khả năng chuyển hóa cơ chất

Tốc độ lắc (v/p) 100 120 150 180 200

Nồng độ sản phẩm (µM) 90 ± 7 130 ± 3 150 ± 5 190 ± 7 170 ± 4

Nhìn vào bảng số liệu ta thấy, nồng độ sản phẩm có sự khác biệt rõ rệt khi

tăng dần tốc độ lắc. Cụ thể, khi nuôi lắc ở 100 v/p nồng độ sản phẩm tạo thành chỉ

đạt 90 µM, nhƣng khi tăng tốc độ lắc lên 120 v/p và 150 v/p thì nồng độ sản phẩm

tăng lên 130 µM và 150 µM. Tiếp tục tăng tốc độ lắc lên 180 v/p thì thấy nồng độ

sản phẩm tăng đáng kể và đạt 190 µM. Tuy nhiên, khi tăng tốc độ lên 200 v/p thì

nồng độ sản phẩm giảm dần xuống 170 µM. Điều đó chứng tỏ, khi tốc độ lắc quá

cao s làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của E.coli. Từ kết quả trên

cho thấy tốc độ lắc lý tƣởng nhất cho quá trình chuyển hóa nootkatone là 180 v/p.

3.4.5 L a chọn nồng cơ ch t thích h chuy n hóa

Để có thể sử dụng hệ xúc tác một cách hiệu quả và kinh tế thì việc lựa chọn

nồng độ cơ chất thích hợp là rất cần thiết. Đối với một lƣợng sinh khối tế bào nhất

định, nồng độ cơ chất tối ƣu là nồng độ cơ chất bổ sung vào thấp nhất nhƣng lƣợng

sản phẩm tạo ra nhiều nhất.

Trong thí nghiệm này chúng tôi khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đƣa

vào đối với hiệu quả chuyển hóa. Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau: Sau 24 giờ

cảm ứng biểu hiện bằng 1 mM IPTG trong môi trƣờng TB, tế bào đƣợc thu nhận

bằng ly tâm và chuyển sang môi trƣờng KppG sao cho mật độ tế bào đạt 20 g/l có bổ sung cơ chất với các nồng độ khác nhau và tiến hành chuyển hóa ở 30οC trong

24 giờ tiếp theo. Môi trƣờng chuyển hóa đƣợc chiết bằng 2 lần thể tích chloroform

và đem đi phân tích HPLC.

Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.5. M i thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Giá trị

biểu diễn trên đồ thị là giá trị trung bình thu đƣợc từ 3 lần thực hiện khác nhau.

Bảng 3.5. Kết quả lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp để chuyển hóa

Nồng độ cơ chất Nồng độ sản phẩm tạo Hiệu suất chuyển hóa

đƣa vào (µM) thành (µM) (%)

100 60 ± 2 60 ± 2

150 97 ± 7 64,67 ± 4,67

200 170 ± 5 85 ± 2,5

250 193 ± 3 77,2 ± 1,2

300 191 ± 7 63,67 ± 2,33

350 195 ± 6 55,71 ± 1,71

Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy: Khi nồng độ cơ chất đƣa vào còn ở mức thấp, thì

nồng độ sản phẩm tăng khi nồng độ cơ chất tăng. Cụ thể: ở nồng độ cơ chất ban đầu

là 100 µM, nồng độ sản phẩm chỉ đạt 60 µM, khi tăng nồng độ cơ chất ban đầu lên

150 và 200 µM thì nồng độ sản phẩm cũng tăng rõ rệt đạt 97 và 170 µM. Điều này

chứng tỏ khi nồng độ cơ chất đƣa vào là 200 µM thì vẫn còn nhiều enzyme trong tế

bào chƣa tiếp xúc đƣợc với cơ chất. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất

đƣa vào lên 250, 300 và 350 µM, chúng tôi nhận thấy nồng độ cơ chất chuyển hóa

tăng với một lƣợng không đáng kể và gần nhƣ bão hòa (193; 191; 195 µM). Lƣợng

sản phẩm tạo thành đạt mốc cao nhất khi nồng độ cơ chất đƣa vào là 250 µM.

Tuy nhiên, khi so sánh hiệu quả chuyển hóa thì chúng tôi thấy rằng hiệu quả

chuyển hóa tốt nhất ở nồng độ cơ chất đƣa vào là 200 µM. Vì vậy, chúng tôi chọn

nồng độ này làm nồng độ chuyển hóa tối ƣu.

Từ những kết quả khảo sát trên, chúng tôi chọn điều kiện để chuyển hóa các

cơ chất tiếp theo là: Môi trƣờng biểu hiện: TB; môi trƣờng chuyển hóa cơ chất: KppG; mật độ tế bào: 20 g/l; nhiệt độ biểu hiện và chuyển hóa cơ chất: 30οC; tốc độ

lắc: 180 v/p; nồng độ cơ chất đƣa vào: 200 µM.

3.5 Sử dụng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA để chuyển hóa một số hợp

chất sesquiterpene

Trong phần này chúng tôi sử dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa 2 hợp chất

sesquiterpenes là longipinene và isolongifolene. Đây là 2 sesquiterpene có và hoạt

tính chống oxi hóa, kháng khuẩn [18], [12].

Hình 3.8. Cấu trúc của longipinene và isolongifolene

Quá trình chuyển hóa đƣợc thực hiện nhƣ điều kiện đã tối ƣu ở trên: Tế bào C43DE3/pETC4AA đƣợc nuôi lắc trong môi trƣờng TB lỏng ở 37οC cho đến khi = 1 thì bổ sung 1mM IPTG và hạ nhiệt độ mật độ quang của dịch nuôi cấy OD600 nm nuôi cấy xuống 30οC. Sau 24 giờ, tế bào đƣợc thu nhận bằng ly tâm và chuyển sang

môi trƣờng KppG sao cho mật độ tế bào đạt 20 g/l, bổ sung 200 µM cơ chất và tiếp

tục lắc trong 24 giờ tiếp theo. Sau đó, môi trƣờng chuyển hóa đƣợc chiết bằng 2 lần

thể tích chloroform và đem đi phân tích GCMS.

Trong những thí nghiệm đầu tiên khi sử dụng hệ xúc tác với các điều kiện tối

ƣu đã xác định ở trên, chúng tôi không phát hiện thấy sản phẩm chuyển hóa. Đồng

thời, kết quả phân tích dịch chiết môi trƣờng sau 24 giờ chuyển hóa cũng không thể

hiện sự có mặt của các cơ chất đƣa vào (longipinene; isologifolene). Phân tích

nguyên nhân, chúng tôi nhận thấy cả longipinene và isologifolene đều là

sesquiterpenes hydrocacbon nên rất dễ bay hơi. Chính vì vậy trong quá trình lắc, các

hợp chất này thoát khỏi môi trƣờng nuôi cấy và không thể tiếp xúc đƣợc với hệ xúc

tác tế bào. Do đó, một câu hỏi đƣợc đặt ra là: làm thế nào để ngăn chặn quá trình

bay hơi của các sesquiterpenes và tăng cƣờng sự tiếp xúc của chúng với hệ xúc tác

tế bào? Qua tham khảo các nghiên cứu trên thế giới, chúng tôi nhận thấy có thể sử

dụng cyclodextrin để giải quyết vấn đề này [41], [42].

Cyclodextrin (CDs) đã đƣợc biết đến từ lâu nhƣ một chất làm tăng khả năng di

chuyển qua màng sinh học của các hợp chất kém tan [30]. Chúng không chỉ đƣợc sử

dụng làm chất vận chuyển thuốc mà còn đƣợc sử dụng trong các chuyển hóa sinh

học nhờ vào tính “thân thiện” của chúng với vi sinh vật [42]. Chẳng hạn, khi có mặt

của cyclodextrin, chuyển hóa cholesterol thành androst-4-ene-3,17-dione bởi

Saccharomyces cerevisiae có thể tăng tới 90% [5]. Sở dĩ cyclodextrin có tính chất

thú vị này là do chúng có cấu trúc rất đặt biệt. Cyclodextrin là hợp chất đƣợc tạo

thành từ các phân tử đƣờng liên kết với nhau tạo thành cấu trúc vòng (vòng

oligosaccharides). Các đơn vị -D, glucosyl liên kết với nhau theo liên kết 1 → 4

tạo thành hình nón cụt [43], [21].

Một cyclodextrin điển hình đƣợc tạo thành bởi 6-8 đơn vị đƣờng. Mặt trong

của cyclodextrin k m ƣa nƣớc nên có thể giữ đƣợc các gốc không phân cực có kích

thƣớc thích hợp trong khoang mà không có sự hình thành hay xáo trộn các liên kết

hóa trị. Ngƣợc lại, mặt ngoài của cyclodextrin có độ ƣa nƣớc đủ để làm cho chúng

và các phức hợp của chúng có thể tan đƣợc trong nƣớc [32]. Trong số các loại

cyclodextrin khác nhau, hydroxypropyl-β-cyclodextrin có hiệu quả nhất để tăng cƣờng chuyển hóa sinh học [41], [27]. Do đó, chúng tôi sử dụng hợp chất này để trợ

giúp hệ xúc tác tế bào trong việc chuyển hóa các hợp chất sesquiterpene.

Nồng độ cyclodextrin ban đầu chúng tôi sử dụng cho chuyển hóa là 1% [30].

Cơ chất và cyclodextrin đƣợc hòa vào đệm KppG và lắc trong 1 giờ trƣớc khi đƣợc bổ sung vào môi trƣờng chuyển hóa.

3.5.1 K t quả chuy n hóa longipinene

Chuyển hóa longipinene đƣợc thực hiện theo những điều kiện đã xác định ở trên. Sau 24 giờ chuyển hóa, môi trƣờng chuyển hóa đƣợc chiết với 2 thể tích ethyl

acetate và đem đi phân tích bằng GC-MS. Kết quả đƣợc trình bày trên hình 3.9.

b a

d c

Hình 3.9. Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa longipinene

Hình a: Sắc ký đồ GCMS của longipinene tinh khiết

Hình b: Sắc ký đồ GCMS của chuyển hóa longipinene in vitro bởi hệ thống

CYP264B1(Sản phẩm chuyển hóa in vitro đƣợc cung cấp bởi Phòng Sinh hóa thực vật)

Hình c: Sắc ký đồ GCMS của chuyển hóa longipinene in vivo bởi E. coli C43DE3/pET17b

Hình d: Sắc ký đồ GCMS của chuyển hóa longipinene in vivo bởi E. coli

C43DE3/pETC4AA

Kết quả trên cho thấy longipinene có thời gian lƣu là 10,35 phút (hình 3.9a).

Chuyển hóa longipinene in vitro bởi CYP264B1 cho sản phẩm duy nhất có thời

gian lƣu là 13,85 phút (hình 3.9b). Khi đƣa longipinene vào môi trƣờng KppG của

C43DE3/pET17b thì không thấy xuất hiện sản phẩm có thời gia lƣu 13,85 phút

(hình 3.9c). Ngƣợc lại, sản phẩm này lại xuất hiện trong môi trƣờng KppG của

C43DE3/pETC4AA sau khi bổ sung cơ chất (hình 3.9d). Điều này chứng tỏ

longipinene đã đƣợc chuyển hóa bởi hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA.

3 5 K ả ch n h i ngifolene

Chuyển hóa isolongifolene đƣợc thực hiện theo những điều kiện đã xác

định ở mục 3.4. Sau 24 giờ chuyển hóa, môi trƣờng chuyển hóa đƣợc chiết với

2 thể tích ethyl acetate và đem đi phân tích bằng GC-MS. Kết quả đƣợc trình

bày trên hình 3.10.

a b

c d

Hình 3.10. Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa isolongifolene

Hình 3.10a: Sắc ký đồ GCMS của isolongifolene tinh khiết

Hình 3.10b. Sắc ký đồ GCMS của kết quả chuyển hóa isolongifolene in vitro bởi hệ thống

CYP264B1(Sản phẩm chuyển hóa in vitro đƣợc cung cấp bởi Phòng Sinh hóa

thực vật)

Hình 310c: Sắc ký đồ GCMS của chuyển hóa isolongipinene in vivo bởi E. coli

C43DE3/pET17b

Hình 3.10d. Sắc ký đồ GCMS của kết quả chuyển hóa longipinene in vivo bởi E. coli

C43DE3/pETC4AA

Kết quả cho thấy isolongifolene có thời gian lƣu là 10,87 phút (hình 3.10a). Chuyển hóa isolongifolene in vitro bởi CYP264B1 cho sản phẩm duy nhất có thời

gian lƣu là 13,57 phút (hình 3.10b). Khi đƣa isolongifolene vào môi trƣờng KppG

của C43DE3/pET17b thì không thấy xuất hiện sản phẩm có thời gian lƣu 13,57 phút

(hình 3.10c). Tuy nhiên, sản phẩm này lại xuất hiện trong môi trƣờng KppG của C43DE3/pETC4AA sau khi bổ sung isolongifolene (hình 3.10d). Điều này chứng tỏ

isolongifolene đã đƣợc chuyển hóa bởi hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA.

3 5 3 Tinh ạch v nhận ạng ản hẩ ch n h

Để có lƣợng sản phẩm chuyển hóa đủ để gửi đi nhận dạng bằng NMR, chuyển

hóa longipinene và isolongifolene đƣợc thực hiện trong 1 lít môi trƣờng KppG với

nồng độ cơ chất là 200 µM (tƣơng đƣơng với 40,8 mg). Sau chuyển hóa, môi

trƣờng đƣợc chiết bằng 2 thể tích ethyl acetate và cô đặc bằng máy hút chân không

nhƣ mô tả ở phần phƣơng pháp. Sản phẩm cô đặc (3 ml) đƣợc đƣa lên cột silicagel

để phân tách với hệ dung môi n-hexan : ethyl acetate (95:5). Các phân đoạn đƣợc

kiểm tra bằng phƣơng pháp TLC với mẫu đối chứng là sản phẩm chuyển hóa in

vitro cơ chất đó bởi CYP264B1. Các phân đoạn chứa sản phẩm đƣợc tập hợp lại và

kiểm tra độ tinh sạch bằng phƣơng pháp GCMS. Sản phẩm, sau đó đƣợc cô đặc lại

bằng máy cô quay chân không trƣớc khi gửi phân tích bằng phƣơng pháp NMR.

Kết quả kiểm tra sản phẩm tinh sạch của longipinene và isolongipine bằng

GCMS đƣợc thể hiện trên hình 3.11 và 3.12.

a b

Hình 3.11. Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa longipinene (a)

và cấu trúc dự đoán bởi GCMS (b)

a b

Hình 3.12. Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa isolongifolene (a)

và cấu trúc dự đoán bởi GCMS (b)

Kết quả trên hình 3.11 cho thấy: Sản phẩm chuyển hóa longipinene có độ tinh sạch cao (hình 3.11a). Khi so sánh với thƣ viện phổ khối NIST 2.0 (National

Institute of Standards and Technology), sản phẩm này có độ tƣơng đồng cao nhất (63%) với chất có công thức phân tử là C15H24O, và có tên là 2-(4a,8-Dimethyl- 1,2,3,4,4a,5,6,7-octahydro-naphthalene-2γ)1-prop-2-en-1-ol, có cấu trúc phân tử

đƣợc minh họa trên hình 3.11b).

Kết quả trên hình 3.12 cho thấy: Sản phẩm chuyển hóa isolongifolene có độ

tinh sạch cao (hình 3.12a). Khi so sánh với thƣ viện phổ khối NIST 2.0, sản phẩm này có độ tƣơng đồng cao nhất (89%) với chất có công thức phân tử là C15H24O và có tên là 9-hydroxy-isolongifolen, cấu trúc phân tử đƣợc minh họa trên hình 3.12b).

Từ 1 lít môi trƣờng chuyển hóa longipinene, chúng tôi thu dƣợc 11mg sản

phẩm sau tinh sạch. Sản phẩm này đã đƣợc gửi đi phân tích cấu trúc bằng phƣơng

pháp NMR. Kết quả phân tích cho thấy, sản phẩm này là 15 hydroxy-longipinene,

có cấu trúc phân tử đƣợc minh họa trên hình 3.13.

Hình 3.13. Cấu trúc phân tử của 15-hydroxy longipinene

Đối với chuyển hóa isolongifolene, lƣợng sản phẩm thu đƣợc sau tinh sạch

chƣa đủ để phân tích bằng NMR (dƣới 1 mg). Nguyên nhân là do quá trình tinh sạch chƣa tối ƣu, dẫn đến lƣợng sản phẩm bị mất nhiều sau quá trình này. Hiện nay,

chúng tôi vẫn đang tiến hành tinh sạch để nhận dạng sản phẩm chuyển hóa

isolongifolene bằng NMR.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

KẾT LUẬN

Qua các thí nghiệm đƣợc trình bày ở trên, đề tài rút ra một số kết luận sau:

1. Điều kiện để hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA hoạt động tối ƣu

- Môi trƣờng biểu hiện: TB

- Môi trƣờng chuyển hóa: KppG

- Mật độ tế bào: 20 g/l - Nhiệt độ biểu hiện và chuyển hóa cơ chất: 30oC

- Tốc độ lắc: 180 v/p

- Nồng độ cơ chất: 200 µM

2. Sử dụng thành công hệ xúc tác tế bào E.coli C43DE3/pETC4AA để chuyển

hóa 2 hợp chất sesquiterpenes là longipinene và isolongifolene. Kết quả

chuyển hóa cả 2 hợp chất này cho thấy chúng đều đƣợc chuyển hóa thành 1

sản phẩm duy nhất.

3. Tinh sạch và xác định đƣợc cấu trúc sản phẩm chuyển hóa của longipinene bằng

phƣơng pháp NMR, sản phẩm có công thức phân tử là C15H24O và đƣợc nhận dạng là 15-OH-longipinene.

4. Đã tinh sạch sản phẩm chuyển hóa của isolongifolene, sản phẩm này có độ tƣơng

đồng cao nhất (89%) với 9-hydoxy isolongifolene, có công thức phân tử

C15H24O. Sản phẩm này hiện nay vẫn đang tiếp tục đƣợc chuyển hóa và tinh sạch để gửi đi phân tích bằng phƣơng pháp NMR.

ĐỀ NGHỊ

1. Tiếp tục tinh sạch để nhận dạng sản phẩm chuyển hóa isolongifolene.

2. Chúng tôi gợi ý thêm một số sesquiterpene thú vị có hàm lƣợng cao và hoạt tính

dƣợc học trong tinh dầu để chuyển hóa bằng hệ xúc tác tế bào

C43DE3/pETC4AA nhƣ: caryophyllene (chiếm 19,22% trong tinh dầu lá ngải

cứu); selinene (chiếm 68,54% trong tinh dầu lá cúc tần); curcumen có trong dầu

nghệ, có tác dụng diệt khuẩn, làm vết thƣơng chóng thành sẹo, chữa loét tá tràng;

zingiberen là thành phần chủ yếu trong dầu gừng.

3. Đánh giá và so sánh hoạt tính sinh học của sesquiterpene và sản phẩm chuyển

hóa của chúng qua khả năng chống ô xi hóa, kháng viêm, kháng khuẩn…

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

1. Đào Hùng Cƣờng và Huỳnh Thị Thanh Hƣơng (2009), “Nghiên cứu xác định

thành phần terpenoid trong tinh dầu rái Đại Lộc – Quảng Nam”, Tạp ch hoa học

và Công nghệ, Đại học Đà Nẵng 6(35).

2. Nguyễn Thị Ngọc Dao (2011), Cytochrome – P450, NXB Khoa học tự nhiên và

Công nghệ Hà Nội, 17-41, 167-185.

3. Nguyễn Thị Ngọc Dao, Đái Duy Ban, Nguyễn Thị Bích Nhi (1985), “Tách chiết

và làm sạch một phần cytochrome P450”, Báo cáo nghiên cứu khoa học – Trung

tâm Sinh lý Hóa sinh Người và Động vật – Viện Khoa học Việt Nam 1975-1985, Hà

Nội, 370-374.

4. Nguyễn Văn Tuyến, Trần Văn Lộc, Nguyễn Đức Vinh, Đặng Thị Tuyết Anh và

Trần Văn Sung (2012), “Nghiên cứu tổng hợp sesquitecpen lacton mới thuộc khung

pseudoguainolide với hệ vòng -lacton và -metyl”, Tạp chí Hóa học 50 (4B):83-86

Tài liệu tiếng anh

5. Bar R (1989), “Cyclodextrin aided bioconversions and fermentations”, Trends Biotechnol. 7:2– 4 6. Bernhardt R (1996), “Cytochrome P450 : structure, function, and generation of

reative oxygen species”, Rev Physiol Biochem Pharmacol, 127, pp, 137-221.

7. Bernhardt R (2006), “Cytochromes P450 as versatile biocatalysts”, J

Biotechnol.124:128-145

8. Chu SS, Jiang GH, Liu ZL (2011), Insecticidal compounds from the essential oil

of Chinese medicinal herb Atractylodes chinensis, Pest Manag Sci. 67:1253-1257.

9. Denisov IG, Makris TM, Sligar SG, and Schlichting I (2005), “Structure and

chemistry of cytochrome P450”, Chem Rev 105:2253–2278.

10. Ewen KM, Hannemann F, Khatri Y, Perlova O, Kappl R, Krug D, Hüttermann

J, Müller R, Bernhardt R (2009), “Genome mining in Sorangium cellulosum So

ce56: identification and characterization of the homologous electron transfer

proteins of a myxobacterial cytochrome P450”, J Biol Chem 284:28590–28598

11. Fraga BM (2006), “Natural sesquiterpenoids”, Nat Prod Rep 23:943–72.

12. Gabriela Paun, Saadia Zrira, Amale Boutakiout, Oana Ungureanu, Demetra

Simion, Ciprian Chelaru and Gabriel Lucian Radu (2013), “Chemical composition,

antioxidant and antibacterial activity of essential oils from moroccan aromatic

herbs”, Rev. Roum. Chim., 58(11-12), 891-897.

13. Hannemann F, Bichet A, Ewen KM, Bernhardt R. (2007), “Cytochrome P450

systems-biological variations of electron transport chains”, Biochim Biophys Acta,

1770(3):330-44.

14. Imai M, Shimada H, Watanabe Y, Matsushima-Hibiya Y, Makino R, Koga H,

Horiuchi T. and Ishimura Y (1989), “Uncoupling of the cytochrome P-450cam

monooxygenase reaction by a single”, Proc Natl Acad Sci USA 86:7823–7827.

15. Jörg Degenhardt, Tobias G. Köllner, Jonathan Gershenzon (2009),

Monoterpene and sesquiterpene synthases and the origin of terpene skeletal

diversity in plants, Phytochemistry, 1621-1637.

16. Khatri Y, Hannemann F, Perlova O, Müller R, Bernhardt R (2011),

“Investigation of cytochromes P450 in myxobacteria: excavation of cytochromes

P450 from the genome of Sorangium cellulosum So ce56”, FEBS Lett, 585:1506–

1513.

17. Kimata Y, Shimada H, Hirose T, Ishimura Y (1995), “Role of Thr-252 in

cytochrome P450cam: a study with unnatural amino acid mutagenesis”, Biochem

Biophys Res Commun 208:96–102.

18. Kowsalya Rangasamy and Elangovan Namasivayam (2014), “In vitro

Antioxidant and Free Radical Scavengin Activity of Isolongifolene”, Asian Journal

of Biological Science. Doi: 10.3923/ajbs.2014

19. Laemmli UK (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of

the head of bacteriophage T4”, Nature, 1970;227:680–5.

20. Lamb DC, Lei L, Warrilow AG, Lepesheva GI, Mullins JG, Waterman MR and

Kelly SL (2009), “The first virally encoded cytochrome P450”, J Virol 83:8266–

8269.

21. Larsen KL (2002), “Large cyclodextrins”, J Inclusion Phenom Macro 43:1–13.

22. Legault J and Pichette A (2007), “Potentiating effect of beta-caryophyllene on

anticancer activity of alpha-humulene, isocaryophyllene and paclitaxel”, J Pharm

Pharmacol 59(12):1643-7.

23. Liu Q, Majdi M, Cankar K, Goedbloed M, Charnikhova T, Verstappen FW, de

Vos RC, Beekwilder J, van der Krol S, Bouwmeester HJ (2011), “Reconstitution of

the costunolide biosynthetic pathway in yeast and Nicotiana benthamiana”, PLoS

One 6(8):e23255.

24. Loeber DE, Russell SW, Toube TP, Weedon BCL, and Diment J (1971),

“Carotenoids and related compounds. Part XXVIII. Syntheses of zeaxanthin, β-

cryptoxanthin, and zeinoxanthin ( -cryptoxanthin)”, J Chem Soc 404–408.

25. Luo DQ, Wang F, Bian XY, Liu JK (2005), “Rufuslactone, a New Antifungal

Sesquiterpene from the Fruiting Bodies of the Basidiomycete Lactarius rufus”, J.

Antibiot. 58(7): 456-459.

26. Ly TT, Khatri Y, Zapp J, Hutter MC, Bernhardt R (2012), “CYP264B1 from

Sorangium cellulosum So ce56: a fascinating norisoprenoid and sesquiterpene

hydroxylase”. Appl Microbiol Biotechnol 95(1):123-33.

27. Mahato SB, Garai S (1997), Advances in microbial steroid biotransformation,

Steroids 62:332–45.

28. Mansuy D (1998), The great diversity of reactions catalyzed by cytochromes

P450, Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol Endocrinol 121:5–14

29. Martinis SA, Atkins WM, Stayton PS, Sligar SG (1989), “A conserved residue

of cytochrome P450 is involved in heme-oxygen stability and activation”, J Am

Chem Soc 111:9252–9253.

30. Másson M, Loftssona T , Mássonb G, Stefánsson E (1999), “Cyclodextrins as

permeation enhancers: some theoretical evaluations and in vitro testing”, Journal of

Controlled Release 59:107–118.

31. McGarvey DJ and Croteau R (1995), Terpenoid Metabolism, The Plant Cell

7:1015–1026.

32. Munoz-Botella S, del Castillo B, Martin MA (1995), Cyclodetrin properties

and applications of inclusion complex formation, Ars Pharm 36:187–98

33. Nelson D.R. (2009), The cytochroem P450 homepage, Hum Genomics, 4(1),

pp, 59-65.

34. Nonaka Y, Murakami H, Yabusaki Y, Kuramitsu S, Kagamiyama H, Yamano

T, Okamoto M (1987), Molecular cloning and sequence analysis of full-length

cDNA for mRNA of adrenodoxin oxidoreductase from bovine adrenal cortex,

Biochem Biophys Res Commun. 1987 Jun 30;145(3):1239-47.

35. Omura T and Sato R (1964), “The Carbon Monoxide-Binding Pigment of Liver

Microsomes”, Ii. Solubilization, Purification, and Properties. J Biol Chem

239:2379–85.

36. Pylypenko O, Schlichting I (2004), “Structural aspects of ligand binding to and

electron transfer in bacterial and fungal P450s”, Annu Rev Biochem 73:991–1018.

37. Ringle M, Khatri Y, Zapp J, Hannemann F, Bernhardt R. (2012), “Application

of a new versatile electron transfer system for cytochrome P450-based Escherichia

coli whole-cell bioconversions”, Appl Microbiol Biotechnol. 2012 Dec 20.

38. Sahdev S, Khattar SK, and Saini KS (2008), Production of active eukaryotic

proteins through bacterial expression systems: A review of the existing

biotechnology strategies, Mol Cell Biochem 307:249–264.

39. Sakaki T (2012), Practical Application of Cytochrome P450 Biol, Pharm. Bull.

35(6) 844–849.

40. Shirano Y and Shibata D (1990), Low temperature cultivation of Escherichia

coli carrying a rice lipoxygenase L-2 cDNA produces a soluble and active enzyme

at a high level, FEBS Lett 271:128–130.

41. Singer Y, Shity H, and Bar R (1991), Microbial transformations in a

cyclodextrin medium. Part 2. Reduction of androstenedione to testosterone by

Saccharomyces cerevisiae. Appi Microbiol Biotechnol 35:731–737.

42. Singh M, Sharma R, Banerjee UC (2002), Biotechnological applications of

cyclodextrins, Biotechnology Advances 20:341–359.

43. Szejtli J (1998), “Introduction and General Overview of Cyclodextrin

Chemistry”, Chem Rev 98:1743–1753.

44. Takahashi S, Yeo YS, Zhao Y, O'Maille PE, Greenhagene BT, Noel JP, Coates

RM, Chappell J. (2007), “Functional characterization of premnaspirodiene

oxygenease, a cytochrome P450 catalyzing regio- and stereo-specific

hydroxylations of diverse sesquiterpene substrates”. J Biol Chem. 282(43):31744-

54.

45. Urlacher VB, Lutz-Wahl S, Schmid RD (2004), “Microbial P450 enzymes

in biotechnology”, Appl Microbiol Biotechnol 64:317–325.

46. Urlacher VB, Girhard M (2012), Cytochrome P450 monooxygenases: an update

on perspectives for synthetic application, Trends Biotechnol. 30(1):26-36.

47. Urlacher VB, Makhsumkhanov A, Schmid RD (2006), Biotransformation of

beta-ionone by engineered cytochrome P450 BM-3, Appl Microbiol Biotechnol

70:53–9.

48. Volonte F, Marinelli F, Gastaldo L, Sacchi S, Pilone MS, Pollegioni L, and

Molla G (2008), Optimization of glutaryl-7- aminocephalosporanic acid acylase

expression in E.coli, Protein Expr Purif 61:131–137.

49. Walton AZ, Stewart JD (2004), Understanding and Improving NADPH-

Dependent Reactions by NongrowingEscherichia coliCells, Biotechnol Prog.

2004;20:403–11.

50. Yu F, Okamoto S, Harada H, Yamasaki K, Misawa N, Utsumi R (2011),

Zingiber zerumbet CYP71BA1 catalyzes the conversion of α-humulene to 8-

hydroxy-α humulene in zerumbone biosynthesis, Cell. Mol. Life. Sci. 68:1033–

1040.

51. Zhao B, Lin X, Lei L, Lamb DC, Kelly SL, Waterman MR, Cane DE (2008),

Biosynthesis of the sesquiterpene antibiotic albaflavenone in Streptomyces

coelicolor A3(2), J Biol Chem. 283(13):8183-9.

PHỤ LỤC

I. Vector pET17b

II. Trình tự gene mã hóa cho CYP264B1, AdR và Adx

Trình t gene mã hóa cho CYP264B1

atgggcactcaagaacaaaccccccagatctgtgtggtgggcagtggcccagctggcttttacacggcccagcacctg

ctaaagcaccactcccgggcccacgtggatatctacgagaaacagctggtgcccttcggcctggtgcgctttggcgtgg

cgcctgaccaccccgaggtcaagaatgttatcaacacctttacccagacggcccgctctgaccgctgtgccttctatggc

aacgtggaggtgggcagggatgtgactgtgcaggagctgcaggacgcctaccacgccgtggtgctgagctatgggg

cagaggaccatcaggccctggatatccctggtgaggagttgcccggcgtgttctcggcccgggcctttgtgggctggta

caatgggcttcctgagaaccgggagctggccccggacctgagctgtgacacagccgtgattctggggcaggggaatg

tggctctggacgtggcccggatcctgctgaccccccccgaccacctggagaaaacggacatcactgaggccgccctg

ggagccctgagacagagtcgggtgaagacggtgtggatcgtgggccgacgtggacccctacaagtggccttcaccat

aaaggagcttcgggagatgattcagttaccaggaactcggcccatgttggatcctgcggatttcttgggtctccaggaca

gaatcaaggaggccgctcgcccgaggaagcggctgatggaactgctgcttcgaacagccacggagaagccagggg

tggaggaggctgcccgccgggcatcagcctcccgtgcctggggcctccgcttcttccgaagcccgcagcaggtcctg

ccctcgccagatgggcggcgggcggcaggcatccgcctggcagtcaccagactggagggcattggagaggccacc

cgggcagtgcccactggggatgtggaggacctcccctgtgggctggtgctgagcagcattgggtataagagccgccc

catcgaccccagtgtgccctttgaccccaagctcggggttgtccccaatatggagggccgggttgtggatgtgccaggc

ctctactgcagcggctgggtgaagcggggacccacaggtgtcatcaccaccaccatgaccgacagcttcctcaccgg

ccagattctgctacaggacctgaaggccgggcacctgccgtctggccccaggccgggctctgcattcatcaaggccct

gctggacagccgaggggtctggcccgtgtctttctcggactgggagaaactggatgctgaggaggtgtcccggggcc

aggcctcggggaagcccagagagaagctgctggatcctcaggagatgctgcggctgctggggcactga

Trình t gene mã hóa cho AdR