Luận văn Thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu sản xuất dịch thủy phân giàu đạm từ các phụ phẩm bằng chế phẩm Aspergillus oryzae N2 và bước đầu ứng dụng trong nông nghiệp

Chia sẻ: Xedapbietbay Xedapbietbay | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:136

Thêm vào BST

Báo xấu

41
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài nghiên cứu này nhằm xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cá phế thải bằng chế phẩm A. oryzae N2 Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân khô dầu lạc bằng chế phẩm A. oryzae N2; Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân hỗn hợp khô dầu lạc và cá phế thải bằng chế phẩm A. oryzae N2.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu sản xuất dịch thủy phân giàu đạm từ các phụ phẩm bằng chế phẩm Aspergillus oryzae N2 và bước đầu ứng dụng trong nông nghiệp

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN NGỌC THANH TRANG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT DỊCH THỦY PHÂN GIÀU ĐẠM TỪ CÁC PHỤ PHẨM BẰNG CHẾ PHẨM Aspergillus oryzae N2 VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm HUẾ - 2019
ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN NGỌC THANH TRANG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT DỊCH THỦY PHÂN GIÀU ĐẠM TỪ CÁC PHỤ PHẨM BẰNG CHẾ PHẨM Aspergillus oryzae N2 VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG NÔNG NGHIỆP LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã số: 8540101 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. LÊ VĂN LUẬN HUẾ - 2019
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu sản xuất dịch thủy phân giàu đạm từ các phụ phẩm bằng chế phẩm Aspergillus oryzae N2 và bước đầu ứng dụng trong nông nghiệp” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi. Các số liệu, ví dụ và trích dẫn trong luận văn đảm bảo độ tin cậy, chính xác và trung thực. Những kết luận khoa học của luận văn chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới thời điểm này. Tác giả luận văn Nguyễn Ngọc Thanh Trang
ii LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian học tập, nghiên cứu, được sự hướng dẫn, giảng dạy của thầy cô, sự quan tâm giúp đỡ của cơ quan cùng với sự đóng góp của bạn bè, đồng nghiệp, sự động viên của gia đình, tôi đã hoàn thành luận văn thạc sỹ. Qua đây, tôi xin chân thành gửi lời cảm cảm ơn đến: Ban Giám hiệu, các thầy cô Khoa Cơ khí - Công nghệ, Phòng Đào tạo Trường Đại học Nông Lâm Huế, cùng các giảng viên đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những tri thức kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Cảm ơn lãnh đạo đơn vị công tác đã tạo điều kiện để tôi được học tập, nâng cao trình độ. Cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp và gia đình đã động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian học tập và hoàn thiện luận văn. Đặc biệt, tôi xin dành sự kính trọng và cảm ơn sâu sắc đến TS. Lê Văn Luận và PGS.TS. Nguyễn Hiền Trang đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tác giả luận văn Nguyễn Ngọc Thanh Trang
iii TÓM TẮT Nghiên cứu này nhằm mục đích khảo sát một số yếu tố như tỷ lệ chế phẩm, thời gian, nhiệt độ ảnh hưởng đến chất lượng dịch thủy phân cá phế thải, khô dầu lạc, hỗn hợp cá phế thải và khô dầu lạc bằng chế phẩm Aspergillus oryzae N2 (A. oryzae N2). Kết quả nghiên cứu cho thấy đối với quá trình thủy phân cá phế thải, ở điều kiện: tỷ lệ chế phẩm A. oryzae N2 bổ sung 4%, nhiệt độ thủy phân 35oC trong thời gian 30 ngày thu được hàm lượng đạm tổng số, hàm lượng amino acid, tỷ lệ đạm thu hồi và tỷ lệ sản lượng dịch thu được đạt cao nhất. Đối với khô dầu lạc, điều kiện tốt nhất để thu nhận dịch thủy phân cũng tương tự đối với cá phế thải (ở tỷ lệ chế phẩm A. oryzae N2 bổ sung 4%, nhiệt độ thủy phân 35oC, thời gian thủy phân là 30 ngày). Sau khi xác định các điều kiện thủy phân riêng biệt của cá phế thải và khô dầu lạc, chúng tôi thử nghiệm thủy phân hỗn hợp của cá phế thải và khô dầu lạc ở các tỷ lệ phối trộn 0:1, 1:0, 1:1, 1:2 và 2:1. Kết quả cho thấy, tỷ lệ phối trộn 2 cá phế thải và 1 khô dầu lạc thu được hàm lượng đạm tổng số, hàm lượng amino acid, tỷ lệ đạm thu hồi cao nhất, lần lượt là 31,88%, 5,38 g/L và 70,82%. Tỷ lệ sản lượng dịch thu được ở các công thức phối trộn khá tương đồng nhau. Dịch thủy phân sản xuất từ hỗn hợp 2 cá phế thải và 1 khô dầu lạc ở nhiệt độ o 35 C trong 30 ngày và bổ sung tỷ lệ chế phẩm A. oryzae N2 4% được ứng dụng vào trồng rau xà lách bằng phương pháp thủy canh trong nhà màng. Tiến hành phân tích chất lượng rau sau 40 ngày trồng cho thấy, rau xà lách trồng ở nồng độ dịch thủy phân 3% (CT3) thu được: hàm lượng xơ, hàm lượng vitamin C, hàm lượng đường khử cao và không có sự sai khác về ý nghĩa thống kê so với mẫu rau xà lách trồng đối chứng (CT0); hàm lượng xơ và hàm lượng khoáng của rau xà lách trồng ở nồng độ dịch thủy phân 3% cao hơn so với nồng độ 1% (CT1), 2% (CT2); hàm lượng vitamin C ở các công thức khá tương đồng và không sai khác về ý nghĩa thống kê (p
iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii TÓM TẮT ................................................................................................................. iii MỤC LỤC .................................................................................................................. iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................viii DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................................ ix DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... x MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề................................................................................................................ 1 2. Mục tiêu của đề tài................................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài...................................................... 2 3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................. 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn................................................................................................... 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ A. oryzae ................................................................................. 3 1.1.1. Tổng quan về nấm mốc ...................................................................................... 3 1.1.2. Tổng quan về Aspergillus ................................................................................... 3 1.1.3. Tổng quan về A. oryzae ...................................................................................... 6 1.2. TỔNG QUAN VỀ KHÔ DẦU LẠC ..................................................................... 9 1.2.1. Tổng quan về cây lạc ......................................................................................... 9 1.2.2. Tổng quan về khô dầu lạc................................................................................. 10 1.3. CÁ PHẾ THẢI .................................................................................................... 11 1.3.1. Giới thiệu về phế phụ phẩm từ cá trên thế giới và Việt Nam ............................ 11 1.3.2. Phân loại sản phẩm thủy phân protein từ phế phụ phẩm cá............................... 12 1.3.3. Dịch thủy phân từ phế phụ phẩm cá giàu protein .............................................. 13 1.3.4. Tận dụng cá phế thải ........................................................................................ 13 1.4. TỔNG QUAN VỀ RAU XÀ LÁCH ................................................................... 14
v 1.4.1. Giới thiệu chung về rau xà lách ........................................................................ 14 1.4.2. Đặc điểm thực vật học...................................................................................... 16 1.4.3. Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh ........................................................................... 16 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ...................................................................................................................... 16 1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................... 16 1.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................................... 17 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 21 2.1. PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU........................................................... 21 2.1.1 Phạm vi nghiên cứu........................................................................................... 21 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................... 21 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 21 2.2.1. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cá phế thải bằng chế phẩm A. oryzae N2 .................................................................................................... 21 2.2.2. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân khô dầu lạc bằng chế phẩm A. oryzae N2 .................................................................................................... 21 2.2.3. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân hỗn hợp cá phế thải và khô dầu lạc bằng chế phẩm A. oryzae N2 ................................................................... 22 2.2.4. Bước đầu ứng dụng trong nông nghiệp............................................................. 22 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 22 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ......................................................................... 22 2.3.2. Phương pháp vật lý .......................................................................................... 29 2.3.3. Phương pháp hóa sinh ...................................................................................... 29 2.3.4. Xử lý số liệu..................................................................................................... 30 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................... 31 3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CÁ PHẾ THẢI BẰNG CHẾ PHẨM A. oryzae N2 ............................. 31 3.1.1. Xác định hàm lượng đạm tổng số ban đầu của cá phế thải ................................ 31 3.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm A. oryzae N2 đến khả năng thủy phân cá phế thải ......................................................................................................... 31
vi 3.1.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân cá phế thải ............................................................................................................................ 33 3.1.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân cá phế thải ............................................................................................................................ 36 3.1.5. Đề xuất quy trình sản xuất dịch thủy phân giàu đạm từ cá phế thải bằng chế phẩm A. oryzae N2 .................................................................................................... 39 3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN KHÔ DẦU LẠC BẰNG CHẾ PHẨM A. oryzae N2 ........................... 40 3.2.1. Xác định hàm lượng đạm tổng số ban đầu của khô dầu lạc............................... 40 3.2.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung đến khả năng thủy phân khô dầu lạc ....................................................................................................................... 41 3.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm A. oryzae N2 đến khả năng thủy phân khô dầu lạc ........................................................................................................ 42 3.2.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân khô dầu lạc ............................................................................................................................. 44 3.2.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân khô dầu lạc.............................................................................................................................. 47 3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CHẤT LƯỢNG DỊCH THỦY PHÂN HỖN HỢP CÁ PHẾ THẢI VÀ KHÔ DẦU LẠC BẰNG CHẾ PHẨM A. oryzae N2 ......................... 51 3.3.1. Kết quả khảo sát chất lượng dịch thủy phân hỗn hợp cá phế thải và khô dầu lạc bằng chế phẩm A. oryzae N2...................................................................................... 51 3.3.2. Đề xuất quy trình sản xuất dịch thủy phân giàu đạm từ hỗn hợp khô dầu lạc và cá phế thải bằng chế phẩm A. oryzae N2 .................................................................... 52 3.4. BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG DỊCH THỦY PHÂN VÀO SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP ................................................................................................................... 54 3.4.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dịch thủy phân đến hàm lượng đường khử của rau xà lách ................................................................................................................. 54 3.4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dịch thủy phân đến hàm lượng vitamin C của rau xà lách ................................................................................................................. 54 3.4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dịch thủy phân đến hàm lượng xơ của rau xà lách ............................................................................................................................ 55 3.4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dịch thủy phân đến hàm lượng khoáng của rau xà lách ....................................................................................................................... 56
vii CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 58 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................ 58 4.2. ĐỀ NGHỊ............................................................................................................ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 59 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 66
viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A. oryzae N2 : Aspergillus oryzae N2 ANOVA : Analysis of Variance B. subtilis : Bacillus subtilis BIO – BL : Chế phẩm sinh học dùng trong trồng trọt cs : cộng sự CT : Công thức TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam WHO : World Health Organization
ix DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng trong 100g phần ăn được của rau xà lách ............. 15 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung đến khả năng thủy phân khô dầu lạc bằng chế phẩm A. oryzae N2 .............................................................................................. 41 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cá phế thải và khô dầu lạc................ 51
x DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Khuẩn ty và sự hình thành cọng mang túi bào tử của Aspergillus ................. 5 Hình 1.2. Đặc điểm vi mô của A. oryzae ...................................................................... 7 Hình 1.3. Rau xà lách................................................................................................. 15 Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cá phế thải bằng chế phẩm A. oryzae N2 ........................................... 23 Hình 2.2. Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân khô dầu lạc bằng chế phẩm A. oryzae N2 .......................................... 25 Hình 2.3. Sơ đồ tổng quát bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ phối trộn cá phế thải và khô dầu lạc khi thủy phân bằng chế phẩm A. oryzae N2 ................................................... 27 Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm A. oryzae N2 đến a) hàm lượng đạm tổng số và b) hàm lượng amino acid trong dịch thủy phân cá phế thải .................................... 32 Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm A. oryzae N2 đến tỷ lệ đạm thu hồi trong dịch thủy phân cá phế thải ................................................................................................. 32 Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm A. oryzae N2 đến tỷ lệ sản lượng dịch thu được trong dịch thủy phân cá phế thải........................................................................ 33 Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến a) hàm lượng đạm tổng số và b) hàm lượng amino acid trong dịch thủy phân cá phế thải .............................................................. 34 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ đạm thu hồi trong dịch thủy phân cá phế thải ... 35 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ sản lượng dịch thu được trong dịch thủy phân cá phế thải ......................................................................................................... 35 Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian đến a) hàm lượng đạm tổng số và b) hàm lượng amino acid trong dịch thủy phân cá phế thải .............................................................. 36 Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ lệ đạm thu hồi trong dịch thủy phân cá phế thải .. 37 Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ lệ sản lượng dịch thu được trong dịch thủy phân cá phế thải ......................................................................................................... 38 Hình 3.10. Sơ đồ quy trình sản xuất dịch thủy phân giàu đạm từ cá phế thải bằng chế phẩm A. oryzae N2 .................................................................................................... 39 Hình 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm A. oryzae N2 đến a) hàm lượng đạm tổng số và b) hàm lượng amino acid trong dịch thủy phân khô dầu lạc ................................... 42
xi Hình 3.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm A. oryzae N2 đến tỷ lệ đạm thu hồi trong dịch thủy phân khô dầu lạc ........................................................................................ 43 Hình 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm A. oryzae N2 đến tỷ lệ sản lượng dịch thu được trong dịch thủy phân khô dầu lạc....................................................................... 44 Hình 3.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến a) hàm lượng đạm tổng số và b) hàm lượng amino acid trong dịch thủy phân khô dầu lạc ............................................................. 45 Hình 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ đạm thu hồi trong dịch thủy phân khô dầu lạc ....................................................................................................................... 46 Hình 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ sản lượng dịch thu được trong dịch thủy phân khô dầu lạc ........................................................................................................ 46 Hình 3.17. Ảnh hưởng của thời gian đến a) hàm lượng đạm tổng số và b) hàm lượng amino acid trong dịch thủy phân khô dầu lạc ............................................................. 47 Hình 3.18. Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ lệ đạm thu hồi trong dịch thủy phân khô dầu lạc ....................................................................................................................... 48 Hình 3.19. Ảnh hưởng của thời gian đến tỷ lệ sản lượng dịch thu được trong dịch thủy phân khô dầu lạc ........................................................................................................ 49 Hình 3.20. Sơ đồ quy trình sản xuất dịch thủy phân giàu đạm từ khô dầu lạc bằng chế phẩm A. oryzae N2 .................................................................................................... 50 Hình 3.21. Sơ đồ quy trình sản xuất dịch thủy phân giàu đạm từ hỗn hợp cá phế thải và khô dầu lạc bằng chế phẩm A. oryzae N2 ................................................................... 52 Hình 3.22. Ảnh hưởng của dịch thủy phân đến hàm lượng đường khử của rau xà lách ................................................................................................................... 54 Hình 3.23. Ảnh hưởng của dịch thủy phân đến hàm lượng vitamin C của rau xà lách 55 Hình 3.24. Ảnh hưởng của dịch thủy phân đến hàm lượng xơ của rau xà lách............ 56 Hình 3.25. Ảnh hưởng của dịch thủy phân đến hàm lượng khoáng của rau xà lách .... 56
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Nước ta có hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường biển dài 3.260 km rất thuận lợi cho hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản. Ngành chế biến thủy sản của nước ta phát triển thành một ngành kinh tế mũi nhọn, ngành sản xuất hàng hóa lớn, đi đầu trong hội nhập kinh tế quốc tế, cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp là lượng chất thải phát sinh tăng theo ngày. Bên cạnh đó, ngành công nghiệp chế biến các sản phẩm nông nghiệp tạo ra rất nhiều chất thải sinh học (rau, củ, quả, hạt, phế phẩm thủy sản,…) làm ảnh hưởng đến môi trường sinh thái và xã hội con người. Khô dầu lạc là sản phẩm phụ chủ yếu trong sản xuất dầu lạc, giàu protein với số lượng amino acid thiết yếu lớn (Basha và cs, 1982), tuy nhiên, chất lượng khô dầu lạc sau quá trình ép dầu dễ bị suy giảm dẫn đến độ hòa tan protein kém, màu tối, hương vị khó chịu và giá trị dinh dưỡng thấp. Ngoài ra, các loại nguyên liệu thủy sản không đáp ứng được yêu cầu chế biến cũng là nguồn nguyên liệu giàu protein, amino acid. Để giảm thiểu ô nhiễm môi trường, công nghệ tái chế và làm sạch được áp dụng ngày càng nhiều. Các phế phụ phẩm này được nghiên cứu tái chế cho việc sản xuất enzyme, các chất có hoạt tính sinh học, phân bón hữu cơ,... như: Đặng Thị Mộng Quyên và cs (2006) đã tiến hành thủy phân cá phèn và cá ngân phế liệu bằng phương pháp thủy phân kết hợp enzyme protease và acid thu được dịch thủy phân có hàm lượng đạm tổng số 39 g/L, đạm amin 21,6 g/L, đạm amoniac 3,95 g/L. Trần Thanh Dũng (2009) sử dụng chế phẩm vi khuẩn B. subtilis thủy phân phụ phẩm cá tra, thu được hàm lượng đạm amin đạt cao nhất (49,88 g/kg chất khô), đạm amoniac thấp nhất (5,0 g/kg chất khô) vào ngày thủy phân thứ 10. Năm 2011, Su và cs đã nghiên cứu sử dụng protease thô từ Aspergillus oryzae HN 3,042 (CPE) để thủy phân khô dầu lạc, hiệu quả thu hồi protein là 80,6%; mức độ thủy phân bởi protease thô cao hơn so với các protease thương mại. Chế phẩm nấm mốc A. oryzae được ứng dụng phổ biến trong quá trình sản xuất nước chấm lên men từ đậu nành, cá hoặc thịt nhằm thúc đẩy quá trình lên men, tăng chất lượng sản phẩm và đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm (Chancharoonpong và cs, 2012). Nghiên cứu của Nguyễn Hiền Trang và cs (2014), cho thấy chủng A. oryzae N2 được nuôi cấy trên môi trường bán rắn (cám gạo và trấu) có hoạt độ protease khá cao. Với những tiềm năng ứng dụng ở trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất dịch thủy phân giàu đạm từ các phụ phẩm bằng chế phẩm Aspergillus oryzae N2 và bước đầu ứng dụng trong nông nghiệp”.
2 2. Mục tiêu của đề tài - Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cá phế thải bằng chế phẩm A. oryzae N2 - Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân khô dầu lạc bằng chế phẩm A. oryzae N2 - Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân hỗn hợp khô dầu lạc và cá phế thải bằng chế phẩm A. oryzae N2. - Bước đầu ứng dụng sản phẩm dịch thủy phân trong nông nghiệp. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần cung cấp những thông tin khoa học liên quan đến việc sản xuất chế phẩm sinh học từ dịch thủy phân từ các phụ phẩm giàu đạm (khô dầu lạc và cá phế thải) bằng chế phẩm A. oryzae N2 và áp dụng thành tựu khoa học này trong sản xuất nông nghiệp. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường, nâng cao giá trị sản phẩm phụ trong ngành chế biến thực phẩm, tạo ra sản phẩm có giá trị kinh tế cao. - Sản xuất dịch thủy phân hữu cơ từ các phế phụ phẩm giàu đạm ứng dụng vào sản xuất rau, hạn chế sử dụng phân bón hóa học.
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. TỔNG QUAN VỀ A. oryzae 1.1.1. Tổng quan về nấm mốc Nấm mốc là một vi nấm có cấu tạo đa bào, tế bào đã có nhân chuẩn, có hình thái dạng sợi phân nhánh hay không phân nhánh, phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, không khí, rác thải,... Nấm mốc góp phần quan trọng trong việc đảm bảo các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên, chúng có khả năng phân giải mạnh mẽ các hợp chất hữu cơ phức tạp, sử dụng để sản xuất tương, đậu phụ, sản xuất các chế phẩm enzyme như amylase, protease,... Nhiều loại nấm mốc có khả năng tích lũy vitamin, các chất sinh trưởng và nhiều loại ankaloit có giá trị chữa bệnh. Nấm mốc có khả năng tiết chất kháng sinh có giá trị như: penicillin, fucidin, fumagilin,… Bên cạnh đó, nấm mốc cũng là nguyên nhân gây ra tổn thất to lớn cho việc bảo vệ mùa màng, lương thực, thực phẩm, hàng hóa, vải vóc, dụng cụ quang học, phim ảnh, sách vở,… Nhiều loại gây nên những bệnh khác phổ biến và khó điều trị ở người, gia súc, cây trồng. Một số loài tiết độc tố gây ngộ độc thức ăn như Aspergillus, gây tổn thất lớn trong chăn nuôi (Hoàng Hải và cs, 2008). 1.1.2. Tổng quan về Aspergillus 1.1.2.1. Lịch sử nghiên cứu và phân loại Aspergillus Aspergillus là tên của một loại nấm mốc được đặt bởi Micheli năm 1729, nhưng đến giữa thế kỷ 19, Aspergilli mới bắt đầu được công nhận là tác nhân tích cực trong nhiều quá trình phân hủy, là nguyên nhân thỉnh thoảng gây bệnh cho người và động vật và là tác nhân lên men có khả năng tạo ra các sản phẩm sinh hóa có giá trị (Charles và cs, 1945). Trong lịch sử, Aspergilli được xem là một phần của sự mốc meo, là một yếu tố môi trường của con người nhưng bị loại bỏ như nấm mốc trắng, vàng, xanh lục, đỏ hoặc đen, có hoặc không có bất kỳ giải thích nào về điều này. Sau khi kính hiển vi ra đời, người ta bắt đầu nhìn thấy cấu trúc của nấm mốc. Micheli (1729), đã phân biệt giữa cọng bào tử và phần bọng. Ông lưu ý rằng, những phần bọng thô, chuỗi bào tử hoặc cột tạo ra một bề mặt không bằng phẳng, do đó ông đặt tên là Aspergillus (rough head - bọng/đầu thô). Sau đó, ông đã đánh dấu bằng các cụm từ Latin trong bản phát thảo của mình về các nấm mốc có màu khác nhau, ví như Aspergillus capitatus ochroleuces có thể là một số chủng Aspergillus ochraceus; Aspergillus capitulo pulla có màu đen… (Charles và cs, 1945). Năm 1809, Link đã mô tả loài Aspergillus glaucus và loài Nấm túi Eurotium herbariorum phát hiện thấy trên cùng một tiêu bản mẫu cây khô (Bùi Xuân Đồng và cs, 2000). Giai đoạn bào tử trần của Eurotium herbariorum chính là Aspergillus
4 glaucus được phát hiện bởi De Bary năm 1850 (Bùi Xuân Đồng và cs, 2000; Charles và cs, 1945). Các nghiên cứu tiếp theo của Fresenius, Cramer, Wilhelm và Brefeld ở Đức, Raulin và Van Tieghem ở Pháp đã phát triển quá trình lên men của tannin trong hạt mật thành acid gallic vào những năm 1860 với nghiên cứu so sánh các loại nấm mốc khác nhau. Năm 1880, tại Paris, Bainier bắt đầu xuất bản các nghiên cứu về nấm mốc khi chúng xuất hiện trong các sản phẩm dược phẩm (Charles và cs, 1945). Từ giữa thế kỷ thứ 20, một số nhà nấm học đã nghiên cứu các đặc điểm khác như các đặc điểm hóa sinh, hóa tế bào,… dùng làm đặc điểm phân loại cho chi Aspergillus. Cho đến nay, hệ thống phân loại chi Aspergillus của Raper và Fennell (1965) gồm 18 nhóm loài vẫn ổn định và được sử dụng rộng rãi, không sửa đổi về cơ bản, mặc dù từ chuyên luận phân loại về chi Aspergillus của Raper và Fennell (1965) đến nay, một số loài mới thuộc chi nấm này đã được công bố ở một số nước (Bùi Xuân Đồng và cs, 2000). 1.1.2.2. Vị trí chi Aspergillus trong hệ thống phân loại nấm Theo Bennett (2009), Aspergillus có hơn 200 loài, chúng được phân vào chung nhóm vì có cấu trúc sinh sản vô tính tương tự nhau. Các loài Aspergillus có khả năng tạo ra số lượng lớn bào tử đính, các bào tử này là vô tính. Hiện nay, có hai quan điểm khác nhau về phân loại chi Aspergillus cùng tồn tại: - Quan điểm thứ nhất: chỉ dùng một tên chi (tên Aspergillus) cho tất cả các loài tạo thành bộ máy mang bào tử trần có các đặc điểm của chi nấm này, dù các loài đó có hoặc không có giai đoạn bào tử túi (giai đoạn hữu tính). Chi Aspergillus như vậy có 2 vị trí phân loại: Vị trí phân loại trong Nấm bất toàn: Lớp: Fungi Imperfecti Bộ: Hyphomycetes Họ: Mucedinaseae Lớp phụ: Aspergilleae Chi: Aspergillus Vị trí phân loại trong Nấm túi: Lớp: Ascomycetes Bộ: Cúc khuẩn Plectascineae Họ: Aspergillaceae Chi: Aspergillus (Charles và cs, 1945; Bùi Xuân Đồng và cs, 2000).
5 - Quan điểm thứ hai: Một khuynh hướng khác không coi chi Aspergillus là một trường hợp ngoại lệ của Luật quốc tế về Danh pháp thực vật. Tên Aspergillus chỉ dùng cho các loài nấm bất toàn, dù các loài đó có hay không tạo thành bào tử túi. Mặt khác, những loài nấm có giai đoạn bào tử trần thuộc chi Aspergillus và tạo thành bào tử túi được tập hợp riêng trong các chi Nấm túi. Các chi Nấm túi này được thành lập căn cứ chủ yếu vào các đặc điểm phân loại của bộ máy sinh bào tử túi. Như vậy, một loài Nấm túi có giai đoạn bào tử trần thuộc chi Aspergillus, mang 2 tên: một tên thuộc chi Aspergillus, một tên loài thuộc chi Nấm túi (Bùi Xuân Đồng và cs, 2000). 1.1.2.3. Đặc điểm hình thái Aspergillus Hình 1.1. Khuẩn ty và sự hình thành cọng mang túi bào tử của Aspergillus Chú thích: Foot cell: tế bào chân, sterigmta = phialide: thể bình, conidiophore: cọng bào tử, vesicle: túi, cytoplasm: tế bào chất (Nguyễn Văn Bá và cs, 2005). Theo Bùi Xuân Đồng (2000), hệ sợi nấm chi Aspergillus gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, màu nhạt hoặc trong một số trường hợp trở thành nâu hay màu sẫm khác ở các vùng nhất định của khuẩn lạc. Bộ máy mang bào tử trần phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của sợi nấm (tế bào chân - foot cell). Giá bào tử trần phát triển từ tế bào chân, như là một nhánh của sợi nấm, gần thẳng góc với trục của nhánh, không có hoặc có ít vách nang, có phần đỉnh to ra thành bọng hình chùy, hình elip, hình nửa cầu hoặc hình cầu. Bọng hữu thụ này (bọng đỉnh giá) mang các thể bình (sterigmata). Các thể bình này hoặc song song và hợp thành cụm ở phần đỉnh bọng, hoặc xếp thành hình tia sát nhau trên toàn bộ bề mặt bọng. Thể bình hoặc chỉ có một tầng hoặc có 2 tầng. Trong trường hợp sau, mỗi thể bình cấp 1 (cũng gọi là cuống thể bình, metula) mang một cụm gồm 2 - 3 (hoặc nhiều hơn) thể bình cấp 2 (gọi là thể bình) ở phần đỉnh. Các bào tử trần được tạo
6 thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình, thành chuỗi hướng gốc (bào tử ở ngay miệng thể bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình càng già), không phân nhánh. Bào tử trần không ngăn vách, thay đổi về hình dạng, kích thước, màu sắc, dấu vết ở mặt ngoài (nhẵn, có gai, có nốt sần) tùy từng loài. Tất cả các chuỗi bào tử trần tạo thành các thể bình của một bọng đỉnh giá hợp thành khối bào tử trần đỉnh bọng (conidial head). Khối bào tử trần đỉnh bọng có thể có các dạng hình cột (các chuỗi bào tử trần song song, sát nhau), hình cầu hoặc hình tia tỏa tròn. Một số có bào tử túi (ascosporum) trong các thể quả kín (eleitothecium). 1.1.2.4. Vai trò của chi Aspergillus Các loài trong họ Aspergillaceae có nhiều ứng dụng trong thực tế sản xuất, chế biến thực phẩm như A. oryzae, A. sojae,… Chúng sinh ra nhiều enzyme như amylase, protease, pectinase và được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất thực phẩm lên men như rượu, tương, nước tương,… (Machida và cs, 2008; Lương Đức Phẩm, 2010). Một số loài có khả năng tạo thành các chất kháng sinh, như A. fumigatus tạo thành fumagilin có tác dụng trên Entanioebae histolyca, A. humicola, A. nidulans tạo thành lần lượt humicolin, nidulin có tác dụng ức chế đối với một số loài nấm, A. candidus tạo thành candidulin, A. oryzae, A. tamatii, một số tạo thành acid kojic có tác dụng ức chế đối với vi khuẩn. Một số loài khác tạo thành các độc tố (mycotoxin), đặc biệt đáng chú ý là các loài tạo thành các độc tố gây ung thư gan như A. flavus, A. parasiticus tạo thành aflatoxin, A. versicoloer tạo thành sterigmatovystin (Bùi Xuân Đồng và cs, 2000). Như vậy, ở trên thế giới cũng như ở nước ta, các loài thuộc chi Aspergillus đã được sử dụng hay được nghiên cứu sử dụng vào công nghệ sinh học, công nghệ thực phẩm và nhiều ngành công nghiệp khác. 1.1.3. Tổng quan về A. oryzae 1.1.3.1. Lịch sử phát hiện và phân lập A. oryzae Theo Machida và cs (2008), A. oryzae lần đầu tiên được phân lập từ koji bởi H. Ahlburg vào năm 1876. Tên ban đầu của nó là Eurotium oryzae, sau này được đổi tên thành A. oryzae bởi F. Cohn vì ông cho rằng, chúng thiếu khả năng sinh sản hữu tính. Trình tự bộ gen của A. oryzae RIB40 (ATTC - 42149) được hoàn thành giải mã năm 2005. Chủng được giải trình tự là một chủng hoang dã, tương tự như các loại được sử dụng để sản xuất rượu sake nhưng vẫn có khả năng sản xuất protease mạnh, đây là một trong những đặc điểm quan trọng nhất cho lên men nước tương. Hiện nay, A. oryzae đã được biết đến và sử dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực, nhiều quốc gia trên thế giới, nhất là sử dụng trong công nghệ lên men, sản xuất thương mại các loại enzyme như amylase, protease, lipase có giá trị công nghiệp ở các quốc
7 gia Châu Á. Việc sử dụng rộng rãi A. oryzae trong các ngành công nghiệp lên men được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chứng nhận an toàn (Generally Recognized as Safe (GRAS)) (Tailor và cs, 1979; Abe và cs, 2006). Sự an toàn của vi sinh vật này cũng được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận vào năm 1987. Mặc dù A. oryzae có bộ gen di truyền rất gần với A. flavus, loài được biết đến sản sinh aflatoxin, chất gây ung thư tự nhiên mạnh nhất. A. oryzae không có báo cáo sản xuất aflatoxin hoặc bất kỳ chất chuyển hóa ung thư nào khác (Barbesgaard và cs, 1992). 1.1.3.2. Vị trí A. oryzae trong hệ thống phân loại nấm A. oryzae là nấm mốc sinh bào tử đính màu vàng hoa cau, theo Lê Xuân Phương (2001), A. oryzae thuộc: Lớp: Ascomycetes Bộ: Cúc khuẩn Plectascineae Họ: Aspergillaceae Giống: Aspergillus Loài: Aspergillus oryzae 1.1.3.3. Đặc điểm hình thái của A. oryzae Đặc điểm đại thể: A. oryzae (Ahlburg) Cohn - Khuẩn lạc trên môi trường Czapek (nhiệt độ nuôi cấy 27oC, 10 ngày tuổi), đường kính 5 - 6 cm, màu lục, vàng lục, lục nâu sau chuyển thành nâu lục, nâu (Bùi Xuân Đồng và cs, 2000). Hình 1.2. Đặc điểm vi mô của A. oryzae (Noor và cs, 2017) Đặc điểm vi thể của A. oryzae: khối bào tử trần đỉnh bọng hình tia tỏa tròn, phần lớn đường kính từ 150 - 300 đến 400 - 500 µm. Giá bào tử trần nhẵn hoặc ráp, thường dài 1,0 - 2,5 cm, có thể tới 4 - 5 cm. Bọng đỉnh giá hình gần cầu, đường kính 40 -50 µm, hoặc mang cuống thể bình và thể bình, hoặc chỉ mang thể bình. Cuống thể bình 4 - 5 x 8 - 12 µm. Thể bình mọc trực tiếp trên bọng đỉnh giá 3 - 5 x 12 - 15 µm, thể bình mọc trên cuống thể bình 3,0 - 3,5 x 8 - 10 µm. Bào tử trần phần lớn hình cầu,