Luận văn Thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Phân lập và tuyển chọn chủng probiotic sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tỉnh Nam Định để ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi tôm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:67

Thêm vào BST

Báo xấu

50
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm các mục tiêu: Tuyển chọn được 1-2 chủng probiotic sinh bacteriocin; định danh chủng được tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử; xây dựng được phương pháp thu nhận bacteriocin quy mô phòng thí nghiệm. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Phân lập và tuyển chọn chủng probiotic sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tỉnh Nam Định để ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi tôm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KINH TẾ - KỸ THUẬT CÔNG NGHIỆP KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ---------- BÙI THỊ HƯƠNG GIANG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PROBIOTIC SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN TỪ RUỘT TÔM NƯỚC MẶN TỈNH NAM ĐỊNH ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI TÔM LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM HÀ NỘI, 2021
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KINH TẾ - KỸ THUẬT CÔNG NGHIỆP KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ---------- BÙI THỊ HƯƠNG GIANG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PROBIOTIC SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN TỪ RUỘT TÔM NƯỚC MẶN TỈNH NAM ĐỊNH ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI TÔM LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101 Người hướng dẫn khoa học 1 : PGS.TS. Vũ Văn Hạnh Người hướng dẫn khoa học 2 : PGS.TS. Hồ Tuấn Anh HÀ NỘI – 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn đều trung thực, chưa được công bố trong các tài liệu khác. Đây là công trình từ thành quả lao động và nghiên cứu khoa học của cá nhân tôi với sự hỗ trợ của giáo viên hướng dẫn là PGS.TS. Vũ Văn Hạnh và PGS.TS. Hồ Tuấn Anh. Những thông tin trong luận văn có liên quan đến các công trình, tác giả, cơ quan, tổ chức khác được thể hiện trong phần Tài liệu tham khảo. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm theo quy định về nghiên cứu khoa học và nội dung luận văn của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 HỌC VIÊN Bùi Thị Hương Giang i
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, các anh chị, bạn bè, các đồng nghiệp và những người thân yêu trong gia đình tôi. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Văn Hạnh, PGS.TS. Hồ Tuấn Anh đã trực tiếp hướng dẫn, động viên, quan tâm và tạo mọi điều kiện giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên khoa Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Kinh tế - Kỹ thuật Công nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các anh chị Phòng Các chất chức năng sinh học - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 HỌC VIÊN Bùi Thị Hương Giang ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...............................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................ii DANH MỤC VIẾT TẮT..................................................................................................v DANH MỤC HÌNH .........................................................................................................vi DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... vii MỞ ĐẦU .............................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................4 1.1. Probiotics trong chăn nuôi tôm..................................................................................... 4 1.2. Bacteriocin trong chăn nuôi tôm .................................................................................. 5 1.3. Nuôi tôm công nghệ cao.................................................................................................. 7 1.4. Tổng quan các công trình nghiên cứu, sản xuất bacteriocin trong và ngoài nước ......................................................................................................................................... 11 1.5. Cơ sở thực tiễn................................................................................................................ 17 CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ................................................................19 CHƯƠNG 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG...................................................................20 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................20 3.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................................... 20 3.1.1. Vật liệu ....................................................................................................................20 3.1.2. Dụng cụ máy móc, thiết bị, hoá chất ....................................................................20 3.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật............................................................................20 3.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................................... 21 3.3. Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng ....................................................... 21 3.3.1. Phương pháp phân lập, làm thuần chủng và tuyển chọn vi sinh vật .................21 3.3.2. Định danh chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin đã được tuyển chọn...........................................................................................................................25 3.3.3. Nghiên cứu xác định thành phần môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin............................................................27 3.3.4. Nghiên cứu xây dựng phương pháp thu nhận sản phẩm bacteriocin qui mô phòng thí nghiệm. ..............................................................................................................28 3.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................................ 29 iii
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................30 4.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tại vùng biển Nam Định........................................ 30 4.2. Định danh đến loài chủng vi sinh vật được tuyển chọn ......................................... 39 4.3. Nghiên cứu xác định thành phần môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin .......................................................... 42 4.3.1. Ảnh hưởng của hoạt tính kháng khuẩn qua các thế hệ nuôi cấy .......................42 4.3.2. Nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy của chủng Bacillus subtilis N1.4 .....................42 4.3.2.2.Nghiên cứu điều kiện lên men cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Bacillus subtilis N1.4 .............................................................................................44 4.4. Nghiên cứu xây dựng phương pháp thu nhận sản phẩm bacteriocin quy mô phòng thí nghiệm................................................................................................................... 46 4.4.1. Nghiên cứu quy trình thu nhận bacteriocin ..........................................................46 4.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của bacteriocin ...........................................49 4.4.3. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của dịch bacteriocin và hoạt tính enzyme .......51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................................53 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................54 iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ Viết Tắt Từ Tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt GRAS Generally regarded as safe Vi sinh vật an toàn LAB Lactic Acid Bacteria Vi khuẩn lactic CMC Carboxymethylcellulose NTTS Nuôi trồng thuỷ sản LB Môi trường nuôi cấy LB FAO Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc v
DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Hình 3.1. Qui trình phân lập và làm thuần các chủng thu được từ 22 ruột tôm 10-4 2 Hình 3.2. Sơ đồ kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng 22 vi sinh vật phân lập 3 Hình 3.3. Sơ đồ kiểm tra hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh của các 24 chủng vi sinh vật phân lập 4 Hình 4.1. Khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase, cellulase và 34 protease 5 Hình 4.2. Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định của các 38 chủng vi khuẩn phân lập từ ruột tôm. 6 Hình 4.3. Trình tự đoạn gen của rARN 16S của chủng vi khuẩn chọn 40 lọc N1.4 7 Hình 4.4. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn chọn lọc N1.4 41 với các trình tự gen trên GenBank có mức độ tương đồng cao nhất 8 Hình 4.5. Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định của các 42 chủng phân lập được qua các thế hệ từ 2 đến 5 9 Hình 4.6. Qui trình chiết tách bacteriocin từ chủng N1.4 48 10 Hình 4.7. Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định của chủng 50 N1.4 trên môi trường LB và khả năng sinh tổng hợp enzyme trên các môi trường chứa cơ chất đặc hiệu 11 Hình 4.8. Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định của 52 chủng N1.4 trên môi trường ở 37°C vi
DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 26 2 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR 27 3 Bảng 3.3. Chu trình phản ứng PCR 27 4 Bảng 4.1. Mật độ vi sinh vật từ các mẫu tôm nước mặn 30 5 Bảng 4.2. Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các 31 chủng phân lập từ ruột tôm 6 Bảng 4.3. Khả năng kháng khuẩn của các chủng phân lập được 35 từ ruột tôm 7 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến chủng 43 Bacillus subtilis N1.4 8 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của điều kiện lên men cho quá trình sinh 44 tổng hợp bacteriocin 9 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng kháng 45 khuẩn 10 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính 46 enzyme thủy phân 11 Bảng 4.8. Khả năng chiết tách của các dung môi khác nhau đối 47 với bateriocins từ dịch nổi 12 Bảng 4.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng khuẩn 49 13 Bảng 4.10. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn 51 14 Bảng 4.11. Ảnh hưởng của protease đến hoạt tính kháng khuẩn 52 của bacteriocin vii
MỞ ĐẦU Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi được tiêu thụ với lượng thích hợp sẽ mang lại những tác động có ích cho vật chủ ( FAO). Việc sử dụng probiotic như thức ăn bổ sung cho vật nuôi được bắt đầu từ những năm 1970. Probiotic được trộn vào thức ăn để làm tăng sự tăng trưởng và sức khỏe vật nuôi bởi chúng giúp vật nuôi tăng khả năng kháng bệnh [21]. De Vuyst đã nghiên cứu bacteriocin là những protein hoặc phức hợp protein có hoạt tính kháng khuẩn [16]. Khác với hầu hết các kháng sinh dùng trong y học, bacteriocin là các phân tử protein dễ bị phân hủy bởi enzyme protease trong hệ tiêu hóa người. Chúng hoạt động chỉ cần một lượng nhỏ và không gây độc. Bacteriocin không gây tác dụng phụ, không gây ra phản ứng dị ứng trong cơ thể người và các vấn đề về sức khỏe. Các bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ thấp, có đặc tính diệt khuẩn trong các cơ quan của hệ tiêu hoá ở pH thấp, bacteriocin tương đối bền ở nhiệt độ cao và không bị ảnh hưởng bởi các dung môi hữu cơ. Bảo quản sinh học thực phẩm với việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng hay các sản phẩm trao đổi chất của chúng (chất bảo quản sinh học) để ức chế hay tiêu diệt các vi sinh vật không mong muốn là giải pháp có nhiều tiềm năng. Ưu điểm của bacteriocin trong bảo quản sinh học thực phẩm là tăng thời hạn sử dụng, hạn chế sự truyền mầm bệnh trong chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh tế do hư hỏng thực phẩm, hạn chế sử dụng chất bảo quản hóa học cũng như những xử lý nhiệt. Bacteriocin giúp bảo quản giá trị dinh dưỡng và vitamin, thỏa mãn nhu cầu công nghiệp và người tiêu dùng. Một xu hướng trong công nghiệp thực phẩm ở Châu Âu là hạn chế sử dụng chất phụ gia và thành phần nhân tạo, đảm bảo an toàn, giữ nguyên chất lượng. Những yêu cầu này có thể được đáp ứng nhờ sử dụng bacteriocin. Ngành thuỷ sản của Việt Nam phát triển rất nhanh chóng, có định hướng đảm bảo nhu cầu tiêu dùng trong nước và ổn định chất lượng cho xuất khẩu. Nuôi tôm công nghệ cao đã phát triển tại nhiều tỉnh ven biển trong đó có Nam Định. 1
Việc nuôi tôm sú, tôm thẻ ở Đồng Bằng sông Cửu Long trong những năm trước đây đã đem lại nguồn lợi nhuận đáng kể và góp phần vào việc phát triển nền kinh tế và ổn định an sinh xã hội. Ô nhiễm môi trường đầm nuôi tôm có nguyên nhân chính là hàm lượng cao của các chất hữu cơ từ thức ăn dư thừa, phân động vật, xác chết sinh khối tảo, thực vật và động vật trong đầm nuôi do mật độ nuôi thả tôm cá cao. Thành phần các chất hữu cơ này rất đa dạng chứa hàm lượng rất cao các thành phần protein, tinh bột, kitin, xenlulose và muối phốt phát. Ngoài ra, trong đầm nuôi cũng tồn tại nhiều loài vi sinh vật gây bệnh đối với tôm cá. Việc tuyển chọn các chủng vi sinh vật probiotic phải dựa trên các tiêu chí là chọn ra chủng sinh ra enzyme ngoại bào có hoạt tính cao để phân hủy các chất hữu cơ (protein, bột, xơ), khả năng chuyển hóa khí độc (NO2, H2S, NH3) sang dạng không độc và bacteriocin với khả năng ức chế được với nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh trong đường ruột và môi trường ao nuôi. Việc sử dụng bacteriocin kết hợp với enzyme và các chủng probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản và chăn nuôi là xu hướng đúng đắn hiện nay, góp phần làm giảm việc sử dụng chất hóa học và kháng sinh độc hại trong nuôi trồng thuỷ sản cũng như trong bảo quản thực phẩm. Chế phẩm bacteriocin với hoạt tính sinh học có thể ứng dụng trong quy trình nuôi tôm công nghệ cao mang lại hiệu quả vượt trội, đóng góp cho cộng đồng thực phẩm an toàn, chất lượng dinh dưỡng và an toàn vệ sinh thực phẩm. Nghiên cứu bacteriocin là hướng đi đúng với định hướng phát triển bền vững theo chủ trương, chính sách của Nhà nước và phù hợp với xu thế phát triển của thế giới. Nhằm góp phần khai thác nguồn vi sinh vật có lợi (probiotics) từ nguồn tôm sống trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin, đề tài luận văn thạc sĩ này được xác định là: “ Phân lập và tuyển chọn chủng probiotic sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tỉnh Nam Định để ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi tôm”. Kết quả nghiên cứu là sản phẩm bacteriocin mang lại ý nghĩa thực tiễn và đặc biệt quan trọng đối với nhu cầu cấp bách hiện nay là giảm và bỏ sử dụng kháng 2
sinh trong chăn nuôi nói chung và nuôi tôm nói riêng, đây là một bước ngoặt của ứng dụng công nghệ cao cho nuôi tôm. Xu hướng phát triển nuôi trồng thuỷ sản ngày nay là siêu thâm canh, năng suất cao. Để thành công, áp lực lớn đè nặng lên người nuôi là giảm giá thành và chống rủi ro bệnh, tôm chậm lớn và chết hàng loạt. Tôm không đạt tiêu chuẩn chất lượng, dư lượng kháng sinh cao là vấn đề rất nhức nhối của ngành thuỷ sản. Tôm với dư lượng hoá chất và kháng sinh cao phải bán giá thấp, không thể xuất khẩu được, người nuôi tôm không có lợi nhuận, thêm nữa, lại bán cho chính người dân nội địa tiêu dùng, ảnh hưởng tiêu cực đến sức khoẻ cộng đồng. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Probiotics trong chăn nuôi tôm Probiotics trong chăn nuôi tôm là các vi sinh vật có lợi được ứng dụng với mục đích tăng sinh khối để hạn chế các vi sinh vật có hại qua cơ chế lấn át và chiếm thức ăn, đồng thời có thể sinh ra các chất có khả năng kháng khuẩn trực tiếp như bacteriocin hay enzymes có khả năng phân huỷ các chất hữu cơ trong tiêu hoá thức ăn hay xử lý ô nhiễm nước ao nuôi tôm. Thức ăn bổ sung vi sinh vật sống ảnh hưởng có lợi đến động vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng đường ruột của nó [21]. Probiotic là các chế phẩm tế bào vi sinh vật hoặc các thành phần của tế bào vi sinh vật có tác dụng có lợi cho sức khỏe và tinh thần của vật chủ [37]. Tuy nhiên, không có định nghĩa nào nêu trên phù hợp với nuôi trồng thủy sản vì động vật thủy sản có mối quan hệ chặt chẽ hơn với môi trường của chúng so với động vật trên cạn. Thực tế, trong nước nuôi thủy sản, mầm bệnh sinh sôi độc lập với vật chủ, sinh vật cơ hội có thể đạt mật độ cao xung quanh động vật thủy sinh [31]. Hơn nữa, vi khuẩn hiện diện trong môi trường nước ảnh hưởng đến thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột [14]. Do sự tương tác tích cực giữa môi trường và động vật thủy sản nuôi, chế phẩm sinh học phải được điều chỉnh cho phù hợp với nuôi trồng thủy sản: “vi sinh vật sống bổ sung với tác dụng có lợi đối với vật chủ bằng cách thay đổi cộng đồng vi sinh vật liên quan đến vật chủ hoặc môi trường xung quanh, đảm bảo cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặc nâng cao giá trị dinh dưỡng của nó, tăng cường phản ứng của vật chủ đối với dịch bệnh, cải thiện chất lượng môi trường xung quanh” [46] Sử dụng chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản cho kết quả ưu việt hơn hẳn sử dụng hóa chất cũng như thuốc kháng sinh. Hóa chất chỉ làm sạch nước tạm thời và giết chết hàng loạt tảo trong đầm. Hơn nữa, thay vì cần phải làm sạch chất hữu cơ và lắng cặn bùn thì hóa chất lại góp phần hình thành nên lớp bùn dày hơn ở đáy đầm tạo điều kiện cho các vi sinh vật gây hại phát triển. Bên cạnh đó, nhiều loài tôm, cá và động vật thủy sinh khác cũng có thể bị chết bởi hóa chất. 4
Hậu quả của việc dùng thuốc kháng sinh cũng không kém phần nghiêm trọng, chất kháng sinh cũng làm chết nhiều loại vi khuẩn có hại nhưng cũng làm chết vi khuẩn có ích, do đó làm giảm tốc độ các quá trình chuyển hóa sinh học trong nước, đồng thời, giảm khả năng tạo miễn dịch tự nhiên của chúng. Sử dụng thuốc kháng sinh lâu dài, bừa bãi không theo hướng dẫn sẽ dẫn đến vi sinh vật gây bệnh nhờn thuốc. Việc sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản còn giúp đối động vật hấp thụ thức ăn dễ dàng hơn, giảm hệ số tiêu thụ thức ăn, tăng năng suất thu hoạch từ 20 – 30% [40]. Probiotic được dùng cho nuôi trồng thủy sản phải có khả năng ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe vật chủ như loại trừ cạnh tranh [10], bổ sung enzyme vào quá trình tiêu hóa và tăng cường phản ứng miễn dịch [11]. 1.2. Bacteriocin trong chăn nuôi tôm Bacteriocin là một nhóm không đồng nhất của các peptit hoặc protein của vi khuẩn có hoạt tính sinh học, được tổng hợp từ ribosom, có hoạt tính kháng khuẩn. Bacteriocin có tính chất sinh hóa khá đa dạng về KLPT, cơ chế hoạt động, phổ hoạt động, vị trí và trình tự của axit amin trong chuỗi. Bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus và Propionibacterium) và vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Shigella, Serratia, Klebsiella và Pseudomonas). Trong cơ sở dữ liệu truy cập mở của Bactibase có hơn 200 bacteriocin. Bacteriocin và vi sinh vật tạo ra bacteriocin đang được quan tâm hơn trong y học và trong bảo quản thực phẩm [24]. Bacteriocin ổn định hơn và hiệu quả hơn ở pH axit, ở nhiệt độ cao hơn hoặc nhiệt độ thấp hơn. Bacteriocin đóng vai trò như các rào cản diệt khuẩn, ví dụ bacteriocin (Lysozyme) là protein có nguồn gốc động vật, phân giải tế bào vi khuẩn Gram dương và được dùng để ngăn chặn sự hình thành khí phomát. Lysozyme và nisin có tác động hiệp đồng để làm bất hoạt chủng Listeria monocytogenes. Một số bacteriocin (lactocin S) có tốc độ tiêu diệt chậm hơn nhiều so với những loại khác. Kết hợp các bacteriocin hoạt tính nhanh và chậm trong thực phẩm có thể cho phép thực phẩm an toàn lâu hơn. Ngoài ra, bacteriocin được 5
sử dụng như một biện pháp xử lý cùng với các phương pháp phát hiện nhanh khác để loại bỏ tạp nhiễm trong sản xuất bia [44]. Bacteriocin là sản phẩm sinh học sinh ra trong quá trình lên men tăng sinh khối probiotic với tác dụng kháng khuẩn, là yếu tố mang lại lợi ích trực tiếp cho nuôi tôm. Vì vậy có thể sử dụng trực tiếp bacteriocin đã được sản xuất từ một quy trình chuẩn, bổ sung vào quy trình chăn nuôi theo liều lượng chuẩn đã được tính toán khoa học (cho ăn và cho vào xử lý nước). So với bổ sung sinh khối probiotic, bổ sung bacteriocin không bị phụ thuộc vào điều kiện nuôi tôm có thể làm thay đổi sự tăng sinh khối của probiotic ảnh hưởng tới hoạt tính, liều lượng của bacteriocin. Việc sử dụng chế phẩm bacteriocin được sản xuất trong điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn và có hoạt lực sinh học cao bổ sung trực tiếp vào ao nuôi ngay lập tức tiêu diệt các hại khuẩn, các mầm bệnh trong ao nuôi, đảm bảo có tác dụng kháng khuẩn tốt nhất thậm chí trong ngày (24 giờ) trước khi thay nước là giải pháp đột phá và có ý nghĩa quan trọng, phù hợp với tình hình nuôi tôm thực tế tại Việt nam và đúng với khoa học, mang lại hiệu quả thành công, an toàn, bảo vệ sức khoẻ người tiêu thụ sản phẩm và bảo vệ môi trường. Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn. Bacteriocin có tính chất sinh hóa khá đa dạng về khối lượng phân tử, cơ chế hoạt động, phổ hoạt động, vị trí và trình tự của axit amin trong chuỗi. Sinh tổng hợp bacteriocin diễn ra dưới sự kiểm soát của các gen trên plasmid hoặc ADN chứa các yếu tố di truyền. Bacteriocin được sinh tổng hợp từ các loại vi khuẩn Gram dương (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus và Propionibacterium) và vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Shigella, Serratia, Klebsiella và Pseudomonas). Bacteriocin có các đặc điểm lí tưởng trong bảo quản sinh học thực phẩm. Nhiều bacteriocin bền trong điều kiện nhiệt độ chế biến cao và hoạt động trong phạm vi pH rộng. Bacteriocin không mùi, không màu, không vị, ít ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột, có phổ kháng khuẩn, mầm bệnh và vi khuẩn gây hỏng 6
thực phẩm tương đối rộng. Một số bacteriocin có hiệu quả cao khi sử dụng phối hợp với các yếu tố kháng khuẩn khác như hợp chất phenolic tự nhiên cũng như những protein kháng khuẩn khác. Ngoài ra, sự kết hợp bacteriocin với xử lý vật lí như áp suất cao hay xung điện trường giúp bảo quản thực phẩm hiệu quả hơn, nhất là đối với những dạng có khả năng sống sót cao như vi khuẩn sinh bào tử. Tính hiệu quả của bacteriocin thường bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, thành phần thực phẩm và cấu trúc, cũng như vi khuẩn thực phẩm. Do đó, cần xác định hiệu quả của bacteriocin cho mỗi hệ thống thực phẩm. Những năm gần đây đã có những nghiên cứu phát triển phương pháp mới trong bảo quản thực phẩm, đặc biệt là các bacteriocin. Tuy nhiên đến nay, tác dụng của các bacteriocin trong thực phẩm còn tương đối hạn chế. Chủng sản xuất phải có dạng GRAS (Generally regarded as safe - vi sinh vật an toàn), phải được thử nghiệm tính độc, không có rủi ro về sức khỏe qua quá trình xác định các mặt như ảnh hưởng tích lũy, điều phối và tiềm tàng. Hiện nay có hai bacteriocin được thương mại là nisin từ Lactococcus lactis và pediocin PA-1/AcH từ Pediococcus acidilactici, chúng đều được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Nisin và pediocin PA-1/AcH có tên thương mại tương ứng là Nisaplin, ALTA). 1.3. Nuôi tôm công nghệ cao Những năm gần đây mô hình nuôi tôm công nghệ cao được áp dụng rộng rãi ở nhiều khu vực, nhiều tỉnh thành và mang lại thành công lớn cho bà con nuôi trồng thủy sản. Mô hình nuôi tôm công nghệ cao mang lại hiệu quả cao gấp nhiều lần so với các mô hình truyền thống. Nuôi tôm công nghệ cao là một mô hình nâng cao năng suất và chất lượng của tôm nuôi nhờ vào sự kiểm soát toàn bộ quá trình nuôi tôm, phân tích, lưu trữ và kiểm soát các tiêu chí, chỉ số của nước. Ngoài ra mô hình nuôi tôm công nghệ cao còn là sự kết hợp của hệ thống bao gồm ao nuôi, ao lắng, ao trữ nước, ao xử lý chất thải, hệ thống xử lý nước phù hợp với từng giai đoạn. Việc kiểm soát chế độ dinh dưỡng và an toàn sinh học trong nuôi tôm công nghệ cao rất quan trọng và được ưu tiên hàng đầu với việc đầu tư trang thiết bị và vận hành hệ thống tự động hoá, ao lót bạt, sục khí tự động, thay nước thường 7
xuyên. Việc thay nước hàng ngày khi tôm đạt kích thước lớn (sau 30 ngày) để hạn chế ô nhiễm làm cho chi phí vận hành tăng cao, hệ vi sinh vật không có đủ thời gian cần thiết để có thể phân giải chất hữu cơ trong ao nuôi hoặc tăng sinh khối để sinh tổng hợp các kháng khuẩn hay enzyme để làm sạch nước. Đầm nuôi tôm là những hệ sinh thái nước không đặc trưng do chịu nhiều tác động của con người. Hệ sinh thái đầm nuôi tôm được cấu thành bởi nước, khoáng chất, các hợp chất hữu cơ hòa tan và sinh vật thuỷ sinh. Vi sinh vật là một thành phần quan trọng của hệ thủy vi sinh vật ở đây vì chúng không những đóng vai trò chủ đạo trong các chu trình chuyển hóa các nguyên tố cơ bản cấu tạo nên hợp chất hữu cơ mà tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên nguồn lợi thủy sản [2]. Các hợp chất hữu cơ trong ao có nguồn gốc khác nhau: thức ăn dư thừa, phân tôm, chất tiết ra từ mọi quá trình trao đổi chất của thủy sinh vật, xác động vật, thực vật phù du…. Do đó, nếu nồng độ của chúng trong nước quá cao sẽ gây ô nhiễm nguồn nước, gây ra các hội chứng sốc ở tôm. Nấm, động vật nguyên sinh và một số vi khuẩn là vi sinh vật dị dưỡng nên chúng cần chất hữu cơ từ bên ngoài môi trường. Chúng sử dụng những chất này để thu nhận các tiền chất cho việc xây dựng nên tế bào và thu nhận năng lượng cho các quá trình sống. Vật chất hữu cơ được vi sinh vật biến đổi thành tế bào và trong điều kiện phù hợp thì chuyển hóa ngược lại thành những chất vô cơ ban đầu. Bên cạnh khả năng phân giải chất hữu cơ, nhóm vi khuẩn có ích còn có khả năng cạnh tranh sinh học, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh ở tôm là Vibrio và Aeromonas [47]. Đối với dinh dưỡng trong nuôi tôm, hàm lượng dinh dưỡng trong công thức cám tôm rất cao (thậm chí rất cao so với các loại vật nuôi xác lớn khác). Thành phần nguyên liệu của thức ăn viên cho tôm thường gồm 35% bột cá, 25% bánh dầu nành, 25% bột mì và 15% chất phụ gia bổ sung khác. Tôm là loài thủy sản ăn và bắt mồi chậm nên sau khi thức ăn được đưa vào nước thì có tới 20% thức ăn là không được tôm ăn vào mà còn lại trong môi trường ao. Thức ăn vào ruột tôm chỉ thực sự hấp thu 30% vào cơ thể, còn lại 70% là vào môi trường nước. Như vậy với 20% thức ăn thức ăn thất thoát và 50% phân tôm sẽ tồn tại trong ao nuôi ở 8
dạng chất thải hữu cơ là nguồn ô nhiễm cho ao nuôi. Ruột tôm rất ngắn, hệ cơ quan nội tạng rất đơn giản, hoạt động của hệ tiêu hoá, gan tuỵ và hệ thống các enzymes đường ruột rất yếu kém. Lượng thức ăn vào hệ thống tiêu hoá là quá tải đối với hệ tiêu hoá tôm, tạo sức ép, gánh nặng lên hoạt động tiêu hoá, gan tuỵ, (tôm dễ mắc bệnh gan tuỵ). Ngoài việc lãng phí thức ăn làm tăng chi phí cao, tôm rất nhạy cảm với các điều kiện bất lợi và sức khoẻ tôm dễ bị ảnh hưởng. Lượng thải ra môi trường ao nuôi trong ngày là rất lớn gây ô nhiễm, đặc biệt trong điều kiện nuôi tôm với mật độ dày đặc. Trong khoảng thời gian gần đây nghề nuôi tôm đang đối mặt với rất nhiều thách thức, dịch bệnh, môi trường ô nhiễm và hiện tượng tôm chết hàng loạt gây ra thiệt hại lớn về kinh tế. Đáng quan tâm nhất là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính [19] hay còn gọi là hội chứng chết sớm (early mortality syndrome – EMS) [28]. Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 2009, ở Việt Nam vào năm 2010 rồi đến Thái Lan và Mã Lai vào năm 2011 [28], [19]. Bệnh này xuất hiện và gây chết hàng loạt trên tôm nuôi ở các Tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Trà Vinh, Bến Tre và Kiên Giang. Bệnh xuất hiện ở tôm sú và tôm thẻ khoảng 10 - 45 ngày sau khi thả giống, tỉ lệ chết có thể lên đến 100% ở những ao nhiễm nặng. Tác nhân gây ra hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mang thể thực khuẩn (Bateriophage) [29]. Hiện nay có nhiều biện pháp được đề xuất để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng hoại tử gan tụy cấp như: dùng hóa chất diệt khuẩn, sử dụng kháng sinh, áp dụng biện pháp sinh học,.... Tuy nhiên, biện pháp sử dụng hóa chất, kháng sinh dễ gây ra nguy cơ phát sinh nhiều loài vi khuẩn gây bệnh kháng với kháng sinh. Thêm vào đó, sự tồn dư thuốc trong thực phẩm cũng là chỉ tiêu quan trọng trong kiểm định nhập khẩu sản phẩm nông nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới. Vì thế, cách tốt nhất là sử dụng biện pháp sinh học, dùng vi khuẩn có lợi probiotic có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh. Biện pháp này không những có thể kiểm soát được mật độ vi khuẩn gây bệnh mà còn đảm 9
bảo an toàn vệ sinh thực phẩm và có lợi cho môi trường do chỉ sử dụng các loài vi khuẩn hữu ích [3] Với tác dụng kháng khuẩn, tiêu diệt được nhiều vi khuẩn có hại, bacteriocin giúp tôm khoẻ, hạn chế được lượng kháng sinh dùng trong chăn nuôi tôm, góp phần cho bảo vệ môi trường và tạo ra nguồn thực phẩm là tôm an toàn, không bị dư lượng kháng sinh, đảm bảo sức khoẻ người tiêu dùng và tăng tỷ lệ thành công trong nuôi tôm cao sản bằng công nghệ cao. Bacteriocin phát triển ngành nuôi tôm, giúp xuất khẩu tôm sạch ra thế giới, mang lại ý nghĩa quan trọng cho ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại vào sản xuất và chế biến thực phẩm. Việc sử dụng probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) còn giúp đối động vật hấp thụ thức ăn dễ hơn giảm hệ số tiêu thụ thức ăn tăng năng suất 20 – 30% [40]. Probiotic được dùng cho NTTS có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe vật chủ [41] như loại trừ cạnh tranh [10] bổ sung enzyme vào quá trình tiêu hóa [11]và tăng cường phản ứng miễn dịch. Vi sinh vật là một thành phần quan trọng của hệ thủy vi sinh vật ở đây, nó tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên nguồn lợi thủy sản [2],[8]. Các vi sinh vật có lợi làm giảm ô nhiễm nguồn nước, bổ sung vào nguồn dinh dưỡng cần thiết cho thủy sản [12]. Trong môi trường nước nuôi tôm và cá chứa các loại hợp chất hữu cơ thường chứa hàm lượng cao: protein, cacbonhidrate, kitin,… Sự phân hủy protein bởi nhiều loại vi khuẩn như Pseudomonas, Clostridium, Bacillus và Enterobacteriaceae trong nước nuôi [6]. Nhóm vi sinh vật hữu ích chuyển hóa các hợp chất cacbonhydrate bao gồm các chi Bacillus, Lactobacillus, Streptococus, Cellulomonas, Aerobacter … Bên cạnh khả năng phân giải chất hữu cơ, nó còn có khả năng cạnh tranh sinh học, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh ở tôm là Vibrio và Aeromonas ở cá [47]. Do đó, phân lập và chọn lựa được chủng vsv tiềm năng sinh tổng hợp bacteriocin, có tính chất probiotic định hướng dùng trong NTTS là rất cần thiết. 10
1.4. Tổng quan các công trình nghiên cứu, sản xuất bacteriocin trong và ngoài nước Các vi sinh vật như Bacillus, Lactobacillus, nhóm vi khuẩn quang dưỡng, hóa dưỡng… được sử dụng chủ yếu để sản xuất các chế phẩm sinh học. Chúng không độc hại, dễ nuôi cấy, dễ tồn tại trong môi trường nước và đất nghèo dinh dưỡng. Chúng có khả năng phân huỷ thức ăn thừa, chất thải hữu cơ và làm sạch môi trường nhờ các enzyme do chúng tạo ra. Ngoài ra chúng còn có khả năng sinh các chất kháng khuẩn như bacteriocin được dùng trong chăn nuôi, bảo quản thực phẩm, nâng cao hiệu suất tăng trưởng, hiệu suất sử dụng thức ăn của động vật nuôi, làm giảm sự sinh sôi và phát triển của những vi sinh vật có hại. Nhờ những đặc điểm này mà chúng được sử dụng để cải thiện môi trường nước, nâng cao hiệu quả kinh tế, hạn chế dịch bệnh cho tôm. Nhóm vi khuẩn Bacillus tiềm năng sản sinh bacteriocin, sinh enzyme ngoại bào. Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rất rộng trong tự nhiên (đất, nước, không khí, thực phẩm…) và gồm nhiều nhóm sinh thái khác nhau (ưa ấm, ưa nhiệt, ưa lạnh…), với khoảng gần 500 loài và dưới loài. Các hoạt chất sinh học của chúng cũng vô cùng phong phú: các enzyme ngoại bào, các chất kháng khuẩn, bacteriocin và kháng nấm, các chất kích thích sinh trưởng thực vật, các chất hoạt động bề mặt [5]. Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng tạo nội bào tử khi gặp điều kiện bất lợi như cạn kiệt nguồn dinh dưỡng, điều kiện bất lợi về nhiệt độ cao, tia bức xạ, hóa chất… Bào tử có thể tồn tại trong nhiều năm, khi gặp điều kiện thuận lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào dinh dưỡng. Bacillus là những vi khuẩn hóa tự dưỡng hữu cơ tùy tiện có khả năng sử dụng nhiều các hợp chất hữu cơ như các loại đường, axit amin, các axit hữu cơ. Một số ít loài như B. megaterium lại không cần đến các yếu tố sinh trưởng hữu cơ, một số khác sinh trưởng lại cần có vitamin B hoặc các axit amin. Phần lớn Bacillus là các vi khuẩn ưa ấm, tối ưu 30 – 45oC, một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 65oC. Một số loài ưa lạnh có thể sinh 11