Luận văn Thạc sĩ Hóa học vô cơ: Hoàn thiện công nghệ bán tổng hợp β-glucan sulfate từ nấm men Saccharomyces cerevisiae làm nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:74

Thêm vào BST

Báo xấu

10
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn so sánh hàm lượng β-glucan trong men bánh mì và hàm lượng β-glucan trong sản phẩm sulfate hóa để tính được hiệu suất chuyển hóa β-glucan thành sulfate β-glucan, và so sánh cấu trúc β-glucan tinh sạch với cấu trúc sản phẩm sulfate β-glucan, để chứng tỏ đã xảy ra quá trình sulfate hóa, tôi đồng thời thực hiện 2 qui trình.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Hóa học vô cơ: Hoàn thiện công nghệ bán tổng hợp β-glucan sulfate từ nấm men Saccharomyces cerevisiae làm nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư

LỜI CAM ĐOAN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn, chỉ bảo của Thầy hướng dẫn và tôi chỉ sử dụng những tài liệu đã ghi trong mục tài liệu tham khảo, ngoài ra không sử dụng bất cứ tài liệu nào khác mà không trích dẫn. Các nghiên cứu chung trong nội dung dự án CNHD.DA.030/19-20: “Hoàn thiện công nghệ bán tổng hợp β-glucan sulfate từ nấm men Saccharo- myces cerevisiae làm nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư”, tôi đã được Thầy hướng dẫn, là chủ nhiệm dự án, cho phép sử dụng báo cáo trong luận văn, vì luận văn này là kết quả đào tạo của dự án. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên. Nha Trang, ngày tháng 8 năm 2020 Học viên Bùi Trường Xuân
LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến thầy TS. NCVC. Nguyễn Duy Nhứt – Giám đốc trung tâm ứng dụng công nghệ mới – Viện Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Trong suốt thời gian học và thực hiện luận văn tôi đã nhận được sự quan tâm tạo điều kiện thuận lợi của Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang, Học viện Khoa học và Công nghệ, Phòng Đào tạo, Khoa Hóa học, và các anh chị trong Trung tâm nghiên cứu tiên tiến và sáng tạo Hòn Chồng đã tận tình hướng dẫn cho tôi trong thời gian qua. Một lần nữa tôi xin cảm ơn Quý Thầy Cô giáo Viện Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang, Trường Đại học Nha Trang, Trường Đại học Khánh Hòa đã dạy dỗ nhiệt tình, tận tâm trong suốt các môn học. Tôi đã tích lũy được rất nhiều kiến thức, kinh nghiệm hay và bổ ích. Và cuối cùng, tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu trường THPTDL Lê Thánh Tôn Nha Trang, đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành khóa học. Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày tháng 8 năm 2020 Học viên Bùi Trường Xuân
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Danh mục 1 PS Polysaccharide 2 DMSO Dimethyl sulfoxide 3 CPC Cetylpyridinium Chloride 4 [BMIM]Cl 1-Butyl-3-methylimidazolium chloride 5 SG Sulfate β-glucan 6 FT-IR Fourier Transform Infrared 7 HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation 8 kDa Kilodalton 9 DMF Dimethylformamide 10 FDA Food and Drug Administration 11 DS Degree of Sulfation
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các hợp chất có trong thành tế bào nấm men bánh mì ................. 14 Bảng 1.2. Một số dạng β-glucan được tinh chế từ tự nhiên ............................ 14 Bảng 1.3. Một số β-glucan có hoạt tính sinh học thường sử dụng ................. 15 Bảng 1.4. Liều gây chết trung bình của một số dung môi .............................. 28 Bảng 2.1. Các hóa chất chính được sử dụng trong luận văn........................... 31 Bảng 2.2. Một số dụng cụ/thiết bị sử dụng chính trong luận văn ................... 32 Bảng 3.1. Hàm lượng β-glucan các mẫu kiểm................................................ 44 Bảng 3.2. Các đỉnh của các nhóm chức đặc trưng cơ bản của β-glucan ........ 47 Bảng 3.3. Số liệu NMR của β-glucan tách chiết ............................................. 48 Bảng 3.4. Hàm lượng sulfate của mẫu sulfate β-glucan thu được .................. 49 Bảng 3.5. Các đỉnh của các nhóm chức đặc trưng của sulfate β-glucan ........ 52 Bảng 3.6. Độ dịch chuyển của carbon có nhóm thế sulfate ............................ 53
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae ................................... 9 Hình 1.2. Cấu trúc của 𝛽-glucan trong thành tế bào nấm men ..................... 12 Hình 1.3. Cấu trúc natri sulfate β-1,3-glucan .............................................. 18 Hình 2.1. Men bánh mì Saf-instant® đỏ ......................................................... 30 Hình 2.2. Qui trình điều chế sulfate β-glucan và β-glucan từ men bánh mì ... 34 Hình 2.3. Cấu trúc các đoạn mạch β-glucan và phổ HSQC của β-(1→3,1→6)- glucan tương ứng theo DatainBrief 15(2017)382–388 . ................................. 39 Hình 2.4. Phổ FT-IR của sulfate β-glucan .................................................... 40 Hình 2.5. Phổ FT-IR của sulfate β-glucan .................................................... 41 Hình 2.6. Phổ CNMR sản phẩm sulfate hóa S-RVS3-II, glucan RVS3-II ..... 41 Hình 3.1. Phổ hồng ngoại của β-glucan chuẩn (A). ........................................ 45 Hình 3.2. Phổ hồng ngoại của β-glucan tách chiết (B) ................................... 46 Hình 3.3. Phổ HSQC của β-glucan tách chiết................................................. 48 Hình 3.4. Phổ IR của β-glucan (A) ................................................................. 51 Hình 3.5. Phổ IR của sulfate β-glucan (C). ..................................................... 52 Hình 3.6. Phổ CNMR của β-glucan (A) và sulfate β-glucan (B) từ luận văn 53 Hình 3.7. Chuyển dịch tín hiệu cộng hưởng của β-glucan do sulfate hóa ...... 54
1 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỤC LỤC................................................................................................. 1 LỜI NÓI ĐẦU .......................................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................... 6 1.1. NẤM MEN BÁNH MÌ SACCHAROMYCES CEREVISIAE: .... 6 1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ β-GLUCAN ..................................... 11 1.3. CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SULFATE β-GLUCAN: ........... 17 1.3.1. Cấu trúc sulfate β-glucan....................................................... 17 1.3.2. Hoạt tính sinh học của sulfate 𝛃-glucan................................ 18 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ....................................................... 23 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ......................................... 23 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .......................................... 25 1.5. MỤC TIÊU LUẬN VĂN ............................................................. 28 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................... 30 2.1. NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT ................................ 30 2.1.1. Mô tả nguồn gốc nguyên liệu ................................................ 30 2.1.2. Hóa chất ................................................................................. 31
2 2.1.3. Dụng cụ/thiết bị: .................................................................... 32 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 32 2.2.1. Tách chiết chuẩn bị mẫu β-glucan từ men bánh mì .............. 32 2.2.2. Sulfate hóa men bánh mì chuẩn bị mẫu sulfate β-glucan: .... 33 2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng sulfate trong sulfate β- glucan............................................................................................... 35 2.2.4. Phương pháp định lượng sulfate β-glucan: ........................... 35 2.2.5. Phương pháp định lượng β-glucan trong nấm men và mẫu sản phẩm thu được từ sulfate hóa nấm men. ......................................... 36 2.2.6. Xác định hiệu suất sulfate hóa 𝛃-glucan từ men bánh mì..... 38 2.3. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC SẢN PHẨM...................................... 39 2.3.1. Xác định β-glucan ................................................................. 39 2.2.2. Xác định cấu trúc sulfate β-glucan:....................................... 40 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ............................................ 42 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................... 43 3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT Β-LUCAN VÀ TỔNG HỢP SULFATE β-GLUCAN TỪ MEN BÁNH MÌ. .................................. 43 3.1.1. Xác định β-glucan từ nấm men, β-glucan luận văn, sulfate β- glucan............................................................................................... 44 3.1.2. Xác định hiệu suất chuyển hóa β-glucan từ men bánh mì thành sulfate β-glucan: .................................................................... 49 3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC SẢN PHẨM SULFATE β-GLUCAN 49 3.2.1. Hàm lượng sulfate ................................................................. 49 3.2.2. Phổ IR của sản phẩm sulfate β-glucan: ................................. 51 3.2.3 Phổ HSQC của sản phẩm β-glucan sulfate từ luận văn ......... 52
3 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................... 55 PHỤ LỤC
4 LỜI NÓI ĐẦU Chuyển hóa một glucan thành nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư là tăng thêm khả năng đẩy lùi bệnh, tăng cường sức khỏe cho hàng trăm ngàn người trong cộng đồng người Việt Nam mỗi năm. Do đó, năm 2017, Học Viện Khoa Học và Công Nghệ thuộc Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã phê duyệt đề tài: “Nghiên cứu qui trình công nghệ tổng hợp sulfate β-glucan từ nấm men bánh mì nhằm tạo nguồn nguyên liệu hỗ trợ điều trị ung thư” [1]. Trong báo cáo tổng hợp kết quả nghiên cứu của đề tài vào năm 2019 có đưa ra một qui trình công nghệ mới: “sulfate hóa trực tiếp men bánh mì để thu nhận sulfate β-glucan”. Đây là hướng nghiên cứu mới đã được Hội đồng khoa học Học viện Khoa học và Công nghệ nghiệm thu, tuy nhiên một số nội dung không thuộc yêu cầu nghiên cứu của đề tài nên tác giả chỉ đưa ra, chưa làm rõ. Trong đó có quá trình phân tích xác định hiệu suất và phân tích cấu trúc của sản phẩm. Nhằm mục đích sử dụng được qui trình sulfate hóa trực tiếp men bánh mì để sản xuất sulfate β-glucan, đưa ra thị trường cần thiết phải xác định hiệu suất của qui trình và cấu trúc của sản phẩm. Từ đó, được sự đồng ý và phê duyệt của Học viện Khoa học và Công nghệ, tôi đã tiến hành thực hiện luận văn “Xác định hiệu suất và cấu trúc của sulfate β-glucan bán tổng hợp từ men bánh mì” Trong luận văn, nhằm mục đích so sánh hàm lượng β-glucan trong men bánh mì và hàm lượng β-glucan trong sản phẩm sulfate hóa để tính được hiệu suất chuyển hóa β-glucan thành sulfate β-glucan, và so sánh cấu trúc β-glucan tinh sạch với cấu trúc sản phẩm sulfate β-glucan, để chứng tỏ đã xảy ra quá trình sulfate hóa, tôi đồng thời thực hiện 2 qui trình. Qui trình thứ nhất: tách chiết β-glucan tinh sạch từ men bánh mì bằng chất lỏng ion làm mẫu đối chứng trước khi sulfate hóa. Qui trình thứ hai: sulfate hóa trực tiếp men bánh mì để thu nhận sulfate β-glucan. Từ các kết quả thực nghiệm thu được từ hai qui trình nói trên tôi tiến hành các phân tích sau:
5 1. Phân tích xác định hàm lượng β-glucan trong sản phẩm tách chiết, sulfate và sulfate β-glucan trong sản phẩm sulfate hóa trực tiếp để tính hiệu suất qui trình sulfate hóa trực tiếp men bánh mì thu nhận sulfate β-glucan. 2. Phân tích cấu trúc sản phẩm sulfate β-glucan thu được từ qui trình.
6 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. NẤM MEN BÁNH MÌ SACCHAROMYCES CEREVISIAE: Nấm men được sử dụng để làm nở bánh mì, từ trước khi con người biết được hình thái, cấu tạo và đặc tính sinh lý, sinh hóa của chúng. Lúc đầu, người Châu Âu để bột mì lên men tự nhiên và làm bánh. Người ta thấy nếu để bột mì lên men tự nhiên thì khối lượng bột sẽ nhiều hơn và khi nướng bánh sẽ có mùi thơm và vị chua hấp dẫn, nhưng người ta không biết tại sao lại thế. Sau đó, vào thế kỷ 17 người Châu Âu không cho bột mì lên men tự nhiên nữa mà sử dụng nấm men bia để nhào bột. Kết quả của việc làm này là khối bột nở đều hơn, bánh thơm hơn, đặc biệt là không chua như cho ủ tự nhiên. Năm 1850 bắt đầu giai đoạn rất quan trọng trong sự phát triển của công nghệ sản xuất nấm men bánh mì. Người Châu Âu đã biết sản xuẩt sinh khối nấm men bánh mì dạng nhão (dạng paste). Lúc đầu họ lấy cặn nấm men từ quá trình sản xuất rượu, chuyển cặn nấm men này sang thùng đựng nấm men, rửa sạch nấm men bằng nước lạnh và đưa vào máy ép vít. Năm 1878, L. Pasteur nghiên cứu ảnh hưởng của oxy đến sự phát triển của nấm men. Kết quả cho thấy khi có mặt oxy hiệu suất thu nhận nấm men rất cao. Khó khăn nhất trong việc cung cấp oxy cho quá trình lên men ở giai đoạn này là người Châu Âu sử dụng môi trường nhão, do đó oxy rất khó phân tán đều vào khối nhão này. Năm 1886, người Châu Âu bắt đầu thay đổi môi trường. Người ta không dùng môi trường nhão nữa mà sử dụng dung dịch nước đường. Bột lúa mì hay đại mạch được thủy phân thành đường, sau đó người ta dùng nước đường này để sản xuất nấm men. Năm 1900, người ta sử dụng máy ly tâm tốc độ cao để tách nước ra khỏi nấm men và phương pháp nuối cấy nấm men được hoàn thiện dần. Sau đó, người ta thay bột thủy phân bằng mật rỉ hoặc phế liệu nhà máy đường, nhà máy bánh kẹo. Lượng đường dùng để lên men cũng giảm dần, lưu lượng khí được tăng lên để tăng khả năng hô hấp của nấm men.
7 Năm 1916, xuất hiện nhà máy đầu tiên thực hiện những cải tiến này. Năm 1940 nhà máy men bánh mì lớn nhất Châu Âu với công suất 16500 tấn / năm được xây dựng ở Moscow. Từ đó đến nay, hầu như nước Châu Âu nào cũng có hàng chục nhà máy lớn, nhỏ sản xuất nấm men bánh mì. Giống [Chi] Saccharomyces có khoảng 40 loài [2], và các loài trong giống này được biết nhiều do chúng được ứng dụng trong làm nổi bánh, bia, rượu,… chúng hiện diện nhiều trong sản phẩm có đường, đất, trái cây chín, phấn hoa. Một số loài đại diện: Saccharomyces bayanus Saccharomyces boulardii Saccharomyces bulderi Saccharomyces cariocanus Saccharomyces cariocus Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces chevalieri Saccharomyces dairenensis Saccharomyces ellipsoideus Saccharomyces martiniae Saccharomyces monacensis Saccharomyces norbensis Saccharomyces paradoxus Saccharomyces pastorianus Saccharomyces spencerorum Saccharomyces turicensis
8 Saccharomyces unisporus Saccharomyces uvarum Saccharomyces zonatus Trong đó, được con người sử dụng phổ biến nhất là Saccharomyces cerevisiae, nó được dùng để sản xuất rượu vang, bánh mì và bia từ hàng nghìn năm trước [3]. Men bánh mì có khá nhiều loại khác nhau, về cơ bản, được chia thành các loại như sau: Loại men thứ nhất, fresh yeast/compressed yeast: là men nở tươi, loại này có màu nâu ngà, mềm và ẩm, thường được đóng thành từng khối để dễ dùng tay bóp vụn khi sử dụng. Men nở tươi thường có hạn sử dụng khá ngắn tuy nhiên đây lại là loại men giúp bánh có mùi vị thơm ngon đặc trưng cũng như giúp bánh nở mềm xốp tốt hơn. Loại men thứ hai, active dry yeast: còn gọi là men khô, đây là loại men phổ biến và thông dụng nhất, loại men khô này có dạng hạt màu nâu ngà nhưng ở dạng hạt và đóng gói chứ không đóng khối như men tươi. Hai loại men nở phổ biến và tính ứng dụng cao trong làm bánh: Instant yeast (Men Instant): một số nơi xem loại men này giống men nổi nhanh. Men Instant được phát triển từ những năm 1960 ở Pháp, loại men này thường được sử dụng để làm bánh chuyên nghiệp và công nghiệp. Mặc dù men Instant khá khô và khá giống active dry yeast (men khô) nhưng cách sử dụng khác nhau. Rapid-rise hoặc quick-rise yeast: còn gọi là men nở nhanh. Nấm men Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có trong bánh mì nên thường gọi là men bánh mì là một loại vi sinh vật thuộc chi Saccharomyces lớp Ascomycetes, bộ Endomycetes, họ Saccha- romycetaceae, giống Saccharomyces [4]. Loài này có thể xem là loài nấm hữu dụng nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay. Nó được dùng rộng rãi trong quá trình lên men làm bánh mì, rượu, và bia.
9 Hình 1.1. Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [5] Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ 5-14 mircomet. Saccharomyces là loại nấm men thuộc nhóm cơ thể đơn bào, gồm có nấm men chìm và nấm men nổi: Nấm men chìm (lager): hầu hết các tế bào khi quan sát thì nảy chồi đứng riêng lẻ hoặc cặp đôi. Hình dạng chủ yếu là hình cầu. Nấm men nổi (ale): tế bào nấm men mẹ và con sau khi nảy chồi thường dính lại với nhau tạo thành chuỗi tế bào nấm men. Hình dạng chủ yếu là hình cầu hoặc ovan với kích thước 7-10 micromet. Sự khác nhau giữa nấm men nổi và nấm men chìm: là khả năng lên men các loại đường trisaccharide, ví dụ raffinose. Trong nấm men chìm có enzyme có thể sử dụng hoàn toàn đường raffinose, trong khi đó nấm men nổi chỉ sử dụng được 1/3 đường saccharose. Ngoài ra chúng còn khác nhau về khả năng hô hấp, khả năng trao đổi chất khi lên men và khả năng hình thành bào tử. Quá trình trao đổi chất của nấm men chìm chủ yếu xảy ra trong quá trình lên men, còn của nấm men nổi xảy ra mạnh trong quá trình hô hấp, vì vậy sinh khối nấm men nổi thu được nhiều hơn nấm men chìm. Nấm men chìm có nồng độ enzyme thấp hơn nấm men nổi. Khả năng tạo bào tử của nấm men chìm lâu hơn và hạn chế hơn nấm men nổi.
10 Nấm men Saccharomyces gồm những thành phần chủ yếu sau: Vách tế bào. Màng tế bào chất: nằm sát vách tế bào, có cấu tạo chủ yếu là lipoprotein, giữ vai trò điều hòa vận chuyển các chất dinh dưỡng cho tế bào. Tế bào chất: gồm có mạng lưới nội chất là vị trí của nhiều hệ thống enzyme khác nhau, đảm bảo sự vận chuyển vật chất cho tế bào và các cấu tử khác nhau như bộ máy golgi, lysosom, không bào, (chứa các sản phẩm bị phân cắt, hay chất độc lạ có thể có hại cho tế bào). Năng lượng cung cấp cho tế bào qua những phản ứng xảy ra trong ti thể cũng nằm trong tế bào chất. Trong tế bào chất có nhân chứa thông tin di truyền cho tế bào và các thành phần liên quan trong quá trình sinh tổng hợp và sinh sản của tế bào. Nhân nấm men có phần trên là trung thể (centrosome) và centrochrometin và phần đáy của nhân có thêm không bào (vacuole), bên trong chứa 6 cặp nhiễm sắc thể (NST) và bên ngoài màng nhân có nhiều ti thể bám quanh. Ngoài ra còn có hạt glycogen, hạt mỡ dự trữ chất dinh dưỡng cho tế bào. Thành phần hoá học của tế bào nấm men Saccharomyces khác nhau tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy, thành phần các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và tình trạng sinh lý của tế bào. Nấm men ép có chứa 70 -75% nước, 25 - 30% còn lại là chất khô. Nước: bao gồm phần nước nằm bên ngoài tế bào và phần nước nằm trong tế bào. Lượng nước khác nhau tuỳ thuộc vào chủng nấm men, kỹ thuật nuôi và phương pháp thu tế bào. Ví dụ: khi nuôi trong môi trường NaCl thì lượng nước trong tế bào giảm. Thành phần chất khô của tế bào nấm men bao gồm protein và các chất có nitơ khác chiếm 50% , chất béo 1,6%, hydratcarbon 33,2%, mô tế bào 7,6%, tro 7,6%. Thành phần của những chất này không cố định, nó có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy cũng như quá trình lên men. Hydratcarbon gồm: polysaccharide, glycogen, trehalose (12 -12,5%), mannan (18,7-24,9%), glucan (9,47-10,96%) và chitin.
11 Những nghiên cứu động học về sự biến đổi hydrat cacbon trong quá trình bảo quản nấm men cho thấy là glucan, mannan và dạng glycogen tan trong kiềm và hydrochloric acid là yếu tố cấu trúc của tế bào, trong khi trehalose và glycogen tan trong acetic acid, là chất tạo năng lượng chính cho tế bào. Hàm lượng trehalose trong nấm men có liên quan đến tính bền vững của nó: lượng trehalose càng cao nấm men càng bền. Chất mỡ của nấm men là mỡ trung tính glycerol, phospho lipide, sterol tự do và nhiều sterol, ester. Tro chiếm 6,5-12% lượng chất khô trong nấm men và dao động tùy theo môi trường nuôi cấy. Đối với màng tế bào của saccharomyces cerevisiae, β-glucan (bao gồm 1,3 và 1,6) chiếm khoảng 30% [6]. 1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ β-GLUCAN Lịch sử của về hợp chất β-glucan bắt đầu với nghiên cứu về khả năng đặc biệt của một hợp chất thô được chiết xuất từ thành tế bào nấm men bánh mì, gọi là Zymosan vào năm 1940 của TS. Louis Pillemer và cộng sự. Nhóm nghiên cứu đã tìm thấy những bằng chứng khoa học về khả năng kích hoạt phản ứng miễn dịch, tiêu diệt các tác nhân gây bệnh hoặc mầm bệnh bao gồm virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng và khối u của Zymosan. Bản chất của Zymosan là phức hợp các protein, lipid và polysaccharide, tuy nhiên vào thời điểm đó Pillemer và các cộng sự của ông chưa lý giải được tại sao và bằng cách nào Zymosan có thể kích hoạt hệ thống miễn dịch từ đó tăng cường sức đề kháng bẩm sinh của cơ thể hay thành phần nào trong chế phẩm này đóng vai trò kích hoạt phản ứng miễn dịch [7]. Trong những năm 1960, TS. Riggi và Di Luzio đã khám phá ra hợp chất kích hoạt phản ứng miễn dịch đặc hiệu có trong thành phần của chế phẩm Zymosan (sau khi kiểm tra hai thành phần lipid và mannoprotein) là β-glucan, một chuỗi polysaccharide tính đến thời điểm này chưa ghi nhận những tác dụng phụ hay độc tố ảnh hưởng tiêu cực đến cơ thể [8].
12 Hình 1.2. Cấu trúc của 𝛽-glucan trong thành tế bào nấm men [9] Kể từ bước đột phá quan trọng này, một lượng lớn các nghiên cứu khoa học đã được thực hiện để làm rõ khả năng kích hoạt miễn dịch của β-glucan cũng như tác dụng đề kháng khối u của phân tử này [10, 11]. Glucans là các polyme của glucose và có nguồn gốc từ nấm men, vi khuẩn, nấm và thực vật. β-(1-3)-Glucans có mạch chính gồm các gluco-pyranose liên kết với nhau tại vị trí C1 của vòng đường này và C3 của vòng đường khác. β-glucan từ lúa mạch có rất ít hoặc không có hoạt tính, β-glucan từ yến mạch có thể giảm nguy cơ bệnh tim, β-glucan trong nấm lớn có phân nhánh với chỉ một phân tử glucose và chỉ tăng cường miễn dịch đến một mức nào đó. Bên cạnh đó, β-glucan chiết từ thành tế bào nấm men bánh mì phân nhánh rất mạnh và nó có khả năng tăng hoạt tính miễn dịch mạnh nhất trong tất cả các loại β-glucan [12]. β-glucan từ men bánh mì (cũng là men bia) có thể thu được bằng cách
13 lên men tăng sinh khối, mà không cần thông qua nuôi trồng nông nghiệp, nên đây là nguồn sản xuất β-glucan có giá thành nguyên liệu thấp nhất. Đồng thời β-glucan từ men bánh mì đã được FDA chấp thuận tại văn bản “FDA Specifications 184.1983”. β-Glucan có thể được phân lập từ các vách tế bào của bánh mì và men bia S. cerevisiae [3]. Đối với việc khai thác và tinh chế các β-glucans từ nấm men, một số lượng đáng kể các phương pháp và công nghệ khác nhau đã được đề xuất và nhiều người trong số họ đã được cấp bằng sáng chế [13]. Các phương pháp khai thác β-glucan đầu tiên được dựa trên phương pháp thủy phân kiềm acid và sau quá trình oxy hóa tế bào bằng sodium hypochlorite. Trong những năm gần đây, phương pháp tách chiết bằng công nghệ sinh học với các enzyme và / hoặc kết hợp sử dụng siêu âm đã được phát triển [14-16]. Các bước quan trọng trong quá trình tách chiết là phân giải tế bào nấm men và sau đó tinh chế màng tế bào, mà phải giữ cho chuỗi glucose ít bị cắt ngắn, sự phân cắt β-glucan làm giảm khối lượng phân tử và chúng tan vào dung dịch, do đó làm giảm năng suất [17]. Những năm vừa qua, sinh khối chất thải men từ ngành công nghiệp sản xuất bia đã được xử lý để sản xuất β-glucan [2, 18] nhưng men từ quá trình sản xuất rượu vang vẫn chưa được chưa sử dụng [14]. Bằng các nghiên cứu của các tác giả Klis và các cộng sự, 2002; Kath & Kulicke, 1999; Lessage & Bussey, 2006; Kwiatkowski và các cộng sự., 2009 [19-22]; đã cho thấy thành phần trong thành tế bào nấm men bánh mì chứa các loại hợp chất glucan, mannoprotein và chitin, được mô tả trong bảng 1.1. Thành phần chính trong thành tế bào nấm men bánh mì là β-glucan, chiếm hơn 50% về khối lượng nên việc nghiên cứu về các hoạt tính của chúng là dễ dàng và góp phần quan trọng thúc đẩy quá trình sản xuất thực phẩm chức năng hay dược phẩm từ chúng.
14 Bảng 1.1. Các hợp chất có trong thành tế bào nấm men bánh mì [23] Hợp chất Trọng lượng thành tế bào (%) (13)-β-D-glucan 50-55 (16)-β-D-glucan 5-10 (14)-α-(13)-β-D-glucan 3-7* Mannoprotein complex 35-40 Chitin 2 Bảng 1.2. Một số dạng β-glucan được tinh chế từ tự nhiên Tính Tên Nguồn tan Nguồn Nhóm thương Cấu trúc tinh chế trong TLTK mại nước Grifola Grifolan Mạch phân nhánh Tan [24] frondosa (GRN) chứa liên kết β-1,3:1,6 Nấm mũ (Mushroom) Lentinan Lentinus Mạch phân nhánh (LNT) Tan [25] edodes chứa liên kết β-1,3:1,6 Ganoderma Mạch phân nhánh P-SG Tan [26] lucidum chứa liên kết β-1,3:1,6 Agaricus Mạch phân nhánh Tan [27] blazel
15 Mạch không phân Auricularia nhánh gồm các liên Tan [27] auriculajudae kết β-1,3 Mạch không phân Không tan Cordyceps nhánh gồm các liên [28] sinensis kết β-1,3 Mạch không phân Hericium HEP3 nhánh gồm các liên Ít tan [29] erinaceus kết β-1,3 chizophyllum Mạch phân nhánh [30, commune SPG Tan chứa liên kết β-1,3:1,6 31] Fries Mạch có độ phân Sclerotinia [32, SSG nhánh cao chứa liên Tan sclerotiorum 33] kết β-1,3:1,6 WGPs Betafect- Bao gồm tất các kiểu Không tan Nấm men Saccharomy- in [34- liên kết trong cấu trúc ces cerevisiae (PGG) 37] β-glucan Zymo- san Bảng 1.3. Một số β-glucan có hoạt tính sinh học thường sử dụng β-glucan Nguồn gốc tinh chế TLTK Zymosan Saccharomyces cerevisiae [35]