Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp multiplex PCR xác định một số tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------

Phạm Thị Thùy

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP

MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC

NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

----------

Phạm Thị Thùy

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP

MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC

NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Lã Thị Huyền

PGS.TS. Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2016

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan: Luận văn là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân,

được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nguyễn Quang Huy và

TS. Lã Thị Huyền.

Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

Phạm Thị Thùy

Lời cảm ơn

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:

PGS. TS. Nguyễn Quang Huy – Trưởng khoa Sinh học - Trường đại học Khoa

học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội và TS. Lã Thị Huyền – Phụ trách phòng

Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm và Khoa

học Việt Nam đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành

luận văn thạc sĩ.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Sinh học – Trường đại học

Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội nói chung và thầy cô giáo chuyên

ngành Sinh học thực nghiệm học nói riêng đã chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện

thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Hóa sinh, khoa Vi sinh và các khoa phòng

liên quan của Bệnh viện Thanh Nhàn đã cung cấp mẫu thí nghiệm cho tôi.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cô chú, anh chị và các bạn công tác tại phòng

phòng Công nghệ Tế bào Động vật cùng toàn thể các cô chú, anh chị và các bạn

đồng nghiệp Khoa Hóa sinh – Bệnh viện 198 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện

thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những người thân, bạn bè đã

động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian qua.

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

Phạm Thị Thùy

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3

1.1. Nhiễm khuẩn huyết .......................................................................................... 3

1.1.1. Khái niệm, lịch sử và tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và Việt

Nam ...................................................................................................................... 3

1.1.2. Dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết............................................................... 7

1.2. Tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp ................................... 7

1.2.1. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus ........................................................ 8

1.2.2. Acinetobacter baumannii ........................................................................... 9

1.2.3. Klebsiella pneumoniae ............................................................................. 11

1.2.4. Pseudomonas aeruginosa ........................................................................ 12

1.2.5. Escherichia coli ....................................................................................... 14

1.3. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết ........................................... 15

1.3.1. Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết bằng phương pháp cấy máu ................... 15

1.3.2. Lai huỳnh quang tại chỗ .......................................................................... 15

1.3.3. Các kỹ thuật khuếch đại DNA ................................................................. 16

1.3.4. Giải trình tự .............................................................................................. 18

1.4. Multiplex PCR và ứng dụng ........................................................................... 19

1.4.1. Giới thiệu chung về multiplex PCR ......................................................... 19

1.4.2. Các loại phản ứng multiplex PCR ........................................................... 19

1.4.3. Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR ............................................. 20

1.4.4. Ưu điểm của phương pháp multiplex PCR .............................................. 21

1.4.5. Tối ưu hóa các thành phần cho phản ứng multiplex PCR ....................... 22

1.4.6. Ứng dụng của phản ứng multiplex PCR .................................................. 24

1.4.7. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc xác định các tác nhân nhiễm

khuẩn huyết ........................................................................................................ 25

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 27

2.1. Vật liệu ........................................................................................................... 27

2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm ............................................................................. 27

2.1.2. Thiết bị ..................................................................................................... 28

2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 28

2.2.1. Thiết kế primer ........................................................................................ 29

2.2.2. Tách chiết DNA ....................................................................................... 29

2.2.3. Phương pháp làm giàu DNA vi khuẩn..................................................... 30

2.2.4. Xác định nồng độ DNA ........................................................................... 31

2.2.5. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ............................................ 31

2.2.6. Phương pháp PCR.................................................................................... 32

2.2.7. Phương pháp giải trình tự gen ................................................................. 33

2.2.8. Đạo đức trong nghiên cứu ....................................................................... 34

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 35

3.1. Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi đặc hiệu gen đích ....................................... 35

3.2. Kết quả kiểm tra các cặp mồi bằng thực nghiệm ........................................... 38

3.2.1. Kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ các chủng vi khuẩn ........................ 38

3.2.2. Kết quả PCR kiểm tra từng cặp mồi đơn trên các chủng vi khuẩn đích . 39

3.2.3. Kết quả xác định trình tự các sản phẩm PCR từ các chủng vi khuẩn

Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa ......................................................... 40

3.2.4. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi ................................................... 43

3.2.5 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích trong

phản ứng multiplex PCR.................................................................................... 45

3.3. Kết quả tối ưu phản ứng multiplex PCR xác định đồng thời 5 vi khuẩn đích ....... 47

3.3.1. Kết quả tối ưu nồng độ mồi của phản ứng multiplex PCR ...................... 47

3.3.2. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi của phản ứng multiplex PCR ............... 48

3.3.3. Kết quả lựa chọn Master Mix trong phản ứng multiplex PCR ................ 50

3.4. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các chủng nhiễm

khuẩn thuần ........................................................................................................... 51

3.5. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm ....... 53

3.5.1. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các mẫu bệnh

phẩm cấy máu .................................................................................................... 53

3.5.2. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các mẫu lâm

sàng .................................................................................................................... 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 62

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tiêu chí đặt tên của ACCP / SCCM [16] .................................................... 4

Bảng 2.1. Trình tự Nucleotide của các cặp mồi ........................................................ 27

Bảng 3.1. Trình tự mồi và kích thước sản phẩm PCR theo tính toán lý thuyết ........ 37

Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm phản ứng multiplex PCR.......................................... 52

Bảng 3.3. So sánh kết quả multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu ......... 55

với kết quả của phương pháp cấy máu ...................................................................... 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa các phản ứng viêm toàn thân và nhiễm trùng, vùng giao

nhau chỉ ra nhiễm khuẩn huyết [16, 56]. ..................................................................... 5

Hình 1.2. Hình ảnh và cấu trúc gen vi khuẩn Staphylococcus aureus ........................ 8

Hình 1.3. Hình ảnh và cơ chế xâm nhập của vi khuẩn Acinetobacter baumannii .... 10

Hình 1.4. Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Klebsiella pneumonia ....................... 11

Hình 1.5. Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ................. 13

Hình 1.6. Hình ảnh và phân loại vi khuẩn Escherichia coli ..................................... 14

Hình 1.7. Mô hình mô tả phản ứng multiplex PCR .................................................. 20

Hình 3.1. Điện di kiểm tra DNA tổng số của các chủng Staphylococcus aureus,

Acinetobacter baumannii, Escherichia

coli, Klebsiella pneumoniae và

Pseudomonas aeruginosa tách chiết từ các chủng chuẩn ......................................... 38

Hình 3.2. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các chủng vi

khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tương ứng. ................................................................ 40

Hình 3.3. Kiểm tra khả năng nhân bản đặc hiệu của các cặp mồi femA, gltA, oprL, mdh,

phoA với các chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas

aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli. .............................................. 43

Hình 3.4. Kiểm tra tính đặc hiệu giữa các cặp mồi và các gen đích trong phản ứng

multiplex PCR. .......................................................................................................... 45

Hình 3.5. Tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng multiplex PCR. .................................. 47

Hình 3.6. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR ............................ 49

Hình 3.7. Lựa chọn thành phần Mastermix trong phản ứng multiplex PCR ............ 50

Hình 3.8. Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm cấy

máu. ........................................................................................................................... 53

Hình 3.9. Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu lâm sàng.................. 59

American College of Chest Physicians

ACCP

Wash buffer AW1

AW1

Wash buffer AW2

AW2

Bệnh nhân

Deoxyribonucleic acid (acid Deoxyribonucleic)

DNA

Deoxyribonucleoside triphosphate

dNTP

Ethylenediaminetetraacetic acid

EDTA

Ethidium bromide

EtBt

Ethanol

EtOH

Intensive care unit (Đơn vị chăm sóc đặc biệt )

ICU

Multilocus sequence typing (Xác định trình tự nhiều

MLST

gen đặc trưng)

MRSA

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu

vàng kháng Methicillin)

Mutiplex PCR

Phản ứng khuếch đại nhiều DNA đích

Nhiễm khuẩn huyết

NKH

Nhân viên y tế

NVYT

Platelet-activating factor

PAF

Ribonucleic acid (Acid Ribonucleic)

RNA

Socity Critical Care Medicine

SCCM

Sodium dodecyl sulfate

SDS

Single nucleotide polymorphism (Đa hình sợi đơn )

SNP

Tris-EDTA-Acetic acid

TAE

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một bệnh nhiễm khuẩn toàn thân nặng,

gây ra do vi khuẩn và độc tố của vi khuẩn lưu hành trong máu. NKH có nguy

cơ tử vong cao do sốc nhiễm khuẩn và rối loạn chức năng nhiều cơ quan. Đặc

điểm lâm sàng của NKH rất đa dạng, diễn tiến thường nặng và không có

chiều hướng tự khỏi nếu không được điều trị kịp thời.

Nhiều năm qua, NKH vẫn là một trong mười nguyên nhân chủ yếu gặp

ở bệnh nhân nhập viện. Theo báo cáo của Trung tâm thống kê quốc gia chăm

sóc sức khỏe của Mỹ cho thấy: Năm 2008, bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết

nhập viện tăng gấp đôi so với năm 2000 (326.000 so với 727.000) . Đặc biệt,

nghiên cứu của Elixhauser A. và tập thể (2009), nhiễm khuẩn huyết ngay lúc

nhập viện là 836.000 ca. Chi phí điều trị mỗi ca NKH dao động từ 10.000-

50.000 đô la và lên tới 17 tỷ đô la mỗi năm cho các trường hợp NKH và thời

gian nằm viện trung bình tăng thêm 19,6 ngày. Theo thống kê của

Fleischmann C. và tập thể (năm 2016) dựa trên 1553 báo cáo từ năm 1979

đến năm 2015 của các nước cho thấy: Đối với các nước thu nhập cao, cứ

100.000 người nhập viện mỗi năm có 437 trường hợp nhiễm khuẩn huyết

(sepsis) và 270 trường hợp nhiễm trùng khuẩn nặng (severe sepsis) và tỉ lệ tử

vong là 17% đối với nhiễm khuẩn huyết và 26% đối với các nhiễm khuẩn

huyết nặng trong thời gian này. Theo tính toán ngoại suy của các nhà khoa

học này ước tính toàn cầu có khoảng 31,5 triệu ca nhiễm khuẩn huyết và 19,4

triệu trường hợp nhiễm khuẩn huyết nặng, và khoảng 5,3 triệu người chết mỗi

năm.

Bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết thường có tiến triển bệnh nhanh,

đặc biệt là ở các đối tượng trẻ em và người già. Vì vậy, việc phát hiện sớm tác

nhân gây bệnh có ý nghĩa quan trọng để điều trị kịp thời và góp phần hạn chế

biến tính, giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết. Hiện nay,

cấy máu kết hợp với xét nghiệm sinh hóa là phương pháp phổ biến nhất để

phát hiện mầm bệnh. Phương pháp này tiến hành đơn giản, dễ thao tác với chi

phí thấp nhưng có nhược điểm là tốn nhiều thời gian, không loại trừ được

trường hợp âm tính giả.

Việc phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân được

cho là một phương pháp có độ nhạy và chính xác cao. Tuy nhiên, cho đến

hiện nay vẫn chưa có phương pháp phát hiện DNA của vi khuẩn nào được cho

là chuẩn để ứng dụng vào chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết. Vì vậy, nghiên cứu

xây dựng một phương pháp chẩn đoán nhanh, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao

đang là nhu cầu bức thiết hiện nay. Multiplex PCR có thể coi là giải pháp cho

những vấn đề trên. Phương pháp này sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một

phản ứng cho phép phát hiện nhiều loại tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết trong

thời gian ngắn với độ chính xác cao.

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên

cứu xây dựng phƣơng pháp multiplex PCR xác định một số tác nhân gây

nhiễm khuẩn huyết” nhằm góp phần vào việc chẩn đoán và điều trị cho các

bệnh nhân nghi ngờ mắc nhiễm khuẩn huyết tại Việt Nam. Nội dung chính

của đề tài bao gồm:

 Lựa chọn và thiết kế các mồi đặc hiệu các gen đích của các

chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết.

 Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex PCR.

 Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm

của bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Nhiễm khuẩn huyết

1.1.1. Khái niệm, lịch sử và tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và

Việt Nam

Trong lịch sử, nhiễm khuẩn huyết là một bệnh rất khó khăn để xác định

và chẩn đoán. Từ 100 trước công nguyên, các học giả La Mã (116 TCN-27

TCN) đã mô tả về nhiễm khuẩn huyết như sau: “những sinh vật nhỏ, không

thể nhìn thấy bằng mắt, có đầy trong không khí và qua hơi thở gây ra các

bệnh nguy hiểm”. Tiếp đó các nhà sử học, nhà triết học, nhân chủng học và

tiêu biểu là một học giả thời kì phục hưng Niccolo Machiavelli (1469-1527)

trong báo cáo của mình cũng đã lần lượt mô tả đầy đủ về nhiễm khuẩn huyết.

Ngày nay, chúng ta đã biết rằng sốt lao phổi không phải nhiễm khuẩn

huyết. Tuy nhiên trong một thời gian dài, sốt lao phổi được cho là nhiễm

khuẩn huyết bởi trong giai đoạn y học chưa phát triển, việc mô tả nhiễm

khuẩn huyết rất khó để được chấp nhận cho đến khi triệu chứng bệnh trở nên

rõ ràng và khó khăn trong điều trị cùng với tính nghiêm trọng của bệnh thì

người ta bắt đầu quan tâm hơn và nỗ lực tìm hiểu đưa ra khái niệm về nhiễm

khuẩn huyết [8]. Trong thực tế sự hiện diện của nhiều vi sinh vật gây bệnh

hay độc tố của chúng trong máu hoặc mô dẫn tới sự phủ định của những khái

niệm chung này đồng thời kéo theo vô số nỗ lực phát triển về dịch tễ học, các

công cụ chẩn đoán và xét nghiệm để xác định nhiễm khuẩn huyết [9].

Vào năm 1992, American College of Chest Physicians (ACCP) và

Socity Critical Care Medicine (SCCM) cùng công bố các khái niệm của

nhiễm trùng huyết (Bảng 1, Hình 1) [16]. Đây là một trong những khái niệm

phổ biến nhất về nhiễm khuẩn huyết trong các đơn vị chăm sóc sức khỏe y tế

đặc biệt, các trung tâm dịch vụ chăm sóc sức khỏe chuyên sâu khác nhau trên

khắp thế giới. Việc mô tả biểu hiện của các phản ứng viêm toàn thân và đưa

ra định nghĩa cụ thể cho nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn huyết nặng, sốc

nhiễm trùng và hội chứng rối loạn chức năng đa cơ quan là những vấn đề

quan trọng trong lĩnh vực nhiễm khuẩn huyết [14, 16, 56].

Bảng 1.1 Tiêu chí đặt tên của ACCP / SCCM [16]

Tiêu chí đặt tên

của ACCP / Dấu hiệu, Triệu chứng

SCCM

Nhiệt độ cơ thể > 38°C hoặc <36°C, Nhịp tim ≥90 bpm,

Hội chứng Khả năng hô hấp ≥ 20 lần / phút (hoặc PaCO2 <32 mmHg)

đáp ứng viêm Tế bào bạch cầu ≥ 12,000 / µl hoặc ≤ 4000 / µl hoặc > 10%

chưa phát triển các triệu chứng.

Nhiễm khuẩn Ít nhất có hai tiêu chí của hội chứng đáp ứng viêm hoặc

huyết nghi ngờ nhiễm trùng.

Nhiễm khuẩn huyết với rối loạn chức năng cơ quan cấp tính Nhiễm khuẩn (bao gồm cả tăng truyền dịch và hạ huyết áp) gây ra bởi huyết nặng nhiễm trùng huyết.

Nhiễm khuẩn huyết với hạ huyết áp kéo dài hoặc hoặc tràn Sốc nhiễm trùng dịch mô mặc dù chất lỏng hồi sức thích hợp.

Xuất hiện rối loạn chức năng nội tạng tại một bệnh cấp tính Hội chứng rối loạn bệnh nhân không thể duy trì cân bằng nội mô khi không có chức năng nội tạng tác động hỗ trợ.

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa các phản ứng viêm toàn thân và nhiễm trùng,

vùng giao nhau chỉ ra nhiễm khuẩn huyết [16, 56].

Nhiễm khuẩn huyết là một trong những nguyên nhân gây bệnh tật và tử

vong hàng đầu ở các bệnh nhân phải nhập viện trên toàn thế giới. Đây là một

tình trạng bệnh lý do đáp ứng của cơ thể với sự có mặt của vi khuẩn hay các

vi sinh vật gây bệnh khác hoặc độc tố được tạo ra bởi sinh vật gây bệnh lưu

hành trong máu và đi tới khắp các cơ quan trong cơ thể. Nhiễm khuẩn huyết

gây ra các triệu chứng lâm sàng đa dạng, suy đa tạng, sốc nhiễm khuẩn với tỉ

lệ tử vong rất cao (từ 20 – 50%), trong đó sốc nhiễm khuẩn là biểu hiện nặng

của nhiễm khuẩn huyết [15].

Mặc dù tần suất mắc nhiễm khuẩn huyết khác nhau tùy theo quốc gia,

bệnh viện, mùa trong năm, đường vào của vi khuẩn và đối tượng bệnh nhân,

nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ NKH chỉ chiếm 3 - 10% bệnh nhân

(BN) nhập viện và có thể tăng tới 75% nếu BN nằm điều trị tại khoa Hồi sức

tích cực (HSTC). Bệnh gây tỷ lệ tử vong cao, dao động 30 - 50% tùy theo

nghiên cứu của các tác giả ở những bệnh viện (BV) khác nhau trên thế giới

[12, 24]. NKH trong các đơn vị chăm sóc đặc biệt là một thách thức lớn đối

với các bác sĩ điều trị [68].

Tại Mỹ, một nghiên cứu trong vòng 22 năm từ năm 1979 - 2000 trên

những

BN xuất viện cho thấy, có tổng số 10.319.418 trường hợp được chẩn đoán là

NKH, chiếm 1,3% số BN nhập viện, trong đó các trường hợp mắc mới là

17,3%/năm. Tần suất mắc bệnh trên 100.000 dân cư tăng từ 164.000 ca

(82,7ca/100.000 dân) năm 1979 lên tới 660.000 ca (240,5 ca/100.000 dân)

trong những năm gần đây. Tuy nhiên, ngược lại tỷ lệ tử vong lại giảm từ

28,7% (năm 1979 – 1984) xuống còn 17,9% (năm 1995 – 2000) do những nỗ

lực can thiệp trong chẩn đoán, điều trị đem đến [55]. Một nghiên cứu khác

của Lambiase và tập thể (2011) cho thấy tỷ lệ NKH tiên phát tăng từ

11,6/10000 ca (năm 2000) lên đến 24/10000 ca (năm 2008) và NKH mắc phải

trong quá trình nằm viện tăng từ 22,1/10.000 ca (năm 2000) lên đến

37/10.000 ca (năm 2008) [48].

Tại Anh, nghiên cứu của Harrison và tập thể (2006) trên 92.673 BN

nhập viện cho thấy, tình trạng NKH nặng xuất hiện trong vòng 24 giờ đầu

tăng từ 23,5% (1996) lên đến 28,7% (2004) và tử vong cũng tăng từ 9.000 ca

(48,3%) năm 1996 lên đến 14.000 ca (44,7%) năm 2004 [37].

Nghiên cứu của Jason và tập thể (2011), tại 150 khoa HSTC của 16

nước trong khu vực châu Á, tỷ lệ NKH trên BN nằm tại khoa HSTC tỷ lệ dao

động từ 5 – 53% tùy theo quốc gia [40]. Nghiên cứu của Divatia và tập thể

(2012), ở Ấn độ trên BN nhập vào khoa HSTC cho thấy, tỷ lệ NKH là 26% và

tử vong là 38% [27].

Tại Việt nam, trong báo cáo của Nguyễn Văn Kính và Tập thể (2008),

khi phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh tại Việt Nam cho thấy, tỷ lệ NKH

nói chung là 8% [3]. Mới đây, nghiên cứu của Vũ Đình Phú và tập thể (2013)

ở các khoa HSTC của 15 bệnh viện trong toàn quốc cho thấy tỷ lệ NKH

chiếm 10,4% [4].

1.1.2. Dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết

 Các dấu hiệu và triệu chứng chung: Sốt cao (đôi khi hạ thân nhiệt), thở

nhanh hoặc nhiễm kiềm hô hấp, tràn dịch, phù nề.

 Dấu hiệu chung về phản ứng gây viêm: Tăng hoặc giảm số lượng tế bào

bạch cầu, tăng dấu hiệu viêm (C-reactive protein, procalcitonin,

interleukin-6).

 Thay đổi huyết áp động mạch: Hạ huyết áp động mạch, nhịp tim nhanh

không rõ nguyên nhân, áp lực mạch máu thấp, tràn dịch dưới da, lượng

nước tiểu giảm.

 Các dấu hiệu của rối loạn chức năng nội tạng: thiếu oxy máu (tổn

thương phổi cấp tính), tình trạng thần kinh bị ảnh hưởng, không giải

thích được thay đổi chức năng thận, tăng đường huyết, giảm tiểu cầu

hoặc đông máu nội mạch rải rác, không rõ nguyên nhân thay đổi trong

các thử nghiệm chức năng gan (bilirubin), không dung nạp thức ăn

(thay đổi nhu động ruột) [21]

1.2. Tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thƣờng gặp

Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu hoặc từ

các ổ nhiễm khuẩn ở mô và cơ quan như: Da, mô mềm, cơ, xương khớp, hô

hấp, tiêu hóa... Ban đầu, bệnh được mô tả gắn liền với các vi khuẩn Gram âm.

Nguyên nhân là do nhiễm khuẩn huyết được coi là một phản ứng của cơ thể

với nội độc tố (endotoxin) một phân tử tương đối đặc hiệu cho các vi khuẩn

Gram âm. Tuy nhiên trong giai đoạn 1979-2000, nguyên nhân gây nhiễm

khuẩn huyết do vi khuẩn Gram dương lại chiếm ưu thế [17].

Trong các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết, Staphylococcus

aureus là chủng Gram dương phổ biến nhất, còn Acinetobacter baumannii,

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa chiếm

ưu thế trong các chủng Gram âm [38].

Tác nhân gây NKH nổi lên hiện nay là vi khuẩn Gram âm và Gram

dương bởi bệnh cảnh lâm sàng thường nặng và hay kèm theo có sốc nhiễm

khuẩn. Tử vong ở bệnh nhân có sốc nhiễm khuẩn, có thể lên tới 80%. Hơn

nữa, việc điều trị mầm bệnh là vi khuẩn rất khó khăn do khả năng đề kháng

với kháng sinh cao của chúng [79]. Do đó phương pháp xác định nhanh tác

nhân gây nhiễm khuẩn là hết sức quan trọng. Phương pháp multiplex PCR

hiện nay là phương pháp có khả năng đáp ứng được yêu cầu của thực tế. Vì

vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu phát hiện 5 chủng vi sinh vật gây nhiễm

trùng huyết phổ biến (Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii,

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa) sử

dụng phương pháp multiplex PCR với mong muốn góp phần vào việc phát

hiện sớm nhiễm khuẩn huyết và góp phần điều trị hiệu quả.

1.2.1. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dương hàng đầu gây nhiều

bệnh khác nhau, từ bệnh nhẹ về da, nhiễm trùng mô mềm tới ảnh hưởng đời

sống bệnh nhân như nhiễm trùng sau phẫu thuật, nhiễm trùng huyết và hội

chứng sốc độc tố. Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) và

Staphylococcus aureus mẫn cảm với Methicillin (MSSA) là nguyên nhân gây

tỷ lệ lớn nhiễm trùng bệnh viện dẫn tới điều trị khó khăn [65].

Hình 1.2. Hình ảnh và cấu trúc gen vi khuẩn Staphylococcus aureus

(http://suckhoedoisong.vn/han-che-benh-do-vi-khuan-tu-cau-n80035.html)

http://www.jenner.ac.uk/staphylococcus-aureus

https://www.pinterest.com/pin/519462138241501307/

Theo nghiên cứu của Anthony và tập thể (2016), trong số 71 bệnh nhân

được chăm sóc đặc biệt thì số bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết chiếm 49%,

nguyên nhân do Staphylococcus aureus chiếm tỉ lệ cao nhất (18,2%) và 8%

Staphylococcus aureus được phân lập kháng Methicillin [11].

Trong thập kỷ qua, các trường hợp nhiễm MRSA ngày càng gia tăng,

MRSA gây nhiễm khuẩn bệnh viện và nhiễm khuẩn mắc phải từ cộng đồng

bao gồm viêm nội mạc tim, viêm tủy xương, hội chứng sốc nhiễm độc, viêm

phổi, ngộ độc thực phẩm và nhọt độc [39]. MRSA kháng methicillin ở tụ cầu

qua trung gian PBP2a, một loại protein được gọi là protein liên kết penicillin

(78 kDa). Protein này có ái lực thấp với nhóm kháng sinh β-lactam. Gen femA

mã hóa cho protein PBP2a kháng methicillin, do đó gen này được sử dụng

như một marker phân tử phát hiện MRSA [40, 42].

Staphylococcus aureus kháng Methicillin được phát hiện trong một

nghiên cứu của Hassanain và tập thể (2009). Trong nghiên cứu này các tác giả

sử dụng phương pháp nhân bản gen đa mồi. 5 gen được nhân bản bao gồm:

16S rRNA của chi Staphylococcus, MecA của Staphylococcus aureus, gen

MecA mã hóa cho kháng methicillin, gen Luks mã hóa sản xuất của Panton-

Valentine leukocidin (PVL) cytotoxin hoại tử và một gen nội chuẩn để tránh

hiện tượng âm tính giả. Thử nghiệm trên 230 chủng phân lập lâm sàng, cho

thấy phương pháp có độ nhạy 97,6% và độ đặc hiệu lên tới 99,3% [38, 75].

1.2.2. Acinetobacter baumannii

Acinetobacter baumannii là cầu trực khuẩn, gram âm, hiếu khí, không

lên men glucose. Nhu cầu sinh trưởng đơn giản và khả năng chống chịu các

điều kiện môi trường rất cao do vậy Acinetobacter baumannii xuất hiện phổ

biến trong môi trường và là một phần của hệ vi khuẩn trong cơ thể người [44].

Trong những nghiên cứu gần đây, chúng ngày càng được chỉ ra là một vi sinh

vật quan trọng trong các loại nhiễm trùng khác nhau ở bệnh viện bao gồm

nhiễm trùng do viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiết niệu,

nhiễm trùng vết thương và viêm màng não [45]. Acinetobacter baumannii có

khả năng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt cùng với khả năng tiếp nhận và

tích lũy các gen kháng kháng sinh cao cấp dẫn tới sự kháng thuốc hàng loạt

[22, 48].

Hình 1.3. Hình ảnh và cơ chế xâm nhập của vi khuẩn Acinetobacter

baumannii

http://acinetobacterbaumannii.com/

http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fcimb.2013.00095/full

Nguyễn Thị Thanh Hà đã tiến hành nghiên cứu lâm sàng trên 287 bệnh

nhân NKH do Acinetobacter baumannii và nhận thấy: NKH gặp nhiều ở trẻ

em, tử vong cao (33,1%), lâm sàng thường nặng và diễn tiến nặng gặp ở

người lớn nhiều hơn trẻ em với tỷ lệ tử vong cao hơn (50,8% so với 20,4%),

hôn mê nhiều hơn (26,6% và 13,7%), phải hô hấp hỗ trợ nhiều (40% và

22,1%), tỷ lệ sốc nhiễm khuẩn cao (45,8% và 26,3%), suy đa tạng nhiều hơn

(45,8% và 31,7%), phải sử dụng thủ thuật xâm lấn nhiều hơn và người lớn có

nguy cơ tử vong cao hơn trẻ em [2]. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Multiplex-PCR đã phát hiện gen OXA trên 62 chủng Acinetobacter

baumannii từ những BN được chẩn đoán NKH: 62 chủng đều mang gen

OXA_51 (100%); 36 chủng mang gen OXA_23 rải rác ở cả 6 bệnh viện của 3

miền Bắc, Trung và Nam, 7 chủng mang gen OXA_58 chỉ gặp ở miền Bắc và

Nam. Đặc biệt, các chủng Acinetobacter baumannii mang gen OXA_58

kháng kháng sinh lên đến 100% với nhóm carbapenem, 100% với ceftazidin.

Các chủng mang gen OXA_23 có mức kháng thấp hơn với imipenem

(66,7%), meropenem (55,6%) và kháng rất cao với ceftazidine (91,6%) và

thấp nhất với cefepim (30,5%) [2].

1.2.3. Klebsiella pneumoniae

Klebsiella pneumoniae là vi khuẩn gram âm và là mầm bệnh cơ hội

chiếm tới 10% tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện, là nguyên nhân phổ biến của bệnh

nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi ở bệnh nhân

suy giảm miễn dịch, đồng thời là tác nhân gây bệnh quan trọng đối với bệnh

nhiễm trùng cộng đồng [49]. Tầm quan trọng của Klebsiella pneumoniae

trong cơ sở y tế đang gia tăng do khả năng kháng kháng sinh phổ rộng β-

lactamase của chúng. Các nghiên cứu chỉ ra rằng sinh vật kháng kháng sinh

phổ rộng có xu hướng đa kháng thuốc dẫn tới khả năng thất bại trong điều trị.

Do vậy mà chúng ngày càng đóng vai trò quan trọng trong nhiễm trùng bệnh

viện và nhiễm trùng cộng đồng [50].

Hình 1.4. Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Klebsiella pneumonia

https://www.pinterest.com/pin/383087512037727953/

Một số phương pháp sinh học phân tử đã được sử dụng cho việc phát

hiện Klebsiella pneumoniae như phân tích đa hình nhân bản ngẫu nhiên

DNA (RAP-PCR), điện di trường xung đẩy hoặc đa hình khuếch đại các đoạn

dài (AFLP) [51]. Tuy nhiên, các phương pháp này dựa trên các băng điện

di vì vậy kết quả có thể không rõ ràng, nhưng nhìn chung các phương pháp

này rất thích hợp để điều tra khu trú dịch tễ học. Tuy nhiên, rất khó để so sánh

kết quả do phòng thí nghiệm khác nhau công bố cho thực hiện một phân tích

dịch tễ học trên toàn thế giới. Để khắc phục những hạn chế của các phương

pháp trên, phương pháp xác định trình tự nhiều gen đặc trưng (MLST) đã

được phát triển, đó là một phương pháp giải trình tự nucleotide các đoạn trình

tự điển hình của vi khuẩn hoặc nấm [52]. Phương pháp này dễ dàng được

chuẩn hóa, lưu trữ và trao đổi thông tin điện tử. Nó được áp dụng thành công

cho việc khu trú dịch tễ học của một loạt các vi khuẩn gây bệnh quan trọng ở

mức lâm sàng như Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus,

Enterococcus faecium, Neisseria meningitidis và Campylobacter jejuni. Gần

đây, phương pháp MLST nhằm phát hiện Klebsiella pneumoniae sử dụng 7

gen quản gia bao gồm rpoB, GAPA, MDH, PGI, phoE, infB, và tonB đã được

phát triển [53].

1.2.4. Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn, Gram âm được tìm thấy phổ

biến trong môi trường tự nhiên, con người và động vật. Chúng sinh trưởng

mạnh trong điều kiện ẩm ướt và có thể sử dụng một loạt các hợp chất hữu cơ.

Pseudomonas aeruginosa gây nhiễm trùng nghiêm trọng dẫn tới tỷ lệ tử vong

cao ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch và là một trong các nguyên nhân gây

nhiễm trùng bệnh viện [54, 55].

Hình 1.5. Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

https://www.pinterest.com/pin/96897829458108615/

Pseudomonas aeruginosa là sinh vật phổ biến nhất được phân lập từ

phổi của 80% bệnh nhân trưởng thành với chứng xơ nang phổi. Sự có mặt của

chủng vi sinh vật này tương quan với sự suy giảm chức năng phổi và các triệu

chứng lâm sàng của bệnh nhân. Tại bệnh viện, các loại thiết bị y tế hoặc dụng

cụ có liên quan đóng vai trò như một nguồn cung cấp Pseudomonas

aeruginosa và những nguồn này trở thành tiêu điểm cho việc bùng phát lây

lan vi sinh vật [16].

Kích thước hệ gen của Pseudomonas aeruginosa khoảng từ 5,2 - 7,1

Mbp. Mức độ dao động kích thước có ý nghĩa quan trọng đối với các phương

pháp được sử dụng để nghiên cứu sự tiến hóa và dịch tễ học của vi sinh vật

này. Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng hơn 80% trình tự hệ gen của các

chủng (chủng PAO1) được công bố (chỉ với 0,5% nucleotide bị phân tán).

Trong khi đó, hiện nay hàng loạt các phương pháp di truyền phân tử được sử

dụng để nghiên cứu dịch tễ học và phân tích di truyền quần thể. Lomholt và

tập thể (2001), Pirnay và tập thể (2002) sử dụng kỹ thuật giải trình tự của

gen mã lipoprotein màng ngoài kết hợp với huyết thanh đặc trưng và

pyoverdine để nghiên cứu di truyền khảm nhiễm thể mở rộng, đặc biệt là ở

gen oprD [53, 66].

1.2.5. Escherichia coli

Escherichia coli là vi khuẩn phổ biến nhất gây nhiễm trùng bệnh viện

và chúng được tìm thấy với tần suất cao ở nhiễm trùng đường hô hấp và

nhiễm trùng đường tiết niệu. Cả hai chủng Escherichia coli và Pseudomonas

aeruginosa đều là các tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng ở

các đơn vị chăm sóc y tế đặc biệt và gây ra nhiễm khuẩn y tế và nhiễm khuẩn

cộng đồng [57].

Hình 1.6. Hình ảnh và phân loại vi khuẩn Escherichia coli

http://www.wikilinks.fr/escherichia-coli-en-photo/?lang=en

http://www.slideshare.net/shrekym/detection-of-stx-gene-of-ecoli-o157

Escherichia coli là vi khuẩn Gram âm, thường có liên quan nhiều đến

nhiễm khuẩn bệnh viện và phổ biến trên bệnh nhân nhiễm trùng phổi. Họ vi

khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) thường cư trú trên đường tiêu hoá của

người và động vật, đang là mối quan tâm lớn trong nhiễm khuẩn bệnh viện do

có khả năng kháng cao với các nhóm kháng sinh amiglycoside, β-lactamase

và có khả năng truyền tính kháng qua plasmid. Nhiều nghiên cứu trong nước

và quốc tế đã kh ng định, Escherichia coli gây nhiễm trùng chủ yếu trên

đường tiết niệu, sinh dục của phụ nữ và nhiễm trùng vết mổ [59].

1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết

1.3.1. Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết bằng phƣơng pháp cấy máu

Phương pháp được dựa trên cơ sở một mẫu máu được nuôi cấy trong

môi trường giàu dinh dưỡng sau đó được nhận diện và kiểm tra các tác nhân

gây bệnh bằng cách sử dụng xét nghiệm sinh hóa tiêu chuẩn. Phương pháp cấy

máu được thực hiện với các thiết bị tự động phát hiện sự tăng trưởng của vi

sinh vật bằng cách phân tích sự giải phóng CO2 bởi huỳnh quang hoặc cảm

biến hoặc cách khác là thay đổi áp suất trong bình nuôi cấy do sự tiêu thụ và

sản xuất khí này dùng để chỉ thị sự phát triển của vi sinh vật [30]. Mặc dù có

những ưu điểm nhất định nhưng thời gian thực hiện của phương pháp là quá

dài dẫn tới khó khăn để đưa ra quyết định điều trị nhanh chóng trong những

trường hợp cần thiết [60]. Trong khi đó độ nhạy của phương pháp còn bị ảnh

hưởng bởi khoảng thời gian từ lấy máu đến nạp vào bình nuôi cấy [30, 61];

mầm bệnh dễ bị suy yếu trong thời gian chờ kết quả. Hơn nữa để có kết quả,

cần thêm một thời gian phát triển của sinh vật gây bệnh khoảng 24 đến 72 giờ

và việc nhuộm Gram cần thêm thời gian ủ qua đêm để thu được khuẩn lạc

riêng rẽ cho xét nghiệm. Hơn nữa, kết quả âm tính chỉ có thể được kết luận

sau 5-7 ngày. Ngoài ra, hiệu ứng ức chế của các loại thuốc kháng sinh hoặc

mầm bệnh khó nuôi cấy cũng làm hạn chế độ nhạy của phương pháp [62].

1.3.2. Lai huỳnh quang tại chỗ

Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là một trong những phương pháp được

nghiên cứu nhiều nhất trong các kỹ thuật thương mại. Phương pháp này phù

hợp cho việc phát hiện tác nhân gây bệnh trong nuôi cấy máu dương tính.

Trong khoảng 2,5- 3 giờ, FISH có thể xác định hơn 95% vi khuẩn và nấm

men thường được tìm thấy trong máu [63, 64]. Kết quả cấy máu dương tính

được chuẩn bị, lai với mẫu dò oligonucleotide gắn huỳnh quang hướng tới

đích là rRNA và quan sát bằng kính hiển vi [64]. Tuy nhiên phương pháp này

có nhược điểm là một số vi khuẩn chỉ có thể được phát hiện ở cấp độ chi bởi

vì không sẵn có mẫu dò cho đặc hiệu cấp độ loài.

1.3.3. Các kỹ thuật khuếch đại DNA

1.3.3.1. Kỹ thuật PCR

PCR là kỹ thuật thường được áp dụng nhất cho các phát hiện của mầm

bệnh từ cấy máu dương tính. Sử dụng xét nghiệm thương mại có sẵn hoặc

broad-range PCR hoặc multiplex PCR.

Trong kỹ thuật PCR, phối hợp khả năng lai đặc hiệu của các đoạn DNA

có trình tự bổ sung với gen đích cùng khả năng kéo dài chuỗi của DNA

polymerase để nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên hàng triệu lần so với

ban đầu. Do DNA polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp

khuôn-mồi, trong môi trường thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành

sợi bổ sung với sợi khuôn. Vì vậy để nhân bản được đoạn DNA đích, người ta

cần thiết kế các mồi (primer) đặc hiệu. Kỹ thuật PCR rất nhạy, chỉ cần một

lượng nhỏ DNA khuôn (ở mức nanogam) là phản ứng đã có thể cho kết quả

dương tính. Phương pháp này có độ nhạy cao, chính xác, phát hiện được nhiều

tác nhân gây bệnh trong khoảng thời gian ngắn.

1.3.3.2. Kỹ thuật Mutiplex PCR

Các xét nghiệm multiplex PCR cho phép phát hiện nhanh chóng tác

nhân gây bệnh trực tiếp từ máu. Mutiplex PCR khuếch đại nhiều DNA đích

trong cùng một mẫu trong cùng một thời điểm sử dụng một hỗn hợp mồi. Kỹ

thuật này thường được dựa trên sự khuếch đại DNA trong vùng sao chép của

vi sinh vật. Đây là vùng không mã hóa của DNA có vị trí giữa các gen và có

tính bảo thủ cao giúp phân biệt giữa các loài vi khuẩn, nấm và các loài sinh

vật khác. Phương pháp có mức độ nhạy cao hơn khi sử dụng mồi thoái hóa

[30].

Mặc dù kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh, nhạy các tác nhân gây

bệnh so với cấy máu thông thường và có thể hỗ trợ rất lớn trong chẩn đoán

nhưng không thể thay thế hoàn toàn phương pháp cấy máu. Trong nhiều

nghiên cứu, tỷ lệ phát hiện bệnh do kết hợp của cả hai phương pháp cao hơn

h n so với chỉ thực hiện PCR hoặc nuôi cấy máu riêng lẻ. Toàn bộ quá

trình xét nghiệm bằng PCR đến khi cho kết quả có thể được hoàn thành

trong khoảng 5 giờ. Phương pháp này rút ngắn thời gian cần thiết cho xác

định kiểu hình và kháng sinh đồ đồng thời có ưu điểm là độ nhạy, độ đặc

hiệu rất cao [70].

1.3.3.3. Kỹ thuật Broad-range PCR

Broad-range PCR cho phép phát hiện vi khuẩn hoặc nấm trong máu

dựa trên gen mã cho 16S rRNA hoặc gen 23S rRNA của vi khuẩn và gen 18S

rRNA của nấm. Sau phản ứng, các sản phẩm khuếch đại có thể được phát

hiện bằng các phương pháp khác nhau như phân tích giải trình tự,

pyrosequencing, hoặc lai với mẫu dò đặc hiệu [32].

1.3.3.4. Kỹ thuật Real-time PCR

Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm

khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng

huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng

lên của tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số

lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Tùy thuộc vào số lượng

bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng)

của các mẫu là khác nhau. Dựa vào đặc điểm này có thể xác định số bản sao

DNA đích có trong mẫu nghiên cứu dựa trên mẫu chuẩn đã biết rõ số lượng

DNA đích ban đầu.

Real-time PCR là phương pháp nhanh hơn so với PCR truyền thống và

không cần thao tác sau khuếch đại cho việc xác định vi khuẩn. Áp dụng các

phương pháp phân tử này đến nay đã được dùng trong việc phát hiện các loài

vi khuẩn cụ thể từ các mô hoặc nhiễm trùng, như viêm màng não do vi khuẩn.

Đối với các vi khuẩn nhiễm trùng bệnh viện, có rất nhiều nghiên cứu sử dụng

realtime PCR để xác định các đối tượng này [67, 69].

1.3.4. Giải trình tự

Một số phương pháp giải trình tự DNA được nghiên cứu nhằm xác định

vi khuẩn, nấm gây bệnh được lấy trực tiếp từ mẫu máu dương tính trong môi

trường cấy máu. Một số tác giả đã sử dụng MicroSeq 500 kit (Perkin-Elmer

Applied Biosystems, CA), một phương pháp về trình tự đầu tiên để xác định

527 base của gene 16S rRNA nhằm xác định các chủng sinh vật gây bệnh [67,

71]. Turenne và tập thể (2000) đã sử dụng phân tích đa hình sợi đơn kết hợp

với PCR để phân biệt giữa các sinh vật [78]. Một số nghiên cứu đã sử dụng

pyrosequencing để nhận dạng nhiều vi khuẩn, nấm men và nấm [72, 73]. Ưu

điểm chính của pyrosequencing là nhanh chóng và giá cả thấp hơn so với giải

trình tự thông thường đồng thời cung cấp nhanh chóng trình tự các đoạn ngắn

khoảng 30 bp trong khoảng 30 phút. Phương pháp này đã được sử dụng để

phân loại, xác định nhiều loài vi khuẩn [74]. Tuy nhiên giải trình tự và giải

trình tự thế hệ mới đòi hỏi thiết bị phức tạp, tốn kém do đó không phải dễ

dàng chuyển sang thực hành lâm sàng.

Ngoài ra, còn nhiều phương pháp phân tử khác như: Khối phổ hay DNA

chip (microarray)… được ứng dụng để phát hiện và chẩn đoán tác nhân gây

nhiễm khuẩn huyết. Ưu điểm của các phương pháp này là có độ nhạy, chính

xác cao và tiết kiệm thời gian. Tuy nhiên, do đòi hỏi về chi phí vận hành và

yêu cầu trình độ kỹ thuật nên các phương pháp này không được sử dụng phổ

biến.

1.4. Multiplex PCR và ứng dụng

1.4.1. Giới thiệu chung về multiplex PCR

Multiplex PCR là một phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhằm

khuếch đại nhiều trình tự ADN chỉ trong một phản ứng PCR. Trong quá trình

phân tích PCR đa mồi, nhiều trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc sử dụng

nhiều cặp mồi, tất cả các thành phần được bổ sung vào cùng một ống phản

ứng. Như một phương pháp cải tiến của phản ứng PCR thông thường, phương

pháp này giúp rút ngắn thời gian thực hiện mà lại không ảnh hưởng tới kết

quả thí nghiệm.

1.4.2. Các loại phản ứng multiplex PCR

1.4.2.1. Phản ứng multiplex PCR dùng một khuôn

Phương pháp này sử dụng một loại khuôn, thường là ADN hệ gen,

cùng với các cặp mồi (các mồi xuôi và mồi ngược) để khuếch đại một số vùng

gen khác nhau có chứa trong sợi khuôn.

1.4.2.2. Phản ứng multiplex PCR dùng nhiều khuôn

Có thể thực hiện duy nhất một phản ứng với nhiều loại khuôn và nhiều

cặp mồi. Tuy nhiên sự có mặt của nhiều cặp mồi có thể dẫn đến việc liên kết

chéo giữa các mồi với nhau và có thể có sự bắt cặp nhầm giữa mồi này và

khuôn kia. Do đó việc thiết kế mồi là rất quan trọng.

Hình 1.7. Mô hình mô tả phản ứng multiplex PCR

(http://www.premierbiosoft.com)

1.4.3. Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR

Thiết kế mồi đặc hiệu là một trong những yếu tố quyết định đến sự

thành công của phản ứng multiplex PCR. Các lưu ý quan trọng khi thiết kế

mồi cho phản ứng này được liệt kê bên dưới. Đây có thể coi là chìa khóa

quyết định sự chính xác của quá trình khuếch đại các trình tự ADN với hàm

lượng sản phẩm cao nhất.

* Chiều dài mồi

Phản ứng multiplex PCR chứa nhiều cặp mồi khác nhau, vì vậy nó đòi

hỏi các mồi được thiết kế phải có chiều dài thích hợp. Thông thường các mồi

có chiều dài khoảng từ 18 đến 22 nucleotide.

* Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm)

Các mồi nên có nhiệt độ nóng chảy tương đương nhau, tốt nhất là nằm

trong khoảng từ 55°C - 60°C. Với những trình tự có tỷ lệ GC cao, Tm của

mồi có thể cao hơn (khoảng 75°C - 80°C). Độ dao động về Tm giữa các mồi

nên nằm trong khoảng 3°- 5°C.

* Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu là vấn đề cần được quan tâm hàng đầu trong quá trình thiết

kế mồi. Với phản ứng multiplex PCR nó càng trở nên quan trọng, đặc biệt là

trong các phản ứng có xảy ra cạnh tranh về mồi và khuôn.

* Tránh hình thành dimer primer

Các mồi được thiết kế nên được kiểm tra xem chúng có hình thành

dimer không. Dimer primer (hiện tượng mồi bắt cặp với nhau) có thể dẫn đến

việc khuếch đại không đặc hiệu.

Tất cả các chỉ số cần lưu ý khi thiết kế mồi gần giống với thiết kế mồi cho 1

phản ứng PCR thông thường. Thông thường, khi tỷ lệ Mồi/Khuôn quá cao

cũng có thể dẫn đến việc hình thành primer dimer, do đó phải chú ý chỉ số của

các thành phần trong phản ứng.

* Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR bằng phần mền PrimerPlex

PrimerPlex là 1 công cụ hữu ích cho quá trình thiết kế mồi đối với phản

ứng multiplex PCR. Chương trình này giúp kiểm tra các oligo xem chúng có

phản ứng chéo với nhau hay không, đồng thời tăng sự thích ứng giữa các mồi.

Quá trình này phân tích hàng triệu cặp mồi khả dĩ chỉ trong vài giây, sau đó

chương trình đưa ra danh sách các mồi để người thiết kế lựa chọn.

1.4.4. Ƣu điểm của phƣơng pháp multiplex PCR

* Đối chứng nội kiểm (Internal control)

Vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR đơn lẻ (Single PCR) là hiện

tượng âm tính giả do sai về các thành phần hay chu trình nhiệt, cũng có khi lại

là hiện tượng dương tính giả do bị nhiễm. Phương pháp multiplex PCR đã

khắc phục được hiện tượng âm tính giả do mỗi sản phẩm khuếch đại sẽ cung

cấp một giá trị giúp kiểm tra các phân đoạn được khuếch đại khác.

* Hiệu quả cao

Chi phí về hóa chất và thời gian tiến hành multiplex PCR giảm đáng kể

so với một phản ứng PCR đơn lẻ. Các phản ứng multiplex PCR cũng bảo đảm

được độ bền của enzyme polymerase và khuôn.

* Xác định được chất lượng khuôn

Phản ứng multiplex PCR có thể xác định được chất lượng mẫu (khuôn)

hiệu quả hơn phản ứng PCR thông thường.

* Xác định được hàm lượng khuôn

Lũy thừa các số lượng bản sao và các tiêu chuẩn của phản ứng

multiplex PCR có thể được sử dụng để ước lượng hàm lượng khuôn có trong

mẫu. Để xác định được hàm lượng khuôn chính xác bằng phản ứng multiplex

PCR cần phải có mẫu đối chiếu, số chu kỳ phản ứng và lượng tối thiểu chất

ức chế phải được xác định sau mỗi mỗi chu kỳ khuếch đại.

Phản ứng multiplex PCR có thể ứng dụng trên cả khuôn là ARN sau khi chuỗi

này được chuyển thành dạng cADN. Sợi cADN sẽ đóng vai trò làm khuôn

cho phản ứng.

1.4.5. Tối ƣu hóa các thành phần cho phản ứng multiplex PCR

* Nồng độ mồi

Nồng độ mồi ban đầu cho phản ứng có nồng độ từ 0.1 µM đến 0.5 µM.

Có thể điều chỉnh chỉ số này tùy thuộc vào từng điều kiện phản ứng, ví dụ,

người ta có thể tăng hàm lượng mồi đối với các locus “yếu” và giảm nồng độ

mồi với các locus “mạnh”. Nồng độ cuối cùng của mỗi mồi trong phản ứng

nên nằm trong khoảng từ 0.04 µM đến 0.5 µM. Với số lượng bản sao thấp hay

ADN phức tạp, nồng độ mồi nên nằm trong khoảng 0.3 µM đến 0.5 µM.

Ngược lại nếu số lượng bản sao lớn hay ADN khuôn ít phức tạp thì nồng độ

mồi nên nằm trong khoảng 0.04 µM đến 0.4 µM.

* Nồng độ dNTP và MgCl2

Nồng độ MgCl2 nên giữ cố định ở mức 2 mM. Nồng độ dNTP có thể

dao động từ 0.5 mM đến 1.6 mM. Nồng độ thích hợp nhất của từng loại dNTP

là từ 0.2 mM đến 0.4 mM. Quá ngưỡng này sẽ làm giảm tốc độ phản ứng.

Nồng độ mỗi loại dNTP thấp hơn 0.1 mM sẽ vẫn giữ được tốc độ phản ứng

nhưng lại làm giảm số lượng sản phẩm. dNTP gốc (stock) nhạy cảm với quá

trình rã đông, do đó làm hiệu quả phản ứng multiplex PCR có thể giảm. Để

khắc phục nhược điểm này, dNTP nên được chia thành từng lượng nhỏ trước

khi bảo quản ở -20ºC.

Do MgCl2 ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả hoạt động của enzyme Taq ADN polymerase nên nồng độ Mg2+ phải được kiểm tra chặt chẽ. Enzyme Taq

polymerase, khuôn, dNTP và các mồi đều liên kết với MgCl2 nên nồng độ

MgCl2 phụ thuộc vào nồng độ các thành phần này. Hơn nữa, nếu khuôn hoặc

mồi có chứa EDTA hay EGTA thì nồng độ MgCl2 cũng sẽ được điều chỉnh.

Mg2+ giúp ổn định cấu trúc sợi đôi, bảo vệ ADN khỏi bị biến tính. Nồng độ Mg2+ cao có thể dẫn đến việc làm tăng lượng sản phẩm không đặc hiệu do nó tác động đến quá trình gắn mồi lên sợi khuôn. Tuy nhiên nếu hàm lượng Mg2+

không đủ cũng sẽ làm giảm lượng sản phẩm cần thiết.

* Sự cân bằng dNTP/ MgCl2

Để làm việc hiệu quả, Taq ADN polymerase cần Mg tự do (bên cạnh

Mg liên kết với dNTP và ADN). Đây là lí do tại sao khi tăng nồng độ dNTP

thì tốc độ phản ứng PCR lại giảm trong khi đó tăng nồng độ Mg lại cho kết

quả ngược lại. 0.2 mM dNTP kết hợp với 1.5 đến 2 mM MgCl2 là hợp lí.

* Nồng độ dung dịch đệm (buffer)

Dùng đệm nồng độ 2X sẽ cải thiện hiệu quả của phản ứng multiplex

PCR. Nó hiệu quả hơn bất kỳ chất điều chỉnh nào (như DMSO, glycerol,

BSA). Các cặp mồi dùng để nhân các đoạn ADN có chiều dài lớn sẽ hoạt

động tốt hơn ở nồng độ muối thấp trong khi các cặp mồi dùng để nhân các

đoạn ADN ngắn hơn yêu cầu nồng độ muối cao hơn.

* Lượng ADN khuôn và Taq ADN polymerase

Khi lượng khuôn ADN thấp, hiệu quả khuếch đại và độ đặc hiệu của

phản ứng có thể tăng lên nếu hạ thấp nhiệt độ gắn mồi. Người ta tiến hành thử

nghiệm ở các nồng độ Taq ADN polymerase khác nhau, sau đó đưa ra được

nồng độ tối ưu đối với enzyme này 2.5U/50µl dịch phản ứng. Nếu quá nhiều

enzyme, nồng độ glycerol dùng để bảo quản enzyme có thể làm mất cân bằng

quá trình khuếch đại làm tăng sự nhiễu. Tỷ lệ mồi đặc hiệu và hỗn hợp phụ

thuộc vào hoạt tính của enzyme, các thành phần thiết yếu trong phản ứng như

MgCl2, dNTPs và bản chất của ADN đích. Vì vậy, một loạt các cải tiến được

thực hiện nhằm cải thiện quá trình PCR chủ yếu định hướng trực tiếp vào các

yếu tố tác động đến việc gắn mồi và kéo dài chuỗi.

* Sử dụng các chất điều chỉnh: DMSO, Glycerol, BSA

Hầu hết các phản ứng multiplex PCR khó thực hiện đều phải được hỗ

trợ bởi các chất phụ gia như DMSO, glycerol, formamide và betaine. Những

phụ gia này giúp làm lỏng chuỗi ADN, do đó ADN dễ dàng bị biến tính bằng

nhiệt nhanh hơn. Tuy nhiên, trong các phản ứng multiplex PCR, DMSO và

glycerol lại gây ra sự cạnh tranh. Vì vậy, nồng độ của các chất này cũng nên

được xem xét kiểm tra chặt chẽ. Nồng độ BSA đạt tới 0.8 µg/µl sẽ làm tăng

hiệu quả phản ứng hơn nhiều so với việc bổ sung DMSO và glycerol.

1.4.6. Ứng dụng của phản ứng multiplex PCR

Multiplex PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi, có thế xác định sự có mặt

cùng lúc nhiều tác nhân khác nhau như virus, vi khuẩn và các tác nhân xâm

nhiễm khác. Đồng thời, phản ứng multiplex PCR cũng được dùng để xác định

các thành phần có trong một hỗn hợp mẫu hoặc cũng có thể dùng để xác định

sự có mặt của nhiều gen đơn lẻ trong hệ gen.

Phản ứng multiplex PCR đƣợc sử dụng vào các mục đích: Xác định tác

nhân gây bệnh; Hiệu suất SNP genotyping cao; Phát hiện đột biến; Phát hiện

đột biến mất đoạn trong gen; Định lượng mẫu; Phân tích các liên kết; Phát

hiện ARN; Nghiên cứu pháp y…

1.4.7. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc xác định các tác nhân

nhiễm khuẩn huyết

Hiện nay, khá nhiều các nhà khoa học đã tập trung phát triển kỹ thuật

PCR, multiplex PCR, multiplex realtime PCR trong kiểm soát các tác nhân

gây nhiễm khuẩn.

Anbazhagan D và tập thể (2011) phát triển các xét nghiệm PCR thông

thường và multiplex realtime PCR để phát hiện mầm bệnh bệnh viện [7].

Gadsby NJ và tập thể (2016) dùng các kỹ thuật PCR xác định tác nhân gây

bệnh đường hô hấp trong cộng đồng viêm phổi mắc phải [32]. Aydemir O và

tập thể (2014) xác định vai trò của multiplex PCR xác định các vi khuẩn gây

bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới [13]. Ở Thổ Nhĩ Kỳ, Kurutepe S và tập

thể (2012) điều tra nguyên nhân do vi khuẩn bằng phương pháp PCR thông

thường và multiplex ở bệnh nhân người lớn bị viêm phổi cộng đồng [46].

Eser O.K. và tập thể (2012) so sánh phương pháp nuôi cấy và phương pháp

realtime PCR trong việc phát hiện vi khuẩn Streptococcus pneumoniae và

Haemophilus influenzae trong viêm tai giữa cấp mẫu vật tràn dịch [29]. Jbara

I và tập thể (2007). So sánh phương pháp nuôi cấy và các phương pháp PCR

cho các phát hiện của Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae và

Moraxella catarrhalis trong dịch não tủy và tràn dịch tai giữa [41]. Thong

K.L và tập thể (2011) đã xây dựng phản ứng multiplex PCR phát hiện đồng

thời Staphylococcus aureus kháng methicillin, Acinetobacter baumannii,

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa. Kết

quả khảo sát trên 50 mẫu kết quả dương tính và âm tính tương đồng 100% so

với kết quả xác định bằng phương pháp nuôi cấy.

Ở Việt Nam, có một số nghiên cứu cũng như các nhà khoa học sử dụng

kỹ thuật PCR trong chẩn đoán các tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết cũng như

nhiễm khuẩn bệnh viện: Nhóm nghiên cứu của PGS.TS. Lê Hữu Song, nhóm

các bác sỹ ở Viện truyền nhiễm Trung ương, nhóm nghiên cứu thuộc bệnh

viện Nhi Trung Ương, nhóm nghiên cứu thuộc bệnh viện Việt Đức, Bạch

Mai, Thanh Nhàn,… Đa số các nghiên cứu sử dụng các Kit ngoại nhập hoặc

các cặp mồi tham khảo trên tạp chí quốc tế ví dụ một nghiên cứu đăng trên

tạp chí Y học thực hành của tác giả Phùng Thị Bích Thủy và tập thể đã sử

dụng bộ Kit Real Time PCR đa mồi SeptiFast (Roche) trong chẩn đoán căn

nguyên gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương [5].

Nhóm nghiên cứu phát hiện được 43,3% dương tính trong khi phương pháp

cấy máu truyền thống chỉ phát hiện được 3,3% tác nhân gây bệnh nhiễm trùng

huyết. Các tác nhân nhiễm trùng huyết thường gặp nhất là Klebsiella

pneumonia/oxytoca có tần số xuất hiện cao nhất ở 7 bệnh nhân (23,3%), tiếp

sau là Enterobacter cloacae/aerogenes với 2 trường hợp (6,6%), thêm vào đó

là các vi khuẩn và nấm khác như: Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Candida parapsilosis, Aspergillus fumigatu, Candida albicans,

Escherichia coli, Stenotrophomonas maltophilia.

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm

 Các chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Acinetobacter

baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và

Pseudomonas aeruginosa phân lập từ máu bệnh nhân do bệnh

viện Thanh Nhàn cung cấp.

 Các chủng nhiễm khuẩn huyết (nuôi cấy thuần).

 Mẫu bệnh phẩm được lấy từ bình cấy máu của 68 bệnh nhân

người Việt Nam nghi ngờ bị nhiễm khuẩn huyết được lấy từ Bệnh

viện Thanh Nhàn.

 Mẫu máu được lấy trực tiếp từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn

huyết do bệnh viện Thanh Nhàn cung cấp.

 Các cặp mồi được tổng hợp bởi Proligo (Sigma-Aldrich,

Corporation, USA) (Bảng 2.1)

Bảng 2.1. Trình tự Nucleotide của các cặp mồi

Cặp mồi Trình tự

gltA Fw: 5’-ATTTACAGTGGCACATTAGGT-3’

Rv: 5’-GCAGAGATACCAGCAGAGAT-3’

phoA Fw: 5’-AAGCCCGGACACCATAAATGC-3’

Rv: 5’-TCATTACGTTGCGGATTTGGC-3’

oprL Fw: 5’-ATGGAATAGCTGAAATTCGG-3’

Rv: 5’-CTTCTTCAGCTCGACGCGA-3’

Mdh Fw: 5’-GCGTGGCGGTAGATCTAAGTCA-3’

Rv: 5’-TTCAGCTCCGCCACAAAGGTA-3’

femA Fw: 5’-CTCTTGCTGGTTTCTTCTTTATC-3’

Rv: 5’-GTGCGGTATATGCTGCGTAA-3’

 Hóa chất: Mastermix, Tris-base, Tris-HCl, EDTA, SDS, EtBr,

Agarose và các hóa chất khác do hãng Merck, Invitrogen,

Promega, Bioline… cung cấp. Kit tách chiết DNA tổng số của

hãng QIAgen (Đức).

2.1.2. Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Công nghệ Tế bào Động vật và

Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam được mua từ nhiều hãng nổi

tiếng khác nhau. Các thiết bị thường sử dụng như:

 Máy Nanodrop 1000

 Bộ điện di DNA của Bio- Rad, Hoa Kỳ

 Bộ nguồn điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Hoa Kỳ).

 Máy soi DNA (Mini -transllumminator. Bio-Rad, Hoa Kỳ).

 Máy ly tâm lạnh (Microcentrifuge-Sorvall, Mỹ).

 Máy PCR (PCR system 9700, Applied Biosystem, Mỹ)

 Tủ lạnh 4oC, tủ lạnh sâu -20oC, -75oC (Sanyo, Nhật Bản)

 Máy ủ ổn nhiệt (Memmert, Đức)

 Máy vortex (RotoLab, OSI)

 Máy khuấy từ (RotoLab, OSI)

 Lò vi sóng (Samsung)

 Một số thiết bị khác như cân phân tích tủ sấy của hãng Carbolite (Anh),

pipetman, nồi khử trùng,…

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

Để tiến hành đề tài này chúng tôi sử dụng hầu hết các kĩ thuật theo

Sambrook và tập thể kèm theo các hướng dẫn của nhà sản xuất các bộ Kit,

bên cạnh đó có cải biến cho phù hợp.

2.2.1. Thiết kế primer

Các gen đích gltA của chủng Acinetobacter baumannii, gen phoA của

chủng Escherichia coli, gen femA của chủng Staphylococcus aureus, gen mdh

của chủng Klebsiella pneumoniae, gen oprL của chủng Pseudomonas

aeruginosa được lựa chọn là gen đích trong nghiên cứu. Các primer được

thiết kế mới bằng phần mềm primer 3 plus, PrimerPlex, kiểm tra bằng công

cụ BLAST (http://www.ncbi.nih.gov). Sau đó các cặp mồi đã được lựa chọn

đó được kiểm tra bằng chương trình phần mềm insilico PCR

(http://insilico.ehu.es/PCR/) dự đoán sản phẩm PCR (amplicon); kiểm tra

bằng các phần mềm online (protocol-online.org).

2.2.2. Tách chiết DNA

2.2.2.1. Tách chiết DNA từ các chủng vi khuẩn nuôi cấy bằng Kit QIAgen

Các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii,

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa được

nuôi cấy trong môi trường đặc hiệu, thu tế bào và tiến hành tách chiết theo

protocol của bộ Kit tách DNA tổng số từ vi khuẩn của QIAgen, thu lại DNA

tổng số của vi khuẩn trong 50 µl nước khử ion vô trùng. Sản phẩm được điện

di kiểm tra trên gel agarose và xác định hàm lượng bằng máy nanodrop 1000.

2.2.2.2. Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm cấy máu bằng phương pháp

đun sôi

Bổ sung lysozyme nồng độ 1 mg/ml vào 1 ml mẫu bệnh phẩm cấy máu, ủ ở 37o trong 30 phút. Sau đó đun sôi mẫu ở 100oC trong 10 phút rồi làm lạnh

nhanh trong nước đá 5 phút. Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5

phút để lấy dịch nổi (chứa DNA).

2.2.2.3. Tách chiết DNA từ mẫu máu của bệnh nhân nghi nhiễm khuẩn

huyết bằng kit tách DNA từ máu của QIAgen

DNA vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân được tách theo chỉ dẫn

của kit Qiagen theo thứ tự các bước như sau:

- Hút 1 ml máu của bệnh nhân vào ống eppendorf 1,5 ml, ly tâm

7000 vòng /phút để thu tế bào.

- Hòa tan tế bào trong 180 µl đệm lysis chứa enzyme lysozyme 1

mg/ml và ủ ở 37oC trong 30 phút.

- Bổ sung 4 µl enzyme RNase 10 mg/ml, ủ mẫu ở nhiệt độ phòng

khoảng 5 phút.

- Bổ sung 200 µl EtOH (96-100%), đảo đều.

- Hút dịch lên cột, ly tâm cột 8000 vòng/phút, 1 phút, bỏ dịch qua

cột.

- Bổ dung 500 µl dung dịch AW1 lên cột, ly tâm 8000 vòng/phút

trong 1 phút, bỏ dịch qua cột.

- Bổ sung 500 µl dung dịch AW2 lên cột, ly tâm 12 000 vòng/phút

trong 5 phút, bỏ dịch qua cột.

- Bổ sung 100 µl nước khử ion vô trùng lên cột, để khoảng 1 phút,

sau đó ly tâm 8000 vòng/phút để thu DNA.

2.2.3. Phƣơng pháp làm giàu DNA vi khuẩn

DNA vi khuẩn được làm giàu bằng cách xử lý DNA người sau đó tăng

sinh bằng các primer và chu trình nhiệt phù hợp.

DNA vi khuẩn được làm giàu bằng cách nhân bản DNA với mồi

random hexamer trong số chu kì ngắn để tạo ra sản phẩm là các đoạn

DNA có kích thước khác nhau với số lượng lớn. Thành phần phản ứng

bao gồm Master mix : 12,5 µl , DNA khuôn: 5 µl , mồi random

hexamer: 1 µl (10 pmol) và bổ sung nước khử trùng sao cho thể tích

cuối cùng bằng 25 µl. Đặt hỗn hợp trên vào máy PCR và chạy với bước biến tính đầu tiên là 93oC trong 3 phút và 20 chu kì tiếp theo với 93oC trong 45 giây, 50oC trong 45 giây và 72oC trong 1 phút 30 giây.

Sản phẩm PCR của phản ứng này sẽ là khuôn cho các phản ứng

multiplex PCR tiếp theo.

2.2.4. Xác định nồng độ DNA

Nồng độ DNA mạch kép được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở

bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280).

Nồng độ DNA được tính theo công thức:

CDNA = OD260 × 50 × d

Trong đó: d: độ pha loãng mẫu khi đo

CDNA: nồng độ DNA

Nếu 1,8 ˂ OD260/OD280 ˂ 2 thì mẫu DNA được đánh giá là đạt yêu cầu

về mức độ tinh sạch cho các thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo.

2.2.5. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose

 Chuẩn bị gel agarose 1%: cân 1 g agarose cho vào 100 ml dung dịch

TAE 1X, đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội khoảng 50oC rồi rót dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng

lược. Sau khoảng 30 phút, khi gel đã đông, gỡ lược ra, đặt bản gel vào

bể điện di. Rót đệm TAE 1X vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel

5mm.

 Tra mẫu DNA: Lấy mẫu DNA trộn với loading dye 6X rồi tra vào các

giếng trên bản gel.

 Chạy điện di ở điện thế 95 - 100V, trong thời gian khoảng 25 - 30 phút.

DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương. Quan sát sự di chuyển màu

bromophenol blue để biết khi nào cần dừng điện di.

 Soi gel: Bản gel được lấy nhẹ nhàng ra khỏi khay và ngâm vào dung

dịch EtBr nồng độ 2µg/ml trong khoảng 5 phút rồi rửa lại bằng nước.

Hiển thị kích thước DNA dưới ánh sáng đèn cực tím (UV) của máy soi

gel. Ước tính kích thước của DNA bằng cách đối chiếu với thang DNA

chuẩn.

2.2.6. Phƣơng pháp PCR

2.2.6.1. Phương pháp PCR đơn mồi

Phản ứng PCR đơn mồi được dùng để kiểm tra hoạt động và độ đặc

hiệu của mồi sau thiết kế. Các gen đích được khuếch đại bằng phản ứng PCR

với các cặp mồi đặc hiệu.

Thành phần phản ứng: Chương trình chạy:

Mồi xuôi/ ngược : 1/1 µl

Master Mix: 12.5 µl

Temp: 3 µl

H20: 7,5 µl

Tổng 25 µl

95oC: 3 phút 94oC: 45 giây 57oC: 45 giây 30 chu kỳ 72oC: 1 phút 72oC: 8 phút Giữ ở: 80C

2.2.6.2. Phương pháp multiplex PCR

Phản ứng multiplex PCR được thực hiện đồng thời với 5 cặp mồi nhân

bản 5 gen đích của các chủng vi khuẩn. Tổng thể tích của phản ứng là 25 µl

với thành phần và chương trình chạy như sau:

Thành phần phản ứng: Chương trình chạy:

Mồi FemA, gltA, phoA, mdh,oprL

Fw/Rv : 0.5 µl, 0.3 µl, 0.3 µl, 0.3

µl, 0.3 µl

Master Mix: 12.5 µl

Temp: 3 µl

H20: 6.1 µl

Tổng 25 µl 95oC: 3 phút 94oC: 45 giây 59oC: 45 giây 30 chu kỳ 72oC: 1 phút 72oC: 8 phút Giữ ở: 80C

Phản ứng multiplex PCR được tối ưu với các điều kiện khác nhau về hàm

lượng mồi, nhiệt độ bắt mồi, master mix… Với mỗi một yếu tố tối ưu sẽ giữ

nguyên tất cả các thành phần, điều kiện còn lại chỉ thay đổi yếu tố cần tối ưu.

2.2.7. Phƣơng pháp giải trình tự gen

Sau khi thu được sản phẩm PCR đặc hiệu, chúng tôi tiến hành xác định

trình tự sản phẩm PCR dựa trên phương pháp của F.Sanger và tập thể. Đặc

trưng của phương pháp này là ngoài những nucleotide thông thường còn sử

dụng thêm 4 loại dideoxynucleotide trong đó thay nhóm 3’-OH bằng 3’-H.

Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành liên kết

photphodieste với các nucleotide tiếp theo, dẫn đến làm ngừng quá trình tổng

hợp DNA.

Quy trình xác định trình tự gồm 3 bước:

Bước 1: Thực hiện phản ứng PCR với hỗn hợp thành phần phản ứng

(15µl) bao gồm: 3 µl Bigdye, x µl sản phẩm PCR, 1,275 µl mồi, 3 µl đệm 2,5

X, bổ sung nước đến thể tích 15µl.

Chu trình nhiệt được thực hiện trên máy PCR 9700 (Applied Biosystem). Bước 1: 96oC, 1 phút, 1 chu kỳ. Bước 2: (96oC 10 giây, 50oC 5 giây, 60oC 4 phút), 25 chu kỳ.

Bước 2: Tinh sạch sản phẩm PCR

- Bổ sung 5 µl EDTA 12,5 mM, pH=8, ly tâm 4000 vòng/phút trong

45 giây.

- Bổ sung 60µl cồn 100%, ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.

- Ly tâm 4500 vòng/phút trong 45 phút để thu tủa.

- Rửa tủa bằng cồn 70%. Ly tâm 10000 vòng/phút để thu tủa.

- Làm khô tủa trong 3 phút.

- Hòa tan tủa trong 10 µl Hidiformamide. - Biến tính ở 95oC trong 3 phút.

Bước 3: Xác định trình tự trên máy. Sản phẩm PCR sau khi đã tinh

sạch được đặt vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100 Avant (Applied

Biosystems) để đọc trình tự.

Trình tự thu được được xử lý bằng phần mềm Bioedit và công cụ Blast.

2.2.8. Đạo đức trong nghiên cứu

Tuân thủ theo các quy định trong Quy chế hoạt động của Hội đồng đạo

đức trong nghiên cứu y sinh học ban hành kèm theo Quyết định số

5129/2002/QĐ - BYT ngày 19/12/2002 của Bộ trưởng Bộ Y tế.

Các bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu đều được giải thích, được cung

cấp thông tin đầy đủ trước khi tham gia nghiên cứu. Các bệnh nhân nghiên

cứu (hoặc người thân của bệnh nhân) đều có quyền tự nguyện chấp thuận

tham gia nghiên cứu, cũng như được quyền từ chối tham gia nghiên cứu bất

kỳ lúc nào, với bất kỳ lý do gì.

Các kết quả nghiên cứu chỉ sử dụng vào mục đích phục vụ cho nghiên

cứu này, không được sử dụng cho mục đích nào khác. Các thông tin cá nhân

của bệnh nhân sẽ được đảm bảo bí mật. Không công bố tên của cá nhân bệnh

nhân trên các bản công bố kết quả nghiên cứu (tạp chí khoa học, bài báo cáo

Hội nghị khoa học...).

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi đặc hiệu gen đích

Các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết phổ biến Staphylococcus

aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và

Pseudomonas aeruginosa được phòng Vi sinh vật bệnh viện Thanh Nhàn

phân lập từ bệnh nhân bằng phương pháp phân lập trên các môi trường thạch:

thạch máu Columbia, thạch chocolate, môi trường Bromocresol purple, sử

dụng máy cấy máu tự động batex với môi trường chai cấy ái khí của

biomerieux. Định danh vi khuẩn bằng bộ định danh vi khuẩn API 20E của

hãng Biomeieux (Pháp). Chúng tôi tiếp nhận các chủng này, sau đó tiến hành

định danh thêm bằng phương pháp sinh học phân tử (phần kết quả này không

trình bày ở đây) trước khi sử dụng cho các nghiên cứu về xây dựng phản ứng

multiplex PCR xác định đồng thời 5 tác nhân gây bệnh nêu trên.

Gen phoA là một gen quản gia mã cho alkaline photphatase, phoA được

một số nhà khoa học lựa chọn là đích để phát hiện Escherichia coli [43, 75].

PhoA cùng với các gen khác cũng được lựa chọn là gen đích để phát hiện

Escherichia coli bằng PCR đa mồi [77].

Staphylococcus aureus tổng hợp cầu nối peptidoglycan interpeptide

pentaglycine nhờ xúc tác của các peptidyl transferase FemX, FemA và FemB.

Khi bất hoạt gen femA dẫn đến sự suy giảm peptidoglycan monoglycine là

một cơ chất của protein gắn penicilin (PBPs) cũng như làm cho thấp ái lực

với tiểu phần PBP2a một sản phẩm được mã hóa bởi gen MecA và dẫn tới

giảm khả năng kháng kháng sinh. Do đó FemX hoặc FemA được xem như các

gen đích tiềm năng trong việc phát hiện các chủng vi khuẩn Staphylococcus

aureus mới có tính kháng kháng sinh cao. Các sản phẩm do gen femA mã hóa

là một yếu tố cần thiết cho sự kháng methicillin và có mặt rộng rãi trong tất cả

các chủng Staphylococcus aureus được phân lập. Trong số các sản phẩm do

gen femA mã hóa có một protein 48 kDa từng được chỉ ra có liên quan trong

quá trình chuyển hóa tế bào và được tìm thấy với số lượng lớn trong môi

trường nuôi cấy [75].

Trong nghiên cứu này, gen femA của chủng Staphylococcus aureus

được nhân bản bằng cặp mồi femAR/F. Kích thước của sản phẩm PCR là 296

bp, tham khảo trình tự mồi của Mehrotra và tập thể (2000) [58].

Đối với chủng Acinetobacter baumannii, gen gltA là gen quản gia mã

hóa cho enzyme tổng hợp citrate được chúng tôi lựa chọn là gen đích. GltA

được Bartual và tập thể (2005) lựa chọn để nghiên cứu [15]. Trong nghiên

cứu này, các tác giả đã khuếch đại gen gltA cùng 6 gen quản gia khác là DNA

gyrase subunit B (gyrB), glucose dehydrogenase B (gdhB), homologous

recombination factor (recA), 60-kDa chaperonin (cpn60), glucose-6-

phosphate isomerase (gpi), RNA polymerase 70 factor (rpoD), phospho-

glucomutase (pgm), quinate shikimate dehydrogenase (quiA) và coenzyme A

thiolase (pcaf). Trong 7 gen này GltA được xem như có tính bảo thủ cao và

phù hợp hơn các gen còn lại [15, 76].

Các protein liên kết màng của Pseudomonas aeruginosa đóng vai trò

quan trọng trong sự tương tác của vi khuẩn với môi trường đồng thời cũng là

một trong những nguyên nhân dẫn đến sự kháng kháng sinh hoặc có ảnh

hưởng nhất định đến sự vận chuyển qua màng của tế bào. Daniel và tập thể

(1997) đã khuếch đại 2 gen đặc trưng mã hóa cho lipoprotein bám màng là

oprI và oprL. Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng oprL có tính bảo thủ rất cao

giữa các chủng Pseudomonas aeruginosa. Do đó gen oprL được lựa chọn làm

gen đích để phát hiện Pseudomonas aeruginosa [25].

Thong và tập thể (2011) đã lựa chọn 6 gen TonB, infB, gyrB, mdh,

parC, 23s-rRNA đặc trưng cho Klebsiella pneumoniae. Trong đó gen Parc

thử nghiệm được thường bị đột biến ở các loài khác nhau và thậm chí cả trong

các chủng khác nhau của cùng một loài. Hơn nữa, trình tự của gen Parc là rất

giàu C/G dẫn đến mồi thiết kế dễ tạo thành cấu trúc kẹp tóc hoặc dimer. Gen

23s-rRNA và Gen gyrB có số bản sao thấp trong hệ gen. Do đó gen mdh được

lựa chọn để phát hiện Klebsiella pneumoniae [76].

Như vậy, sau khi tham khảo các tài liệu, chúng tôi lựa chọn được các

gen đích gltA cho chủng Acinetobacter baumannii, gen phoA là gen đích của

chủng Escherichia coli, gen femA là gen đích của chủng Staphylococcus

aureus, gen mdh là gen đích của chủng Klebsiella pneumoniae, gen oprL lựa

chọn là gen đích của chủng Pseudomonas aeruginosa. Sựa lựa chọn này

tương đồng với nghiên cứu của Thong và tập thể (2011) [76]. Sau khi tham

khảo trình tự các primer của các tác giả khác đã công bố, chỉnh sửa và thiết kế

mới bằng phần mềm primer 3 plus, PrimerPlex, kiểm tra bằng công cụ

BLAST (http://www.ncbi.nih.gov) để giảm thiểu khả năng nhân gen không

đặc hiệu từ locut không phải là đích. Sau đó các cặp mồi đã được lựa chọn đó

được kiểm tra bằng chương trình phần mềm insilico PCR

(http://insilico.ehu.es/PCR/) dự đoán sản phẩm PCR (amplicon); kiểm tra

bằng các phần mềm online (protocol-online.org). Chúng tôi đã lựa chọn và

thiết kế được trình tự mồi được liệt kê ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Trình tự mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR theo tính toán lý

thuyết

Trình tự Kích thƣớc sản phẩm Tên mồi

722 bp gltA

Fw: 5’ ATTTACAGTGGCACATTAGGT 3’ Rv: 5’ GCAGAGATACCAGCAGAGAT 3’

890 bp phoA

Fw: 5’ AAGCCCGGACACCATAAATGC 3’

Rv: 5’ TCATTACGTTGCGGATTTGGC 3’

504 bp Oprl

Fw: 5’ ATGGAATAGCTGAAATTCGG 3’ Rv: 5’ CTTCTTCAGCTCGACGCGA 3’

364 bp Mdh

Fw: 5’ GCGTGGCGGTAGATCTAAGTCA 3’ Rv: 5’ TTCAGCTCCGCCACAAAGGTA 3’

296 bp femA

Fw: 5’ CTCTTGCTGGTTTCTTCTTTATC 3’ Rv: 5’ GTGCGGTATATGCTGCGTAA 3’

3.2. Kết quả kiểm tra các cặp mồi bằng thực nghiệm

3.2.1. Kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ các chủng vi khuẩn

Các cặp primer sau khi thiết kế được đặt tổng hợp, tiến hành kiểm tra

trên các mẫu DNA của các chủng chuẩn bệnh viện Thanh nhàn cung cấp.

DNA tổng số của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter

baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas

aeruginosa được tách chiết như đã giới thiệu ở phần phương pháp và được

điện di kiểm tra trên gel agarose 1 % (Hình 3.1).

Hình 3.1. Điện di kiểm tra DNA tổng số của các chủng Staphylococcus

aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae

và Pseudomonas aeruginosa tách chiết từ các chủng chuẩn

Đường chạy 1-3: DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Staphylococcus

aureus; 4-6: DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Acinetobacter

baumannii; 7-9; DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Escherichia coli; 10-

12: DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa; 13-15:

DNA tách chiết từ các chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae.

Kết quả điện di DNA tổng số cho thấy các băng DNA sáng rõ có độ di

động thấp gần với vạch xuất phát và không bị phân cắt thành từng vệt chứng

tỏ rằng DNA tổng tách được còn nguyên vẹn không bị đứt gãy, đạt hàm lượng

và độ sạch cần thiết cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.2. Kết quả PCR kiểm tra từng cặp mồi đơn trên các chủng vi khuẩn

đích

Tiếp theo, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR đơn mồi với các cặp mồi

đặc hiệu các gen đích tương ứng để xác định độ đặc hiệu. Sản phẩm PCR

được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được thể hiện trên Hình 3.2.

Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy ở tất cả các giếng đều xuất

hiện các băng đậm rõ nét có kích thước tương ứng khoảng 296 bp (đường

chạy 1-3), 364 bp (đường chạy 4-6), 504 bp (đường chạy 7-9), 722 bp (đường

chạy 10-12), 890 bp (đường chạy 13-15) phù hợp với tính toán lý thuyết về

kích thước của các gen femA của chủng Staphylococcus aureus, mdh của

chủng Klebsiella pneumoniae, gen oprL của chủng Pseudomonas aeruginosa,

gltA của chủng Acinetobacter baumannii, và gen phoA của chủng Escherichia

coli. Kết quả PCR chứng tỏ tất cả các cặp mồi đã kiểm tra đều đặc hiệu với

các sinh vật đích vì các gen dự đoán đều được khuếch đại. Tuy nhiên để

kh ng định chắc chắn các gen nhân bản được chính là các gen đích, sản phẩm

PCR từ các chủng được lựa chọn tiến hành xác định trình tự.

Hình 3.2. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các

chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tƣơng ứng.

Cặp mồi phoA khuếch đại gen phoA (Escherichia coli), cặp mồi gltA khuếch

đại gen gltA (Acinetobacter baumannii), cặp mồi oprL khuếch đại gen oprL

(Pseudomonas aeruginosa), cặp mồi mdh khuếch đại gen mdh (Klebsiella

pneumonia), cặp mồi femA khuếch đại gen femA (Staphylococcus aureus).

Đường chạy 1-3: sản phẩm PCR gen femA (theo lý thuyết 296 bp), 4-6: sản

phẩm PCR gen mdh (theo lý thuyết là 364 bp), 7-9: sản phẩm PCR gen oprL

(theo lý thuyết là 504 bp),: 10-12: sản phẩm PCR gen gltA (theo lý thuyết là

722 bp), 13-15: sản phẩm PCR gen phoA (theo lý thuyết là 890 bp), 16:

Marker 1 kb (Fermentas). 17: Đối chứng âm.

3.2.3. Kết quả xác định trình tự các sản phẩm PCR từ các chủng vi

khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli,

Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa

Để kh ng định quá trình khuếch đại đã nhân được chính xác các gen

đích, chúng tôi tiến hành phân tích trình tự DNA của các sản phẩm PCR với

mồi tương ứng. Kết quả thu được được trình bày ở phần dưới đây.

> Trình tự gen oprL của Pseudomonas aeruginosa

1 atggaaatgc tgaaattcgg caaatttgct gcgctggctc tggccatggc

51 TGTAGCTGTG GGTTGCTCCT CCAAGGGCGG CGACGCTTCC GGTGAAGGTG

101 CCAACGGCGG CGTCGACCCG AACGCAGGCT ATGGCGCTAA CAGCGGTGCC

151 GTTGACGGCA GCCTGAGCGA CGAAGCCGCT CTGCGTGCGA TCACCACCTT

201 CTACTTCGAG TACGACAGCT CCGACCTGAA GCCGGAAGCC ATGCGTGCTC

251 TGGACGTACA TGCAAAAGAC CTGAAAGGCA GCGGTCAGCG CGTAGTCCTG

301 GAAGGCCACA CCGACGAACG TGGTACCCGC GAGTACAACA TGGCCCTGGG

351 CGAGCGTCGT GCCAAGGCCG TTCAGCGTTA CCTGGTACTG CAGGGCGTGT

401 CCCCGGCTCA GCTGGAACTG GTTTCCTACG GTAAGGAGCG TCCGGTTGCC

451 ACTGGCCACG ACGAGCAGTC CTGGGCCCAG AACCGTCGCG TCGAGCTGAA

501 GAAG

> Trình tự gen gltA của Acinetobacter baumannii

1 atttacagtg gcacattagg tcccgatgta atcgacgtta aagatgtatt

51 ggcctcaggt cactttacTT TTGATCCTGG TTTTATGGCG ACAGCTTCAT

101 GCGAGTCTAA AATCACATTT ATCGATGGTG ACAAAGGTAT TTTATTACAC

151 CGCGGTTACC CGATTGACCA GTTAGCGACT CAAGCAGACT ACCTTGAAAC

201 TTGTTATTTA TTATTAAATG GCGAGTTACC AACTGCTGAA CAAAAAGTTG

251 AGTTCGATGC GAAAGTTCGT GCTCATACTA TGGTTCATGA TCAAGTTAGC

301 CGTTTCTTCA ATGGTTTCCG TCGTGATGCT CACCCTATGG CAATCATGGT

351 TGGTGTAGTA GGCGCATTAT CTGCTTTCTA TCACAACAAC CTTGACATTG

401 AAGACATCAA CCACCGCGAA ATTACTGCGA TTCGTTTGAT TGCTAAAATT

451 CCAACGCTTG CTGCTTGGAG CTACAAATAT ACTGTAGGTC AGCCATTCAT

501 CTATCCACGT AATGACTTAA ATTACGCGGA AAACTTCTTA CACATGATGT

551 TTGCAACTCC TGCAGACCGT GACTACAAAG TAAACCCTGT TCTTGCTCGT

601 GCAATGGATC GTATCTTTAC GCTTCATGCT GACCACGAAC AAAACGCGTC

651 TACTTCTACA GTTCGACTTG CTGGTTCTAC TGGTGCGAAC CCATATGCGT

701 GTATCTCTGC TGGTATCTCT GC

> Trình tự gen phoA của Escherichia coli

1 aagcccggac accagaaatg cctgttctgg aaaaccgggc tgctcagagc

51 CGATATTACT GCACCCGGCG GTGCTCGCCG CTTAACGGGT GATCAGACCG

101 CTGCTCTGCG TGATTCTCTT AGCGATAAAC CTGCAAAAAA TATTATTTTG

151 CTGATTGGCG ATGGGATGGG GGACTCGGAA ATTACTGCCG CACGCAATTA

201 TGCCGAAGGT GCGGGCGGCT TTTTTAAAGG TATCGATGCC TTACCGCTTA

251 CCGGGCAATA CACTCACTAT GCGCTGAATA AAAAAACCGG CAAACCGGAC

301 TACGTCACCG ACTCGGCTGC ATCAGCAACC GCCTGGTCAA CTGGTGTCAA

351 AACCTATAAC GGCGCGCTGG GCGTCGATAT TCACGAAAAA GATCACCCAA

401 CGATTCTGGA AATGGCAAAA GCCGCAGGTC TGGCGACCGG TAACGTTTCT

451 ACCGCAGAGT TGCAGGATGC CACGCCCGCT GCGCTGGTGG CGCATGTGAC

501 CTCGCGCAAA TGCTACGGTC CAAGTGCGAC CAGTGAAAAA TGTCCGGGTA

551 ACGCTCTGGA AAAAGGCGGA AAAGGATCGA TTACCGAACA GCTGCTTAAC

601 GCCCGTGCCG ATGTTACGCT TGGCGGCGGT GCAAAAACCT TTGCTGAAAC

651 GGCAACCGCC GGTGAATGGC AGGGAAAAAC GCTGCGTGAA CAGGCACAGG

701 CGCGTGGTTA TCAGTTGGTG AGCGATGCTG CCTCACTGAA TTCGGTGACG

751 GAAGCGAATC AGCAAAAACC CCTATTAGGA CTGTTTGCTG ACGGCAATAT

801 GCCAGTGCGC TGGCAAGGAC CGAAAGCAAC GTACCACGGT AATATAGATA

851 AGCCCGCAGT CACCTGTACG CCAAATCCGC AACGTAATGA

> Trình tự gen mdh của Klebsiella pneumoniae

1 gcgtggcggt agatctaagt catatcccca cagatgtaaa aattaaagGA

51 TTTTCCGGTG AAGACGCTAC TCCGGCGCTG GAAGGCGCGG ATGTAGTGCT

101 GATCTCCGCG GGCGTGGCGC GTAAGCCCGG CATGGATCGT TCCGACCTGT

151 TTAATGTGAA TGCGGGTATC GTGAAGAACC TCGTGCAGCA GATTGCCAAA

201 ACCTGCCCGC AGGCCTGCAT CGGCATTATC ACCAACCCGG TGAATACCAC

251 CGTGGCTATC GCCGCCGAAG TACTGAAAAA AGCCGGCGTG TACGATAAAA

301 ACAAACTGTT CGGCGTTACC ACGCTGGACA TCATCCGTTC CAATACCTTT

351 GTGGCGGAGC TGAA

> Trình tự gen FemA của Staphylococcus aureus

1 CTCTGCTGGT TTCTTCTTTA TCAATCCATT TGAAGTTGTT TATTATGCTG

51 GTGGTACATC AAATGCATTC CGCCATTTTG CCGGAAGTTA TGCAGTGCAA

101 TGGGAAATGA TTAATTATGC ATTAAATCAT GGCATTGACC GTTATAATTT

151 CTATGGTGTT AGTGGTAAAT TTACAGAAGA TGCTGAAGAT GCTGGTGTAG

201 TTAAATTCAA AAAAGGTTAC AATGCTGAAA TTATTGAATA TGTTGGTGAC

251 TTTATTAAAC CAATTAATAA ACCTGTTTAC GCAGCATATA CCGCAC

Kết quả phân tích Blast cho thấy trình tự thu được có độ tương đồng

cao từ 98% đến 100% với các trình tự của các chủng vi khuẩn tương ứng trên

GenBank (phụ lục 1- 10). Như vậy các cặp primer đã thiết kế nhân bản được

chính xác các gen đích của các vi khuẩn đích với đúng kích thước mong

muốn: Gen phoA của Escherichia coli có kích thước 890 bp; gen GltA của

Acinetobacter baumannii có kích thước 722 bp; gen OprL của

Pseudomonas aeruginosa có kích thước 504 bp; gen Mdh của Klebsiella

pneumoniae có kích thước 364 bp; gen FemA của Staphylococcus aureus

có kích thước 296 bp.

3.2.4. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi

Để kiểm tra tính đặc hiệu của các mồi được thiết kế, chúng tôi sử dụng

DNA của 5 chủng lần lượt Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii,

Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli làm

khuôn cho các phản ứng PCR sử dụng từng cặp mồi riêng biệt femA, gltA,

oprL, mdh, phoA cho mỗi phản ứng. Kết quả thể hiện trên Hình 3.3.

A B

Hình 3.3. Kiểm tra khả năng nhân bản đặc hiệu của các cặp mồi femA,

gltA, oprL, mdh, phoA với các chủng Staphylococcus aureus,

Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella

pneumoniae và Escherichia coli.

Hình 3.3A. đường chạy 6: Thang chuẩn DNA 1 kb; 1-5: PCR cặp mồi gltA

với 5 chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas

aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli; 7-11: PCR cặp mồi

oprL với 5 chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii,

Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli; 12-16:

PCR cặp mồi mdh với 5 chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter

baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia

coli . Hình 3.3B. 6: Thang chuẩn DNA 1 kb; 1-5: PCR cặp mồi femA với 5

chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas

aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli; 7-11: PCR cặp mồi

phoA với 5 chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii,

Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli.

Kết quả điện di cho thấy với mồi gltA chỉ xuất hiện băng 722 bp với khuôn là

chủng Acinetobacter baumanii (Hình 3.3A đường chạy 4) Trong khi 4 đường

chạy còn lại không xuất hiện băng chứng tỏ rằng mồi gltA thiết kế đặc hiệu

cho riêng chủng Acinetobacter baumanii

Tương tự, mồi oprL chỉ thấy băng 504 bp với khuôn là Pseudomonas

aeruginosa (đường chạy 7 Hình 3.3A) và không thu được băng nào trong các

đường chạy sử dụng 4 chủng còn lại làm khuôn.

Mồi mdh chỉ cho băng 364 bp (Hình 3.3 A, đường chạy 14) khi sử dụng

khuôn tương ứng là DNA của Klebsiella pneumonia đồng thời cũng không

xuất hiện băng khi sử dụng 4 chủng còn lại làm khuôn cho các phản ứng.

Mồi femA chỉ cho băng 296 bp (Hình 3.3 B đường chạy 4) khi sử dụng

khuôn là DNA của Staphylococcus aureus.

Mồi phoA chỉ xuất hiện một băng 890 bp duy nhất, là băng đặc trưng

cho kích thước của gen phoA của Escherichia coli (Hình 3.3 B đường chạy

11).

Kết quả trên chứng tỏ rằng từng cặp mồi được thiết kế đặc trưng cho

từng chủng vi khuẩn quan tâm, không có khả năng bắt cặp chéo hay bắt cặp

nhầm giữa các chủng vi khuẩn khác nhau và thể hiện tính đặc hiệu cao với 5

loài vi khuẩn được nghiên cứu.

3.2.5 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích

trong phản ứng multiplex PCR

Phản ứng multiplex PCR được thiết kế dựa trên phản ứng PCR chuẩn

với tổng thể tích của một phản ứng là 25 µl bao gồm Mastermix, mồi, khuôn

DNA và nước khử ion. Tuy nhiên, trong phản ứng multiplex PCR có bổ sung

thêm các cặp mồi để phát hiện đồng thời nhiều gen khác nhau. Việc bổ sung

này làm cho nồng độ các thành phần thay đổi so với phản ứng PCR chuẩn,

đồng thời có thể xảy ra hiện tượng các cặp mồi ức chế, bắt cặp chéo lẫn nhau

dẫn đến không phát hiện được gen đích quan tâm. Do đó, chúng tôi tiến hành

phản ứng multiplex PCR để kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi và các gen

đích tương ứng. Kết quả phản ứng multiplex PCR được kiểm tra trên gel

agarose 1% và được thể hiện trên Hình 3.4.

Hình 3.4. Kiểm tra tính đặc hiệu giữa các cặp mồi và các gen đích trong

phản ứng multiplex PCR.

(A): Phản ứng multiplex PCR một gen đích: 1: đối chứng âm (không có

khuôn DNA), 2: marker 1 kb, 3: sản phẩm PCR gen phoA (890 bp), 4: sản

phẩm PCR gen gltA (722 bp), 5: sản phẩm PCR gen oprL (504 bp), 6: sản

phẩm PCR gen mdh (364 bp), 7: sản phẩm PCR gen femA (296 bp). (B):

Phản ứng multiplex PCR nhiều gen đích: 1: đối chứng âm (không có khuôn

DNA), 2: marker 1kb, 3: hỗn hợp sản phẩm multiplex PCR các gen phoA,

gltA, oprL, mdh, và femA.

Kết quả điện di trên gel agarose trên Hình 3.4A cho thấy các sản phẩm

nhân gen bằng phản ứng multiplex PCR thu được đều đặc hiệu, phù hợp với

tính toán về kích thước của các gen đích và không có sản phẩm phụ. Điều này

chứng tỏ trong phản ứng multiplex PCR này các cặp mồi rất đặc hiệu với các

gen đích, các cặp mồi không ức chế và bắt cặp chéo lẫn nhau. Để kh ng định

chắc chắn về độ đặc hiệu của các cặp mồi với các gen đích trong cùng một

phản ứng multiplex PCR, chúng tôi trộn DNA của 5 chủng vi khuẩn khác

nhau tạo thành hỗn hợp DNA khuôn và tiến hành phản ứng multiplex PCR.

Kết quả là, sản phẩm của phản ứng multiplex PCR này xuất hiện cả 5 băng

đậm, rõ nét tương ứng với kích thước của 5 gen đích và không có băng phụ

(Hình 3.4B, đường chạy 3). Ngoài ra, đường chạy 1 (Hình 3.4A) và đường

chạy 1 (Hình 3.4B) là đối chứng âm không có băng nào xuất hiện chứng tỏ

hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm hoàn toàn tinh khiết, các bước thao

tác không bị nhiễm và kết quả của chúng tôi thu được đáng tin cậy.

Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi có một số điểm tương đồng với

nghiên cứu của Thong và tập thể (2011) về việc lựa chọn các gen femA, gltA,

oprL, mdh, phoA để phát hiện 5 chủng vi sinh vật Staphylococcus aureus,

Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae

và Escherichia coli bằng phản ứng multiplex PCR [76].

Đồng thời nghiên cứu của chúng tôi cũng có điểm tương tự như

một nghiên cứu của Daniel và tập thể (1997) khi tác giả sử dụng PCR đa

mồi để phát hiện Pseudomonas aeruginosa dựa trên sự khuếch đại 2 gen

mã hóa licoprotein trên màng là oprI kích thước 249 bp và oprL kích

thước 504 bp [25].

3.3. Kết quả tối ƣu phản ứng multiplex PCR xác định đồng thời 5 vi

khuẩn đích

3.3.1. Kết quả tối ƣu nồng độ mồi của phản ứng multiplex PCR

Mồi và nồng độ của mồi là yếu tố quyết định độ đặc hiệu của phản ứng

PCR để nhân bản thành công gen đích. Do đó, để phản ứng multiplex PCR có

hiệu quả cao, nồng độ các mồi cần phải được tối ưu. Trong nghiên cứu đã

công bố của Thong và tập thể (2011), các tác giả đã tối ưu được nồng độ các

mồi và thực hiện phản ứng multiplex PCR với thành phần phản ứng PCR bao

gồm: 25 µl chứa 100 ng khuôn DNA, đệm 1X, các mồi gltA, phoA, oprL và

mdh đều có nồng độ 0.3 µM, mồi femA 0.5 µM, hỗn hợp dNTP 200 µM,

MgCl2 1.5 mM và Taq DNA polymerase (Promega, USA) 1U [76].

Trong nghiên cứu này, để tối ưu được nồng độ mồi, đầu tiên chúng tôi

khảo sát tất cả các mồi ở nồng độ 0,3 µM. Kết quả điện di sản phẩm multiplex

được thể hiện trên hình 3.5 (A).

Hình 3.5. Tối ƣu nồng độ mồi cho phản ứng multiplex PCR.

(A). Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex PCR với nồng độ mỗi mồi là 0,3

µM. Đường chạy 1. Sản phẩm PCR gen oprL (504 bp), 2. sản phẩm PCR gen

gltA (722 bp), 3. Sản phẩm PCR gen mdh (364 bp), sản phẩm PCR gen phoA

(890 bp), 5. Thang DNA chuẩn, 6. Sản phẩm PCR gen femA; (B). Hình ảnh

điện di sản phẩm multiplex PCR với nồng độ mồi femA là 0,5 µM, nồng độ

các mồi còn lại là 0,3 µM. Đường chạy 1. Sản phẩm PCR gen femA (296 bp),

2. Sản phẩm PCR gen mdh (364 bp), 3. Sản phẩm PCR gen oprL (504 bp), 4.

sản phẩm PCR gen gltA (722 bp), 5. sản phẩm PCR gen phoA (890 bp), 6.

Sản phẩm multiplex PCR, 7. Thang DNA chuẩn 1 kb, 8. Đối chứng âm.

Kết quả điện di trên Hình 3.5 (A) cho thấy, ở nồng độ các mồi là 0,3

µM chỉ có các gen oprL, gtlA, mdh và phoA được khuếch đại với các kích

tương ứng là 504 bp (đường chạy 1), 722 bp (đường chạy 2), 364 bp (đường

chạy 3) và 890 bp (đường chạy 3). Đường chạy 6 là sản phẩm PCR của gen

femA nhưng không có băng nào xuất hiện. Như vậy, ở nồng độ mồi femA là

0,3 µM, gen femA không được khuếch đại. Do đó, chúng tôi tăng nồng độ mồi

femA lên 0,5 µM, nồng độ các mồi khác vẫn giữ là 0,3 µM. Tiếp theo chúng

tôi tiến hành 5 phản ứng multiplex PCR với khuôn là DNA của 5 chủng vi

khuẩn quan tâm, 1 phản ứng multiplex PCR với khuôn là hỗn hợp DNA của 5

chủng này. Kết quả multiplex PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%

và được thể hiện trên hình 3.5 (B).

Kết quả trên hình 3.5 (B) cho thấy với nồng độ mồi femA là 0,5 µM và

nồng độ các mồi là 0,3 µM, tất cả 5 gen đích của 5 chủng vi khuẩn đều được

khuếch đại. Hơn nữa, ở nồng độ này, hỗn hợp sản phẩm PCR (đường chạy 6)

đều xuất hiện cả 5 băng đặc hiệu tương ứng với 5 gen đích và không có sản

phẩm phụ. Từ kết quả thu được, chúng tôi chọn nồng độ mồi femA là 0,5 µM

và nồng độ các mồi còn lại là 0,3 µM để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

3.3.2. Kết quả tối ƣu nhiệt độ gắn mồi của phản ứng multiplex PCR

Nhiệt độ gắn mồi là một trong các yếu tố ảnh hưởng lớn đến phản ứng

PCR nhất là phản ứng multiplex PCR vì thành phần phản ứng này gồm nhiều

cặp mồi và mỗi cặp mồi lại có nhiệt độ gắn mồi khác nhau. Do đó, nhiệt độ

gắn mồi phải được tối ưu để tránh các sản phẩm không đặc hiệu và đảm bảo

các gen đích đã chọn đều được khuếch đại chính xác.

Việc tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi được thực hiện bằng cách chạy

gradient nhiệt độ gắn mồi, nhiệt độ trung gian được chia tự động trên máy iCyler từ 52-59oC. Để tối ưu nhiệt độ gắn mồi, tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần

4 phản ứng multiplex PCR giống nhau về thành phần, chỉ khác nhau về nhiệt độ gắn mồi (52oC, 55oC, 57oC và 59oC). Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi

trong phản ứng multiplex PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và

được thể hiện trên Hình 3.6.

Hình 3.6. Tối ƣu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR

Hình ảnh điện di so sánh sản phẩm phản ứng multiplex PCR ở các nhiệt độ gắn mồi 52oC, 55oC, 57oC và 59oC. 1. Sản phẩm multiplex PCR (52oC), 2.sản phẩm multiplex PCR (55oC), 3.multiplex PCR (57oC), 4.multiplex PCR (59oC), 5.Thang DNA chuẩn 1kb.

Kết quả điện di trên Hình 3.6 cho thấy ở nhiệt độ gắn mồi 59oC (đường

chạy 4), sản phẩm xuất hiện cả 5 băng đặc hiệu rõ nét tương ứng với 5 gen

đích và không có sản phẩm phụ. Hơn nữa, cường độ của các băng sản phẩm multiplex PCR tại nhiệt độ 59oC sáng rõ nhất trong số các sản phẩm tại các nhiệt độ gắn mồi 57oC, 55oC và 52oC. Tại các nhiệt độ 52oC và 55oC chỉ có 4

gen đích được khuếch đại. Như vậy, từ kết quả thu được, chúng tôi chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 59oC.

3.3.3. Kết quả lựa chọn Master Mix trong phản ứng multiplex PCR

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Master Mix mua từ các hãng

khác nhau để chuẩn bị phản ứng PCR. Thông thường, thành phần cơ bản của

master Mix bao gồm buffer, dNTPs, MgCl2, Taq polymerase. Tuy nhiên,

dNTPs, MgCl2 và loại Taq polymerase của mỗi hãng có nồng độ khác nhau.

Hơn nữa, nồng độ của các thành phần này ảnh hưởng rất lớn đến độ nhạy và

độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Do đó, chúng tôi khảo sát 3 loại Master Mix

trong phản ứng multiplex PCR nhiều gen đích để lựa chọn Master Mix.

Để lựa chọn được loại Master Mix có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tiến

hành lặp lại 3 lần, mỗi lần thực hiện 3 phản ứng multiplex PCR nhiều gen

đích khác nhau, mỗi phản ứng đều giống nhau về thành phần khuôn DNA,

mồi, chỉ khác nhau về loại Master Mix. Kết quả lựa chọn loại Master mix

được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được thể hiện trên Hình 3.7.

Hình 3.7. Lựa chọn thành phần Mastermix trong phản ứng multiplex PCR

Hình ảnh điện di so sánh sản phẩm phản ứng multiplex PCR với 3 loại

Master Mix khác nhau.1: Sản phẩm multiplex PCR với Master Mix hãng

Invitrogen, 2: Sản phẩm multiplex PCR với Master Mix hãng Promega, 3.

Sản phẩm multiplex PCR với Master Mix hãng Bioline, 4. Marker 1kb.5, 6, 7.

Đối chứng âm (không có khuôn DNA).

Kết quả điện di trên hình 3.7 cho thấy, với Mastermix hãng Invitrogen

(đường chạy 1) và Mastermix hãng Promega (đường chạy 2), sản phẩm

multiplex PCR chỉ xuất hiện 3 băng tương ứng với 3 gen đích gồm mdh (364

bp), oprL (504 bp) và gltA (722 bp). Trong khi đó, với Mastermix hãng

Bioline (đường chạy 3) thì sản phẩm multiplex PCR xuất hiện cả 5 băng đặc

hiệu tương ứng với 5 gen đích và không có băng phụ. Kết quả này chứng tỏ

Mastermix của hãng 3 có độ nhạy, độ đặc hiệu tốt và phù hợp với phản ứng

multiplex PCR nhằm phát hiện được đồng thời nhiều gen quan tâm trong

cùng một phản ứng. Các đường chạy 5, 6, 7 là các mẫu đối chứng âm tương

ứng với 3 Mastermix của các hãng không có bất kỳ băng nào xuất hiện chứng

tỏ hóa chất của chúng tôi có độ tinh sạch cao và quá trình thao tác thí nghiệm

không bị nhiễm.

3.4. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên các chủng

nhiễm khuẩn thuần

Sau khi đã tối ưu được nhiệt độ gắn mồi và lựa chọn được loại

Mastermix có độ nhạy cao, chúng tôi tiến hành thử nghiệm phản ứng

multiplex PCR trên 30 chủng vi khuẩn nuôi cấy thuần gồm Staphylococcus

aureus (n=5), Acinetobacter baumannii (n=5), Escherichia coli (n=5),

Pseudomonas aeruginosa (n=5) và Klebsiella pneumonia (n=5),

Streptococcus suis (n=5). Kết quả thử nghiệm được trình bày ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm phản ứng multiplex PCR

Số chủng đƣợc xét nghiệm cho

kết quả Tổng

dƣơng tính Chủng vi khuẩn số

chủng md femA gltA phoA oprL h

− Staphylococcus aureus 5 5 − − −

− Acinetobacter baumannii 5 − 5 − −

− Escherichia coli 5 − − 5 −

− Pseudomonas aeruginosa 5 − − − 5

5 Klebsiella pneumoniae 5 − − − −

_ Streptococcus suis 5 _ _ _ _

5 Tổng số 30 5 5 5 5

Kết quả thu được ở bảng 1 cho thấy 25 chủng chứa gen đích gồm

Staphylococcus aureus (n=5), Acinetobacter baumannii (n=5), Escherichia

coli (n=5), Pseudomonas aeruginosa (n=5), Klebsiella pneumoniae (n=5) cho

kết quả dương tính, chủng vi khuẩn còn lại Streptococcus suis (n=5) cho kết

quả âm tính. Điều này chứng tỏ phản ứng multiplex PCR đã tối ưu có độ nhạy

và độ đặc hiệu cao, có khả năng khuếch đại chính xác gen đích trong chủng

vi khuẩn quan tâm. Trong trường hợp này, kĩ thuật multiplex PCR chứng tỏ

được độ nhạy và độ đặc hiệu là 100% trong việc phát hiện đúng các chủng

vi khuẩn. Dự đoán giá trị âm tính và dương tính của kĩ thật multiplex PCR

là 100%.

3.5. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh

phẩm

3.5.1. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên các mẫu

bệnh phẩm cấy máu

Nhằm mục tiêu đưa phương pháp multiplex PCR áp dụng vào thực tiễn

để chẩn đoán và phát hiện nhanh nhiễm khuẩn huyết, chúng tôi thử nghiệm

phương này trên mẫu bệnh phẩm cấy máu trước. Phương pháp multiplex PCR

được thử nghiệm trên 68 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nghi ngờ nhiễm

khuẩn huyết nhận được từ bệnh viện Thanh Nhàn. Các mẫu này đã được mã

hóa để tăng tính khách quan cho thử nghiệm.

Đầu tiên, DNA của các chủng vi khuẩn từ 68 mẫu bệnh phẩm cấy máu

được tách chiết bằng phương pháp đun sôi (theo mô tả phần vật liệu và

phương pháp nghiên cứu). Tiếp theo, chúng tôi dùng DNA đã tách chiết được

để làm khuôn cho phản ứng multiplex PCR. Kết quả multiplex PCR được

điện di triểm tra trên gel agarose 1% và so sánh với kết quả cấy máu.

Hình 3.8. Thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm

cấy máu.

Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex PCR trên một số mẫu bệnh phẩm

cấy máu. 1. Đối chứng âm, 2. Marker 1kb, 3-17. Sản phẩm multiplex PCR

của các mẫu BN1-BN15.

Kết quả điện di kiểm tra trên gel agarose cho thấy sản phẩm PCR của

các mẫu bệnh phẩm BN2 (đường chạy 4), BN4 (đường chạy 6), BN8 (đường

chạy 10), BN10 (đường chạy 12), BN12 (đường chạy 14) cho kết quả dương

tính với các băng sáng rõ tương ứng với kích thước của các gen đích gltA

(722 bp) của chủng Acinetobacter baumannii, mdh (364 bp) của chủng

Klebsiella pneumonia, femA (296 bp) của chủng Staphylococcus aureus, phoA

(890 bp) của chủng Escherichia coli và oprL (504 bp) của chủng

Pseudomonas aeruginosa. Các mẫu bệnh phẩm còn lại bao gồm BN1 (đường

chạy 3), BN3 (đường chạy 5), BN5 (đường chạy 7), BN6 (đường chạy 8),

BN7 (đường chạy 9), BN9 (đường chạy 11), BN11 (đường chạy 13), BN13

(đường chạy 15), BN14 (đường chạy 16), BN15 (đường chạy 17) cho kết quả

âm tính. Mẫu đối chứng (đường chạy 1) là đối chứng âm cho kết quả âm tính

chứng tỏ hóa chất mà chúng tôi sử dụng có độ tinh khiết cao và quá trình thao

tác thí nghiệm đảm bảo không bị nhiễm. Các mẫu bệnh phẩm âm tính có thể

là các chủng vi khuẩn gây bệnh khác hoặc có thể chứa chủng vi khuẩn quan

tâm mà gen đích không được khuếch đại hoặc không có bất kỳ chủng vi

khuẩn nào. Ngoài ra, trong tổng số 68 mẫu bệnh phẩm cấy máu mà chúng tôi

khảo sát còn có các mẫu dương tính và âm tính khác. Do đó, để kh ng định

kết quả, chúng tôi tiến hành so sánh kết quả multiplex PCR của 68 mẫu cấy

máu này với kết quả cấy máu để đánh khả năng phát hiện sinh vật đích

bằng phương pháp multiplex PCR. Kết quả so sánh được thể hiện ở Bảng

3.3 dưới đây.

Bảng 3.3. So sánh kết quả multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy

máu

với kết quả của phƣơng pháp cấy máu

ST Mã bệnh nhân Kết quả multiple PCR Kết quả cấy máu T

BN1 Âm tính Âm tính 1

BN2 Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 2

BN3 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 3

BN4 Klebsiella pneumonia Klebsiella pneumonia 4

BN5 Âm tính Âm tính 5

BN6 Âm tính Âm tính 6

BN7 Âm tính Trực khuẩn Gr(+) 7

BN8 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 8

BN9 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 9

BN10 Escherichia coli Escherichia coli 10

BN11 Âm tính Âm tính 11

BN12 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas 12

aeruginosa

BN13 Trực khuẩn Gr(-) Âm tính 13

BN14 Trực khuẩn Gr(-) Âm tính 14

BN15 Nấm candida Knisie Âm tính 15

BN16 Cầu khuẩn Gr (+) Âm tính 16

BN17 Cầu khuẩn Gr (+) Âm tính 17

BN18 Âm tính Âm tính 18

BN19 Cầu khuẩn Gr (+) Âm tính 19

BN20 Cầu khuẩn Gr (+) Âm tính 20

BN21 Citrobacter sp Âm tính 21

ST Mã bệnh nhân Kết quả multiple PCR Kết quả cấy máu T

BN22 22 Âm tính Âm tính

BN23 23 Trực khuẩn Gr(-) Âm tính

BN24 24 Cầu khuẩn Gr (+) Âm tính

BN25 25 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus

BN26 26 Cầu khuẩn Gr (+) Âm tính

BN27 27 Streptococus Pneumonie Âm tính

BN28 28 Cầu khuẩn Gr (+) Âm tính

BN29 29 Nấm candida Knisie Âm tính

BN30 30 Nấm candida Knisie Âm tính

BN31 31 Escherichia coli Escherichia coli

BN32 32 Cầu khuẩn Gr (+) Âm tính

BN33 33 Trực khuẩn Gr(-) Âm tính

BN34 34 Cầu khuẩn Gr (+) Âm tính

BN35 35 Âm tính Âm tính

BN36 36 Trực khuẩn Gr(-) Âm tính

BN37 37 Âm tính Âm tính

BN38 38 Streptococcus Âm tính

Pneumonie

BN39 39 Nấm candida Knisie Âm tính

BN40 40 Pseudomonas sp Âm tính

BN41 41 Cầu khuẩn Gr (+) Âm tính

BN42 42 Trực khuẩn Gr(-) Âm tính

BN43 43 Trực khuẩn Gr(+) Âm tính

BN44 44 Âm tính Âm tính

BN45 45 Citrobacter sp Âm tính

ST Mã bệnh nhân Kết quả multiple PCR Kết quả cấy máu T

BN46 Escherichia coli Escherichia coli 46

BN47 Escherichia coli Escherichia coli 47

BN48 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 48

BN49 Escherichia coli Escherichia coli 49

BN50 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 50

BN51 Klebsiella pneumonia Klebsiella pneumonia 51

BN52 Escherichia coli Escherichia coli 52

BN53 Âm tính Tụ cầu da 53

BN54 Escherichia coli Escherichia coli 54

BN55 Âm tính Tụ cầu da 55

BN56 Âm tính Âm tính 56

BN57 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 57

BN58 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas 58

aeruginosa

BN59 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 59

BN60 Âm tính Tụ cầu da 60

BN61 Âm tính Trực khuẩn gram(-) 61

BN62 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 62

BN63 Âm tính Tụ cầuda 63

BN64 Escherichia coli Escherichia coli 64

BN65 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 65

BN66 Âm tính Tụ cầu da 66

BN67 Âm tính Âm tính 67

BN68 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 68

Dữ liệu thu được ở Bảng 3.3 cho thấy kết quả của phương pháp

multiplex PCR hoàn toàn trùng khớp với kết quả cấy máu. Trong đó có 21

mẫu dương tính gồm 8 mẫu Staphylococcus aureus, 8 mẫu Escherichia coli, 1

mẫu Acinetobacter baumannii, 2 mẫu Klebsiella pneumonia và 2 mẫu

Pseudomonas aeruginosa. Kết quả này kh ng định rằng phương pháp

multiplex PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có khả năng phát hiện đồng

thời và chính xác 5 chủng vi khuẩn khác nhau gây nhiễm khuẩn huyết. Hơn

nữa, kết quả này còn cho thấy phương pháp multiplex PCR có độ tin cậy. Do

đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trực

tiếp trên các mẫu lâm sàng.

3.5.2. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên các mẫu lâm

sàng

Mẫu lâm sàng mà chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này là 15 mẫu

máu của các bệnh nhân nghi ngờ mắc nhiễm khuẩn huyết do bệnh viện Thanh

Nhàn cung cấp.

Đầu tiên, DNA của vi khuẩn từ các mẫu máu được tách chiết bằng kit

Qiagen theo chỉ dẫn của kit. Tuy nhiên, do vi khuẩn trong mẫu máu chưa qua

nuôi cấy nên có số lượng ít và DNA thu được chứa phần lớn là DNA người.

Do đó, chúng tôi xử lý DNA người, làm giàu DNA vi khuẩn trước khi tiến

hành PCR. Kết quả của phản ứng multiplex PCR được điện di kiểm tra trên

gel agarose 1% và được thể hiện trên Hình 3.9.

Hình 3.9. Thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên mẫu lâm sàng

Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex PCR trên các mẫu lâm sàng (máu của

bệnh nhân nghi nhiễm khuẩn huyết). 1-15. Sản phẩm multiplex PCR của 1-15

mẫu lâm sàng, 16. Marker 1kb, 17. Đối chứng âm.

Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy sản phẩm PCR của các mẫu

máu số 4 (đường chạy 4), 6 (đường chạy 6), 8 (đường chạy 8), 14 (đường

chạy14) xuất hiện các băng sáng rõ có kích thước tương ứng với gen mdh

(364 bp) của chủng Klebsiella pneumonia, phoA (890 bp) của chủng

Escherichia coli, femA (296 bp) của chủng Staphylococcus aureus và gltA

(722 bp) của chủng Acinetobacter baumannii. Riêng mẫu số 12 (đường chạy

12) xuất hiện hai băng có kích thước 364 bp (mdh) và 890 bp (phoA). Như

vậy, mẫu 4 dương tính với chủng Klebsiella pneumonia, mẫu 6 dương tính

với Escherichia coli, mẫu 8 dương tính với Staphylococcus aureus, mẫu 14

dương tính với Acinetobacter baumannii, mẫu 12 dương tính với Klebsiella

pneumonia và Escherichia coli. Mẫu đối chứng âm (đường chạy 17) cho kết

quả âm tính chứng tỏ hóa chất mà chúng tôi sử dụng có độ tinh khiết cao và

quá trình thao tác thí nghiệm đảm bảo không bị nhiễm. Kết quả thu được cho

thấy phương pháp multiplex PCR có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và hiệu quả

trong việc phát hiện nhanh và đồng thời các sinh vật đích trên mẫu lâm sàng.

Phương pháp multiplex PCR có nhiều ưu điểm nổi bật trong việc phát

hiện nhanh và đồng thời nhiều vi khuẩn đích so với PCR đơn mồi. Kĩ thuật

multiplex PCR cũng được thiết lập dễ dàng ở nhiều phòng thí nghiệm bao

gồm các phòng thí nghiệm y học và thực phẩm miễn là các phòng thí nghiệm

đó được trang bị máy PCR.

Mặc dù hầu hết các phương pháp nuôi cấy truyền thống vẫn hữu dụng

và có giá trị, song phương pháp phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn gây bệnh

như PCR là công cụ không thể thiếu ở các phòng thí nghiệm vi sinh y học.

Phát hiện các chủng gây nhiễm khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy truyền

thống và các xét nghiệm hóa sinh có thể mất 5 ngày để có kết quả, trong khi

đó PCR chỉ cần khoảng 5 giờ. Việc chẩn đoán nhanh rất quan trọng đối với

bệnh nhân để có liệu pháp điều trị hợp lý, giảm được thời gian nằm viện và

chi phí điều trị.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ các kết quả thu được trong công trình nghiên cứu này, chúng tôi đưa

ra một số kết luận sau:

1. Đã lựa chọn và thiết kế thành công 5 cặp mồi đặc hiệu 5 gen đích của

các chủng nhiễm khuẩn huyết gồm Staphylococcus aureus, Klebsiella

pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli và Pseudomonas

aeruginosa.

2. Đã tối ưu và lựa chọn được nồng độ mồi femA là 0.5 µM và các mồi

oprL là 0.3 µM, mdh là 0.3 µM, gltA là 0.3 µM, phoA là 0.3 µM nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 59oC, Master Mix tốt nhất là Master Mix hãng Bioline

3. Thử nghiệm thành công phương pháp multiplex PCR trên 68 mẫu

bệnh phẩm cấy máu và 15 mẫu máu. Kết quả tương đồng với phương pháp

nuôi cấy (phát hiện 5 tác nhân gây bệnh Staphylococcus aureus, Klebsiella

pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli và Pseudomonas

aeruginosa).

KIẾN NGHỊ

1. Xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng multiplex PCR.

2. Tạo bộ kit phát hiện nhanh vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết bằng

phương pháp multiplex PCR.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Đạt Anh, Đặng Quốc Tuấn (2012), Tình trạng sepsis nặng và sốc

nhiễm khuẩn, Hồi sức cấp cứu và chống độc, Bệnh viện Bạch Mai, tr.11-18.

2. Nguyễn Thị Thanh Hà (2015), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và vi sinh ở

bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết do Acinetobacter baumannii, Luận án tiến sĩ,

Viện nghiên cứu khoa học y dược lâm sàng 108, Bộ Quốc Phòng, Bộ

GD&ĐT.

3. Nguyễn Văn Kính (2008), Phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh tại Việt

Nam, GARP Việt nam, http://www.cddep.org/sites/cddep.org truy cập

ngày 16/11/ 2013.

4. Vũ Đình Phú (2013), Khảo sát nhiễm trùng bệnh viện và sử dụng kháng sinh

tại khoa Hồi sức tích cực ở Việt Nam, Hội nghị kháng kháng sinh Châu Á,

Bệnh viện Bạch Mai.

Phùng Thị Bích Thủy, Khúc Thị Rềnh Hoa, Phan Thu Chung, Tạ Anh Tuấn,

Nguyễn Thanh Liêm (2012), “Ứng dụng kỹ thuật real time PCR đa mồi trong

chẩn đoán các căn nguyên gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi

trung ương”, Tạp chí y học Việt Nam, tháng 9 – số đặc biệt 2012 tập 397, tr.

336-341.

Phạm Hùng Vân và Tập thể (2010), "Nghiên cứu đa trung tâm về tình hình

đề kháng imipenem và meropenem của trực khuẩn gram âm dễ mọc kết quả

trên 16 bệnh viện tại việt nam", Tạp chí Y học Tp. HCM, 14 (2), tr.280-286.

TIẾNG ANH

7. Anbazhagan D., Mui W. S., Mansor M., Yan G. O., Yusof M. Y., Sekaran

S.D. (2011), “Development of conventional and real-time multiplex PCR

assays for the detection of nosocomial pathogens”, Braz J Microbiol., 42(2),

pp. 448-458.

8. Abraham E., Matthay M. A., Dinarello C. A. (2000), “Consensus conference

definitions for sepsis, septic shock, acute lung injury, and acute respiratory

distress syndrome: time for a reevaluation”, Critical Care Medicine, 28(1),

pp. 232–235.

9. Angus D. C, Linde-Zwirble W. T., Lidicker J., Clermont G., Carcillo J.

(2001), “Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of

incidence, outcome, and associated costs of care”, Critical Care Medicine,

29(7), pp. 1303–1310.

10. Angus D. C., Van der Poll T. (2013), “Severe sepsis and septic shock”, The

New England Journal of Medicine, 369(9), pp. 840–851.

11. Anthony A. L., Folasade T. O., Rita O. O., Oyin O. O., Ibironke D.,

Chukwudi C. E., Agwu U. N., Comfort N. A., Ita O. L., Godwin I. O.

(2016), “Incidence, Clinical Outcome and Risk Factors of Intensive Care

Unit Infections in the Lagos University Teaching Hospital (LUTH), Lagos,

Nigeria”, Plos one, DOI:10.1371.

12. Artero A., Zaragoza R., Nogueira J. M. (2012), Epidemiology of Severe

Sepsis and Septic Shock, Severe Sepsis and Septic Shock, In Tech,

www.intechopen.com, Aceess on 16 feb 2013.

13. Aydemir O., Aydemir Y., Ozdemir M. (2014), “The role of multiplex PCR

test in identification of bacterial pathogens in lower respiratory tract

infections”, Pak J Med Sci., 30(5), pp. 1011-1016.

14. Barenfanger J, Graham D. R., Kolluri L., Sangwan G., Law-horn J. (2008),

“Decreased mortality associated with prompt Gramstaining of blood

cultures”, American Journal of Clinical Pathology, 130(6), pp. 870–876.

15. Bartual S.G., Seifert H., Hippler C., Angeles M., Wisplinghoff H.,

Rodriguez-Valera F. (2005), “Development of a multilocus sequence

typing scheme for characterization of clinicalisolates of Acinetobacter

baumannii”, Journal of Clinical Microbiology, 43(9), pp. 4382-4390.

16. Bone R. C., Balk R. A., Cerra F. B., Dellinger R. P., Fein A. M., Knaus W.

A., Schein R. M., Sibbald W. J. (1992), “Definitions for sepsis and organ

failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The

ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of

Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine”, Chest, 101(6), pp.

1644-1655.

17. Bradford P. A. (2001), “Extended spectrum β-lactamases in the 21st century:

characterization, epidemiology, and detection of this important resistance

threat”, Clinical Microbiology Review, 14(4), pp. 933–951.

18. Brahm G., Brett G., Adrienne R. et al. (2005), "International pediatric sepsis

consensus conference: Definitions for sepsis and organ dysfunction in

pediatri ", Pediatr Crit Care Med, 6, pp. 2-8.

19. Caliendo A. M., Gilbert D. N., Ginocchio C. C., Hanson K. E., May L.

(2013) “Bettertests, bett ercare: improve diagnosti for infectious diseases”,

Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious

Diseases Society of America, 57( 3), pp. 139–170.

20. Cefai C., Richards J., Gould F. K., McPeake P. (1990), “An outbreak of

Acinetobacter

respiratory

tract

infection

resulting

from

incomplete

disinfection of ventilatory equipment”, The Journal of Hospital Infection,

15(2), pp. 177-182.

21. Centers for Disease Control: Increase in national hospital discharge survey

rates for septicemia United States, 1979 –1987, JAMA 1990, 263, pp. 937–

938.

22. Chang H., Tang C., Hsu Y., Wan L., Chang Y., Lin C., Tseng Y., Lin Y.,

Sheu J. J., Lin W., Chang Y., Ho M., Lin C., Ho C., Lai C. (2009),

“Nosocomial outbreak of infection with multidrug-resistant Acinetobacter

baumannii in a medical center in Taiwan”, Infection Control and Hospital

Epidemiology, 30(1), pp. 34-38.

23. Chapin K., Musgnug M. (2003), “Evaluation of three rapid methods for the

direct identification of Staphylococcus aureus from positive blood cultures”,

Journal of Clinical Microbiology, 41, 4324–4327.

24. Chaulagain B. D., Jang S. J., Ahn G. Y. et al. (2012), "Molecular

Epidemiology of an Outbreak of Imipenem-Resistant

Acinetobacter

baumannii Carrying the ISAba1-blaOXA-51-like Genes in a Korean

Hospital", Jpn. J. Infect., 65, pp.162-166.

25. Daniel D. V., Lim A. J. R., Pirnay J., Struelens M., Christian V.,

Duinslaeger L., Alain V., Pierre C. (1997), “Direct detection and

identification of Pseudomonas aeruginosa in clinicalsamples such as skin

biopsy specimens and expectorations by multiplex PCR based on two outer

membrane lipoprotein genes oprI and oprL”, Journal of Clinical

Microbiology, 35(6), pp. 1295–1299.

26. Dellinger R. P., Levy M. M., Rhodes A., Annane D., Gerlach H. (2013).

“Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of

severe sepsis and septic shock: 2012”, Critical Care Medicine, 41, pp. 580–

637.

27. Divatia J. (2012), "Management of sepsis in Indian ICUs: Indian data from

the MOSAI study ", Critical Care, 16 (3), pp.90.

28. Elixhauser A., Friedman B., Stranges E. (2009), "Septicemia in U.S.

Hospitals", Agency for Healthcare and Quality, 122, pp. 1- 13.

29. Eser O. K., Alp S., Ergin A., Ipçi K., Alp A., Gür D., Hasçelik G. (2012),

“Comparison of culture and real-time PCR methods in the detection of

Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae in acute otitis media

effusion specimens”, Mikrobiyol Bul, 46(4), pp. 676-681.

30. Fagon, J. Y., Chastre J., Hance A. J., Montravers P., Novara A., Gibert C.

(1993), “Nosocomial pneumonia in ventilated patients: a cohort study

evaluating attributable mortality and hospital stay”, American Journal of

Medicine, 94(3), pp. 281–288.

31. Fleischmann C., Scherag A., Adhikari N.K., Hartog C.S., Tsaganos T.,

Schlattmann P., Angus D. C., Reinhart K. (2016), “Assessment of Global

Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis: Current Estimates and

Limitations”, Am J Respir Crit Care Med., 193(3). pp. 259-272.

32. Gadsby N. J., Russell C. D., McHugh M. P., Mark H., Conway Morris A.,

Laurenson I. F., Hill A. T , Templeton K. E. (2016), “Comprehensive

Molecular Testing for Respiratory Pathogens in Community-Acquired

Pneumonia”, Clin Infect Dis., 62(7), pp. 817-23.

33. Geha D.J., James R.U., Cynthia A.G., David H.P. (1994), “Multiplex PCR

for identification of methicillin-resistant Staphylococci in the clinical

laboratory”, Journal of Clinical Microbiology, 32(7), pp. 1768-1772.

34. Grundmann H., Kropec A., Hartung D., Berner R., Daschner F. (1993),

“Pseudomonas aeruginosa in a neonatal intensive care unit: reservoirs and

ecology of the nosocomial pathogen”, The Journal of Infectious Diseases,

168, pp. 943–947.

35. Haanpera M., Jalava J., Huovinen P., Meurman O., Ranta kokko Jalava K.

(2007), “Identification of alphahemolytic streptococci by pyrosequencing the

16S rRNA gene and by use of VITEK 2”, Journal of Clinical Microbiology,

45, pp. 762–770.

36. Hall MZ., Williams SN., DeFrances CJ. (2011), "Inpatient Care for

Septicemia or Sepsis: A Challenge for Patients and Hospitals", NCHS Data

Brief, 62, pp.1-8.

37. Harrison DA., Welch CA., Eddleston JM. (2006), "The epidemiology of

severe sepsis in England, Wales and Northern Ireland, 1996 to 2004:

secondary analysis of a high quality clinical database, the ICNARC Case

Mix Programme Database", Critical Care, 10, pp.42.

38. Hassanain A., Chan Y.Y., Alyaa A., Habsah H., Kirnpal Kaur B.S., Karim

A., Manickam R. (2009), “A pentaplex PCR assay for the detection of

methicillin

resistant Staphylococcus aureus and Panton Valentine

Leucocidin”, BioMed Central Microbiology, 9(113), pp. 1-8.

39. Hotchkiss R. S., Monneret G., Payen D. (2013), “Sepsis-induced

immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy”, Nature

Reviews Immunology, 13(12), pp. 862–874.

40.

Jason P., Younsuck K., Bin D. et al. (2011), "Management of severe sepsis

in patients admitted to Asian intensive care units: prospective cohort study",

BMJ, 342, pp. 32-45.

41.

Jbara I., Baysallar M., Kiliç A., Yetişer S., Unay B., Açikel C., Yapar M.,

Doğanci L. (2007), “Comparison of culture and polymerase chain reaction

methods for the detection of Haemophilus influenzae, Streptococcus

pneumoniae and Moraxella catarrhalis in cerebrospinal fluids and middle

ear effusions”, Mikrobiyol Bul., 41(4), pp. 495-502.

42.

Josefson P., Stralin K., Ohlin A., Ennefors T., Dragsten B. (2011),

“Evaluation of a commercial multiplex PCR test (Septi-Fast) in the

etiological diagnosis of community-onset bloodstream infections”, European

Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: official publication

of the European Society of Clinical Microbiology, 30(9), pp. 1127–1134.

43. Kirn T. J, Weinstein M. P. (2013), “Update on blood cultures: how to obtain,

process, report, and interpret”, Clinical Microbiology and Infection: the

official publication of the European Society of Clinical Microbiology and

Infectious Diseases, 19(6), pp. 513–520.

44. Kong R.Y.C., So C.L., Law W.F., Wu R.S.S. (1999), “A sensitive and

versatile multiplex PCR system for the rapid detection of enterotoxigenic

(ETEC), enterohaemorrhagic (EHEC) and enteropathogenic (EPEC) strains

of Escherichia coli”, Marine Pollution Bulletin, 38(12), pp. 1207-1215.

45. Kumar A., Haery C., Paladugu B., Symeoneides S., Taiberg L. (2006), “The

duration of hypotension before the initiation of antibiotic treatment is a

critical determinant of survival in a murine model of Escherichia coli septic

shock: asso-ciation with serum lactate and inflammatory cytokine levels”,

The Journal of Infectious Diseases, 193(2), pp. 251–258.

46. Kurutepe S., Ecemiş T., Ozgen A., Biçmen C., Celik P., Aktoğu Özkan S.,

Sürücüoğlu S. (2012), “Investigation of bacterial etiology with conventional

and multiplex PCR methods in adult patients with community-acquired

pneumonia” Mikrobiyol Bul., 46(4), pp. 523-531.

47. Labelle A. J., Micek S. T., Roubinian N., Kollef M. H. (2008), “Treatment

related risk factors for hospital mortality

in Candida bloodstream

infections”, Critical Care Medicine, 36(11), pp. 2967–2972.

48. Lambiase A., Piazza O., Rossano F. et al. (2012), “Pesistence of

carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii strains in an Italian intensive

care unit during a forty-six month study periode”, New Microbiological, 35,

pp. 199-206.

49. Leea N. Y., Leea C. C., Huang W. H., Tsuic K. C., Hsuehb P. R., Koa W. C.

(2012), “Carbapenem Therapy for Bacteremia Due to Extended-Spectrum-β-

Lactamase-Producing Escherichia

coli or Klebsiella pneumoniae:

Implications of Ertapenem Susceptibility”, Antimicrobial Agents and

Chemotherapy, 56(6), pp. 2888-2893.

50. Levy M. M.,

Fink M.

P., Marshall

(2001),

“SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS

international

sepsis

definitions

conference”, Critical Care Medicine, 31(4), pp. 1250–1256.

51. Levy M.M., Fink M.P., Marshall J.C., Abraham E., Angus D., Cook D.,

Cohen J., Opal S. M., Vincent J. L., Ramsay G. (2003), “SCCM/

ESICM/ACCP/ATS/SIS

international

sepsis definitions conference”,

Intensive Care Medicine, 29, pp. 530–538. Liesenfeld O., Lehman L., Hunfeld K. H., Kost G. (2014), “Molecular

52.

diagnosis of sepsis: new aspects and recent developments”, European

Journal of Microbiology and Immunology, 4 (1), pp. 1–25.

53. Lomholt J. A., Poulsen K., Kilian M. (2001), “Epidemic populationstructure

of Pseudomonas aeruginosa: evidence for a clone that is pathogenicto the

eye and that has a distinct combination of virulence factors”, Infection

Immunology, 69(10), pp. 6284–6295.

54. Maiden M. C., Bygraves J. A., Feil E., Morelli G., Russell J. E., Urwin R.,

Zhang Q., Zhou J., Zurth K., Caugant D. A., Feavers I. M., Achtman M.,

Spratt B. G. (1998), “Multilocus sequence typing: a portable approach to

identification of clones within populations of pathogenic microorganisms”,

Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 95(6), pp. 3140–

3145.

55. Mancini N., Carletti S., Ghidoli N., Cichero P., Burioni R. (2010), “The era

of molecular and other nonculture based methods in diagnosis of sepsis”,

Clinical Microbiology Reviews, 23(1), pp. 235–251.

56. Martin G. S., Mannino D. M., Eaton S, Moss M. (2003), “The epidemiology

of sepsis in the United States from 1979 through 2000”, The New England

Journal of Medicine, 348, pp. 1546–1554.

57. Martin, G. S. (2012), “Sepsis, severe sepsis and septic shock: changes in

incidence, pathogens and outcomes”, Expert Review of Anti-infective

Therapy, 10(6), pp. 701–706.

58. Mayr F. B., Yende S., Linde-Zwirble W. T., Peck-Palmer O. M., Barnato A

.E. (2010), “Infection rate and acute organ dysfunction risk as explanations

for racial differences in severe sepsis”, JAMA: the journal of the American

Medical Association, 303(24), pp. 2495–2503.

59. Mehrotra M., Wang G., Johnson W.M. (2000), “Multiplex PCR for detection

of genes for Staphylococcus aureus enterotoxins, exfoliative toxins, toxic

shock syndrome toxin 1, and methicillin resistance”, Journal of Clinical

Microbiolog, 38(3), pp. 1032-1035.

60. Nordmann P., Gniadkowski M., Giske C. G., Poirel L., Wood-ford N.

(2012), “Identification and screening of carbapenemase producing

Enterobacteriaceae”, Clinical Microbiology and Infection, 18(5), pp. 432–

438.

61. Oliveira K., Haase G., Kurtzman C., Hyldig-Nielsen J J., Stender H. (2001),

“Differentiation of Candida albicans and Candida dubliniensis by fluorescent

in situ hybridization with peptide nucleic acid probes”, Journal of Clinical

Microbiology, 39(11), pp. 4138–4141.

62. Opal S. M., Garber G. E., LaRosa S. P., Maki D. G., Freebairn R. C. (2003),

“Systemic host responses

in severe sepsis analyzed by causative

microorganism and treatment effects of drotrecogin alfa (activated)”,

Clinical Infectious Diseases, 37(1), pp. 50–58.

63. Osek J.

(2001), “Multiplex polymerase Chain

reaction assay

for

identification of Escherichia coli strains”, Journal of Veterinary Diagnostic

investigation, 13(4), pp. 308-311.

64. Paolucci M., Landini M. P., Sambri V. (2010), “Conventional and molecular

techniques for the early diagnosis of bacteraemia”, International Journal of

Antimicrobial Agents, 36(2), pp. 6–16.

65. Perez-roth E., Claverie F., Villar J., Mendez S. (2001), “Multiplex PCR for

simultaneous identification of Staphylococcus aureus and detection of

methicilin and mupirocin resistance”, Journal of Clinical Microbiology,

39(11), pp. 4037-4041.

66. Pirnay J. P., De Vos D., Cochez C., Bilocq F., Vanderkelen A., Zizi M.,

Ghysels B., Cornelis P. (2002), “Pseudomonas aeruginosa displays an

epidemic population structure”, Environment Microbiology, 4(12), pp. 898–

911.

67. Prathiba K., Chow C., Gamini K., Chit L. P. (2004), “Rapid detection of

Klebsiella pneumoniae from blood culture bottles by real-time PCR”,

Clinical Microbiology, 42(3), pp. 1337–1340.

68. Qian Q., Tang Y. W., Kolbert C. P., Torgerson C. A., Hughes J. G. (2001),

“Direct

identification of bacteria from positive blood cultures by

amplification and sequencing of the 16S rRNA gene: evaluation of BACTEC

9240 instrument true-positive and false-positive results”, Journal of Clinical

Microbiology, 39(10), pp. 3578–3582.

69. Ramsamy Y., Hardcastle T. C., Muckart D. J. (2016), “Surviving Sepsis in

the Intensive Care Unit: The Challenge of Antimicrobial Resistance and the

Trauma Patient”, World journar of surgery, DOI: 10.1007/s00268-016-3531-

70. Rangel Frausto M. S., Pittet D., Costigan M., Hwang T., Davis C. S. (1995),

“The natural history of the systemic inflammatory response syndrome

(SIRS). A prospective study”, JAMA: the journal of the American Medical

Association, 273(2), pp. 117–123.

71. Russmann H., Kempf V. A., Koletzko S., Heesemann J., Auten-rieth I. B.

(2001), “Comparison of fluorescent in situ hybridization and conventional

culturing for detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy specimens”.

Journal of Clinical Microbiology, 39(1), pp. 304–308.

72. Sautter R. L., Bills A. R., Lang D. L., Ruschell G., Heiter B. J. (2006),

“Effects of delayed-entry conditions on the recovery and detection of

microorganisms from BacT/ALERT and BAC-TEC blood culture bottles”,

Journal of Clinical Microbiology, 44(4), pp. 1245–1249.

73. Savitha, N., Prasanthi, N., Dasarathy, R., Gayathri A. (2006), “Genotyping

ofmethicillin- resistant

Staphylococcus aureus

isolates from Indian

hospitals” , Current Science, 91(10), pp. 1364-1369.

74. Shepard J. R., Addison R. M., Alexander B. D., Della Latta P., Gherna M.

(2008), “Multicenter evaluation of the Candida albicans/Candida glabrata

peptide nucleic acid fluorescent insitu hybridization method for simultaneous

dualcolor identification of C. Albicans and C. glabrata directly from blood

culture bottles”, Journal of Clinical Microbiology, 48(1), pp. 50–55.

75. Tang Y. W., Kilic A., Yang Q., McAllister S. K., Li H. (2007), “StaphPlex

system for rapid and simultaneous identification of antibiotic resistance

determinants and Panton-Valentine leukocidin detection of staphylococci

from positive blood cultures”, Journal of Clinical Microbiology, 45(6), pp.

1867–1873.

76. Thong, K. L., Lai, M. Y., Teh C. S. J., Chua K. H. (2011), “Simultaneous

detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Acinetobacter

baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas

aeruginosa by multiplex PCR”, Tropical Biomedicine, 28(1), pp. 21–31.

77. Tsalik E. L., Jones D., Nicholson B., Waring L., Liesenfeld O. (2010),

“Multiplex PCR to diagnose bloodstream infections in patients admitted

from

the emergency department with sepsis”, Journal of Clinical

Microbiology, 48(1), pp. 26–33.

78. Turenne C. Y., Witwicki E., Hoban D. J., Karlowsky J. A., Kabani A. M.

(2000), “Rapid identification of bacteria from positive blood cultures by

fluorescence-based PCR-single-strand conformation polymorphism analysis

of the 16S rRNA gene”, Journal of Clinical Microbiology, 38(2), pp. 513–

520.

79. Vincent J. L. (2000), “Procalcitonin: the marker of Sepsis”, Critical Care

Medicine, 28(4), pp. 1226–1228.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Hình ảnh Chromas trình tự gen mdh của Klebsiella pneumoniae

Phụ lục 2: Hình ảnh Chromas trình tự gen femA của Staphylococcus aureus

Phụ lục 3: Hình ảnh Chromas trình tự gen oprL của Pseudomonas aeruginosa

Phụ lục 4: Hình ảnh Chromas trình tự gen phoA của Escherichia coli

Phụ lục 5: Hình ảnh Chromas trình tự gen gltA của Acinetobacter baumannii

Phụ lục 6: Kết quả phân tích Blast gen oprL của Pseudomonas aeruginosa

iii

Phụ lục 7: Kết quả phân tích Blast gen gltA của Acinetobacter baumannii

Phụ lục 8: Kết quả phân tích Blast gen phoA của Escherichia coli

Phụ lục 9: Kết quả phân tích Blast gen mdh của Klebsiella pneumoniae

Phụ lục 10: Kết quả phân tích Blast gen femA của Staphylococcus aureus

vii

STT

Họ tên

Khoa

Kết quả cấy máu

HSTC HSTC CTCH

HSTC

Mã (kí hiệu mẫu) 2300m 2297m 2369m 2079m 2309m

1 Đỗ Bá L 2 Nguyễn Đức L 3 Cao Thị V 4 Đào Văn H 5 Hà Phương A 6 Nguyễn Thị Q 7 Nguyễn Văn T 8 Nguyễn Đức M 9 Nguyễn Văn Q 10 Lê Văn P 11 Bùi Thanh T 12 Nguyễn Xuân T 13 Tạ Thị L 14 Nguyễn Đình K 15 Phạm Văn T 16 Phạm Văn K 17 Vũ Thị H 18 Phạm văn T 19 Nguyễn Thế Ng 20 Tạ Thị L 21 Lương Thị G 22 Đỗ Văn H 23 Cao Dụ T

2272 2238m 2278m 2253m 2011m 2044m 2105m 2342m 2300m 2314m 2364m 2351m 2337m 2339m 2279m 2367m 2365m

Âm tính A.baumannii Cầu khuẩn Gr (+) K. pneumonia Âm tính Âm tính Trực khuẩn Gr(+) S.aureus Cầu khuẩn Gr (-) E.Coli Âm tính P.aeruginosa Trực khuẩn Gr(-) Trực khuẩn Gr(-) Nấm candida Knisie Cầu khuẩn Gr (+) Cầu khuẩn Gr (+) Nấm candida Knisie Cầu khuẩn Gr (+) Cầu khuẩn Gr (+) Citrobacter sp Cầu khuẩn Gr (+) Trực khuẩn Gr(-)

24 Lưu Thị B 25 Nguyễn Đức M 26 Đỗ Văn H 27 Nguyễn Viết C

2302m 2238m 2367m 2348

HSTC HSTC NTT HSTC HSTC C1 HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC CC Nội HSGM Thận TN CTCH HSTC HSTC HSTC (VT2) HSTC HSTC HSTC HSTC VT1

28 Phạm Trí D 29 Lê Hữu P 30 Nguyễn Viết C

2303m 2250m 2348m

Độtquỵ HSTC HSTC

31 Lê Văn P 32 Trần Trung H 33 Nguyễn Xuân L

2249m 2222m 2326m

HSTC HSTC

Cầu khuẩn Gr (+) S.aureus Cầu khuẩn Gr (+) Streptococus. Pneumonie Cầu khuẩn Gr (+) Nấm candida Knisie Streptococus. Pneumonie E.Coli Cầu khuẩn Gr (+) Trực khuẩn Gr(-)

viii

2262m

34 Nguyễn Thị B 35 Nguyễn Thị Q 36 Trần Thị S 37 Đào Văn H 38 Nguyễn Viết C

2396m 2067m 2247m

39 Phạm Văn T 40 Phạm Thanh K 41 Doãn Thị K 42 Lê Văn L 43 Trần Thế P 44 Đào Văn H 45 Lương Thị G 46 Lê Văn P 47 Nguyễn Văn L 48 Nguyễn.T.M.T 49 Nguyễn văn V 50 Lê Thị Ng 51 Nguyễn Viết V 52 Trần Văn Ng 53 Vũ Xuân 54 Nguyễn Văn V 55 Dương văn T 56 Bùi Thanh T 57 Lê Tiến T 58 Nguyễn Xuân T 59 Nguyễn Thị D 60 Hoàng Sinh L 61 Nguyễn Văn L 62 Lê Tiến T 63 Nguyễn Viết T 64 Vũ Văn Q 65 Lê Tiến T 66 Vũ Thị V 67 Bùi Thanh T 68 Lê Thị C

HSTC HSTC TT HSTC HSTC (VT2) GMHS TTM HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC HSTC CTCH HSTC GMHS HSTC HSTC NTH HSTC CTCH GMHS HSTC HSTC HSTC GMHS

2351m 2391m 2218m 2261m 2326m 2067m 2380m 2249m 2159m 2331m 2158m 2136m 2221m 2277m 2056m 2158m 2030m 2011m 2085m 2043m 2109m 2046m 2330m 2086m 2091m 2096m 2085m 2062m 2011m 2069m

Cầu khuẩn Gr (-) Âm tính Trực khuẩn Gr(-) Âm tính Streptococus. Pneumonie Nấm candida Knisie Pseudomonas sp Cầu khuẩn Gr (+) Trực khuẩn Gr(-) Trực khuẩn Gr(+) Âm tính Citrobacter sp E.Coli E.Coli Cầu khuẩn Gr (+) E.Coli S.aureus K. pneumonia E.Coli Tụ cầu da E.Coli Tụ Cầu da Âm tính S.aureus P.aeruginosa S.aureus Tụ cầu da Trực khuẩn Gr(-) S.aureus Tụ cầu da E.Coli S.aureus Tụ cầu da Âm tính S.aureus

Phụ lục 11: Danh sách 68 bệnh nhân

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp multiplex PCR xác định một số tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết

Phạm Thị Thùy

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP

MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC

NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Thị Thùy

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP

MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC

NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Lời cam đoan

TS. Lã Thị Huyền.

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

Phạm Thị Thùy

Lời cảm ơn

PGS. TS. Nguyễn Quang Huy – Trưởng khoa Sinh học - Trường đại học Khoa

Học viên

Phạm Thị Thùy

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 27

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 62

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

TIẾNG ANH

PHỤ LỤC

STT

Họ tên

Khoa

Kết quả cấy máu

Mã (kí hiệu mẫu) 2300m 2297m 2369m 2079m 2309m

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Thực trạng tuân thủ vệ sinh tay thường quy của nhân viên y tế tại Bệnh viện Phụ sản Thái Bình năm 2024

Luận án Tiến sĩ: Bồi dưỡng cho học sinh năng lực thích nghi trí tuệ nhằm nâng cao hiệu quả dạy học hình học không gian ở trường Trung học phổ thông

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của lượng phân bón đến sinh trưởng và năng suất một số giống lúa lai triển vọng tại Nam Trực, Nam Định

Luận văn Thạc sĩ: Đánh giá đặc điểm nông sinh học và khả năng kết hợp của một số dòng thuần phục vụ công tác chọn tạo giống ngô làm thức ăn gia súc

Luận văn Thạc sĩ: Ảnh hưởng của lượng phân bón và mật độ trồng đến sinh trưởng, năng suất và chất lượng của dòng khoai lang 15D-1-16 tại Thanh Trì, Hà Nội

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu giá trị thrombomodulin trong tiên lượng tổn thương thận cấp và tử vong ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết

Đánh giá nhận thức, thái độ và thực hành của nhân viên y tế trong hoạt động báo cáo phản ứng có hại của thuốc tại Bệnh viện Phổi Thái Bình năm 2022

Giá trị của chỉ số lactat/albumin trong tiên lượng tử vong ở bệnh nhân sốc nhiễm khuẩn

Báo cáo ca bệnh và tổng quan tài liệu về hội chứng áp xe gan xâm lấn do Klebsiella pneumoniae (KILAS) có viêm màng não mủ kết hợp viêm mủ nội nhãn

Khi nhân viên y tế thực hiện nghiên cứu khoa học: Thuận lợi, rào cản và giải pháp

Quy trình chuyên môn điều trị bệnh tiêu chảy cấp ở trẻ em

Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị một số bệnh truyền nhiễm: Bệnh dịch hạch

Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị một số bệnh truyền nhiễm: Nhiễm khuẩn huyết

Phẫu thuật áp xe dưới màng tủy

Xác định ngưỡng cắt của độ phân bố kích thước bạch cầu đơn nhân ở máu ngoại vi trong chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết

Ảnh hưởng của năng lực tâm lý tới chất lượng đời sống việc làm và chất lượng cuộc sống - nghiên cứu trường hợp nhân viên y tế tại thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Y tế Công cộng: Thực trạng và một số yếu tố liên quan đến stress ở nhân viên y tế tại một số Bệnh viện Đại học Y giai đoạn 2020-2022 và kết quả một số biện pháp can thiệp

Luận án Tiến sĩ Y tế Công cộng: Thực trạng và một số yếu tố liên quan đến stress ở nhân viên y tế tại một số Bệnh viện Đại học Y giai đoạn 2020-2022 và kết quả một số biện pháp can thiệp

Bài giảng Đặc điểm tâm lý của nhân viên y tế - ThS. Nguyễn Hồng Xuân Nguyên

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu