Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tách chiết hoạt chất protodioscin từ cây Bạch tật lê (Tribulus terrestris L.)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------***---------

VŨ QUANG THẮNG

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT PROTODIOSCIN

TỪ CÂY BẠCH TẬT LÊ (Tribulus terrestris L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------***---------

VŨ QUANG THẮNG

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT PROTODIOSCIN

TỪ CÂY BẠCH TẬT LÊ (Tribulus terrestris L.)

Chuyên ngành

: Sinh học thực nghiệm

Mã số

: 8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. PHẠM HƢƠNG SƠN

TS. LÊ HỒNG ĐIỆP

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Ban Giám hiệu,

Phòng Đào tạo Sau đại học, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, Bộ môn Sinh học thực

nghiệm và các thầy cô trong Khoa Sinh học đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức

cho tôi trong những năm tháng học tập và nghiên cứu tại trƣờng.

Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS. Phạm Hƣơng Sơn – Phó

viện trƣởng, Viện Ứng dụng Công nghệ - Bộ Khoa học và Công nghệ, là ngƣời

hƣớng dẫn chính của tôi. Cô đã giúp tôi định hƣớng nghiên cứu và dành rất nhiều

tâm huyết, thời gian, công sức, luôn động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện

đề tài. Tôi cũng xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới TS. Lê Hồng Điệp, là

ngƣời đồng hƣớng dẫn của tôi. Thầy là ngƣời đã truyền dạy kiến thức cho tôi, giúp

tôi định hƣớng nghiên cứu và luôn quan tâm tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn

thành nghiên cứu này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban Giám Đốc, Khoa Hóa Sinh,

Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật tỉnh Quảng Ninh, đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi

hoàn thành khóa học.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời thân, đã

luôn ở bên, động viên cho tôi có thêm nghị lực để vƣợt qua những lúc khó khăn

trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, tháng 11 năm 2018

Học viên

Vũ Quang Thắng

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 2

1.1. Tổng quan về cây Bạch tật Lê (Tribulus terrestris L.) .................................. 2

1.1.1. Đặc điểm về hình thái, phân loại và phân bố .............................................. 2

1.1.2. Thành phần hóa học và tác dụng dƣợc lí của cây Bạch Tật Lê ................... 4

1.2. Protodioscin .............................................................................................. 14

1.2.1. Cấu trúc của Protodioscin ........................................................................ 14

1.2.2. Tác dụng dƣợc lí của Protodiscin ............................................................. 15

1.3. Các phƣơng pháp tách chiết các hơp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật. 22

1.3.1. Các phƣơng pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật ............................... 22

1.3.2. Tách chiết Protodioscin ........................................................................... 25

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................. 28

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 28

2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................. 28

2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ................................................................... 28

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 29

2.2.1. Phƣơng pháp lựa chọn dung môi để chiết Bạch Tật Lê ............................ 29

2.2.2. Phƣơng pháp lựa chọn phƣơng pháp, nhiệt độ, thời gian chiết tổng Bạch

Tật Lê .................................................................................................................... 29

2.2.3. Phƣơng pháp chiết phân đoạn mẫu dịch chiết tổng Bạch Tật Lê .............. 29

2.2.4. Phƣơng pháp tách sắc ký làm giàu protodioscin ....................................... 30

2.2.5. Phƣơng pháp dựng đƣờng chuẩn định lƣợng protodioscin ....................... 30

2.2.6. Phƣơng pháp thử nghiệm sự thay đổi hormon sinh dục trên chuột ........... 31

2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu ....................................................................... 31

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 32

3.1. Lựa chọn dung môi và điều kiện chiết tổng Bạch Tật Lê ............................ 32

3.2. Lựa chọn phƣơng pháp, nhiệt độ chiết tổng Bạch Tật Lê ............................ 33

3.3. Lựa chọn thời gian chiết tổng Bạch Tật Lê ................................................. 35

3.4. Nghiên cứu chiết phân đoạn dịch chiết tổng Bạch Tật Lê ........................... 37

3.5. Nghiên cứu tách sắc ký làm giàu Protodioscin ............................................ 38

3.6. Xây dựng quy trình tách chiết Protodioscin quy mô phòng thí nghiệm ....... 40

3.7. Nghiên cứu sự thay đổi hormon sinh dục của chuột khi sử dụng dịch chiết

chứa Protodioscin từ Bạch Tật Lê .......................................................................... 42

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN ................................................................................... 46

KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 46

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. So sánh các phƣơng pháp tiền tách chiết ................................................ 23

Bảng 1.2. So sánh các phƣơng pháp tách chiết truyền thống. ................................. 24

Bảng 1.3. So sánh các phƣơng pháp tách chiết hiện đại ......................................... 25

Bảng 1.4. Dung môi khách nhau dùng trong chiết xuất các nhóm hoạt chất từ dƣợc

liệu.................. ....................................................................................................... 26

Bảng 3.1. Hiệu suất chiết theo các dung môi chiết khác nhau (g cao chiết/2kg

nguyên liệu, đun hồi lƣu trong 2h). ........................................................................ 33

Bảng 3.2. Hiệu suất chiết theo các phƣơng pháp chiết khác nhau (g cao chiết/2 kg

nguyên liệu)........................................................................................................... 34

Bảng 3.3. Hiệu suất chiết theo các nhiệt độ chiết khác nhau (g cao chiết/2 kg

nguyên liệu)........................................................................................................... 35

Bảng 3.4. Hiệu suất chiết theo thời gian chiết khác nhau (g cao chiết/2 kg nguyên

liệu, đun hồi lƣu với 50% ethanol trong 2 h) .......................................................... 36

Bảng 3.5. Hiệu suất chiết theo các điều kiện khác nhau (g cao chiết/2 kg nguyên

liệu) ....................................................................................................................... 36

Bảng 3.6. Nồng độ các hormon sinh dục ở chuột bình thƣờng và chuột uống chiết

xuất chứa protodioscin từ Bạch Tật Lê .................................................................. 42

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình thái toàn cây và quả Bạch Tật Lê (Tribulus terrestris) ................... ..3

Hình 1.2. Đặc điểm hình thái của cây Bạch Tật Lê (Tribulus terrestris) ................ ..3

Hình 1.3. Các loại khung carbon của saponin spiroston trong Bạch Tật Lê ............ ..6

Hình 1.4. Các loại khung carbon của saponin furostane trong Bạch Tật Lê ............ ..7

Hình 1.5. Một số saponin chính có hoạt tính sinh học tách chiết từ Bạch Tật

Lê............................................................................................................................. ..8

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của flavonoid tách chiết từ Bạch Tật Lê ...................... ..8

Hình 1.7. Cấu trúc của alkaloid tách chiết từ Bạch Tật Lê ..................................... ..9

Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của protodioscin.......................................................... 15

Hình 1.9. Cơ chế hoạt động của protodioscin trong cải thiện chức năng tình dục ... 19

Hình 2.1. Mẫu cây Bạch Tật Lêđƣợc phơi khô và mẫu đã khô ............................... 28

Hình 2.2. Đƣờng chuẩn định lƣợng chất chuẩn protodioscin .................................. 31

Hình 3.1 Sắc ký bản mỏng mẫu cao chiết tổng và phân đoạn: (1) cao A, (2) cao

chiết ethyl acetate, (3) dịch chiết B. Bản mỏng silica gel pha thƣờng, dung môi triển

khai dichloromethane-methanol 1:1 ....................................................................... 38

Hình 3.2. Sắc ký bản mỏng mẫu cao B (1), cao C (2). Bản mỏng silica gel pha

thƣờng, dung môi triển khai ethyl acetate:cồn 20:1 ................................................ 38

Hình 3.3. Sắc ký đồ UV 210nm của chất chuẩn protodioscin ................................. 39

Hình 3.4. Sắc ký đồ UV 210nm của mẫu Bạch Tật Lê thân lá................................ 39

Hình 3.5. Sắc ký đồ UV 210nm của mẫu Bạch Tật Lê quả .................................... 39

Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của cao D chứa protodioscin ....................................... 40

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

kilodalton kDa

Tế bào ung thƣ gan HepG2

Escherichia coli E. coli

Staphylococcus aureus S. aureus

Nitric oxit NO

Nanomole/Lite nmol/L

Hormon LH Luteinizing Hormone

Hormon FSH Follicle Stimulating Hormone

Hormon GnRH Gonadotropin Releasing Hormone

Dehydroepiandrosterone DHEA

Deoxyribonucleic acid DNA

Vietnamese Good Agricultural Practices

VietGAP

Cyclic adenosine monophosphate cAMP

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bạch tật lê (Tribulus terrestris) là một loại thảo dƣợc đƣợc trồng quanh năm

ở khu vực Địa Trung Hải và các vùng có khí hậu ấm ở Châu Âu, Châu Á, Mỹ, Châu

Phi và Australia. Từ lâu, loại cây này đã đƣợc sử dụng trong y học cổ truyền của

Trung Quốc, Ấn Độ, Iraq, Bulgari, Nam Phi và Iran. Bạch tật lê có rất nhiều thành

phần có hoạt chất sinh học nhƣ steroid, saponin, flavonoid, alkaloid, các acid béo

không bão hòa, vitamin, tannin, acid aspartic và acid glutamic. Trong đó saponin

đƣợc coi là thành phần đặc trƣng nhất của cây đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng từ

lâu để làm tăng khả năng sinh sản ở cả động vật thí nghiệm và ngƣời.

Cây Bạch tật lê đƣợc dùng điều trị cho bệnh nhân nam giới vô sinh bởi vì có

tác dụng tăng số lƣợng tinh trùng và khả năng di động tinh trùng. Bên cạnh đó,

Bạch tật lê còn làm cải thiện khả năng cƣơng cứng và các hành vi tình dục ở động

vật thí nghiệm. Các tác dụng trên là do Bạch tật lê có chứa thành phần protodioscin

saponin tăng các hormon sinh dục ảnh hƣởng lên hệ thống sinh sản. Protodioscin

làm tăng hormon sinh dục testosterone tự do trong máu, dihydrotrestosterone

(DHT), dehydroepiandrosterone (DHEA) dehydroepiandrosterone sulfat (DHEA-

S), đồng thời cân bằng nồng độ estrogen, progesterone và pregnenolone. Chính vì

vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với các mục tiêu:

Nghiên cứu các điều kiện tách chiết hoạt chất protodioscin từ cây Bạch tật lê

nhằm tìm ra hoạt chất sinh học an toàn, hiệu quả trong điều trị tăng cƣờng sinh lực

ở nam giới.

1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây Bạch tật lê (Tribulus terrestris L.)

1.1.1. Đặc điểm hình thái, phân loại và phân bố.

1.1.1.1. Phân loại

Chi Tribulus thuộc họ Zygophyllaceae bao gồm khoảng 20 loài trên thế giới,

trong đó có ba loài: Tribulus cistoides, Tribulus terrestris, và Tribulus alatus xuất

hiện phổ biến ở Ấn Độ. Trong số đó, Bạch tật lê (T. terrestris) đƣợc sử dụng nhƣ

một dƣợc liệu quý nhằm hỗ trợ và cải thiện sức khỏe con ngƣời. Bạch tật lê là một

loài cây bụi, đƣợc tìm thấy ở Địa Trung Hải, cận nhiệt đới và sa mạc vùng khí hậu

trên toàn thế giới nhƣ Ấn Độ, Trung Quốc, các quốc gia Nam Mỹ, Mexico, Tây Ban

Nha, và Bulgaria [16].

Phân loại

Giới: Plantae

Phân giới: Phanerogams

Phân ngành: Angiospermae

Lớp: Dicotyledonae

Phân lớp: Polypetalae

Dòng: Disciflorae

Bộ: Giraniales

Họ: Zygophyllaceae

Chi: Tribulus

Loài: terrestris Linn [16]

1.1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh thái và phân bố.

Trên thế giới cây Bạch tật lê đƣợc mô tả với các đặc điểm nhƣ sau: Thân thấp

nhỏ, cao 10-60 cm, tối màu. Gốc hình trụ, dài 7-18 cm đƣờng kính 0,3-0,7 cm. Lá

kép mọc đối từ 5 đến 8 cặp hình elip hoặc hình trụ tuy nhiên bất đối xứng. Hoa có

màu vàng. Quả có nhiều hình dạng (tròn, dẹt, năm góc) và thƣờng đƣợc bao phủ

một màu vàng nhạt, có nhiều hạt. Rễ xơ, hình trụ, thƣờng phân nhánh, mang một số

rễ nhỏ và có màu nâu nhạt (Hình 1.1) [16].

2

Hình 1.1. Hình thái toàn cây và quả Bạch tật lê (Tribulus terrestris) [16]

Tại Việt Nam cây Bạch tật lê đƣợc Bùi Đình Thạch và cộng sự (2011) mô tả

với đặc điểm hình thái tƣơng tự: Cây thảo, mọc bò lan, phân nhánh nhiều, có lông

trắng nằm. Lá kép lông chim, mọc đối hoặc gần đối, một to một nhỏ, gồm 5-7 đôi lá

chét bằng nhau; phiến lá dài 5-16 mm, rộng đến 2,5 mm, phủ lông trắng ở mặt dƣới.

Hoa mọc riêng lẻ ở nách lá; lá đài 5; cánh hoa 5, nhỏ ngắn hơn 1 cm, mỏng, màu

vàng, vành xanh, sớm rụng; nhị 10, có 5 dài, 5 ngắn; bầu 5 ô. Quả thƣờng có 5

cạnh có gai, có lông dày, tách thành 5 mảnh vỏ rất cứng, mỗi mảnh mang nhiều hạt.

Mùa hoa tháng 5-7; mùa quả tháng 8-9 (Hình 1.2).

Hình 1.2. Đặc điểm hình thái của cây Bạch tật lê (Tribulus terrestris) [1]

3

Sinh thái: Cây ƣa sáng, chịu đƣợc khô hạn, thƣờng mọc thành đám nhỏ trên

các bãi cát ven biển. Cây tái sinh bằng hạt vào mùa mƣa. Sinh trƣởng phát triển

nhanh, bò lan trên mặt đất. Sau khi mùa hoa quả kết thúc, cây cũng tự tàn lụi vào

đầu mùa khô. Quả tự mở khi chín để hạt thoát ra ngoài. Hạt nằm lẫn trong cát suốt

mùa khô vẫn còn khả năng nảy mầm tốt.

Phân bố: Bạch tật lê phân bố rải rác ở khắp các vùng nhiệt đới châu Á, châu

Phi và cả vùng ôn đới ấm của châu Âu. Ở Việt Nam, cây chỉ gặp ở vùng ven biển,

từ Quảng Bình, Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên,

Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận đến Trà Vinh [1,2].

1.1.2. Thành phần hóa học và tác dụng dược lí của cây Bạch tật lê

1.1.2.1. Thành phần hóa học của cây Bạch tật lê

Nghiên cứu thành phần hóa học sơ bộ của Bạch tật lê cho thấy sự có mặt của

saponin, flavonoid, glycosid, alkaloid và tanin [56]. Trong đó saponin và furostanol

saponin đƣợc xem là thành phần chính bao gồm 58 loại saponin spicrostan và 50

loại saponin furostane (Hình 1.3, 1.4). Các saponin steroid nhƣ protodioscin,

prototribestin, rutin và dioscin đƣợc xem là các saponin có hoạt tính sinh học của

Bạch tật lê (Hình 1.5). Tuy nhiên, theo nhiều nghiên cứu trƣớc đây cho thấy thành

phần saponin và hàm lƣợng saponin của cây Bạch tật lêtừ các vùng địa lý khác nhau

là khác nhau [31].

Các hợp chất flavonoid của Bạch tật lêchủ yếu là các dẫn xuất của quercetin,

kaempferol và isorhamnetin bao gồm:

Quercetin (109), iso-quercitrin (110), rutin (111), quercetin-3-O-gent (112),

quercetin-3-O-gentr (113), quercetin-3-0-rha-gent (114), quercetin-3-O-gent-7-O-

glu (115) là favonoid với quercetin là cấu trúc gốc cơ bản.

Isorhamnetin (116), isorhamnetin-3-O-glu (117), isor-hamnetin-3-O-gent

(118), isorhamnetin-3-O-rutinoside (119), isorhamnetin-3-O-rutinoside (120),

isorhamnetin-3,7-di-O-glu (121), isorhamnetin-3-O-p-coumarylglu (122),

isorhamnetin-3-O-gent-7-O-glu (123), isorham-netin-3-O-gentr-7-O-glu (124) là

favonoid với isorhamnetin là cấu trúc gốc cơ bản.

4

Kaempferol (125), kaempferol-3-O-glu (126), kaemp-ferol-3-O-gent (127),

kaempferol-3-O-rutinoside (128), kaemp-ferol-3-O-gent kaempferol-3-O-gent-7-O-

glu (129), tribuloside (130) là favonoid với kaempferol nhƣ cấu trúc gốc cơ bản

(Hình 1.6)

Alkaloid bao gồm:

Tribulusamide C (131), tribulusterine (132), tribulusinA (133), harmine (134),

harman (135), harmmol (136), tribulusimide C (137), terrestriamide (138), N-trans-

coumaroyltyramine (139), N-trans-cafeoyltyramine (140), terrestribisamide (141) là

những alkaloid chính đƣợc tách từ thân, lá và quả của Bạch tật lê. Các alkaloid của

hạt chủ yếu thuộc nhóm β-carboline alkaloid và amide alkaloid (Hình 1.7).

Nghiên cứu của Kostova về tác dụng hóa học và hoạt tính sinh học của

saponin chỉ ra rằng furostanol và saponin spirostanol của tigogenin, neotigogenin,

gitogenin, neogitogenin, hecogenin, neohecogenin, diosgenin, chlorogenin,

ruscogenin và sarsasapogenin thƣờng đƣợc phát hiện ở cây Bạch tật lê. Ngoài ra,

bốn saponin sulfat của tigogenin và diosgenin cũng đƣợc phân lập, chủ yếu là các

furostanol glycoside bao gồm: protodioscin và protogracillin, trong đó protodioscin

là chất saponin chủ yếu nhất và chỉ có một lƣợng nhỏ các spirostanol glycoside

[31,54].

Wu và cộng sự chỉ ra rằng trong cây Bạch tật lêhàm lƣợng flavonoid gấp 1,5

lần lƣợng saponin [5]. Bhutani và cộng sự đã phân lập đƣợc các hợp chất

kaempferol, kaempferol-3-glucoside, kaempferol-3-rutinoside và tribuloside

[kaempferol-3- β-D- (6 "-p-coumaroyl) glucoside] từ lá, quả cây Bạch tật lêvà xác

định công thức của các hợp chất này bằng các phƣơng pháp phân tích quang phổ

[14].

Louveaux và cộng sự đã phát hiện 18 flavonoid (các dẫn xuất của caffeoyl,

các quercetin glycoside, bao gồm rutin và các kaempferol glycoside) bằng sắc kí

lỏng hiệu năng cao (HPLC) trong 4 phân đoạn dịch chiết xuất từ lá cây Bạch tật

lê[10].

5

Matin Yekta đã tách chiết 3 flavonoid glycoside bao gồm: Quercetin 3-O-

glycoside, quercetin 3-O-rutinoside và kaempferol 3-O-glycoside từ các bộ phận

trên mặt đất của cây Bạch tật lê[38].

Raja và Venkataraman đã xác định đƣợc các hợp chất flavonoid từ phân đoạn

dịch chiết ether và chloroform của quả Bạch tật lêtƣơi từ Ấn Độ sử dụng hệ dung

môi ethyl acetate : benzen (1:9). Trong khi đó các flavonoid này không đƣợc phát

hiện trong dịch chiết của các loài quả khác [38, 44].

Wu đã phân tách và định danh ba hợp chất mới, terrestribisamide, 25R-

spirost-4-en-3, 12-dione và tribulusterine, cùng với 10 hợp chất đã biết bao gồm: N-

p coumaroyltyramine, terrestriamide, hecogenin, aurantiamide acetate, xanthosine,

este axit béo, ferulicaxit, vanillin, axit p-hydroxybenzoic, và β-sitosterol từ quả

Bạch tật lê khô [53].

Các alkaloid trong dịch chiết bao gồm harmane và norharmane. β -carboline

alkaloid, tribulusterine chiếm một hàm lƣợng nhỏ trong quả cây [15]. Sử dụng sắc

ký khí kết hợp khối phổ phân tích dịch chiết metanol của toàn bộ cây Bạch tật lêcho

thấy α-amyrin là thành phần chính và 7 hợp chất với hàm lƣợng nhỏ hơn là

3,7,11,15-tetrametyl-2-hexadecen-1-ol, axit n-hexadecadienoic, axit

hexadecadienoic este ethyl, phytol, 9,12-octadecadienoicaxit, axit 9,12,15-

octadecatrienoic và 1,2-benzenedicarboxylicaxit disoctyl este. Ngoài ra, sterol (β-

sitosterols và stigmasterol) cũng đƣợc phát hiện [15].

6

Hình 1.3. Các loại khung carbon của saponin spiroston trong Bạch tật lê [56].

7

Hình 1.4. Các loại khung carbon của saponin furostane trong Bạch tật lê [56]

Hình 1.5. Một số saponin chính có hoạt tính sinh học tách chiết từ Bạch tật lê [27].

8

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của flavonoid tách chiết từ Bạch tật lê [56].

Hình 1.7. Cấu trúc của alkaloid tách chiết từ Bạch tật lê [56].

9

1.1.2.2. Tác dụng dược lí của cây Bạch tật lê.

Bạch tật lê đƣợc sử dụng trong các vị thuốc truyền thống nhƣ thuốc bổ, thuốc

tăng cƣờng sinh lí, thuốc giảm nhẹ co thắt dạ dày, hạ huyết áp và lợi tiểu. Quả Bạch

tật lê khô rất có hiệu quả trong chữa trị hầu hết các rối loạn sinh dục và là một thành

phần quan trọng của Ayurvedic - một loại thuốc đƣợc sử dụng để hỗ trợ chức năng

sinh lí và tiêu hóa cũng nhƣ để loại bỏ độc tố do nƣớc tiểu.

Bạch tật lê đã đƣợc sử dụng trong hàng thế kỷ ở Ayurveda để điều trị chứng

bất lực, bệnh hoa liễu và khiếm khuyết sinh dục. Tại Bulgaria, chúng đƣợc sử dụng

nhƣ một loại thuốc truyền thống để điều trị chứng bất lực. Ngoài tất cả các ứng

dụng này, rễ và quả Bạch tật lê còn đƣợc sử dụng trong điều trị rối loạn tim mạch,

các bệnh về mắt, phục hồi chức năng gan, nhuận tràng, giảm đau, lợi tiểu và làm

thuốc bổ tại Trung Quốc và Ấn Độ [30].

Tác động lợi tiểu

Các đặc tính lợi tiểu của cây Bạch tật lê là do một lƣợng lớn nitrat và tinh dầu

có trong quả và hạt đồng thời cũng có thể là do sự có mặt của muối kali ở nồng độ

cao. Ali và cộng sự đã nghiên cứu tác động lợi tiểu của dịch chiết từ quả và lá cây

Bạch tật lê trên chuột với nồng độ uống là 5,0 g/kg. Kết quả chỉ ra rằng tác động lợi

tiểu của dịch chiết cây Bạch tật lê cao hơn so với furosemide (một loại thuốc có

công dụng giúp lợi tiểu). Nồng độ natri và clorua trong nƣớc tiểu tăng lên. Tăng sức

căng thành mạch giúp ích trong việc đẩy cặn muối dọc theo đƣờng tiết niệu [8].

Tác động kích thích tình dục

Singh và cộng sự đánh tác động kích thích tình dục của chuột đực bằng việc

sử dụng dịch chiết quả Bạch tật lê khô ở nồng độ 50 và 100 mg/kg trọng lƣợng cơ

thể. Kết quả cho thấy có sự cải thiện hành vi tình dục của chuột đực phụ thuộc vào

nồng độ dịch chiết cho uống. Một điểm nổi bật nữa là sự gia tăng đáng kể mức

testosterone huyết thanh. Những kết quả này khẳng định hiệu quả của việc sử dụng

dịch chiết cây Bạch tật lê tăng cƣờng tình dục nam giới. Ngoài ra dịch chiết ethanol

của cây Bạch tật lê còn có tác dụng chống lại tổn thƣơng tinh hoàn do ức chế

10

peroxide hóa mô tinh hoàn bằng các chất chống oxy hoá và tạo phức với kim loại

hoạt động hoặc bằng cách kích thích sản xuất testosterone [47].

Xử lí một quần thể cá bằng dịch chiết cây Bạch tật lê (100-300 mg/L) cho thấy

sự gia tăng tỷ lệ con đực trong quần thể. Mặt khác, khi xử lý tinh hoàn cá bằng dịch

chiết Bạch tật lê đã cải thiện chất lƣợng của tinh trùng trong tất cả các giai đoạn

phát triển [28]. Hai thành phần chính thuộc nhóm saponin từ Bạch tật lê là

protodioscin và protogracillin đƣợc xác định là gây ra kích thích hành vi tình dục.

Protodioscin có tác dụng làm tăng chuyển đổi testosterone thành

dehydrotestosterone đồng thời kích thích sản xuất tế bào hồng cầu từ tủy xƣơng

cùng với sự phát triển cơ bắp góp phần cải thiện lƣu thông máu và vận chuyển oxy

dẫn đến sức khoẻ đƣợc cải thiện [5].

Tác động chống hình thành sỏi niệu

Dịch chiết ethanol từ quả cây Bạch tật lê đã đƣợc thử nghiệm trên chuột. Kết

quả cho thấy dịch chiết ethanol đã làm giảm hoạt động của việc hình thành sỏi niệu

thông qua các chỉ số sinh hóa trong nƣớc tiểu, huyết thanh và mô bệnh học. Bàng

quang và đƣờng tiết niệu đƣợc phục hồi phụ thuộc vào lƣợng dịch chiết đƣợc sử

dụng. Một protein mới, có khả năng ngăn chặn hình thành sỏi niệu, bảo vệ tế bào,

khối lƣợng phân tử khoảng 60 kDa đƣợc tách chiết từ Bạch tật lê. Aggarwal đã chỉ

ra tác động của protein này trong việc ức chế sự tích tụ của canxi oxalat (CaOx)

cũng nhƣ bảo vệ tế bào biểu mô thận [7].

Glycolate oxidase (GOX) là một trong những enzyme chính tham gia vào quá

trình tổng hợp oxalate chuyển hóa glycolate thành glyoxylate thông qua quá trình

oxy hóa, sản phẩm cuối cùng đƣợc tạo ra là oxalate. Cơ chế của việc chống hình

thành sỏi niệu là việc ức chế GOX để ngăn hình thành oxalate. Quercetin và

kaempherol là các thành phần có hoạt tính của Bạch tật lê đã đƣợc chứng minh là

những chất ức chế không cạnh tranh và cạnh tranh của GOX tƣơng ứng.

Hoạt động tăng cường miễn dịch

Saponin đƣợc tách chiết từ quả cây Bạch tật lê đã chứng minh sự tăng số

lƣợng đại thực bào phụ thuộc vào liều lƣợng sử dụng. Điều này cho thấy sự kích

11

thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu. Ngoài ra, dịch chiết ethanol của toàn bộ

cây Bạch tật lê còn làm tăng hiệu quả đáp ứng quá mẫn và miễn dịch đặc hiệu [49].

Tác động ngăn ngừa tiểu đường

Saponin từ Bạch tật lê có tác dụng hạ đƣờng huyết. Dịch chiết Bạch tật lê làm

giảm đáng kể lƣợng đƣờng huyết, triglyceride huyết thanh và cholesterol huyết

thanh. Dịch chiết etanol Bạch tật lê ở nồng độ 2,0 g/kg trọng lƣợng cơ thể có thể

bảo vệ hiệu quả chuột mắc bệnh tiểu đƣờng do streptozotocin bằng cách ức chế

stress oxy hóa và thể hiện 70% ức chế α-glucosidase ở nồng độ 500 μg/mL sử dụng

cơ chất maltose cũng nhƣ 100% ức chế reductase aldose ở nồng độ 30 μg/mL sử

dụng cơ chất dl-glyceraldehyde. Đƣờng huyết sau ăn ở chuột giảm một cách đáng

kể sau khi sử dụng saponin từ Bạch tật lê, Ngoài ra, saponin còn có tác dụng cải

thiện tuần hoàn động mạch vành do đó, đƣợc ứng dụng để điều trị đau thắt ngực và

các biến chứng tim mạch khác của bệnh tiểu đƣờng [34].

Tăng cường hấp thụ

Saponin trong dịch chiết ethanol Bạch tật lê đƣợc chứng minh tăng cƣờng sự

hấp thụ metforminhydrochloride ở ruột dê [12].

Tác động giảm lipid máu

Dịch chiết từ quả Bạch tật lê đã đƣợc đánh giá làm giảm lipid máu trong

chuột. Ở nồng độ 580 mg/kg của dịch chiết có tác dụng làm giảm cholesterol, lipid

máu, triglyceride và lipoprotein trong máu. Việc dẫn đến tăng lipid máu là do sự có

mặt của các hợp chất phenolic dẫn đến tăng lipoprotein lipase trong cơ và mô [29].

Tuncer đã nghiên cứu tác động của dịch chiết Bạch tật lê ở nồng độ 5.0

mg/kg/ngày trong 8 tuần đối với các mô lipid và mạch của thỏ đƣợc ăn chế độ ăn

giàu cholesterol. Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng làm giảm đáng kể lipid

máu, giảm tổn thƣơng bề mặt tế bào nội mô và sửa chữa một phần các rối loạn nội

mạch do tăng lipid máu [50]. Saponin từ Bạch tật lê cũng đã đƣợc nghiên cứu về

việc phòng ngừa và điều trị tăng lipid máu ở chuột. Việc phòng ngừa hiệu quả đƣợc

12

chứng minh bằng cách giảm mức cholesterol huyết thanh đồng thời cũng làm giảm

cholesterol gan, triglyceride và tăng hoạt tính của superoxide dismutase trong gan.

Tác động trong điều trị rối loạn tim

Bạch tật lê cho thấy hiệu quả đáng kể trong điều trị các bệnh tim khác nhau

nhƣ bệnh mạch vành, nhồi máu cơ tim, xơ cứng động mạch não và di chứng của

khối huyết tắc nghẽn động mạch. Zhang và cộng sự đã đánh giá tác dụng bảo vệ

ngăn ngừa thiếu máu cục bộ/tổn thƣơng tái phát trên chuột của tribulosin từ Bạch

tật lê. Kết quả cho thấy, tribulosin bảo vệ cơ tim chống lại chứng thiếu máu đồng

thời tái tạo máu thông qua hoạt động của protein kinase C. Ngoài ra, tribulosin còn

làm giảm malondialdehyde, transaminase aspartate, creatinekinase, dehydrogenase

lactate và hoạt động apoptosis của cơ tim [55].

Hợp chất saponin trong Bạch tật lê đã đƣợc chứng minh trong việc điều trị

hiệu quả các bệnh tim mạch nhƣ cao huyết áp, bệnh mạch vành, nhồi máu cơ tim,

xơ cứng động mạch não và đọng huyết khối. Dịch chiết methanol có tác động hạ

huyết áp thông qua việc trực tiếp giãn nở cơ trơn động mạch và giãn nở màng tế bào

và bảo vệ các tế bào tim. Đặc biệt, có thể cải thiện chức năng tim sau các cơn đau

tim [43].

Tác động lên hệ thần kinh trung ương

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng harmine - β-carboline alkaloid có trong Bạch tật

lê là một trong những thành phần chính góp phần tác động lên hệ thần kinh.

Harmine ức chế monoamine oxidase giúp tăng mức dopamine trong não [17].

Tác động chống viêm

Dịch chiết ethanol của Bạch tật lê đã ức chế sự biểu hiện của cyclooxygenase-

2 (COX-2) và oxit nitric synthase trong tế bào đồng thời cũng ức chế sự biểu hiện

của cytokin tiền viêm nhƣ các yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-α) và interleukin

(IL) -4 trong đại thực bào. Vì vậy, dịch chiết ethanol cây Bạch tật lê có khả năng ức

chế sự biểu hiện các cytokine viêm và có tác dụng hiệu quả trong các điều kiện

viêm khác nhau [41].

Tác động giảm đau

13

Nghiên cứu chỉ ra rằng dịch chiết methanol của Bạch tật lê ở nồng độ 100

mg/kg trọng lƣợng có tác dụng giảm đau. Hiệu quả giảm đau của dịch chiết thấp

hơn morphine tuy nhiên cao hơn acid acetylsalicylic (aspirin) đồng thời mức độ gây

loét dạ dày của dịch chiết Bạch tật lê thấp hơn so với domethacin (một loại thuốc

chống viêm không có steroid) [13]

Tác động chống co thắt

Hỗn hợp saponin đông khô của Bạch tật lê đã làm giảm đáng kể các chuyển

động nhu động của ruột non thỏ phụ thuộc vào liều lƣợng xử lí. Những kết quả này

cho thấy rằng hỗn hợp saponin có tác dụng điều trị chứng co thắt cơ trơn hoặc

chứng đau thắt cổ. [46]

Tác động chống ung thư

Tác dụng của dịch chiết rễ và quả Bạch tật lê ở nồng độ 800 mg/kg lên 7,12-

dimethylbenz antracene (DMBA) và dầu khổ sâm đã đƣợc nghiên cứu trong điều trị

chứng nhồi máu ở chuột. Sự phối hợp 3 chất trên đã làm giảm đáng kể tác động của

khối u và kích thƣớc khối u trong các giai đoạn trƣớc, trong và sau giai đoạn khởi

phát khối u so với nhóm đối chứng chỉ đƣợc điều trị DMBA và dầu khổ sâm [32].

Ngoài ra, dịch chiết Bạch tật lê còn ngăn chặn sự phát triển tế bào HepG2 và

gây ra apoptosis thông qua việc ức chế nhân tố tăng cƣờng chuỗi kappa kích hoạt tế

bào B (NF-ĸB). Vì vậy dịch chiết Bạch tật lê có tác dụng chống lại tế bào ung thƣ

gan và chống phóng xạ khi đƣợc sử dụng ở nồng độ 800 mg/kg trong 7 ngày liên

tiếp trƣớc khi chiếu xạ gamma bằng cách ức chế sự suy giảm glutathione do bức xạ

gây ra và giảm oxy hóa lipid trong gan của chuột [33].

Tác động kháng khuẩn

Tất cả các bộ phận (hoa quả, thân, lá và rễ) của Bạch tật lê cho thấy hoạt tính

kháng khuẩn chống lại Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Escherichia

coli, và Pseudomonas aeruginosa. Quả và lá của Bạch tật lê Ấn Độ đã có tác động

kháng E. coli và S. aureus. Các dịch chiết methanol quả Bạch tật lê đƣợc chứng

minh là có tác động kháng khuẩn tốt đối với cả vi khuẩn gram dƣơng và vi khuẩn

14

gram âm. Trong khi đó, dịch chiết ether, chloroform thể hiện hoạt tính kháng khuẩn

thấp hơn [9].

Nhƣ vậy, Bạch tật lê là một loài thảo dƣợc quý đƣợc sử dụng nhiều trong y

học truyền thống của nhiều quốc gia để chữa trị một số bệnh. Các tác dụng nổi bật

của Bạch tật lê bao gồm: Lợi tiểu, kích thích tình dục, chống trầm cảm, điều hòa

miễn dịch, hạ huyết áp, chống cao huyết áp, chống bệnh đái tháo đƣờng, chống

viêm gan, kháng khuẩn, giảm đau và chống viêm. Tuy nhiên nhiều hợp chất vẫn

còn chƣa đƣợc phát hiện hoặc nghiên cứu về cơ chế sinh học phân tử. Do đó mà các

hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học nên đƣợc tập trung nghiên cứu.

1.2. Protodioscin

1.2.1. Cấu trúc của protodioscin

Protodioscin là một hợp chất saponin steroid đƣợc tìm thấy trong một số loài

thực vật, chủ yếu ở các chi Tribulus họ bá vƣơng (Zygophyllaceae), Trigonella họ

đậu (Fabaceae) và Dioscorea họ củ nâu (Dioscereaceae) đặc biệt là cây Bạch tật lê

(Tribulus terrestris) [46]. Protodioscin có vị đắng, có màu vàng nâu tan trong nƣớc,

hơi tan trong methanol, nhƣng không tan trong dung môi chloroform.

Protodioscin có công thức hóa học theo IUPAC là C51H84O22 tên gọi là [26-O-

β-D-Glycopyranosyl-22-hydroxyfurost-5-ene-3β, 26-diol-3-O-β-diglucorhamno-

side] (Hình 1.8).

Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của protodioscin [46].

1.2.2. Tác dụng dược lí của protodioscin.

15

1.2.2.1. Protodioscin tăng cường hoạt động tình dục và sinh sản

Protodioscin chiết xuất từ dịch chiết Bạch tật lê đã đƣợc chứng minh là có tác

dụng kích thích tình dục ở một số loài động vật [22]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng

protodioscin có đƣợc công dụng này là do khả năng làm tăng nồng độ thụ thể

androgen trong tế bào, làm cho thụ quan trở nên nhạy cảm hơn với androgen nhƣ

testosterone. Cơ chế tác động này chƣa đƣợc xác định rõ ràng, tuy nhiên,

protodioscin đã đƣợc chứng minh là kích hoạt giải phóng oxit nitric trong mô thể

hang của dƣơng vật và làm tăng đáng kể về mức độ hormone testosterone,

dihydrotestosterone và dehydroepiandrosterone của động vật [20].

Tăng cƣờng hoạt động tình dục là tác dụng dƣợc lí nổi bật của protodioscin.

Gauthaman và cộng sự (2003) đã nghiên cứu về tác động của dịch chiết Bạch tật lê

(trong đó protodioscin chiếm 45% trọng lƣợng khô dịch chiết) lên hành vi tình dục

chuột.

40 con chuột đƣợc chia thành 4 nhóm (I, II, III, IV) cho uống dịch chiết Bạch

tật lê với nồng độ 2,5; 5,0 và 10 mg/kg thể trọng một lần mỗi ngày trong 8 tuần.

Theo dõi trọng lƣợng, huyết áp của các nhóm chuột thí nghiệm và ghi lại hành vi

tình dục của chuột đực so với nhóm đối chứng. Kết quả cho thấy: Tăng trọng lƣợng

cơ thể (9, 23, và 18% đối với nhóm II, III và IV). Huyết áp (43% và 26% đối với

nhóm III và IV) có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng. Số lƣợng tham gia

hành vi tình dục tăng (27% và 24%). Thời gian quan hệ tăng (19% và 22%) đối với

nhóm III và IV có ý nghĩa thống kê. Giảm thời gian nghỉ giữa các lần quan hệ

(16%, 23%, và 22% đối với nhóm II, III, và IV) và khoảng thời gian giữa các lần

xuất tinh (20% đối với nhóm III) có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng. Từ đó

các tác giả kết luận: Protodioscin có tác dụng tăng trọng lƣợng cơ thể và cải thiện

các thông số hành vi tình dục quan sát đƣợc ở chuột đồng thời chỉ ra sự gia tăng

androgen và giải phóng của oxit nitric từ các dây thần kinh vào trong các thể hang

[22]. Hoạt động tình dục của chuột đƣợc tăng cƣờng bởi protodioscin đƣợc giải

thích thông qua các các cơ chế sau:

16

1) Chuyển đổi trực tiếp thành phần hoạt chất protodioscin trong dịch chiết

Bạch tật lê, cụ thể là, chuyển đổi protodioscin thành de-hydroepiandrosterone

(DHEA) mà trung tâm là sự tác động thần kinh thông qua steroid bởi vì

protodioscin là một hợp chất steroid có cấu trúc phù hợp với dẫn truyền các thông

tin sinh học trong cơ thể.

(2) Tăng lƣợng DHEA dẫn tới tác động kìm hãm axit gamma aminobutyric

(GABA) qua đó hỗ trợ tăng cƣờng chức năng tình dục bởi vì GABA là chất ức chế

tình dục đã đƣợc thử nghiệm trên các mô hình. Lƣợng GABA tăng lên sau khi xuất

tinh, đánh dấu giai đoạn không hoạt động tình dục trên chuột.

3) Tăng mức testosterone và giảm dihydrotestosterone, hai tác động này ảnh

hƣởng lên hệ thần kinh trung ƣơng và thần kinh ngoại biên để kích thích hành vi

tình dục, bởi vì các hormon nam tính đƣợc chỉ ra là để cải thiện ham muốn tình dục

và tăng vận chuyển nito oxide trong các thể hang của thỏ.

4) Điều hòa tổng hợp NO ở vùng trung gian vùng dƣới đồi làm tăng dopamine

(chất tạo cảm giác hƣng phấn), tăng kích thích và hoạt động tình dục thông qua việc

dẫn truyền thần kinh ngoại biên [22].

Tác động của protodioscin lên chức năng tình dục nam giới đã đƣợc nghiên

cứu từ trƣớc đó, Arsyad (1996) đã đánh giá hiệu quả của protodioscin cho ham

muốn tình dục, cƣơng cứng, xuất tinh và cực khoái ở nam giới khi đƣợc sử dụng với

nồng độ 3x2 viên nén 250 mg/ngày ở 15 nam giới độ tuổi từ 25-40 trong 60 ngày

điều trị và 30 ngày sau điều trị.

Kết quả chỉ ra rằng điều trị bằng protodioscin với liều 3x2 viên 250 mg/ngày

trong 60 ngày có thể làm tăng chất lƣợng và số lƣợng tinh trùng ở đàn ông, khôi

phục và tăng cƣờng ham muốn tình dục, cƣơng cứng, xuất tinh và cực khoái của

quan hệ tình dục, so với trƣớc khi điều trị. Số lƣợng tinh trùng từ 9,89 triệu/mL tăng

lên 15,73 triệu/mL, độ di động của tinh trùng tăng từ 24,33% lên 36% và hình thái

tinh trùng bình thƣờng tăng từ 35,93% lên 43,87% sau điều trị. Nồng độ hormon

LH (IU/I) tăng từ 6,86 lên 9,90 sau 30 ngày điều trị và 7,10 sau 60 ngày điều trị.

17

Nồng độ testosteron (nmol/L) tăng từ 283,4 lên 328,4 sau 30 ngày điều trị và lên tới

379 sau 60 ngày điều trị.

Kết quả này là phù hợp với giả thuyết về tác dụng của protodioscin lên

testosteron vì mức độ LH tăng lên do đƣợc điều trị bằng protodioscin đã kích hoạt

các tế bào Leydig tăng bài tiết testosterone, do đó làm tăng mức testosterone trong

máu. Nồng độ testosteron tăng lên làm gia tăng số lƣợng, tính di động và hình thái

tinh trùng bởi vì testosteron có liên quan đến sự trƣởng thành của tinh trùng trong

mào tinh hoàn. Đồng thời nghiên cứu cũng cho thấy protodioscin làm tăng mức độ

chuyển đổi testosterone thành dihydrotestosterone kích thích sự trƣởng thành của

tinh trùng đồng thời protodioscin cũng làm tăng sản xuất tinh trùng bằng việc kích

thích các tế bào Sertoli và tế bào mầm [10].

Gauthaman và cộng sự (2008) đã nghiên cứu tác động của dịch chiết Bạch tật

lê lên các hormon giới tính của linh trƣởng, thỏ và chuột để xác định công dụng của

protosioscin trong điều trị rối loạn cƣơng dƣơng.

Dịch chiết Bạch tật lê đƣợc sử dụng với nồng độ 7,5; 15 và 30 mg/kg thể trọng

ở linh trƣởng cho nghiên cứu. Thỏ và chuột bình thƣờng đã đƣợc điều trị với nồng

độ 2,5; 5,0 và 10 mg/kg uống trong 8 tuần, để nghiên cứu mãn tính. Ngoài ra,

Chuột bị thiến đƣợc điều trị bằng testosterone cypionate (10 mg/kg, tiêm dƣới da,

hai tuần một lần trong 8 tuần) hoặc uống dịch chiết Bạch tật lê (5,0 mg/kg/ngày

trong 8 tuần). Mẫu máu đƣợc thu nhận cho phân tích testosterone (T),

dihydrotestosterone (DHT) và dehydroepiandrosteronesulphate (DHEAS) bằng

cách sử dụng phƣơng pháp miễn dịch.

Kết quả cho thấy, ở động vật linh trƣởng, nồng độ T tăng 52%, DHT tăng 31%

và DHEAS tăng 29% khi đƣợc điều trị với dịch chiết Bạch tật lê ở nồng độ 7,5

mg/kg. Ở thỏ, T và DHT đều tăng so với đối chứng, tuy nhiên, chỉ có DHT tăng

30% và 32% ở nồng độ điều trị 5,0 và 10 mg/kg có ý nghĩa thống kê. Ở chuột bị

thiến, T tăng 51% và 25% đối với nồng độ dịch chiết điều trị tƣơng ứng có ý nghĩa

thống kê [20].

18

Từ đó có thể thấy, protodioscin trong dịch chiết Bạch tật lê có tác dụng làm

tăng các hormon giới tính.

Gần đây hơn, Swaroop và cộng sự (2017) đã nghiên cứu tác động của dịch

chiết hạt Trigonella foenum-graecum giàu protodioscin (20%) trên 50 tình nguyện

viên nam (độ tuổi: 35-65) về mức độ tăng testosterone tự do và tổng số, chỉ số tinh

trùng, sức khoẻ tim mạch, tinh thần, tâm trạng, độ ham muốn và sức khỏe tình dục

trong thời gian 12 tuần. Các tình nguyện viên đƣợc sử dụng dịch chiết với nồng độ

500mg/ngày.

Kết quả cho thấy lƣợng testosterone tự do tăng 1,47 lần trong khi testosterone

tổng số tăng 1,08 lần. Số lƣợng tinh trùng sau 4 tuần điều trị tăng từ 35,13 (triệu

tinh trùng/mL) lên 48,9 (triệu tinh trùng/mL), sau 8 tuần điều trị là 86,16 (triệu tinh

trùng/mL) và sau 12 tuần điều trị là 88,31 (triệu tinh trùng/mL). Tính di động của

tinh trùng tăng từ 35,79% lên 45,73 sau 4 tuần điều trị 55,79 sau 8 tuần điều trị và

74,11% sau 12 tuần điều trị. Hình thái học những tinh trùng bất thƣờng không có ý

nghĩa thống kê trong 4 tuần điều trị tuy nhiên sau 8 tuần và 12 tuần điều trị đã có ý

nghĩa thống kê về việc giảm hình thái bất thƣờng của tinh trùng từ 42,46% giảm

xuống còn 21,88% và 15,40% tƣơng ứng. Kích thích tình dục tăng từ 4,02 lên 4,93

sau 4 tuần điều trị, lên đến 6,34 sau 8 tuần điều trị và lên tới 8,47 sau 12 tuần điều

trị.

Kết quả này chỉ ra rằng protodioscin có tác dụng làm tăng testosteron và cải

thiện hoạt động tình dục rõ rệt [48].

Cơ chế hoạt động của protodioscin đã đƣợc đề xuất nhƣ sau:

Để cải thiện khả năng sinh sản, protodioscin làm tăng mức sinh tinh trùng

bằng cách kích thích tế bào Sertoli và tế bào mầm, dẫn đến tăng sản sinh tinh trùng.

Trong quá trình này, protodioscin tăng cƣờng việc chuyển đổi testosterone thành

dihydrotestosterone (DHT), do đó kích thích sự sản xuất protein Androgen Binding

(ABP) trong tế bào Sertoli. Tăng sản xuất ABP dẫn tới sự hình thành phức hệ DHT-

ABP (phức hệ kích thích sản xuất tinh trùng trong các tế bào mầm). Một phần khác

19

của phức hệ DHT-ABP đƣợc vận chuyển đến tuyến thƣợng thận làm tăng hiệu quả

của sự trƣởng thành của tinh trùng thành các tinh trùng có khả năng sinh sản.

Về sự cải thiện chức năng tình dục, protodioscin hoạt động bằng cách tăng

chuyển đổi testosterone thành DHT (Hình 1.9). Ngoài việc tăng ham muốn tình dục,

DHT cũng kích thích hồng cầu, sản xuất hồng cầu và phát triển cơ, góp phần cải

thiện lƣu thông máu cũng nhƣ hệ thống vận chuyển ôxy giúp làm tăng thời gian

cƣơng cứng dƣơng vật và cải thiện xuất tinh sớm ở nam giới [11].

Hình 1.9. Cơ chế hoạt động của protodioscin trong cải thiện chức năng tình dục [11].

1.2.2.2. Các tác dụng khác của protodioscin

Protodioscin cảm ứng apotosis ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư

Hibasami và cộng sự (2003) đã nghiên cứu tác động của protodiocin trên 2

dòng tế bào ung thƣ bạch cầu cấp dòng tủy HL-60 và dòng tế bào ung thƣ dạ dày

KATO III.

Kết quả cho thấy tế bào HL-60 và tế bào KATO III bị ức chế khi nồng độ

protodioscin tăng. Sự phát triển của tế bào HL-60 đã bị ức chế hoàn toàn khi sử

dụng nồng độ 7,5 µM protodioscin. Mặt khác, protodioscin ức chế yếu sự phát triển

của các tế bào KATO III. Sự ức chế tăng trƣởng đáng kể của protodioscin đã gợi ý

việc kích thích apoptosis. Về mặt hình thái học, sự phân mảnh của hệ gen DNA là

đặc trƣng của apoptosis. Hình thái học của tế bào HL-60 cho thấy có apoptosis sau

20

3 ngày điều trị với 5,0 và 10µM protodioscin nhƣng không quan sát thấy apotosis ở

dòng tế bào KATO III. Sử dụng phƣơng pháp đếm dòng chảy tế bào cho thấy, HL-

60 đƣợc xử lí với 2,5; 5,0 và 10µM protodioscin trong 3 ngày xuất hiện apoptosis

75,2; 96,3 và 100% tƣơng ứng [26].

Trong một nghiên cứu khác, Oyama và cộng sự (2017) đã tách chiết

protodioscin từ loài Dioscorea tokoro ở Đông bắc Nhật Bản và nghiên cứu sự ức

chế của hợp chất này lên sự phát triển của dòng tế bào ung thƣ bạch cầu cấp dòng

tủy Hl-60. Kết quả cho thấy protodioscin ức chế sinh trƣởng của tế bào HL-60 với

IC50 là 5,1µM [42].

Những kết quả này này chứng minh rằng protodioscin có thể kích hoạt hoạt

động chống ung thƣ bằng cách kích hoạt apoptosis ở tế bào ung thƣ bạch cầu cấp

dòng tủy ngƣời HL-60.

Protodioscin trong chữa trị bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đƣờng là một trong những vấn đề sức khoẻ đƣợc quan tâm trên toàn

thế giới. Guo và cộng sự (2016) đã điều tra tiềm năng hạ đƣờng huyết và hạ lipid

máu của protodioscin trên chuột bị tiểu đƣờng.

Sau 4 tuần cho ăn một chế độ nhiều chất béo, chuột đƣợc tiêm streptozotocin

vào tĩnh mạch để gây bệnh tiểu đƣờng. Chuột bị bệnh tiểu đƣờng đƣợc chia thành 5

nhóm để nhận carboxymethyl cellulose sodium, metformin (200 mg/kg), và 3 nồng

độ protodioscin (10, 20 và 40 mg/kg) liên tục trong 12 tuần. Nồng độ glucose máu,

glycogen, cholesterol tổng số (TC), triglycerides (TG), axit béo không este hóa

(NEFA) cholesterol giàu lipoprotein (HDL-c), cholesterol hàm lƣợng lipoprotein

thấp (LDL-c), hemoglobin đƣợc glycosyl hóa (GHb), insulin và adiponectin đƣợc

tính toán. Các kết quả cho thấy protodioscin làm tăng khả năng dung nạp glucose,

làm giảm nồng độ glucose, GHb, TG, TC, LDL-c và NEFA trong khi đó tăng HDL-

c, adiponectin và glycogen. Xét nghiệm mô học cho thấy protodioscin cải thiện rối

loạn cấu trúc gan, làm giảm glucose máu và lipid máu ở chuột bị bệnh tiểu đƣờng.

Do đó, protodioscin đƣợc xem nhƣ là một tiềm năng làm thuốc cho bệnh tiểu đƣờng

[25].

21

Protodioscin chống viêm và oxy hóa.

Protodioscin và methyl protodioscin có tác dụng chống viêm đã đƣợc báo cáo

trong nhiều nghiên cứu trƣớc đây. Liu và cộng sự (2017) đã điều tra các ảnh hƣởng

của protodioscin lên bệnh viêm khớp ở chuột.

Chuột đƣợc chia ngẫu nhiên thành các nhóm và đƣợc tiêm với các nồng độ

protodioscin khác nhau (50, 100 và 200 mg/kg trọng lƣợng cơ thể). Nghiên cứu mô

học, sự thay đổi các thông số sinh hóa và sự biểu hiện cytokine viêm để đánh giá

hiệu quả chống viêm của protodioscin. Kết quả cho thấy, sau 15 ngày điều trị bằng

200mg protodioscin khối lƣợng của chân sau chuột đã giảm xuống trong khi trọng

lƣợng cơ thể tăng lên so với nhóm đối chứng đồng thời giảm sƣng viêm mắt cá chân

và giảm sự xâm nhiễm bạch cầu phụ thuộc vào liều lƣợng protodioscin sử dụng.

Ngoài ra khi sử dụng protodioscin ở nồng độ 200mg cho thấy sự hoạt động mạnh

của các enzyme chống oxy hóa bao gồm: Catalase, Glutathione, Superoxide

dismutase và giảm các cytokine tiền viêm. Do đó, protodioscin có tác dụng chống

viêm, giảm xâm nhiễm bạch cầu và giảm các stress oxy hóa thông qua cơ chế cải

thiện các enzym liên quan đến oxy hóa và các cytokine tiền viêm [35].

Protodioscin giảm lipid máu

Các rối loạn liên quan đến chuyển hoá, bao gồm chứng béo phì và tăng lipid

máu là vấn đề quan trọng đối với sức khoẻ con ngƣời. Wang và cộng sự (2010) đã

nghiên cứu tác động của protodioscin tách chiết từ thân và rễ của loài Dioscorea

nipponica (Rhizoma Dio-scoreae Nipponicae) lên chứng tăng lipid máu.

Chuột bị chứng tăng lipid máu sau khi đƣợc điều trị với protodioscin cho thấy

tăng thời gian đông máu đồng thời giảm nồng độ tryglyceride, cholesterol,

lipoprotein trong máu và làm tăng tỷ lệ cholesterol giàu lipoprotein (HLD) /

cholesteron chứa hàm lƣợng lipoprotein thấp (LDL). Các kết quả nghiên cứu đã chỉ

ra tiềm năng của protodioscin trong việc giảm lipid máu cũng nhƣ giảm cholesteron

trong việc bảo vệ tim mạch [52].

22

1.2.2.3. Ứng dụng của protodioscin trong làm thuốc cải thiện sinh lí.

Protodioscin đã đƣợc chứng minh tác dụng dƣợc lí nổi bật nhất là tăng cƣờng

chức năng tình dục. Do đó đƣợc ứng dụng trong việc sản xuất các loại thuốc tăng

cƣờng sinh lí nam giới. Trên thế giới đã có những loại thuốc sử dụng dịch chiết

Bạch tật lê với thành phần chính là protodioscin nhƣ Libilov™ dạng viên nén

250mg hoặc nhƣ Tribulus M1445 của Mediherb dạng viên nén có chứa 100mg

protodioscin hoặc 4x Sports Food Tribulus Terrestris chứa 95% Saponins, 80%

Protodioscin dạng viên 1000mg. Các loại thuốc này đều làm tăng cƣờng phát triển

cơ bắp, tăng hồng cầu, vận chuyển oxy trong máu, tăng hoocmon nam giới (LH,

testosteron, FSH) do đó mà cải thiện chức năng tình dục.

1.3. Các phƣơng pháp tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật

1.3.1. Các phương pháp tách chiết các hợp chất từ thực vật

Có 4 phƣơng pháp tiền tách chiết các hợp chất từ thực vật: Sấy khô bằng khí,

sấy bằng lò vi sóng, sấy khô và sấy đông khô (Bảng 1.1) [13].

Bảng 1.1. So sánh các phƣơng pháp tiền tách chiết [13]

Sấy bằng khí Sấy khô Sấy đông khô Sấy bằng lò vi sóng Phƣơng pháp

Cách sử dụng Sử dụng bức xạ điện từ Dựa vào hiện tƣợng thăng hoa

Thời gian Qua đêm (12h) Ngắn hơn sấy bằng khí 3-7 ngày, vài tháng cho đến một năm Sử dụng năng lƣợng nhiệt Ngắn hơn sấy bằng khí

Đặc điểm Không sử dụng nhiệt độ cao Có hiện tƣợng làm nóng đồng thời

Các hợp chất chịu nhiệt đƣợc bảo toàn. Hàm lƣợng phenolic Ƣu điểm

23

cao hơn

Hạn chế

Đôi khi gây ra sự giảm thiểu lƣợng phytochemicals Thời gian tiến hành lâu Mẫu có thể bị nhiễm bẩn ở điều kiện nhiệt độ không ổn định Mẫu bị mất do tỏa ra trong bình đông. Tốn kém

Đôi khi không có ảnh hƣởng đáng kể đến hoạt động chống oxi hoá

Có nhiều phƣơng pháp tách chiết kể cả phƣơng pháp truyền thống và hiện đại

với mục đích là tách đƣợc hợp chất mong muốn. Các phƣơng pháp tách chiết

truyền thống bao gồm: Ngâm, truyền, thấm và sắc; Chiết bằng máy chiết Soxhlet

(Bảng 1.2). Các phƣơng pháp tách chiết hiện đại bao gồm: Chiết bằng lò vi sóng

(MAE), chiết bằng sóng siêu âm (UAE), chiết nhanh với dung môi (ASE) và chiết

siêu tới hạn (SFE) (Bảng 1.3). ASE và SFE đƣợc sử dụng ít vì tốn kém và hiệu quả

thấp. Mỗi phƣơng pháp phù hợp với mẫu chiết và dung môi chiết khác nhau. Dung

môi chiết có thể phân cực hoặc không phân cực, ví dụ nƣớc, ethanol, methanol, n-

hexane, ethyl acetate [13].

Bảng 1.2. So sánh các phƣơng pháp tách chiết truyền thống [13]

Đặc điểm Nhƣợc điểm Ƣu điểm Phƣơng pháp

Dễ dàng và đơn giản Ngâm, truyền, thấm Bã của mẫu còn lại sau khi chiết vẫn chứa dung môi - Ngâm là phƣơng pháp lấy bột thực vật ngâm với dung môi nhiệt độ phòng ít nhất 3 ngày để giải phóng các chất phytochemical hòa tan. Sau đó, hỗn hợp này đƣợc lọc qua màng lọc, tùy thuộc vào loại chiết mà lựa chọn dung môi chiết phù hợp. và sắc

- Truyền và sắc có quy trình tƣơng tự nhƣ quá trình ngâm nhƣng thời gian nhanh hơn.

- Thẩm thấu có nguyên tắc tƣơng tự 3

24

phƣơng pháp trên. Ở phƣơng pháp này mẫu đƣợc ngâm trong 2 giờ.

Dễ cháy, tốn kém, gây ô nhiễm

Chiết bằng máy chiết Soxhlet

Chỉ cần một lƣợng nhỏ dung môi

Mẫu mịn đƣợc đặt trong một túi xốp hoặc "bao" đƣợc làm từ giấy lọc hoặc xenlulô đƣợc đặt trong buồng của thiết bị Soxhlet. Dung môi chiết xuất đƣợc đun nóng trong bình đáy và bay hơi vào buồng mẫu, ngƣng tụ trong bình ngƣng và nhỏ giọt. Khi lƣợng chất lỏng tiếp cận cánh tay siphon, dung dịch trong bình cạn và quá trình này tiếp tục.

25

Bảng 1.3. So sánh các phƣơng pháp tách chiết hiện đại [13]

Đặc điểm Ƣu điểm Nhƣợc điểm Phƣơng pháp

Hạn chế các hợp chất phenolic nhỏ Thời gian tách chiết giảm

Lò vi sóng tƣơng tác với cực của vật liệu phân cực và cực có thể gây nóng ở gần bề mặt của vật liệu và nhiệt đƣợc truyền bằng cách dẫn truyền ion và quay lƣỡng cực. Chiết bằng lò vi sóng (MAE) thể đƣợc coi Cải thiện sự phục hồi của chất phân tích

MAE có là phƣơng pháp có lợi cho các phân tử phân cực và dung môi có hằng số điện môi cao.

Thời gian tách chiết nhanh.

Sử dụng ít dung môi

Chiết bằng sóng siêu âm (UAE) Chi phí thấp

Sóng siêu âm trên 20kHz có thể có ảnh hƣởng đến các chất thông qua sự hình thành của các gốc tự do.

Sử dụng sóng siêu âm từ 20kHz đến 2000 Hz để tăng bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và mẫu và độ thấm của thành tế bào. Nhƣ vậy tính chất của tế bào thay đổi tế bào để giải phóng các hợp chất và tăng cƣờng sự vận chuyển khối lƣợng của dung môi vào tế bào thực vật.

1.3.2. Tách chiết protodioscin

Protodioscin đã đƣợc Dong và cộng sự (2004) tách chiết sử dụng phƣơng pháp

chiết bằng ethanol. Hai hợp chất tách ra là dioscoreside và protodioscin đã thể hiện

hoạt tính sinh học chống lại một dòng tế bào ung thƣ phổi [18]. Ngoài ra,

protodioscin đã đƣợc Shishovska và cộng sự (2015) tách chiết sử dụng phƣơng pháp

sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò Diode-Array. Kết quả cho thấy giới

hạn phát hiện là 16µg và giới hạn định lƣợng là 48.6µg trong 1gam lá Bạch tật lê

[46]. Sarvin và cộng sự (2017) đã thực hiện so sánh các phƣơng pháp tách chiết

protodioscin từ cây Bạch tật lê sử dụng các phƣơng pháp chiết bằng sóng siêu âm

(UAE), Reflux Extraction (RE), low pressure reflux Extraction (LPRE) và Soxhlet

26

(SE). Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi protodioscin lần lƣợt là 99 ± 2, 98 ± 2,

97 ± 3, 96 ± 4% tƣơng ứng với các phƣơng pháp UAE, LPRE, RE, SE [45].

Ở Việt Nam các nghiên cứu về cây Bạch tật lê cũng nhƣ protodioscin còn hạn

chế, các tác giả chủ yếu tập trung vào việc xác định hàm lƣợng một số chất trong

cây Bạch tật lê nhƣ Nguyễn Thế Chiến và cộng sự (2008), các tác giả phân lập một

hợp chất spirostanol saponin là tribulosin. Tuy nhiên chƣa xác định tính chất của

hợp chất này [2]. Bùi Đình Thạch và cộng sự (2011) cũng điều tra và xác định hàm

lƣợng tribulosin từ cây Bạch tật lê tại các vùng miền khác nhau trong nƣớc [1].

Trong dân gian Bạch tật lê đƣợc sử dụng trực tiếp bằng cách sắc uống toàn cây

Bạch tật lê nhằm tăng cƣờng chức năng sinh lí. Tuy nhiên chƣa có công trình trong

nƣớc nào sử dụng trực tiếp protodioscin để làm thuốc.

Bảng 1.4. Dung môi khác nhau dùng trong chiết xuất các nhóm hoạt chất từ

dƣợc liệu

Độ phân cực Dung môi Phân nhóm hóa học chiết

Thấp Chloroform Terpenoid, Flavonoid, Alcaloid, Aglycogen

Cyclohexan Sáp, chất béo

Hexan Sáp, chất béo

Dichloromethan Terpenoid, Flavonoid, Alcaloid, Aglycogen

Diethylether Alcaloid, Aglycogen

Ethylacetat Alcaloid, Aglycogen, Glucosid

Aceton Flavonoid, Alcaloid, Aglycogen

Ethanol Tannin, Polyphenol, Flavonoid, Terpenoid,

Sterol, Alcaloid, polyacetylen

Trung Bình Methanol Saponin, Tanin, Phenon, Flavon, Đƣờng,

Aminoacid, Anthrocyanidin, Terpenoid,

Xanthoxyllin, Totarol, Lactone, Polyphenol

Nƣớc Đƣờng, Aminoacid, Saponin, Tanin, Lectin,

Terpenoid, Anthrocyanidin, Tinh bột,

Cao Polypeptid

27

Về nguyên tắc, để chiết đƣợc các chất phân cực (alkaloid, glycoside, ...) thì

phải sử dụng các dung môi phân cực. Mà ethanol, methanol và nƣớc đều là những

dung môi có độ phân cực cao.

Nƣớc là dung môi thông dụng, dễ kiếm, giá thành rẻ. Dễ thấm vào dƣợc liệu

do có độ nhớt thấp và sức căng bề mặt nhỏ. Có khả năng hòa tan muối alkaloid, một

số glycosid, đƣờng, chất nhầy, pectin, chất màu, các acid, các muối vô cơ,

enzyme,... Tuy nhiên khả năng hòa tan rộng nên dịch chiết có nhiều tạp chất, tạo

môi trƣờng cho vi khuẩn, nấm mốc phát triển, dịch chiết khó bảo quản. Có thể gây

thủy phân một số hoạt chất (glycosid, alkaloid). Nƣớc có độ sôi cao nên khi cô đặc

dịch chiết, nhiệt độ sẽ làm phân hủy đi một số hoạt chất.

Trên thực tế, ethanol ở các nồng độ khác nhau là dung môi đƣợc sử dụng

nhiều nhất do hòa tan đƣợc nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ tiền và dễ kiếm.

Ethanol hòa tan đƣợc alcaloid, một số glycosid, tinh dầu, nhựa, ít hòa tan các tạp

chất nên có khả năng hòa tan chọn lọc. Có thể pha loãng với nƣớc ở bất kỳ tỉ lệ nào,

nên có thể pha loãng ethanol thành những nồng độ khác nhau theo yêu cầu chiết

xuất đối với từng loại dƣợc liệu. Ethanol có nồng độ >20% có khả năng bảo quản,

ngăn cản vi khuẩn, nấm mốc phát triển. Nhiệt độ sôi thấp nên khi cô đặc dịch chiết,

hoạt chất ít bị phân hủy. Ethanol cao độ làm đông vón các chất nhầy, albumin, gôm,

pectin… nên còn dùng để loại tạp chất. Tuy nhiên ethanol là một chất dễ gây cháy

nổ. Nên việc sử dụng trong phòng thí nghiệm cần phải thực hiện hết sức nghiêm

ngặt về nội quy an toàn phòng thí nghiệm.

28

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu

Cây Bạch tật lê (thân, quả, rễ) khô đƣợc lấy từ vùng trồng Bạch tật lê theo tiêu

chuẩn VietGAP của Viện Ứng dụng Công nghệ tại Ninh Thuận. Cây đƣợc thu vào

tháng 9, khi quả ngả sang màu hơi vàng.

Hình 2.1. Mẫu cây Bạch tật lê đƣợc phơi khô và mẫu đã khô

2.1.2. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị

- Dung môi kỹ thuật: Methanol, dichloromethane, acetone, ethyl acetate, n-

hexane (Hàn Quốc, Indonesia), cồn thực phẩm, nƣớc cất 1 lần.

- Dung môi phân tích HPLC: methanol, acetonitrile, nƣớc tinh khiết HPLC

(Fisher)

- Bột sắc ký silica gel pha thƣờng, pha đảo C-18, sephadex LH-20, dianion

HP20

- Bình chiết thuỷ tinh 10, 5, 2, 1 lít

- Cột sắc ký thuỷ tinh

- Bình cầu thuỷ tinh cất quay.

- Bình định mức loại 25mL.

- Máy xay mẫu

- Máy cất quay chân không

- Bể siêu âm

29

- Bộ lọc busne, máy bơm hút chân không.

- Phễu chiết phân lớp

- Chất chuẩn Protodioscin 98% (TRC, Canada).

- Máy LC-MS: Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems.

- Cột sắc ký HPLC: Cột VertiSep GES C18 (150x4,6 mm; 5μm) và cột bảo vệ

GES C18 của hãng Vertical.

- Máy siêu âm.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp lựa chọn dung môi để chiết Bạch tật lê

Để lựa chọn dung môi chiết phù hợp nhất, mẫu Bạch tật lê (2 kg) đƣợc xay

thành bột mịn và ngâm chiết với các dung môi khác nhau methanol, ethanol 95%,

50% và nƣớc. Chiết mẫu bằng cách ngâm chiết ở điều kiện thƣờng, đun hồi lƣu

trong 2 giờ và ngâm chiết kết hợp siêu âm với thời gian ngâm chiết khác nhau. Sau

đó hỗn hợp đƣợc lọc qua giấy lọc và máy cô quay để thu cặn ethanol, methanol,

nƣớc khô. Mẫu đƣợc chiết lần lƣợt 4 lần. Dịch chiết của các lần chiết đƣợc cất loại

dung môi để cân so sánh khối lƣợng cao chiết thu đƣợc. Ký hiệu là cao chiết A.

2.2.2. Phương pháp lựa chọn phương pháp chiết (kiểu chiết), nhiệt độ, thời gian

chiết tổng Bạch tật lê

Từ lƣợng Bạch tật lê tổng số ban đầu (2kg) đƣợc chiết bằng các phƣơng pháp

đun hồi lƣu (~95ºC trong 2h), ngâm cách thuỷ 80ºC trong 2h, siêu âm (40ºC trong

0,5 giờ) và ngâm chiết (nhiệt độ thƣờng trong 24h). Thu lấy cao chiết tiến hành cân

khối lƣợng và so sánh hiệu suất của từng phƣơng pháp.

Với phƣơng pháp đã đƣợc lựa chọn, thời gian chiết và nhiệt độ chiết đƣợc tối ƣu bằng cách chiết trong các nhiệt độ (95ºC, 80oC và 60oC) và thời gian (2h, 3h và

4h). Cân và so sánh lƣợng cao chiết thu đƣợc để tìm ra điều kiện tối ƣu cho phƣơng

pháp chiết.

2.2.3. Phương pháp chiết phân đoạn mẫu dịch chiết tổng Bạch tật lê

Sau khi lựa chọn đƣợc dung môi chiết tổng và thu đƣợc cao chiết tổng, cao

chiết này đƣợc chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau để

30

loại bỏ các thành phần hoá học không mong muốn, làm giàu thành phần

protodioscin. Cao chiết A đƣợc hoà lại vào 3 lít nƣớc sau đó chiết bằng dung môi

ethyl acetate (1lít x 3lần). Tách loại lớp dung môi hữu cơ, dịch nƣớc đƣợc cô quay

còn 2L để loại bỏ dung môi hữu cơ tồn dƣ thu đƣợc dịch B.

2.2.4. Phương pháp tách sắc ký làm giàu protodioscin

Lọc dịch B còn lại qua cột diaion HP20. Rửa giải bằng các hệ dung môi nƣớc,

dung môi cồn 80%. Gom dịch rửa giải cồn 80% và cất loại dung môi thu đƣợc cao

C.

Tách phân đoạn cao chiết C thu đƣợc trên cột sắc ký với chất hấp phụ silica

gel pha thƣờng, tỷ lệ cao chiết/chất hấp phụ = 1/5 theo khối lƣợng, cột nhồi 

10cm) và dung môi rửa giải lần lƣợt là ethyl acetate, ethyl acetate:ethanol 50:1,

ethyl acetate:ethanol 10:1 và ethanol 95%. Dịch rửa giải từ hệ ethyl acetate:ethanol

10:1 đƣợc gom lại, cất loại hết dung môi đến khô thu đƣợc cao D.

Hàm lƣợng protodioscin trong cao chiết D thu đƣợc đƣợc kiểm tra độ sạch

bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Điều kiện phân tích HPLC: Máy sắc ký

Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems. Cột sắc ký: Cột Zorbax

Eclipse XDB C18 (250 x 4.6 mm, 5μm) và cột bảo vệ C18 của hãng Agilent. Pha

động gradient 2% acetonitrile trong nƣớc trong 20 phút với tốc độ dòng: 0.5

ml/phút. Thể tích bơm mẫu 5μl, nhiệt độ cột 30ºC. Đầu dò DAD bƣớc sóng phân

tích 210 nm.

2.2.5. Phương pháp dựng đường chuẩn định lượng protodioscin

Đƣờng chuẩn định lƣợng có dạng y = ax + b đƣợc xây dựng dựa trên mối quan

hệ giữa diện tích pic UV đƣợc chọn (y) và nồng độ tƣơng ứng của chất chuẩn (x). Đƣờng chuẩn định lƣợng thu đƣợc đạt độ tuyến tính cao với hệ số tƣơng quan R2 ≥

0,999 đối với phƣơng pháp định lƣợng bằng DAD.

Chất chuẩn Phƣơng trình đƣờng chuẩn Hệ số tƣơng quan

Protodioscin Y = 0,998484x – 0,624106 0,99998

31

Hình 2.2. Đƣờng chuẩn định lƣợng chất chuẩn protodioscin

2.2.6. Phương pháp thử nghiệm sự thay đổi hormon sinh dục trên chuột

40 chuột nhắt trắng đực trƣởng thành đƣợc chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm:

nhóm I là nhóm chứng (10 chuột); nhóm II, III, nhóm IV là nhóm đƣợc sử dụng tinh

chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê với liều lần lƣợt là 2,5mg/kg (10 chuột);

5,0mg/kg (10 chuột) và 10 mg/kg (10 chuột) cân nặng.

Điều trị bằng sử dụng dịch chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê cho chuột

nhóm II, III, IV: cho sử dụng dịch chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê 1 lần/ngày

với liều lƣợng lần lƣợt là 2,5 mg/kg; 5,0mg/kg và 10 mg/kg cân nặng trong 4 tuần.

Một ngày sau khi sử dụng liều cuối cùng thì chuột đƣợc lấy máu định lƣợng

nồng độ các hormon testosterone, gonadotropin (FSH và LH). Xét nghiệm định

lƣợng nồng độ hormon testosterone, gonadotropin (FSH, LH) bằng phƣơng pháp

elisa sử dụng qui trình xét nghiệm và máy xét nghiệm QTXN.MD.002/003/007 V 1,0

Cobas6000 tại bệnh viện phụ sản Trung ƣơng. So sánh nồng độ hormon sinh dục ở

nhóm chứng và nhóm điều trị.

2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu

Các dữ liệu đƣợc phân tích bằng phần mềm Microsoft excel và phần mềm

STATA, kiểm định giá trị trung bình. Xác định hàm lƣợng và các tính chất lý hóa của

sản phẩm, tiến hành lặp lại 3 lần.

32

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Lựa chọn dung môi và điều kiện chiết tổng Bạch tật lê

Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải đƣợc lựa chọn rất cẩn thận. Điều

kiện của dung môi là phải hòa tan đƣợc chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu,

dễ dàng đƣợc loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc,

không dễ bốc cháy. Chloroform, metylen clorid và methanol là những dung môi

thƣờng đƣợc lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây nhƣ: lá, thân, rễ,

củ, quả, hoa… Những tạp chất của chloroform nhƣ CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản

ứng với một vài hợp chất nhƣ các alkaloid tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác.

Tƣơng tự nhƣ vậy, sự có mặt của lƣợng nhỏ axit clohydric (HCl) cũng có thể gây ra

sự phân hủy, sự khử hay sự đồng phân hóa các hợp chất khác.

Methanol và ethanol là những dung môi phân cực hơn các hydrocarbon clo

hóa. Ngƣời ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rƣợu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế

bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu đƣợc lƣợng lớn các thành phần

trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của chloroform thấp hơn, nó có thể rửa

giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancohol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa

phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng

ancohol thì các chất này cũng bị hòa tan đồng thời. Thông thƣờng dung môi cồn

trong nƣớc có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.

Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng các dung môi: methanol, ethanol 95%, ethanol

50% và nƣớc để chiết mẫu Bạch tật lê.

33

Bảng 3.1. Hiệu suất chiết theo các dung môi chiết khác nhau (g cao chiết/2 kg nguyên liệu, đun hồi lƣu ở 950C trong 2h)

Dung môi Ethanol 50% Ethanol 95% Methanol Nƣớc

Chiết lần 1 (g) 139,1 127,2 132,5 134,6

Chiết lần 2 (g) 55,8 48,3 51,4 55,1

Chiết lần 3 (g) 12,4 9,4 10,5 11,2

Chiết lần 4 (g) 2,92 1,5 2,3 4,1

Tổng 210,22 205 191,4 191,7

(10,5%) (9,57%) (9,58%) (10,25%)

Qua kết quả ở bảng 3.1 ta thấy: Trong số các dung môi methanol, ethanol

50%, 95% và nƣớc đƣợc sử dụng để chiết mẫu Bạch tật lê. Methanol vừa có hiệu

suất chiết thấp (9,58%) vừa là dung môi độc nên không phù hợp. Chiết bằng nƣớc

có ƣu điểm rẻ tiền, an toàn và có hiệu suất khá cao, tuy nhiên dịch chiết có độ nhớt

cao, nhiều bọt nên khó cho các bƣớc xử lý tiếp theo. Dung môi ethanol 50% cho

hiệu suất chiết tốt nhất đạt 10,5%, lƣợng dịch chiết nhiều hơn các dung môi còn lại

đồng thời dịch chiết ít nhớt, dễ xử lý cho công đoạn tiếp theo. Chính vì vậy, ở các

nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi sử dụng dung môi ethanol 50%.

Kết quả này tƣơng đƣơng với nghiên cứu của Ghosh và cộng sự (2012) cây

Bạch tật lê khô cũng đƣợc chiết bởi các dung môi ethanol 30%, 50%, 70%, 100%,

methanol và nƣớc. Trong đó, chiết bằng ethanol 50% cho khả năng hòa tan các

saponin trong Bạch tật lê là tốt nhất [23]

3.2. Lựa chọn phƣơng pháp, nhiệt độ chiết tổng Bạch tật lê

Từ kết quả ở phần 3.1, chúng tôi đã nghiên cứu các phƣơng pháp chiết khác

nhau với dung môi ethanol 50% ở các nhiệt độ khác nhau và đánh giá hiệu suất

chiết.

3.2.1. Lựa chọn phương pháp chiết suất Protodioscin từ cây Bạch tật lê:

34

Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy: Chiết bằng cách siêu âm, đun hồi lƣu và ngâm

chiết ở nhiệt độ thƣờng cho thấy hai phƣơng pháp siêu âm, đun hồi lƣu cho hiệu

suất chiết giống nhau (10,4-10,5%), ngâm chiết ở nhiệt độ thƣờng có hiệu suất chiết

thấp hơn (8,85%), trong khi chiết bằng ngâm cách thuỷ ở 80ºC cho hiệu suất thấp

nhất (7,63%). Ngâm chiết ở nhiệt độ thƣờng có ƣu điểm đơn giản, dễ thực hiện, ít

tốn năng lƣợng gia nhiệt, tuy nhiên hiệu suất chiết không cao và tốn thời gian. Chiết

bằng siêu âm có ƣu điểm nhanh tiết kiệm đƣợc thời gian nhƣng phải sử dụng bể siêu

âm, tốn điện năng, khó kiểm soát nhiệt độ chiết, chi phí cao nếu áp dụng ở quy mô

lớn. Đun hồi lƣu ở nhiệt độ sôi của hỗn hợp dung môi đơn giản dễ thực hiện, có thể

áp dụng ở quy mô lớn. Trong khi đó nghiên cứu của Sarvin và cộng sự (2017) cũng chỉ ra rằng đun hồi lƣu ở 950c cho kết quả thu đƣợc protodioscin từ Bạch tật lê là

cao nhất khi so sánh với các phƣơng pháp chiết khác nhau để thu hồi protodioscin

bao gồm siêu âm, đun hồi lƣu, đun hồi lƣu với áp lực thấp và chiết thông thƣờng

[45].

3.2.2. Lựa chọn nhiệt độ chiết suất Protodioscin từ cây Bạch tật lê:

Bảng 3.2. Hiệu suất chiết theo các phƣơng pháp chiết khác nhau

(g cao chiết/2 kg nguyên liệu)

Ethanol 50%

Ngâm chiết Dung môi Đun hồi lƣu Ngâm cách Siêu âm (nhiệt độ (~95ºC, 2h) thuỷ (80ºC, 2h) (40ºC, 0,5h) thƣờng, 24h)

121,4 48,3 140,3 Chiết lần 1 (g) 139,1

45,2 52,4 54,5 Chiết lần 2 (g) 55,8

9,2 37,8 11,8 Chiết lần 3 (g) 12,4

1,1 13,3 1,49 Chiết lần 4 (g) 2,92

152,7 208,09 176,9 Tổng 210,22

(7,63%) (10,4%) (8,85%) (10,5%)

35

Thử nghiệm các điều kiện chiết xuất ở nhiệt độ khác nhau cho thấy mẫu đƣợc

đun hồi lƣu trong 2h có hiệu suất chiết cao nhất. Khi giảm nhiệt độ chiết xuống

80ºC và tăng thời gian ngâm chiết lên 3h hoặc ngâm ở 60ºC trong 4h cho hiệu suất

thấp hơn rất nhiều (7,63% và 6,07%).

Bảng 3.3. Hiệu suất chiết theo các nhiệt độ chiết khác nhau

(g cao chiết/2 kg nguyên liệu)

Ethanol 50%

Ngâm chiết Dung môi Đun hồi lƣu Ngâm chiết Ngâm chiết (nhiệt độ (~95ºC, 2h) (80ºC, 3h) (60ºC, 4h) thƣờng, 24h)

Chiết lần 1 (g) 139,1 48,3 32,7 121,4

Chiết lần 2 (g) 55,8 52,4 45,5 45,2

Chiết lần 3 (g) 12,4 37,8 32,8 9,2

Chiết lần 4 (g) 2,92 13,3 10,4 1,1

Tổng 210,22 152,7 121,4 176,9

(10,5%) (7,63%) (6,07%) (8,85%)

3.3. Lựa chọn thời gian chiết suất Protodioscin từ cây Bạch tật lê

Thời gian chiết đƣợc thử nghiệm với các điều kiện ethanol 50%, đun hồi lƣu

nhƣ xác định ở trên. Các thời gian đƣợc thử nghiệm gồm đun hồi lƣu trong 1 giờ;

1,5 giờ; 2 giờ; 2,5 giờ và 3 giờ. Kết quả cho thấy thời gian đun hồi lƣu trong 2h cho

hiệu suất chiết tối ƣu nhất. Mặc dù thời gian đun lâu hơn (2,5 và 3 giờ) cho hiệu

suất chiết cao hơn nhƣng về mặt kinh tế lại không tối ƣu do lƣợng cao chiết thu

đƣợc tăng lên không đáng kể mà thời gian chiết kéo quá dài.

36

Bảng 3.4. Hiệu suất chiết theo thời gian chiết khác nhau (g cao chiết/2 kg nguyên liệu, đun hồi lƣu ở 950C trong 2 h với ethanol 50%)

Dung môi 1 giờ 1,5 giờ 2 giờ 2,5 giờ 3 giờ

Chiết lần 1 (g) 107,2 128,6 139,1 142,7 145,1

Chiết lần 2 (g) 62,3 54,1 55,8 56,9 59,3

Chiết lần 3 (g) 17,9 12,5 12,4 10,3 9,4

Chiết lần 4 (g) 3,4 2,0 2,92 2,8 5,1

Tổng 190,8 197,2 210,22 212,7 218,9

(9,54%) (9,86%) (10,5%) (10,6%) (10,9)

Số lần chiết đƣợc thực hiện thử nghiệm 4 lần, lƣợng dịch chiết sau mỗi lần

chiết đƣợc cân chính xác để so sánh. Kết quả cho thấy sau 3 lần chiết là đủ để chiết

hết hoạt chất.

Kết quả so sánh tổng hợp đƣợc mô tả trong bảng sau (nguyên liệu 2kg bột

Bạch tật lê khô):

Bảng 3.5. Hiệu suất chiết theo các điều kiện khác nhau

(g cao chiết/2 kg nguyên liệu)

Ethanol Ethanol 50% Methanol Nƣớc 95%

Ngâm Đun hồi Đun hồi Đun hồi Dung môi chiết ở Siêu âm ở 400C nhiệt độ Đun hồi lƣu ở 950C lƣu ở 950C trong lƣu ở 950C lƣu ở 950C thƣờng trong 2h trong 2h 0,5h trong 2h trong 2h trong 24h

Chiết lần 1 (g) 139,1 140,3 121,4 127,2 132,5 134,6

Chiết lần 2 (g) 55,8 54,5 45,2 51,4 48,3 55,1

Chiết lần 3 (g) 12,4 11,8 9,2 10,5 9,4 11,2

Chiết lần 4 (g) 2,92 1,49 1,1 2,3 1,5 4,1

Tổng 210,22 208,09 176,9 191,4 191,7 205

37

Từ các kết quả trên cho thấy chiết bằng dung môi ethanol 50% bằng phƣơng pháp đun hồi lƣu ở 950C trong thời gian 2h, lặp lại 3 lần cho hiệu suất chiết tối ƣu

nhất. Áp dụng điều kiện này để chiết xuất Protodioscin từ cây Bạch tật lê, gom các

dịch chiết lại, cất loại dung môi thu đƣợc cao chiết saponin steroid giàu

protodioscin từ cây Bạch tật lê (Cao chiết A).

Trong nghiên cứu của Ghosh và cộng sự (2012) phƣơng pháp đun hồi lƣu ở 950C trong 2 giờ với dung môi ethanol 50% cũng đƣợc các tác giả áp dụng [23]

chứng tỏ điều kiện chiết suất nhƣ chúng tôi áp dụng là có hiệu quả tối ƣu nhất trong

các điều kiện chiết đƣợc thiết lập.

3.4. Nghiên cứu chiết phân đoạn dịch chiết tổng Protodioscin từ cây Bạch tật

lê:

Sau khi lựa chọn đƣợc dung môi chiết tổng và thu đƣợc cao chiết A, cao chiết

này đƣợc chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau để loại bỏ

các thành phần hoá học không mong muốn, làm giàu thành phần protodioscin. Hợp

chất này là saponin nhiều glycoside có độ phân cực cao do đó việc tách loại nhóm

chất kém phân cực nhƣ dầu béo, sáp và nhóm chất phân cực trung bình (saponin,

flavonoid, terpenoid...) sẽ góp phần làm giàu hoạt chất.

Cao chiết ethanol 50% thu đƣợc đƣợc ở trên đƣợc phân bố lại vào nƣớc sau đó

chiết loại nhóm chất kém phân cực bằng dung môi ethyl acetate. Dịch nƣớc còn lại

sau khi chiết đƣợc gom lại, cất quay chân không sơ bộ để loại hết dung môi ethyl

acetate còn dƣ thu đƣợc dịch chiết B.

38

Hình 3.1: Sắc ký bản mỏng mẫu cao chiết Hình 3.2: Sắc ký bản mỏng mẫu cao B

tổng và phân đoạn: (1) cao A, (2) cao (1), cao C (2). Bản mỏng silica gel pha

chiết ethyl acetate, (3) dịch chiết B. Bản thƣờng, dung môi triển khai ethyl

mỏng silica gel pha thƣờng, dung môi acetate:ethanol 20:1

triển khai dichloromethane-methanol 1:1

3.5. Nghiên cứu tách sắc ký làm giàu protodioscin

Dịch chiết B chứa protodioscin đƣợc lọc qua cột sắc ký diaion HP20, rửa giải

cột bằng nƣớc cất nhằm loại tạp gồm các muối vô cơ, muối hữu cơ, đƣờng tự do....

Sau đó rửa giải cột bằng hệ dung môi ethanol 80%. Gom dịch rửa giải ethanol 80%

và cất loại dung môi thu đƣợc 18,5g cao chiết C.

Cao chiết C đƣợc phân tách tiếp trên cột sắc ký silica gel pha thƣờng, rửa giải

lần lƣợt bằng hệ dung môi ethyl acetate, ethyl acetate:ethanol (50:1), ethyl

acetate:ethanol (10:1) và ethanol 95%. Gom các dịch rửa giải phân đoạn ethyl

acetate:ethanol (10:1) cất loại dung môi thu đƣợc 1,4g cao chiết D chứa

protodioscin.

Hàm lƣợng protodioscin trong cao chiết D thu đƣợc ở trên đƣợc kiểm tra độ

sạch bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Kết quả cho thấy hàm lƣợng

39

protodioscin đạt 40,6%. Các kết quả phân tích sắc ký đƣợc thể hiện ở các hình 3.3-

3.6.

Hình 3.3. Sắc ký đồ của chất chuẩn protodioscin bƣớc sóng 210nm

Hình 3.4. Sắc ký đồ của mẫu Bạch tật lê thân lá bƣớc sóng 210nm

Hình 3.5. Sắc ký đồ của mẫu Bạch tật lê quả bƣớc sóng 210nm

40

Hình 3.6. Sắc ký đồ HPLC của cao D chứa protodioscin bƣớc sóng 210nm

Từ các kết quả trên, chúng tôi đã xác định đƣợc hàm lƣợng protodioscin từ

cây Bạch tật lê.

3.6. Xây dựng qui trình tách chiết protodioscin qui mô phòng thí nghiệm

Từ các kết quả thu đƣợc ở trên, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình chiết

xuất làm giàu protodioscin qui mô phòng thí nghiệm theo sơ đồ sau:

Thuyết minh qui trình:

Bƣớc 1: Phần lá cành Bạch tật lê đƣợc sơ chế và phơi khô trong bóng râm sau đó

xay thành bột mịn. Bƣớc 2: Đun hồi lƣu ở 950C 2 kg mẫu nguyên liệu bột khô này bằng 4 lít ethanol

50% trong 2h. Dịch chiết đƣợc rút kiệt ra rồi bổ sung 3 lít ethanol 50% vào và chiết

tiếp. Sau 3 lần ngâm chiết nhƣ vậy, các dịch chiết đƣợc gom lại, lọc và cất loại dung

môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc 210 g cao chiết tổng, ký hiệu là cao chiết A.

Bƣớc 3: Thêm 3 lít nƣớc vào cao chiết A và chiết phân bố bằng dung môi ethyl

acetate (1lít x 3lần). Tách loại lớp dung môi hữu cơ, dịch nƣớc đƣợc cô quay còn 2

lít để loại bỏ dung môi hữu cơ tồn dƣ thu đƣợc dịch B.

Bƣớc 4: Lọc dịch B còn lại ở bƣớc 3 qua cột diaion HP20. Rửa giải bằng các hệ

dung môi nƣớc, dung môi ethanol 80%. Gom dịch rửa giải ethanol 80% và cất loại

dung môi thu đƣợc cao chiết C.

41

Bƣớc 5: Tách phân đoạn cao chiết C thu đƣợc trên cột sắc ký với chất hấp phụ

silica gel pha thƣờng, tỷ lệ cao chiết/chất hấp phụ = 1/5 theo khối lƣợng, cột nhồi 

10cm và dung môi giải hấp lần lƣợt là ethyl acetate, ethyl acetate:ethanol (50:1),

ethyl acetate:ethanol (10:1) và ethanol 95%. Dịch rửa giải từ hệ ethyl

acetate:ethanol (10:1) đƣợc gom lại, cất loại hết dung môi đến khô thu đƣợc cao

chiết D.

42

3.7. Nghiên cứu sự thay đổi hormon sinh dục của chuột khi sử dụng dịch chiết

chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê:

Bảng 3.6. Nồng độ các hormon sinh dục ở chuột bình thƣờng và chuột sử dụng

dịch chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê

Nhóm Nhóm I Nhóm sử dụng P

43

(Đối chứng) Nhóm II Nhóm III Nhóm IV

Hormon ̅ ± SD ̅ ± SD ̅ ± SD ̅ ± SD

LH (IU/L) < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1

FSH (IU/L) < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1

P21 = 0,75 Testosterone 1,83 ± 1,56 9,73±20,76 15,43±18,53 25,03±17,19 P31= 0,03 (ng/ml) P41 = 0,03

Từ kết quả ở bảng 3.8 ta thấy: nồng độ hai hormon sinh dục FSH và LH đều

thấp dƣới ngƣỡng phát hiện nhỏ nhất của máy xét nghiệm (<0,1 IU/L).

Nồng độ hormon sinh dục testosterone ở chuột đƣợc cho sử dịnh dịch chiết

chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê liều thấp nhất (2,5 mg/kg/ngày) và nhóm chứng

không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Ở hai nhóm còn lại nhóm III

và nhóm IV nồng độ hormon sinh dục testosterone trong máu sau điều trị 4 tuần cao

hơn ở nhóm chứng, trong đó nồng độ hormon sinh dục testosterone ở nhóm điều trị

với liều lƣợng 10 mg/kg là cao nhất 25,03±17,19 mg/mL. Sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê với P < 0,05.

Khi đánh giá về ảnh hƣởng của chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê

lên nồng độ hormon sinh dục gonatropin của thùy trƣớc tuyến yên chúng tôi đã gặp

khó khăn và không đánh giá đƣợc do nồng độ hai hormon sinh dục FSH và LH đều

thấp dƣới ngƣỡng phát hiện. Lý giải kết quả này là do ở Bệnh viện Phụ Sản Trung

Ƣơng sử dụng hệ thống để định lƣợng các hormon sinh dục với ngƣỡng phát hiện

nhỏ nhất của FSH và LH là 0,1 IU/L. Cho tới hiện nay có rất ít nghiên cứu đánh giá

về ảnh hƣởng thực sự của chiết xuất chữa protodioscin từ cây Bạch tật lê lên các

hormon sinh dục này và các kết quả trong các nghiên cứu cũng rất khác nhau.

Nghiên cứu của Adaay và Matta (2012) sử dụng chiết xuất chứa protodioscin từ cây

Bạch tật lê cho thấy nồng độ hormon sinh dục FSH ở nhóm chuột bình thƣờng là

1,34 ± 0,03 mIU/mL và còn ở nhóm đƣợc cho sử dụng hỗn hợp thức ăn có chứa

chiết xuất chữa protodioscin từ cây Bạch tật lê là 1,98 ± 0,01 mIU/mL. Giá trị

44

hormon sinh dục LH ở hai nhóm lần lƣợt là 1,57 ± 0,01 mIU/mL và 2,17 ± 0,01

mIU/mL [4]. Một nghiên cứu khác của Moghaddam và cộng sự (2013) sử dụng

ELISA kits (Labsystem, Finland) để định lƣợng nồng độ hormon sinh dục

gonadotropin trong máu thu đƣợc kết quả ở nhóm chứng khoảng 0,3 mIU/mL,

nhóm đƣợc sử dụng tinh chiết chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê là 0,271

mIU/mL, giá trị hormon sinh dục LH ở nhóm đối chứng khoảng 0,2 mIU/mL, ở

nhóm dùng thuốc là 0,207 mIU/mL, ở chuột gây nghiện 0,0125 ± 0,017 mIU/mL

[39]. Chứng tỏ ngƣỡng phát hiện của kit xét nghiệm có giá trị thấp hơn kit xét

nghiệm của chúng tôi và bản thân ngƣỡng phát hiện của các kít xét nghiệm cũng rất

khác nhau. Nhƣng xét trong điều kiện kinh phí của đề tài và điều kiện xét nghiệm

tại Việt Nam chúng tôi chƣa thể sử dụng kit xét nghiệm có ngƣỡng phát hiện thấp

hơn vì vậy chúng tôi hi vọng các nghiên cứu sau sẽ khắc phục đƣợc nhƣợc điểm này

của chúng tôi.

Khi đánh giá ảnh hƣởng của chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê lên

hormon sinh dục testosterone là hormon có vai trò quan trọng lên quá trình sinh tinh

chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ trong bảng 3.8. Sau 4 tuần cho chuột sử dụng tinh

chiết chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê với các liều khác nhau 2,5mg/kg;

5,0mg/kg; 10mg/kg chúng tôi thấy so với nhóm không đƣợc dùng thuốc thì ở hai

nhóm dùng liều 5,0mg/kg/ngày và 10mg/kg/ngày có nồng độ hormon sinh dục

testosterone cao hơn với P<0,05. Kết quả này của chúng tôi cũng tƣơng tự nhƣ

nghiên cứu của Gauthaman và cộng sự (2008). Khi cho chuột sử dụng chiết xuất

chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê với liều 5,0mg/kg và 10mg/kg thì nồng độ

hormon sinh dục testosterone trong máu tăng 21% và 23% so với nhóm chuột

không đƣợc sử dụng dịch chiết chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê. Trong nghiên

cứu này các tác giả cũng ghi nhận không chỉ trên chuột mà ở cả linh trƣởng và thỏ

chiết xuất protodioscin từ cây Bạch tật lê cũng cho kết quả tƣơng tự [40]. Có nhiều

quan điểm để giải thích cho kết quả làm tăng nồng độ hormon sinh dục testosterone

trong máu sau khi dùng chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê. Quan điểm

cũ cho rằng chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê làm tăng hormon sinh

45

dục LH ở thùy trƣớc tuyến yên do vậy làm tăng nồng độ hormon sinh dục

testosterone. Trong chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê có khả năng kích

thích vùng dƣới đồi sản xuất hormon tăng trƣởng GnRH, sau đó GnRH tác động

vào thùy trƣớc tuyến yên làm tăng sản xuất hormon sinh dục FSH và LH hoặc tác

dụng trực tiếp vào các tế bào thùy trƣớc tuyến yên làm tăng sản xuất hormon sinh

dục LH [20, 21]. Hormon sinh dục LH sẽ kích thích các tế bào Leydig trong mô kẽ

của tinh hoàn tăng sản xuất testosterone. Hormon sinh dục FSH cũng có vai trò

quan trọng trong việc duy trì nồng độ cao của hormon sinh dục testosterone tại tinh

hoàn để kích thích quá trình sinh tinh thông qua tế bào Sertoli. Hormon sinh dục

FSH kích thích các tế bào Sertoli làm tăng sản xuất ABP-Androgen Binding

Protein. Bình thƣờng ABP có ái lực cao với testosterone do vậy testosterone sẽ đi từ

mao mạch vào khoảng kẽ, qua màng đáy của ống sinh tinh để đi vào tế bào Sertoli,

cuối cùng nó đi qua màng tế bào để vào lòng ống sinh tinh. Đây chính là lƣợng

hormon sinh dục testosterone cần thiết để kích thích sinh tinh trùng. Nhiều nghiên

cứu cho thấy để quá trình sinh tinh diễn ra một cách bình thƣờng thì nồng độ

hormon môn sinh dục testosterone trong tinh hoàn phải cao hơn trong huyết tƣơng

5–10 lần. Trong nghiên cứu của chúng tôi có định lƣợng cả hormon sinh dục FSH

và LH để xem tác dụng lên trục hạ đồi tuyến yên nhƣng do nhƣợc điểm của nghiên

cứu chƣa thể hiện đƣợc số thực của các hormon trên nên chúng tôi chƣa đƣa ra

đƣợc nhận xét về cơ chế này. Kết quả nghiên cứu của Moghaddam và cộng sự

(2013), El-Tantawy (2007) là cơ sở ủng hộ cho quan điểm trên khi thấy sau khi

dùng chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê thì nồng độ hormon sinh dục

FSH và LH tăng cao so với nhóm không đƣợc điều trị. Một cơ chế khác đƣợc đƣa ra

để giải thích tăng nồng độ hormon sinh dục testosterone đó là làm tăng quá trình

tổng hợp tạo ra tiền chất liên quan đến quá trình tổng hợp hormon sinh dục

testosterone trong máu. Saponin chiết xuất từ Bạch tật lê mà đặc biệt là protodioscin

có cấu trúc tƣơng tự nhƣ DHEA-dehydroepiandrosterone tiền chất để tổng hợp

hormon sinh dục testosterone [19, 39]. Adimoelja và Adaikan (199) đã báo cáo

rằng chính thành phần saponin mà chủ yếu là protodioscin trải qua quá trình chuyển

46

hóa sinh học trong cơ thể làm tăng nồng độ của DHEA [6]. Gauthaman và cộng sự

(2008) thấy sau khi sử dụng chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê thì cả

nồng độ hormon sinh dục testosterone và DHEA đều tăng lên [20]. Chiết xuất chứa

protodioscin từ cây Bạch tật lê cũng làm tăng cAMP để hoạt hóa phản ứng este hóa

chuyển cholesterol thành pregenalone thông qua hoạt động của cytochrome P450 và

tăng sản xuất DHEA [24, 37]. Nhƣ vậy, từ kết quả nghiên cứu của chúng tôi kết hợp

với một số nghiên cứu khác có thể thấy chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật

lê có tác dụng làm tăng nồng độ hormon sinh dục testosterone trong máu, nhờ tác

dụng này mà Bạch tật lê đƣợc nghiên cứu để ứng dụng làm tăng cƣờng khả năng

sinh sản nam giới.

47

CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

1. Đã thiết lập đƣợc điều kiện tách chiết protodioscin từ cây Bạch tật lê bao gồm: Đun hồi lƣu Bạch tật lê trong ethanol 50% ở 95oC trong 2h. Sử dụng sắc kí

lỏng hiệu năng cao cho thấy hàm lƣợng protodioscin đạt 40,6% trong cao chiết

Protodioscin từ câyBạch tật lê.

2. Kết quả thử nghiệm trên chuột cho thấy hai nhóm dùng dịch chiết chứa

protodioscin từ cây Bạch tật lê với liều 5 mg/kg/ngày và 10 mg/kg/ngày có nồng độ

hormon sinh dục testosterone cao hơn so với đối chứng với P < 0,05. Điều này

chứng tỏ chiết xuất chứa protodioscin từ cây Bạch tật lê có tác dụng làm tăng nồng

độ hormon sinh dục testosterone trong máu dẫn đến tăng cƣờng khả năng sinh sản

nam giới.

Kiến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu để xây dựng qui trình tách chiết protodioscin từ cây

Bạch tật lê qui mô lớn để có thể ứng dụng vào thực tế.

2. Nghiên cứu sâu hơn tác dụng của protodioscin đến tăng cƣờng khả năng

sinh sản nam giới: ảnh hƣởng của protodioscin đến cấu trúc tinh hoàn.

48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Bùi Đình Thạch, Nguyễn Thị Thu Kiều, Nguyễn Hữu Hổ, Đặng Văn Sơn,

Phùng Văn Trung. (2011), “Điều tra và xác định hàm lƣợng hoạt chất tribulosin

trong cây Bạch tật lê(Tribulus terrestris L.) phân bố ở Việt Nam”, Hội nghị Khoa

học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên lần thứ 4 (ISSN 1859-4425), Nhà xuất bản

Nông nghiệp, tr. 1301-1304.

2. Nguyễn Thế Chiến, Phùng Văn Trung, Nguyễn Ngọc Hạnh. (2008), “Phân lập

tribulosin, một spirostanol saponin từ cao n-butanol cây Bạch tật lê(tribulus

terrestris L.”),Tạp chí Khoa học (10), tr. 67-71.

Tài liệu tiếng Anh

3. Abirami P., Rajendran A. (2011), “GC‑MS Analysis of Tribulus terrestris”, L

Asian J Plant Sci Res, pp. 13‑1.

4. Adaay M. H., Matter A. G. (2012), “Effect of aqueous and ethanolic extracts of

tribulus terrestris, phoenix dactylifera and nasturtium officinale mixture on some

reproductive parameters in male mice”, J. Baghdad for Sci, 9, 640 – 650.

5. Adaikan P. G., Gauthaman K., Prasad R. N. (2001), “History of herbal

medicines with an insight on the pharmacological properties of Tribulus terrestris”,

Aging Male, 4, pp. 163‑9.

6. Adimoelja A., Adaikan P. (1997), “Protodioscin from herbal plant Tribulus

terrestris L. improves male sexual function possibly via DHEA”, Int. J. Impot.

Res., 9, 223-226.

7. Aggarwal A., Tandon S., Singla S. K., Tandon C. (2012), “ A novel

antilithiatic protein from Tribulus terrestris having cytoprotective potency”,

Protein Pept Lett, 19, pp. 812‑9.

8. Al‑Ali M., Wahbi S., Twaij H., Al‑Badr A. (2003), “Tribulus terrestris:

Preliminary study of its diuretic and contractile effects and comparison with Zea

mays”, J Ethnopharmacol, 85, pp. 257‑60.

49

9. Al‑Bayati F. A., Al‑Mola H. F. (2008), “Antibacterial and antifungal activities

of different parts of Tribulus terrestris L. growing in Iraq” , J Zhejiang Univ Sci B,

9, pp. 154‑9.

10. Arsyad K. M. (1996), “ Effect of protodioscin on the quantity and quality of

sperms from males with moderate idiopathic oligozoospermia”, Medika, 22 (8), pp.

614-618.

11. Arsyad K. M. (1996), “Result of Protodioscin (Tribulus terrestris) treatment in

males diagnosed with infertility and impotence” Maj. Kedok. Indon, 44 (1), pp. 19-

24.

12. Ayyanna C., Chandra M. R. G., Sasikala. M., Somasekhar. P. (2012),

“Absorption Enhancement Studies of Metformin Hydrochloride by Using Tribulus

terrestris Plant Extract”, Int J Pharm Technol, 4, pp. 4118‑25.

13. Azwanida, N.N. (2015), “A review on the extraction methods use in medicinal

plants, principle, strength and limitation”, Med Aromat Plants, 4(3), pp. 1–6.

14. Bhutani S. P., Chibber S., Seshadri T. R. (1969), “Flavonoids of the fruits and

leaves of T. terrestris”, Phytochemistry, 8, pp. 299.

15. Bremner J., Sengpracha W., Southwell I., Bourke C., Skelton B., White A.

(2005), “The Alkaloids of Tribulus terrestris: A revised structure for the Alkaloid

Tribulusterine”, Perspect Nat Prod Chem, 3, pp. 11‑7.

16. Chhatre S., Nesari T., Somani1G., Kanchan1D., Sathaye S. (2014),

“Phytopharmacological overview of Tribulus terrestris” Phcog Rev, 8, pp. 45‑51.

17. Deole Y. S., Chavan S. S., Ashok B. K., Ravishankar B., Thakar A. B.,

Chandola H. M. (2011), “Evaluation of antidepressant and anxiolytic activity of

Rasayana Ghana tablet (a Compound Ayurvedic formulation) in albino mice”, Ayu,

32, pp. 375-9. 18. Dong M., Feng X. Z., Wang BX., Ikejima T., Wu L. J. (2004) Steroidal

saponins from Dioscorea panthaica and their cytotoxic activity, Pharmazie, 59(4),

pp. 294-6.

50

19. El-Tantawy W. H., Temraz A., El-Gindi O. (2007), “Free testosterone level in

male rats treated with tribulus alatus extracts”, Int Braz J Urol, 33, 554 – 559.

20. Gauthaman K., Adaikan P. (2008), “The hormonal effect of Tribulus terrestris

and its role in the management of male erectile dysfunction –an evaluation using

primates, rabbit and rat”, Phytomedicine : international journal of phytotherapy

and phytopharmacology, 15 (1–2), pp. 44–54.

21. Gauthaman K., Adaikan P., Prasad R. (2003), “Sexual effects of puncturevine

Tribulus terrestris extract (protodioscin) an evaluation using a rat model”, J.

Altern. Complement Med., 9(2), 257-265.

22. Gauthaman K., Ganesan A. P., Prasad R. N. (2003), “Sexual effects of

puncturevine (Tribulus terrestris) extract (protodioscin): an evaluation using a rat

mode”, Journal of alternative and complementary medicine, 9 (2), pp. 257–65.

23. Ghosha V. K., Bhopea S. G., Kubera V. V., Sagulale A. D (2012). An improved

method for the extraction and quantitation of diosgenin in tribulus terrestris L.

Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 35:9. pp. 1141-1155

24. Granner D. K. (2000), “Hormones of the adrenal cortex”. In: Barnes, D.A.,

Ransom, J., Roche, J. (Eds.), Harper’s Biochemistry. Appleton and Lange,

Stamford, pp. 575–587.

25. Guo C., Li C., Yu Y., Chen W., Ma T., Zhou Z. (2016), “Antihyperglycemic

and antihyperlipidemicactivities of protodioscin in a high-fat diet and

streptozotocin-induced diabetic rats”, RSC A dv, 6, pp. 88640–8 8646.

26. Hibasami H., Moteki H., Ishikawa K., Katsuzaki H., Imai K., Yoshioka K.,

Ishii. Y., Komi T. (2003), “Protodioscin isolated from fenugreek

(Trigonellafoenumgraecum) induces cell death and morphological change indicative

of apoptosis in leukemic cell line H-60, but not in gastric cancer cell line KATO

III”, International journal of molecular medicine, 11, pp. 23-26.

27. Ivanova A., Lazarova I., Mechkarova P., Tchorbanov B. (2014), “HPLC

Method for Screening of Steroidal Saponins and Rutin as Biologically Active

51

Compounds in Tribulus Terrestris L”, Biotechnology and Biotechnological

equiqment, pp. 129-133.

28. Kavitha P., Ramesh R., Subramanian P. (2012) Histopathological changes in

Poecilia latipinna male gonad due to Tribulus terrestris administration, In Vitro Cell

Dev Biol Anim, 48, pp. 306‑12.

29. Khan S., Kabir H., Jalees F., Asif M., Naquvi K. J. (2011), “Antihyperlipidemic

potential of fruits of Tribulus terrestris linn”, Int J BiomedRes, 2, pp. 98‑101.

30. Khare C. P. (2007), “Indian medicinal plants: An illustrated dictionary”,

Berlin, Heidelberg: Springer Verlag, pp. 669‑671.

31. Kostova I., Dinchev D. (2005), “Saponins in Tribulus terrestris-chemistry and

bioactivity”, Phytochem Rev, 4, pp. 111‑37.

32. Kumar M., Soni A. K., Shukla S., Kumar A. (2006), “ Chemopreventive

potential of Tribulus terrestris against 7, 12‑dimethylbenz (a) anthracene induced

skin papillomagenesis in mice”, Asian Pac J Cancer Prev, 7, pp. 289‑94.

33. Kumar M., Panwar M., Samarth R., Kumar A. (2009). “Evaluation of

radiomodulatory influence of Tribulus terrestris Root extract against gamma

radiation: Hematological, Biochemical and cytogenetic alterations in swiss albino

mice”, Pharmacologyonline, 1, pp. 1214‑28.

34. Lamba H. S., Bhargava C. H., Thakur M., Bhargava S. (2011), “α‑ glucosidase

and aldose reductase inhibitory activity in vitro and antidiabetic activity in vivo of

Tribulus terrestris”. Int J Pharm Pharma Sci, 3, pp. 270‑2.

35. Liu J. Y., Hou Y. L., Cao R., Qiu H. X., Cheng G H., Tu R., Wang L Zhang

J., Liu D. (2017), “Protodioscin ameliorates oxidative stress, inlammation

and histology outcome in Complete Freund’s adjuvant induced arthritis rats”,

Apoptosis, DOI 10.1007/s10495-017-1420-0.

36. Louveaux A., Jay M., Taleb O., Hadi M. E., Roux G. (1998), “Variability in

flavonoid compounds of four Tribulus species: Does it play a role in their

52

identification by desert locust Schistocerca gregaria”, J Chem Ecol, 24, pp.

1465‑1481.

37. Miller W. L. (1988), “Molecular biology of steroid hormone synthesis”,

Endocr. Rev, 9, pp. 295–318.

38. Mitra N., Mehdi. D. M., Reza Z. M. (2012), “Tribulus terrestris L. Flavonoid

Compounds”, Int J Mod Bot, 2, pp. 35‑39.

39. Moghaddam M., Khalili M., Abadi M. (2013), “The effect of oral feeding

of Tribulus terrestris L. on sex hormone and gonadotropin levels in addicted male

rats”, International Journal of Fertility and Sterility, 7(1), 57 – 62.

40. Neychev V. K., Mitev V. I. (2005), “The aphrodisiac herb Tribulus terrestris

does not influence the androgen production in young men”, J. Ethnopharmacol.,

101, 319-323.

41. Oh J. S., Baik S. H., Ahn E. K., Jeong W., Hong S. S. (2012),

“Anti‑inflammatory activity of Tribulus terrestris in RAW264.7”, Cells. J

Immunol, 88, pp. 54-2.

42. Oyama M., Tokiwano T., Kawaii S., Yoshida Y., Mizuno K., Oh. K.,

Yoshizawa Y. ( 2017), “Protodioscin, Isolated from the Rhizome of Dioscorea

tokoro Collected in Northern Japan is the Major Antiproliferative Compound to HL-

60 Leukemic Cells”, Current Bioactive Compounds, 13, pp. 170-174.

43. Phillips O. A., Mathew. K. T., Oriowo. M. A. (2006), “Antihypertensive and

vasodilator effects of methanolic and aqueous extracts of Tribulus terrestris in rats,

J Ethnopharmacol”, 104, pp. 351‑5.

44. Raja M., Venkataram A. R. (2011), “Pharmacognostical studies on Tribulus

terrestris and Tribulus alatus”, Der Pharmacia Sinica, 2, pp. 136‑9.

45. Sarvin B., Stekolshchikova E., Rodin I., Stavrianidi A., Shpigun O. (2017)

“Different extraction techniques for isolation of steroidal saponins from Tribulus

terrestris” https ://www. researchgate.net/ publication/323322686.

46. Shishovska M., Sarafinovska Z. A., Memeti S. (2015) “A Simple Method for

Determination of Protodioscin in Tribulus Terrestris L. and Pharmaceuticals

53

by High-Performance Liquid Chromatography Using Diode-Array Detection”,

Journal of Chemical Engineering Research Updates, 2, pp. 12-21.

47. Singh S., Nair V., Gupta Y. K. (2012), “Evaluation of the aphrodisiac activity

of Tribulus terrestris Linn in sexually sluggish male albino rats”, J Pharmacol

Pharmacother, 3, pp. 43‑7.

48. Swaroop A., Maheshwari A., Verma N., Tiwari K., Kumar P., Bagchi M.,

Preuss H. G., Bagchi D. (2017), “A novel protodioscin-enriched fenugreek seed

extract (Trigonella foenum-graecum, family Fabaceae) improves free testosterone

level and sperm profile in healthy volunteers”, Functional Foods in Health and

Disease, 7(4), pp. 235-245.

49. Tilwari A., Shukla NP., Devi U. (2011), “Effect of five medicinal plants used in

Indian system of medicines on immune function in Wistar rats”, Afr J Biotechnol

,10, pp. 16637‑45.

50. Tuncer M. A., Yaymaci B., Sati L., Cayli S., Acar G., Altug T., Demir R.

(2009), “ Influence of Tribulus terrestris extract on lipid profile and endothelial

structure in developing atherosclerotic lesions in the aorta of rabbits on a

high‑cholesterol diet”, Acta Histochem, 111, pp. 488‑500.

51. Usman H., Abdulrahman F., Ladan A. (2007), “Phytochemical and

antimicrobial evaluation of Tribulus terrestris L. growing in Nigeria”, Res J Biol

Sci, 2, pp. 244‑7.

52. Wang T., Choi R. C. Y., Li J., Cathy W. C., Bi C. W. C., Zang L., Liu L., Dong

T. T. X., Bi K., Tsim K. W. K. (2010), “Antihyperlipidemic Ef fec t of Protodioscin

an Ac tive Ingredient Isolated from the Rhizomesof Dioscorea nipponica”, Planta

Med, 76, pp. 1642– 1646.

53. Wu T. S., Shi L. S., Kuo S. C. (1999), “Alkaloids and other constituents from

Tribulus terrestris”, Phytochemistry, 50, pp. 1411‑5.

54

54. Xu Y. J., Xu T. H., Zhou H. O., Li B., Xie S. X., Si Y. S. (2010), “Two new

furostanol saponins from Tribulus terrestris”, J Asian Nat Prod Res, 12, pp.

349‑54.

55. Zhang S, Li H., Yang S. J. (2010), “Tribulosin protects rat hearts from is

chemia/reperfusion injury”. Acta Pharmacol Sin, 31, pp. 671‑8.

56. Zhu W., Du Y., Meng H., Dong Y., Li L. (2017), “A review of traditional

pharmacological uses, phytochemistry, and pharmacological activities of Tribulus

terrestris”, Chemistry Central Journal, pp. 11-60. DOI 10.1186/s13065-017-0289-x

55