Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây

Chia sẻ: Lavie Lavie | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:90

Thêm vào BST

Báo xấu

137
lượt xem 32
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây được thực hiện nhằm tìm điều kiện để vi khuẩn sinh acetic acid sinh trưởng mạnh; biện pháp tối ưu để tăng hiệu suất lên men acetic trong thời gian ngắn, tạo ra những sản phẩm giấm trái cây thơm ngon và có giá trị dinh dưỡng cao.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP.HCM NGUYEÃN TRÖÔNG BAÛO TRAÂN CHOÏN GIOÁNG VI KHUAÅN VAØ KHAÛO SAÙT MOÄT SOÁ ÑIEÀU KIEÄN LEÂN MEN ACETIC ÑEÅ LAØM GIAÁM TRAÙI CAÂY Chuyeân ngaønh : Vi sinh vaät hoïc Maõ Soá : 60 42 40 LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC: TS. TRÒNH THÒ HOÀNG Thaønh phoá Hoà Chí Minh – 2007
LÔØI CAÛM ÔN Em xin chaân thaønh caûm ôn COÂ- TIEÁN SÓ TRÒNH THÒ HOÀNG- ñaõ taïo ñieàu kieän vaø taän tình chæ baûo ñeå em hoaøn thaønh luaän vaên naøy. Em voâ cuøng caûm ôn CAÙC THAÀY COÂ KHOA SINH HOÏC TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM ñaõ truyeàn nhöõng kieán thöùc quyù baùu trong suoát quaù trình em hoïc taïi tröôøng. Em xin chaân thaønh caûm ôn CAÙC THAÀY COÂ VAØ CAÙC BAÏN PHOØNG THÍ NGHIEÄM BOÄ MOÂN VI SINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC KHOA HOÏC TÖÏ NHIEÂN ñaõ giuùp ñôõ vaø taïo ñieàu kieän toát cho em trong suoát thôøi gian em thöïc hieän ñeà taøi. Toâi xin caûm ôn CAÙC BAÏN HOÏC VIEÂN CAO HOÏC KHOAÙ 15 cuøng ÑOÀNG NGHIEÄP BAÏN BEØ ñaõ ôû beân caïnh giuùp toâi hoaøn thaønh luaän vaên naøy. Con voâ cuøng bieát ôn BA MEÏ vaø MOÏI NGÖÔØI TRONG GIA ÑÌNH maõi maõi laø choã döïa vöõng chaéc vaø aám aùp cho con.
MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Trong các loại thực phẩm lên men thì giấm ăn là loại gia vị, thực phẩm phổ biến và phần lớn các gia đình Việt Nam đều sử dụng. Giấm sử dụng trong che biến thực phẩm hàng ngày, bảo quản thực phẩm, làm gia vị chế biến thực phẩm. Ngoài ra, giấm được dùng như bài thuốc chữa nấc cục, buồn nôn, tàn nhang, lở loét, các vết cắn của chó, bò cạp, rết hay côn trùng. Ở Việt Nam, quá trình “lên men” acetic rất quen thuộc với nhân dân thông qua việc nuôi giấm trong gia đình. Giấm được tạo ra bằng phương pháp lên men dân gian từ các nguyên liệu như chuối, dứa, nước dừa, rượu ngũ cốc, rượu trái cây. Nước ta có rất nhiều loại trái cây, có thể sử dụng các loại trái cây này để làm giấm. Do đó, đề tài “Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây” rất có ý nghĩa đối với sản xuất và đời sống. 2. Mục đích của đề tài nghiên cứu Tìm điều kien để vi khuẩn sinh acetic acid sinh trưởng mạnh. Tìm biện pháp tối ưu để tăng hiệu suất lên men acetic trong thời gian ngắn, tạo ra những sản phẩm giấm trái cây thơm ngon và có giá trị dinh dưỡng cao. 3. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu tài liệu nhằm xây dựng tổng luận nghiên cứu: Thu thập tài liệu, nghiên cứu, phân tích, tổng hợp những tài liệu về những nội dung có liên quan đến đề tài. Phương pháp thực nghiệm, chứng minh.
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Các loại giấm thông dụng và một số vấn đề về giấm trái cây 1.1.1. Sơ lược lịch sử lên men acetic. [12], [31], [32] Từ đầu thế kỷ XIV ở Pháp đã có những cơ sở công nghiệp sản xuất giấm. Đến năm 1786 người ta đã bắt đầu để ý đến vai trò cua oxy và nhấn mạnh độ thoáng khí ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ tạo thành giấm . Năm 1822 Person đã chú ý đến 1 lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt giấm và ông đặt tên Mycoderma (là 1 loài vi khuẩn hiếu khí ). Từ năm 1837 đến 1838 Turpin và Kiizing đã nhấn mạnh quá trình lên men acetic là do vi sinh vật và đặt tên vi sinh vật đó là Ulviva acetic. Năm 1862 đến 1868, nhà bác học người Pháp Louis Pasteur khám phá ra được bản chất của quá trình lên men này. Ông miêu tả được vi khuẩn sinh acid acetic hiện diện trong màng mỏng của giấm, và chứng minh được quá trình lên men giấm thực chất là quá trình chuyển hóa rượu thành acid acetic trong điều kiện có oxy và ông đặt tên vi khuẩn này là Mycoderma aceti. Năm 1901 M.W Bejerinck phân lập thuần khiết được vi khuẩn lên men acetic và gọi là vi khuẩn Acetobacter. Ngày nay ứng dụng của quá trình lên men acetic, người ta đã sản xuất nhiều loại giấm khác nhau, thường là giấm ăn chứa khoảng 3% acid acetic. 1.1.2. Các loại giấm thông dụng [28], [42]. - Giấm cồn “Spirit vinegar”: là sản phẩm của quá trình lên men chua, dung dịch cồn nguyên chất được pha loãng, có bổ sung các muối vô cơ và chất dinh dưỡng. - Giấm vang “Wine vinegar” : là sản phẩm của quá trình lên men chua dịch rượu vang nho.
- Giấm gạo “Rice vinegar”: là sản phẩm của quá trình lên men chua dịch bột gạo đã được chuyển hoá thành đường rồi thành rượu. - Giấm mạch nha “Malt vinegar” là sản phẩm của quá trình lên men chua dịch tinh bột đã được chuyển hoá thành malt. - Ngoài ra giấm còn được làm từ các loại nước trái cây khác : nước ép thơm, nước ép trái điều, nước dừa. Từ rượu vang các loại: vang dứa, vang sơri, vang mít… 1.1.3. Thành phần của giấm ăn [28], [42]. Bên cạnh acetic acid và ethanol, giấm còn chứa các sản phẩm thứ cấp, có vai trò quan trọng trong việc tạo mùi vị… Những thành phần này có nguồn gốc từ nguyên liệu hay được bổ sung trong khi lên men, tạo thành do vi khuẩn Acetic hoặc do mối tương tác giữa các sản phẩm tạo thành. Trong giấm còn có những hợp chất không giải thích được nguồn gốc. Trong giấm chứa nhiều amino acid (ví dụ giấm cồn có 18 loại amino acid), nguồn gốc amino acid được tạo ra chủ yếu từ sự tự phân của vi khuẩn Acetic. Các hợp chất bay hơi: Trong giấm có chứa nhiều hợp chất bay hơi khác nhau như ethylacetate, aldehyt, ethylformate… 1.1.4. Nguyên liệu sử dụng để làm giấm [12], [24] Ethanol là nguyên liệu trực tiếp để lên men tạo acid acetic. Ngòai ra còn dùng dung dịch chứa đường như: mật rỉ đường, mật ong, các loại trái cây có chứa đường (nho, lê, đào, táo, chuối,mận,dứa…) hay tinh bột đã qua quá trình đường phân. Nguyên liệu có bột  Đường  Rượu  acid acetic. Nguyên liệu có đường  Rượu  acid acetic. Nguyên liệu có rượu  acid acetic.
Các muối khoáng, nguồn Nitơ dễ đồng hóa (muối Amon) hết một lượng ít acid acetic để tạo pH ban đầu thích hợp cho vi khuẩn họat động lên men. Nồng độ rượu thích hợp là 6-15%. Khi hết rượu vi khuẩn có thể oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O theo phương trình: CH3COOH + 2O2  CO2 + H2O Vì thế trong quá trình lên men bao giờ cũng phải đảm bảo hàm lượng ethanol tối thiểu là 0,3-0,5% . 1.1.5. Đặc điểm 1 số loại trái cây sử dụng để làm giấm I.1.5.1. Đặc điểm của dứa. [9] ,[29] Dứa có tên khoa học là Ananas Comonus thuộc họ Bromeliace (lớp thứ Một lá mầm ), là cây ăn quả nhiệt đới có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Châu Mỹ- Braxin hay Paragoay, do đó thích hợp nhiệt độ cao và độ ẩm cao. Dứa là loại cây không kén đất vì chúng có thể sinh trưởng trên các vùng gò đồi, dốc (20 độ trở xuống), nghèo dinh dưỡng như đất phèn ở Đồng bằng Sông Cửu Long, đất đá vôi, đất vàng đỏ ở ở các tỉnh miền Bắc. Sau 1-2 năm trong dứa có thể cho năng suất 10-12 tấn/ha, thậm chí là 30-35 tấn/ha. Hàm lượng đường trong dứa trung bình từ 8-12%, có nơi trồng giống tốt và chăm sóc tốt tỷ lệ đường đạt đến 15-16% (trong đó 66% đường dưới dạng saccaroz và 34% dưới dạng fructoz và glucoz ). Dứa có độ acid khoảng 0,6% (trong đó có tới 87% acid citric). Hàm lượng chất tro chiếm 0,4-0,6% trọng lượng (chủ yếu là kali, magie và canxi). Trong dứa có chứa nhiều vitamin C : 24-28mg/100g. Trong dứa có enzym Bromelin có tác dụng tiêu hoá rất tốt. Dứa cung cấp năng lượng đáng kể cho cơ thể con người: 1kg trái dứa cho 400-420 calo hoặc 150ml nước dứa cung cấp 100-150 calo.
Bảng 1.1 : Thành phần dinh dưỡng của dứa Thành phần Hàm lượng Nước (%) 54,3 Protein(%) 0,5 Acid hữu cơ (g%) 0,6 Glucid (g%) 3,9 Tro (g% ) 0,2 Muối khoáng (mg%) Ca 9,0 P 10,2 Fe 0,3 Vitamin (mg%) B1 0,05 B2 0,01 PP 0,1 C 14 1.1.5. Đặc điểm của nho. [9], [29] Nho là loại cây ăn trái có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, được nhập vào Việt Nam vào đầu của thập niên 70 thế kỉ trước và ngày càng được trồng phổ biến ở một số vùng của nước ta. Thành phần dinh dưỡng của nho được trình bày ở bảng sau Bảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng của nho Thành phần Hàm lượng Nước (%) 85% Đường tổng số g/100g trái cây 16,8 Acid malic g/100g trái cây 1,0 Protein g/100g trái cây 0,5 Chất tro g/100 g trái cây 0,4 Thiamin (B1) g 160-450 Riboflavin (B2) g 3-60 Acid panthothenic 0,5-1,4
Pyridoxin (B6) mg 0,16-0,5 Nicotinamit (PP) mg 0,68-2,6 Acid p-amiobenzoic g 15-92 1.1.6. Các tác nhân gây hại giấm [18], [20], [24], [28]. Giấm dễ bị hỏng trong thời gian bảo quản do nhiều nguyên nhân Giấm chưa đạt chất lượng dễ bị oxy hóa quá mức tạo thành CO2 và H2O làm giấm bị giảm độ chua và vẩn đục. Các vi sinh vật làm hư giấm như nấm men thuộc giống Candida. Các sinh vật làm hư giấm như: lươn giấm, ruồi giấm, bọ giấm… Lươn giấm có tên là Anguila aceti, là loại sâu phổ biến trong sản xuất giấm. Nó có dạng giống giun tròn, có thể nhìn thấy bằng kính lúp. Chúng xúât hiện trong thùng lên men giấm và trong dung dịch rượu trước khi lên acid hóa. Con đực trưởng thành dài 1mm, con cái dài 1-2mm. Lươn giấm sinh sản và phát triển mạnh ở nồng độ giấm thấp, ở nồng độ acid cao từ 9-10% chúng bị ưc chế nhưng không hoàn toàn ngưng sinh sản, với nồng độ cao hơn chúng mới chết. Lươn giấm sống bằng cách ăn vi khuẩn acetic, một phần rượu, acid acetic, đạm, các khoáng hòa tan làm giảm độ chua của giấm. Lươn giấm không độc đối với nguời, nhưng với số lượng lớn, chúng làm vỡ màng giấm, làm vẩn đục giấm và giấm không ngon. Lươn giấm có trong giấm là do không vệ sinh sạch sẽ trong quá trình lên men. Ruồi giấm : làm giảm acid, sinh ấu trùng, có thể ăn vi khuẩn Acetic.
Vi khuẩn Lactic:Vi khuẩn Lactic tạo mùi khó chịu và làm mất màu giấm, giảm độ chua. Có 3 cách chống vi khuẩn lactic: o Lọc và tiệt trùng rượu đã lên men. o Bổ sung giấm ngon vào dịch trước khi lên men tạo độ chua ban đầu để hạn chế vi khuẩn lactic. o Bổ sung SO2 vào giấm. Giấm chuyển thành màu đen: do 3 nhân tố là tannin,sắt và các men oxy hóa. Khắc phục tannin và sắt bằng cách thông khí và lọc. Một số men oxy hóa cũng làm thay đổi màu giấm, khắc phục bằng cách thanh trùng Pasteur. 1.1.7. Các tiêu chuẩn về thực phẩm của giấm ăn. [26], [28], [42] Giấm ăn là loại thực phẩm không độc đối với người và không có vi sinh vật gây bệnh. Một mẫu giấm phải đạt các tiêu chuẩn sau: Trạng thái cảm quan tốt: giấm trong suốt hoặc hơi đục (nếu nguyên liệu là tinh bột), màu trắng trong (giấm rượu, nước dừa…) hoặc có màu vàng nhạt đến nâu (giấm bia, rượu vang, rỉ đường, trái cây…). Mùi vị chua dịu, có thể có mùi của nguyên liệu như rượu, bia, rỉ đường…Nếu giấm có nhiều mùi vị của nguyên liệu thì sự lên men chưa đạt, giấm chóng hỏng. Không có lươn giấm. Không chứa acid vô cơ tự do. Không có kim loại nặng. Không chứa phẩm màu. Không chứa chất sát trùng. Không chứa hơn 2% ethanol. 1.1.8. Bảo quản giấm ăn. [28], [42]
Giấm thu được sau khi lên men gọi là giấm tươi, giấm có ít hoặc nhiều vẩn đục do chứa vi khuẩn acetic và các chất phân hủy từ nguyên liệu ban đầu nên cần được xử lý trước khi tiêu thụ. Phương pháp thanh trùng Pasteur Các loại giấm sản xuất từ rượu vang, dịch ép trái cây thường tạo tủa ở đáy chai sau 1 thời gian bảo quản. Người ta thanh trùng bằng cách đun sôi ở 75o- 80oC trong 30-40 giây,nếu thanh trùng ở nhiệt độ cao thì ảnh hưởng đến mùi vị và giấm bị đục. Sử dụng chất chống oxy hóa (Sulfit). SO2 là tác nhân chống oxy hóa được phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm với hàm lượng thấp hơn 10mg/l SO2 được thêm vào dạng khí hoặc K2SO3 ngay trước khi đóng chai. SO2 có tác dụng làm giảmvận tốc oxy hóa các chất có gốc aldehyt, aceton tự do trong giấm. Màu và sự khử màu Các chất màu có trong giấm có nguồn gốc từ nguyên liệu sử dụng ban đầu hoặc các chất tạo ra trong quá trình lên men. Ví dụ: màu vàng do caramen hoặc những chất màu khác cho phep sử dụng trong thực phẩm. Giấm làm từ nguyên liệu tự nhiên đôi khi cần có màu như màu đỏ của giấm làm từ vang đỏ có ý nghĩa cảm quan. Ở một số nước giấm được bán sau khi đã qua khử màu bằng than hoạt tính. Đóng chai và bảo quản sản phẩm Giấm thành phẩm dùng trong gia đình được chứa trong chai nhựa hoặc chai thủy tinh và bảo quản bằng cách gắn xi trên nắp chai. Giấm sử dụng trong chế biến bảo quản thực phẩm được chứa trong những thùng có dung tích lớn và kín. Trong gia đình, có thể bảo quản những lọ giấm bằng cách cho cào vài tép tỏi hoặc 1 ít muối ăn.
Bảo quản giấm ở điều kiện thóang mát, tránh ánh sáng mặt trời và nhiệt độ cao. Giấm đã qua lọc bảo quản được lâu hơn. 1.2. Vi khuẩn lên men sinh Acid Acetic. 1.2.1. Đặc điểm chung. [13], [30], [37], [42], [47],[50] Vi khuẩn sinh acetic acid là những vi sinh vật Gram âm, hiếu khí bắt buộc, có hình que và rất phổ biến trong tự nhiên. Chúng sử dụng oxygen làm chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp. Vi khuẩn sinh acetic acid thường hiện diện trong những môi trường có đường, alcohol hay các môi trường acid hoá như trái cây, các loài hoa hoặc các sản phẩm lên men rượu Khả năng oxy hoá ethanol tạo thành acetic acid và tiết ra môi trường được xem là đặc điểm chung của vi khuẩn sinh acetic acid. Vi khuẩn Acetic di động nhờ 1-8 tiêm mao ở cực hay chu mao, hoặc không di động. Không hình thành nội bào tử. Đặc điểm hình thái [13] Các đặc điểm hình thái thường được khảo sát gồm màu sắc, hình dạng khuẩn lạc, trạng thái Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thước tế bào. Ngoài ra, số lượng và cách sắp xếp roi trên tế bào cũng có vai trò trong việc định danh vi khuẩn sinh acid acetic. Đặc điểm sinh thái . [13], [39] Đặc điểm phân bố của vi khuẩn sinh acid acetic thường gắn liền với nguồn dinh dưỡng chứa đường hay alcohol như các loại hoa, quả, bia, rượu và ở các nơi sản xuất giấm. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa. [13], [30], [34], [38], 40], [41],[42], [48], [49] Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid được phân biệt bởi các điểm sinh lý, sinh hoá sau: - Oxy hoá acetate và lactate tạo CO2 và H2O.
- Phát triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau. - Phát triển sinh khối khi nuôi cấy trong các môi trường chứa: D-glucose 30%; acid acetic 0.35%; KNO3 1.0%; methanol; glutamate; mannitol. - Sinh acetic acid từ nguồn cơ chất ethanol. - Tạo sắc tố hoà tan trong nước. - Tạo các polysaccharide có cấu trúc giống levan. - Đồng hoá ammonia trong môi trường chứa D-glucose, D-mannitol hay ethanol. - Tạo dihydroxyaceton từ glycerol. - Phát triển sinh khối và tạo acid trong các môi trường có nguồn carbon duy nhất là: D-glucose, D-mannose, D-galactose, D-fructose, L-sorbose, D- xylose, D-arabinose, L-rhamnose, D-mannitol, D-sorbitol, D-arabitol, meso- ribitol, dulcitol, meso-erythritol, myo-inositol, glycerol, maltose, lactose, melibiose, sucrose, sucrose, raffinose và ethanol. 1.2.2. Vai trò của vi khuẩn sinh acetic acid [13] Các ứng dụng và triển vọng sử dụng vi khuẩn sinh acetic acid - Sản xuất giấm. - Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học: Đặc tính oxy hoá không hoàn toàn nhiều loại nguồn carbon khác nhau của giống Gluconobacter đặc biệt có ý nghĩa trong công nghệ sinh học và sản xuất công nghiệp. Ví dụ: G.oxydans có vai trò rất quan trọng ở giai đoạn chuyển hoá D-sorbitol thành L-sorbose trong nghành công nghiệp sản xuất vitamin C; G.oxydans còn được sử dụng trong sản xuất dihyroxyacetone (DHA) nhờ quá trình chuyển hoá glycerol. - Sản xuất một số loại nước giải khát lên men truyền thống. Ví dụ: sản xuất rượu Kombucha, 1 loại nước giải khát có vị hơi chua và sủi bọt được ưa thích ở Nhật Bản, Trung Quốc, An Độ và một số nước Châu Au, là quá trình
lên men trà đen đã bổ sung đường bởi tổ hợp nấm men cùng 3 giống Acetobacter, Gluconobacter và Gluconacetobacter . -Sản xuất cellulose vi khuẩn. 1.2.3. Phân loại. [13] Vi khuẩn sinh acetic acid được phân loại trong họ Acetobacteraceae thuộc phân lớp -Proteobacteria. Theo International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM)- Tạp chí Quốc Tế về Phân loại và Tiến hóa của Vi sinh vật, cho đến nay họ Acetobacteraceae có 10 giống gồm: Acetobacter Beijerinck 1898, Gluconobacter Asai 1935, Acidomonas Urakami và cộng sự 1989, Gluconacetobacter Yamada và cộng sự 1998, Asaia Yamada và cộng sự 2000, Kozakia Lisdiyanti và cộng sự 2002, Saccharibacter Jojima và cộng sự 2004, Swaminathania Loganathan và Nair 2004, Neoasaia Yukphan và cộng sự 2006, và Granulibacter Greenberg và cộng sự 2006 1.2.3.1. Giống Acetobacter Beijerinck 1898 Beijerinck (1898) dùng thuật ngữ “ Acetobacter” để chỉ các vi khuẩn hiếu khí hình que, Gram âm, có khả năng sinh acetic acid từ ethanol. Các chủng Acetobacter có thể dễ dàng phân biệt với các loài thuộc những giống khác trong họ Acetobacteraceae bởi các đặc điểm kiểu hình sau: Q-9 là thành phần ubiquinone chính trong màng tế bào và oxy hoá 2 nguồn cơ chất acetate và lactate cho sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O. Hiện nay, giống Acetobacter gồm 16 loài gồm: A. aceti, A.pasteurianus, A.pomorum, A.indonesiensis, A.tropicalis, A.orientalis, A.syzygii, A.cibinogensis, A.tropicalis, A.orientalis, A.cibinogensis, A.estunensis, A.orleanensis, A.peroxydans, A.cerevisiae, A.malorum, A.oeni và A.nitrogenifigens; A.aceti là loài điển hình của giống. 1.2.3.2. Giống Gluconobacter Asai 1935
Giống thứ hai trong họ Acetobacteraceae, Gluconobacter được đề nghị bởi Asai vào năm 1935. Vào thời điểm này tất cả các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acetic acid đều được định danh là giống Acetobacter, Asai đã đề nghị phân loại các chủng có khả năng tạo acetic acid từ ethanol kém nhưng oxy hoá mạnh D-glucose thành D-gluconic vào 1 nhóm phân loại mới với tên giống là Gluconobacter, các chủng có khả năng oxy hoá mạnh ethanol thành acetic acid vẫn được xác định là Acetobacter. 1.2.3.3. Giống Acidomonas Urakami và cộng sự-1989 Tên giống Acidomonas được đề nghị bởi Urakami và cộng sự (1989) với chỉ 1 loài là Acidomonas methanolica. Giống này được công nhận với các đặc điểm Gram âm, tế bào hình que, ưa acid và đặc biệt là có khả năng dinh dưỡng methyl tùy ý. 1.2.3.4. Gluconacetobacter Yamada và cộng sự- 1998 Thuật ngữ “ Gluconoacetobacter” được dùng đầu tiên cho cấp độ phân loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984) nhận thấy thành phần ubiquinone chính trong màng tế bào sinh vi khuẩn sinh acetic acid khác nhau. Các chủng có Q-10 là thành phần ubiquinone chính được phân loại trong giống phụ Gluconoacetobacter, trong khi Q-9 là thành phần ubiquinone chính trong màng tế bào Acetobacter. Sau đó, giống phụ Gluconoacetobacter được đưa lên thành giống thứ tư trong họ Acetobacteraceae dựa vào mối quan hệ phát sinh loài khi phân tích một phần trình tự mã hoá 16S rRNA. 1.2.3.5. Giống Asaia Yamada và cộng sự-2000 Giống Asaia được giới thiệu là giống thứ năm trong họ Acetobacteraceae bởi Yamada và cộng sự (2000). Các loài Asaia có những đặc điểm khá khác biệt so với các giống đã biết; Không sinh acetic acid hoặc tạo thành 1 lượng rất ít từ nguồn cơ chất ethanol và hầu như bị kìm hãm phát
triển trong môi trường có chứa acid acetic với nồng độ 0,35%. Hầu như tất cả các chủng Asaia được phân lập từ các loài hoa ở vùng nhiệt đới và phát triển tốt trong môi trường có nguồn cơ chất là đường. 1.2.3.6. Giống Kozakia Lisdiyanti và cộng sự 2002 Giống mới Kozakia được phát hiện khi Lisdiyanti (2002) khảo sát 1 cụm phát sinh loài mới trên cây phát sinh loài của vùng trình tự 16S đối với các chủng vi khuẩn sinh acetic acid phân lập tại Indonesia. 1.2.3.7 Giống Swaminathania Loganathan và Nair 2004 Các chủng Swaminathania phân lập từ cây lúa hoang mọc ở khu vực sinh thái ngập mặn. Loganathan và Nair (2004) xác định giống Swaminathania dựa vào khả năng sinh acetic acid từ ethanol và vị trí phân loại của các chủng thuộc giống này trên cây phát sinh được xây dựng dựa vào trình tự 16S rDNA. 1.2.3.8. Giống Saccharibacter Jojima và cộng sự 2004 Đặc điểm nổi bật của Saccharibacter là tính ưa áp suất thẩm thấu, chỉ có thể tồn tại và phát triển trong môi trường có nồng độ đường cao từ 5-40%. Ngoài ra, Saccharibacter không sinh acid acetic từ ethanol và không thể phát triển trong môi trường có 0,35% c acid acetic. 1.2.3.9. Giống Neoasaia Yukphan và cộng sự 2006 Neoasaia, giống thứ chín trong họ Acetobacteraceae, được Yukphan và cộng sự phát hiện và chỉ có 1 loài là Ne. chiangmaiensis. Giống này được phân loại dựa vào đặc điểm kiểu hình cùng với kết quả phân tích trình tự vùng 16S rDNA, 16S-23S rDNA ITS và kết quả lai DNA bộ gen với loài điển hình của các chủng đã biết. 1.2.3.10. Giống Granulibacter Greenberg và cộng sự 2006
Granulibacter là giống thứ 10 trong họ Acetobacteraceae được công bố trên tạp chí IJSEM vào cuối năm 2006. Đây là giống đầu tiên thuộc họ Acetobacteraceae được biết đến như chủng gây bệnh cho người khi được phân lập từ bệnh nhân bị u hạch mãn tính. 1.3. Cơ chế của quá trình lên men “Acetic” và 1 số phương pháp lên men 1.3.1. Cơ chế của quá trình lên men acetic [2], [12] Acid acetic thu nhận từ nhiều phương pháp: Chưng cất gỗ, tổng hợp hóa học hay sinh học lên men. Lên men acetic thực chất là quá trình oxy hóa không hoàn toàn ethanol thành acid acetic dưới tác dụng của vi khuẩn. Louis Pasteur là người khám phá ra cơ chế của quá trình lên men acetic vào năm 1802. Phương trình tổng quát: CH3CH2OH + O2  CH3COOH +H2O + 117kcal Thực chất trải qua các giai đọan sau: 2CH3CH2OH + O2  CH3CHO +2H2O ethanol Acetaldehyt CH3CHO + H2O  CH3CH(OH)2 Hydrat của acetaldehyt CH3CH(OH)2 +1/2 O2 CH3COOH + H2O Acid acetic Ngoài ra vi khuẩn Acetic còn có khả năng oxy hóa nhiều chất khác nhau như: Propanol  acid propionic. Lactic acid  acetoin. Glycerine  dyhiroxyacetol. D-sorbitol  L-sorbose. D-Ribit  L-ribulose.
D-Manit  D-Fructose. D-Glucose  acid gluconic  D-5-ketogluconic. Lactic acid  pyruvic acid. 1.3.2 . Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lên men.[12] 1.3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid. Trong quá trình lên men acetic, nồng độ acid ảnh hưởng rất quan trọng đến sự lên men. Nếu nồng độ acid acetic đạt 8% sẽ ức chế họat động của vi khuẩn và nếu nồng độ đạt acid acetic từ 12-14% sẽ ức chế hoàn toàn vi khuẩn. 1.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ rượu. Nồng độ rượu trong môi trường lên men là 6-7% thể tích hoặc 9- 14% đối với lọai vi khuẩn khác. Nếu trong môi trường không có rượu thì vi khuẩn tiếp tục oxy hóa acid acetic để thu nhận năng lượng dùng trong sự sống. Vì thế đây là 1 quá trình có hại. Việc sử dụng acid acetic bởi vi khuẩn dấm gọi là sự quá oxy hóa và acid acetic bị mất đi theo phản ứng: CH3COOH + 2O2 =2CO2 +2H2O Trong sản xuất người ta thường giữ lại độ rượu trong môi trường là 0,3-0,5%. Sự quá oxy hóa phụ thuộc vào độ acid của môi trường. Đối với những lòai vi khuẩn khác nhau tồn tại một giá trị pH giới hạn làm ngừng sự quá oxy hóa. Giá trị pH đối với sự quá oxy hóa luôn cao hơn giá trị pH giới hạn đối với sự oxy hóa rượu 1 ít. Do đó khi có rượu thì sẽ kìm hãm sự quá oxy hóa. Đầu tiên rượu có mặt bị oxy hóa và chỉ khi độ acid chuyển sang giá trị giới hạn thì sự quá oxy hóa bắt đầu. 1.3.2.3.Nhiệt độ
Vi khuẩn Acetobacter thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp đối với chúng là từ 25-32oC. Ở nhiệt độ thấp thì quá trình lên men xảy ra chậm.Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế họat động và đến mức độ nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào làm tăng sự tổn thất cho vi khuẩn và hiệu suất của quá trình lên men giảm do sự bay hơi của acid acetic và rượu etylic. Tùy theo từng lòai mà nhiệt độ tối ưu cho quá trình oxy hóa sẽ thay đổi. Nhưng trong sản xuất người ta dùng những lòai vi sinh vật thích ứng cho quá trình oxy hóa là 30-400C. 1.3.2.4. Độ thoáng khí Oxy là 1 yếu tố quan trọng và là nhân tố điều chỉnh quá trình lên men. Theo cơ chế của quá trình oxy hóa, lượng không khí cung cấp cho quá trình lên men là tương đối lớn. Trong thực tế càng thóang khí năng suất càng cao( có giới hạn do năng suất của chủng vi khuẩn). 1.3.2.5. Ảnh hưởng của nguồn C.N. P và các nguyên tố vi lượng Để quá trình oxy hóa xảy ra nhanh, trong dịch lên men ngòai acid acetic, rượu etylic, dung dịch lên men cần đượcc bổ sung 1 số muối khóang (NH4)2SO4, (NH4)2PO4, KH2PO4, MgSO4, CaHPO4, FeCl3…tùy theo nhu cầu cụ thể của từng loài. Ngòai ra trong môi trường dung dịch còn được bổ sung thêm vitamin và chất kích thích sinh trưởng: pepton, cao nấm men, cao thịt, sữa…Theo nghiên cứu của 1 số tác giả Nhật Bản trong môi trường dung dịch còn được bổ sung sake, myglycerin, lactic acid … 1.3.3. Các phương pháp lên men [12], [20] 1.3.3.1. Phương pháp chậm Nguyên lý Phương pháp chậm còn được gọi là phương Pháp – Orleans, được biết đến từ năm 1670, khời đầu là vùng nho nổi tiếng cuả Pháp. Người ta thấy dịch
vang nho để trong thùng gỗ bị hở nắp dần dần đục hơn, có màng phủ trên bề mặt và trở nên chua. Để sản xuất giấm theo phương pháp này, người ta dùng những thùng gỗ đứng có vòi tiếp nguyên liệu và rót giấm (thường bằng thủy tinh, nhựa…). Vật liệu cấy là dấm tươi lấy từ thùng lên men khác, cho vào 1/5 thể tích thùng là dấm tươi, sau đó đổ dịch lên men vào đến khoảng ½ thùng. Tiếp đó cứ theo 1 chu kỳ( 1tuần) đổ thêm dịch lên men vào cho đến khi đầy thùng. Thường dịch lên men là hỗn hợp của rượu vang và acid tạo nên dung dịch có nồng độ từ 1-2% acid, 2-4% rượu. Vi khuẩn Acetobacter phát triển trên bề mặt chất lỏng và “cái giấm” hình thành chứa chứa 1 lượng lớn vi khuẩn Acetobacter. Sở dĩ ngươi ta cho acetic acid trước là để tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, mặt khác là để ngăn ngừa các vi khuẩn khác phát triển, không bị nhiễm. Quá trình lên men diễn ra chậm chạp do sự thâm nhập hạn chế của oxy qua bề mặt dung dịch bị che phủ một lớp cái dấm. Thường quá trình kết thúc sau 5 tuần nuôi cấy. Lúc đó nồng độ dịch lên men vào để lên men tiếp. Trong quá trình lên men do bị chấn động( va chạm )” cái dấm” chìm xuống và tiêu thụ 1 lượng cơ chất mà không tạo thành acid acetic. Đây là nguyên nhân giảm độ acid trong giấm thành phẩm. Sau đó trên bề mặt thóang khí lại hình thành 1 lớp màng vi khuẩn mới và lại diễn ra quá trình lên men như trên. Giấm lấy ra được lọc trong và thanh trùng Pasteur để bảo quản được lâu. Ưu điểm -Cho chất lượng giấm thơm ngon. -Thiết bị sản xuất không phức tạp, phù hợp với các cơ sở sản xuất nhỏ ở các địa phương. Nhược điểm - Thời gian lên men dài.
- Năng suất thấp. - Nồng độ acid thấp. - Mặt bằng sản xuất phải lớn. - Khó cơ khí hóa, tự động hóa. - Hiện nay chỉ còn 1 vài nước chậm phát triển còn sử dụng như biện pháp duy nhất để sản xuất giấm trong đó có Việt Nam. 1.3.3.2. Phương pháp nhanh Nguyên lý Phương pháp nhanh còn được gọi là phương pháp Đức. Phương pháp này được tìm ra vào năm 1823, do Schiizenbachi, cho phép thời gian lên men giảm xuống đáng kể. Nguyên tắc của phương pháp này là tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn giữa vi khuẩn Acetobacter với không khí để oxy hóa rượu. Bề mặt lớn được tạo ra khi sử dụng vật liệu xốp (thường dùng vỏ bào, lõi ngô xếp trong thiết bị dạng thap, trụ, nón cụt…), tháp lên men thông thường làm bằng gỗ, thường có chiều cao gấp đôi đường kính 2,5 – 6m x 1,2 -3m. Vi khuẩn acetic được bám trên vat liệu xốp (vật liệu mang). Những vật liệu này có bề mặt tiếp xúc riêng lớn ,thể tích tự do lớn, khối lượng riêng bé, độ bền cơ học cao, rẻ tiền, dễ kiếm, phải có đủ độ nhám, độ xốp để màng vi sinh vật có thể bám lên đó, dịch lên men cho phương pháp nhanh thường là hỗn hợp acid 6% và 3% rượu etylic để thu được dấm 8-9%. Dịch lên men được chuyển từ trên xuống và không khí được chuyển từ dưới lên. Phản ứng sinh học được thực hiện trong khối tế bào cố định, dịch lên men được chuyển hóa nhanh thành acid acetic nhờ vi khuẩn. Khi hầu hết rượu etylic được oxy hóa thành acid acetic người ta thường để trong dung dịch lên men khỏang 0,2-0,5% rượu etylic để tránh quá