Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) mang gen GmDREB2 phận lập từ cây đậu tương

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:62

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu tạo nguyên liệu biến nạp từ cây thuốc lá giống K326; nghiên cứu lây nhiễm A. tumefaciens mang vector chuyển gen vào mảnh lá thuốc lá. Tái sinh in vitro, chọn lọc và tạo các dòng cây thuốc lá chuyển gen; phân tích sự có mặt của gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen ở thế hệ T0 bằng kỹ thuật PCR.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) mang gen GmDREB2 phận lập từ cây đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG THUỐC LÁ (NICOTIANA TABACUM L.) MANG GEN GmDREB2 PHẬN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.Vũ Thị Thu Thuỷ Thái Nguyên, năm 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Vũ Thị Thu Thủy, sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, cán bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại Khoa Sinh học– Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên. Các số liệu nêu trong luận văn là trung thực. Các kết quả chưa được công bố trong bất kỳ các công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2015 Tác giả Nguyễn Thị Phương Thảo XÁC NHẬN XÁC NHẬN CỦA KHOA CHUYÊN MÔN CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Vũ Thị Thu Thủy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN i http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Thị Thu Thủy đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành Bản luận văn thạc sĩ này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên; xin cảm ơn chị Trần Thị Hồng - KTV phòng Công nghệ tế bào thực vật, đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện các thí nghiệm của đề tài. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới bạn bè cùng toàn thể gia đình đã động viên, khuyến khích, giúp đỡ tôi, luôn quan tâm và là chỗ dựa cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2015 Tác giả Nguyễn Thị Phương Thảo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN ii http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC Trang Lời cam đoan ........................................................................................................ i Lời cảm ơn ........................................................................................................... ii Mục lục ............................................................................................................... iii Danh mục chữ cái viết tắt ................................................................................... iv Danh mục bảng .................................................................................................... v Danh mục hình .................................................................................................... vi MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 1.1. Cây thuốc lá và hệ thống tái sinh cây thuốc lá ......................................... 3 1.1.1 Cây thuốc lá ............................................................................................ 3 1.1.2 Hệ thống tái sinh và chuyển gen cây thuốc lá. ....................................... 4 1.2. Tính chịu hạn và gen liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật................... 6 1.2.1. Hạn và tác hại của hạn lên thực vật ....................................................... 6 1.2.2 Đặc tính chịu hạn của thực vật .............................................................. 8 1.2.3. Gen liên quan đến tính chịu hạn .......................................................... 10 1.2.4. Gen DREB và gen DREB2 .................................................................. 12 1.3. Phương pháp tạo cây trồng chuyển gen.................................................. 18 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 26 2.1. Vâ ̣t liê ̣u hoá chấ t và thiế t bi .................................................................... ̣ 26 2.1.1. Vật liệu................................................................................................. 26 2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 26 2.1.3. Thiết bị ................................................................................................. 26 2.1.4. Điạ điể m nghiên cứu............................................................................ 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 27 2.2.1. Phương pháp tạo nguyên liệu biến nạp .............................................. 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN iii http://www.lrc.tnu.edu.vn
2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua A. tumefaciens 27 2.2.3. Phân tích sự có mặt của cấu trúc mang gen GmDREB2 bằng phương pháp PCR 29 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................... 32 3.1. Kết quả tạo nguyên liệu biến nạp ........................................................... 32 3.2. Kế t quả chuyể n vector mang cấu trúc GmDREB2 vào thuố c lá ............ 33 3.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch A. tumefaciens và cảm ứng tạo cu ̣m chồi .. 34 3.2.2. Tạo rễ và chuyển cây ra môi trường tự nhiên..................................... 37 3.3. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các dòng thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR ..................................................................... 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣............................................................................. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 43 PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN iv http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ABA Abscisic acid AS Acetosyringone A.tumefacines Agrobacterium tumefacines BAP 6-Benzyl Amino Purine bp Base pair (cặp base) DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxynucleic triphosphate DREB Dehydration Responsive Binding protein ĐC Đối chứng EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid IAA Indoleacetic acid IBA Indole-3 butyric acid LB Luira and Bertani LEA Late Embryogenesis Abundant MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) PCR Polymerase chain reaction RM Môi trường ra rễ TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Ti-plasmid Plasmid tạo khối u Vir Virulence region Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN iv http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm chiết DNA tổng số ................................ 29 Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của că ̣p mồ i PCR khuế ch đa ̣i đoa ̣n GmDREB2 ... 30 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen GmDREB2 ... 31 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gen GmDREB2 ......................... 31 Bảng 3.1. Kết quả cảm ứng chồi từ mảnh lá thuốc lá ....................................... 36 Bảng 3.2. Kế t quả tạo rễ và tái sinh cây thuốc lá ở thí nghiệm và đối chứng ... 38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN v http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Cây thuốc lá giai đoạn trưởng thành và giai đoạn ra hoa .................... 3 Hình 1.2 Cấu trúc Ti - Plasmid .......................................................................... 22 Hình 1.3. Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens ........................... 23 Hình 3.1. Tạo nguyên liệu biến nạp .................................................................. 32 Hình 3.2. Vùng T-DNA của vector pBI121 - GmDREB2 ................................. 33 Hình 3.3. Hình ảnh nhiễm khuẩn mẫu và đồng nuôi cấy .................................. 35 Hình 3.5. Hình ảnh tạo rễ trên môi trường kháng sinh chọn lọc ....................... 38 Hình 3.6. Các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hê ̣ T0 trồ ng trên châ ̣u trong nhà lưới ..................................................................................................................... 39 Hình 3.7. Kế t quả điện di kiể m tra sản phẩ m PCR nhân đoa ̣n GmDREB2 từ 17 dòng cây thuốc lá chuyể n gen............................................................................ 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN vi http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Một trong những hiện tượng thay đổi của môi trường ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của thực vật là tình trạng hạn. Hạn hán có ảnh hưởng xấu ở các mức độ khác nhau trong suốt quá trình hay từng giai đoạn sống của cơ thể thực vật dẫn đến làm giảm năng suất cây trồng, chậm phát triển và gây chết. Hiện nay trên thế giới diện tích đất nông nghiệp bị hạn hán ngày càng tăng. Ở Việt Nam tình trạng hạn hán trở nên báo động trong năm 2015, diện tích đất nông nghiệp không có nước để sản xuất này càng tăng cao. Khả năng chịu hạn của thực vật là tính trạng do nhiều gen quy định. Hiện nay, người ta vẫn chưa tìm được một gen cụ thể nào thực sự quyết định tính chịu hạn, mà mới chỉ xác định được các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây thực vật. Nhiều trình tự gen liên quan đến tính chịu hạn ở đậu tương đã được công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế, trong đó có gen DREB. DREB (Dehydration Responsive Element Binding) là một họ gen sản xuất protein kích hoạt nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của thực vật. Việc nghiên cứu gen DREB2 liên quan đến tính chịu hạn cho thấy đây là nhóm gen đa dạng về cấu trúc, chức năng và các tác giả khuyến cáo cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu. Hiện nay, nhờ những tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền mà người ta đã tạo ra các giống cây trồng có khả năng chịu hạn bằng cách lai giống, đột biến thực nghiệm, công nghệ tế bào, chuyển gen. Chọn tạo giống cây trồng có thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như chọn dòng biến dị soma, lai giống, gây đột biến thực nghiệm, sử dụng công nghệ tế bào và chuyển gen... Đã có nhiều giống cây trồng đã được chọn tạo như các giống lúa chịu hạn của tác giả Đinh Thị Phòng [17], các dòng lúa chịu nóng của Nguyễn Thị Tâm [19] Các dòng lạc chịu hạn cũng đã được tạo ra bằng cách gây đột biến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 1 http://www.lrc.tnu.edu.vn
thực nghiệm- tác giả Vũ Thị Thu Thủy [23]... Chuyển gen là kỹ thuật cho phép đưa một hay một số gen nhất định nào đó vào hệ gen của cây chủ được quan tâm để tạo ra những cây trồng biến đổi gen nhằm cải thiện một số đặc tính hay tính trạng theo hướng có lợi cho con người . Chuyển gen đang là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng, đã được tiến hành thực nghiệm trên nhiều giống cây trồng như: cà chua, lúa, ngô, đậu tương... và được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới. Trong đó chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacines (A.tumefacines) tỏ ra ưu thế hơn cá kỹ thuật chuyển gen khác do ít tốn kém, quy trình đơn giản, nhanh chóng, dễ áp dụng trên nhiều đối tượng cây trồng. Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương đối đơn giản và thời gian phân hóa từ mô thành cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trong những nghiên cứu về chuyển gen các nhà khoa học thường chọn cây thuốc lá làm cây mô hình. Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) mang gen GmDREB2 phận lập từ cây đậu tương”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tạo được dòng thuốc lá chuyển gen mang gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tương. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu tạo nguyên liệu biến nạp từ cây thuốc lá giống K326. (2) Nghiên cứu lây nhiễm A. tumefaciens mang vector chuyển gen vào mảnh lá thuốc lá. Tái sinh in vitro, chọn lọc và tạo các dòng cây thuốc lá chuyển gen. (3) Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen ở thế hệ T0 bằng kỹ thuật PCR Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 2 http://www.lrc.tnu.edu.vn
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cây thuốc lá và hệ thống tái sinh cây thuốc lá 1.1.1 Cây thuốc lá Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana tabacum L. thuộc ngành hạt kín, lớp 2 lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà. Họ này có trên dưới 85 chi với tổng số trên 1800 loài. Một số loài trong họ này được trồng rộng rãi như khoai tây, cà chua, ớt và các loại cà, trong đó có chi Nicotiana. . Hình 1.1. Cây thuốc lá giai đoạn trưởng thành và giai đoạn ra hoa (Hình ảnh chụp tại vườn thực nghiệm khoa Sinh học trường ĐH Sư phạm) Rễ thuốc lá là một hệ thống gồm rễ cái (rễ trục) và rễ nhánh (rễ bên) và rễ hấp phụ. Ngoài ra thuốc lá còn có rễ bất định mọc ở cổ rễ, sát mặt đất. Rễ trụ được hình thành từ trục của rễ cái, thường có độ xiên 30 – 40 độ. Rễ hấp thu được phát triển trên các rễ nhánh. Có nhiệm vụ cung cấp nước và các chất dinh dưỡng cho cây. Rễ bất định mọc từ thân, những rễ bất định ở phần sát gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi có độ ẩm không khí cao. Rễ thuốc lá tập trung dày đặc ở lớp đất 0 – 30 cm, phát triển theo các hướng. [3]. Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân đứng, tiết diện thân tròn, chiều cao thân cây có thể đạt từ 1 – 3m, chia làm nhiều đốt, mỗi đốt mang một lá. Đường kính thân đạt 2 – 4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là chồi nách. Có 2 loại chồi nách: Chồi nách chính và chồi nách phụ [3]. Trên thân chính của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 3 http://www.lrc.tnu.edu.vn
cây thuốc lá có nhiều lá. Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu là: hình trứng, hình tim, hình elip, hình mũi mác [3]. Hoa thuốc lá là hoa đơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhị cái ở giữa, xung quanh có 5 nhị đực thường mọc cao hơn nhị cái. Thuộc loại hoa tự hữu hạn, được hình thành do sự phân hóa đỉnh sinh trưởng thân. Chính giữa chùm hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của chùm hoa [3]. Quả thuốc lá được hình thành trên đài hoa. Mỗi cây có 100 – 150 quả trên mỗi chùm hoa, có những cây hoặc những giống có tới 400 – 500 quả trên chùm hoa. Mỗi quả có hai ngăn, khi chín chúng thường tách ra. Hạt thuốc lá rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng sấy lò là 0,07 – 0,10 gam, trong mỗi gam hạt có từ 10000 đến 15000 hạt [3]. 1.1.2 Hệ thống tái sinh và chuyển gen cây thuốc lá Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang bộ máy thông tin di truyền giống nhau. Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau. Các tế bào được lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ...) đều có thể được kích thích để tái sinh thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài, phát triển và ra hoa kết quả bình thường, thông qua phát sinh cơ quan hoặc hình thành phôi vô tính, miễn là chúng được nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng cần thiết [62]. Các loại mô đã phân hóa tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, hoặc là chúng phát triển thành tế bào mô sẹo. Đó là loại tế bào không phân hóa, phân chia liên tục và có khả năng phân hóa thành phôi, chồi để tạo cây hoàn chỉnh. Khả năng đó gọi là tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năng chính là cơ sở của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào, là cơ sở của công nghệ tế bào thực vật đang ngày càng phát triển và hoàn thiện. Các nhà khoa học đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất này Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 4 http://www.lrc.tnu.edu.vn
được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ trợ nhau. Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định. Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chát điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin [24], [27] Tái sinh cây được xem là khâu mấu chốt quyết định thành công trong nuôi cấy mô và chuyển gen ở thực vật. Nguồn mẫu ban đầu dùng cho tái sinh cây rất đa dạng như : phôi hữu tính, lá non, lá mầm, phần trụ của lá mầm, đoạn thân... Các mẫu này được sử dụng trong hệ thống tái sinh thông qua hai con đường: tái sinh trực tiếp hoặc qua giai đoạn mô sẹo và tái sinh thông qua hình thành phôi soma trên các môi trường thích hợp. Theo con đường thứ nhất, sự tái sinh chồi trực tiếp từ các mẫu vật như lá mầm, nách lá mầm, mảnh lá là một phương pháp có hiệu quả được sử dụng trong tái sinh và chuyển gen một số loài thực vật. Giai đoạn cảm ứng tạo chồi là giai đoạn quan trọng trong quá trình phát triển chồi trực tiếp từ nách lá mầm. Môi trường cảm ứng tạo chồi ở thực vật thường sử dụng các chất kích thích sinh trưởng nhóm auxin và cytokinin như IBA, IAA, BAP... Trong đó, BAP là kích thích sinh sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin được sử dụng nhiều trong môi trường cảm ứng tạo chồi ở thực vật [30], [72]. Sự tái sinh thông qua giai đoạn mô sẹo thường bắt đầu từ các mẫu vật như phôi trục, lá non, đoạn thân... Tuy nhiên, mô sẹo được tạo thành cho tỉ lệ đa chồi rất thấp thường là một hoặc hai chồi, điều này không có ý nghĩa trong chuyển gen. Con đường tái sinh thứ hai, chồi được tái sinh thông qua hình thành phôi soma. Các phôi soma thường là sự biến đổi của khối mô sẹo, chúng có cấu trúc tương tự như phôi hữu tính. Hệ thống tái sinh cây thông qua phôi soma được sử dụng khá phổ biến trong nuôi cấy in vitro do khả năng tái sinh cây khá cao và giảm được đáng kể hiện tượng khảm của cây chuyển gen [16]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 5 http://www.lrc.tnu.edu.vn
Đối với cây thuốc lá, gen thường được chuyển thông qua trung gian A. tumefaciens hoặc thông qua các phương pháp chuyển giao DNA trực tiếp như xung điện hoặc bắn gen bằng vi đạn... Trong lịch sử, cả hai phương pháp đã được sử dụng để chuyển DNA, tuy nhiên phương pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium được áp dụng rộng rãi hơn, thời gian tái sinh cây chuyển gen ngắn hơn, kết quả các locus gen chuyển từ việc nhiễm khuẩn A.tumefacines ít phức tạp hơn so với việc được tạo ra bằng các phương pháp chuyển gen trực tiếp, do đó làm giảm nguy cơ tái sắp xếp gen chuyển và bất hoạt gen. Do đó thuốc lá thường được chọn làm cây mô hình. Trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều thành công trong chuyển gen cây thuốc lá. Gen cryIII được chuyển vào cây thuốc lá và cây khoai tây để kháng sâu Colorado potato beetle (leptiontarsa deeecemlineata) do Perlak và cs thực hiện năm 1993 [64]. Liu và cs đã chuyển gen DREB4 vào cây thuốc lá [57]. Nguyễn Thị Thu Ngà (2014) sử dụng cây thuốc lá để chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 bằng phương pháp xung điện, thành công đã được minh chứng bằng sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra bằng kĩ thuật lai Western [16]. Nghiên cứu của Phạm Thị Vân và cs (2009) đã tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng virus TMV bằng kĩ thuật RNAi [25]. Gen kháng kanamycine cũng được chuyển thành công vào mô thuốc lá là nghiên cứu của Nguyễn Liên Chi và cs (1989) [3]. 1.2. Tính chịu hạn và gen liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật 1.2.1. Hạn và tác hại của hạn lên thực vật Hạn là tình trạng mất nước ở cây nguyên nhân có thể do nhiều lý do: như sự thiếu nước trong môi trường hay do nhiệt độ thấp, đốt nóng, nồng độ muối khoáng trong môi trường quá cao. Có ba hình thức hạn gặp ảnh hưởng đến cây trồng là hạn đất, hạn không khí và hạn tổ hợp [11]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 6 http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hạn đất xảy ra khi lượng nước trong đất thiếu nhiều không đủ cho rễ hút để cung cấp cho cây. Vì thế, cây có thể bị héo và chết. Tuy nhiên, cũng có những trường hợp đủ nước mà cây vẫn héo, nguyên nhân là do hạn sinh lý gây nên. Hạn không khí thường xẩy ra khi không khí trong môi trường có nhiệt độ cao và độ ẩm thấp, ví dụ như gió nóng Israel, gió Lào ở miền Trung nước ta... làm cho cây thoát hơi nước quá mạnh, vượt xa mức bình thường và dẫn tới hiện tượng mất nước, do rễ hút vào không đủ bù lượng nước mất đi, làm các bộ phận non của cây thiếu nước. Hạn tổ hợp là sự phối hợp thiếu nước trong đất và không khí. Tác hại của hạn lên thực vật Thiếu nước sẽ gây nên các hậu quả rất lớn đối với hoạt động sống của cây. Trước tiên ảnh hưởng đến sự cân bằng nước của cây, từ đó ảnh hưởng đến các chức năng sinh lý khác như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng và cuối cùng là ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của thực vật dẫn đến giảm năng suất. Khi gặp hạn trạng thái của chất nguyên sinh trong tế bào thay đổi mạnh, ảnh hưởng đến tính chất hóa lý của chất nguyên sinh như tính thấm, mức độ thủy hóa keo, thay đổi pH, độ nhớt, dẫn đến sự thay đổi vị trí các thành phần cấu tạo nên chất nguyên sinh, cuối cùng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất bình thường của cơ thể [5]. Trong thời gian cây bị hạn, hàm lượng nước tự do trong lá giảm xuống nhưng hàm lượng nước liên kết lại tăng lên. Chất nguyên sinh của tế bào có tính đàn hồi lớn thì cây có khả năng chịu hạn cao [ 28]. Hạn còn ảnh hưởng đến hô hấp. Trong thời gian khô hạn, ở những cây trung sinh thường tăng cường hô hấp. Nhờ gia tăng hô hấp mà cây giữ được độ ngậm nước của keo nguyên sinh chất [5]. Sự tăng cường quá trình thủy phân khi gặp điều kiện khô hạn là nguyên nhân tăng cường hô hấp trong cây. Khi mất nước ban đầu hô hấp tăng, nhưng sau đó giảm đột ngột, nếu tình trạng thiếu nước kéo dài [28]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 7 http://www.lrc.tnu.edu.vn
Thiếu nước ảnh hưởng đến quang hợp. Hạn hán đã ảnh hưởng xấu đến quá trình hình thành diệp lục, phá hoại lạp thể nên hiệu suất quang hợp giảm xuống nhanh chóng [28]. Hạn ảnh hưởng đến hoạt động hút khoáng của hệ rễ, dẫn đến tình trạng thiếu những nguyên tố dinh dưỡng quan trọng trong quá trình trao đổi và tổng hợp các chất hữu cơ khác nhau trong cơ thể thực vật [5]. Hạn ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng các tế bào, đặc biệt là trong pha giãn của tế bào, từ đó mà ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của toàn cây [28]. 1.2.2 Đặc tính chịu hạn của thực vật Mỗi loài cây trồng có một ghới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trường như: nhiệt độ, nước, phèn, độ mặn...Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính làm tăng nhiệt độ cây và gây mất nước trong cây. Trong những nhân tố sinh thái của môi trường thì nước là một nhân tố ghới hạn quan trọng của cây trồng là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hóa diễn ra trong cơ thể thực vật. Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn Nước có ý nghĩa quyết định đến đời sống của thực vật. Thiếu nước cây sẽ chết non hoặc giảm sức sống, giảm năng suất. Do sự thiếu nước của môi trường, nhiệt độ thấp hay cao... có thể gây ra hiện tượng mất nước của cây. Để đáp ứng sự thiếu hụt nước trong điều kiện cực đoan, cây bắt buộc phải có những cơ chế thích ứng đặc biệt giúp cây duy trì sự tồn tại khi bị hạn. Khi gặp hạn thực vật luôn có những biến đổi về mặt sinh lý, sinh hoá để nhằm không mất nước. Có hai cơ chế bảo vệ để thực vật tồn tại trên môi trường thiếu nước đó là vai trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Vai trò của bộ rễ: Những cây chịu hạn có bộ rễ khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu giúp cây hút được nước ở tầng đất sâu. Bộ rễ lan rộng, có nhiều rễ phụ và có nhiều mô thông khí, cùng với hệ mạch dẫn phát triển giúp cho việc thu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 8 http://www.lrc.tnu.edu.vn
nhận và cung cấp nước tới các bộ phận khác của cây trong điều kiện khó khăn về nước. Thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng khi ở giai đoạn cây non thường chịu tác động mạnh của hạn vì bộ rễ phát triển chưa đầy đủ còn yếu. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu (ASTT): Là một đặc tính quan trọng của tế bào khi mất nước do nóng hạn. Khi tế bào bị mất nước dần dần, các chất hòa tan sẽ được tích lũy trong tế bào chất (như: đường, axit hữu cơ, amino acid, các ion chủ yếu là ion K+...), các chất này có tác dụng điều chỉnh áp suất thẩm thấu . Những thực vật tồn tại trên môi trường cân bằng về áp suất thẩm thấu đòi hỏi phải có khả năng chống lại điều kiện khắc nghiệt đó. Trong điều kiện khô hạn ASTT được điều chỉnh tăng lên giúp cho tế bào thu nhận được những phân tử nước từ đất. Bằng cơ chế như vậy thực vật có thể chịu được sự mất nước trong thời gian ngắn [11]. Ngoài ra, thực vật còn có khả năng chống chịu bằng những biến đổi về hình thái như lá cuộn lại thành ống, lá có nhiều lông, cutin dày để giảm thoát hơi nước [5]. Cơ sở sinh hóa và di truyền của tính chịu hạn Khi phân tích thành phần hóa sinh của các cây chịu hạn, các nghiên cứu đều cho rằng, khi gặp hạn có hiện tượng tăng lên về hoạt độ enzyme, hàm lượng ABA, hàm lượng proline, nồng độ ion K+, các loại đường, axit hữu cơ,...giảm CO2, protein và axit nucleic [2],[4],[13],[17]. Nghiên cứu sự đa dạng và hoạt động của enzyme trong điều kiện gây hạn đã được nhiều tác giả quan tâm. Trần Thị Phương Liên (1999) nghiên cứu đặc tính hóa sinh của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, hạn đã nhận xét rằng áp suất thẩm thấu cao ảnh hưởng rõ rệt tới thành phần và hoạt độ protease, kìm hãm sự phân giải protein dự trữ [11]. Một số nghiên cứu trên các đối tượng như lạc, lúa, đậu xanh, đậu tương... cho thấy, có mối tương quan thuận giữa hàm lượng đường tan và hoạt độ α - amylase, giữa hàm lượng protein và hoạt độ protease [10],[16],[22]... Đường tan là một trong những chất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 9 http://www.lrc.tnu.edu.vn
tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào. Sự tăng hoạt độ α - amylase sẽ làm tăng hàm lượng đường tan, do đó làm tăng áp suất thẩm thấu và tăng khả năng chịu hạn của cây trồng [14],[17]. Những thay đổi hóa sinh khác do hạn gây ra cũng đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu, trong đó có sự biến đổi hàm lượng proline. Nghiên cứu khả năng chịu hạn của một số giông lúa cạn địa phương ở vùng núi phía Bắc, tác giả Chu Hoàng Mậu và cs đã nhận xét, khả năng chịu hạn của cây lúa cạn phụ thuộc tuyến tính vào hàm lượng proline [15]. Xử lý bằng dung dịch sorbitol 5% đối với một số dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước, tác giả Đinh Thị Phòng cho thấy, hàm lượng proline của các dòng chọn lọc khi bị xử lý sorbitol tăng lên và vượt xa so với đối chứng [17]. 1.2.3. Gen liên quan đến tính chịu hạn Tính chịu hạn là tính trạng đa gen, được biểu hiện khác nhau trong các giai đoạn phát triển của cây. Trên thực tế vẫn chưa tìm được gen thực sự quyết định tính chịu hạn mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu hạn. Có thể chia các gen liên quan đến tính chịu hạn làm hai nhóm: (1) Các gen liên quan đến khả năng chịu hạn của thực vật; (2) Nhóm gen mã hóa protein điều khiển hoạt động phiên mã của các gen liên quan đến tính chịu hạn. Nhóm thứ nhất, các gen liên quan đến khả năng chịu hạn tiếp tục được chia nhỏ thành các nhóm: (i) Các gen tham gia vào quá trình bảo vệ thành tế bào; (ii) Các gen tham gia vào quá trình tổng hợp các chất điều hòa áp suất thẩm thấu và (iii) Các gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ. Một số gen được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây là: LEA, P5CS, NCED, PLD...[32],[40],[46]. Gen LEA (Late Embryogenesis Abundant) là một trong những nhóm gen liên quan tới sự mất nước của thực vật. Bình thường, sản phẩm của gen LEA được tạo ra với lượng lớn trong giai đoạn muộn của quá trình hình thành phôi. Khi tế bào bị mất nước protein LEA được tổng hợp nhiều hơn, mức độ phiên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 10 http://www.lrc.tnu.edu.vn
mã của LEA được điều khiển bởi ABA. Biểu hiện mạnh của gen LEA sẽ làm giảm độ mất nước và tăng áp suất thẩm thấu trong tế bào [32], [45]. Nhóm gen P5CS mã hóa tổng hợp pyrroline 5 carboxylate synthetase. Biểu hiện của gen P5CS mạnh sẽ làm tăng hàm lượng proline trong cây, theo đó tăng áp suất thẩm thấu của tế bào và khả năng chống chịu với các yếu tố bất lợi của cây được cải thiện [8],... Gen NCED mã hóa tổng hợp 9 - cis epoxycarotenoid dioxygenase. Theo nghiên cứu của Guerrini và đtg (2005), sự bất lợi của điều kiện về hạn, muối làm cho gen điều khiển tổng hợp 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase biểu hiện mạnh hơn. Hoạt động của 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase sẽ biến đổi neoxathin thành xathoxin, đây chính là giai đoạn trước khi hình thành ABA. Do đó, hoạt động của NCED được xác nhận có mối liên quan với khả năng chống chịu của thực vật [46]. Gen PLD mã hóa phospholipase D. Hoạt động của phospholipase D mạnh mẽ tạo một phân tử phospholipid và một gốc chứa nhóm hydroxyl tự do, hoạt động của các PLD được khẳng định có liên quan đến hạn [40],[48],[75]. Nhóm thứ hai, các gen mã hóa protein điều khiển phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen liên quan đến tính chịu hạn. Cơ chế hoạt động thông qua việc bám vào trật tự DNA trên vùng khởi động gen (promoter) và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã. Nhóm gen mã hóa các yếu tố phiên mã chiếm khoảng 8 - 10% trong hệ gen mỗi loài và đóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động sống như quá trình sinh trưởng phát triển và chống chịu với bất lợi môi trường. Các nhà khoa học đã xác định nhóm gen liên quan đến tham gia vào quá trình phiên mã DREB, NAC, MYB.... [67], [73]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 11 http://www.lrc.tnu.edu.vn
1.2.4.Các nhân tố phiên mã và gen DREB Nhân tố phiên mã trong tế bào được kí hiệu là TF (transcription factor). Đặc điểm đặc trưng của các nhân tố phiên mã là có hai vùng hoạt động: (1) Vùng hoạt hoá các protein chức năng và (2) vùng liên kết với các trật tự DNA đặc hiệu trên promoter. TF là các protein có khả năng nhận biết các trình tự cis – yếu tố điều hòa sự phiên mã đặc hiệu trên promoter và hoạt hóa sự phiên mã. Yếu tố cis chứa trình tự hộp GC là một trình tự dài 11 bp (5’- C/AACACGTGGCA – 3’) nằm ở phía trước của rất nhiều gen mã hóa cho các tiểu đơn vị nhỏ của ribulose biphosphate carboxylase [39], [77]. Các protein tham gia điều khiển biểu hiện gen có chức năng trong việc phản ứng với nhờ các tiết tấu trình tự có khả năng gắn với DNA như bZIP, MYB, MYC… Vùng khởi động gen của hầu hết các gen liên quan đến tính chịu hạn thường chứa một hoặc nhiều trật tự DNA đặc hiệu. Các trật DNA phổ biến là ABRE (ABA responsive element) và DRE/ CRT (Dehydration responsive element/ C repeat), NAC, MYB... Trong điều kiện cực đoan, các nhân tố phiên mã sẽ gắn với các trật tự trên và biểu hiện phụ thuộc hoặc không phụ thuộc vào nồng độ ABA [77]. Trong điều kiện biểu hiện của các nhân tố phiên mã phụ thuộc vào ABA, thì ABA được xem là chất có vai trò chủ yếu phối hợp với một hệ thống điều hòa cho phép thực vật đối phó với điều kiện thiếu nước. Các nhân tố phiên mã phụ thuộc vào ABA được xác định gần đây gồm MYB, MYC, bZIP ...[40]. Ở Arabidopsis, MYB gồm nhiều loại và được kí hiệu là AtMYB. Nghiên cứu của Abe và cs (2008) xác định loại AtMYB2 nhận biết trình tự TGGTTAG trên promoter để hoạt hóa gen rd22 trong điều kiện mất nước [29]. Gen AtMYB60 biểu hiện trong tế bào khí khổng đã giúp thực vật vượt qua được tình trạng mất nước [12]. MYC có thể nhận biết trình tự CAxxTG trên promoter (x là một nucleotit bất kì) [12]. bZIP (nhân tố phiên mã AREB/ABF) có trình tự gắn đặc hiệu là ACGT [44]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN 12 http://www.lrc.tnu.edu.vn