ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
TRẦN NGỌC NAM
NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO LAN HOÀNG THẢO THẠCH HỘC TÍA
(DEDROBIUM NOBILE LINDL)
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
Thái Nguyên - 2018
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
TRẦN NGỌC NAM
NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG
IN VITRO LAN HOÀNG THẢO THẠCH HỘC TÍA
(DEDROBIUM NOBILE LINDL)
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN THỊ HẢI YẾN
Thái Nguyên - 2018
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS. Nguyễn Thị Hải Yến
giảng viên Khoa Công nghệ sinh học đã rất nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi
hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo và các cán bộ Phòng thí nghiệm sinh học
Khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện về thời gian cũng như cơ sở vật chất
cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành đề tài này.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè cùng tất cả các thầy cô luôn
luôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình tôi học tập và làm
đề tài.
Thái Nguyên, ngày … tháng …năm 2018
Học Viên
i
Trần Ngọc Nam
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i
MỤC LỤC ....................................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................. iv
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................... v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ................................................................. vi
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PHONG LAN ............................................................... 3
1.1.1. Phân loại và nguồn gốc ..................................................................................... 3
1.1.2. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) .................................................................... 4
1.2. MỘT SỐ LOÀI LAN DENDROBIUM DÙNG LÀM THUỐC .............................. 7
1.2.1. Lan Thạch hộc ................................................................................................... 7
1.2.2. Hoàng thảo ngọc trúc - Dendrobium moniliforme............................................ 9
1.2.3. Dendrobium officinale ...................................................................................... 9
1.2.4. Các Dendrobium khác ..................................................................................... 10
1.3. GIÁ TRỊ DƯỢC LIỆU CỦA LAN THẠCH HỘC ................................................ 10
1.3.1. Đặc điểm thực vật học ..................................................................................... 10
1.3.2. Thu hái và chế biến ......................................................................................... 11
1.3.3. Công dụng và thành phần hóa học .................................................................. 12
1.3.4. Các vị thuốc chứa thạch hộc ........................................................................... 13
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN DENDROBIUM ...... 16
1.4.1. Một số nghiên cứu trên thế giới ..................................................................... 16
1.4.2. Một số nghiên cứu tại Việt Nam ..................................................................... 17
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 19
2.1. VẬT LIỆU .............................................................................................................. 19
2.1.1. Vật liệu thực vật .............................................................................................. 19
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất ........................................................................................ 19
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 20
2.2.1. Thu và xử lý mẫu ............................................................................................ 20
2.2.2. Khử trùng mẫu hạt đưa vào nuôi cấy .............................................................. 20
2.2.3. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................ 20
ii
MỤC LỤC
2.2.4. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 21
2.2.5. Điều kiện nuôi cấy .......................................................................................... 22
2.2.6. Các chỉ tiêu đánh giá ....................................................................................... 22
2.2.7. Xử lý số liệu .................................................................................................... 22
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 23
3.1. KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG MẪU ............................................................................ 23
3.2. KẾT QUẢ TÁI SINH TẠO PROTOCORM ......................................................... 25
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tăng sinh protocorm ................. 25
3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến quá trình nhân nhanh protocorm 26
3.2.3. Ảnh hưởng của nước dừa đến quá trình phát sinh chồi protocorm ................. 28
3.2.4. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh chồi từ protocorm ..... 29
3.3. KẾT QUẢ NHÂN NHANH VÀ TẠO CÂY HOÀN CHỈNH IN VITRO ............. 31
3.3.1. Ảnh hưởng của BAP đến sự nhân nhanh chồi lan Thạch hộc ........................ 31
3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh nghiền đến sự phát triển
chồi lan Thạch hộc .................................................................................................... 33
3.3.3. Ảnh hưởng của α – NAA đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc .......................... 35
3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI GIÁ THỂ ĐẾN SINH TRƯỞNG VÀ
PHÁT TRIỂN LAN THẠCH HỘC SAU KHI RA CÂY ............................................ 36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 39
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 42
iii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng đoạn thân lan Thạch hộc ....................................... 23
Bảng 3.2. Kết quả khử trùng hạt lan Thạch hộc ................................................. 24
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng phát sinh Protocorm ..... 26
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến khả năng nhân nhanh
protocorm ............................................................................................................ 27
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng phát sinh chồi từ
cụm protocorm .................................................................................................... 28
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh chồi từ cụm
protocorm ............................................................................................................ 30
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát triển cụm chồi lan Thạch hộc ....... 31
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng chuối xanh và khoai tây nghiền đến sự
phát triển lan Thạch hộc ...................................................................................... 33
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan Thạch hộc ...... 35
iv
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến sự phát triển lan Thạch hộc 37
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây và hoa lan Thạch hộc ................................................................... 11
Hình 3.1. Hình ảnh mẫu thân lan thạch hộc sinh trưởng trên môi trường bổ sung
BAP 1mg/l ........................................................................................................... 23
Hình 3.2. Hình ảnh protocorm phát sinh từ hạt Thạch hộc trong môi trường nuôi
cấy sau 40 và 60 ngày ......................................................................................... 25
Hình 3.2. Hình ảnh protocorm sinh trưởng trên môi trường có nồng độ BAP
khác nhau ............................................................................................................. 26
Hình 3.3. Hình ảnh protocorm sinh trưởng trên môi trường có bổ sung
saccharose sau 8 tuần nuôi cấy ............................................................................ 28
Hình 3.4. Chồi phát sinh từ cụm protocorm trong môi trường chứa 100ml/l
nước dừa .............................................................................................................. 29
Hình 3.5. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh chồi từ cụm
protocorm ............................................................................................................ 30
Hình 3.6. Ảnh hưởng của BAP tới sự nhân nhanh chồi lan Thạch hộc ............. 32
Hình 3.7. Ảnh hưởng của chuối xanh và khoai tây lên sự phát triển lan Thạch hộc .... 34
Hình 3.8. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan Thạch hộc ...... 35
Hình 3.9. Hình ảnh cây lan thạch hộc con sinh trưởng trên các loại giá thể khác
v
nhau sau khi ra chai và huấn luyện tại vườn ươm .............................................. 37
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
Chữ viết tắt (ký hiệu) Tên đầy đủ
ABA Abscisic acid
ADN Acid deoxyribonucleic
APG III Angiosperm Phylogeny Group
III
B1 Thiamine
B2 Riboflavin
BAP 6 - Benzyl adenin purine
EAC Ehrlich ascites cells
GA3 Gibberellic acid
IAA Indol - 3 - acetic acid
IBA Indol - 3 - butyric acid
Kinetin 6 - furfurryl - aminopurin
MS Murashige and Skoog
PM Phytamax
RE Robert Ernst
VW Vacin Went
USA United States of America
2,4 - D 2,4 - Dichlorophenoxy acetic
acid
vi
α - NAA α - Naphthalene acetic acid
MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bảo tồn và phát triển các loài cây dược liệu dân gian đang trở thành vấn
đề cấp thiết, do tình trạng khai thác bừa bãi, thiếu khoa học cũng như sự giảm
nhanh diện tích rừng tự nhiên, điều đó đã và đang làm giảm trầm trọng nguồn
cây thuốc trong tự nhiên trong đó bao gồm cả các loài lan làm thuốc, đại diện
điển hình là dược liệu lan Thạch hộc thuộc chi lan Hoàng thảo.
Trên thế giới, chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) có khoảng 1400 loài, chủ
yếu phân bố ở Đông Nam Á và các đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia,
Papua New Guinea, Đông Bắc Australia. Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ, phân
bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển. Tuy nhiên, do
nhiều nguyên nhân khác nhau, đến nay nhiều loài đã bị tuyệt chủng hoặc bị đe
dọa. Tình trạng khai thác đến cạn kiệt hầu hết các loài phong lan rừng ở nước ta
đang xảy ra mạnh, điển hình như vùng Tây Nguyên và các tỉnh phía Bắc như Hà
Giang, Yên Bái, Thái Nguyên... gây nguy cơ tuyệt chủng cao một số loài phong
lan quý hiếm.
Hoa Phong Lan không chỉ có tác dụng làm đẹp cho không gian sống mà
còn là bài thuốc có tác dụng chữa bệnh thần kỳ. Trong đó có thể kể đến lan Kim
tuyến được dùng trong điều trị các bệnh như trị đau bụng, sốt cao, rắn cắn, bệnh
tiểu đường, bệnh viêm thận, huyết áp cao, yếu sinh lý, phòng ngừa u bướu và
chữa các bệnh tim mạch; Lan Phi Điệp, Hoàng thảo đùi gà trị các chứng suy
nhược cơ thể, thần kinh suy nhược, đau họng và yếu sinh lý ở nam giới. Lan
Thạch hộc được dùng chữa ho lao, sốt nóng, khô cổ, ho, đau họng, khát nước
thuộc chứng âm hư, nóng trong, đau lưng, chân tay nhức mỏi, ra mồ hôi trộm,
thiểu năng sinh dục ở nam giới, di tinh, đau dạ dày, viêm ruột…
Hiện nay, lan rừng đang bị khai thác cạn kiện do nhu cầu chơi hoa cũng
như nhu cầu thu hái làm thuốc. Các thương lái Trung Quốc đã tràn sang các tỉnh
phía bắc Việt Nam và săn lùng, thu mua số lượng lớn các loại lan có tác dụng
1
làm thuốc. Vì vậy việc bảo tồn nguồn dược liệu tự nhiên là rất cần thiết.
Thông qua phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật với hệ số nhân
giống cao có thể tạo ra rất nhiều cây con in vitro đồng đều mang các đặc điểm
ưu việt mong muốn mà không phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết… góp phần thực
hiện công tác bảo tồn nguồn gen phong lan tốt hơn. Thêm vào đó, phương pháp
nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng thực vật có thể tạo ra các cây con sạch virus từ cây
mẹ đã bị nhiễm bệnh (phục tráng giống cây trồng). Hơn nữa, nuôi cấy mô, tế
bào còn cung cấp nguyên liệu cho việc tạo ra giống mới bằng công nghệ gen, lai
soma, chọn dòng tế bào… mang các đặc điểm tốt như có hoạt tính sinh học cao,
có khả năng kháng bệnh virus, chịu hạn, chịu các yếu tố bất lợi từ môi trường.
Từ các lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài "Nghiên cứu nhân giống
in vitro lan Hoàng thảo Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl.)"
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro lan rừng
Dendrobium nobile Lindl, góp phần cho công tác bảo tồn và cung cấp giống lan
Thạch hộc.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu đối với lan Thạch hộc.
2. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên quá trình
tái sinh chồi, sự phát triển chồi và ra rễ của lan Thạch hộc in vitro.
2
3. Nghiên cứu giá thể phù hợp để ra cây đối với lan Thạch hộc.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PHONG LAN
1.1.1. Phân loại và nguồn gốc
Họ lan hay họ Phong lan (Orcchidaceae) là một họ thực vật có hoa, thuộc
bộ măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm (monocotylendons). Họ
Phong lan là một trong những họ thực vật lớn nhất và phân bố khắp nơi trên thế
giới. Phong lan chủ yếu mọc bám trên các cây cao trong rừng và ở các khu rừng
nhiệt đới. Bên cạnh đó cũng có các loài mọc trong đất và được gọi là địa lan và
có một số loài mọc trên đá tức thạch lan. Họ lan đã biết khoảng 28.000 loài tự
nhiên và 100.000 lai ghép, 850 chi chiếm khoảng 10% của các loài thực vật có
hoa.
• Nhiệt đới châu Mỹ: 250 - 270 chi
• Nhiệt đới châu Á: 260 - 300 chi
• Nhiệt đới châu Phi: 230 - 270 chi
• Châu Đại Dương: 50 - 70 chi
• Châu Âu và ôn đới châu Á: 40 - 60 chi
• Bắc Mỹ: 20 - 25 chi
Danh sách dưới đây liệt kê sự phân bố của họ này:
Ở Việt Nam có 137 đến 140 chi gồm trên 800 loài lan rừng, bao gồm địa
lan, thạch lan và phong lan, phân bố rộng khắp cả nước .
Theo đặc điểm của thân cây, phong lan được chia làm hai nhóm là nhóm
cây đơn thân (monopodia) và nhóm cây đa thân (sympodia). (1) Thuộc nhóm
cây đơn thân thì cây chỉ có một trụ phát triển duy nhất, lá mầm từ đỉnh mọc
thêm hàng năm kéo theo thân cây phát triển dài ra có thể đạt kích thước tối đa
tới vài mét. (2) Thuộc nhóm cây đa thân thì một thân mầm chỉ phát triển đến
một kích thước nhất định, sau đó ngừng phát triển và có các thân mầm khác phát
triển thay thế. Thân mầm phát triển từ mắt cây. Các mắt cây phát triển đến một
3
kích thước nào đó sẽ phát triển thêm lá và rễ tạo nên một thân cây. Thân cây cứ
phát triển theo cách này tạo nên một tập hợp phân nhánh các thân cây mọc từ
gốc ban đầu [6].
1.1.2. Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)
a. Phân loại chi lan Hoàng thảo
Chi lan Hoàng thảo có tên khoa học là Dendrobium thuộc họ thực vật
Orchidacea, là một chi hoa rất lớn bao gồm trên 1500 loài, sinh sống tự nhiên
trong một khu vực trải rộng từ Triều Tiên, Nhật xuống Mã Lai, Indonesia, đến
Úc và New Zealand. Dendrobium là chi lan lớn thứ 2 trong họ hoa lan đứng sau
lan lọng. Lan Hoàng thảo rất phong phú và đa dạng với hơn 1600 loài, phân bố ở
các vùng châu Úc, châu Á tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á. Lan
Dendrobium là một họ lan nhiều sắc thái bao gồm cả những loài rụng lá và loài
có lá xanh quanh năm. Đa số lan tự nhiên thuộc loài cộng sinh, sống bám trên
cây hoặc trên đá, có những giả hành dài từ vài cm (D. leucocyanum) đến vài
thước (D. discolor), thân gầy, uốn cong khi phát triển hoặc mập mạp và đứng
thẳng. Lan Dendrobium có thể có lá thon nhỏ, mọc chéo theo suốt chiều dài của
thân. Lá nơi gốc có thể mọc bao kín chồi.Cần hoa cũng dài hay ngắn khác nhau,
từ vài cm đến 1m. Cây mang từ 1-4 hoa (D. nobile) nhưng cũng có thể đến cả
100 hoa (D. speciosum). Những cây rụng lá, thường mất lá sau 1-2 năm và hoa
mọc ra từ các thân trơ trụi, trong khi đó những cây không rụng lá thường trổ hoa
từ thân sau khoảng 1 năm và tiếp tục ra hoa trong nhiều năm kế tiếp. Do sự đa
dạng nên các nhà sưu tập và trồng Dendrobium đã tạm phân loại chúng dựa theo
một số điểm tương đồng, về cách sống, mùa nghỉ và mùa hoa. Một số nhóm
tiêu biểu như:
(1) Callista : Không rụng lá, đa số có giả hành. Có từ 1-6 lá mọc phía
trên đỉnh giả hành. Cần hoa xuất hiện vào mùa Xuân, thường cong vòng và
mang nhiều hoa màu vàng, trắng, tím nhạt. Trong nhóm này có những loài như
Den. chrysotoxum (Hoàng lạp), Den. densiflorum (Thủy tiên vàng), Den.
farmeri (Thùy tiên trắng), Den. Lindleyi và Den. Thyrsiflorum
(2) Spatulata : thường được gọi là nhóm lan 'Hoàng thảo-sừng sơn
4
dương', do hoa có đôi cánh dài và mọc xoắn như sừng antelope. Không rụng lá,
giả hành to, cao. Ra hoa một lượt với nhiền cành hoa, hoa lâu tàn. Được xem là
nhóm dễ trồng. Trong nhóm có Den. antenatum, Den. canaliculatum, Den.
discolor, Den. gouldii, Den. johannis, Den. lineale, Den. sratiotes, Den.
strebloceras và Den. Laurinum.
(3) Dendrobium : Rụng lá và giả hành mọc rũ xuống. Hoa mọc ra gần
đầu các cành già không còn lá. Cây cần có mùa đông lạnh để trổ hoa. Nhóm này
có Den. Anosmum (Phi điệp), Den. chrysanthum, Den.falconeri, Den.
fimbriatum, Den. findlayanum, Den.friedricksianum, Den. heterocarpum,
Den.loddigesti, Den. moniliforme, Dem. Nobile (Thạch hộc), Den. Parishii
(Trầm), Den. primulinum, Den. transparent và Den. wardianum
(4) Formosae: Lá không rụng, hẹp; giả hành mọc thẳng đứng có những
đám lông đen nơi nối kết của lá. Hoa trắng, lớn đến 10 cm, có những điểm vàng,
cam, lục hoặc tím. Trong nhóm có Den. bellatulum (Bạch hỏa hoàng), Den.
draconis (Nhất điểm hồng), Den. formosum (Bạch nhạn), Den. infundibulum,
Den. lowii, Den.lyonii, Den. margaritaceum, Den. sanderae
(5) Latura : Không rụng lá, có giả hành dày, to cỡ trung bình. Hoa
thường màu vàng-xanh đến xanh lục gồm Den. atroviolaceum, Den. johnsoniae,
Den macrophylum, Den. spectabile.
(6) Oxyglossum : Nhóm lan rừng, nhỏ, không rụng lá, gặp tại vùng núi
cao. Hoa lâu tàn , nhiều màu sắc. Gồm Den. bellwigianum, Den. cuthbersonii,
Den. laviefolium, Den. vexillarius
Bên cạnh đó, có thể căn cứ vào đặc điểm sinh trưởng và dạng thân, lan
Dendrobium được chia thành 2 nhóm chính là (1) Nhóm thân mềm: Có đặc
điểm là các giả hành buông lõng hoặc rủ xuống, thường thấy ở vùng khí hậu
lạnh, gồm các giống được lấy ở vùng cao nguyên Việt Nam, Miến Điện…, trên
độ cao 1000 m; (2) Nhóm thân cứng: Mọc thẳng đứng thường ở vùng nóng hơn
(Malaysia, Indonexia…).[8]
b. Các điều kiện cơ bản để nuôi trồng lan Dendrobium
- Ánh sáng: Lan cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trời nhưng
5
cần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng. Khi thấy cây quặt quẹo, đó
là dấu hiệu thiếu nắng, hãy đưa cây ra chỗ có nhiều nắng hơn nhất là vào mùa
đông, nếu thiếu nắng cây khó ra hoa.
- Nhiệt độ: Lan cần nuôi trong nhiệt độ từ 8 - 25°C tuy nhiên lan có thể
chịu nóng tới 38°C và có thể chịu lạnh tới 3,3°C. Ngoài ra nếu vào mùa đông
lạnh dưới 15,6°C trong vòng 4 - 6 tuần lan sẽ khó ra nụ.
- Độ ẩm và thoáng gió: Lan mọc mạnh nếu độ ẩm từ 60 - 70%. Nếu độ ẩm
quá thấp cây non sẽ không lớn được và bị teo đi. Cây cũng không mọc mạnh nếu
không thoáng gió và trong thời kỳ lan ra nụ nếu không thoáng gió nụ sẽ ít đi.
- Giá thể: Với một số loài lan trồng không cần dùng đến giá thể vẫn sinh
trưởng tốt, nhưng nếu môi trường sống có giá thể vẫn tốt hơn. Giá thể của lan
gồm những thứ dễ kiếm, nhiều khi không cần mất tiền mua vì có sẵn trong tự
nhiên. Những chất liệu này không phải vùng nào cũng giống nhau và chúng
được chọn tùy theo điều kiện ngoại cảnh, nhân lực, loài lan và qui mô sản xuất.
Những loại giá thể thường sử dụng như vỏ thông, mùn cưa, vụn dớn, vỏ dừa,
rêu...
- Tưới nước: Vào mùa hè khi lan ra mầm non và mọc mạnh, tưới 2 - 3 lần
một tuần. Vào mùa thu, khi cây đã ngừng tăng trưởng nên tưới nước thưa đi,
mỗi tuần chỉ cần tưới 1 lần cho thân cây khỏi bị teo lại. Vào mùa đông, đây là
thời gian lan chuẩn bị để ra hoa, ngưng hẳn việc tưới nước. Nếu độ ẩm quá thấp
nên phun sương mỗi tháng 1 - 2 lần [26].
c. Sâu bệnh và các vấn đề khác
Vì lan Dendrobium cần được bón nhiều loại phân hữu cơ khác nhau và
môi trường giá thể sẽ mục nát sau một thời gian trồng cây nên đã tạo điều kiện
cho nhiều loài sâu bệnh gây hại, một số bệnh thường gặp và cách điều trị:
+ Bệnh hại trên lan
- Bệnh đen thân cây lan: Do nấm Fusarium sp. gây nên, cách phòng trị là
tách những cây bị bệnh để riêng và dùng thuốc phòng trừ hay nhúng cả cây vào
thuốc trị nấm. Với cây lớn hơn thì cắt bỏ phần thối rồi phun thuốc diệt nấm như
6
Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000.
- Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora sp. gây nên, bệnh thường phát sinh
mạnh trên cây lan Dendrobium sp., gây hại trong mùa mưa ở những vườn lan có
độ ẩm cao, phòng trừ bằng các thuốc diệt nấm như Carboxin 1/2000; Zineb
3/2000; Benlat 1/2000.
- Bệnh thán thư: Do nấm Collectotrichicum sp. gây ra. Bệnh phát triển
mạnh vào mùa mưa nên phải phòng trừ trước, thường cắt bỏ lá vàng rồi phun
thuốc diệt nấm 5 - 7 ngày/1 lần.
- Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây ra. Vết
bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo
chiều rộng của lá. Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh
mô bệnh khô tóp có màu trắng xám.
Để phòng trừ bệnh do nấm, trước hết cần bảo đảm cho cây đủ dinh dưỡng
và tỷ lệ N:P:K cân đối. Dư N và thiếu K thường làm cho lá mềm, dễ nhiễm bệnh.
Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho lá. Lá bị gãy do dư N, thiếu K hay do
thiếu ánh sáng. Không tưới dư nước vì dễ làm cho rễ úng và thối. Phun thuốc
phòng ngừa thường xuyên 1 tháng 1 - 2 lần. Nếu thấy bệnh xuất hiện cần phun
nhiều hơn (1 tuần 2 - 3 lần) cho đến khi triệu chứng bệnh giảm thì trở lại phun
theo cách phòng ngừa.
+ Sâu hại lan:
- Rệp vảy: Rệp thường bám trên các thân giả hành còn non, phòng trị
bằng cách dùng bàn chải chà xát rồi phun dung dịch thuốc Malathion 50 pha
loãng.
- Bọ trĩ: Gây hại chủ yếu trong mùa nắng, dùng Malathion 5 mg/bình 4 lít
nước, phun 1 tuần/lần, phun liên tiếp liên tục trong 3 tuần [26].
1.2. MỘT SỐ LOÀI LAN DENDROBIUM DÙNG LÀM THUỐC
1.2.1. Lan Thạch hộc
Đây là loài lan được dùng làm thuốc lâu đời nhất tại Trung hoa, Nhật và
cũng là cây được nghiên cứu sâu rộng nhất về dược tính và ứng dụng làm thuốc
kể cả các thuốc đặc chế. Lan Thạch hộc phân bố khá rộng từ vùng Himalaya,
7
Assam, Nepal, Bhutan, Myanmar, Trung Hoa, Thái, Lào, Việt Nam. Cây được
dùng làm 'cây gốc' để lai tạo thành nhiều chủng loại cho hoa có mùi thơm và đủ
màu sắc.
Loài lan Thạch hộc thuộc chi Dendrobium bao gồm một số loài quý hiếm
đang cạn kiệt trong thiên nhiên. Tên Thạch hộc, theo Trung Hoa, “thạch” là đá;
“hộc” là đơn vị đo lường, “Thạch hộc” có nghĩa là lan mọc trên những tảng đá
to cỡ một hộc. Đây là cây lan được dùng làm thuốc lâu đời nhất tại Trung Quốc,
Nhật Bản và cũng là cây được nghiên cứu sâu rộng nhất về dược tính và ứng
dụng làm thuốc kể cả các thuốc đặc chế .
Thạch hộc khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng, những cây mọc hoang dã
đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy
cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do đó nguồn cung cấp tự nhiên đã cạn
kiệt, cấm thu hái và buôn bán. Một số loại Thạch hộc thường gặp bao gồm:
- Thạch hộc Rỉ sắt (Thiết bì Thạch hộc - Dendrobium nobile Lindl.) với
đặc trưng vỏ cây có màu xanh tía nên còn được gọi là thạch hộc tía, là cây thảo
bản phụ sinh lâu năm, sống bám vào cây gỗ lớn rừng nguyên sinh có độ ẩm cao
hoặc ở vách đá ẩm ướt, ưa khí hậu ẩm và râm mát, có giá trị độc đáo về dược
phẩm.
- Thạch hộc Lưu tô (đuôi ngựa) phân bố chủ yếu ở Quý Châu, Vân Nam,
Quảng Châu ở độ cao 600 - 1700 m, phụ sinh trên cây gỗ rừng kín hoặc vách đá
ẩm ướt, phân bố ở nhiều nước Ấn Độ, Nê Pan, Xích Kim, Bu Tan, Myanma,
Thái Lan, Việt Nam. Loài này rất dễ sinh trưởng, mọc nhanh, năng suất cao,
cũng có tác dụng nhất định về công năng dược liệu.
- Thạch hộc Kim thoa cũng là cây thảo bản lâu năm, mọc thành bụi, phân
bố chủ yếu ở Quý Châu, Tứ Xuyên, Quảng Tây (Trung Quốc), cũng có công
dụng làm thuốc chữa một số bệnh.
- Thạch hộc Cầu hoa thân đứng hoặc nghiêng, mọc trên cây gỗ rừng độ
cao 750 - 1.800 m, hoa rất đẹp, thường dùng làm cây cảnh.
- Thạch hộc Cổ chùy là cây thảo bản phụ sinh lâu năm, mọc bám vào cây
gỗ rừng thường xanh hoặc vách đá rừng thưa, độ cao 500 - 1600 m, phân bố ở
8
Ấn Độ, Myanma, Thái Lan, Lào, Việt Nam.
- Thạch hộc Hooc sơn phân bố ở huyện Hooc Sơn, An Huy - Trung Quốc,
có công dụng làm dược liệu để chữa một số bệnh.
- Thạch hộc Thủy thảo rất dễ trồng, sinh trưởng nhanh, năng suất cao,
cũng có công năng làm dược liệu.
Trong đó Thạch hộc rỉ sắt là quý nhất được đánh giá là tuyệt phẩm của Thạch
hộc. Thạch hộc rỉ sắt là loài cây có nguy cơ tuyệt chủng, được ghi vào sách đỏ, là dược
liệu quý hiếm được pháp luật bảo hộ nghiêm ngặt. Quý tộc thời Trung Hoa cổ đại coi
Thạch hộc rỉ sắt là “nàng tiên” hay “cỏ cứu mệnh”, được dùng trong nhiều vị thuốc và
chữa được nhiều bệnh theo kinh nghiệm của dân gian [22].
1.2.2. Hoàng thảo ngọc trúc - Dendrobium moniliforme
Phong lan với thân cao khoảng 30 - 40 cm gồm nhiều đốt, mỗi đốt dài chừng
2.5 cm, màu vàng tươi. Lá mọc cách hình thuôn chừng 3-5 cm x 0.5 - 1.2 cm. Hoa
mọc từng chùm 2-3 chiếc, ở các đốt trên thân cây già đã rụng lá. Hoa có nhiều màu
như trắng, hồng, tím, vàng nhạt và xanh. Hoa lớn cỡ 3-4 cm, lâu tàn và rất thơm. Cây
phân bố rất rộng: Trung Hoa, Taiwan, Bhutan, Ấn, Nhật, Hàn, Myanmar, Nepal, Việt
Nam. Trong cây có những hợp chất phenanthrene-quinones như denbinobin, có hoạt
tính chống sưng và tạo tiến trình apoptosis nơi tế bào. Cây còn có những sesquiterpene
glucosides và phenolic glycosides như copacamphane, picrotoxane có những hoạt tính
kích ứng miễn nhiễm. Dendroside A, C và vaniloside có hoạt tính kích thích sự sinh
sản tế bào B, đồng thời ức chế sự bội sinh tế bào T. Dịch chiết bằng methanol toàn
cây cho những alkyl ferulates có hoạt tính chống oxy-hóa. Dịch chiết bằng methanol
từ rễ có hoạt tính hạ nhiệt khi thử [8].
1.2.3. Dendrobium officinale
Cây lan hầu như ít được nhắc đến trong các sách vở nghiên cứu, nuôi trồng lan
và chỉ được mô tả trong các bài viết y dược tại Trung Hoa. Theo Ủy Ban Chế dược
thư (Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010) thì D. officinale được xếp vào loại
cây thuốc giúp đề kháng ung thư và tăng tuổi thọ. Những nghiên cứu khoa học ghi
nhận D. officinale có polysaccharides trong cây cải thiện, tăng cường sức đề kháng tế
bào khi thử trên chuột, hoạt tính chống oxy-hóa của các polysaccharides tổng cộng và
9
polysaccharide tinh chế DCPP3c-1 (trích từ môi trường cấy mô D. officinale) đã được
chứng minh qua các thử nghiệm 'in vitro'. Dịch chiết từ D. officinale có hoạt tính làm
hạ đường khi thử trên chuột bị gây tăng đường trong máu bằng adrenaline và bằng
streptozotocin do cách tác động kích thích sự bài tiết insulin từ tế bào beta, đồng thời
ngăn sự bài tiết glucagon từ tế bào alpha, ngoài ra còn làm giảm sự phân hủy của
glycogen trong cơ thể, làm tăng tổng hợp glycogen trong gan. D. officinale là một
trong 5 dược thảo có chứa chrysotoxene, erianin và confusarin là những chất có hoạt
tính diệt bào khi thử (in vivo và in vitro) trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau [8].
1.2.4. Các Dendrobium khác
Một số Dendrobium khác đã được nghiên cứu về hoạt chất cùng khả
năng trị bệnh như:
- Dendrobium densiflorum: Trong cây có Scopoletin và Scoparone có
hoạt tính ngăn chặn sự kết tụ tiểu cầu.
- Dendrobium chrysanthum: Trong đọt có erianin có hoạt tính diệt bào
chống sự bội sinh của tế bào ung thư máu HL-60 do khả năng tạo tiến trình tự
hủy (apoptosis) và gây trở ngại cho sư phân lập bcl-2 và gen bax trong HL-60.
Erianin còn có tác động làm teo bướu ung thư , gây hoại tử tế bào ung thư và
chặn sự chuyển vận dưỡng chất qua vi mạch tế bào ung thư khi thử trên tế bào
ung thư gan hepatoma Bel7402 và melanoma A375 [8].
- Dendrobium amoenum var. denneanum: Hợp chất loại dihydrostibene,
isoamoenylin có hoạt tính chống oxy-hóa khá mạnh.
1.3. GIÁ TRỊ DƯỢC LIỆU CỦA LAN THẠCH HỘC
1.3.1. Đặc điểm thực vật học
Thạch hộc rỉ sắt (Dendrobium nobile Lindl.) thuộc nhóm cây đa thân,
thân mọc khỏe chia nhiều đốt ngắn, có nhiều rễ khí sinh. Cây biểu sinh trên cây
gỗ hay vách đá, cao 30-60 cm, đường kính 1,3 cm, thường mọc thành khóm.
Thân hơi dẹt có rãnh dọc, khi khô có màu vàng rơm. Lá mọc so le hai bên thân
dài 6-12 cm, rộng 1-3 cm, không lông, dễ rụng. Hoa to xếp thành bó 1-4 cái ở
sát nách lá, hoa dài 4-4,5 cm, rộng 3-3,5 cm, màu hồng tía ờ chót đầu của cánh
hoa, chuyển sang trắng vào phía trung tâm; ở họng của cánh môi có một chấm to
10
màu hạt dẻ. Quả nang hơi hình thoi, khi khô tự mở theo các rãnh dọc.
Hình 1.1. Cây và hoa lan Thạch hộc [28]
Lan Thạch hộc phân bố khá rộng từ vùng Himalaya, Assam, Nepal,
Bhutan, Myanmar, Trung Hoa, Thái Lan, Lào, Việt Nam.... Cây được dùng làm
'cây gốc' để lai tạo thành nhiều chủng loại cho hoa có mùi thơm và đủ màu sắc.
Ở Việt Nam loài này phân bố rộng trên toàn quốc tập trung ở vùng núi
phía bắc, ngoài ra loài này còn phân bố ở các tỉnh như Thanh Hóa, Nghệ An,
Lâm Đồng…
Thạch hộc rỉ sắt thường mọc ở những cây cao, cổ thụ hoặc ở những hốc
đá nhỏ ẩm ướt. Cũng như các loài lan khác chúng ưa nơi có độ ẩm trong không
khí cao và cường độ ánh sáng vừa phải [23].
1.3.2. Thu hái và chế biến
Trữ lượng Thạch hộc của ta rất phong phú, nhu cầu làm thuốc và xuất khẩu
cũng rất nhiều nhưng ở thị trường không có bán vì Thạch hộc là một loại dược liệu
hiếm gặp, khai thác khó khăn tốn kém, trong thân cây có chất dịch keo quánh, vỏ
dày, phơi rất lâu khô, nếu không được nắng mà bị mốc đen mất phẩm chất thì
không bán được. Do đó ít người thu hái chế biến để bán.
Vậy thu hái Thạch hộc phải chọn thời gian nắng lâu để có điều kiện phơi
khô. Nên tổ chức phơi, sấy tại chỗ nơi có dược liệu, vừa sẵn củi để sấy khô, vừa
đỡ phải chở cây tươi về, tốn nhiều công sức cước phí.
Thạch hộc thu hái về, cắt bỏ lá rễ, lấy thân trước trên luộc lên rồi phơi
11
nắng cho chóng khô, sau sấy thêm và xông diêm sinh cho vàng và khô đều. Ở
những nơi có nhiều dược liệu và có điều kiện tập trung thì nên xây lò sấy như
một gian chuông kín, làm giàn nhiều tầng để rải mỏng dược liệu từng lớp, đốt
than củi mà sấy, và trở luôn cho đều, thì không cần phải luộc trước. Tiện nhất là
làm lò sấy bằng tôn, để lưu động. Và nếu khai thác với quy mô lớn thì tốt nhất
xây lò gạch chịu lửa kiểu như lò bánh mỳ, đốt lò để sấy với hơi nóng hẩm đều
thì phẩm chất đảm bảo và sau không cần xông diêm sinh nữa.
Cao Thạch hộc: Để khỏi phải phơi sấy phức tạp và chuyên chở công kềnh
tốn công, ta nên nấu cao thạch hộc tại chỗ: đập dập thân cây, cắt khúc nấu, lọc,
cô thành cao, 100kg dược liệu tươi cho 8 lít cao lỏng như mật ong, dùng rất tốt
và rất tiện trong việc trị bệnh cũng như tẩm bổ [1].
1.3.3. Công dụng và thành phần hóa học
Thạch hộc làm thuốc có nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quý. Thạch
hộc tía giàu polysacharide Thạch hộc, alkaloid Thạch hộc, các acid amine và
nhiều chất khoáng kali, canxi, magie, mangan, đồng, titan và nhiều nguyên tố vi
lượng, trong đó polysacharide Thạch hộc tới 22%, hàm lượng các acid amine
như glutamic, asparagic, glucin chiếm tới 35% tổng lượng acid amine.
Ngoài ra, Thạch hộc tía còn có những hợp chất đặc thù như este và các
chất phenanthryn, bibenzyl, keton, nhầy, hợp chất amidon. Trong thân Thạch
hộc tía có hàm lượng alkaloid sinh học chiếm tới 0,3%, trong đó những chất
amine đã được giám định cấu trúc gồm dendrobine, dendramine, nobilonine,
dendrin, 6-hydroxy-dendroxine, shiunin, shihunidine và muối amoniac N-
methyl-dendrobium, các chất này có vị hơi đắng. Thân Thạch hộc có dầu bay
hơi, trong đó có chất manool của hợp chất ditecpen chiếm hơn 50%.
Giá trị: Trong cổ thư đông y Trung Quốc cách đây hơn 1.000 năm đã xác
định ở Trung Quốc có 9 loại tiên dược được xếp theo thứ tự như sau: Thạch hộc,
Tuyết liên, Nhân sâm, Thủ ô, Phục linh, Tùng dung, Linh chi, Ngọc trai, Đông
trùng hạ thảo, trong đó Thạch hộc xếp đầu bảng. Giá trị của thạch hộc có 2 loại
12
công năng chủ yếu:
- Làm thuốc: Thạch hộc tía có giá trị độc đáo và công năng bảo vệ sức
khỏe, đã trở thành sản phẩm bổ dưỡng từ lâu đời. Nghiên cứu về dược lý hiện
đại, Thạch hộc tía có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng
của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu, được sử dụng rộng rãi trong
lâm sàng và làm các bài thuốc. Thạch hộc tía có thể dùng đơn độc hoặc phối
trộn với các dược liệu khác, đã có hơn 100 bài thuốc từ Thạch hộc được thị
trường đón nhận. Trong dược điển có đề cập đến nhiều loài Thạch hộc nhưng tốt
nhất vẫn là Thạch hộc tía.
- Làm thực phẩm: Cách sử dụng làm thực phẩm có nhiều cách như nấu súp
với hồng sâm, với bách sa sâm lợi phổi sinh tân. Ngoài ra có thể nấu cháo Thạch hộc,
trà Thạch hộc và nhiều món ăn khác. Những năm gần đây công năng làm thực phẩm
chức năng đã được khám phá thêm, là sản phẩm thiên nhiên an toàn và bổ dưỡng.
Thạch hộc tía có vị hơi ngọt hơi đắng vào 3 kinh phế, vị, thận, công năng tư âm,
thanh nhiệt, chỉ khát, hư hao, gầy yếu, miệng khô [22].
1.3.4. Các vị thuốc chứa thạch hộc
Thạch hộc giúp tiêu hóa, bổ âm sinh tân dịch, giúp tiêu hóa khỏi nôn ọe,
háo khát, chữa bệnh sốt âm kéo dài, người gầy khô do tinh dịch hao kém, dùng
12-20g phối hợp với các vị khác.
Chữa bệnh ôn nhiệt, nóng ẩm khô rát, mất nước: dùng Thạch hộc, Mạch
môn, Huyền sâm, Sa sâm nam mỗi vị 20g sắc uống. Hoặc dùng cao thạch hộc
uống một thìa 3ml, ngày uống 3-4 lần.
Chữa bệnh âm hư hỏa bốc, người gày sạm đen, khô khát, thổ huyết, ra máu
mũi, dùng phương “Tư âm giáng hỏa” của Lãn Ông: Thạch hộc, Sinh địa, Thục
địa, Đơn sâm, Sa sâm, Thiên môn, Ngưu tất mỗi vị 16g, Ngũ vị tử 3g sắc uống.
Chữa lao phòng quá độ, hao nhiều tinh khí, hoặc thức đêm mất ngủ, ngồi lâu
làm việc trí óc sinh đau lưng mệt mỏi, hỏa bốc nhức đầu ù tai, đỏ mồ hôi trộn, khó
ngủ, chán cơm dùng cao Thạch hộc uống mỗi lần 4ml, ngày uống 3-4 lần.
Chữa di tinh, đái đường: Thạch hộc, Kim anh tử mỗi vị 16g sắc uống với
13
bột Hoài sơn, củ Súng mỗi vị 12g, chia làm 3 lần [1].
Các dụng chính của Thiết bì thạch hộc
- Bổ dưỡng tân dịch
“Đại từ điển dược học Trung Quốc” gọi Thiết bì thạch hộc là “chuyên bổ khí
dịch phế vị, khí dịch xung vượng, thận thủy tự sinh”, tốt cho bổ âm sinh dịch, trị
chứng thiếu âm dịch, giúp cải thiện rõ rệt triệu chứng tinh thần ủ rũ, sắc diện nhợt
nhạt, mắt khô thần sắc trì trệ, đau lưng mỏi gối, chóng mặt lao lực, táo bón [23].
- Tăng cường thể chất
Thiết bì thạch hộc có công dụng tư dương dưỡng huyết, “Dược tính luận”
của đời Đường có ghi chép thiết bì thạch hộc có thể bổ thận tích tinh, dưỡng vị âm,
ích khí lực, trong thạch hộc có chứa nhiều polisaccharide, nghiệm chứng chứng
minh polisaccharide trong thạch hộc có tác dụng tăng cường miễn dịch, có thể tăng
cường khả năng nuốt tế bào hồng cầu của đại thực bào (macrophage) [23].
-Bổ ích tỳ vị
Thiết bì thạch hộc là vị thuốc ích vị sinh dịch. Trong “Thần nông bổn
thảo kinh”, “Bổn thảo tái tân” đều có ghi chép, gọi là “thuốc trường vị”, là thuốc
thường dùng để trị đau dạ dày, đau thượng vị. Thực nghiệm y học hiện đại cho
thấy, thiết bì thạch hộc có tác dụng ức chế hiệu quả vi khuẩn Hecolibacter pylori
gây bệnh thường gặp trong bệnh tỳ vị, giúp ích cho việc trị liệu các chứng bệnh
dương tính với Hecolibacter pylori như viêm dạ dày teo, viêm dạ dày bề mặt
nông, loét tá tràng,… Bên cạnh đó, sử dụng thiết bì thạch hộc còn thúc đẩy tiết
dịch vị, tăng cường chức năng dạ dày [23].
- Bảo vệ gan, lợi mật
Thiết bì thạch hộc có tác dụng lợi mật khá tốt. Nhiều thế hệ thầy thuốc
đều cho rằng “Thiết bì thạch hộc” có tác dụng bổ gan âm, là vị thuốc quan trọng
để trị liệu các loại bệnh gan mật, có thể dùng để chữa viêm gan, viêm túi mật ,
sỏi mật [23].
- Mạnh gân cốt giảm mỡ
Khi chúng ta bước vào tuổi trung niên, âm dịch bắt đầu suy yếu, chức
năng gân cốt dần giảm sút, thiết bì thạch hộc có thể bồi bổ âm dịch, âm dịch có
14
thể bôi trơn khớp xương, nhờ đó đạt hiệu quả mạnh gân cường cốt, khớp xương
linh hoạt, tăng khả năng chống phong thấp. Nghiên cứu dược lý hiện đại còn cho
thấy, thiết bì thạch hộc còn tăng khả năng loại bỏ stress, có tác dụng chống mệt
mỏi, bảo vệ chống giảm oxy mô; thúc đẩy tuần hoàn, mở rộng huyết quản, qua
đó thúc đẩy tuần hoàn huyết dịch. Kết quả thực nghiệm cho thấy, thiết bì thạch
hộc cải thiện rõ rệt huyết tắc, giảm cholesteron máu và lipit, chữa bệnh tim mạch
huyết quản [23].
- Hạ đường huyết
Đông Y cho rằng, bệnh tiểu đường phát sinh chủ yếu là do cơ bệnh thận
âm hư, tỳ vị táo nhiệt, với đặc điểm bệnh lý là khí âm đều hư. Thiết bì thạch hộc
có thể dưỡng âm, thanh nhiệt, nhuận táo, từ cổ đến nay chính là thuốc chuyên
dùng để trị liệu bệnh tiểu đường. Nghiên cứu lâm sàng cho thấy, thiết bì thạch
hộc không chỉ tăng cường hoạt tính insulin, đồng thời hạ rõ rệt mức đường huyết,
khôi phục đường huyết bình thường [23].
- Ức chế khối u
Thiết bì Thạch hộc có tác dụng tiêu diệt một số tế bào khối u ác tính
trong ung thư phổi, ung thư buồng trứng và bệnh máu trắng tế bào tiền tủy bào,
có hoạt tính kháng u khá mạnh. Thực tiễn lâm sàng cho thấy, thạch hộc dùng trị
liệu phụ trợ với các khối u ác tính, có thể cải thiện bệnh trạng của người mắc
khối u, giảm bớt tác dụng phụ của xạ trị, hóa trị, tăng cường khả năng miễn dịch,
nâng cao chất lượng sống, kéo dài thời gian sống [23].
- Sáng mắt
Đông Y cho rằng “gan thông với mắt”, sinh lý bệnh lý của mắt có quan
hệ mật thiết với sự thịnh vượng âm tinh của gan, Thạch hộc có công dụng bổ âm
dưỡng mắt, được nhiều thế hệ thầy thuốc xem là thuốc quý để bồi bổ đôi mắt.
Nghiên cứu dược lý học hiện đại chứng minh, thiết bì Thạch hộc có tác dụng
làm chậm đục thủy tinh thể ở người già, có thể duy trì 36% độ trong của thủy
tinh thể, có tác dụng ức chế và sửa chữa với những biến đổi bất thường của hoạt
tính enzyme do galatoza tạo ra, bên cạnh đó còn có hiệu quả rõ rệt với việc bảo
15
vệ thị lực của thanh thiếu niên nhi đồng [23].
- Đẹp da
Con người sau khi bước vào tuổi trung niên, do âm dịch trong cơ thể
ngày càng giảm sút, từ đó đẩy nhanh tốc độ lão hóa da, khiến da trở nên khô
sạm hoặc nhăn nheo. Thiết bì Thạch hộc có chứa đa lượng chất bạch huyết, có
tác dụng dưỡng ẩm, cung cấp dinh dưỡng cho làn da [23].
-Kéo dài tuổi thọ
“Thần nông bổn thảo kinh” liệt thiết bì thạch hộc là thần dược có tác
dụng “khinh thân diên niên”. Nghiên cứu dược lý học hiện đại chứng minh, thiết
bì thạch hộc có chứa nhiều loại nguyên tố vi lượng, có quan hệ mật thiết với sức
khỏe và tuổi thọ con người, có tác dụng chống lão hóa với cơ thể người rộng rãi,
toàn diện hơn các loại dược liệu thông thường [23].
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN DENDROBIUM
1.4.1. Một số nghiên cứu trên thế giới
Bijaya Pant and Deepa Thapa (5/2012) khi nghiên cứu nhân nhanh giống
Dendrobium primulinum Lindl. có nguy cơ tuyệt chủng đã nhận thấy: Thông
qua việc nuôi cấy các đỉnh chồi có kích thước từ 0,3 đến 0,5mm trên môi trường
MS cơ bản và môi trường MS bổ sung kết hợp các chất kích thích tăng trưởng
NAA, BAP ở các nồng độ khác nhau, các protocorm hình thành đã tạo chồi và
rễ. Sau 5 tuần nuôi cấy số lượng chồi tăng nhanh nhất trên môi trường MS +
1,5mg/l BAP + 0,5mg/l NAA. Trong thí nghiệm tạo rễ, rễ được quan sát sau 3
tuần cấy thấy trên môi trường MS + IAA 0,5mg/l, cây lan ra rễ tốt nhất. Khi ra
cây trên giá thể đất sạch và rêu (dớn) tỷ lệ 2:1 thì gần 70% cây con sống sót [19].
Tháng 4 năm 2011, Sana A. & CS đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh
chồi giống lan Dendrobium nobile var. Emma từ chồi nách, sử dụng môi trường
có bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 và 3,0 mg/l và
kinetin. Qua nghiên cứu họ nhận thấy, ở môi trường có chứa 1,5 mg/l BAP kết
hợp với kinetin cho kết quả nhân chồi cao nhất. Tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất trên
môi trường chứa 2 mg/l IBA với tỷ lệ phần trăm tạo rễ (97,5%), số
lượng rễ (4,70) và chiều dài cây (3,47 cm) hiệu quả hơn so với NAA. Nồng độ
16
cao hơn của IBA và NAA (3,0mg/l) cho thấy khả năng hình thành rễ kém [20].
Tháng 8 năm 2010, Maridass M. & CS đã tiến hành nhân giống in vitro
phong lan Dendrobium nanum từ nguồn vật liệu ban đầu là thân rễ. Nghiên cứu
này được đăng trên Tạp chí Công nghệ sinh học quốc tế (2010). Vật liệu thân
rễ được rửa bằng nước cất, rửa qua ethanol 70% trong 30 giây, tiếp theo khử
trùng với hypo natri 3% (bổ sung 2 - 3 giọt Tween 80 EAC) trong 20
phút và sau đó rửa sạch cho 4 - 5 lần bằng nước cất vô trùng. Thân rễ được trẻ
ra cắt miếng nhỏ (5mm) và các mảnh rễ được cấy trên môi trường cơ bản của
MS bổ sung các chất kích thích tăng trưởng như NAA, BAP và kinetin. Các mẫu
hình thành protocorm tốt trên môi trường MS + 1,2μMkinetin + 2,0μM NAA .
Sau đó protocorm phát sinh chồi tốt nhất trên môi trường MS + 0,5μM BAP [21].
1.4.2. Một số nghiên cứu tại Việt Nam
Nguyễn Thanh Tùng và CS (2010) đã áp dụng phương pháp nuôi cấy lát
mỏng tế bào trong nhân giống in vitro cây Hoàng thảo thân gãy (Dendrobium
aduncum). Trong nghiên cứu của nhóm tác giả này, vật liệu khởi đầu là chồi in
vitro được cắt lát mỏng theo chiều ngang. Kết quả cho thấy mẫu cảm ứng tốt
trên môi trường ½ MS + 0,5 mg/l BA và tái sinh tốt trên môi trường MS + 3mg/l
kinetin + 0,3 mg/lNAA. Từ protocorm tỷ lệ chồi đạt được 5,67 chồi/mẫu [10].
Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Kim điệp (Dendrobium
chrysotoxum), Nguyễn Văn Song (2011) đã tìm ra môi trường thích hợp cho sự
nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS + 20 g/l đường saccharose+ 8 g/l
agar + 150 ml/l nước dừa + 2,0 mg/l BAP. Môi trường nhân nhanh protocorm
tốt nhất là MS + 20 g/l đường saccharose+ 8 g/l agar + 150 ml/l nước dừa + 2,0
mg/l BAP. Môi trường MS + 20 g/l đường saccharose+ 8 g/l agar + 150 ml/l
nước dừa + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ
protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro. Môi trường MS + 20 g/l đường
saccharose+ 8 g/l agar + 150 ml/l nước dừa + 1,0 mg/l NAA thích hợp nhất cho
sự ra rễ của chồi in vitro [11].
Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Hoàng thảo Long nhãn
(Dendrobium fibriatum), Nguyễn Thị Sơn (2011) đã khẳng định môi trường thích
17
hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS + 10 g/l đường saccharose
+ 6 g/l agar + 100 ml/l nước dừa. Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là
Knud + 10 g/l đường saccharose+ 6 g/l agar + 100 ml/l nước dừa + 60 g/l khoai tây.
Môi trường MS + 20 g/l đường saccharose+ 6 g/l agar + 100 ml/l nước dừa + 60 g/l
chuối chín là thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro. Môi trường tạo cây hoàn
chỉnh là RE + 10 g/l đường saccharose+ 1 g/l than hoạt tính + 6 g/l agar [12].
Bùi Thị Tường Thu và CS (2007), khi nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất
điều hòa sinh trưởng đến quá trình phát sinh phôi và tế bào đã đưa ra một số kết
quả về lan Dendrobium như sau: Mẫu nuôi cấy ban đầu là chồi non, được cắt
thành lát mỏng, nuôi cấy trên môi trường VW + 20 g/l đường saccharose+ 100
ml/l nước dừa + 1 g/l peptone + 1 mg/l BA + 0,3 mg/l NAA + 1 g/l AC. Sau thời
gian nuôi cấy 30 ngày, tế bào soma phát sinh trên vết cắt, tỷ lệ tạo soma là 100%
trên các mẫu nuôi cấy. Tế bào soma màu trắng sáng, được tiến hành nhân sinh
khối trên 6 môi trường thực nghiệm và kết quả thu được tế bào soma tăng sinh
mạnh mẽ trên môi trường VW + 1 mg/l BA + 0,3 mg/l NAA + 100 ml/l nước
18
dừa [13].
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Vật liệu thực vật
Chúng tôi sử dụng loài phong lan Thạch hộc tía (Dendrobium nobile
Lindl.) được người dân khai thác từ rừng thuộc địa bàn tỉnh Hòa Bình để làm vật
liệu nghiên cứu. Thu mẫu (thân và quả) vào tháng 10, 11. Quả còn xanh hoặc già
nếu chưa mở đều sử dụng để cho hạt nuôi cấy in vitro được. Chọn những quả và
các cây to khỏe và lành lặn.
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất
• Dụng cụ dùng trong nuôi cấy chủ yếu gồm:
- Bình tam giác 250ml hoặc ống nghiệm.
- Cân phân tích, máy đo pH và quỳ tím.
- Lò vi sóng.
- Nồi hấp vô trùng.
- Box cấy vô trùng.
- Dao, kéo, kẹp, panh, khay cấy, đũa thủy tinh, bông không thấm nước,
giấy lọc, đèn cồn và bật lửa…
- Phòng nuôi cấy, phòng chuẩn bị môi trường.
• Dụng cụ dùng cho ra cây
- Cốc nhựa, kéo, túi bóng nilon và ghim.
- Giá thể: vụn dớn, mùn cưa.
• Hóa chất
- Môi trường nuôi cấy: các thành phần vô cơ và hữu cơ theo môi trường
MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung một số chất kích thích sinh trưởng
như kinetin, BAP, IBA, NAA… và các thành phần than hoạt tính, agar, nước dừa,
khoai tây, chuối xanh.
- Hóa chất khử trùng là cồn (C2H5OH) 70%, hydrogen peroxide (H2O2),
thủy ngân clorua (HgCl2).
19
- Dung dịch tưới: ½ MS, nước lã.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thu và xử lý mẫu
Thân và quả lan được thu vào khoảng tháng 9, 10 thông qua những người
dân khai thác lan rừng. Thu mẫu còn tươi, nguyên vẹn lành lặn cho vào túi
nilon sạch và bảo quản ở tủ mát trong khoảng thời gian 1 tuần
2.2.2. Khử trùng mẫu hạt đưa vào nuôi cấy
Khử trùng cả quả lan xong mới tách vỏ lấy hạt nuôi cấy. (1) Trước khi khử
trùng, quả lan được rửa sạch bằng nước xà phòng loãng, sau đó, quả được đem
vào box cấy vô trùng để khử trùng bằng cồn 70% trong 30 giây rồi dung hóa chất
để khử trùng. (2) Hóa chất khử trùng là thủy ngân clorua (HgCl2) 0,1% với hai
cách xử lý khác nhau là: cho mẫu vào HgCl2 một lần với khoảng thời gian là 10
phút và cho vào hai lần với thời gian tương ứng là lần một 10 phút, lần hai 5 phút.
(3) Tráng lại bằng nước cất và tách hạt đưa vào môi trường nuôi cấy
2.2.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy về thành phần và hàm lượng của các muối khoáng,
các vitamin theo môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962). Sử dụng đường
saccharose hàm lượng làm nguồn cung cấp cacbon. Chất điều hòa sinh trưởng
nhóm cytokinin gồm có BAP hoặc kinetin và auxin (NAA); các chất bổ sung,
đường saccharose, nước dừa, agar và than hoạt tính… pH môi trường từ 5,5 - 6,0.
Chuối xanh nghiền: Chuối tiêu xanh rửa sạch, gọt vỏ cho vào luộc trong
khoảng 10 -15 phút cho chuối chín. Sau đó cho chuối vào nghiền mịn bằng máy
xay. Hàm lượng chuối bổ sung vào môi trường tùy theo yêu cầu của thí nghiệm.
Khi bổ sung chuối xanh vào môi trường nuôi cấy cần khuấy kĩ tránh vón cục
làm môi trường không đều và làm ảnh hưởng tới thí nghiệm.
Khoai tây nghiền: Khoai tây rửa sạch, gọt vỏ cho vào luộc trong khoảng
10 - 15 phút cho khoai tây chín. Sau đó cho khoai tây vào nghiền mịn bằng máy
xay. Hàm lượng khoai tây bổ sung vào môi trường tùy theo yêu cầu của thí
nghiệm. Khi bổ sung khoai tây vào môi trường nuôi cấy cần khuấy kĩ tránh vón
20
cục làm môi trường không đều và làm ảnh hưởng tới thí nghiệm.
Môi trường được đổ vào bình tam giác 250 ml khử trùng trong nồi áp suất
với nhiệt độ 121oC, áp suất 1,2 atm.
2.2.4. Bố trí thí nghiệm
Lô thí nghiêm 1: Nghiên cứu quá trình khử trùng mẫu lan Thạch hộc
đưa vào nuôi cấy mô tế bào.
Lô thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng một số yếu tố đến sự tái sinh
protocorm.
Sau khoảng 2-3 tuần vào mẫu thì sẽ xuất hiện các thể li ti gọi là
protocorm. Đây là những mầm non sẽ hình thành nên một cây mới. Cắt và chia
nhỏ chúng ra các bình môi trường khác. Từ một mẫu nhỏ hạt có thể hình thành
nên rất nhiều thể protocorm và từ thể protocorm chúng bắt đầu hình thành chồi
non. Trong lô thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành một số thí nghiệm sau :
Thí nghiệm 2.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến
quá trình nhân nhanh protocorm.
Thí nghiện 2.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến quá trình phát
sinh chồi protocorm.
Thí nghiệm 2.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng
phát sinh chồi từ protocorm.
Lô thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự nhân
nhanh và tái tạo cây hoàn chỉnh.
Chúng tôi tách lấy các cụm chồi nhỏ phát sinh từ protocorm ở lô thí
nghiệm 2 để tiến hành nhân nhanh chồi và tạo cây hoàn chỉnh. Trong lô thí
nghiệm này chúng tôi tiến hành một số thí nghiệm sau :
Thí nghiệm 3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự nhân nhanh
chồi lan Thạch hộc.
Thí nghiệm 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và
chuối xanh nghiền đến sự phát triển lan Thạch hộc.
Thí nghiệm 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của α – NAA đến khả năng ra
21
rễ lan Thạch hộc.
Lô thí nghiệm 4 : Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể đến
sinh trưởng và phát triển của lan Thạch hộc sau khi ra cây.
Khi cây con nuôi cấy mô ở lô thí nghiệm 3 đã đạt đủ tiêu chuẩn, chúng tôi
tiến hành dùng panh gắp cây con khỏi bình nuôi cấy sau đó rửa nhẹ nhàng dưới vòi
nước cho thật sạch môi trường thạch và tránh để cây bị nát, để cây con ráo nước,
rồi trồng vào cốc nhựa đựng giá thể, nguyên liệu mà chúng tôi sử dụng để làm giá
thể là mùn cưa đã được ủ hoai mục và vụn dớn.
2.2.5. Điều kiện nuôi cấy
Quá trình nuôi cấy đước tiến hành ở điều kiện:
• Nhiệt độ: nhiệt độ phòng là 25 ± 2ºC.
• Ánh sáng: thời gian chiếu sáng là 16h/ngày.
2.2.6. Các chỉ tiêu đánh giá
- Các chỉ tiêu theo dõi trong bình tam giác.
+ tỷ lệ mẫu nhiễm
+ Kích thước cụm protocrom
+ Số chồi/cụm
+ Chiều cao chồi cây
+ Số lá/chồi
+ Số rễ và độ dài rễ /cây
- Các chỉ tiêu theo dõi khi ra cây
+ Chiều cao cây, số lá và số chồi mới phát triển.
2.2.7. Xử lý số liệu
Kết quả được chúng tôi xử lí theo phương pháp thống kê sinh học trên
phần mềm tin học excel. Đây là phần mềm lập trình sẵn, các hàm sử dụng được
n
iX
1 Giá trị trung bình ( X ): X = ∑ n 1 = i
n
2
X
dựa trên công thức cơ bản của toán thống kê trong đó có công thức:
)
i
( −∑ X
i
= 1
−
1
n
Độ lệch chuẩn (δ): δ =
iX : Giá trị của từng số liệu.
Trong đó:
22
n: Số lần thí nghiệm.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG MẪU
Để đưa mẫu thân lan thạch hộc vào nuôi cấy in vitro, chúng tôi tiến hành
khử trùng theo các bước đã trình bày trong mục 2.2.2 sau đó cấy lên môi trường
MS bổ sung BAP với hàm lượng 1mg/l. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, mặc dù
các công thức khử trùng được bố trí theo cấp độ tăng dần tác động của hóa chất
vào mẫu cấy nhưng hiệu quả thu được sau 4 tuần theo dõi không tỷ lệ thuận. Ở
CT3 cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất cũng chỉ đạt 15% khi sử dụng HgCl2 để khử
trùng. Nguồn mẫu sạch thu được từ việc đưa đoạn thân vào rất hạn chế, do tỷ lệ
nhiễm cũng như tỷ lệ mẫu chết cao, có thể do nhiều nguyên nhân khách quan
khác nhau. Chính vì vậy, chúng tôi phải sử dụng nguồn mẫu quả lan, để đưa vào
nuôi cấy in vitro
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng đoạn thân lan Thạch hộc
Công thức thí nghiệm Số mẫu cấy (%) (%) (%)
Mẫu chết Số lượng 5 25,0 Mẫu nhiễm Số lượng 15 75,0 Mẫu sống Số lượng 1 5,0 20
12 60,0 8 40,0 2 10,0 20
7 35,0 13 65,0 3 15,0 20
15 75,0 5 25,0 2 10,0 20
CT1 (Javen 30% trong 10 phút) CT2 (Javen 30% trong 20 phút) CT3 (HgCl2 0,1% 8 phút) CT4 (HgCl2 0,1% 10 phút)
Sau 2 tuần Sau 3 tuần Sau 4 tuần
Hình 3.1. Hình ảnh mẫu thân lan thạch hộc sinh trưởng trên môi trường bổ sung BAP 1mg/l
23
Vì các hạt lan được bảo vệ bởi một lớp vỏ quả rất dày nên mẫu hạt không
chứa các vi khuẩn, nấm và ít khi chịu tác động trực tiếp của hóa chất khử trùng.
Sau khi khử trùng bề mặt quả, chúng tôi mới tách vỏ để lấy hạt nuôi cấy.
Trong các loại hóa chất dùng để khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy thì
HgCl2 thường được sử dụng do tác dụng diệt nấm, khuẩn mạnh. Chúng tôi đã
tiến hành khử trùng quả bằng HgCl2 0,1% với hai phương pháp theo các bước
đã trình bày trong mục 2.2.2. Sau đó, tiến hành tách lấy hạt và cấy lên môi
trường MS bổ sung BAP với nồng độ 1 mg/l. Tỷ lệ mẫu nhiễm (hoặc nảy mầm)
được tính theo đơn vị là bình nuôi cấy. Kết quả khử trùng của các thí nghiệm
được theo dõi trong 20 ngày và ghi lại ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khử trùng hạt lan Thạch hộc
Số bình bị Số bình không Số bình có hạt Tổng Phương Số lô nhiễm nhiễm nảy mầm số bình pháp khử thí nuôi Số Tỷ lệ Tỷ lệ Số Tỷ lệ trùng nghiệm Số bình cấy bình (%) (%) bình (%)
1 8 3 37,5 5 62,5 5 62,5
2 5 1 20,0 4 80,0 4 80,0 Phương
pháp 1 3 7 1 14,3 6 85,7 5 71,4
5 25,0 15 75,0 Tổng 20 14 93,33
1 7 1 14,3 6 85,7 5 71,4
2 7 1 14,3 6 85,7 6 85,7 Phương
pháp 2 3 6 1 17,0 5 83,0 4 66,7
3 15,0 17 85,0 Tổng 20 15 88,24
Từ kết quả trên bảng 3.2 cho thấy, hai phương án khử trùng mẫu quả
thạch hộc bằng HgCl2 0,1% đều cho tỷ lệ mẫu vô trùng cao đến trên 60%
Khi theo dõi sự nảy mầm của hạt chúng tôi nhận thấy, tỷ lệ hạt nảy mầm
trong khoảng thời gian xử lý 10 phút là 14/15 bình (chiếm 93,33%), và ở hai
khoảng thời gian 10 phút lần 1 và 5 phút lần 2 xử lý mẫu là 15/17 (chiếm 88,24%).
24
Tuy nhiên, nguyên nhân chính của một số bình nuôi cấy không có hạt nào nảy
mầm là do môi trường nuôi cấy trong bình tam giác ít, trong quá trình nuôi cấy
nước bị bốc hơi dần dần làm cho thạch khô lại và môi trường bị hỏng. Như vậy,
sự nảy mầm của hạt không bị ảnh hưởng bởi hóa chất khử trùng.
Do đó, có thể kết luận rằng sử dụng hạt lan làm nguyên liệu đưa vào nuôi
cấy là phù hợp, hóa chất HgCl2 0,1% cho kết quả khử trùng tốt, tỷ lệ mẫu được
vô trùng cao, không ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt (tỷ lệ nảy mầm
của hạt ở thí nghiệm đạt trên 90%).
Các bình hạt sau 20 ngày nếu không bị nhiễm vi khuẩn, nấm thì được xem
như là đảm bảo khâu vô trùng. Trên môi trường chứa chất kích thích sinh trưởng
BAP với nồng độ 1,0 mg/l. Sau 40 ngày hạt đã tăng sinh về kích thước khối mô và
có màu xanh nhạt (Hình 3.2). Sau 60 ngày các khối mô chuyển màu xanh lá, các
khối mô lúc này được gọi là các protocorm, chồi lan sau này sẽ phát sinh từ các
khối protocorm đó.
Hình 3.2. Hình ảnh protocorm phát sinh từ hạt Thạch hộc trong môi trường nuôi
cấy sau 40 và 60 ngày
3.2. KẾT QUẢ TÁI SINH TẠO PROTOCORM
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tăng sinh protocorm
Sau khi gieo hạt lan khoảng 60 ngày, protocorm xuất hiện, tiến hành tách các
khối protocorm và cấy trong môi trường MS chứa saccharose (10g/l ); agar (6g/l);
than hoạt tính (1g/l); nước dừa 50ml/l và bổ sung BAP với nồng độ thay đổi ở bốn
công thức (CT) thí nghiệm: CT1- không bổ sung BAP; CT2- 0,5 mg/l BAP; CT3-
1mg/l BAP; CT4- 1,5mg/l BAP. Sau 30 ngày theo dõi kết quả được trình bày trên
25
bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng phát sinh Protocorm
Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Hệ số nhân Protocorm (lần)
CT1 CT2 CT3 CT4 0 0,5 1 1,5 Đường kính trung bình khối protocorm ban đầu (mm) 5 ± 0,15 4,7 ± 0,09 5,2 ± 0,12 5 ± 0,15 Đường kính trung bình khối protocorm sau 30 ngày (mm) 12 ± 0,1 18 ± 0,14 20 ± 0,08 15 ± 0,18 2,4 3,6 3,8 3,0
CT3 CT1
Hình 3.2. Hình ảnh protocorm sinh trưởng trên môi trường
có nồng độ BAP khác nhau
Chúng tôi nhận thấy ở tất cả các công thức thí nghiệm, các khối
protocorm đều tăng sinh về kích thước.Ở công thức thí nghiệm CT3 (bổ sung
BAP nồng độ 1mg/l) cho kết quả tăng sinh khối protocorm lớn hơn (hệ số nhân
protocorm đạt 3,8 lần) so với các công thức còn lại (Hình 3.3).
3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến quá trình nhân nhanh
protocorm
Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến
quá trình nhân nhanh protocorm, chúng tôi tiến hành cấy các khối protocorm
lên môi trường có các thành phần như thí nghiệm 1, bổ sung BAP 1mg/l và
saccharose với hàm lượng được thay đổi theo 4 công thức (CT) tương ứng
như sau: CT1- không bổ sung saccharose; CT2- bổ sung 5g/l saccharose;
CT3 – 10g/l saccharose; CT4 – 15g/l saccharose; CT5 – 20g/l saccharose.
Mỗi công thức có 3 bình môi trường (loại bình 250ml), mật độ cấy: 4-10
26
cụm protocorm/bình.
Sau 8 tuần cấy chuyển, chúng tôi thấy ở CT3 cho các chỉ tiêu nhân
nhanh protocorm vượt trội so với các công thức thí nghiệm khác (Bảng 3.4).
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose đến khả năng nhân nhanh
protocorm
Đường kínhtrung Đường kính Hệ số Hàm lượng bình khối trung bình khối nhân Công thức saccharose protocorm sau 8 protocorm ban protocorm (g/l) tuần nuôi cấy đầu(mm) (lần) (mm)
5,2 ±0,12 8,10±0,45 1,56 0 CT1
4,5 ±0,07 10,5 ±0,13 2,33 5 CT2
5,0 ±0,085 14,5 ±0,09 2,9 10 CT3
4,7 ±0,06 13,0 ±0,1 2,76 15 CT4
4,8 ±0,065 12,0 ±0,15 2,5 20 CT5
So sánh với kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan bản địa
Dendrobium nobile Lindl. của tác giả Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh,
Viện Sinh học nông nghiệp, Trường đại học nông nghiệp Hà Nội [9]. Chúng
tôi nhận thấy, tuy cùng loài cây và thời gian nghiên cứu là như nhau nhưng
với môi trường chứa 10g/l saccharose thì kết quả của chúng tôi lại cho hệ số
nhân nhanh protocorm cao hơn, điều này có thể là do chúng tôi bổ sung
nước dừa vào môi trường nuôi cấy nên đã kích thích sự phát triển của
protocorm nhanh hơn. Ngoài ra điều kiện chiếu sáng, nhiệt độ, mật độ nuôi
cấy và tỷ lệ các chất trong có môi trường khác nhau cũng có thể dẫn đến sự
sai khác trong hệ số nhân chồi của hai nghiên cứu nói trên.
Bên cạnh sự phát triển của protocorm thì chúng tôi còn nhận thấy rằng
với hàm lượng đường 10g/l thì protocorm có xu hướng biệt hóa hình thành
chồi nhanh hơn so với các công thức thí nghiệm còn lại. Điều này cần phải
27
lưu ý trong quá trình tạo chồi, phát triển cây hoàn chỉnh.
CT2 CT3
Hình 3.3. Hình ảnh protocorm sinh trưởng trên môi trường có bổ sung
saccharose sau 8 tuần nuôi cấy
3.2.3. Ảnh hưởng của nước dừa đến quá trình phát sinh chồi protocorm
Để tìm hiểu ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình phát sinh chồi từ các
cụm protocorm, tiến hành cấy các cụm protocorm trên môi trường MS có chứa:
agal 6g/l; saccharose 10g/l; than hoạt tính 1g/l; BAP 0,5mg/l và nước dừa với
hàm lượng thay đổi theo từng công thức (CT) như sau: CT1- không bổ sung;
CT2- 50ml/l; CT3- 100ml/l; CT4- 150 ml/l.
Sau 40 ngày nuôi cấy chúng tôi thu được kết quả tạo chồi từ protocorm
ở từng công thức môi trường như sau: với CT1cho hệ số phát sinh chồi là 75%,
CT2 là 88,6%, CT3 là 97,4% và CT4 là 87,9%, qua đó có thể thấy với môi
trường CT3 khả năng phát sinh chồi từ protocorm cao hơn so với các công thức
môi trường thí nghiệm khác (Bảng 3.5).
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng phát sinh chồi
từ cụm protocorm
Hàm lượng nước dừa (ml/l) Tỷ lệ phát sinh chồi (%) Số cụm protocorm phát sinh chồi Số cụm protocorm đưa vào
0 50
28
Công thức nhân chồi CT1 CT2 CT3 CT4 100 150 30 31 37 29 75 88,6 97,4 87,9 40 35 38 33
Tuy tỷ lệ phát sinh chồi của các cụm protocorm cao (trên 70%) nhưng số
lượng chồi trên một cụm protocorm còn thấp (trung bình 3-5 chồi trên một
cụm). Chất lượng và hình thái của
chồi thay đổi theo tùng công thức môi
trường, trong đó chúng tôi nhận thấy
rằng với công thức môi trường CT3
thì chồi cho chất lượng tốt nhất, kích
thước chồi trung bình, chồi xanh đều,
mỗi chồi mang từ 3-4 lá và cao từ
0,5- 1cm (Hình 3.5).
Hình 3.4. Chồi phát sinh từ cụm
3.2.4. Ảnh hưởng của than hoạt
protocorm trong môi trường chứa
tính đến khả năng phát sinh chồi từ
100ml/l nước dừa
protocorm
Để kiểm tra mức độ ảnh hưởng của than hoạt tính đến quá trình phát sinh
chồi của protocorm chúng tôi tách các cụm protocorm cấy chuyển vào môi
trường MS chứa: 10g đường saccharose; BAP 0,5 ml/l; nước dừa 100ml/l; agar
6g/l và than hoạt tính với hàm lượng được thay đổi theo 4 công thức sau: CT1-
không bổ sung; CT2- 0,5g/l; CT3- 1g/l và CT4- 1,5 g/l.
Sau 40 ngày nuôi cấy, ở CT3 cho tỷ lệ phát sinh chồi cao (đạt tỷ lệ 94,3%), các
chồi mập và phát triển tốt hơn so với các công thức thí nghiệm khác (Bảng 3.6; Hình
3.6). Tuy nhiên trong quá trình theo dõi chúng tôi thấy rằng khi bổ sung tăng dần
29
lượng than hoạt tính thì chiều cao cây lại có xu hướng giảm dần.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh chồi từ
cụm protocorm
Công Hàm lượng Số cụm Số cụm Tỷ lệ phát Hình thái
thức than hoạt tính protocorm phát sinh sinh chồi chồi
(g/l) đưa vào chồi (%)
Chồi gầy, lá CT1 0 26 74 35 xanh đậm
Chồi vừa, lá CT2 0,5 30 85,7 35 xanh nhạt
Chồi mọc
CT3 1 33 94,3 35 vừa, lá
xanh.
Chồi thấp,
CT4 1,5 35 28 80 lá bé xanh
nhạt
CT3 CT4
Hình 3.5. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng phát sinh chồi từ cụm
protocorm
30
3.3. KẾT QUẢ NHÂN NHANH VÀ TẠO CÂY HOÀN CHỈNH IN VITRO
3.3.1. Ảnh hưởng của BAP đến sự nhân nhanh chồi lan Thạch hộc
BAP (6 - benzyl amino purin) là hormone sinh trưởng thuộc nhóm
cytokinin có vai trò chủ yếu là kích thích sự phân chia tế bào. BAP ảnh hưởng rõ
rệt lên sự hình thành và phân hóa của cơ quan thực vật, đặc biệt là sự phân hóa
chồi. Thông qua cơ chế di truyền BAP tác động lên quá trình sinh tổng hợp
protein, từ đó ảnh hưởng đến sự tổng hợp protein, enzyme cần thiết cho sự phân
chia và sinh trưởng của tế bào. Ngoài ra, BAP còn có tác dụng ngăn chặn sự già
hóa của tế bào thực vật, ngăn chặn sự phân hủy protein, axit nucleic và
chlorophyll.
Để nghiên cứu sự ảnh hưởng của BAP đến sự phát triển chồi lan Thạch hộc,
chúng tôi đã tách các cụm chồi nhỏ phát sinh từ protocorm cấy chuyển vào môi
trường MS bổ sung đường saccharose 30 g/l; agar 7g/l; nước dừa 50ml/l; than hoạt
tính 1g/l và BAP với nồng độ thay đổi ở bốn công thức (CT) thí nghiệm: CT1 -
không bổ sung BAP; CT2 - 0,5mg/l BAP; CT3 - 1mg/l BAP; CT4 - 1,5mg/l BAP.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát triển cụm chồi lan Thạch hộc
Nồng độ Số Chiều cao Môi Số lá/chồi Hình thái chồi BAP chồi/cụm chồi (mm) trường (mg/l)
0 7,22 ± 0,07 11,5 ± 0,08 CT1 2,9 ± 0,05 Chồi nhỏ, lá xanh nhạt
Chồi nhỏ, lá CT2 0,5 7,85 ± 0,12 14,7 ± 0,1 3,82 ± 0,2 xanh
Chồi BT, lá CT3 1 8,32 ± 0,09 16,5 ± 0,12 3,7 ± 0,16 xanh đậm
Chồi to, lá CT4 1,5 9,75 ± 0,23 17,25 ± 0,2 4,1 ± 0,15 xanh đậm
Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy ở tất cả các môi trường đều có sự nhân chồi.
31
Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy có sự chênh lệch lớn về hệ số nhân chồi cũng như
khả năng phát triển của chồi khi thay đổi nồng độ BAP. Trong đó, môi trường CT1
chúng tôi không bổ sung BAP, các mẫu thu được cho hệ số nhân chồi thấp nhất chỉ
đạt 7,72 chồi/cụm. Chiều cao chồi trung bình chồi là 11,5 mm và số lá trên chồi là
2,9, chồi nhỏ, lá xanh nhạt, cho thấy khả năng nhân nhanh cũng như sự phát triển
của chồi chưa thực sự tốt. Sau đó chúng tôi bổ sung BAP vào môi trường, các chỉ
tiêu theo dõi đã có sự thay đổi khá rõ rệt theo từng công thức, với môi trường CT2
chúng tôi bổ sung 0,5mg/l BAP thì số chồi/ cụm là 7,85 và chỉ số này tăng dần với
môi trường CT3 và CT4. Qua quá trình theo dõi, chúng tôi nhận thấy trên môi
trường CT4 cho hệ số nhân chồi cao nhất với hệ số nhân chồi đạt 9,75 chồi/cụm,
chiều cao chồi đạt 17,25 mm và số lá là 4,1 lá/chồi, các chồi phát triển khỏe mạnh,
đồng đều và có màu xanh đậm.
CT2 - BAP 0 mg/l CT4 - BAP 1,5mg/l
Hình 3.6. Ảnh hưởng của BAP tới sự nhân nhanh chồi lan Thạch hộc
Như vậy, chúng tôi kết luận khả năng nhân chồi của giống lan Thạch hộc
cao nhất ở môi trường MS bổ sung 30g/l đường saccharose; 6g/l agar; 50ml/l
nước dừa; 1g/l than hoạt tính; 1,5mg/l BAP.
Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy khi không bổ sung chất kích thích vẫn
cho kết quả tạo chồi, điều này có khả năng loài lan này có chứa lượng cytokinin
nội sinh cao nên vẫn tự tạo được lượng chồi tương đối dù không có bổ sung
cytokinin vào môi trường. Đây là một trong những ưu thế của giống lan
32
Dendrobium do đó khi nhân giống đối tượng này ta không cần phải tiêu tốn
lượng chất điều hòa sinh trưởng nhiều, điều này vừa kinh tế lại vừa hạn chế
được hiện tượng đột biến cho mẫu cấy.
3.3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây và chuối xanh nghiền đến sự
phát triển chồi lan Thạch hộc
Ngoài các chất điều tiết sinh trưởng để thúc đẩy quá trình nuôi cấy giúp
cây sinh trưởng nhanh hơn và có chất lượng tốt hơn người ta thường bổ sung
khoai tây, chuối xanh là những thành phần không xác định có tác dụng kích
thích sự sinh trưởng của mô tế bào. Do đó trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử
dụng dịch khoai tây nghiền và chuối xanh nghiền để theo dõi sự sinh trưởng lan
thạch hộc. Các chồi lan được tách ra thành 3 chồi/ cụm rồi chuyển sang môi
trường MS bổ sung 30 g/l đường saccharose; 6 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; 1
g/l BAP và bổ sung chuối xanh nghiền, khoai tây nghiền với hàm lượng ở các
công thức thí nghiệm như sau: CT1- không bổ sung, CT2- bổ sung 30g/l khoai
tây, CT3- bổ sung 50g/l khoai tây, CT4- bổ sung 30g/l chuối xanh, CT5- bổ
sung 50g/l chuối xanh. Kết quả theo dõi sau 90 ngày được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng chuối xanh và khoai tây nghiền đến sự
phát triển lan Thạch hộc
Hình thái cây CT thí nghiệm Chiều cao tb cây (mm) Số lá/cây Số chồi/cụm cây
4,6 ± 0,06
5,8 ± 0,12 59,5 ± 2,2
6,3 ± 0,01 63,6 ±1,82 5,1 ±0,08
6,2 ± 0,04 54,2 ± 3,04 4,1 ±0,13 CT1- không bổ sung CT2 - 30 g/l khoai tây CT3 - 50 g/l khoai tây CT4 - 30 g/l chuối xanh
6,8 ± 0,06 57,2 ± 3,32 4,7 ±0,09 47,1 ± 2,26 3,37 ± 0,07 Cây nhỏ, lá nhỏ và xanh 4,5 ± 0,11 Cây vừa, lá trung bình và xanh Cây mập, lá to và xanh đậm Cây nhỏ, lá nhỏ và xanh Cây nhỏ, lá nhỏ, dài và xanh đậm CT5 - 50 g/l chuối xanh
Qua bảng 3.8 cho thấy, ở môi trường CT1 không bổ sung khoai tây và
chuối xanh nghiền thì sự nhân lên là thấp hơn cả so với các môi trường khác bổ
33
sung khoai tây nghiền và chuối xanh nghiền. Với môi trường này vì vẫn bổ sung
chất kích thích tăng trưởng nên chồi vẫn tiếp tục phát triển tuy nhiên các chỉ số
theo dõi đều thấp hệ số nhân chồi đạt 4,6 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt
47,1 mm và số lá/chồi là 3,37. Chồi nhỏ và lá xanh nhạt hơn so với chồi ở các
môi trường bổ sung khoai tây nghiền và chuối xanh nghiền.
Với hàm lượng khoai tây 30 g/l, thì hệ số nhân chồi đạt 5,8 chồi/cụm, chiều
cao trung bình đạt 59,5 mm và số lá/chồi là 4,5 sau đó chúng tôi tăng hàm lượng
khoai tây ở môi trường CT3 lên 50 g/l thì sự sinh trưởng và phát triển của chồi
tăng lên rõ rệt đi hệ số nhân chồi đạt 6,3 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 63,6
mm và số lá/chồi là 5,1.
CT1- không bổ sung CT3- 50g/l khoai tây CT5- 50g/l chuối xanh
Hình 3.7. Ảnh hưởng của chuối xanh và khoai tây lên sự phát triển lan Thạch hộc
Với hàm lượng chuối xanh 30g/l ở môi trường CT4, thì hệ số nhân chồi
đạt 6,2 chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 54,2 mm và số lá/chồi là 4,1 còn với
hàm lượng chuối xanh lên 50g/l ở môi trường CT5 thì hệ số nhân chồi đạt 6,8
chồi/cụm, chiều cao trung bình đạt 57,2 mm và số lá/chồi là 4,7.
So sánh sự sinh trưởng của lan Thạch hộc ở môi trường có chứa dịch
chuối xanh và khoai tây nghiền, chúng tôi nhận thấy với môi trường bổ sung
50g/l khoai tây thì sự phát triển của lan Thạch hộc đạt kết quả tốt nhất. Từ đó,
chúng tôi rút ra kết luận rằng môi trường thích hợp cho lan Thạch hộc phát triển
là môi trường MS bổ sung đường saccharose 25g/l; agar 6g/l; than hoạt tính
34
1g/l; BAP 1g/l và khoai tây 50g/l.
3.3.3. Ảnh hưởng của α – NAA đến khả năng ra rễ lan Thạch hộc
α - NAA là hormone sinh trưởng thuộc nhóm auxin. Nó được sinh ra ở
mô phân sinh ngọn và được vận chuyển xuống các bộ phận khác của cây. Vai trò
của α - NAA là thúc đẩy sự sinh trưởng và dãn nở của tế bào thực vật, tăng cường
quá trình tổng hợp và trao đổi các chất như ADN, protein…. Ngoài ra nó còn kích
thích sự ra rễ, kéo dài rễ và tham gia vào cảm ứng tạo chồi vô tính trong ống
nghiệm. Để nghiên cứu ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ lan chúng
tôi sử dụng môi trường: MS bổ sung đường saccharose 30 g/l; agar 6g/l; than
hoạt tính 1g/l; khoai tây 50g/l và bổ sung NAA (nồng độ từ 0mg/l đến
0,75mg/l ). Kết quả theo dõi sau 80 ngày được trình bày trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan Thạch hộc
Nồng độ Độ dài tb rễ CT Số rễ tb/cây Đặc điểm rễ α – NAA (mm)
0 CT1
0,25 5,7 ± 0,01 6,5 ± 0,05 CT2
CT3 0,5 7,32 ± 0,11
CT4 0,75 6,78 ± 0,03 11 ± 0,22 Rễ nhỏ, ngắn, màu xanh 15,9 ± 0,31 Rễ nhỏ,màu xanh, 20,5 ± 0,25 Rễ mập, dài, màu trắng đục, chóp rễ xanh 18,2 ± 0,38 Rễ dài, nhỏ, màu trắng đục, chóp rễ có màu xanh
CT1- 0 NAA CT2- 0,25mg/l NAA CT3- 0,5mg/l NAA
Hình 3.8. Ảnh hưởng của α - NAA đến khả năng tạo rễ của lan Thạch hộc
35
Qua bảng 3.9, chúng tôi nhận thấy môi trường bổ sung α - NAA ở các
hàm lượng khác nhau thì thu được các kết quả khác nhau. Ở môi trường CT1 thì
chồi lan có tăng trưởng về chiều cao và số lá nhưng tỷ lệ rễ/cây chưa cao chỉ là
5,7; độ dài rễ là 11 mm. Rễ nhỏ, ngắn, màu xanh nhạt. Khi môi trường có bổ
sung α - NAA, lan Thạch hộc đều ra rễ với tỉ lệ khá cao. Ở nồng độ NAA
0,25mg/l thì số rễ/cây là 6,5; độ dài rễ là 15,9 mm; rễ nhỏ, màu xanh. Khi tăng
nồng độ NAA lên 0,5 mg/l thì độ dài rễ lên đến 20,5 mm,và số rễ trên trung bình
trên một cây đạt 7,32, rễ mập, dài, màu trắng đục, chóp rễ màu xanh. Chúng tôi
tiếp tục tăng nồng độ NAA lên 0,75mg/l thì số rễ trên cây, chiều dài rễ tương
ứng là 6,78 và 18,2 mm. Rễ dài, nhỏ, màu trắng và chóp rễ xanh. Từ thí nghiệm,
chúng tôi đánh giá nồng độ α - NAA thích hợp cho sự ra rễ của lan Thạch hộc
là 0,5 mg/l.
3.4. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI GIÁ THỂ ĐẾN SINH TRƯỞNG
VÀ PHÁT TRIỂN LAN THẠCH HỘC SAU KHI RA CÂY
Đưa cây ra ngoài vườn ươm là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ,
huấn luyện thích nghi với thay đổi của nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và
chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Đây là giai đoạn quyết
định khả năng ứng dụng quy trình nhân giống in vitro.
Khi cây con nuôi cấy mô khi đã đạt đủ tiêu chuẩn, chúng tôi tiến hành dùng
panh gắp cây con khỏi bình nuôi cấy sau đó rửa nhẹ nhàng dưới vòi nước cho thật
sạch môi trường thạch và tránh để cây bị nát, để cây con ráo nước, rồi trồng vào
cốc nhựa đựng giá thể, nguyên liệu mà chúng tôi sử dụng để làm giá thể là mùn cưa
đã được ủ hoai mục và vụn dớn, để nghiên cứu chúng tôi đã chia làm ba loại giá thể
như sau: loại thứ nhất chỉ chứa mùn cưa; loại hai chứa cả mùn cưa với vụn dớn trộn
đều vói tỷ lệ 1:1 và loại 3 chỉ chứa vụn dớn. Mỗi loại giá thể chúng tôi tiến hành thí
nghiện trồng 50 cây con.
Sau khi trồng vào giá thể chúng tôi đưa cây vào túi bóng nilon và ghim lại.
Tiến hành chăm sóc bằng cách tưới nước lã và tưới dung dịch ½ MS (Kết quả theo
dõi sau 60 ngày được trình bày trong bảng 3.10).
Chúng tôi nhận thấy rằng các loại giá thể đều có khả năng trồng lan Thạch
36
hộc sau khi ra cây với tỷ lệ cấy sống đều đạt trên 80% tuy nhiên so với hai loại
giá thể là giá thể mùn cưa và gia thể vụn dớn thì giá thể chứa hỗn hợp cả hai loại
vụn dớn + mùn cưa cho tỷ lệ cây sống và cây đạt chất lượng tốt hơn, tỷ lệ cây
sống đạt 92% và cây to khỏe ra rễ nhiều, số chồi mới hình thành đạt 2,86 chồi
trên một cây. Như vậy, chúng tôi kết luận giá thể chứa hai mùn cưa và vụn dớn
với tỷ lệ 1:1 là thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của cây lan Thạch hộc.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến sự phát triển lan Thạch
hộc
Số cây Số chồi mới Số lá/ cây Đặc điểm cây Giá thể còn sống hình thành
Cây khỏe, lá xanh nhạt và
Mùn cưa 42 1,54 ± 0,12 7,45 ± 0,12 nhỏ, rễ mới hình thành
không nhiều, chồi con ít.
Mùn cưa Cây to khỏe, lá xanh, ra rễ
46 2,86 ± 0,15 8,5 ± 0,03 mới nhiều, rễ xanh, nảy và vụn
dớn chồi con nhiều.
Cây khỏe, lá xanh nhạt, ra
Vụn Dớn 45 1,7 ± 0,1 6,8 ± 0,04 rễ mới và nảy chồi con
nhưng chưa nhiều.
VỤN DỚN MÙN CƯA + VỤN DỚN MÙN CƯA
Hình 3.9. Hình ảnh cây lan thạch hộc con sinh trưởng trên các loại giá thể khác
nhau sau khi ra chai và huấn luyện tại vườn ươm
37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Mẫu phù hợp để khử trùng tạo vật liệu đưa vào nuôi cấy lan thạch hộc
là sử dụng quả lan và hóa chất khử trùng thích hợp là HgCl2 0,1%
2. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự tái sinh protocorm và môi
trường phù hợp.
- Môi trường MS bổ sung đường saccharose 10g/l + aga 6g/l r + than hoạt
tính 1g/l; nước dừa 50ml/l và BAP 1,0 mg/l phù hợp để phát sinh protocrom
từ hạt Thạch hộc.
- Môi trường tốt nhất để hình thành chồi lan Thạch hộc từ protocorm là
MS bổ sung 10g đường saccharose; 6g/l agar; 1g/l than hoạt tính; 0,5ml/l BAP
và 100ml/l nước dừa.
3. Kết quả nhân nhanh và tạo cây hoàn chỉnh
- Môi trường phù hợp nhân nhanh chồi lan Thạch hộc là môi trường MS
bổ sung 30 g/l đường saccharose; 6g/l agar; 1g/l than hoạt tính; 50 ml/l nước dừa và
1mg/l BAP.
- Lan Thạch hộc phát triển và hình thành rễ tốt trong môi trường MS bổ
sung 30 g/l đường sacch arose; 6 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính; 50g/l khoai tây và
0,5mg/l NAA.
- Giá thể thích hợp để trồng lan Thạch hộc là mùn cưa hoai mục trộn với
vụn dớn với tỷ lệ 1:1.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro loài lan
Thạch hộc nhằm góp phần bảo tồn lan rừng và cung cấp nguồn dược liệu quý
Thạch hộc cho thị trường, phục tráng giống cây và giữ gìn các chất có hoạt tính
38
sinh học trong cây, phục vụ nghiên cứu di truyền tạo giống mới.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam – Trồng hái chế biến, trị
bệnh ban đầu. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
2. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học
thực vật trong cải tiến cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
3. Dương Mậu Hùng, Lê Đình Khả (2003), Giáo trình giống cây rừng.
Nhà xuất bản nông nghiệp.
4. Nguyễn Hoàng Nghĩa (2001), Nhân giống vô tính và trồng rừng vô
tính. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội.
5. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2005), Sinh lý học thực
vật. Nhà xuất bản Giáo Dục.
6. Trần Hợp (1998), Phong lan Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
7. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mậu Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Sinh lý học
thực vật (tập 2). Nhà xuất bản giáo Dục.
8. Trần Việt Hưng (2014), Lan Hoàng thảo Dendrobium cây hoa, vị thuốc.
9. Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013), Nhân giống In vitro loài lan
bản địa dendrobium Nobile Lindl. Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 11 (7):
917-925.
10. Nguyễn Thanh Tùng, Lê Văn Điệp, Nguyễn Minh Trung, Trương
Thị Bích Phượng (2010), “Áp dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào trong
nhân giống in vitro cây Hoàng lan thân gãy (Dendrobium aduncum), Tạp chí
Công nghệ Sinh học 8 (3): 361 - 367.
11. Nguyễn Văn Song (2011), “Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp
(Dendrobium chrysotoxum) - một loài lan rừng có nguy cơ tuyệt chủng”, Tạp
chí khoa học Đại học Huế, số 64, tr.127 – 136.
12. Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai
(2011), “Nhân giống in vitro giống lan Dendrobium fimbriatum (Lan Hoàng
Thảo Long nhãn)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, Trường Đại học Nông
39
nghiệp, tập 10, số 2, tr.263 – 271.
13. Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh (2007), “Ảnh hưởng của chất
điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy phát sinh tế bào soma và phôi vô
tính ở cây lan (Dendrobium, Phalaenopsis, Cybidium)”, Hội nghị Khoa học và
Công nghệ 2007, trang 503 – 508.
Tài liệu tiếng Anh
14. Kusumoto and Furukawa (1977), Effect of Oganic Matter on the Growth
of Cymbidium Protocrom Cultured in vitro. Japan Soc Hort Sci 45 (4): 421-426
15. Tawaro Supavadee, Suraninpong Potjamarn and Chanprame Sontichai
(2008), Germination Regenaration of Cymbidium findlaysonyanum Lindl. on a
Medium Supplemented with Some organic Sourcer. Walailak J Sci & Tech 5
(2): 125-135
16. Chang C, Chen YC, Hsu YH, Wu JT, Hu CC, Chang WC, Lin NS
(2005), Transgenic resistance to Cymbidium mosaic virus in Dendrobium
expressing the viral capsid protein gene. Transgenic Res, 14(1), pp: 41–46.
17. Narayanaswamy S (1994) Plant Cell and Tissue Culture. Tata
Mcgraw Hill Publishing Company Limited, New Delhi.
18. Kauth P (2005) In vitro seed germination and seedling development of
Calopogon tuberosus and Sacoila Lanceolata var. lanceolata: Two Florida
native terrestrial orchids. Master thesis, University of Florida.
19. Bijaya Pant and Deepa Thapa (2012), “In vitro mass propagation of an
epiphytic orchid, Dendrobium primulinum Lindl. through shoot tip culture”.
African Journal of Biotechnology Vol. 11(42), pp. 9970-9974.
20. Sana Asghar, Touqeer Ahmad, Ishfaq Ahmad Hafiz and Mehwish
Yaseen (2011 ), “In vitro propagation of orchid (Dendrobium nobile) var. Emma
white”. African Journal of Biotechnology Vol. 10(16), pp. 3097 – 3103.
21. M. Maridass, R. Mahesh , G.Raju A.Benniamin and K.Muthuchelian
(2010) “In Vitro propagation of Dendrobium nanum through rhizome bud
40
culture”. International Journal of Biological Technology, 1(2), 50 – 54.
Tài liệu trang web
22. http://nongnghiep.vn/than-duoc-thach-hoc-tia-post119811.html
23. http://thachhoc.net/
24. http://www.thaythuoccuaban.com/vithuoc/thonhilan.htm
25. http://bioplants.com.vn/ky-thuat-trong-cay-thach-hoc-tia
26. http://www.vuonhoalan.net/?tab=detailnews&tin=68&title=lan-da-
hac-phi-diep-dendrobium-anosmum
27. http://www.vnorchids.net/index.php?/topic/11-lan-hoang-thao%
41
28. http://blogcaycanh.vn/cay_canh/d/cay-thach-hoc-tia
PHỤ LỤC
Môi trường nuôi cấy là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)
Thành phần Nồng độ (mg/l)
1650 NH4NO3
1900 KNO3
Khoáng đa lượng 440 CaCl2.2H2O
370 MgSO4.7H2O
170 KH2PO4
23,3 MnSO4.4H2O
8,6 ZnSO4.7H2O
6,2 H3BO3
0,83 KI Khoáng vi lượng
0,25 Na2MoO4.2H2O
0,025 CuSO4.5H2O
0,025 CoCl2.6H2O
37,3 Na2.EDTA Sắt EDTA 27,8 FeSO4.7H2O
100 myo-Inositol
0,1 Thiamin (B1) Vitamin 0,5 Nicotinic acid
42
0,5 Pyridoxine HCl
