Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập gen mã hóa protein Lc điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ cây ngô nếp địa phương

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:57

Thêm vào BST

Báo xấu

28
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn nghiên cứu nhằm tạo dòng gen Lc từ giống ngô nếp địa phương chịu hạn tốt Nà Hạo (NH): Tách chiết mRNA tổng số, khuếch đại cDNA bằng kỹ thuật PCR, tách dòng phân tử cDNA gen Lc; phân tích đặc điểm trình tự gen Lc và protein suy diễn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập gen mã hóa protein Lc điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ cây ngô nếp địa phương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ KHUYÊN PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA PROTEIN Lc ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN TỪ CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2018
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ KHUYÊN PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA PROTEIN Lc ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN TỪ CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƯƠNG Ngành: Di truyền học Mã ngành: 8.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Thị Thanh Nhàn THÁI NGUYÊN - 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. Thái Nguyên, tháng 4 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Khuyên i
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Phạm Thị Thanh Nhàn đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của cô Trần Thị Hồng kĩ thuật viên Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật - Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên và Viện Khoa học sự sống – Đại học Nông lâm – Đại học Thái Nguyên. Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học, bộ phận Sau đại học thuộc Phòng đào tạo - Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lời biết ơn đến gia đình, bạn bè đã động viên, khuyến khích và giúp đỡ tôi trong tiến trình học tập và hoàn thành luận văn. Trong quá trình hoàn thiện luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi rất mong nhận được những đóng góp quý báu để luận văn được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 4 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Khuyên ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................v DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... vi MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1 2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................................2 3. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3 1.1. Sơ lược về cây ngô ...............................................................................................3 1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây ngô .........................................................................3 1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô nếp ........................................................4 1.2. Hạn và phản ứng của cây ngô trước tác động của hạn .........................................5 1.2.1. Hạn và tính chống chịu stress oxy hóa ..............................................................5 1.2.2. Cơ sở sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở ngô ...............8 1.3. Anthocyanin và vai trò chuyển hóa các dạng oxy hoạt hóa ...............................11 1.3.1. Vai trò của anthocyanin khi thực vật bị hạn ...................................................11 1.3.2. Gen điều hoà tổng hợp anthocyanin ở cây ngô ...............................................14 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................18 2.1. Vật liệu ...............................................................................................................18 2.2. Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu ..........................................................18 2.2.1. Hóa chất ..........................................................................................................18 2.2.2. Thiết bị ............................................................................................................18 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................18 2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................19 2.3.1. Phương pháp gây hạn nhân tạo .......................................................................19 iii
2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số .............................................................19 2.3.3. Phương pháp RT- PCR ...................................................................................20 2.3.4. Tạo vector tái tổ hợp .......................................................................................21 2.3.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5 ..............21 2.3.6. Kiểm tra sản phẩm tách dòng ..........................................................................21 2.3.7. Tách plasmid ...................................................................................................21 2.3.8. Phương pháp xác định trình tự gen .................................................................23 2.3.9. Phương pháp xử lý số liệu ...............................................................................23 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................24 3.1. Kết quả phân lập gen Lc từ giống ngô nếp địa phương NH .............................24 3.1.1. Kết quả tách dòng phân tử mang gen Lc từ giống NH ...................................24 3.1.2. Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen Lc ở giống ngô nếp NH ........................26 3.2. Đặc điểm trình tự gen Lc của giống ngô nếp địa phương NH ...........................26 3.2.1. So sánh trình tự gen Lc của giống NH với các trình tự trên GenBank.........................26 3.2.2. Phân tích sự tương đồng gen Lc của giống NH với các gen khác trong họ bHLH .........................................................................................................................33 3.3. Đặc điểm trình tự protein Lc suy diễn của giống ngô nếp địa phương NH .......34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................39 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................40 iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ABA Abscisic acid Axit abscisic ANR Anthocyanidin reductase Enzyme chuyển hóa flavan-3-ol Enzyme chuyển hóa tạo ANS Anthocyanidin synthase anthocyanidin APX Ascorbate peroxidase Enzyme chuyển hoá H2O2 thành H2O bHLH Binding helix- loop- helix Protein họ bHLH Bp Base pair Cặp bazơ nitơ C1 Colored aleurone 1 Gen C1 DNA sợi đôi được tổng hợp từ cDNA Complementary DNA mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược CHS Chalcone synthase Enzyme xúc tác tổng hợp chalcon DEPC Diethyl pyrocarbonate Chất ức chế enzyme phân hủy RNA CLP Protease CLP Enzym protease CLP Enzyme chuyển hóa tạo DFR Dihydroflavonol 4 reductase leucoanthocyanidin DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic (ADN) dNTPs Deoxynucleotit triphosphate Các loại nucleotit triphotphate Dehydration responsive DRE Yếu tố đáp ứng với hydrat hóa element Ethylene diamine tetraa acid EDTA Axit etylen diamin tetraxetic cetic Ethylene-responsive element EREBP Protein liên kết nguyên tố Ethylene binding protein GSH Glutathione Protein trong giai đoạn muộn của LEA Late embryo abundant quá trình hình thành phôi Lc /LC Leaf colour Gen Lc iv
Forward primer/ Reverse Cặp mồi xuôi ngược trong phản ứng LcF/LcR primer RT-PCR của mRNA gen Lc MGPT Molecular brokerage Môi giới phân tử MYB Myeloblastosis Gen MYB MYC Myelocolour Gen MYC mRNA Messenger RNA ARN thông tin Nicotinamide adenine Coenzym được sử dụng trong phản NADP dinucleotide phosphate ứng đồng hóa PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic (ARN) Reverse transcription- Phản ứng khuếch đại cDNA từ RT- PCR polymerase chain reaction mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược ROS Reactive oxygen species Các dạng oxy hoạt hóa Enzyme xúc tác phản ứng loại bỏ SOD Superoxide dismutase superoxide Sol Solution Dung dịch Các nhân tố phiên mã, hay yếu tố TF Transcription factors phiên mã Người cùng làm chung trong một Cs Cộng sự công việc v
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR .......................................................................20 Bảng 2.2. Thành phần dung dịch tách plasmid .........................................................22 Bảng 3.1. Các vị trí sai khác về nucleotid giữa gen Lc của giống NH với các trình tự trên GenBank ..............................................................................32 Bảng 3.2. Bảng hệ số tương đồng di truyền về gen Lc giữa giống NH và các trình tự trên GenBank. .............................................................................33 Bảng 3.3. Sự sai khác về amino acid trong protein Lc suy diễn giữa giống NH với các trình tự trên GenBank..................................................................36 Bảng 3.4. Bảng hệ số tương đồng di truyền về protein Lc suy diễn giống NH và một số trình tự trên GenBank. .................................................................38 v
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin ..........................................11 Hình 1.2. Vai trò chất chống oxy hóa của anthocyanin ............................................13 Hình 1.3. Ba nhóm gen điều hòa tham gia tổng hợp anthocyanin ở ngô ........................15 Hình 1.4. Cấu trúc không gian của protein bHLH ....................................................16 Hình 1.5. Các vùng chức năng của nhân tố bHLH ...................................................16 Hình 3.1. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RT- PCR gen Lc..............................24 Hình 3.2. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid (A) và sản phẩm clony- PCR (B) ......25 Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng BamHI (B) ................25 Hình 3.4. Ảnh blast trình tự nucleotid của gen Lc giống NH trên NCBI ................26 Hình 3.5. So sánh trình tự nucleotid của gen Lc ở giống NH và trình tự khác trên GenBank. ..........................................................................................31 Hình 3.6. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa gen Lc của giống ngô NH với các gen thuộc họ bHLH .......................................................33 Hình 3.7. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein Lc ở giống NH và các trình tự trên GenBank ........................................................................35 Hình 3.8. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền giữa protein Lc suy diễn của giống ngô NH với các trình tự trên GenBank ...................................38 vi
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngô (Zea mays L.) là một trong ba cây ngũ cốc quan trọng nhất, cung cấp lương thực cho loài người và là thức ăn cho gia súc (với 70% chất tinh trong khẩu phần ăn), là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất và chế biến lương thực - thực phẩm - dược phẩm, là mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị. Giá trị sử dụng rộng rãi của ngô được chứng minh bằng 670 mặt hàng khác nhau. Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa của nông dân vùng trung du và miền núi phía Bắc, và là cây lương thực chính của đồng bào các dân tộc thiểu số ở các vùng núi cao. Năm 2016, tỉnh Hà Giang có diện diện tích trồng lúa là 37500 ha, ngô là 53500 ha; tỉnh Cao Bằng có diện tích trồng lúa là 28900 ha, ngô là 40100 ha; tỉnh Sơn La có diện tích trồng lúa là 51700 ha, ngô là 152400 ha; tỉnh Lào Cai có diện tích trồng lúa là 31600 ha, ngô là 37600 ha (theo số liệu của Tổng cục Thống kê) [13]. Nước ta có 75% diện tích là đồi núi, lượng mưa hàng năm không đồng đều giữa các vùng, tình trạng hạn hán thường xuyên xảy ra dẫn đến năng suất của các giống cây trồng nói chung, cây ngô nếp địa phương nói riêng bị giảm. Trong những năm gần đây, các giống ngô nếp địa phương có chất lượng hạt cao, khả năng chịu hạn tốt và phù hợp với điều kiện canh tác đất dốc của từng vùng ở miền núi, nhưng do năng suất thấp nên nhiều giống quý bị mất dần do hướng sản xuất ngô ở nước ta là tăng cường diện tích ngô lai có năng suất cao trên cơ sở ứng dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên tiến. Vì vậy, việc nghiên cứu và chọn tạo các giống ngô có khả năng chịu hạn là rất cần thiết, góp phần bảo tồn nguồn gen và tạo vật liệu cho lai giống. Anthocyanin là một loại sắc tố dịch bào, là sản phẩm thứ cấp của quá trình trao đổi chất. Anthocyanin thuộc nhóm flavonoid, xuất hiện trong các bộ phận của thực vật với màu đỏ, đỏ tía, tím và xanh đậm. Ngoài việc tạo màu sắc đẹp để bảo vệ và thụ phấn, anthocyanin còn có hoạt tính sinh học rất quý 1
là khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp tế bào giữ nước khi mất cân bằng áp suất thẩm thấu. Anthocyanin được coi là một dấu hiệu của điều kiện cực đoan và là một phần trong cơ chế hạn chế tác động tiêu cực đó. Hiện nay, định hướng nghiên cứu xác định chỉ thị cho đặc tính chịu hạn của cây trồng đang được quan tâm, trong đó có chỉ thị sắc tố anthocyanin và các gen liên quan. Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Phân lập gen mã hóa protein Lc điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ cây ngô nếp địa phương”. 2. Mục tiêu của đề tài Phân lập và phân tích được đặc điểm trình tự gen Lc điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin từ cây ngô nếp địa phương. 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo dòng gen Lc từ giống ngô nếp địa phương chịu hạn tốt Nà Hạo (NH): Tách chiết mRNA tổng số, khuếch đại cDNA bằng kỹ thuật PCR, tách dòng phân tử cDNA gen Lc. - Phân tích đặc điểm trình tự gen Lc và protein suy diễn. 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lược về cây ngô 1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây ngô Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L, thuộc chi Zea, họ Hoà thảo (Poaceae), bộ Hoà thảo (Poales). Từ loài Zea mays Line, dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt và hình thái bên ngoài, ngô được phân thành các loài phụ: ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa. Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô được phân chia thành các thứ. Ngoài ra, ngô còn được phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm [7]. Ngô có lá hình mũi mác rộng bản, dài 50–100 cm và rộng 5-10 cm. Thân cây thẳng, cao 2–3 m, nhiều mấu, các lá tỏa ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn. Dưới các lá này và ôm sát thân cây là các bắp. Từ các đốt ở phía dưới sinh ra một số rễ [7]. Các bắp ngô là các cụm hoa cái hình bông được bao bọc trong một số lớp lá, và được các lá này bao chặt vào thân đến mức chúng không lộ ra cho đến khi xuất hiện các râu ngô. Râu ngô là các núm nhụy thuôn dài, ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng. Hạt ngô là dạng quả thóc với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt. Các hạt ngô bám chặt thành các hàng tương đối đều xung quanh một lõi trắng để tạo ra bắp ngô. Mỗi bắp ngô dài khoảng 10- 25cm, chứa khoảng 200- 400 hạt. Các hạt có màu như ánh đen, xám xanh, đỏ, trắng và vàng. Khi được nghiền thành bột, ngô tạo ra nhiều bột và ít cám hơn so với lúa mì [7]. Ngô nếp (Zea mays L. subsp. Ceratina Kulesh), là một trong những loài phụ chính của Zea mays L. Bề ngoài hạt ngô nếp tương tự với ngô đá, nhưng bóng hơn. Lớp ngoài cùng của mặt cắt nội nhũ không có lớp sừng như ở ngô tẻ, có tính chất quang học giống như lớp sáp. Do vậy, ngô nếp còn có tên gọi 3
khác là ngô sáp. Tinh bột của ngô nếp chứa gần như 100% amylopectin, trong khi ngô thường chỉ chứa 75% amylopectin và 25% amylase [7]. Theo Peter Thompson (2005), đặc tính của ngô nếp được quy định bởi đơn gen lặn đó là gen wx [52]. Ngô có 10 cặp nhiễm sắc thể (n=10). Chiều dài tổng cộng của các nhiễm sắc thể là 1500 cM. Một số nhiễm sắc thể của ngô có "bướu nhiễm sắc thể" - các vùng lặp lại cao với vết màu sẫm. Mỗi bướu riêng biệt là đa hình trong số các giống của cả ngô lẫn cỏ ngô. Barbara McClintock đã sử dụng các bướu này để chứng minh thuyết “Yếu tố di truyền vận động” [66]. Năm 2005, Quỹ Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ (NSF), Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ và Bộ Năng lượng Hoa Kỳ (DOE) đã xác định trình tự chuỗi bộ gen của ngô. Bộ gen ngô có 50000– 60000 gen nằm rải rác trong 2,5 tỷ base [65]. 1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và kinh tế của ngô nếp Ngô nếp được sử dụng chủ yếu làm lương thực và thức ăn cho con người. Khi nấu chín có độ dẻo, mùi vị thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, dễ hấp thu hơn so với tinh bột của ngô tẻ [68]. Một trong những nguyên nhân là do trong ngô nếp có hàm lượng các amino acid không thay thế như triptophan và lyzin cao. Hàm lượng lipit cao (3,5- 7%) và phụ thuộc vào từng giống, điều kiện tự nhiên. Lipit được tập trung ở phôi và tầng alơron. Dầu ngô chứa đến 50% axit linoleic liên kết với các glyxerit, axit oleic, panmitic, rixinic. Hàm lượng lipit là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt. Protein của ngô được chia thành ba loại chính: protein hoạt tính (chủ yếu là enzyme), protein cấu trúc và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất. Hàm lượng protein dao động từ 4,8- 16,6% ở mỗi giống. Lợi dụng tính chất hoà tan của protein trong các dung môi, người ta có thể tách chiết protein tan từ ngô phục vụ cho nhiều mục đích nghiên cứu như đánh giá chất lượng, khả năng chịu hạn...[65]. 4
Thân cây ngô được sử dụng chủ yếu để nuôi gia cầm và gia súc: cỏ khô, cỏ ủ chua. Hạt ngô cũng có nhiều ứng dụng trong công nghiệp như: tổng hợp chất dẻo hay vải sợi; sản xuất xi rô chứa nhiều fructose, chưng cất một số dạng rượu. Ethanol từ ngô cũng được dùng ở hàm lượng thấp (10% hoặc ít hơn) như là phụ gia của xăng làm nhiên liệu cho một số động cơ để gia tăng chỉ số octan, giảm ô nhiễm và giảm mức tiêu thụ xăng (ngày nay gọi chung là "các nhiên liệu sinh học"). Trong nhiều nền văn hóa, người ta sử dụng các món cháo ngô, bánh ngô, bánh mèn mén. Một vài dạng ngô cũng được trồng làm cây cảnh do lá hay bắp nhiều màu, kích thước lớn, bắp dài [65]. Cũng như tình trạng chung trên thế giới, các nghiên cứu về ngô ở Việt Nam tập trung chủ yếu vào ngô tẻ. Đối với các giống ngô nếp địa phương, đến nay chỉ có một số ít công trình được công bố [3]. Thời gian gần đây, các nhà tạo giống Việt Nam đã bắt đầu chuyển sang hướng tạo giống nếp lai và đã tạo được một số giống nếp lai không quy ước có triển vọng như các giống lai VN2, MX2, MX4, Bạch ngọc... Trong khi đó, các giống ngô nếp địa phương có ưu điểm chất lượng hạt cao, khả năng chịu hạn và kháng sâu bệnh tốt, có thể gieo trồng trên nhiều loại đất khác nhau đang đứng trên nguy cơ bị suy giảm quỹ gen vì năng suất thường thấp. Vì vậy, việc sưu tập, nghiên cứu và đánh giá một cách toàn diện nguồn gen các giống ngô địa phương là hết sức cần thiết cho công tác giống và bảo tồn nguồn gen quý. 1.2. Hạn và phản ứng của cây ngô trước tác động của hạn 1.2.1. Hạn và tính chống chịu stress oxy hóa 1.2.1.1. Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước do môi trường gây nên làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển. Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể làm giảm thiếu hụt mức độ tổn thương do thiếu nước gây ra gọi là tính chịu hạn. 5
Có hai loại hạn cơ bản: hạn thật (gồm hạn đất, hạn không khí, hạn toàn diện), và hạn sinh lí. Hạn đất là do lượng nước trong đất giảm làm hệ rễ của cây không thể lấy nước từ đất vào tế bào dẫn đến cây có hiện tượng bị héo lâu dài. Hạn đất tác động mạnh lên bộ rễ của cây. Hiện tượng này gây ra các biểu hiện thích ứng tại vùng xảy ra yếu tố cực đoan và ở mức độ cao hơn, biểu hiện thích ứng toàn cơ thể. Hạn có thể tạo ra những hạt khô, nhăn nheo, không có phẩm chất tốt và thậm chí mất mùa hoàn toàn. Ở ngô sự trỗ cờ và phun râu phải xảy ra đồng thời. Hiện tượng phun râu ngô chậm gắn liền với sự chịu hạn bởi vì râu ngô chứa phần lớn là nước. Chọn giống theo hướng phun râu đồng thời (không bị chậm) là phương pháp hữu hiệu để chọn được giống chịu hạn ở ngô ở các vùng Mỹ, Canada [6]. Hạn không khí thường xảy ra ở những vùng gió nóng, nhiệt độ cao (39- 42oC) và độ ẩm thấp
nhất là chuyển sang trạng thái lục lăng ngược. Trong trạng thái cuối cùng màng lipit kép bị gián đoạn, các phức enzyme bị phá hủy, dịch tế bào có thể dò rỉ ra ngoài. Tiếp sau đó, các hệ thống màng khác trong tế bào như màng lưới nội chất, màng lục lạp, màng ty thể cũng bị thiếu nước và không còn khả năng trao đổi chất [6]. Hiện tượng nóng hạn còn tạo ra các gốc tự do của hydroxyl, superoxide... oxy hoá các đại phân tử và làm mất hoạt tính của chúng. Ngoài ra, các sản phẩm phân hủy của các đại phân tử và nồng độ ion cao khi mất nước gây độc cho tế bào. Khi bắt đầu mất nước sự tổng hợp protein được tăng cường, nhưng hạn kéo dài sẽ xảy ra hiện tượng thủy phân protein. Stress oxy hóa xảy ra trong điều kiện hạn tạo ra hàng loạt các dạng oxy hoạt hóa (ROS) gây tổn thương, thậm chí làm chết tế bào [45]. Những yếu tố môi trường gây stress oxy hóa có thể kể đến là: nồng độ ozon hoặc SO2 quá cao, chất diệt cỏ bị ôxy hóa, kim loại nặng, hạn, nóng, lạnh, tổn thương cơ học, UV, chiếu sáng liên tục, sự xâm nhập của mầm bệnh, sự lão hóa... Ở những điều kiện này, chúng thúc đẩy hiện tượng ức chế quang hợp [26]. 1.2.1.2. Các dạng oxy hoạt hóa (ROS) và hệ thống bảo vệ cây trồng khỏi tác động của của oxy hóa ROS tồn tại trong tự nhiên và cơ thể sống có thể kể đến là: oxy phân tử (O2); oxy dạng đơn (singlet oxy), superoxide anion (O 2-), hydro peroxide tự do (OH*), hydro peroxide (H2O2), pehydroxyl tự do (O2H*), ozon (O3)... Phần lớn chúng tạo ra trong chu trình chuyển hóa electron trong ty thể hoặc lục lạp. Tuy nhiên, những hợp chất oxy hoạt hóa như superoxide anion (O 2-), H2O2 cần cho sự hóa gỗ (sự hóa lignin) và thực hiện chức năng như tín hiệu phản ứng bảo vệ đối với hiện tượng nhiễm bệnh [18]. Hệ thống bảo vệ cây trồng bao gồm các enzyme và hợp chất không phải enzyme, đó là: superoxide dismutase (SOD), catalasse, các enzyme chuyển hoá ascorbate, glutathion (GSH). Ngoài các hợp chất có bản chất enzyme trên, 7
các chất khác không có hoạt tính xúc tác sinh học cũng tham gia trực tiếp chuyển hóa các gốc tự do như: vitamin E, vitamin C, carotenoid, polyamin, zeaxanthin và flavonoid. Chúng tương tác với các gốc carbocyl tự do, hạn chế sự chuyển hóa thành các gốc tự do khác. Carotenoid và flavonoid còn nhận năng lượng ánh sáng, hạn chế tác động của ánh sáng và các gốc tự do sinh ra trong quá trình quang hợp [45], [49]. 1.2.2. Cơ sở sinh lý, sinh hóa và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở ngô Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật rất phức tạp liên quan đến các đặc điểm hình thái giải phẫu, sinh lí, hoá sinh, và các gen chịu hạn. Hiện nay có nhiều quan điểm khác nhau giải thích cơ chế chịu hạn, trong đó có hai quan điểm được chấp nhận hơn cả là vai trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về tính chịu hạn của cây ngô. Tính chịu hạn của cây ngô có liên quan tới sự sinh trưởng và phát triển của bộ rễ. Trong môi trường bị hạn rễ thường phát triển theo chiều sâu hoặc chiều ngang và số lượng rễ tăng lên [37]. Tốc độ vươn dài của lá phụ thuộc vào sự thay đổi về thế nước của lá và khả năng cung cấp nước của đất. Khi gặp điều kiện khô hạn hoặc nhiệt độ cao, các tính chất lí hoá của keo nguyên sinh thay đổi ví dụ như: tính đàn hồi và độ nhớt bị giảm, đồng thời trao đổi chất cũng giảm, tế bào bị mất nước. Kết quả tế bào sẽ bị chết do mất tính bán thấm, không có hiện tượng co nguyên sinh chất [6]. Đặc điểm này là cơ sở xây dựng các phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn, chịu nóng của cây: phân tích protein, axít amin, ABA... Axit abscicic có vai trò quan trọng đối với khả năng chịu hạn ở ngô. Kết quả nghiên cứu của các tác giả Hu và cs (2012), Jiang và cs (2013) chứng minh vai trò trung tâm trong việc điều khiển sự đóng mở khí khổng duy trì cân bằng nước của cây ngô bị hạn. Sự xuất hiện ABA trong điều kiện hạn có liên quan đến các gen đặc hiệu [34], [38]. 8
Những thực vật sống trong môi trường mất cân bằng về áp suất thẩm thấu đòi hỏi phải có khả năng chống lại được điều kiện khắc nghiệt đó. Tồn tại 2 cơ chế khắc phục sự bất lợi này: (1) Khả năng thích nghi đặc biệt của cấu trúc và hình thái rễ, lá để tránh cho tế bào khỏi mất nước; (2) Khả năng chịu mất nước dựa trên sự thay đổi tinh vi trong sinh hoá tế bào dẫn đến sự xuất hiện và tích lũy các chất hoà tan, protein, amino acid đặc hiệu (proline) [21]. Tính chịu nóng hạn của cây trồng được hình thành trong quá trình tiến hoá tự nhiên, do một hệ đa gen quyết định, biểu hiện trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây [21]. Các gen chịu hạn của những cây hạn sinh lý vẫn là vấn đề nghiên cứu lý thú đối với các nhà khoa học. Nghiên cứu cơ sở phân tử của tính chống chịu theo hướng khả năng bảo vệ của tế bào khỏi tác động của điều kiện cực đoan gồm hai nhóm: Nhóm 1: nhóm có chức năng chịu hạn bao gồm MGPT, protein LEA, protein kênh chuyển nước qua màng, đường, proline,... Protein LEA, MGPT và mRNA binding protein đã được nghiên cứu về mặt hóa sinh, và chỉ ra rằng chúng tham gia bảo vệ các cấu trúc đại phân tử như các enzyme, lipit và mRNA khỏi bị mất nước. Proline, glycine, betaine và đường thực hiện chức năng như các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu [21], [41]. Nhóm 2: các protein có chức năng điều khiển sự biểu hiện gen và có thể có chức năng trong việc phản ứng đối với tình trạng hạn như protein kinase, nhân tố phiên mã và các enzyme trong chuyển hoá phospholipit. Gen mã hoá cho nhân tố phiên mã có chứa DNA binding motif. Chúng có vai trò điều hoà các gen chức năng dưới tác động của điều kiện cực đoan [40]. Phần lớn các gen chịu cảm ứng điều hiện khô hạn đều cảm ứng với điều kiện mặn. Một trong số gen này còn chịu cảm ứng điều kiện lạnh. Những đường dẫn truyền tín hiệu này chia thành 2 loại: (1) Phụ thuộc vào ABA (đòi hỏi tổng hợp protein MYC, MYB hoặc không cần); (2) Không phụ thuộc vào ABA, yếu tố phản ứng với mất nước DRE tham gia vào việc điều hòa biểu hiện gen. 9
DRE được đặt tên cho trình tự gồm 9 bp TACCGACAT. Yếu tố protein gắn với trình tự DRE (DREBS) ở vùng promoter. Những protein này chứa các các vùng bảo thủ như các protein EREBP (tham gia biểu hiện ethylene responsive gene), AP2 (tham gia trong quá trình biểu hiện kiểu hình của thực vật có hoa). Các gen rd19, rd21 mã hóa cho thiol protease; erd1 mã hóa cho tiểu phần điều hòa của protease CLP, là những gen chỉ cảm ứng bởi hạn, mà không cảm ứng bởi ABA [6]. Hướng tiếp theo về nghiên cứu sử dụng công nghệ gen tăng cường tính chống chịu là: điều khiển sự biểu hiện và hoạt tính của các hệ vận chuyển K + (qua hoạt tính của protein tạo kênh chuyển - aquaporin); tăng cường sự thoát các ion Na+ của tế bào rễ, tonoplast; tăng cường điều chỉnh áp suất thẩm thấu; tăng cường cơ chế bảo vệ tế bào bằng các phản ứng trao đổi chất đặc hiệu trong tế bào nhờ có protease, protein sốc nhiệt, loại bỏ các gốc tự do... [6]. Một trong những cơ chế để nâng cao khả năng chịu hạn và chịu muối là điều chỉnh áp suất thẩm thấu và loại bỏ các gốc tự do. Những thử nghiệm đầu tiên về hướng này đã được thực hiện. Nguyễn Thị Thuý Hường (2011) đã chuyển gen P5CS mã hóa enzyme tham gia tổng hợp proline vào cây thuốc lá. Sau khi gây hạn nhân tạo, hàm lượng proline tăng rất mạnh so với trước gây hạn ở tất cả các dòng cây nghiên cứu, đặc biệt các dòng cây chuyển gen. Sau 9 ngày gây hạn, proline ở cây đối chứng không chuyển gen tăng 206,8 %, trong khi ở cây chuyển gen tăng từ 259,5- 451,8% [4]. Từ những năm 90 của thế kỷ XX đến nay, đã có nhiều công trình trong nước quan tâm nghiên cứu đến khả năng chịu hạn của cây ngô. Đó là các kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô trên đồng ruộng [10]; đánh giá khả năng chịu hạn của cây ngô non trong điều kiện hạn nhân tạo [8], [14]; phân lập gen dehydrin dhn1/rab17 từ DNA hệ gen [5], [6]; nghiên cứu chọn tạo dòng thuần ngô bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn [2], [12]; nghiên cứu hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen ở ngô [11]... Hiện nay trên thế giới cũng đã và đang tiến hành một hướng nghiên cứu về sắc tố anthocyanin liên quan 10