Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá đa dạng di truyền và xác định marker phân tử đặc trưng nhận dạng một số mẫu Sâm Lai Châu

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -----------***----------- KHƯƠNG THỊ BÍCH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ ĐẶC TRƯNG NHẬN DẠNG

MỘT SỐ MẪU SÂM LAI CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT -----------***----------- KHƯƠNG THỊ BÍCH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ ĐẶC TRƯNG NHẬN DẠNG

MỘT SỐ MẪU SÂM LAI CHÂU Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mãsố: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. KHUẤT HỮU TRUNG

HÀ NỘI - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân

tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS.Khuất Hữu Trung. Các số liệu và tài liệu

được trích dẫn trong lu ận văn là trung th ực.Kết qu ả nghiên cứu này không

trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó.

Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.

Hà Nội, tháng năm 2018

Tác giả

Khương Thị Bích

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin g ửi lời cảm ơn chân thành đến Vi ện Sinh thái và Tài nguyên

Sinh vật, Viện Di truyền Nông nghiêp, các thầy giáo, cô giáo đã tạo điều kiện

thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành khóa học này.

Tôi xin bày t ỏ lòng bi ết ơn sâu s ắc đến Phó giáo s ư - Ti ến sĩ Khuất

Hữu Trung - Phó viện trưởng - Vi ện Di truy ền Nông nghi ệp, người đã tận

tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành lu ận văn: “Đánh giá đa dạng di

truyền và xác định marker phân t ử đặc trưng nhận dạng một số mẫu Sâm

Lai Châu.”

Tôi xin được cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện

Di truyền Nông nghiệp luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về

cơ sở vật chất - trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin bày t ỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình, đặc

biệt là bố mẹtôi, những người luôn bên cạnh và hỗ trợ tôi về mọi mặt để tôi có

thể hoàn thành t ốt nhi ệm vụ học tập của mình. Nhân d ịp này tôi c ũng trân

trọng cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp những người đã luôn bên cạnh, động viên,

góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập.

Hà Nội, tháng năm 2018

Tác giả

Khương Thị Bích

ii

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT................................................................ v

DANH MỤC BẢNG.......................................................................................vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH.............................................................................vii

PHẦN I: MỞ ĐẦU.......................................................................................... 1

PHẦN II: NỘI DUNG..................................................................................... 4

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 4

1.1. Tình hình nghiên cứu cây Sâm Lai Châu trên Thế giới và ở Việt Nam... 4

1.1.1. Tên gọi, phân loại và hình thái............................................................4

1.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố ..........................................................11

1.1.3. Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế ........................................................14

1.1.4. Các thành phần hoạt chất ở chi Panax..............................................16

1.2. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm.....................................19

1.3. Nghiên cứu bảo tồn và phát triển Sâm.................................................21

1.4. Tổng quan phương pháp nghiên cứu về phân loại thực vật..............22

1.4.1. Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái..................................22

1.4.2. Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử ........................................23

Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................30

2.1. Vật liệu....................................................................................................30

2.2. Hóa chất..................................................................................................31

2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................31

2.3.1. Tách chiết ADN tổng số ....................................................................31

2.3.2. Chu trình PCR...................................................................................32

2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose..............................................33

2.3.4. Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen..............................................34

2.3.5. Giải trình tự........................................................................................34

iii

Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................35

3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số............................................................35

3.2. Phân tích các sản phẩm khuếch đại của 25 mẫu nghiên cứu.............36

3.3. Kết qu ả kh ảo sát trình t ự vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 ở các

mẫu nghiên cứu.....................................................................................36

3.4. Kết quả so sánh trình t ự nucleotid vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2

của các mẫu nghiên cứu........................................................................40

3.5. Kết quả xây dựng cây quan h ệ phát sinh gi ữa 25 mẫu nghiên

cứu...........................................................................................................45

3.6. Kết quả xác định Marker phân tử phân biệt 25 mẫu Sâm nghiên

cứu...........................................................................................................51

PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................58

CÔNG TRÌNH C ỦA TÁC GI Ả ĐÃ CÔNG B Ố LIÊN QUAN

ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN............................................................................59

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................60

PHỤ LỤC: TRÌNH TỰ 25 MẪU SÂM LAI CHÂU NGHIÊN CỨU.......70

iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragments Length Polymorphism

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide

DMSO Dimethyl sulfoxide(CH3)2SO

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTPs Deoxynucleoside triphosphates

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

EtBr Ethidium Bromide

ISSR Inter simple sequence repeat

ITS Internal Transcribed Spacer

PCR Polymerase chain reaction. Phản ứng nhân theo chuỗi

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA Ribonucleic acid

SCAR Sequence Characterised Amplification Regions

SSR Simple sequence repeats

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Danh sách 25 mẫu Sâm..................................................................30

Bảng 2.2. Danh sách các mồi ITS sử dụng trong nghiên cứu.........................31

Bảng 3.1. Độ dài các trình t ự thuộc 25 mẫu Sâm nghiên c ứu và mẫu

tham chiếu KJ418192.1 .................................................................38

Bảng 3.2. Thành ph ần bốn loại nucleotide của 25 mẫu nghiên cứu và

mẫu tham chiếu KJ418192.1 .........................................................39

Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền giữa 25 mẫu nghiên cứu và mẫu

tham chiếu KJ418192.1 vào trình t ự vùng ITS1-5,8SrRNA-

ITS2................................................................................................46

vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Sơ đồ vùng ITS c ủa các gen rDNA vùng nhân và v ị trí của

các mồi ITS (Embong et al., 2008)..............................................29

Hình 3.1: Ảnh điện di ADN tổng số của 25 mẫu Sâm nghiên cứu.................35

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 trên

25 mẫu Sâm v ới thang chu ẩn Marker 100bp và m ẫu đối

chứng trắng (H2O)........................................................................36

Hình 3.3: Một đoạn giản đồ có các đỉnh với 4 màu sắc khác nhau tương

ứng với 4 loại nucleotide của mẫu Sâm PT7...............................37

Hình 3.4: Kết quả gióng hàng, gióng c ột 25 trình t ự ITS1-5,8SrRNA-

ITS2 của 25 mẫu Sâm và mẫu tham chiếu KJ418192.1 ..............44

Hình 3.5. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 25 mẫu nghiên

cứu................................................................................................47

Hình 3.6. Cây quan hệ phát sinh giữa 25 mẫu nghiên cứu và mẫu tham

chiếu KJ418192.1.........................................................................48

vii

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài

Tại các n ước châu Á, Nhân sâm được coi là v ị thu ốc quý đứng đầu

trong các lo ại thuốc quý đông y (sâm, nhung, qu ế và ph ụ). Nhân sâm có tác

dụng kích thích nh ẹ ở li ều th ấp làm t ăng vận động, tăng trí nh ớ nh ưng tác

dụng ức chế ở liều cao đối với hệ thần kinh; làm t ăng sinh lực chống lại sự

mệt mỏi, giúp hồi phục sức lực làm tăng sự thích nghi của cơ thể trước những

bất lợi của điều kiện môi tr ường sống; tác dụng bảo vệ tế bào giúp h ồi phục

số hồng cầu, bạch cầu bị gi ảm; tác dụng tăng nội ti ết tố sinh d ục; tác d ụng

kháng viêm; tác d ụng điều hoà ho ạt động của tim; tác d ụng hạ cholesterol

máu, ch ống xơ vữa động mạch; tác d ụng gi ải độc gan và tác d ụng kháng

khuẩn nhất là đối với Streptococcus gây bệnh viêm họng.

Sâm Lai Châu ( Panax vietnamensis var. fuscidiscus) có tên gọi khác là

Tam thất hoang Mường Tè;Tam thất rừng; Tam thất đen. Năm 2013, loài cây

này đã được công bố phát hiện tại Lai Châu và đăng trên các tạp chí khoa học

quốc tế và đăng ký mẫu DNA vào ngân hàng Genbank. Tính đến năm 2016

thì diện tích phân bố tự nhiên của Sâm Lai Châu đã giảm đáng kể chỉ còn lại

rất ít trong r ừng rậm nguyên sinh m ưa mùa nhi ệt đới chưa bị tác động hoặc

tác động nhẹ thuộc vùng núi cao xã Pa Vệ Sử, xã Ka Lăng, xã Thum Lũm, xã

Tá Bạ huyện Mường Tè, cây phân bố rải rác.

Sâm Lai Châu có tác d ụng tương tự như Nhân sâm: củ và thân rễ dùng

làm thuốc bổ; tăng lực, chống suy nhược, hồi phục sức lực bị suy giảm, kích

thích nội tiết sinh dục, tăng sức chịu đựng, giải độc và bảo vệ gan, điều hoà

thần kinh trung ương, điều hoà tim m ạch, ch ống xơ vữa động mạch, gi ảm

đường huyết và có thể dùng làm thuốc trị viêm họng.

Hiện nay, t ại Vi ệt Nam, Sâm Lai Châu còn l ại rất ít trong t ự nhiên.

Chính vì vậy, việc bảo tồn và phát triển loại dược liệu quý báu này không ch ỉ

1

góp phần xoá đói giảm nghèo, tạo công ăn việc làm cho bà con vùng núi mà

còn tạo nguồn dược liệu quý, sạch để cung cấp cho các công ty dược phẩm và

người tiêu dùng. Để góp phần nghiên cứu bảo tồn loài cây quý hi ếm này, tôi

tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền và xác định marker

phân tử đặc trưng nhận dạng một số mẫu SâmLai Châu”.

2. Mục đích nghiên cứu

Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử để xác định nguồn gốc, mối

quan hệ di truyền của các giống/loài Sâm Lai Châu, phân bi ệt Sâm Lai Châu

với với loài khác cùng chi Panax; ph ục vụ cho công tác b ảo tồn, ch ọn tạo

giống và phát triển nguồn gốc dược liệu quý giá có giá trị kinh tế.

Xác định được các ch ỉ thị/marker phân tử đặc trưng để nhận dạng một số

nguồn gen Sâm Lai Châutrong tập đoàn nghiên cứu.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: 25 mẫu Sâm thu th ập tại 5 địa điểm ở Lai Châu

(Ka Lăng - Mường Tè, Pa Vệ Sử - Mường Tè, Thu Lũm - Mường Tè; Sìn

Hồ; Tam Đường và Phong Thổ).

- Thời gian thu mẫu: tháng 5 - 6/2017

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2017 đến tháng 8/2018.

- Địa điểm nghiên cứu: thực hiện các thí nghi ệm phân tử tại Bộ môn Kỹ

thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp.

4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học

Hiểu bi ết về đa dạng di truy ền ở mức phân t ử của các m ẫu Sâm Lai

Châu thu được, là c ơ sở để phân lo ại, tuy ển ch ọn nh ững ngu ồn gen ưu tú

phục vụ cho công tác ch ọn và lai t ạo giống mới. Các marker phân t ử nhận

biết chính xác m ột số ngu ồn gen Sâm b ản địa quý được sử dụng để xác

2

định tính đúng gi ống ph ục vụ công tác nhân gi ống và ki ểm soát cây con

giống ở giai đoạn sớm.

Kết qu ả của đề tài r ất có ý ngh ĩa trong vi ệc xây dựng và tiêu chu ẩn hoá

phương pháp đánh giá ngu ồn gen làm c ơ sở cho vi ệc đăng kí b ản quy ền ở

Ngân hàng gen thế giới, khẳng định chủ quyền Quốc gia về nguồn tài nguyên

thực vật bản địa.

Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài góp phần thu thập các nguồn gen Sâm thu thập tại Lai Châu.

Kết quả đề tà i góp ph ần bảo tồn và s ử dụng hợp lí ngu ồn gen Sâm Lai

Châu của Vi ệt Nam, phục vụ cho công tác chọn tạo gi ống mới, chu ẩn hóa

nguồn cây giống dược liệu góp phần nâng cao thương hiệu cho sản phẩm Sâm

Lai Châu của Việt Nam ở khu vực và trên thế giới.

3

PHẦN II: NỘI DUNG

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nghiên cứu cây Sâm Lai Châu trên Thế giới và ở Việt Nam

1.1.1. Tên gọi, phân loại và hình thái

v Tên gọi

Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus K.Komatsu,

S.Zhu & S.Q.Cai) là cây thân th ảo, củ và rễ được sử dụng làm thu ốc từ rất

lâu đời thuộc chi Nhân sâm (Panax L.), họ Ngũ gia bì (Araliaceae).

Các loài Nhân sâm được phân biệt dựa vào hình thái, màu s ắc và được

gọi theo tên địa phương; ví dụ một số loài Sâm chính như sau:

- Panax vietnamensis Ha et Grushv.: sâm Việt Nam, sâm Ngọc Linh, sâm Nga

Mi, mọc hoang dại, được trồng chủ yếu ở Kon Tum và Quảng Nam.

- Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M. Feng: m ọc hoang d ại ở mi ền Nam

Trung Quốc và Bắc Việt Nam.

- Panax ginseng C.A. Meyer: sâm Tri ều Tiên, sâm Cao ly, nhân sâm, h ồng

sâm, là loài hoang dại, hiện nay rất hiếm, được trồng ở Đông Bắc, Châu Á.

- Panax quinquefolius L.: sâm Mỹ, sâm Tây Dương, mọc hoang, được trồng ở

vùng Bắc Mỹ.

- Panax notoginseng F.H. Chen ex C.Y. Wu et K.M. Feng: sâm Trung Qu ốc,

tam thất, điền th ất, phân bố loài hoang d ại ch ưa rõ, được trồng ở Vân Nam

Trung Quốc.

- Panax japonicus C.A. Meyer: sâm Nh ật Bản, sâm lá tô, sâm đốt tre, m ọc

hoang dại ở Nhật Bản và Nam Trung Quốc.

v Phân loại

Phân loại Sâm Lai Châu:

Giới : Plantae (Thực vật)

Ngành : Magnoliophyta (Ngọc Lan)

4

Lớp : Magnoliopsida (Ngọc Lan)

Bộ : Araliales (Nhân sâm)

Họ : Araliaceae (Nhân sâm)

Chi : Panax (Sâm)

Loài :Panax vietnamensis

Thứ loài: ( Panax vietnamensis var. fuscidiscus K.Komatsu,

S.Zhu & S.Q.Cai)

Theo Nguyễn Huy Sơn (2016) Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var.

fuscidiscus) có tên g ọi khác là Tam th ất hoang M ường Tè;Tam th ất rừng;

Tam thất đen[6]. Loài cây này được Zhu và cộng sự đã mô tả là một thứ mới,

bậc phân lo ại dưới loài c ủa Sâm ng ọc linh ( Panax vietnamensis). Thứ này

được phát hiện đầu tiên tại vùng Jinping, phía nam của tỉnh Vân Nam - Trung

Quốc. Đây là cây dược liệu đặc hữu có giá trị thuộc chi Sâm (Panax), họ Ngũ

gia bì (Araliaceae).Trong k ết quả nghiên cứu của mình tác gi ả đã mô tả thu

mẫu được cả quả chín đốm đen.

Chi Sâm Panax L. gồm có 15 loài và d ưới loài và h ầu hết chúng là

nguồn dược liệu cho y học cổ truyền như các loại Nhân Sâm, Nhân Sâm Hoa

kỳ, Tam th ất, Nhân Sâm Nh ật bản và Sâm Ng ọc Linh (Nguy ễn Tập, 2005)

[8].Mới gần đây nhóm nghiên c ứu của Phan Kế Long et al., (2013) đã phát

hiện th ứ Panax vietnamensis var. fuscidiscus nói trên có phân b ố ở tỉnh Lai

Châu và được gọi tên là Sâm Lai Châu. Loài này có phân b ố hẹp trên dãy núi

Pu Si Lung và lân c ận (Mường Tè và Tây Sìn H ồ, giáp biên gi ới với Trung

Quốc) và dãy núi Pu Sam Cáp nằm giữa các huyện Sìn Hồ và Tam Đường với

Thành phố Lai Châu, tỉnh Lai Châu. Sâm Lai Châu b ị người dân bản địa khai

thác, sử dụng làm thuốc và bán sang Trung Qu ốc, đang bị đe doạ tuyệt chủng

ở mức độ trầm trọng (CR) (Phan Kế Long et al., 2013) [52].

5

v Đặc điểm hình thái

Chi Sâm Panax L. thu ộc họ Ng ũ gia bì (Araliaceae) được mô t ả sớm

nhất và được ứng dụng phổ biến nhất.Chi Sâm được mô tả đầu tiên cho hai

loài là P. quinquefolius L. và P. trifolius L. với đặc điểm khác biệt so với các

chi khác trong h ọ là b ầu 2 ô, hoa m ẫu 5, x ếp van hay x ếp lợp (Linnaeus,

1754)[48].De Candolle (1830) đã sắp xếp một số loài thu ộc chi Nothopanax

vào chi Panax[23]. Tuy nhiên, Decaisne và Planchon (1854) l ại cho rằng đặc

điểm chính của chi Panax là đài xếp van, nên chuy ển 2 loài P. quinquefolius

và P. trifolius sang chi Aralia, đồng th ời đồng nh ất hoá các chi Polyscias

Forest, Cheirodendron Nutt, Pseudopanax Koch và Maralia Pet. vào chi

Panax[22].Như vậy, với cách phân lo ại như trên, các tác gi ả đã cho rằng đặc

điểm hình thái của chi Panax bên cạnh đài xếp van còn có đặc điểm thân gỗ

và thân th ảo. Đồng ý v ới quan điểm trên, các tác gi ả Bentham và Hooker

(1867), Clarke (1879) ti ếp tục xác nhập chi Nothopanax vào chi Panax, đồng

thời chuyển chi Panax vào tông (tribe) Panaceae[17], [19].

Seemann (1868) đã nghiên cứu sự khác bi ệt giữa chi Panax so với chi

khác trong họ Araliaceae là: thân d ạng củ, đài 5, xếp lợp, bầu 2 ô. D ựa vào

kết qu ả trên, tác gi ả đã chuy ển 61 loài không có thân d ạng củ ra kh ỏi chi

Panax, đồng thời chuyển các loài có thân d ạng củ trước đây ở các chi khác

vào chi Panax, và chi này chỉ còn lại các loài: P. trifolium L., P. quinquefolius

L., P. ginseng Mey., P. pseudoginseng Wall., P. japonicus Mey. và P.

bipinnatifidus Seem. Với loài P. fructicosus có đặc điểm là đài xếp van, tác

giả xếp vào chi Nothopanax và đồng th ời lấy loài này là danh pháp cho chi

Nothopanax (Seemann, 1868) [57]. N ăm 1987, Harm cho r ằng chi Panax có

nguồn gốc từ chi Aralia dựa trên các đặc điểm của các loài Nhân sâm phân bố

trên thế giới như: cơ quan sinh sản, cơ quan sinh dưỡng[32].Britton và Brown

(1913) cho rằng loài P. quinquefolius được mô tả lần đầu tiên và có đặc điểm

6

đại diện cho chi Panax như thân dạng củ, hoa mẫu 5 xếp van hay xếp lợp, bầu

2 ô, nên lấy loài này để phân loại danh pháp cho chi [18].

Nhiều nghiên cứu cho rằng chi Panax có mối quan hệ gần gũi với chi

Aralia(Hara 1970; Wen, 1993; Wen và Zimmer, 1996; Plunkett et al., 1996;

Xiang và Lowry, 2007)[31], [65], [66], [54], [69]. Theo các tác giả, cách phân

loại các loài thuộc chi Panax sẽ dựa vào hình thái của thân rễ (Rhizome type:

thân rễ có dạng thân củ (carot type); thân r ễ có đốt kéo dài; và thân r ễ có đốt

ngắn nh ư đốt trúc); các đặc điểm cơ quan sinh d ưỡng; đặc điểm hình thái,

hình thái gi ải ph ẫu, hạt ph ấn và sinh h ọc phân t ử. Bên c ạnh cách phân lo ại

dựa trên các hình thái còn có một số nghiên cứu phân loại khác dựa trên thành

phần hoạt chất và số lượng nhiễm sắc thể (Tsai và Feng, 1975; Yang, 1981)

[63], [70].

Ví dụ, Tsai và Feng (1975) đã chỉ ra có 2 nhóm triterpenoid saponin

chính tồn tại trong các loài Sâm khác nhau: Triterpenoid dammarane g ồm có

các loài: P. ginseng, P. notogingseng và Triterpenoid oleanane g ồm các loài:

P. pseudoginseng , P. zingiberensis , P. japonicus , P. japonicus var.

angustifolius, P. japonicus var. major, P. japonicus var. bipinatifidus, P.

stipuleanatus. Ngoài ra, k ết hợp với các đặc điểm hình thái c ủa thân rễ, các

tác gi ả chia các loài Sâm ở Trung Qu ốc thành 2 nhóm chính: Nhóm 1 g ồm

các loài có thân r ễ ng ắn, gi ống thân c ủ cà r ốt, hạt lớn, đồng th ời ho ạt ch ất

chính là tetracyclic triterpenoid có trong thân rễ; Nhóm 2 gồm các loài có thân

rễ dài hay d ạng đốt trúc, h ạt nh ỏ, đồng th ời có ho ạt ch ất pentacyclic

triterpenoid. Yang (1981) đã ch ỉ ra số lượng nhi ễm sắc th ể của 7 loài Sâm.

Tác gi ả cũng cho r ằng hai loài P. gingseng và P. quinquefolius không là t ổ

tiên của chi Panax vì 2n = 48 (44), mà t ổ tiên c ủa chi Panax ph ải là P.

japonicus với bộ nhiễm sắc thể 2n = 24).

7

Tuy nhiên, s ố lượng các loàiSâm c ủachi Panax vẫn ch ưa rõ ràngvì

một số tác gi ả xác định cùng m ột loài nh ưng lại cho các k ết quả khác nhau.

Nhiều nghiên c ứu xác định các loài Sâm đã sử dụngphương pháp hình thái

học, tế bào h ọc, gi ải ph ẫu học, sinh lý h ọc và sinh thái h ọc (Woo et al.,

2004; Yu et al., 2009; Jee et al., 2014; Bai et al., 2015; Kim et al., 2015)

[68], [73], [35], [13], [40]. S ử dụng nh ư đặc điểm hình thái để phân bi ệt

giữa các loài có th ể dẫn đến sự nhầm lẫn bởi vì các đặc điểm biểu hi ện có

thể là k ết qu ả kết hợp của di truy ền và môi tr ường (Jo et al., 2013) [37].

Hơn nữa, kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng để bổ sung thêm một

mức độ phân lo ại các loài thông qua các nghiên c ứu về DNA (Lim và Choi

1990; Lim et al., 1993; Hon et al., 2003) [46], [47], [33]. Để phân lo ại các

loài th ực vật, các k ỹ thu ật nh ư RFLP, RAPD, AFLP và SSR đã được sử

dụng. Trong đó các k ỹ thuật marker SSR ho ặc microsatellite có ti ềm năng

rất lớn do có kh ả năng phát hi ện tính đa hình rất cao, có th ể phân biệt được

sự sai khácmà không xác định được bằng các marker khác nh ư RAPD và

RFLP(Powell et al., 1996; Kim et al., 2007; Silva et al., 2013)[55], [42],

[58].Những nghiên c ứu ứng dụng marker SSR để đánh giá đa dạng di

truyền, xây d ựng bản đồ di truy ền, so sánh gen, l ựa ch ọn tr ợ giúp c ủa

marker đã mang l ại nhiều kết quả khả quan, vì b ộ gen c ủa Nhân sâm là r ất

lớn (3.12 t ỷ cặp base) và có r ất nhi ều gi ống phát tri ển gần đây. Bảng 1.1

cho th ấy vi ệc phân lo ại các taxon thu ộc chi Panax dựa vào đặc điểm hình

thái với các kết quả rất khác nhau, đòi hỏi cần tiếp tục có những nghiên c ứu

về phân loại.

8

Bảng 1.1: Phân loại các taxon Panax ở Châu Á theo quan điểm của các

nhà nghiên cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1996-2014

Loài Nguồn

Wen và Zimmer (1996)[66] Hệ thống phân loại Dựa trên hình thái và vùng ITS1-5,8S-ITS2

P. aponicus, P.

Zuo et al., (2011, 2014)[75], [76]

Dựa trên hình thái, các barcode ITS, barcode l ục lạp và k ỹ thu ật AFLP

Shu et al., (2003) [61]

Dựa trên hình thái, trình tự gene 18S rDNA và gene matK/trnK var. major, P.

Panax ginseng, P. japonicas, P.bipinnatifidus (Sichuan, China), P. omeiensis, P. bipinnatifidus (Hubei, China), P. major ((Syn.: P. japonicus var. major; P. pseudoginseng subsp. himalaicus), P. wangianus (Syn.: P. japonicus var. angustifolius), P. sinensis, P. zingiberensis, P. pseudoginseng, P. notoginseng, P. stipuleanatus P. ginseng, bipinnatifidus, P. elegantior, P. assamicus, P. shangianus, P. variabilis, P. omeiensis,P. major, P. wangianus, P. sinensis, P. zingiberensis, P. vietnamensis, P. pseudoginseng, P. notoginseng,P. stipuleanatus Panax ginseng, P. japonicus (Japan), P. japonicus (China), P. japonicus var. bipinnatifidus P. japonicus pseudoginseng subsp. Himalaicus, P. japonicus var. angustifolius, P. zingiberensis, P. vietnamensis, P. vietnamensis var. fuscidiscus, P. pseudoginseng, P. notoginseng, P. stipuleanatus

9

Ở Việt Nam, loài cây này đã được công bố phát hi ện tại Lai Châu năm

2013 và đăng trên các tạp chí khoa học quốc tế và đăng ký mẫu DNA vào ngân

hàng Genbank. Tính đến năm 2016 thì diện tích phân bố tự nhiên của Sâm Lai

Châu đã giảm đáng kể chỉ còn lại rất ít trong rừng rậm nguyên sinh mưa mùa

nhiệt đới chưa bị tác động hoặc tác động nhẹ thuộc vùng núi cao xã Pa Vệ Sử, xã

Ka Lăng, xã Thum Lũm, xã Tá Bạ huyện Mường Tè, cây phân bốrải rác.

Sâm Lai Châu là cây th ảo, sống nhiều năm, cao 40-80 cm. Thân rễ hợp

trục, nằm ngang hay hơi chếch, mập, nạc có nhiều chỗ lõm do vết thân để lại;

ít khi phân nhánh; đường kính củ 1,5-3 cm. M ỗi cây th ường có 1 thân mang

lá, ít khi 2 hoặc 3 trừ trường hợp đầu thân rễ bị tổn thương, sau phân nhánh và

mọc lên s ố ch ồi thân t ương ứng. Thân đơn độc, vỏ màu đen ho ặc lục, mọc

thẳng đứng, nh ẵn, cao 0,3m (khi ch ưa có hoa); 0,7m (khi có hoa); khi t ươi

đường kính 0,3-0,6 cm, mặt cắt ngang hình tròn hay hơi có 3 cạnh, xốp ở giữa

khi tươi, rỗng khi khô.

Lá kép chân vịt, gồm 3-4 cái có khi lên đến 5-6 cái, mọc vòng ở ngọn;

có cuống dài 5-10 cm. Lá chét 5; có cu ống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn,

nhọn 2 đầu, 5-13 x 2-4 cm; mép có r ăng cưa, hoặc ở một số ít cây non có th ể

gặp dạng xẻ lông chim nông, mép c ủa thuỳ nông cũng khía răng cưa; thường

có lông ở gân mặt trên lá.

Mùa ra hoa tháng 4-5, qu ả tháng 7-9 (10). Tái sinh ch ủ yếu tự nhiên

bằng hạt. Thân mang lá lụi hàng năm vào mùa đông, chồi mới mọc lên từ đầu

thân rễ vào đầu mùa xuân năm sau.

Cây Sâm Lai Châu có phân b ố tập trung ch ủ yếu ở tỉnh Lai Châu, cây

có cụm hoa tán đơn, mọc ở ng ọn, hi ếm khi có thêm 1 tán ph ụ, nhỏ. Cuống

cụm hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, giữa vòng lá cao tán lá, dài đến 25 cm, gấp

1,5-2 lần cuống lá. Cụm hoa có dạng hình cầu. Lá hoa tổng bao hình tam giác

hẹp, dài kho ảng 2mm, mép nguyên. Cu ống hoa dài 1-1,5cm, mang dày đặc

10

nhú mịn, mọng chất tiết giống như trên cu ống cụm hoa. Cụm hoa có đường

kính 2,5-4cm. Số hoa trên 1 tán từ 70-100 hoa, có khi hơn tuỳ vào kích thước

và tu ổi cây, nh ưng tỷ lệ đậu qu ả th ấp, ch ỉ đạt từ kho ảng 40-50%. Hoa màu

vàng xanh nhạt, 5 lá đài nhỏ; 5 cánh hoa; 5 nh ị; bầu 2 ô, có đầu nhuỵ thường

chẻ đôi. Nh ị đực màu tr ắng, ch ỉ nh ị hình s ợi, dài kho ảng 2,5mm; bao ph ấn

hình thuôn ngắn, dài khoảng 1mm. Đĩa tuyến mật trên đỉnh bầu thoạt đầu hơi

hình nón, sau dẹt dần, toàn bộ màu mận chín.

Thường có đến 80% số lượng hoa ch ỉ có một ô cùng m ột vòi nguyên

phát triển, ô còn lại sớm bị tiêu giảm. Quả mọng, gần hình cầu dẹt (thận) dẹt

theo hướng lưng bụng, đường kính 0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ có chấm đen.

Có 1 hạt, gần giống hạt đậu tròn, màu xám trắng, vỏ cứng, có rốn hạt.

1.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố

Trong vùng phân b ố, Sâm m ọc tự nhiên d ưới tán r ừng có độ cao t ừ

1500m tr ở lên, phù h ợp với điều ki ện khí h ậu ôn hòa, mát m ẻ quanh n ăm. Nhiệt độ trung bình t ừ 20 0C đến 25 0C, tổng tích ôn t ừ 7200-7500 0C/năm. Nhiệt độ tối thấp trên 50C và nhiệt độ tối cao là 330C, nhiệt độ quá cao và thấp

sẽ ảnh hưởng tới sinh tr ưởng của cây. Hạt Sâm có th ể mọc mầm trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời kỳ hạt Sâm mọc yêu cầu nhiệt độ từ 100C trở nên. Cây

Sâm mọc tự nhiên dưới tán rừng nên yêu c ầu về độ ẩm không khí và độ ẩm

đất tương đối cao từ 80% đến 90% so với độ ẩm tối đa. Ở thời kỳ sinh trưởng,

thân khí sinh yêu cầu độ ẩm cao, lượng mưa trung bình từ 200-250 mm/tháng.

Ngoài ra, trong quá trình sinh tr ưởng của cây, các yếu tố như mưa dông, mưa

đá, sương muối đều không thích h ợp, gây tổn hại đến cây. Ch ế độ ánh sáng,

đặc biệt là chất lượng ánh sáng và th ời gian chiếu sáng rất quan trọng đối với

quá trình sinh tr ưởng và phát tri ển của cây Sâm. Ch ế độ ánh sáng tr ực xạ

chiếm 10% và tán xạ chiếm 90% là ánh sáng được xem là thích hợp nhất cho

sinh trưởng của cây. Cây Sâm phát triển tốt dưới tán rừng, nơi đất đai tơi xốp,

11

có lớp mùn dày, đủ ẩm và có điều kiện thông thoáng t ốt. Cây cần một lượng

đạm nhất định, pH trung tính, giàu lân và kali t ạo điều kiện cho củ Sâm tích

lũy các ho ạt chất có năng suất cao, ch ất lượng tốt. Các lo ại đất trũng, nghèo

dinh dưỡng đều không thuận lợi cho sự sinh trưởng của cây.

Sự phân bố của chi Panax L. chỉ xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài t ừ

vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc Mỹ bao gồm Bắc Hoa Kỳ và

Tây-Nam Canada (có 2 loài P. quinquefolius và P. trifoliatus. Vùng Đông Bắc

Á (gồm Viễn Đông Nga, Đông Bắc Trung Quốc, bán đảo Triều Tiên và Nh ật

Bản) có 2 loài là P. ginseng và P. japonica. Trung tâm phân bố của chi Panax

L. có thể từ vùng Tây- Nam của Trung Quốc lan toả xuống phía Bắc của Việt

Nam. Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung

Quốc) và Lào Cai (Việt Nam), ở đây đang có tới 7 loài và dưới loài (thứ) mọc

hoàn toàn tự nhiên, 2 loài tr ồng là P. notoginseng (nhập từ Bắc Mỹ) và P.

pseudoginseng (không tìm thấy trong tự nhiên, nhưng giả thiết có nguồn gốc từ

vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó).

Đây có th ể coi là trung tâm phân b ố của chi Sâm ( Panax L.) của thế giới. Ở

Bắc Mỹ hiện có 3 loài (P. notoginseng; P. quinquefolius và P. trifoliatus). Giới

hạn cu ối cùng về phía Nam c ủa chi Panax L. là loài Sâm Vi ệt Nam (Panax vietnamensis) ở Miền Trung của Việt Nam, tại 14015’ vĩ độ Bắc.

Năm 2016, Ph ạm Quang Tuy ến trong hội thảo “Bảo tồn và phát tri ển

Sâm Lai Châu tại huyện Mường Tè” trong báo cáo v ề đặc điểm sinh thái cây

Sâm Lai Châu v ề cơ bản thống nhất với những mô tả về hình thái lá, hoa và

hạt của Phan Kế Long et al., (2013) [11]. Nh ưng tác giả có bổ sung đặc điểm

quan trọng để nhận biết cây Sâm Lai Châu và phân bi ệt với các loài cùng chi

Panax đó là: qu ả khi chín có màu đỏ ch ấm đen ở đầu. Đây là đặc điểm dễ

nhận bi ết để phân bi ệt Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus )

với Tam th ất hoang ( Panax stipuleanatus ) và Sâm v ũ di ệp (Panax

12

bipinnatifidus) khi chín h ạt chỉ có màu đỏ. Như vậy, các kết quả nghiên cứu

phân loại, tên gọi và mô tả đặc điểm hình thái cây Sâm Lai Châu về cơ bản đã

đầy đủ thông tin làm c ơ sở nhận biết đặc trưng loài và d ưới loài. Tuy nhiên,

một số mẫu cây mọc tự nhiên vẫn có đặc điểm hình thái thân và c ủ màu sắc

khác nhau có thể do các yếu tố về vùng địa lý (xuất xứ) hoặc hoàn cảnh sống.

Đây là yếu tố quan trọng để xác định mẫu giống trong quá trình chọn giống.

Ở Việt Nam, Sâm Lai Châu có đặc điểm ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác

trên đất có nhi ều mùn, dưới tán rừng kín th ường xanh ẩm, trên đất có nhi ều

mùn, hoặc rừng có xen lẫn với sặt gai, ở độ cao 1400-2300m. Độ cao thường

gặp từ 1400-1900m. Thực vật đi cùng thường là các loài cây thân gỗ, cây bụi,

cây th ảo thu ộc các h ọ: Ng ọc Lan (Magnoniaceae), D ẻ (Fagacea), Re

(Lauraceae), Ngũ gia bì (Araliaceae), Đỗ quyên (Ericaceae), Hồi (Illiciaceae),

Gừng (Zingiberacaea),... nhiều chỗ có Sặt gai (Sinarudinaria griffiana) chiếm

ưu thế và một số loài Dương xỉ khác.

Đất đai, thổ nhưỡng: Sâm Lai Châu phát tri ển trên các nhóm: Đất mùn

trên núi cao >1700m; đất mùn vàng đỏ trên núi cao 700-1700m. Đất rừng có

Sâm lai châu phân b ố nhìn chung thu ộc loại đất chua (pH 3,5-5,7); đất khá

màu mỡ hàm l ượng các bon h ữu cơ 2,88-7,23%; hàm l ượng nit ơ tổng số

0,25-0,76%.

Khí hậu: Số liệu khí hậu (bảng 1.2) được thu thập và kế thừa từ số liệu

được tổng hợp ở bảng sau:

Bảng 1.2: Đặc điểm khí hậu các xã vùng cao huyện Mường Tè

Địa điểm nghiên cứu Lượngmưa (mm/năm) Độ ẩm (%) Nhiệt độ trungbình năm (độ)

3.000 87,5 15 Các xã vùng cao huyện Mường Tè

(Nguồn dẫn: Niêm giám thống kê tỉnh Lai Châu, 2005-2010)

13

Sâm Lai Châu là cây ưa ẩm, khí hậu mát quanh n ăm và lạnh về mùa

đông. Kết quả điều tra đặc điểm khí hậu tại các xã vùng cao huyện Mường Tè

cho th ấy tổng lượng mưa trong n ăm trung bình là 3.000mm/n ăm; Độ ẩm không khí 87,5%; Nhiệt độ trung bình năm là 150C. Kết quả điều tra này một

lần nữa khẳng định cây Sâm Lai Châu là cây ưa ẩm (87%), khí hậu mát quanh năm (trung bình kho ảng 150C).Kết quả nghiên cứu này là c ơ sở cho vi ệc lựa

chọn địa điểm trồng bảo tồn và phát triển cây Sâm tại Lai Châu.

1.1.3. Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế

Tại các n ước Châu Á, Nhân sâm được coi là v ị thu ốc quý đứng đầu

trong các lo ại thuốc quý đông y (sâm, nhung, qu ế và ph ụ). Nhân sâm có tác

dụng kích thích nhẹ ở liều thấp làm tăng vận động, tăng trí nhớ nhưng tác dụng

ức chế ở liều cao đối với hệ thần kinh; làm tăng sinh lực chống lại sự mệt mỏi,

giúp hồi phục sức lực; làm tăng sự thích nghi c ủa cơ thể trước những bất lợi

của điều kiện môi trường sống; tác dụng bảo vệ tế bào giúp hồi phục số hồng

cầu, bạch cầu bị giảm; tác dụng tăng nội tiết tố sinh dục; tác dụng kháng viêm;

tác dụng điều hoà ho ạt động của tim; tác d ụng hạ cholesterol máu, ch ống xơ

vữa động mạch; tác dụng giải độc gan và tác dụng kháng khuẩn nhất là đối với

Streptococcus gây bệnh viêm họng. Thân rễ và r ễ củ Sâm có th ể dùng nh ư

Nhân sâm làm thu ốc bổ; tăng lực, chống suy nh ược, hồi phục sức lực bị suy

giảm, kích thích nội tiết sinh dục, tăng sức chịu đựng, giải độc và bảo vệ gan,

điều hoà thần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, chống xơ vữa động mạch,

giảm đường huy ết, và có th ể dùng làm thu ốc tr ị viêm h ọng. Ginsenosides,

cáchợp chất hóa học độc đáo của các loài Panax, đang được nghiên cứu để sử

dụng tiềm năng trong y h ọc. Tuy nhiên d ược tính và tác d ụng bổ dưỡng của

Sâm còn gây tranh cãi trong giới học giả phương Tây.

Nhân sâm thương mại được bán tại hơn 35 quốc gia với doanh số vượt

quá tỷ $ 2.1 vào n ăm 2013, trong đó một nửa đến từ Hàn Qu ốc và Trung

14

Quốc là thị trường tiêu thụ lớn nhất (Bae và So, 2013) [12]. Giá trị kinh tế của

các loại Nhân sâm rất khác nhau tùy vào th ời điểm, xuất xứ, loài, độ tuổi, có

nguồn gốc tr ồng hay t ừ tự nhiên. Giá bán Sâm t ự nhiên đắt gấp nhi ều lần

Nhân sâm trồng, giá bán Nhân sâm đỏ (P. ginseng) trồngtại Hàn Quốc là 250

USD/kg còn giá của Sâm tự nhiên cùng loại dao động từ 2000-20.000USD/kg

tùy vào tu ổi. Ở Vi ệt Nam, giá bán c ủa P. vietnamensis khoảng1000-1500

USD/kg, giá bán c ủa P. vietnamensis var. fuscidiscus khoảng 200-300

USD/kg; giá của P. stipuleanatus khoảng 150-250 USD/kg và giá b ản của P.

bipinnatifidus khoảng 100-200 USD/kg. Chính vì có giá tr ị dược dụng và giá

trị kinh tế lớn, mà các quốc gia trên thế giới có các loài thuộc chi Panax phân

bố tự nhiên nh ư Hàn Qu ốc, Mỹ, Canada, Trung Qu ốc… đều đã đưa ra các

chương trình bảo tồn, phát triển và khai thác rất nghiêm ngặt để bảo vệ nguồn

tài nguyên quý hi ếm này (Bai et al., 1997; Jennifer và Hamrick, 2004; Eidus

và Leopold, 2013) [14], [36], [24].

Theo Sách Đỏ Việt Nam (2007) Tam th ất hoang là ngu ồn gen đặc biệt

quý hiếm đối với Việt Nam và thế giới [1]. Tất cả các bộ phận của cây đều có

thể dùng làm thu ốc. Thân rễ thường được dùng làm thu ốc bổ, cầm máu, tăng

cường sinh lực, chống stress. Lá, nụ hoa dùng làm trà u ống có tác d ụng kích

thích tiêu hoá, an thần.

Tam thất có vị ngọt, hơi đắng, tính ôn; có tác dụng chỉ huyết, phá huyết

tán ứ, tiêu th ũng định thống và tư bổ cường tráng. Ngoài ra, Tam th ất có tác

dụng tăng lực rất tốt, tác dụng này giống với tác dụng của Nhân sâm; rút ngắn

thời gian đông máu; tiêu máu ứ và tăng lưu lượng máu ở động mạch vành của

động vật thí nghi ệm. Làm tăng sức co bóp c ơ tim ở liều thấp; tác dụng kích

dục, đối với chức năng nội tiết sinh dục nữ, thể hiện ở các hoạt tính oestrogen

và hướng sinh dục; giãn mạch ngoại vi và không ảnh hưởng đến huyết áp và

hệ thần kinh trung ương; điều hòa miễn dịch; kích thích tâm thần, chống trầm

15

uất. Dựa trên những đặc điểm trên mà Tam thất đã được sử dụng trong đông y

từ khá lâu đời như một vị thuốc quý.

Công trình nghiên c ứu của tác giả Phạm Thanh Huyềncũng đã đạt một

số kết quả về nghiên cứu giá trị của các thành phần hóa học của loàiTam thất

hoang tại Việt Nam.Tác gi ả cũng đã xác định được các thành ph ần hóa học

của Tam thất hoang có Saponin, Phytosterol, tinh dầu, Axit hữu cơ, Acid béo,

hợp chất uronic và đường khử tự do. Ngoài ra, tác gi ả còn xác định sự khác

nhau giữa thành ph ần hóa học tinh dầu lá và b ước đầu xác định dấu vân tay

hóa học của loài góp ph ần vào vi ệc phân lo ại và ki ểm định dược liệu(Phạm

Thanh Huyền, 2007)[2].

Trong Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh v ật

lần thứ 5, Lã Đình Mỡi và nhóm tác giả đã công bố kết quả nghiên cứu về các

loài cây thuốc quý thuộc họ Sâm. Kết quả cho thấy trong rễ của hai loài Sâm

vũ di ệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam th ất hoang ( Panax

stipuleanatusH.T. Tsai et K.M. Feng) phân b ố tại vùng núi Hoàng Liên S ơn

(Lào Cai) ch ứa các h ợp ch ất saponin triterpen thu ộc nhóm olean (nh ư các

chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginseninosid Ro, Rb, Rd, Re, Rg1,

Rg2,...), các phytosterol, đường kh ử tự do, tinh d ầu, các acid h ữu cơ, acid

uronic và các acid béo. Các thành ph ần hóa học chủ yếu của tinh dầu ở cả 2

loài cũng tương tự nhau (như: β-farnesen, germacren D, spatulenol). Cả 2 loài

hiện đã rất hiếm, đã và đang bị de dọa ở mức độ rất nguy cấp (CR. A1a,c,d,

B1+2b,c,e và CR. A1c,d, B1+2b,ce) (Lã Đình Mỡi et al., 2013)[5]. Nhìn

chung, những nghiên cứu sâu về mặt hóa học mới chỉ được thực hiện ở một

số ít các loài thuộc học Sâm.

1.1.4. Các thành phần hoạt chất ở chi Panax

Đến nay, các nhà khoa h ọc đã xác định rất nhiều hoạt chất dược thuộc

các nhóm ginsenoside, polysaccharide, polyacetylene, peptide và amino acid

16

ở các loài Nhân sâm thu ộc chi Panax. Tuy nhiên, thành ph ần dược dụng chủ

yếu được quan tâm là các triterpen saponin (ginsenoside), trong đó nhóm

saponin dammarane và oleane là quan tr ọng nhất. Chính thành ph ần và hàm

lượng của nhóm ho ạt ch ất này quy ết định giá tr ị dược dụng của các taxon

cũng như chất lượng dược liệu.

Ginsenosides hoặc panaxosides là một lớp học của glycosides steroid ,

và saponin triterpene, đặc biệt tìm thấy trong chi Panax nên còn gọi là saponin

Nhân sâm để phân bi ệt với các lo ại saponin trong nhi ều loại thảo dược khác.

Ginsenosides là chất quan trọng trong các mục tiêu nghiên cứu, khi chúng được

xem như là các hợp chất chính đứng đằng sau những hiệu quả của Nhân sâm.

Bởi vì ginsenosides xuất hiện trong Nhân sâm và mộtsố loại thực vật khác cùng

với nhiều hợp nh ất nh ư fenolic hay acid amin protein polyacetylene d ẫn đến

nhiều khó kh ăn trong vi ệc đánh giá về hiệu quả của Nhân sâm, tác động của

chúng rất phức tạp và khó kh ăn để nghiên cứu. Ginsenosides được phân tách

bằng sắc ký cột . Hàm lượng Ginsenoside có thể khác nhau tùy thuộc vào giống

cây Sâm (panax) và giai đoạn sinh tr ưởng, phát tri ển của Nhân sâm vào th ời

gian khác nhau tr ước khi thu ho ạch và cũng bị ảnh hưởng khá nhi ều bởi quy

trình và phương pháp chế biến. Gốc Sâm hay thân củ Sâm còn gọi là rễ chính

là cơ quan được sử dụng th ường xuyên nh ất, ch ứa nhi ều ph ức hợp saponin

Nhân sâm quan tr ọng nhất. Chúng th ường được phân chia thành hai nhóm:

nhóm Rb1 (đặc trưng bởi protopanaxaDiol - PD gồm Rb1, Rb2, Rc và Rd) và

nhóm Rg1 (protopanaxaTriol PT : Rg1, Re, Rf, RG2).

Elyakov và cộng sự đã phân lập từ dịch chiết rễ Nhân sâm nhiều thành

phần có liên kết đường và đặt là “panaxoside”; panaxoside A và B được nhóm

tác gi ả báo cáo năm 1962 và các panaxoside C, D, E, F được công bố năm

1964[27]. Shibata và c ộng sựcũng đã phân lập và mô tả các saponin từ Sâm

tương tự và gọi là “ginsenoside”. Năm 1962, Fujita và công sự đã nghiên cứu

17

dịch chi ết cồn của rễ P. ginseng, P. japonicum và P. quinquefolium , phân

biệt các saponin và thành phần aglycol và sapogenin của chúng bằng cách

thủy phân v ới acid hydrochloric [28]. Đến năm 1963, Shibata và cộng sự

đã lập cấu trúc sapogenin panaxadiol ở dạng dammarane-type tetracyclic

triterpene [59].

Có nhi ều nghiên c ứu cho th ấy sự bi ến động thành ph ần ginsenodide

theo vào tuổi, điều kiện canh tác, vùng tr ồng ở nhiều taxon Panax khác nhau

trên thế giới (Kenneth et al., 2004[38]; Deborah et al., 2005[21]), bi ến động

ginsenodide và các hoạt chất khác theo điều kiện nuôi cấy in vitrocũng như sự

đa dạng và khác bi ệt hóa h ọc của các loài (Kim, 2012[39]; Komatsu et al.,

2005[43]; Quan et al., 2001 [56]).

Quá trình nghiên c ứu, sự đa dạng các ho ạt ch ất có bản ch ất Saponin

được phát hi ện ở chi Panax được hệ thống hóa trong m ột công trình nghiên

cứu mang tính khái quát hóa c ủa các nhà khoa h ọc Hàn Qu ốc. Theo đó, đến

cuối năm 2012, có tối thiểu 289 loại saponin khác nhau được ghi nh ận, phân

loại thành 6 nhóm là protopanaxadiol, protopanaxatriol, octillol, oleanolic

acid, nhóm biến động vị trí chuỗi C17 và một nhóm đa thành phần có cấu trúc

sapogenin khác nhau (Yang et al., 2014) [71].

Có một số nghiên c ứu sử dụng thành ph ần ho ạt ch ất, ch ủ yếu là các

saponin để phân biệt các taxon thuộc chi Panax: Tsai và Feng (1975) khảo sát

thành ph ần ho ạt ch ất trong các loài Sâm ở Trung Qu ốc[63]. Thông qua đó,

các tác gi ả đã ch ỉ ra có 2 nhóm triterpenoid saponin chính t ồn tại trong các

loài Sâm khác nhau: Triterpenoid dammarane và Triterpenoid oleanane. Theo

Osamu Tanaka thì chi Panax có đến 8 loài và 11 taxon d ưới loài được phân

thành các nhóm dựa vào thành phần hoạt chất.

18

1.2.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm

Tại nhiều nước trên thế giới, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong phân

loại chi Panax đã được triển khai và đạt được nhiều kết qu ả mang tính ứng

dụng cao.

Shim và cộng sự (2003) tiến hành phân biệt P.ginseng (Hàn Quốc) với

các taxon Panax khác gồm Nhân sâm SheoAn (Trung Qu ốc), P. notoginseng

(Trung Qu ốc), P. japonicus (Nh ật Bản) và hai loại Nhân sâm thu ộc loài P.

quinquefolius từ Mỹ và Canada được thu th ập từ 6 vùng khác nhau bằng kỹ

thuật RAPD [60]. Kết quả phân tích với mồi 80 mồi ngẫu nhiên cho thấy mồi

OP-13B có thể xem là marker RAPD duy nh ất để phân biệt các taxon Nhân

sâm được khảo sát. Nh ững kết quả nà y cho phép phân bi ệt Nhân sâm Hàn

quốc (P. ginseng) với các taxon khác ở mức độ phân tử.

Năm 2007, Kim và cộng sự đã phát triển các chỉ thị Microsatellite mới

để nhận dạng P. Ginseng [41]. Nhóm nghiên cứu đã xây dựng một thư viện

được làm giàu microsatellite của P. ginseng và 251 trình tự microsatellite mới

được xác định. Thông qua việc xác định kiểu gene của 91 microsatellite bằng

cách sử dụng tập hợp các mồi đặc hiệu cho chỉ thị, nhóm tác giả đã xác định

11 chỉ thị đa hình trong loài cũng như 14 chỉ thị đa hình phân biệt P. ginseng

và P. quinquefolius . Kết qu ả nghiên c ứu này cho th ấy các chỉ th ị

microsatellite rất hữu ích cho phân tích di truy ền và việc xác định các loài

thuộc chi Panax.

Dan và cộng sự (2010) đã thử nghiệm với 35 cặp mồi được thiết kế cho

35 microsatellite được chọn ở các mẫu P. ginseng cho thấy 12 trong số chúng

là đa hình, 19 là đơn hình và 3 không có s ản phẩm khuếch đại [20]. Phân tích

thêm các chủng thuộc P. quinquefolius từ Mỹ và Canada cho th ấy các mồi có

khả năng khuếch đại ở P. ginseng cũng thể hiện kết quả ở P. quinquefolius.

Từ đó, nhóm tác giả đề xuất và có thể sử dụng các chỉ thị ISSR có được trong

19

việc phân biệt các chủng P. ginseng và P. quinquefolius, cũng như trong việc

lập bản đồ gene và đánh giá mức độ bảo thủ.

Thuan và cộng sự (2010) cũng đã sử dụng kỹ thu ật RFLP với các mồi

khuếch đại các vùng rDNA 18S và ITS cũng như kỹ thuật Random Amplified

Microsatellite (RAMS) để xá c định 4 loài P. ginseng , P. quinquefolius, P.

notoginseng và P. vietnamensis[62].Kết quả cho thấy, vùng ITS được khuếch

đại với sản phẩm có kích thước như trông đợi ở tất cả các mẫu ngoại trừ P.

ginseng mua tại Việt Nam.Dựa trên trình tự vù ng ITS, tất cả cá c mẫu được

xác định là thuộc chi Panax. Tuy nhiên, k ết quả có được không th ể sử dụng

để phân bi ệt các loài dựa trên trình tự gene 18S rRNA. Phân tích RFLP trên

vùng ITS cho th ấy hai mẫu thuộc P. notoginseng không gi ống nhau, các tác

giả giải thích là do khác nhau về nguồn gốc, điều ki ện trồng. Ngoài ra, d ựa

trên phân tích RFLP vùng ITS, các tác gi ả cho rằng 2 loài P. ginseng và P.

quinquefolius có quan hệ phá t sinh g ần. Phân tích RFLP vùng 18S rRNA

cũng cho thấy các mẫu thuộc P. ginseng mua ở Hàn Quốc là giống nhau hơn

những mẫu cùng loài này mua ở Việt Nam. Kết quả phân tích RFLP dựa trên

vùng 18S rRNA có mức độ tương đồng cao hơn dựa trên vùng ITS.

Gần đây, Lee và cộng sự (2011) đã phát triển một chỉ thị SCAR dẫn xuất

từ ISSR để nhận dạng các chủng giống Sâm P. ginseng để xác định sự phân

biệt các chủng nông nghiệp có đặc tính tốt phục vụ cho chọn giống [45]. Các

tác giả đã khảo sát 80 mồi ISSR trên 6 m ẫu thuộc P. ginseng và 2 mẫu Nhân

sâm nước ngoài thuộc hai loài P. quinquefolius và P. notoginseng. 34 trong số

85 mồi SSR hình thành các locus đa hình với tần suất trung bình 6,9 locus/mồi.

Các mẫu kiểm tra được nhận thấy có khác biệt rõ ràng bằng cách sử dụng các

mồi này. Các mồi UBC-821, UBC-868 và UBC-878 làm nảy sinh các band đa

hình giữa các chủng P. ginseng và cho phép phân bi ệt chúng với các mẫu P.

quinquefolius và P. notoginseng. Thêm vào đó, đa hình đặc hi ệu cho chủng

20

Nhân sâm Sunwon được hình thành bằng cách xử lý sản phẩm PCR bằng mồi

PgI821C650 với enzyme giới hạn Taq I. Kết quả này là công cụ chỉ thị DNA

hữu ích để xác định Nhân sâm Hàn Quốc, đặc biệt là chủng Sunwon, quản lý

hạt giống và các chương trình chọn giống được hỗ trợ bằng chỉ thị phân tử.

1.3. Nghiên cứu bảo tồn và phát triển Sâm

Năm 1988, hội thảo quốc tế về bảo tồn thực vật hoang dại hữu ích được

tố chức ở Chiang Mai, Thái Lan đã đánh giá cao tầm quan trọng của thực vật

hoang dại hữu ích trong ch ăm sóc sức khỏe ban đầu, giá tr ị kinh tế và ti ềm

năng của cây cỏ đối với việc tìm ra các lo ại thực phẩm và thu ốc mới. Đồng

thời báo động về việc mất tính đa dạng sinh vật cây cỏ và có th ể ảnh hưởng

đến việc tìm kiếm loài hoang dại hữu ích mới mang lại lợi ích toàn cầu. Nhằm

bảo tồn các ngu ồn đa dạng sinh vật cũng như tạo ra và duy trì m ối quan hệ

hợp tác, bảo vệ quyền lợi của các quốc gia trong việc bảo tồn và phát triển các

nguồn lợi đa dạng sinh vật, đã có 2 công ước toàn cầu được ký kết là Công

ước đa dạng sinh học (CBD) và Công ước về chống buôn bán các loài động

thực vật có nguy cơ bị tiêu diệt (CITES). Với công ước CBD, lần đầu tiên thế

giới đã chuyển các ngu ồn tài nguyên sinh h ọc từ một di sản chung của nhân

loại thành tài s ản quốc gia. Mặc dù vậy, hoạt động bảo tồn đa dạng sinh học

(trong đó có thực vật hoang dại hữu ích) đang gặp phải mối thách thức kép là:

(i) mối thách th ức của bản thân vi ệc bảo tồn đa dạng sinh học, (ii) bảo vệ tri

thức truyền thống về sử dụng các ngu ồn tài nguyên kh ỏi sự khai thác mang

tính chất thương mại trong phạm vi quốc gia cũng như quốc tế, (iii) phát triển

các sản phẩm từ đa dạng sinh học và bản quyền tri thức cộng đồng.

Shi-Lia Zhou và cộng sự (2005) khi nghiên cứu về sự mất tính đa dạng

di truy ền của loài P. notoginsen , trong đó có s ự so sánh v ới loài P.

stipuleanatus đã đề nghị cần phải bảo tồn tại chỗ các quần thể mọc hoang dại

của loài P. stipuleanatus, cũng như dựa vào bảo tồn tại vườn trồng các giống

21

khác nhau c ủa loài P. notogingseng (d ẫn theo Ph ạm Thanh Huy ền, 2007).

Việc nghiên c ứu tr ồng bảo tồn và phát tri ển loài P. stipuleanatus ở Trung

Quốc cũng mới chỉ dừng lại ở mức đề xuất. Mà ch ưa có các nghiên c ứu gây

trồng và phát tri ển cụ thể. Đây cũng chính là m ột trong nh ững tồn tại trong

nghiên cứu nhân gi ống, gây tr ồng trên th ế giới nhằm bảo tồn cũng như phát

triển nguồn gen loài P. stipuleanatus.

Qua các nghiên c ứu về phân lo ại, đặc điểm hình thái, phân b ố, đặc

điểm sinh thái, giá tr ị sử dụng cũng như khả năng nhân gi ống, gây tr ồng và

bảo tồn loài Sâm trên thế giới còn rất nhiền vấn đề tồn tại cần giải quyết. Đặc

biệt, việc nghiên cứu kỹ thuật nhân giống, gây trồng để bảo tồn và phát tri ển

các loài Sâm vẫn còn là m ột khoảng trống. Phần lớn các nghiên c ứu mới chỉ

dừng lại ở việc mô tả và phân lo ại, cũng như đánh giá đa dạng di truyền giữa

các loài trong chi Panax mà chưa có những nghiên cứu thực sự đi sâu vào vấn

đề kỹ thuật nhân gi ống, kỹ thuật lâm sinh trong vi ệc gây tr ồng phát tri ển và

bảo tồn loài này.

1.4. Tổng quan phương pháp nghiên cứu về phân loại thực vật

1.4.1. Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái

Các đặc điểm hình thái trong phân loại sinh vật được sử dụng từ rất sớm.

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là hai đơn vị phân loại (taxon) càng

có nhiều đặc điểm chung, càng giống nhau thì quan hệ giữa hai taxon càng gần

gũi với nhau. Bất cứ sự khác nhau nào gi ữa hai cá th ể đều được nghiên cứu,

nhưng không ph ải bất cứ đặc điểm nào cũng có th ể dùng làm đặc điểm phân

loại. Những đặc điểm phân lo ại ổn định, biến đổi chậm, liên quan đến những

cấu trúc ít bi ến đổi của cơ thể sinh vật thường được sử dụng để phân bi ệt và

xác định các taxon bậc cao, nh ững biến đổi nhanh hoặc liên quan đến cơ chế

cách ly sinh sản có tác dụng xác định các taxon bậc thấp. Người ta thường kết

hợp nhiều đặc điểm để làm tăng giá trị tin cậy của kết quả so sánh.

22

Mặc dù ph ương pháp s ử dụng các ch ỉ tiêu hình thái có ưu điểm là

tiện lợi, nhanh chóng, kinh t ế, có th ể so sánh các đặc điểm gi ữa các loài

hoá th ạch với các loài đang sống để tìm ki ếm mối quan h ệ họ hàng gi ữa

chúng. Nh ưng việc lựa chọn và cân nh ắc giá tr ị sử dụng của các đặc điểm

phân lo ại là m ột trong nh ững khâu khó nh ất, không ch ỉ đòi hỏi ki ến th ức

mà còn đòi hỏi kinh nghi ệm và s ự khéo léo c ủa các nhà phân lo ại học.

Bên cạnh đó, ph ương pháp này nhi ều khi không chính xác vì có hi ện

tượng đồng quy tính tr ạng và không phân bi ệt được các loài đồng

hình.Mặt khác b ởi hình thái chính là k ết qu ả của bi ểu hi ện gene trong m ột

điều kiện ngoại cảnh nhất định nên vi ệc hoàn toàn d ựa vào hình thái đôi khi

dẫn đến các kết quả không xác thực, nhất là đối với các taxon thực vật có mức

độ th ường bi ến cao. Các marker hình thái có nhi ều điểm hạn ch ế nh ư: các

biến đổi hình thái không phát hi ện được ở một số loài; các nghiên c ứu sử

dụng đặc điểm hình thái nói chung th ường gi ới hạn trong một hay một vài

locus; nhiều đặc điểm hình thái chỉ có thể quan sát được vào cuối chu kỳ sống;

nhiều đặc tính hình thái không riêng bi ệt mà mang tính liên t ục và ch ồng lấp

giữa các loài gây trở ngại cho việc phân tích chính xác sự đa dạng di truyền của

quần thể.

1.4.2. Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử

1.4.2.1. Các Marker phân tử dựa trên DNA

Các marker phân tử được sử dụng để đánh giá đa hình DNA được phân

thành hai loại: marker dựa trên cơ sở lai phân tử và marker dựa trên cơ sở phản

ứng chuỗi polymer hóa (PCR). Về mặt định dạng, đặc tính DNA có thể nhận ra

thông qua vi ệc lai các đoạn DNA được cắt giới hạn bằng enzymes phân gi ải

với các DNA th ăm dò (probe) được đánh dấu vốn là các đoạn DNA có ngu ồn

gốc hoặc trình tự đã biết. Marker trên cơ sở PCR bao gồm việc khuếch đại in

vitro những trình tự DNA hay locus đặc trưng bằng cách sử dụng những trình

23

tự olygonucleotide trong vai trò là các m ồi đặc hi ệu hay ng ẫu nhiên và m ột

enzyme DNA polymerase bền nhiệt. Các đoạn được khuếch đại được tách ra

trên điện di và tạo các đặc trưng hình thành băng, các đặc trưng này vốn được

phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như nhuộm hay ghi phóng xạ tự

động. Những marker phân tử thường được sử dụng bao gồm:

Đa hình chi ều dài các đoạn giới hạn [Restriction Fragment Length

Polymorphism (RFLP)]

RFLP là một kỹ thuật áp dụng để phân biệt các sinh vật với nhau bằng

cách phân tích các ki ểu dẫn xu ất hình thành t ừ vi ệc cắt nh ỏ DNA c ủa

chúng.RFLP có thể ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng và phát sinh loài trên

dải đối tượng từ các cá thể đến quần thể, từ trong loài đến các loài có quan hệ

họ hàng g ần.RFLP được sử dụng rộng rãi trong vi ệc nghiên cứu lập bản đồ

gene bởi tính phong phú cao của chúng trên bộ gene, khả năng ứng dụng rộng

của các enzymes c ắt gi ới hạn khác nhau và s ự phân b ố ng ẫu nhiên su ốt bộ

gene của các RFLP (Neale & Williams 1991)[51].RFLP c ũng được sử dụng

trong nghiên cứu khảo sát mối quan hệ giữa các bậc phân lo ại gần, hoặc sử

dụng nh ư một công c ụ làm n ảy sinh đặc tr ưng nh ận dạng DNA (DNA

fingerprinting), trong nghiên c ứu về đa dạng di truy ền lai, chuy ển gene quan

tâm vào sinh vật và bao gồm cả những nghiên cứu về dòng gene hay phân b ố

gene giữa các cây tr ồng. Các marker RFLP c ũng được sử dụng lần đầu trong

việc xây dựng bản đồ di truyền bởi Botstein và cộng sự năm 1980, từ đó một

bộ các marker RFLP phát hi ện được đã tạo nhiều cơ hội cho vi ệc phát tri ển

một bản đồ chi tiết ở rau diếp (Landry et al., 1987)[44].

DNA Đa hình khu ếch đại ng ẫu nhiên [Random Amplified

Polymorphic DNA (RAPD)]

RAPD là một kỹ thuật dựa trên cơ sở PCR. Phương pháp được dựa trên

cơ sở sự khu ếch đại các đoạn DNA mục tiêu hay ng ẫu nhiên dưới tác động

24

của enzyme với các mồi tùy ch ọn, kỹ thuật này được Welsh và McClelland

phát triển năm 1991. Trong ph ản ứng RAPD, một chủng loại mồi đơn sẽ gắn

vào DNA b ộ gene ở hai v ị trí khác nhau trên hai m ạch bổ sung c ủa DNA

khuôn mẫu. Trung bình, m ỗi mồi sẽ dẫn đến vi ệc khu ếch đại một vài locus

riêng rẽ trên bộ gene, đó là cơ sở cho sự hữu dụng của RAPD cho vi ệc sàng

lọc một cách hi ệu qu ả các đa hình trình t ự nucleotide gi ữa các cá th ể. Tuy

nhiên, vì tính ng ẫu nhiên một cách tự nhiên trong vi ệc khuếch đại DNA với

các mồi có trình t ự ngẫu nhiên, điều quan tr ọng là ph ải tối ưu hóa và duy trì

điều kiện phản ứng cho việc nhân mạch đôi DNA.

RAPD đã được sử dụng với nhiều mục đích, từ nghiên cứu ở mức độ cá

thể (như xác định đa dạng di truyền) đến nghiên cứu liên quan đến những loài

họ hàng g ần nhau.RAPD c ũng đã và đang được ứng dụng vào vi ệc nghiên

cứu lập bản đồ gene để lấp đầy những lỗ hổng mà các markers khác chưa thực

hiện được (Hadrys et al., 1992)[30].

Vi vệ tinh hay Trình t ự lặp đơn gi ản [Microsatellites or Simple

sequence Repeat (SSR)]

Microsatellite đặc biệtthích hợp để phân bi ệt các ki ểu gene có quan h ệ

họ hàng gần; bởi mức độ biến động cao của chúng, vì thế chúng được ưa thích

khi sử dụng trong các nghiên c ứu về qu ần th ể và cho vi ệc nh ận dạng các

chủng giống nông nghiệp có quan hệ gần. Microsatellite thể hiện một tính đa

hình cao nên chúng là nh ững marker có th ể được sử dụng trong nhiều nghiên

cứu về di truyền quần thể cũng như các nghiên cứu quan hệ phát sinh từ mức

độ cá th ể (như nhân dòng vô tính và xác định các dòng) đến mức độ những

loài có quan hệ họ hàng gần. Ngược lại, tỷ lệ đột biến cao của chúng làm cho

chúng không thích hợp trong nghiên cứu phân biệt các taxon có quan h ệ phát

sinh xa nhau.Microsatellite được xem là các marker lý t ưởng trong nghiên

cứu lập bản đồ gene (Jarne & Lagoda 1996)[34].Marker SSR đã được chứng

25

minh tính hữu dụng cho việc đánh giá biến động di truyền trong chọn lọc các

sinh vật (Mohammadi & Prasanna 2003)[49].

1.4.2.2. Sử dụng các trình tự DNA bảo tồn cao trong phân tích quan hệ

phát sinh ở thực vật

Hệ thống hóa là quá trình th ăm dò, mô tả và giải thích tính đa dạng của

thế gi ới sinh v ật. Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ th ống phân lo ại

mang tính thứ tự trước khi phát triển học thuyết tiến hóa. Sự xuất hiện và phát

triển của các kỹ thu ật phân tử mà đặc bi ệt là ph ản ứng chuỗi polymer hóa -

PCR (Mullis và Faloona, 1987) đã hình thành nên m ột lượng lớn các dữ liệu

sẵn sàng cho vi ệc giải trình tự DNA và các k ỹ thu ật làm nảy sinh đặc trưng

nhận dạng DNA [50]. Nhiều dạng đặc điểm mang tính thông tin, đặc biệt là các

trình tự DNA đã được ứng dụng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh và quá

trình tiến hóa ở thực vật. Các th ực vật bậc cao mang trong nó ba b ộ gene: bộ

gene trong nhân, bộ gene ty thể và bộ gene lạp thể.

Bộ gene lục lạp

Bộ gene lục lạp của đa số các thực vật trên cạn thông thường được đặc

trưng bởi phân tử dạng vòng.Thành phần, kích thước, cấu trúc và trình tự của

bộ gene lục lạp đã được xác định là có m ức độ bảo tồn cao trong các nghiên

cứu về tiến hóa.Tính bảo tồn cao này ch ỉ ra rằng bất kỳ thay đổi nào về cấu

trúc, cách sắp xếp hay thành ph ần đều liên quan m ạnh mẽ đến quan hệ phát

sinh. Các ph ần khác nhau c ủa bộ gene ti ến hóa theo các t ỷ lệ khác nhau và

tương đối chậm ở mức độ trình tự nucleotide. Những vùng không mã hóa của

bộ gene lục lạp tiến hóa nhanh hơn những vùng mã hóa. Các đột biến ở DNA

lục lạp thường là các thay thế nucleotide hay sự sắp xếp lại. Các đột biến tăng

đoạn hay mất đoạn tích lũy trong vùng không mang mã xảy ra với tỷ lệ ngang

với sự thay thế nucleotide và chính ki ểu đột biến này làm tăng cường tính đa

dạng của các vùng không mang mã. Ph ần lớn các gene l ục lạp là lo ại gene

26

đơn bản trong khi các gene trong nhân là thành viên c ủa những họ đa gene.

Tính bảo tồn cao của DNA lục lạp thực sự là ưu thế khi sử dụng nó để xây

dựng lại mối quan hệ phát sinh và quá trình ti ến hóa ở các mức độ từ loài đến

chi và đến họ thực vật.Có thể thấy những gene mã hóa và không mã hóa ở lục

lạp thường được sử dụng trong nghiên cứu quan hệ phát sinh như sau:

Các trình tự bảo thủ ở bộ gene trong nhân

Bộ gene trong nhân có kích th ước lớn nhất trong số ba bộ gene ở thực vật (1.1 × 106 đến 110 × 106 kbp) và bao gồm rất nhiều gene. Phần lớn các nỗ

lực nghiên cứu về quan hệ phát sinh bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự

DNA ribosome trong nhân. C ấu trúc căn bản của DNA ribosome là m ột đơn

vị lặp đơn, mỗi đơn vị như thế có thể lặp lại đến hàng ngàn lần trong bộ gene.

Bộ gene trong nhân chứa một vùng sao mã có cấu trúc bao gồm khoảng trống

bên ngoài vùng sao mã, ti ếp theo là gene 18S mã hóa cho ti ểu đơn vị nhỏ và

gene 26S mã hóa cho ti ểu đơn vị lớn vốn phân cách nhau b ởi một gene nh ỏ

hơn là 5,8S. Các kho ảng trống trong vùng phiên mã (ITS1 và ITS2) tách r ời

những gene vừa đề cập. Chiều dài của ba vùng mang mã là gi ống nhau ở các

thực vật: gene 18S là kho ảng 1800bp, 26S là kho ảng 3300bp và gene 5,8S là

khoảng 160bp. Ngược lại, chiều dài của các khoảng trống giữa các gene bi ến

động từ 1 đến 8kb. Họ gene rDNA ch ứa các vùng b ảo tồn cao nh ư 18S, 26S

có th ể sử dụng để suy lu ận các quan h ệ phát sinh ở các m ức độ phân lo ại

cao.Các đoạn tiến hóa nhanh như các vùng ITS có th ể là thích hợp nhất trong

so sánh các loài và những chi gần nhau, thậm chí là so ở mức độ các quần thể.

Các trình tự 18S rDNA th ường được sử dụng rộng rãi hơn các trình t ự

26S.Cho dù c ả hai vùng cùng được có d ải ứng dụng rộng nh ư nhau nh ưng

kích thước trên 3000bp của 26S rDNA đã cản trở các nhà nghiên cứu, đặc biệt

là trong vi ệc gi ải trình t ự toàn b ộ gene.Trái l ại, kích th ước của 18S rDNA

khoảng 1800bp giúp cho nó được ưu tiên lựa chọn hơn để khu ếch đại bằng

27

PCR và giải trình tự.Thực tế cho thấy hình thể cây quan hệ phát sinh sử dụng

trình tự 18S rDNA khá đồng dạng với cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự

rbcL ở nhi ều mức độ phân lo ại ở th ực vật hạt kín.Cho dù r ất có ti ềm năng

trong vi ệc xây dựng cây quan h ệ phát sinh ở thực vật, vùng 18S rDNA v ẫn

chưa được tận dụng trong hệ thống học thực vật hạt kín.

Gene 26S rDNA th ường được lưu ý là ứng viên cho vi ệc thay thế gene

18S rDNA. Khi so sánh có th ể nh ận th ấy toàn bộ gene 26S rDNA ti ến hóa

nhanh gấp từ 1,6 đến 2,2 lần và cung c ấp các đặc điểm mang tính thông tin

nhiều hơn 3 lần so với 18S rDNA.

Gene 5,8S rDNA dễ dàng được khuếch đại và giải trình tự khi sử dụng

các mồi định vị trên các gene 18S và 26S rDNA. Gene 5,8S rDNA hi ếm khi

được sử dụng để suy lu ận quan h ệ phát sinh b ởi tính b ảo th ủ cao và kích

thước bé (164-165bp). Tỷ lệ các vị trí mang thông tin tiềm năng cho phân tích

quan hệ phát sinh ở thực vật có hạt cũng tương đương với gene 18S rDNA.

Vùng ITS: ITS1 phân cách gene 18S rDNA v ới gene 5,8S rDNA còn

ITS 2 phân cách gene 5,8S rDNA v ới gene 26S rDNA. Vùng ITS hi ện hữu

một cách r ộng rãi d ưới 700bp ở các th ực vật có hoa (Baldwin et al.,

1995)[15].Vùng ITS chứa các trình tự bảo tồn cao nên rất nhiều mồi tổng thể

được thiết kế cho việc khuếch đại và gi ải trình tự đã được mô tả.Các trình tự

ITS1 và ITS2 v ốn giàu GC làm cho vi ệc giải trình tự trở nên khó kh ăn. Khó

khăn trong vi ệc gi ải trình t ự bi ến động theo các nhóm th ực vật và vi ệc cho

thêm DMSO vào PCR hay ph ản ứng gi ải trình t ự là vi ệc bổ sung mang l ại

hiệu quả cao. Vi ệc căn trình tự ITS từ nhiều họ thực vật hạt kín ch ỉ ra rằng

các trình tự ITS1 và ITS2 đa dạng hơn trình tự của các gene rDNA. Các trình

tự ITS bi ến động một cách hi ệu qu ả cho phép gi ải quy ết nh ững câu h ỏi về

quan hệ phát sinh ở những taxon có quan h ệ họ hàng gần. Theo đó, rất nhiều

các bài báo thể hiện sự thành công trong việc xây dựng lại lịch sử tiến hóa sử

28

dụng các trình tự ITS(Bellarosa et al., 2005) [16]. Hơn nữa, vùng ITS được di

truyền theo ki ểu từ cả cha và m ẹ khiến cho nó c ũng có th ể được sử dụng để

thăm dò sự lai chéo.

Hình 1.1: Sơ đồ vùng ITS của các gen rDNA vùng nhân và vị trí

của các mồi ITS(Embong et al., 2008) [25]

29

Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

Vật liệu sử dụng trong nghiên c ứu là 25 m ẫu Sâm được thu th ậpở các

xã Pa V ệ Sử, Thu L ũm và Ka L ăng của huy ện Mường Tè; Sìn H ồ; Tam

Đường và Phong Thổ tỉnh Lai Châu.

Thời gian thu mẫu: từ tháng 5/2017 đến tháng 6/2017.

Bảng 2.1. Danh sách 25 mẫuSâm.

Tên mẫu Địa điểm thu thập STT Ký hiệu mẫu

Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè AS02 1

Sâm Lai Châu Sìn Hồ PTH2 2

Sâm Lai Châu Phong Thổ LNT3 3

Sâm Lai Châu Phong Thổ LNT4 4

Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè PX9 5

Sâm Lai Châu Tam Đường PXA3 6

Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè PX13 7

Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè PX14 8

Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè PX15 9

Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè MX5 10

Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè MX4 11

Sâm lai châu Pa Vệ Sử - Mường Tè MX1 12

Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè PT3 13

Sâm lai châu Ka Lăng - Mường Tè PKL1 14

Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè PT10 15

Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè PT19 16

17 PTPX3 Sâm Lai Châu tím Pa Vệ Sử - Mường Tè

18 PTPX2 Sâm Lai Châu tím Pa Vệ Sử - Mường Tè

30

19 PT7 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

20 SLC2 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

21 SLC3 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

22 SLC6 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

23 SLC9 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

24 PX10 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

25 PTH1 Sâm Lai Châu Sìn Hồ

2.2. Hóa chất

Một số hóa ch ất thông dụng dùng trong sinh h ọc phân tử của các hãng

Sigma, Merck,...CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, dNTPs, EDTA, 6X orange

loading dye solution, Taq Polymeraza, Ethanol, 2-propanol, Acetic acid glacial,

Phenol, Chloroform, isoamyalcohol, Agarose, kit Qiagen, các mồi ITS.

Bảng 2.2. Danh sách các mồi ITS sử dụng trong nghiên cứu

Trình tự Nucelotid

TT ITS1 TCC GTA GGT GAA CCTTGC GG

ITS8 TCCTCCGCTTATTGATATGC

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Tách chiết ADN tổng số

Trong nghiên c ứu này, chúng tôi đã lựa ch ọn ph ương pháp s ử dụng

CTAB của P. Doyle and Doyle (1987) có m ột số cải tiến nhỏ để tiến hành

tách chiết ADN từ các mẫu nghiên cứu.

Quy trình: Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 600C.

Nghiền 0,3 gam m ẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nit ơ lỏng đến

khi thành dạng bột mịn (mẫu sâm, chày, cối được giữ trước ở - 800C).

31

Hoà tan m ẫu đã nghi ền nh ỏ trong 800 ml CTAB buffer và 60 ml SDS

10%. Thành ph ần dung dịch đệm chiết: Tris-bazơ 100 mM, EDTA 20 mM,

NaCl 1,4 M, CTAB 2% và PVP 1%.

Ủ mẫu ở 65(cid:176)C trong bể ổn nhiệt, thời gian 30 phút sau đó để nguội ở

nhiệt độ phòng

Bổ sung th ể tích tương đương chloroform—isoamylalcohol (24:1), l ắc

nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa. Ly tâm 11000 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 40C. Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới.

Tiếp tục chiết lần 2 bằng chloroform—isoamylalcohol (24:1), thu được

dịch chiết chứa ADN.

Tủa ADN bằng isopropanol đã làm lạnh.Để ở -200C trong 1 giờ. Ly tâm thu tủa 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C.

Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu tủa

Làm khô và hòa tan ADN, loại ARN, hoà tan ADN trong đệm TE.

2.3.2. Chu trình PCR

* Thành phần của một phản ứng PCR

- Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần:

STT Thành phần Thể tích (µl)

9

1 Nước cất hai lần khử ion 2 Buffer Mg+ 25 Mm 1,5

3 dNTPs 10 Mm 0,3

4 Taq ADN polymerase 5 U/µl 0,2

5 Mồi ITS1 10 µM 1,5

6 Mồi ITS8 10 µM 1,5

7 DNA 1

Tổng thể tích của một phản ứng 15,0

32

* Chương trình chạy PCR

Phản ứng PCR được ti ến hành trong ống eppendorf 0,2 ml và tsh ực

hiện trên máy Mastercycler epgradient S theo chu trình sau:

Thời gian chu kì Các bước Nhiệt độ((cid:176)C)

1 94 5 phút 1

2 94 50 phút

35 3 58 45 giây

4 72 55 giây

6 72 7 phút 1

7 4 ∞

Sau khi hoàn thành ch ương trình ch ạy PCR, s ản ph ẩm PCR được bổ

sung 4 µl loading dye rồi tiến hành điện di.

2.3.3. Phương pháp điện di trên gel agarose

Cân 0,6 g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan

hoàn toàn. Để nguội 45-50(cid:176)C bổ sung 2,5ml Ethidium Bromide, đổ vào khuôn

gel đã được chuẩn bị sẵn. Sau 30-60 phút, khi gel đã nguội và đông cứng thì

chuyển khay ch ứa bản gel vào máy điện di và cho đệm ch ạy TAE 1X vào

buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5-1 cm.

Tra mẫu: Sản phẩm PCR được trộn với 4 ml loading dye và tra vào các

giếng trên gel.

Chạy điện di: Sau khi tra m ẫu điện di xong, máy điện di được kết nối

với bộ nguồn. Đặt 130 V.

Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, DNA sẽ được phát sáng nh ờ

liên kết với EtBr.

33

2.3.4. Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen

1. Cắt lấy đoạn ADN mong mu ốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt

vào ống eppendorf 2ml.

2. Bổ sung buffer QG theo t ỷ lệ 3 th ể tích QG : 1 th ể tích gel (100mg

~100μl).

3. Ủ ở nhiệt độ 50°C trong kho ảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn

toàn.

4. Sau khi gel tan hoàn toàn, ki ểm tra màu c ủa dung dịch phải là màu

vàng, nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc màu tím xanh thì phải bổ sung

10μl sodium acetate 3M, pH 5.

5. Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm tốc

độ 13 000 rpm trong 1 phút.

6. Bổ sung 500 μl buffer QG vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000

rpm trong 1 phút để loại hết agarose dư thừa.

7. Bổ sung 750 μl buffer PE vào c ột QIAquick, để cột th ẳng đứng 5

phút sau đó ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút.

8. Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1.5ml sạch.

9. Để hoà tan ADN, b ổ sung 30 μl nước (pH 7 - 8.5) vào gi ữa màng

của cột QIAquick và ly tâm t ốc độ 13 000 rpm trong 1 phút, thu l ượng

ADN tinh sạch.

2.3.5. Giải trình tự

Sản phẩm PCR ITS sau khi được tinh sạch, được giải trình tự tại công

ty Macrogen (HànQuốc).Kết quả giải trình tự được được so sánh với các trình

tự tương đồng trên NCBI.Sau đó, các trình t ự được tập hợp lại và phân tích

bằng chương trình MEGA v6.0để tạo cây phát sinh loài.

34

Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số

Tách chi ết axit nucleic là công vi ệc đầu tiên đóng vai trò quan tr ọng

trong công nghệDNA. Nhờ tiến bộ và sự đổi mới công nghệ mà tách chiết axit

nucleic ngày nay đã trở nên đơn giản. Hiện nay có rất nhiều phương pháp tách

chiết DNA tổng số của thực vật. Tuy nhiên đối với từng đối tượng nhất định

cần có phương pháp riêng. Do vậy, việc lựa chọn và cải tiến phương pháp cho

phù hợp với từng đối tượng là điều rất cần thiết và quan trọng.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sử dụng CTAB

của Doyle and Doyle (1987) có một số cải tiến nhỏ để tiến hành tách chiết DNA

tổng số của 25 mẫu Sâmnghiên cứu. Kết quả tách chiết DNA tổng số của 25 mẫu

Sâmđược kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%(hình 3.1 số thứ

tự DNA 25 mẫu nghiên cứu ứng với số thứ tự 25 mẫu theo bảng 2.1).

Hình 3.1: Ảnh điện di ADN tổng số của 25 mẫu Sâm nghiên cứu và

mẫu đối chứng H2O

Qua kết quả điện di trên gel agarose 1% ở hình 3.1cho s ản phẩm PCR

rõ nét, rõ b ăng. Các băng DNA thu được của các mẫu Sâmkhá gọn và đồng

đều, chỉ có 1 b ăng duy nh ất tương đồng với kích th ước lí thuy ết, chất lượng

DNA của các mẫu tốt.Mẫu đối chứng nước không lên ch ứng tỏ mẫu PCR về

cơ bản không bị nhiễm tạp chất.Kết quả điện di cũng cho thấy DNA có nồng

35

độ tương đối cao, đảm bảo mức độ nguyên vẹn và tinh s ạch, đáp ứng được

các yêu cầu dành cho vi ệc phân tích đa hình di truy ền trong các thí nghi ệm

tiếp theo. Các mẫu DNA tổng số được pha loãng về nồng độ 50 mg/µl để thực

hiện phản ứng PCR.

3.2. Phân tích các sản phẩm khuếch đại của 25 mẫu nghiên cứu

Sau khi th ực hi ện ph ản ứng PCR, s ản ph ẩm khu ếch đại với cặp mồi

ITS1/ITS8 và được điện di trên gel agarose 1,5% cho b ăng đơn hình với kích

thước khoảng 700 bp. Sau khi khu ếch đại sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành

thôi gel b ằng vi ệc sử dụng cột QIAquick Spin Columns (USA) nh ằm thu

được sản phẩm PCR đặc hiệu.

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 trên 25

mẫu Sâm với thang chuẩn Marker 100bp và mẫu đối chứng trắng (H2O)

3.3. Kết qu ả kh ảo sát trình t ự vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 ở các

mẫunghiên cứu

Bên cạnh việc phân loại theo phương pháp truyền thống dựa vào việc

so sánh hình thái gi ải ph ẫu của cơ quan sinh s ản và dinh d ưỡng, trong vi ệc

định lo ại các taxon sinh v ật hi ện đại, đặc bi ệt là các taxon có s ự bi ến động

hình thái lớn như các loại thực vật, trong đó có các loài thu ộc chi Panax, các

dữ li ệu về đặc tính phân lo ại và quan h ệ phát sinh d ựa trên các vùng b ảo

36

thủcao (phylogenetical characteristics) đóng một vai trò quan tr ọng. Các d ữ

liệu này dựa trên đặc điểm trình tự các nucleotide c ủa các vùng trình t ự bảo

thủ cao trong b ộ gene nói chung và các DNA barcodenói riêng nhi ều khi

chính là cơ sở để nhận dạng và định loại một số taxon của Sâm.

Với kết quả thu được thì 25 mẫu Sâm nghiên c ứu có kích th ước và tỉ

lệ thành phần (G+C) vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 tương tự như kết quả nghiên

cứu ở nhiều loài thực vật thuộc họ Araliaceae đã được công bố. Việc xác định

trình tự và sử dụng trình tự nucleotid đoạn ITS1-5,8SrRNA-ITS2 để so sánh

nhằm tìm ra m ối quan h ệ phát sinh gi ữa các loài ho ặc sự đa dạng di truy ền

trong một chi, thậm chí các bậc phân loại dưới loài trong một loài đã được sử

dụng phổ biến từ lâu trên thế giới.

Sản ph ẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 (b ảng 2.2), sau khi tinh s ạch

được phân tích tr ực ti ếp trên máy gi ải trình t ự ABI PRISM 3100 DNA

Analyzer (Applied Biotech) và phần mềm MEGA v6.0, kết quả cho ra giản đồ

có các đỉnh (peak) với 4 màu s ắc khác nhau t ương ứng với 4 lo ại nucleotide

và bi ểu th ị dãy trình t ự các nucleotide (hình 3.3). K ết qu ả thuđược 25 đoạn

trình tự ITS của 25 mẫu Sâm với số nucleotide khác nhau trên từng mẫu.

Hình 3.3: Một đoạn giản đồ có các đỉnh với 4 màu sắc khác nhau

tương ứng với 4 loại nucleotide của mẫu Sâm PT7

37

Thông qua quá trình khu ếch đại và giải trình tự đối với các mẫu khảo

sát theo ph ương pháp được nêu trong ph ần vật li ệu và ph ương pháp nghiên

cứu, xác định vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 trên s ản ph ẩm khu ếch đại thông

qua việc căn trình tự và đối chiếu với các trình t ự ITS1-5,8S rRNA và ITS2

của các taxon cùng chi trên Genbank, thu được các trình tự có độ dài được thể

hiện trong bảng 3.1:

Bảng 3.1. Độ dài các trình tự thuộc 25 mẫu Sâm nghiên cứu và mẫu tham

chiếu KJ418192.1

Tổng số Tổng số STT Kí hiệu STT Kí hiệu nucleotide nucleotide

1 AS02 588 PKL1 588 14

2 PTH2 588 PT10 586 15

3 LNT3 588 PT19 588 16

4 LNT4 588 PTPX3 588 17

5 PX9 588 PTPX2 588 18

6 PXA3 588 PT7 588 19

7 PX13 588 SLC2 588 20

8 PX14 586 SLC3 588 21

9 PX15 586 SLC6 588 22

10 MX5 588 SLC9 588 23

11 MX4 588 PX10 588 24

12 MX1 588 PTH1 588 25

13 PT3 586 588 KJ418192.1* 26

Trung bình 587,7

*: Trình tự tương ứng của Sâm Lai Châu được lấy từ Genbank với mã truy

cập là KJ418192.1.(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ418192.1/)

38

Kết quả thu được từ bảng 3.1. cho th ấy độ dài vùng ITS1-5,8SrRNA-

ITS2 có sự khác biệt nhau giữa các mẫu đại diện cho các taxon kh ảo sát, dao

động từ 586 - 588nucleotide.

Kết quả này phù h ợp với kết quả của nhóm nghiên c ứu của Phan Kế

Long và cs,vào n ăm 2012 - 2013, đã ti ến hành thu th ập mẫu, gi ải trình t ự

P.vietnamenesis tại Kon Tum và m ột taxon Panax tại Lai Châu và công b ố

trình tự gen matK và ITS-rDNA (ITS1-5,8S và một phần ITS2) của taxon này

lên Genbank và xác định đây là taxon P.vietnamensis var. fuscidiscus

Komatsu, Zhu & Cai. Trình t ự ITS-rDNA mà các tác gi ả công bố là trình t ự

vùng ITS1-5,8S và một phần ITS2 có kích thước 588 bp.

Khảo sát thành ph ần nucletotide thu ộc các trình t ự ITS1-5,8SrRNA-

ITS2 của các mẫu nghiên cứu, thu được kết quả trình bày trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Thành phần bốn loại nucleotide của 25 mẫu nghiên cứu và mẫu

tham chiếu KJ418192.1

Mẫu %T (U) %C %A %G %GC %AT STT

1 AS02 21.9 18.4 30.6 59.7 40.3 29.1

2 PTH2 22.4 18.2 30.6 59.4 40.6 28.7

3 LNT3 22.3 18.2 30.6 59.5 40.5 28.9

4 LNT4 22.3 18.2 30.6 59.5 40.5 28.9

5 PX9 22.3 18.7 30.3 59.0 41.0 28.7

6 PXA3 22.3 18.4 30.4 59.4 40.6 28.9

7 PX13 19.4 20.9 30.8 59.7 40.3 28.9

8 PX14 22.4 18.8 30.0 58.9 41.1 28.8

9 PX15 20.3 19.1 32.3 60.6 39.4 28.3

10 MX5 21.8 18.5 30.4 59.7 40.3 29.3

11 MX4 21.8 18.5 30.4 59.7 40.3 29.3

12 MX1 22.1 18.2 30.6 59.7 40.3 29.1

13 PT3 21.7 18.4 31.1 59.9 40.1 28.8

39

14 PKL1 21.9 28.6 18.2 31.3 59.9 40.1

15 PT10 21.7 28.8 18.6 30.9 59.7 40.3

16 PT19 22.1 28.9 18.5 30.4 59.4 40.6

17 PTPX3 23.0 28.6 18.4 30.1 58.7 41.3

18 PTPX2 22.1 29.1 18.4 30.4 59.5 40.5

19 PT7 21.9 29.1 18.7 30.3 59.4 40.6

20 SLC2 22.6 28.4 18.5 30.4 58.8 41.2

21 SLC3 22.6 28.4 18.5 30.4 58.8 41.2

22 SLC6 22.3 28.7 18.5 30.4 59.2 40.8

23 SLC9 22.3 28.7 18.7 30.3 59.0 41.0

24 PX10 22.4 28.9 18.7 29.9 58.8 41.2

25 PTH1 22.4 28.7 18.2 30.6 59.4 40.6

26 KJ418192.1 22.1 29.1 18.2 30.6 59.7 40.3

Trung bình 22.0 28.8 18.6 30.6 59.4 40.6

Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, thành phần Guanin, Cytosine, Adenine và

Thyminecủa các mẫu nghiên cứu khác nhau trong đó tỉ lệ thành phần Adenine

là thấp nhất và Guanin cao nhất. Đây cũng là đặc điểm cho thấy sự khác nhau

giữa các mẫu khảo sát dựa trên vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 . Nhìn chung, các

mẫu nghiên c ứu có t ỷ lệ Guanin và Cytosine cao h ơn tỷ lệ Adenine và

Thymine hay nói m ột cách khác là đều có thành ph ần %GC cao h ơn thành

phần %AT và s ự chênh l ệch này có ở cây hai lá m ầm.Mẫu PX15 có thành

phần GC cao nh ất (60,6%) và có thành ph ần AT (39,4%) th ấp nh ất. Tỷ lệ

thành phần %GC trung bình ở cả 25 mẫu nghiên cứu là 59,4% và t ỷ lệ thành

phần %AT trung bình 40,6% (bảng 3.2).

3.4. Kết qu ả so sánh trình t ự nucleotid vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 của

các mẫu nghiên cứu

Trình t ự vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 của các mẫu nghiên cứu thuộc chi

Panax được tiến hành so sánh v ới nhau. Phép so sánh gióng hàng b ằng công

40

cụ căn trình t ự ClustalW c ủa ph ần mềm Mega 6.0 và CLC v8.02, k ết qu ả

được thể hiện trong hình 3.4.

41

42

43

Hình 3.4: Kết quả gióng hàng, gióng cột 25 trình tựITS1-5,8SrRNA-ITS2

của25 mẫu Sâm và mẫu tham chiếu KJ418192.1

44

Kết quả hình 3.4, có thể nhận thấy sự khác biệt giữa các trình tự chủ yếu

là các vị trị đa hình đơn (SNP) ở 25 mẫu nghiên cứu.Trong đó, 1 nucleotid bị

thay thế bởi một nucleotid khác, bên cạnh đó cũng có một số khoảng trống giữa

các trình tự. Điều này có th ể là do h ệ quả sự biến động theo hướng mất hoặc

tăng thêm (deletion và insertion) một hay một số nucleotide trong trình tự vùng

ITS1-5,8SrRNA-ITS2 của các mẫu Sâmkhảo sát.

Trình tự nucleotide c ủa mẫu PX13, đây là m ẫu nghiên c ứu có nhi ều

điểm sai khác nhất trong dãy trình t ự do đó mẫu này có sự khác biệt lớn nhất

so với mẫu tham chiếu Sâm lai châu. Các mẫu như PT10, PT3, PX14 bị mất 2

nucleotide ở vị trí 79, 80 trong dãy trình tự; PX15 mất 2 nucleotide ở vị trí 90,

91. Một số mẫu có sự sai khác rất ít trong dãy trình tự như AS02, MX1 chỉ có

1 điểm sai khác duy nhất.

25 mẫu Sâm được nghiên cứu có sự khác biệt rất nhiều về trình tự vùng

ITS1-5,8SrRNA-ITS2, sự biến động trình tự giữa các mẫu thể hiện rõ nh ất ở

khoảng 200 nucleotid đầu và 200 nucleotid cu ối, đây chính là các vùng tr ống

không mang mã hai phía c ủa gene 5,8S rRNA. Nói cách khác, ở các m ẫu

Sâmtrong nghiên cứu này thì s ự biến động trình tự xảy ra mạnh mẽ ở vùng

ITS1 và ITS2 nhưng ít hơn ở vùng gene 5,8S rRNA.Sự biến động ít hay nhiều

trong dãy trình tự của 25 mẫu Sâm nghiên cứu đã thể hiện mối quan hệ về mặt

di truy ền, đồng th ời sự khác nhau trong dãy trình t ự của các m ẫu cũng th ể

hiện được tính đa dạng của các m ẫu nghiên c ứu nh ằm mục đích phân lo ại,

chọn lọc được nguồn gen quý.

3.5. Kết quả xây dựng cây quan hệ phát sinh giữa 25 mẫu nghiên cứu

Sự khác biệt về trình tự vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2giữa các mẫu khảo

sát được thể hiện thông qua hệ số tương đồng trình tự vùng ITS1-5,8SrRNA-

ITS2 gi ữa 25 m ẫu Sâm nghiên c ứu. Hệ số tương đồng di truy ền được tính

45

bằng ph ần mềm NTSYSpc 2.1,k ết qu ả ma tr ận tương đồng được th ể hi ện ở

bảng 3.3.

Bảng 3.3. Hệ số tươngđồng di truyền giữa 25 mẫu nghiên cứu và mẫu

tham chiếu KJ418192.1vào trình tự vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2

*Ghi chú: Th ứ tự mẫu từ 1 đến 26 theo hàng ngang gi ống thứ tự mẫu theo

hàng dọc

Kết qu ả phân tích d ựa vào đoạn trình t ự ITS1-5,8SrRNA-ITS2 cho

thấy, các mẫu Sâm thu t ại Lai Châu khá đa dạng di truyền được thể hiện qua

hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truy ền giữa các mẫu. Trong số

25 mẫu nghiên cứu, hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 100% (một số mẫu

Sâm có chung ngu ồn gốc), còn h ệ số th ấp nh ất là 87,07%; kho ảng cách di

46

truyền gần nhất là 0,00 và xa nh ất là 0,14.Điều này thể hiện có sự phân hóa ở

vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2của các mẫu khảo sát trong quá trình tiến hóa.

Sau khi xác định được trình t ự nucleotid vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 ,

tiến hành dựng cây quan hệ phát sinh bằng phần mềm Mega 6.0 theo ph ương

SLC2

SLC3

SLC6

PX9

SLC9

PX10

PT19

PT7

AS02

PTPX3

MX5

MX4

MX1

PTPX2

PTH2

PTH1

LNT3

LNT4

PXA3

PKL1

PT3

PT10

PX14

PX15

PX13

0.01

pháp Maximum likelihood, kết quả thể hiện ở hình 3.5.

Hình 3.5.Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền

giữa 25 mẫu nghiên cứu

47

Kết qu ả ở hình 3.5 cho th ấy, dựa vào trình t ự vùng ITS1-5,8SrRDN-

ITS2, 25 mẫu Sâm ở Lai Châu được khảo sát chia thành 2 nhóm chính d ựa

trên sự khác biệt di truyền của chúng:

v NhómI: chỉ 1 taxon nghiên c ứu là PX13, m ẫu này được thu tại Thu

Lũm - Mường Tè. Hệ số tương đồng di truy ền với các mẫu còn l ại

dao động từ 87,07% ( PKL1) đến 90,14% (MX1, AS02) và so v ới

mẫu tham chiếu cũng là 90,14%. Đây là mẫu có hệ số tương đồng di

truyền th ấp nh ất so v ới các mẫu còn l ại. Khoảng cách di truy ền xa

nhất là 0,14 và gần nhất là 0,11.

SLC2

SLC3

SLC6

PX9

SLC9

PX10

PT19

PT7

AS02

PTPX3

MX5

MX4

PTPX2

KJ418192.1

MX1

PTH2

PTH1

LNT3

LNT4

PXA3

PKL1

PT3

PT10

PX14

PX15

PX13

0.01

v NhómII: gồm 24 taxon nghiên cứu còn lại và mẫu tham chiếu (hình 3.6)

Hình 3.6. Cây quan hệ phát sinh giữa 25 mẫu nghiên cứu và mẫu tham

chiếu KJ4181892.1

48

Nhóm II được chia làm 3 nhóm nhỏ:

- Nhóm 1:có 1 taxon nghiên c ứu là PX15, m ẫu này thu t ại Thu L ũm -

Mường Tè. Hệ số tương đồng di truy ền với các mẫu còn lại dao động

từ 89,46% (PX13) đến 95,92% (PT10). Kho ảng cách di truy ền xa nh ất

là 0,11 (PX13).

- Nhóm2: có 1 taxon nghiên c ứu là PX14, m ẫu này thu t ại Thu L ũm -

Mường Tè. Hệ số tương đồng di truy ền với các mẫu còn lại dao động

từ 88,44% (PX13) đến 98,12% (PT3). Khoảng cách di truyền xa nhất là

0,12 (PX13).

Như vậy, nhóm 1 và 2 là 2 m ẫu nghiên cứu có mối quan hệ gần nhất

với PT3 và PT10 nằm trong nhóm 3, trong đó PX14 lại có quan hệ gần

hơn nữa với khoảng cách di truyền là 0,02.

- Nhóm3: gồm 22 taxon nghiên c ứu còn l ại và mẫu tham chi ếu. Nhóm

này được chia thành 3 nhóm phụ:

• Nhóm phụ 3.1: gồm 2 taxon nghiên c ứu là PT3 và PT10. Hai m ẫu này

đều thu t ại Thu Lũm - M ường Tè. H ệ số tương đồng di truy ền của 2

mẫu này với nhau là 99,83% với khoảng cách di truyền là 0,17cho thấy

giữa chúng có quan hệ rất gần gũi với nhau. Hệ số tương đồng di truyền

với các mẫu còn lại dao động từ 88,95% (PX13) đến 98,29% (PX14) và

với mẫu tham chiếu là trên 97%. Khoảng cách di truyền cao nhất của 2

mẫu này với mẫu PX13 là 0,11 và 0,12.

• Nhóm ph ụ 3.2: có 1 m ẫu là PKL1, m ẫu này được thu t ại Ka L ăng -

Mường Tè. Hệ số tương đồng di truy ền với các mẫu còn lại dao động

từ 87,07% (PX13) đến 95,92% (LNT3, LNT4). Kho ảng cách di truy ền

xa nhất là 0,14 (PX13) và kho ảng cách di truy ền thấp nhất là 0,04 ch ủ

yếu với các mẫu nằm trong nhóm phụ 2.3.

49

• Nhóm ph ụ 3.3: g ồm 19 m ẫu nghiên c ứu còn l ại và m ẫu tham chi ếu

KJ418192.1 và được chia thành 3 nhóm nhỏ hơn:

(cid:252) Nhóm 3.3.1: g ồm7 taxon nghiên c ứu: MX1 và PTPX2 ( Pa V ệ Sử -

Mường Tè), PTH2 và PTH1 (Sìn H ồ), LNT3 và LNT4 (Phong Th ổ),

PXA3 (Tam Đường), mẫu tham chi ếu KJ418192.1 cũng thu ộc nhóm

này. Các mẫu này có h ệ số tương đồng di truy ền với các mẫu còn l ại

dao động từ 89,46% (PX13) đến 100%. M ẫu LNT3 và LNT4 gi ống

nhau 100% (có th ể là cùng m ột loài) và có h ệ số di truy ền với mẫu

tham chiếu Sâm lai châu là 99,83% v ới khoảng cách di truy ền là 0,00.

Chứng tỏ LNT3 và LNT4 có quan h ệ chị em và rất gầngũi với Sâm lai

châu. Riêng mẫu MX1 có h ệ tương đồng với mẫu tham chiếu là 100%

và cùng giống nhau với các mẫu còn lại. Các mẫu còn lại cũng có quan

hệ rất gần gũi với mẫu tham chiếu do có hệ số tương đồng di truyền cao

trên 99% với khoảng cách di truyền xa nhất là 0,01.

(cid:252) Nhóm 3.3.2: gồm 4 taxon nghiên cứu là: AS02, PTPX3, MX5 và MX4.

Các mẫu nghiên c ứu đều được thu t ại Pa V ệ Sử - M ường Tè. H ệ số

tương đồng di truyền với các mẫu còn lại dao động từ 89,29% (PX13)

đến 100%. Kho ảng cách di truy ền xa nh ất là 0,12 (PX13). Nhóm m ẫu

này cũng có hệ số tương đồng di truyền khá cao so với mẫu tham chiếu

trên 99% với khoảng cách di truy ền xa nhất là 0,01 nên chúng c ũng có

quan hệ gần gũi với mẫu tham chiếu.Hai mẫu MX4 và MX5 có hệ số di

truyền với nhau là 100% và so v ới các mẫu còn lại là hoàn toàn gi ống

nhau nên có thể 2 mẫu này là cùng có chung một nguồn gốc.

(cid:252) Nhóm 3.3.3: gồm 8 taxon nghiên c ứu còn lại: SLC2, SLC3, SLC6 và

SLC9 ( Pa Vệ Sử - Mường Tè); PX9, PX10, PT19 và PT7 (Thu L ũm -

Mường Tè). Hệ số tương đồng di truyền với các mẫu còn lại dao động

từ 88,27% (PX13) đến 100%. Nhóm này có hệ số tương đồng di truyền

với mẫu tham chi ếu đều trên 97% nên chúng có m ối quan hệ khá gần

50

với mẫu tham chiếu.Trong đó, 2 mẫu SLC2 và SLC3 có hệ số di truyền

với nhau và với các mẫu còn lại giống nhau 100%, chứng tỏ 2 mẫu này

có quan hệ rất gần gũi với nhau và có thể cùng một nguồn gốc. Khoảng

cách di truyền xa nhất của nhóm này là 0,12 (PX13).

3.6. Kết quả xác định Marker phân tử phân biệt 25 mẫu Sâm nghiên cứu

Chỉ thị (marker) là m ột dấu hiệu, một đặc trưng có th ể nhận biết được

giúp chúng ta phân bi ệt th ứ này với th ứ khác, ví d ụ như hình thái, màu s ắc

hoa; hình d ạng, màu s ắc thân, lá,….T ương tự, ch ỉ th ị phân t ử (molecular

marker) hay chỉ thị di truyền (genetic marker) cũng là các dấu hiệu, hoặc các

đặc trưng có tính phân bi ệt giữa các cá th ể.Điểm khác bi ệt của những chỉ thị

này không dựa trên hình thái bên ngoài mà là dựa trên sự khác biệt về trình tự

gene của mỗi sinh vật.

Dựa vào k ết qu ả so sánh trình t ự các nucleotide ở hình 3.4, cho th ấy

dựa vào trình tự ITS1-5,8SrRNA-ITS2với marker ITS1/ITS8 có thể phân biệt

và nhận dạng chính xác các mẫu Sâm Lai Châu trong tập đoàn nghiên cứu.

Trình tự nucleotide c ủa các m ẫu nghiên c ứu có s ự khác bi ệt với các

giống khác chủ yếu là các vị trí đa hình đơn (SNP), trong đó có 1 nucleotid bị

thay thế bởi một nucleotid khác.

- Trình tự mẫu PX13 có nhi ều điểm sai khác nhất trong dãy trình t ự do

đó mẫu này có sự khác biệt lớn nhất so với mẫu tham chiếu Sâm Lai Châu:

+ Vị trí nucleotide số 35 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 82 thay T bằng G

+ Vị trí nucleotide số 85 thay T bằng A

+ Vị trí nucleotide số 88 thay C bằng T

+ Vị trí nucleotide số 90, 91 thay TC bằng CA

+ Vị trí nucleotide số 107 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 116 thay C bằng A

51

+ Vị trí nucleotide số 124 thay A bằng G

+ Vị trí nucleotide số 128 thay T bằng A

+ Vị trí nucleotide số 142 thay C bằng A

+ Vị trí nucleotide số 151 và 159 thay G bằng C

+ Vị trí nucleotide số 172 và 180 thay T bằng A

+ Vị trí nucleotide số 187 thay T bằng G

+ Vị trí nucleotide số 195 và 200 thay C bằng A

+ Vị trí nucleotide 207 thay T bằng A

+ Vị trí nucleotide số 218 thay C bằng G

+ Vị trí nucleotide số 232, 233 thay GC bằng CT

+ Vị trí nucleotide số 237 thay A bằng G

+ Vị trí nucleotide số 240 thay G bằng T

+ Vị trí nucleotide số 271 thay A bằng G

+ Vị trí nucleotide số 275 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 281 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 314, 315 thay GC bằng TA

+ Vị trí nucleotide số 320 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 333 thay C bằng A

+ Vị trí nucleotide số 339 thay C bằng G

+ Vị trí nucleotide số 351 thay T bằng G

+ Vị trí nucleotide số 354 thay C bằng G

+ Vị trí nucleotide số 361và 365 thay T bằng G

+ Vị trí nucleotide số 372 thay C bằng A

+ Vị trí nucleotide số 375 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 382 thay G bằng T

+ Vị trí nucleotide số 388 thay G bằng C

+ Vị trí nucleotide số 406 thay G bằng A

52

+ Vị trí nucleotide số 418 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 459 thay T bằng G

+ Vị trí nucleotide số 462 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 485 thay C bằng G

+ Vị trí nucleotide số 488 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 514 và 523 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 533 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 544 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 557 và 568 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 570 thay C bằng G

+ Vị trí nucleotide số 580 thay G bằng T

+ Vị trí nucleotide số 583 thay T bằng C

- Trình tự mẫu PX15 có các điểm sai khác:

+ Vị trí nucleotide số 79 thay T bằng G

+ Vị trí nucleotide số 87 thay A bằng G

+ Vị trí nucleotide số 172, 173 thay TG bằng CA

+ Vị trí nucleotide số 185 thay A bằng G

+ Vị trí nucleotide số 195 thay C bằng G

+ Vị trí nucleotide số 205, 275 thay T bằng G

+ Vị trí nucleotide số 320 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 437 thay C bằng G

+ Vị trí nucleotide số 485 thay C bằng T

+ Vị trí nucleotide số 493 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 500 thay G bằng T

+ Vị trí nucleotide số 547 thay T bằng G

+ Tại các v ị trí nucleotide s ố: 35; 82; 85; 90; 91; 116; 124; 128; 142; 180;

233; 339; 351; 272 và 533 có sự sai khác nucleotide giống với mẫu PX13.

53

- Trình tự nucleotide của mẫu PX14:

+ Sự sai khác trình t ự nucleotide của PX14 tại các vị trí gi ống với PX15 là:

172; 185; 205; 241; 372; 437; 485; 493

+ Vị trí nucleotide số 79, 80 bị mất 2 nucleotide

+ Vị trí nucleotide số 173 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 245; 314 thay G bằng T

+ Vị trí nucleotide số 341 thay G bằng C

+ Vị trí nucleotide số 413 thay C bằng T

+ Vị trí nucleotide số 513 thay G bằng T

+ Vị trí nucleotide số 554 thay G bằng A

- Trình tự nucleotide của 2 mẫu nghiên cứu PT10 và PT3 có các điểm sai

khác giống nhau:

+ Vị trí nucleotide số 35 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 79; 80 mất 2 nucleotide

+ Vị trí nucleotide số 124 thay A bằng G

+ Vị trí nucleotide số 172 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 185 thay A bằng G

+ Vị trí nucleotide số 205 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 372 thay C bằng T

+ Vị trí nucleotide số 413; 485 thay C bằng T

+ Vị trí nucleotide số 493 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 542 thay C bằng G

+ Vị trí nucleotide số 547 thay T bằng G

+ Vị trí nucleotide số 32 của mẫu PT10 có G thay bằng A

- Trình tự nucleotide của mẫu PKL1 có s ự sai khác v ới các mẫu còn lại

tại các điểm. Đây là mẫu mà các vị trí sai khác có nhi ều khác biệt so với các

mẫu còn lại:

54

+ Vị trí nucleotide số 25; 80 thay T bằng A

+ Vị trí nucleotide số 93 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 145 thay T bằng A

+ Vị trí nucleotide số 171 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 182 thay A bằng C

+ Vị trí nucleotide số 205 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 384 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 402 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 472-474 thay AGC bằng GAA

+ Vị trí nucleotide số 529 thay C bằng T

+ Vị trí nucleotide số 546; 575 thay A bằng G

- Trình tự nucleotide của mẫu PX10 có s ự sai khác v ới các mẫu còn lại

tại các vị trí. Đây là mẫu có sự khác biệt lớn nhất trong phân nhóm phụ 3.3.3:

+ Vị trí nucleotide số 164 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 487 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 501 thay G bằng T

+ Vị trí nucleotide số 545 thay T bằng G

+ Vị trí nucleotide số 554 thay G bằng C

+ Vị trí nucleotide số 556 thay G bằng T

+ Vị trí nucleotide số 565; 569 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 570 thay C bằng T

+ Vị trí nucleotide số 588 thay C bằng A

- Trình tự nucleotide của mẫu nghiên cứu PX9 có các vị trí sai khác sau:

+ Vị trí nucleotide số 2 thay C bằng T

+ Vị trí nucleotide số 164 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 506 thay C bằng T

+ Vị trí nucleotide số 580 thay G bằng A

55

- Trình tự nucleotide mẫu nghiên c ứu SLC2, SLC3, SLC6 và SLC9 có

các điểm sai khác khác với mẫu còn lại tại các vị trí:

+ Vị trí nucleotide số 2 thay C bằng T

+ Vị trí nucleotide số 7 thay C bằng T (SLC3)

+ Vị trí nucleotide số 31 thay C bằng T (SLC2)

+ Vị trí nucleotide số 244 thay C bằng T

- Trình tự nucleotide m ẫu PT7 và PT19 có các điểm sai khác: v ị trí

nucleotide số 164, 231 và 487 thay G b ằng A (PT7); vị trí nucleotide số 165,

487 thay G bằng A (PT19).

- Trình tự nucleotide mẫu nghiên cứu MX4 và MX5 có các vị trí sai khác

khác với các mẫu còn lại:

+ Vị trí nucleotide số 422 thay G bằng A

+ Vị trí nucleotide số 552 thay A bằng C

+ Vị trí nucleotide số 584-586 thay TCG bằng CAA

- Trình tự nucleotide mẫu nghiên cứu PTPX3 tại các vị trí sai khác:

+ Vị trí nucleotide số 386-388 thay CCG bằng TTT

+ Vị trí nucleotide số 391-392 thay CG bằng TT

+ Vị trí nucleotide số 417 thay G bằng T

+ Vị trí nucleotide số 422 thay G bằng A

- Trình tự mẫu nghiên cứu AS02 chỉ có 1 điểm sai khác tại vị trí số 422

G được thay bằng A. Cũng có 1 điểm sai khác duy nh ất nhưng vị trí sai khác

lại khác biệt với mẫu tham chiếu KJ418192.1

- Trình tự nucleotide mẫu nghiên cứu PXA3 có các điểm sai khác:

+ Vị trí nucleotide số 27 thay C bằng T

+ Vị trí nucleotide số 57 thay G bằng T

+ Vị trí nucleotide số 412 thay G bằng A

56

- Trình tự nucleotide 2 m ẫu nghiên c ứu PTH1 và PTH2, trong đó mẫu

PTH2 mặc dù cùng nhóm d ưới phụ nhưng PTH2 lại chỉ có 1 điểm sai khác ở

vị trí 277, thay C bằng T. PTH1 ngoài có điểm sai khác giống mẫu tham chiếu

ở vị trí 57 và PTH2 ở trí 277 thì còn có các điểm sai khác so với các mẫu còn

lại:

+ Vị trí nucleotide số 27 thay C bằng T

+ Vị trí nucleotide số 584 thay T bằng C

+ Vị trí nucleotide số 585 thay C bằng T

- Trình tự nucleotide mẫu PTPX2 có 2 vị trí sai khác trong dãy trình tự là

vị trí nucleotide số 57 (G b ằng T) và 216 (G b ằng A), trong đó sai khác ở vị

trí số 57 trùng với mẫu tham chiếu của Sâm Lai Châu.

- Trình tự nucleotide mẫu LNT3, LNT4 và MX1 có cùng 1 vị trí sai khác

là nucleotide số 57 thay G bằng T. Toàn bộ dãy trình tự và vị trí sai khác duy

nhất trong dãy trình t ự của 3 mẫu này hoàn toàn kh ớp với mẫu tham chi ếu

KJ418192.1

57

PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Kết quả phân tích đa dạng di truyền 25 mẫu Sâm nghiên cứuthu tại Lai

Châu và taxon cùng chi ( Panax vietnamensis var. fuscidiscus)dựa vào đoạn

trình tự genITS1-5,8rRNA-ITS2 cho thấy:Các mẫu Sâm thu thập tại Lai Châu

khá đa dạng di truy ền. Hệ số tương đồng di truy ền gi ữa các m ẫu Sâm dao

động từ 87,07% đến100% (khoảng cách di truyền gần nhất là 0,00 và xa nh ất

là 0,14%).

25 mẫu Sâm nghiên c ứu được chia thành nhi ều nhóm nh ỏ khác nhau

dựa trên sự khác biệt di truyền của chúng. Trong đó có các mẫu ( mẫu LNT3

và LNT4; mẫu MX4 và MX5) có h ệ số tương đồng là 100% có th ể có cùng

một ngu ồn gốc. Mẫu MX1 gi ống với mẫu tham chi ếu Sâm Lai Châu 100%

(có cùng nguồn gốc với mẫu tham chiếu KJ418192.1-Panax vietnamensis var.

fuscidiscus).

Sử dụng vùng trình t ự ITS1-5,8SrRNA-ITS2 có th ể nhận dạng chính

xác các m ẫu Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var. fuscidicus trong tổng

số 25 mẫu nghiên c ứu.Đây là cơ sở để xác định được những nguồn gen quý

phục vụ công tác nhân gi ống, phát tri ển và b ảo tồn loài Sâm Lai Châu c ủa

Việt Nam.

2. Kiến nghị

Tiếp tục nghiên c ứu về sự đa dạng ở mức hình thái đặc biệt là thành

phần dinh d ưỡng, các ho ạt ch ất dược học để xác định nguồn giống có năng

suất, ch ất lượng ph ục vụ công tác nhân gi ống, bảo tồn, lưu gi ữ ngu ồn gen

Sâm Lai Châu quý hiếm ở Việt Nam.

58

CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN

1. Ph ạm Quang Tuy ến1, Nguy ễn Minh Đức2, Kh ương Th ị Bích 2, Nguy ễn Thái Dương2, Nguyễn Trường Khoa2,Bùi Thanh Tân 2, Nguyễn Thị Hoài Anh1, Tr ịnh Ng ọc Bon 1, Tr ần Th ị Kim H ương3, Tr ần Đăng Khánh2,Khuất Hữu Trung 2, “Đánh giá đa dạng di truy ền một số mẫu giống sâm thu th ập tại Lai Châu”, Tạp chí Khoa h ọc và Công ngh ệ Việt Nam, 2018, 60(2), tr.27-31.

ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN

59

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Tài liệu tiếng Việt:

1. Bộ Khoa h ọc và Công ngh ệ và Vi ện Khoa h ọc và Công ngh ệ Vi ệt

Nam(2007). Sách đỏ Việt Nam phần II - Thực vật. NXB. KHTN & CN,

Hà Nội.Tr 82-91.

2. Phạm Thanh Huyền (2007). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của

4 loài cây thu ốc quý Acanthopanax gralicilistylus W. W. Smith, A.

trifiliatus (L.) Merr., Panax bipinnatifidus Seem., P. stipuleanatus H. T.

Tsai & K. M. Feng thu ộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae) ở Việt Nam nhằm

bảo tồn và phát tri ển. Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc Gia

Hà Nội.

3. Phan Kế Long, H ồ Th ị Loan, Nguy ễn Giang S ơn, Đặng Tất Th ế

(2009).Mối quan h ệ di truy ền của một số loài Lan hài thu ộc chi

Paphiopedilum ở Vi ệt Nam . Trong H ội ngh ị khoa h ọc toàn qu ốc về

sinh thái và tài nguyên sinh v ật lần th ứ 3: 194-199. NXB Nông

nghiệp, Hà Nội.

4. Phan Kế Long, V ũ Đình Duy, Phan K ế Lộc, Nguy ễn Giang S ơn,

Nguyễn Th ị Ph ương Trang, Lê Th ị Mai Linh, Lê Thanh S ơn (2014),

“Mối quan h ệ di truy ền của các m ẫu Sâm thu ở Lai Châu trên c ơ sở

phân tích trình t ự nucleotide vùng Matk và ITS-rDNA ”, Tạp chí Công

nghệ sinh học, 12(2), tr.327-337.

5. Lã Đình Mỡi, Châu V ăn Minh, Tr ần Văn Sung, Ph ạm Qu ốc Long,

Phan Văn Kiệm, Trần Huy Thái, Tr ần Minh Hợi, Ninh Kh ắc Bản, Lê

Mai Hương (2013), Họ nhân sâm (Araliaceae Juss.) - Ngu ồn hoạt chất

sinh học đa dạng và đầy tri ển vọng ở Vi ệt Nam, Hội ngh ị khoa h ọc

toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh v ật lần thứ 5, Nhà xu ất bản

Nông nghiệp, 1152-1158.

60

6. Nguyễn Huy Sơn (2016). Đặc điểm sinh thái cây Sâm Lai Châu (Panax

vietnamensis var. fuscidiscus). Báo cáo hội thảo “Bảo tồn và phát tri ển

Sâm Lai Châu t ại huyện Mường Tè), Vi ện Nghiên cứu Lâm sinh, n ăm

2016.

7. Lê Thanh Sơn, Nguyễn Tập (2006) Những đặc điểm sinh thái c ơ bản

của sâm Ngọc Linh. Tạp chí Dược liệu (Hà Nội) 11: 145-147.

8. Nguyễn Tập (2005) Các loài thu ộc chi Panax L. ở Việt Nam. Tạp chí

Dược liệu (Hà Nội) 10: 71-76.

9. Nguyễn Ngh ĩa Thìn (2005), Các ph ương pháp nghiên c ứu th ực vật.

NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

10. Nguyễn Thanh Thu ận, Vũ Thanh Th ảo, Nguyễn Văn Thanh, Tr ần Cát

Đông (2010), “Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định một số

loài sâm thu ộc chi Panax”, Tạp chí Y h ọc TP. H ồ Chí Minh, 14(1),

tr.129-133.

11. Phạm Quang Tuyến (2016b). Kết quả nghiên cứu nhân giống, trồng bảo

tồn cây Sâm Lai Châu ( Panax vietnamensis var. fuscidiscus) trên địa

bàn các xã vùng cao huy ện Mường Tè. Báo cáo h ội thảo “Bảo tồn và

phát triển Sâm Lai Châu t ại huyện Mường Tè), Vi ện Nghiên cứu Lâm

sinh, năm 2016.

Tiếng Anh

12. Baeg I.H. and So S.H., 2013. The word ginseng market and the ginseng

(Korea). Journal of Ginseng Research 37(1): 1-7.

13. Bai, H, Wang, S, Liu, J, Gao, D, Jiang, Y, and Liu, H (2015).

Localization of ginsenosides in Panax ginseng with different age by

matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight mass

spectrometry imaging. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.

61

14. Bai D., Brandle J. and Reeleder R., 1997. Genetic diversity in North

American ginseng (Panax quinquefolius L.) grown in Ontario detected

by RAPD analysis. Genome 40(1): 111-115.

15. Baldwin, B.G., Sanderson, M.J., Porter, J.M., Wojciechowski, M.F.,

Campbell, C.S., Donoghue, M.J., 1995. The ITS region of nuclear

ribosomal DNA-A valuable source of evidence on Angiosperm

phylogeny. Ann. Mo. Bot. Gard. 82, 247-277.

16. Bellarosa R, Simeone MC, Papini A, Schirone B. Utility of ITS

sequence data for phylogenetic reconstruction of Italian Quercus spp.

Mol Phylogenet Evol 34: 355-370.

17. Bentham G. and Hooker J.D., 1867. Araliaceae, Vol.1. Genera

plantarum. London: L. Reeve &Amp;Co.,pp. 931-947.

18. Britton, N.L., and A. Brown. 1913. An illustrated flora of the northern

United States, Canada and the British Possessions. 3 vols. Charles

Scribner's Sons, New York. Vol. 2: 440.

19. Clarke C.B., 1879. Araliaceae. Flora of British India , Vol. 2. London:

L. Reeve &Amp; Co., pp. 134-179.

20. Dan N.V., Ramchiary N., Choi S.R., Uhm T.S., Yang T.J., Ahn I.O.

and Lim Y.P., 2010. Development and characterization of new

microsatellite markers in Panax ginseng (C.A. Meyer) from BAC end

sequences. Conservation Genetics 11: 1223-1225.

21. Deborah Y., Hong Q., Lau A.J., Yeo C.L., Liu X.K., Yang C.R., Koh

H. L. and Hong Y., 2005. Genetic Diversity and Variation of Saponin

Contents in Panax notoginseng Roots from a Single Farm. Journal of

Agricultural and Food Chemistry 53: 8460−8467.

22. Decaisne J. and Planchon J.E., 1854. Esquisse d’une monographie des

Araliacees. Revue Horticole 4:104-109.

62

23. De Candolle A.P., 1830. Araliaceae. Prodromus systematis naturalis

regni vegetabilis Vol. 4, ed. A. P. de Candolle. Paris: Treuttel &

Wurtz., pp. 251-266.

24. Eidus R. and Leopold S., 2013. Highlights of the International

American Ginseng Expo. Journal of Medicinal Plant Conservation.

25. Embong, Z., Wan Hitam, W-H., Yean, C., Rashid, N., Kamarudin, B.,

et al., (2008) Specific detection of fungal pathogens by 18S rRNA gene

PCR in micribial keratitis. BMC Ophthalmol, 8:7

26. Florence C.L., 1992. Facts about Ginseng: The Elixir of Life . Hollym

International Corporation.

27. Elyakov GB, Uvarova NI, Gorshkova RP (1965b) The Structure of

carbohydrate chains of panaxosides D, E, F. Tetrahedron Lett

6(51):4669-4674.

28. Fujita M, Itokawa H, Shibata S (1962) Chemical studies on ginseng. I.

Isolation of sapogenin from radix ginseng. Yakugaku Zasshi 82(12):

1634-1638.

29. Ha TD, Grushvitsky IV (1985) A new species of the genus Panax

(Araliaceae) from Vietnam. Bot J (Leningrad): 519-522.

30. Hadrys , H.,Balick, M.and Schierwater, B. (1992) Application of

random ampli-fied polymorphic DNA (RAPD) in molecular ecology.

Molecular Ecology, 1, 55-63.

31. Hara H., 1970. On the Asiatic species of the genus Panax. Journal

Japan Botany 45(7): 197-212

32. Harms H., 1897. Zur Kenntnis der Gattungen Aralia und Panax.

Botanische Jahrbücher fur Systematik 23: 1-23.

33. Hon, CC, Chow, YC, Zeng, FY, and Leung, FC (2003). Genetic

authentication of ginseng and other traditional Chinese medicine. Acta

Pharmacol Sin. 24, 841-846.

63

34. Jarne P, Lagoda PJL.(1996). Microsatellites, from molecules to

populations and back. Trends Ecol Evol 11: 424-429.

35. Jee, HS, Chang, KH, Park, SH, Kim, KT, and Paik, HD (2014).

Morphological characterization, chemical components, and

biofunctional activities of Panax ginseng, Panax quinquefolium,

and Panax notoginseng roots: A comparative study. Food Rev

Int. 30, 91-111.

36. Jennifer M.C. and Hamrick J.L., 2004. Genetic diversity in harvested

and protected populations of wild American ginseng, Panax

quinquefolius L. (Araliaceae). American Journal of Botany 91(4): 540-

548.

37. Jo, IH, Bang, KH, Kim, YC, Kim, JU, Shin, MR, and Moon, JY (2013).

Analysis of mitochondrial DNA sequence and molecular marker

development for identification of Panax species. Korean J Med Crop

Sci. 21, 91-96.

38. Kenneth W.M., Joseph P.L., Wansang L. and Robert L. B., 2004.

Effects of Population and Age on Ginsenoside Content of American

Ginseng (Panax quinquefolium L.). Acta horticulturae 629: 161-166.

39. Kim D.H., 2012. Chemical Diversity of Panax ginseng, Panax

quinquifolium, and Panax notoginseng. .Journal of Ginseng Reseach

36(1): 1-15.

40. Kim, YJ, Jang, MG, Zhu, L, Silva, J, Zhu, X, and Sukweenadhi, J

(2015). Cytological characterization of anther development in Panax

ginseng Meyer. Protoplasma.

41. Kim O.T., Bang K.H., In D.S., Lee J.W., Kim Y.C., Shin Y.S., Huyn

D.Y., Lee S.S., Cha S.W. and Seong N.S., 2007. Molecular

authentication of ginseng cultivar by comparision of internal

64

transcribed spacer and 5.8S rDNA sequences. Plant Biotechnology

Report 1: 163-167.

42. Kim, J, Jo, BH, Lee, KL, Yoon, ES, Ryu, GH, and Chung, KW (2007).

Identification of new microsatellite markers in Panax ginseng. Mol

Cells. 24, 60-68.

43. Komatsu K., Chihiro T. and Shu Z., 2005. Ginseng drugs - Molecular

and chemical characteristics and possibility as antidementia drugs.

Nutraceutical Research 3(1): 47-64.

44. Landry, B. S. and Michelmore, R. W. 1987. Methods and applications

of restriction fragment length polymorphism analysis to plants. In:

Tailoring genes for crop improvement: an agricultural perspective. Ed.

by: G. Bruening, J. Harada, and A. Hollaender. Plenum Press, New

York. pp. 25-44.

45. Lee J.W., Kim Y.C., Jo I.H., Seo A.Y., Lee J.H., Kim O.T., Hyun D.Y.,

Cha S.W., Bang K.H. and Cho J.H., 2011. Development of an ISSR-

Derived SCAR Marker in Korean Ginseng Cultivars (Panax ginseng C.

A. Meyer). Journal of Ginseng Research 35(1): 52-59.

46. Lim, YP, and Choi, KT (1990). The characterization of mitochondrial

DNA of Korean ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer). Korean J

Ginseng Sci. 14, 310-316.

47. Lim, YP, Shin, CS, Lee, SJ, Youn, YN, and Jo, JS (1993). Survey of

proper primer and genetic analysis of Korean ginseng (Panax ginseng

C.A. Meyer) variants using the RAPD technique. Korean J Ginseng

Sci. 17, 153-158.

48. Linnaeus C. 1754. Genera plantarum, 5th edition. Stockholm.

49. Mohammadi, S.A. and Prasanna, B.M. (2003) Review and

Interpretation Analysis of Genetic Diversity in Crop Plants —Salient

Statistical Tools. Crop Science, 43, 1235-1248.

65

50. MULLIS K.B., FALOONA F.A. (1987): Specific synthesis of DNA in

vitro via a polymerase-catalysed chain reaction. Meth. Enzymol., 155:

335-350

51. Neale, D. B. and Williams, C. G. 1991. Restriction fragment length

polymorphism mapping in conifers and applications to forest genetics and

tree improvement. Can. J. For. Res. 21: 545-554. Nybom, H., Schaal.

52. Phan Ke Long, Le Thanh Son, Phan Ke Loc, Vu Dinh Duy, Pham Van

The (2013) Lai Chau ginseng Panax vietnamensis var. fuscidiscus K.

Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai I . Morphology, Ecology, Distribution and

Conservation Status. In Proc. 2 nd VAST-KAST Workshop on

Biodiversity and Bio-Active Compounds: 65-73.

53. Phan Ke Long, Nguyen Thi Phuong Trang, Leonid V. Averyanov, Phan

Ke Loc (2011) Molecular characterisation of Calocedrus rupestris

Averyanov LV, Nguyen HT and Phan LK, 2008 (Cupressaceae) based

on ITS1 partial sequence. Gen Molec Res 10 (4): 3702-3711.

54. Plunkett G.M., Soltis D.E. and Soltis P.S., 1996. Higher level

relationships of Apiales (Apiaceae and Araliaceae) based on

phylogenetic analysis of rbcLsequences. American Journal of Botany

83(4): 499-515.

55. Powell, W, Machray, GC, and Provan, J (1996). Polymorphism

revealed by simple sequence repeats. Trends Plant Sci. 1, 215-222.

56. Quan L.T., Adnyana I.K., Tezuka Y., Nagaoka T., Qui K.T., and

Kadota S., 2001. Triterpene Saponins from Vietnamese Ginseng

(Panax vietnamensis) and their hepatocytoprotective Activity. Journal

of Natural Products 64(4): 456- 461.

57. Seemann, B. (1868) On the genus Panax. Journal of Botany (Moral) 6:

52-58.

66

58. Silva, PI, Martins, AM, Gouvea, EG, Pessoa-Filho, M, and Ferreira,

ME (2013). Development and validation of microsatellite markers for

Brachiaria ruziziensis obtained by partial genome assembly of Illumina

single-end reads. BMC Genomics. 14, 17.

59. Shibata S., Tanaka O., Ando T., Sado M., Tsushima S., Ohsawa T.

Chemical studies on oriental plant drugs. XIV. Protopanaxadiol, a

genuine sapogenin of ginseng saponins. Chem Pharm Bull.

1966;14:595-600. [PubMed]

60. Shim Y.H., Choi J.H., Park C.D., Lim C.J., Cho J.H. and Kim H.J.,

2003. Molecular Differentiation of Panax Species by RAPD Analysis.

Archives of Pharmacal Research 26(8): 601-605.

61. Shu Z., Fushimi H., Cai S. and Komatsu K., 2003. Phylogenetic

relationship in the genus Panax: inferred from chloroplast trnK Gene

and Nuclear 18S rDNA Gene Sequences. Planta Medica 69(7): 647-653.

62. Thuan N.T., Thao V.T., Thanh N.V., Dong T.C., 2010. Authentication

of ginseng species by biomolecular methods. Y Hoc TP. Ho Chi Minh -

Supplement 14(1): 129-133.

63. Tsai H.T. and Feng K.M., 1975. Triterpenoid from Panax L. and their

relationship withtaxonomy and geographical distribution. Acta

Phytotaxonomica Sinica 13(2): 29-48.

64. Um, JY, Chung, HS, Kim, MS, Na, HJ, Kwon, HJ, and Kim, JJ (2001).

Molecular authentication of Panax ginseng species by RAPD analysis

and PCR-RFLP. Biol Pharm Bull. 24, 872-875.

65. Wen J., 1993. Generic delimitation of Aralia L. (Araliaceae). Brittonia

45(1) 47-55.

66. Wen J. and Zimmer E.A., 1996. Phylogeny and Biogeography of Panax

L. (the Ginseng Genus, Araliaceae): Inferences from ITS Sequences of

67

Nuclear Ribosomal DNA. Molecular Phylogenetics and Evolution 6(2):

167-177.

67. William E.C., 2000. Ginseng - the genus Panax . Harwood academic

publishers, pp. 55-116.

68. Woo, SY, Lee, DS, and Kim, PG (2004). Growth and eco-physiological

characteristics of Panax ginseng grown under three different forest

type. J Plant Biol. 47, 230-235.

69. Xiang Q.B. and Lowry P.P., 2007. Araliaceae. - In: Wu C.Y., Rawen

P.H. & Hong D.Y. (eds), Flora of China, Vol. 13. Science Press,

Beijing, Missouri Botanical Garden Press., pp. 435-491.

70. Yang D.Q., 1981. The cyto-taxonomic studies on some species of

Panax L. Acta Phytotaxonomica Sinica 19:298-303. (In Chinese with

English summary.).

71. Yang W., Hu Y., Wu W., Ye M. and Guo D., 2014. Saponins in the

genus Panax L. (Araliaceae): A systematic review of their chemical

diversity. Phytochemistry 106: 7-24.

72. Yu K.W., Gao W.Y., Son S.H. and Paek K.Y., 2000. Improvement of

ginsenoside production by jasmonic acid and some other elicitors in

hairy root culture of ginseng ( Panax ginseng C. A. Meyer). In Vitro

Cellar and Development Biology - Plant 36(5): 424-428.

73. Yu, RH, Zhao, YJ, Xu, KZ, Zhang, MS, Zhang, ZA, and Chen, ZY

(2009). Diurnal changes of photosynthesis in Panax ginseng and Panax

quinquefolium under different environmental conditions. J South China

Agr Univ. 30, 7-11.

74. Zhou L., Cao X., Zhang R., Peng Y., Zhao S. and Wu J., 2007.

Stimulation of saponin production in Panax ginseng hairy roots by two

oligosaccharides from Paris polyphylla var. yunnanensis.

Biotechnology Letters 29(4): 631-634.

68

75. Zuo Y.J., Chen Z.J., Kondo K.K., Funamoto T., Wen J. & Shou S.L.,

2011. DNA Barcoding of Panax Species. Planta Medica 77(2): 182-187.

76. Zuo Y.J., Wen J., Ma J. and Zhou S., 2014. Evolutionary radiation of

the Panax bipinnatifidus species complex (Araliaceae) in the Sino-

Himalayan region of eastern Asia as inferred from AFLP analysis.

Journal of Systematics and Evolution 53(3): 210-220.

69

>AS02

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAATTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGGTCC

CCGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAA

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>PTH2

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGTTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAATAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTTACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGGTCC

CCGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAA

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>LNT3

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGTTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAATAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGTGAGGGAGTGATG

PHỤ LỤC: TRÌNH TỰ 25 MẪU SÂM LAI CHÂU NGHIÊN CỨU

70

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGGTCC

CCGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAA

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>LNT4

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGTTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAATAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGGTCC

CCGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAA

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>PX9

GTGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCAACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGATCC

71

CCGACCATGGGTTTGTAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAA

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAAGTTTCGAC

>PXA3

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGTTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAATAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCACGCAGTTCAGTTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGGTCC

CCGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAA

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>PX13

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACAGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGGCGAGATGCACATCGCCAAGGACTCACATTTGGGACAACCG

CGCGGAGAGACACGGGAGGACATTATCCCCCCCTCCCCCTCGACTCCCGAGAGGGAGAGGT

GAGGTGGGGGGAGACGAGGTGTGAGACGCCCAGGGAGACGTGCCCTCGCTCTAGTGTCTT

CGGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGGTGGCTCACGAGATTCTGCAATTCACACCAAGTAT

CGCATTTCTATACGCTCTTCATCGATGAGAGAGGCGAGATATCCGGTGGCGAGAGGCGTGT

GTGTTATAAAAAGACTCTTCCCCCGCCCGCAAACGGGGGAGACGCGCGCAGCTCAGTTTGA

TTTCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGGTGCTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGGGG

CCCCCGACCATGGGTTTGCAACTTGGAGAGCTTGCACACCCCTCGCCCCTCACCCGATATTGT

AACGTGCTCGCGGGTCGCTGTGCTATGCATGTCTCGAC

>PX14

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACAGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGCG

72

CGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGCAAGGGAGTGATGG

GTTGGGGGGCGACGCGATGCGTGACGCCCAGGCAGACATGCCCTCGGCCTAATGGGTTCT

GGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCG

CATTTCTCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCCAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGTGT

TTTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGTGCAGTTCAGTTTGATTTC

CTTGGGGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGTGGTCCCC

AACCATGGGTTTGCAACTTGTGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAACAT

GTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>PX15

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCAACAGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACGTGGCGAGGCGCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGGCAACCGC

GCGGGGAGACACGGGAGGGCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGCAAGGGAGAGAT

GGGTTGGGGGGGGACGCGATGCGTGACGCCCAGGCAGACATGCCCTCGGGCTAATGGGTT

CGGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGGTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTAT

CGCATTTCGCTACGCTCTTCATCGATGCGAGAGACGAGATATCCGCTGCCGAGAGTCGTTTG

TGTTTTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGAT

TTCCTTGGGGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGTGGTC

CCCAACCATGTGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGCCCCTCACCCGGTAGTGTA

ACGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>MX5

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAATTTGATT

73

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGGTCC

CCGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAC

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTCAAAC

>MX4

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAATTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGGTCC

CCGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAC

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTCAAAC

>MX1

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAATAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGGTCC

CCGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAA

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>PT3

74

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACAGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGCG

CGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGCAAGGGAGTGATGG

GTTGGGGGGCGACGCGATGCGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTCG

GGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCG

CATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGTG

TTTTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGTGCAGTTCAGTTTGATTT

CCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGTGGTCCC

CAACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCGGGTAGTGTAAC

GTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>PKL1

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTCGTTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTAGTCGTGACGTCCGTCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCG

CGCGGTGAGACACGGGAGGCCAATATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCATGAGGGAGTGCG

GGGTTGGGGGGCGACGCGATGCGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTT

CGGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTAT

CGCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTG

TGTTTTAGAAAGACGCCTCCGCCGCCCGCAAACGAGGGGGACGCGTGCAGTTCAGTTTGAT

TTCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGGAACACCCAAGGGTAGTC

CCCGACCATGGGTTTGTAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCTTCGTCCCTCACCCGGTGTTGTA

ACGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTGTGCAGGTTTCGAC

>PT10

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCAACAGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGCG

CGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGCAAGGGAGTGATGG

GTTGGGGGGCGACGCGATGCGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTCG

GGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCG

75

CATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGTG

TTTTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGTGCAGTTCAGTTTGATTT

CCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGTGGTCCC

CAACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCGGGTAGTGTAAC

GTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>PT19

GTGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCAACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGATCC

CCGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAA

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>PTPX3

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTTTTCCTCTCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCATTTCAATTTGATTT

CCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGGTCCC

CGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAAC

GTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

76

>PTPX2

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAATAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAAGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTCG

GGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCG

CATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGTG

TTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATTT

CCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGGTCCC

CGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAAC

GTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>PT7

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCAACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGACCTAATGGCTTCG

GGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCG

CATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGTG

TTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATTT

CCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGATCCC

CGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAAC

GTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>SLC2

GTGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGTGACGGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCAACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTTG

77

GGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCG

CATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGTG

TTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATTT

CCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGATCCC

CGACCATGGGTTTGTAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAAC

GTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>SLC3

GTGCAATAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCAACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTTG

GGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCG

CATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGTG

TTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATTT

CCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGATCCC

CGACCATGGGTTTGTAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAAC

GTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>SLC6

GTGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCAACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGATCC

78

CCGACCATGGGTTTGTAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAA

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

>SLC9

GTGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCAACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGATCC

CCGACCATGGGTTTGTAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAA

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAAGTTTCGAC

>PX10

GTGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAAGAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCAACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGATCC

CCGACCATGGTTTTGTAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGGATTGTAA

CCTTTTCGCGGTCCGTCTTGCTATGCAGGTTTCGAA

>PTH1

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGTTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAATAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

79

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTTACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGGTCC

CCGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAA

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTCTGAC

>KJ418192.1

GCGCAACAGGGTCATGAGAGCTTTTGCTGGCGACGGGTCACCGCACGACATGAGAATAGG

GCTTTTTACAACCACCACTTGTCGTGACGTCCATCGCCAAGGACTCGCATTTGGGCCAACCGC

ACGGTGAGACACGGGAGGCCATTATCCGCCCCTCCGCCTCGACTCCCGTGAGGGAGTGATG

AGTTGGGGGGCGACGCGATGTGTGACGCCCAGGCAGACGTGCCCTCGGCCTAATGGCTTC

GGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATC

GCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTGT

GTTCTAGAAAGACGCTTCCGCCGCCCGCAAACGGGGGGGACGCGCGCAGTTCAGTTTGATT

TCCTTGGCGCATTCCGCGCCGGGGGGTCGTTGTTCGGACGAGAGCCACCCAAGGGCGGTCC

CCGACCATGGGTTTGCAACTTGGGGAGCTTGCGCACCCCTCGTCCCTCACCCGGTATTGTAA

CGTGTTCGCGGGTCGTTCTGCTATGCAGGTTTCGAC

80