Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: So sánh trình tự gen liên quan đến tổng hợp isoflavone của 2 giống đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––––––

ĐẶNG KIỀU TRANG

SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP ISOFLAVONE CỦA 2 GIỐNG ĐẬU TƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––––––––

ĐẶNG KIỀU TRANG

SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP ISOFLAVONE CỦA 2 GIỐNG ĐẬU TƯƠNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

PGS. TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Người hướng dẫn khoa học:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

THÁI NGUYÊN - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự

hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh và sự giúp đỡ của các cán

bộ Khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái

Nguyên, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai

công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi thông tin trích dẫn trong luận

văn này đã được ghi rõ nguồn gốc.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này.

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 11 năm 2016

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Đặng Kiều Trang

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian nghiên cứu thực hiện luận văn này tôi luôn nhận

được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh,

người trực tiếp hướng dẫn luận văn cho tôi. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn

chân thành và sâu sắc tới cô.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trịnh Đình Khá cũng như các thầy cô

giáo Khoa Khoa học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã

tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập cũng như

thực hiện đề tài này.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn và các cán bộ, kỹ thuật

viên phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tốt nhất

để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này.

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình,

đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn cùng tôi

trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thiện luận văn này.

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 11 năm 2016

Tác giả luận văn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Đặng Kiều Trang

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii

MỤC LỤC ........................................................................................................ iii

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... v

DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................... vii

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................... 2

1.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3

1.1. Cây đậu tương ............................................................................................ 3

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tương ................................................... 3

1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu tương ........................................... 4

1.1.3. Thành phần dinh dưỡng trong hạt đậu tương .......................................... 7

1.2. Thành phần và hoạt tính của isoflavone đậu tương ................................. 10

1.2.1. Thành phần của isoflavone đậu tương .................................................. 10

1.2.2. Hàm lượng isoflavone trong thực phẩm ............................................... 13

1.2.3. Hoạt tính của isoflavone đậu tương ...................................................... 14

1.2.4. Tác dụng của isoflavone ....................................................................... 15

1.3. Sinh tổng hợp isoflavone.......................................................................... 21

1.3.1. Con đường sinh tổng hợp isoflavone .................................................... 21

1.3.2. Các enzyme tổng hợp isoflavone .......................................................... 22

1.3.3. Gen tổng hợp isoflavone IFS2 ở cây đậu tương ................................... 23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 24

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 24

2.2. Hóa chất thiết bị và địa điểm nghiên cứu................................................. 25

2.2.1. Hóa chất................................................................................................. 25

2.2.2. Thiết bị .................................................................................................. 26

2.2.3. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 26

2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 27

2.3.1. Phương pháp phân tích hàm lượng isoflavone trong các mẫu đậu

tương nghiên cứu ............................................................................................. 27

2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ................................................... 27

2.3.3. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số ........................ 28

2.3.4. Kỹ thuật PCR ........................................................................................ 28

2.3.5. Tinh sạch sản phẩm PCR ...................................................................... 30

2.3.6. Kĩ thuật tách dòng gen .......................................................................... 30

2.3.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotide ............................................ 33

2.3.8. Phương pháp phân tích trình tự gen ...................................................... 33

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 34

3.1. Hàm lượng isoflavone của các giống đậu tương nghiên cứu ................... 34

3.2. Kết quả nhân dòng và xác định trình tự gen IFS2 ................................... 35

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ........................................................... 35

3.2.2. Kết quả nhân gen IFS2 ở cây đậu tương ............................................... 36

3.2.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR .......................................................... 37

3.2.4. Kết quả tách dòng gen ........................................................................... 37

3.2.5. Kết quả giải trình tự gen ........................................................................ 39

3.3. So sánh trình tự nucelotide của gen IFS2 ................................................ 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 51

1. Kết luận ....................................................................................................... 51

2. Đề nghị ........................................................................................................ 51

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

bp base pair (cặp bazơ)

cDNA complementary DNA

CHI Chalcone isomerase

cs cộng sự

DEPC diethyl pyrocarbonate

DNA deoxyribosenucleic acid

dNTP deoxynucleoside triphosphate

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

E. coli Escherichia coli

IFS Isflavone synthase

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kb kilo base

kDa kilo Dalton

mRNA messenger ribonucleic acid

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RNA Ribonucleic acid

TAE Tris-acetate-EDTA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của hạt đậu tương ........................................... 7

Bảng 1.2. Hàm lượng amino acid không thay thế trong protein đậu tương ......... 8

Bảng 1.3. Thành phần vitamin trong đậu tương ............................................... 8

Bảng 1.4. Hàm lượng isoflavone trong thực phẩm ........................................ 13

Bảng 2.1. Đặc điểm các giống đậu tương nghiên cứu .................................... 24

Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị đã sử dụng ................................................... 26

Bảng 2.3. Cặp mồi nhân gen IFS2 .................................................................. 29

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen IFS2 ............................................. 29

Bảng 2.5. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen IFS2 ............................. 29

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối gen IFS2 vào vector pBT...................... 31

Bảng 2.7. Thành phần của phản ứng colony - PCR ........................................ 32

Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng colony- PCR ................................... 33

Bảng 3.1 . Hàm lượng Isoflavone ở các giống đậu tương .............................. 34

Bảng 3.2. Giá trị mật độ quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm và

280nm của hai giống đậu tương DT84 và DT22 ............................ 35

Bảng 3.3 Số lượng và tỷ lệ các nucleotide trong gen IFS2 của giống đậu

tương DT84 và DT22 ...................................................................... 39

Bảng 3.4. Các trình tự đoạn mã hoá của gen IFS2 mang mã số trên Ngân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

hàng gen quốc tế NCBI được sử dụng để phân tích ....................... 42

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của các aglucon ................................................... 12

Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của các ß-Glucozit ............................................. 12

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp isoflavone ............................................. 21

Hình 1.4. Sơ đồ mô tả gen IFS2 ở cây đậu tương ........................................... 23

Hình 2.1. Cấu trúc vector pBT ........................................................................ 31

Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose ............................. 35

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen IFS2 của 2 mẫu đậu

tương DT84 và DT22 ...................................................................... 36

Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR tinh sạch ....................... 37

Hình 3.4. Hình ảnh sản phẩm colony-PCR ...................................................... 38

Hình 3.5. Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp BT-IFS2 của giống đậu

tương DT22 và DT84 ...................................................................... 39

Hình 3.6. Trình tự gen DT22 ........................................................................... 40

Hình 3.7. Trình tự gen DT84 .......................................................................... 41

Hình 3.8. Hệ số tương đồng dựa vào trình tự mã hóa (CDS) của DT 84, DT22

và các trình tự tương đồng trên NCBI ............................................... 43

Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide gen IFS2 của giống DT84 và DT2

và trình tự tương đồng trên GenBank ............................................. 44

Hình 3.10. Hệ số tương đồng trình tự amino acid suy diễn của giống đậu

tương DT22 và DT84 với các trình tự tương đồng trên GenBank ...... 48

Hình 3.11. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein IFS2 giống

đậu tương DT22, DT84 và trình tự tương đồng trên NCBI ............ 49

Hình 3.12. Cây quan hệ di truyền gen IFS2 và protein suy diễn của giống

đậu tương DT22 và DT84 với các trình tự tương đồng trên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

GenBank.......................................................................................... 50

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Đậu tương từ lâu đã được biết đến là thực phẩm có giá trị dinh dưỡng

cao vì nó chứa hàm lượng protein cao hơn bất kì loại nông sản nào, không

những thế trong đậu tương còn chứa rất nhiều khoáng chất, các chất sinh tố B

đặc biệt là các hoạt chất thảo mộc có khả năng ngăn ngừa và trị liệu bệnh tật.

Trong những năm gần đây, đậu tương đã và đang chuyển biến từ thực phẩm

thành dược phẩm, là cây thuốc quí được sử dụng trong đông y. Nhiều nghiên

cứu khoa học đã chỉ ra sử dụng đậu tương có tác dụng giảm nguy cơ các bệnh

liên quan đến tim mạch, ngăn cản sự phát triển một số dạng tiền ung thư và

ung thư, ngăn ngừa bệnh thận, bệnh tiểu đường, bệnh loãng xương, bệnh

nhiếp hộ tuyến đàn ông, các triệu chứng rối loạn tiền mãn kinh phụ nữ…

Hàm lượng protein cao trong hạt đậu tương cũng như nhiều hợp chất có giá trị

khiến đậu tương trở thành một trong những thực phẩm quan trọng trên thế

giới, đậu tương còn được mệnh danh là “thần dược” của phụ nữ [3].

Điều làm các nhà khoa học say mê nghiên cứu là khám phá ra các hoạt

chất thảo mộc có trong đậu tương và những ứng dụng của chúng trong lĩnh

vực y khoa trị liệu, trong đó các isoflavones là loại hoạt chất sinh học mang

lại nhiều hứng thú nhất [3]. Isoflavone là một enyme có nguồn gốc từ thực vật

có cấu trúc tương tự như hormone kích thích tố sinh dục phái nữ và sự vận

hành giống như estrogen. Vì thế các nhà khoa học còn gọi nó là estrogen thảo

mộc (phytoestrogens). Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng isoflavone đậu tương

không chỉ có tác dụng phòng mà còn có khả nãng điều trị nhiều căn bệnh nan

y của thời đại [8], [9], [10], [11].

Đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính và tác dụng của isoflavone đậu

tương cũng như phương pháp tách chiết, sản xuất, ứng dụng sản phẩm này,

nhưng những nghiên cứu sâu hơn về di truyền đối với gen isoflavone vẫn còn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

rất hạn chế. Hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương khá cao, cao nhất

trong các loại hạt đậu. Tuy nhiên, để đáp ứng nhu cầu ứng dụng hoạt chất

isoflavone làm dược phẩm của con người, yêu cầu đặt ra là phải nâng cao hơn

nữa hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương. Phân lập và xác định trình tự

gen tổng hợp isoflavone là bước đầu tiên tạo tiền đề cho những nghiên cứu

tiếp theo như nghiên cứu về chức năng của gen, thiết kế vector chuyển gen…

nhằm đạt mục đích nâng cao hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương. Xuất

phát từ đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “So sánh trình tự gen liên

quan đến tổng hợp isoflavone của 2 giống đậu tương”.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được đặc điểm trình tự gen tổng hợp isoflavone phân lập từ 2

giống đậu tương có hàm lượng isoflavone khác nhau.

1.3. Nội dung nghiên cứu

- Xác định hàm lượng isoflavone có trong một số giống đậu tương

nghiên cứu.

- Khuếch đại, chọn dòng và xác định trình tự gen tổng hợp isoflavone

của 2 giống đậu tương có hàm lượng isoflavone khác nhau.

- So sánh trình tự gen đã phân lập của 2 giống đậu tương nghiên cứu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

với nhau và với trình tự đã công bố trên GenBank.

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cây đậu tương

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tương

Cây đậu tương hay còn gọi là cây đậu nành có tên khoa học là Glycine

max (L.) Merrill, là loại cây ăn hạt, thân thảo thuộc họ đậu (Fabaceae), có bộ

nhiễm sắc thể 2n=40. Cây đậu tương thuộc:

Giới : Plantae

Ngành : Magnoliophyta

Lớp : Magnoliopsida

Bộ : Fabales

Họ : Fabaceae

Phân họ : Faboideae

Giống gt : Glycine

Loài : max

Cây đậu tương là cây trồng có lịch sử lâu đời. Theo các tài liệu nghiên

cứu thì cây đậu tương có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu phía Bắc Trung Quốc

từ thời các triều đại Phong kiến, trong đó nhiều tài liệu cho rằng cây đậu

tương được thuần hoá dưới triều đại Shang, hay còn gọi là triều đại nhà

Thương, vào khoảng thế kỉ XVII đến thế kỉ XI trước Công Nguyên. Từ đây

cây đậu tương được lan truyền sang Nhật Bản, Triều Tiên vào khoảng thế kỷ

thứ VIII, sau đó truyền bá sang các nước châu Á khác như Thái Lan,

Malaysia, Hàn Quốc, Việt Nam.. [2], [4].

Đến thế kỷ XVII, cây đậu tương được giới thiệu vào Châu Âu bởi các

nhà thực vật học và được đặt tên là Glicine max. Thế kỷ XVIII cây đậu tương

mới được du nhập vào Mỹ trên những thuyền hàng có hành trình từ Trung

Quốc. Cây đậu tương được du nhập vào Châu Âu trước nhưng do khí hậu và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đất đai ở đây không mấy phù hợp nên việc trồng trọt đậu tương tại Mỹ phát

triển nhanh chóng hơn nhiều. Cho đến ngày nay, Mỹ vẫn là một trong những

quốc gia đứng đầu về sản xuất sản phẩm hạt đậu tương chiếm 50% sản lượng

trên toàn thế giới, tiếp theo là Trung Quốc, Ấn Độ. Cây đậu tương là một trong

năm cây thực phẩm quan trọng ở Hoa Kì, theo số liệu thống kê của bộ nông

nghiệp Hoa Kì năm 2008 diện tích trồng cây đậu tương chuyển gen chiếm 92%

trong tổng diện tích trồng cây đậu tương trên cả nước [5], [6], [10].

Ngày nay, cây đậu tương đã trở nên phổ biến và được trồng ở rất nhiều

nước trên thế giới, trở thành cây thực phẩm có giá trị kinh tế cao, quan trọng

nhất trong các loại cây thuộc họ đậu, nhờ vào những đặc điểm ưu việt vượt trội

so với các loại cây đậu khác, như hàm lượng protein, lipid cao, chứa nhiều

vitamin, các khoáng chất và nhiều loại hoạt chất thảo mộc có lợi cho sức khoẻ

con người.

1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu tương

Cây đậu tương là loại cây thân thảo, hằng năm. Thân cây mảnh, cao từ

0,8m đến 0,9m, có lông, cành hướng lên phía trên. Một cây đậu tương hoàn

chỉnh bao gồm rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt [6].

Rễ

Đậu tương là cây rễ cọc, bộ rễ gồm có rễ cái (rễ chính) và các rễ bên (rễ

phụ). Rễ cái có thể ăn sâu vào đất đến 150 cm hoặc sâu hơn, nhưng trong điều

kiện bình thường chỉ ăn sâu vào khoảng 20-30 cm. Điểm đặc biệt của bộ rễ

đậu tương là trên rễ, cả rễ cái và rễ bên, có chứa các nốt sần. Nốt sần là phần

vỏ rễ phình ra và trong đó có hàng tỷ vi khuẩn Rhizobium japonicum sinh

sống. Vi khuẩn này hình gậy, sống trong đất, có khả năng đi vào rễ và cố định

đạm từ khí trời, với lượng đạm cung cấp cho cây khoảng 30-60kg/ha [10].

Thân, cành

Đậu tương là cây thân thảo, thân hình tròn, chia đốt, ít phân cành. Trên

thân đậu tương có nhiều lông nhỏ. Thân đậu tương thường đứng, cũng có khi

thân bò hay nửa bò, thường có màu xanh hoặc màu tím, chiều cao trung bình

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

0,5-1,2m, cao nhất có thể lên đến 1,5m.

Cành mọc ra từ các đốt trên thân, hướng lên trên. Số cành trên thân nhiều

hay ít phụ thuộc vào giống, đất đai và kỹ thuật canh tác. Nhiều giống đậu

tương chỉ có 1-2 cành hoặc không có cành. Các cành mọc ra ở đốt thứ nhất

hoặc đốt thứ 2 trên cây sẽ mập và khoẻ hơn các cành bên trên. Cành cùng với

thân chính sẽ tạo thành tán cây đậu tương [6], [10].

Lá

Lá mọc cách, có 3 loại chính là lá mầm, lá đơn, lá kép. Lá có nhiều hình

dạng khác nhau như hình trái xoan, trứng, tròn, dài, ô van, mũi lá gần nhọn,

không đều ở gốc. Mặt lá thường có nhiều lông trắng.

Lá mầm (lá tử diệp): Lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi

tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh. Hạt giống to thì lá mầm

chứa nhiều dinh dưỡng nuôi cây mầm, khi hết chất dinh dưỡng lá mầm sẽ khô

héo đi.

Lá nguyên (lá đơn): Lá nguyên xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3 ngày và

mọc phía trên lá mầm. Lá đơn mọc đối xứng nhau. Lá đơn to màu xanh bóng

là biểu hiện cây sinh trưởng tốt. Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện cây sinh

trưởng không bình thường.

Lá kép: Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét. Lá kép mọc so le, lá

kép thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu. Cũng có

giống khi quả chín lá vẫn giữ được màu xanh. Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ.

Số lượng lá kép nhiều hay ít, diện tích lá to hay nhỏ chi phối rất lớn đến năng

suất và phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng. Các lá nằm cạnh chùm hoa nào giữ vai

trò chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa ấy. Nếu vì điều kiện nào đó làm

cho lá bị úa vàng thì quả ở vị trí đó thường bị rụng hoặc lép [1], [6].

Hoa

Đậu tương có hoa dạng cánh bướm, ống đài năm cánh không bằng nhau.

Hoa có màu trắng hay tím xếp thành chùm ở nách lá, đầu cành hoặc thân, mỗi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nách lá mang một chùm hoa, mỗi chùm hoa có từ 1-10 hoa, thường là 7-8

hoa. Đậu tương là cây có hoa lưỡng tính, hoàn toàn tự thụ phấn. Cây ra hoa

sớm hay muộn, thời gian ra hoa tuỳ thuộc vào giống và thời vụ gieo do chịu

ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ. Điều kiện thích hợp cho sự nở

hoa là ở nhiệt độ 25-280C, ẩm độ không khí 75-80%, ẩm độ đất 70-80%. Cây

đậu tương cho nhiều hoa nhưng tỷ lệ hoa không thành quả chiếm 20-80% [6].

Quả và hạt

Quả thõng, hình lưỡi liềm, gân bị ép, trên quả có nhiều lông mềm màu

vàng, thắt lại giữa các hạt. Quả đậu tương thuộc loại quả giáp, khi chín thì quả

chuyển sang màu vàng hoặc xám. Mỗi quả có từ 1-4 hạt. Quả đậu tương gồm 2

nửa của lá noãn, nối với nhau ở phần bụng và lưng. Trên cả 2 đường nối biểu bì

của quả cong vào phía trong tạo nên một lớp nhu mô thẳng đứng, lớp nhu mô

này tách mô dẫn thành 2 vùng giúp quả tách ra khi quả chín.

Hạt đậu tương cũng như hạt của nhiều loại họ đậu khác là không có nội

nhũ mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn. Trong hạt, phôi thường

chiếm 2%, 2 lá tử điệp chiếm 90% và vỏ hạt 8% tổng khối lượng hạt. Hình

dạng hạt có nhiều hình như hình cầu, dẹt, dài và oval. Màu sắc rốn hạt khác

nhau đặc trưng cho từng giống. Hạt có kích thước to nhỏ khác nhau tuỳ theo

từng giống, khối lượng hạt trung bình khoảng 200-400mg/hạt [2], [3], [6].

Đặc điểm sinh thái học của cây đậu tương

Nhiệt độ thích hợp ở giai đoạn nẩy mầm và giai đoạn cây con là từ 24 -

300C, độ ẩm ở giai đoạn nẩy mầm khoảng từ 75 - 80% nhưng đến giai đoạn cây

non độ ẩm lại giảm xuống 50 - 60%. Nhiệt độ 24 -340C là nhiệt độ thích hợp

cho giai đoạn ra hoa kết trái, ở giai đoạn này nhu cầu độ ẩm tăng gần như giai

đoạn nẩy mầm từ 70 -80%, sang đến giai đoạn quả chín nhiệt độ thích hợp giảm

còn 20 - 250C và độ ẩm cũng giảm mạnh xuống mức 35 - 45%. Ở cây đậu tương

lượng mưa cần phải đạt từ 700 mm là tốt nhất. Đa số các giống đậu tương có thể

trồng trên nhiều loại đất khác nhau như: đất phù sa, đất xám, đất giồng cát,

những loại đất này thường có thành phần cơ giới nhẹ, độ PH từ 5-8 [8].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1.1.3. Thành phần dinh dưỡng trong hạt đậu tương

 Thành phần hóa học trong đậu tương.

Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, giàu protein, lipid, vitamin

và muối khoáng. Đậu tương là loại hạt mà giá trị của nó được đánh giá đồng

thời cả về protein và lipid.

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của hạt đậu tương [7]

Thành phần, % trọng lượng khô Các phần của Protein Lipid Carbohydrat Tro hạt đậu tương (%) (%) (%) (%)

4,9 35 40 20 Hạt nguyên

5 29 43 23 Tử diệp

4,3 86 8,8 1 Vỏ hạt

4,4 43 41 11 Phôi

Protein

Đậu tương được nhiều nhà khoa học xem như là chìa khóa để giải

quyết nạn thiếu protein trong dinh dưỡng của con người. Protein trong hạt đậu

tương chứa khoảng trên 38% tùy loại. Hiện nay nhiều giống đậu tương có hàm

lượng protein đặc biệt cao tới 40-45%. Có những chế phẩm của đậu tương mang

tới 90-95% protein, đây là nguồn thực vật có giá trị cao cung cấp cho con người.

Protein đậu tương dễ tiêu hóa hơn thịt và không có các thành phần tạo thành

cholesterol, không có các dạng acid uric,…ngày nay người ta mới biết nó

chứa chất Leucithine có tác dụng làm cơ thể trẻ nâu, sung sức, làm tăng thêm

trí nhớ, tái sinh các mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng cho cơ thể.

Protein đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong các protein thực vật bởi vì nó

đươc tạo bởi các amino acid, trong đó có đủ các loại amino acid không thay

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

thế [50].

Trp

Leu

Ile

Val

Thr

Lys

Met

Phe

Bảng 1.2. Hàm lượng amino acid không thay thế trong protein đậu tương [24]

Amino acid

1,1%

8,4%

5,8%

5,8% 4,8%

6,0%

1,4%

3,8%

Giá trị

Lipid

Ở đậu tương, hàm lượng lipid chiếm từ 12 - 25% khối lượng khô, trong

đó hàm lượng các axit béo no thấp, khoảng 13%, không có cholesterol, 30%

là các axit béo chưa no một nối đôi. Lượng axit béo không no cần thiết: axit

linoleic 50% và đặc biệt có 7% axit anpha linolenic là nguồn cung cấp axit

béo chuỗi mạch dài omega 3 quan trọng cho cơ thể như DHA (Docosa

Hexaenoic Acid) và EPA (Eicosa Pentaenoic Acid) [47]. Hàm lượng lipid do

đậu tương cung cấp có chất lượng cao vì vậy đậu tương được sử dụng rộng rãi

trong công nghệ chế biến thực phẩm. Hiện nay, mức sống ngày càng được cải

thiện nên con người chuộng dầu thực vật hơn mỡ động vật.

Vitamin

Hạt đậu tương cũng chứa khá nhiều các loại vitamin, cả tan trong dầu và

tan trong nước, đặc biệt là hàm lượng của vitamin B2 và B1. Ngoài ra, trong

đậu tương còn có các loại vitamin như: PP, A, E, K, C, D,…Trong hạt đậu

tương khô chứa khoảng 5% khoáng, với các nguyên tố khoáng đa lượng như

muối của K, P, Mg, S, Ca, Cl, Na. Hàm lượng trung bình của các nguyên tố

khoáng này nằm trong khoảng 0,2-2,1%. Những nguyên tố khoáng vi lượng

gồm có: Cu, Zn, Fe, Co, Pb, I, Se, Mn, Cd,… Hàm lượng của những nguyên tố

khoáng vi lượng này dao động khoảng 0,01-140 ppm [10], [24].

Bảng 1.3. Thành phần vitamin trong đậu tương [24]

Thành phần Thiamine Riboflavine

Vitamine E

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hàm lượng 6,25-6,85 0,92-1,19 10,9-28,4 150-190 24,6-72,5 -tocopherol -tocopherol -tocopherol Đơn vị g/g g/g g/g g/g g/g

 Thành phần hoạt chất thảo mộc trong đậu tương

Lecithin (phosphatidyl choline)

Trong đậu tương lecithin chiếm khoảng 0,5-1,5%. Lecithin là một

nguồn quan trọng của choline. Lecithin là nguồn cung cấp nhóm methyl cần

thiết cho sự trao đổi chất bình thường, tham gia xây dựng cấu trúc tế bào. Lợi

ích về mặt chữa bệnh của lecithin bao gồm: giảm nguy cơ mắc các bệnh về

tim mạch, ngăn ngừa sự phát triển bất thường của bào thai, giúp tăng cường

trí nhớ, ngăn ngừa hoặc làm giảm tác dụng phụ của một số loại thuốc [24].

Saponins

Trong protein đậu tương có chứa 0,1-0,3% saponins. Nhiều nghiên cứu

cho thấy rằng saponins có nhiều công dụng tích cực như: giảm lượng

cholesterol trong máu, ngăn ngừa sự phát triển của các tế bào ung thư, tăng

cường khả năng miễn dịch của cơ thể [24].

Trypsin inhibitors

Có 2 loại chất ức chế trypsin được phân lập ra từ đậu tương là: Kunitz

trypsin inhibitor và Bowman-Birk (BB) inhibitor. Hai chất này đều có khả

năng ức chế enzyme trypsin trong cơ thể người, riêng BB inhibitor còn có khả

năng ức chế chymotrypsin. Các trypsin inhibitors này dễ bị phá hủy bởi nhiệt.

Nhiều nghiên cứu mới đây cho thấy rằng, các trypsin inhibitors có thể là

nguyên nhân gây ra chứng phình to tuyến tụy ở trẻ nhỏ. Bên cạnh đó, người ta

cũng thấy được rằng BB inhibitor cũng có khả năng ngăn ngừa các tác nhân

gây ra ung thư [5], [24].

Lectins

Lectins hay còn được biết với tên là hemagglutinins, lectins được hình

thành từ sự liên kết của 4 hyroxyproline. Lectins rất tốt cho sức khỏe như: làm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

giảm lượng insulin trong máu, giảm suy thoái của gan và thận [5].

Phenolic acid

Phenolic axit là một hoạt chất chống oxy hoá (anti - oxidant) và phòng

ngừa các nhiễm sắc thể khỏi bị tấn công bởi những tế bào ung thư.

Omega - 3 fatty acid

Omega - 3 fatty axit là loại chất béo không bão hoà có khả năng làm giảm

luợng cholesterol xấu đồng thời giúp làm gia tăng lượng cholesterol tốt trong

máu [5].

Phytosterols

Hạt đậu tương chứa khoảng 0,3-0,6 mg/g là phytosterols, trong đó

stanol chiếm khoảng 2%. Campesterol, -sitosterol, stigmasterol là 3

phytosterol chính. Khi các sterols bị hydro hóa ta sẽ thu được stanol. Cấu trúc

của sterol và stanol thì tương tự với cấu trúc của cholesterol động vật. Mặc

dù phytosterol có cấu trúc tương tự như cholesterol, nhưng chúng lại có khả

năng làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu giúp giảm nguy cơ về các

bệnh tim mạch [5], [24].

Isoflavone

Trong số các hoạt chất thảo mộc trong đậu tương thì isoflavone đang

được quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học vì những tính năng vượt trội

trong phòng và điều trị nhiều căn bệnh [5], [24].

1.2. Thành phần và hoạt tính của isoflavone đậu tương

1.2.1. Thành phần của isoflavone đậu tương

Các isoflavone trong đậu tương đã được biết đến với tác dụng estrogen

yếu hoặc hoạt tính giống với hormone nên còn được gọi là hormone thực vật -

phytoestrogen. Các chất có tác dụng “phytoestrogen” trong hạt đậu tương

gồm chủ yếu là daidzin, genistin.

Năm 2005, các nhà khoa học Brazil đã tiến hành phân tích 18 mẫu đậu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tương. Mục đích của thí nghiệm là xác định thành phần lớp chất isoflavon từ

đó so sánh tỉ lệ các chất trong 18 mẫu. Qua phân tích, cho thấy isoflavon

trong đậu tương là một hợp chất phenolic gồm có: aglucone (daidzein,

genistein và glyxitein), ß - glucozit (genistin, daidzin, glyxitin), ß - glucozit

kết hợp với nhóm malonyl (6” - O - malonyldaidzin, 6” - O - malonylgenistin

và 6” - O - malonylglycitin), ß - glucozit kết hợp với nhóm axetyl (6” - O -

axetyldaidzin, 6” - O - axetylgenistin và 6” - O - axetylglycitin) [31].

Bằng các phương pháp sắc kí HPLC/DAD và phổ UV các nhà khoa học

Bồ Đào Nha cũng đã xác định thành phần của isoflavone trong 40 mẫu hạt

Đậu tương. Sau khi so sánh với các kết quả nghiên cứu đã được thực hiện

trước đó với kết quả phân tích trong thí nghiệm, các khoa học gia khẳng định

trong hạt Đậu tương các aglucone chiếm một lượng nhỏ, hợp chất chính

trong hạt Đậu tương là các dẫn xuất malonyl và dẫn xuất axetyl của ß -

glucozit. Báo cáo còn chỉ ra trong hạt Đậu tương còn chứa các aglucone :

sissotrin, ononin; các dẫn xuất axetyl của ß - glucozit : 6” - axetylsissotrin, 6” -

axetylononin; các dẫn xuất malonyl của ß - glucozit : 6” - malonylsissotrin, 6”

- malonylononin [27].

Năm 2006 các nhà khoa học Hàn Quốc đã thực hiện một nghiên cứu so

sánh thành phần isoflavone trong phôi, lá mầm, hạt và vỏ hạt Đậu tương. Kết

quả nhận được, tổng tỉ lệ trung bình của isoflavone là 2887μg/g trong phôi,

575μg/g trong hạt, 325μg/g trong lá mầm, 33μg/g trong vỏ hạt. Các khoa học

gia cũng đã phân tách được 12 đồng phân isoflavone trong 90 phút/mẫu thí

nghiệm bằng phương pháp HPLC - PDA [16].

Cấu trúc cơ bản của isoflavon gồm 2 vòng bezen: A và B nối với một

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

dị vòng pyron.

Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của các aglucon [18]

Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của các ß-Glucozit [18]

Phần lớn các isoflavone trong đậu tương là ở dạng glucoside như

genistin, daidzin, glycitin. Tuy nhiên, dạng isoflavone này có hoạt tính sinh

học thấp hơn so với dạng aglucone (genistein, daidzein, glycitein). Matsura và

cộng sự đã xác định được trong đậu tương nảy mầm, isoflavone dạng

aglucone tăng lên rất nhiều do hoạt tính của β-glucosidase nội bào của đậu

tương được kích hoạt bởi quá trình nảy mầm. Enzyme này cắt liên kết β-

glucoside trong phân tử genistin, loại đi phân tử glucose để chuyển thành

genistein [28].

Khi vào cơ thể, các isoflavone tự do đựợc hấp thu ở ruột non nhanh hơn

so với các isoflavone ở dạng glucoside. Sự chuyển hoá các isoflavone đáng

chú ý vì quá trình này tạo ra các sản phẩm có tác dụng mạnh hơn nhiều so với

các chất ban đầu. Hệ vi sinh đường ruột được chứng minh là có tầm quan

trọng đặc biệt đối với chuyển hoá và tính khả dụng của các isoflavone, khi chỉ

có các động vật có hệ vi sinh đường ruột mới được thấy có bài tiết sản phẩm

chuyển hoá có tác dụng mạnh (equol) của isoflavone. Một số nghiên cứu đánh

giá mức độ thải trừ equol qua nước tiểu cho thấy chỉ khoảng 33% cá thể

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

người phương Tây chuyển hoá daidzein thành equol. Sự khác nhau về chuyển

hoá isoflavone có thể có những ảnh hưởng quan trọng tới hoạt tính sinh học

của các phytoestrogen này [35], [36].

1.2.2. Hàm lượng isoflavone trong thực phẩm

Trong số các loại đậu, đậu tương là loại đặc biệt có hàm lượng

isoflavone khá cao, cao nhất trong các loại hạt đậu. Các nhà khoa học đã kết

luận cứ 1 gr đậu tương khô thì thu được hơn 3 mg Isoflavone (chiếm từ 0,3%

đến 0,4% khối lượng đậu tương). Các loại đậu và thực phẩm khác cũng chứa

isoflavone nhưng nồng độ các chất isoflavone trong những thực phẩm này rất

thấp so với đậu tương. Thực phẩm làm từ đậu tương có chứa 120-170 mg

isoflavones mỗi 100 gram của sản phẩm, trong khi các loại đậu, các loại hạt

có chứa chỉ 1-2 mg isoflavones mỗi 100 gram.

Bảng 1.4. Hàm lượng isoflavone trong thực phẩm [51]

Hàm lượng isoflavone Sản phẩm (mg/100g)

34,39 Đậu tương

Đậu Hà Lan 2,42

Hạt lạc 0,56

Đậu triều 0,26

Đậu xanh 0,19

Cỏ ba lá 0,15

Khoai tây 0,07

Đậu tây 0,06

Trà xanh 0,05

Cải canh 0,04

Cỏ linh lăng 0,04

Đậu đũa 0,03

Măng tây 0,03

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Hạnh nhân 0,01

1.2.3. Hoạt tính của isoflavone đậu tương

Các isoflavone trong đậu tương đã được biết đến với tác dụng estrogen yếu

hoặc hoạt tính giống với hormone nên còn được gọi là hormone thực vật -

phytoestrogen. Các chất có tác dụng “phytoestrogen” trong hạt đậu tương gồm

chủ yếu là daidzin, genistin.

Chất chuyển hoá chính của genistein là hydroxy - O - demethylangolensin.

Những chất chuyển hoá chính của daidzein là O - demethylan - golensin,

glyxitein và equol. Equol là thành phần rất quan trọng cho hoạt tính của

isoflavone đậu tương trong điều trị các triệu chứng mãn kinh, vì hoạt tính

estrogen của equol mạnh gấp 5 lần hoạt tính này của chất mẹ daidzein và lớn

gấp 2 lần hoạt tính của genistein [15].

Các estrogen tác dụng thông qua liên kết với các thụ thể estrogen trong

tế bào (có hai loại thụ thể ER là alphe ER (α ER) và beta ER (ß ER).α ER có

mặt tại màng trong tử cung, trong chất đệm của buồng trứng và ở tuyến vú.

Còn ß ER, tồn tại trong các tế bào nội mô của thành mạch máu, ở não, thận và

trong các tế bào của bàng quang và niệu đạo, trong tế bào của niêm mạc ruột

và phổi, tế bào xương. Do đó những tác dụng khi kích thích α ER sẽ khác hẳn

tác dụng khi kích thích ß ER.

Estradiol là hormon estrogen sinh lý chủ yếu, sẽ kích thích chủ yếu α ER

và cho những tác dụng nội tiết rất quen thuộc trên màng trong tử cung và ở

vú. Trái lại, genistein, daidzein và các chất chuyển hoá của chúng kích thích

chủ yếu vào ß ER, vì vậy rất khó có tác dụng trên màng trong tử cung và vú,

trong khi đó lại có nhiều tác dụng thuận lợi khác nhau trên các triệu chứng

của mãn kinh.

Ái lực của isoflavone trong đậu tương tới ER thấp hơn ái lực của hormon

estrogen hàng 500 - 10000 lần. Vì vậy những tác dụng của isoflavone trong

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đậu tương luôn luôn yếu hơn rất nhiều so với tác dụng của hormon estrogen

thực thụ, nên thoả mãn được sự cân bằng tinh tế về hormon cần xác định sau

khi mãn kinh [35].

1.2.4. Tác dụng của isoflavone

1.2.4.1. Ngăn ngừa ung thư

Thông qua kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy isoflavones

và các hóa thảo khác trong đậu tương có khả năng chống lại sự phát triển các

mầm ung thư trong cơ thể. Trong vòng hơn hai mươi năm qua, hơn ba mươi

cuộc nghiên cứu đã được thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới và cung cấp

những dữ liệu quan trọng về sự liên hệ giữa việc tiêu thụ thực phẩm đậu

tương và bệnh ung thư. Hầu hết kết quả cho thấy rằng những người ăn thực

phẩm đậu tương thường xuyên có tỷ suất về bệnh ung thư thấp hơn những

người không ăn hay ăn ít và không ăn thường xuyên thực phẩm đậu tương.

Trong nhiều nghiên cứu cho thấy rằng những người ăn thực phẩm đậu

tương hằng ngày giảm thiểu nguy cơ bị bệnh ung thư tới 50 phần trăm so với

những người không ăn hay chỉ ăn một hay hai lần trong một tuần lễ. Nói một

cách khác nếu bạn ăn thực phẩm đậu tương một hay hai lần mỗi tuần, cơ hội

bạn bị bệnh ung thư nhiều gấp hai lần những người ăn thực phẩm đậu tương

hằng ngày [43].

Ảnh hưởng việc tiêu thụ thực phẩm đậu tương không chỉ giới hạn một

hay hai loại ung thư mà còn có tác dụng trên nhiều thứ bệnh ung thư, bao gồm

các bệnh ung thư vú, kết tràng (colon), rectum, phổi, và ung thư dạ dày

(stomach cancer). Được biết là hầu hết các cuộc nghiên cứu đều để ý đến sự

tiêu thụ các thực phẩm đậu tương dạng không lên men (nonfermented

soyfoods) như đậu hũ, protein đậu tương và sữa đâu nành. Tuy nhiên, điều

quan trọng nhất là, không có một chứng cớ nào cho thấy tiêu thụ thực phẩm

đậu tương lại sinh ra bệnh hay gia tăng nguy cơ bị bệnh ung thư. Dưới đây là

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

một vài kết quả nghiên cứu:

Ung Thư Vú (breast cancer)

Một nghiên cứu ở Singapore so sánh 200 phụ nữ bị bệnh ung thư vú

với 420 phụ nữ không bị bệnh ung thu vú cho thấy rằng những người ăn nhiều

thực phẩm đậu tương, khoảng 55 grams mỗi ngày, ít bị nguy cơ lâm bệnh ung

thư tới 50 phần trăm so với những người không ăn hay ăn ít [5] [29].

Ung Thư Kết Tràng (Colon and Rectal Cancers)

Một nghiên cứu ở Nhật Bản cho thấy rằng những người ăn đậụ nành

hoặc đậu hũ đã giảm mức nguy cơ lâm bệnh rectal cancer hơn 80 phần trăm.

Đậu tương và đậu hũ làm giảm nguy cơ lâm bệnh ung thư kết tràng colon-

cancer đến 40 phần trăm. Trong nghiên cứu này, chỉ một hay hai serving đậu

hũ mỗi tuần được coi như là bảo vệ tốt. Trung Quốc, chủ thể nghiên cứu là

những người ít ăn thực phẩm đậu tương như đậu hũ, giá sống có độ nguy cơ

về bệnh ung thư rectal ba lần nhiều hơn những người ăn đậu hũ thường xuyên

[42]. Ở Hoa Kỳ, ăn đậu hũ giảm nguy cơ bị lâm bệnh ung thư kết tràng 50

phần trăm.

Ung Thư Dạ Dầy (Stomach Cancer)

Ở Trung Hoa, thường xuyên uống sữa đậu tương có độ giảm nguy cơ

bệnh ung thư dạ dày đến 50 phần trăm so với những người không uống.

Ngoài ra một nghiên cứu khác cũng cho thấy những người ăn đậu hũ và uống

sữa đậu tương thường xuyên ít bị ung thư dạ dày đến 40 phần trăm so với

những người không ăn hay ăn ít và không thường xuyên [42]. Những người

Hawaii gốc Nhật ăn đậu hũ có độ nguy cơ bệnh ung thư dạ dày thấp hơn một

phần ba những người không ăn đậu hũ.

Ung Thư Phổi (Lung Cancer)

Một nghiên cứu 1.500 người đàn ông ở tỉnh Vân Nam đã cho thấy rằng

những người thường xuyên ăn đậu hũ ít bị bệnh ung thư phổi đến 50 phần

trăm so với những người không ăn. Càng ăn nhiều đậu hũ, độ nguy cơ lâm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

bệnh ung thư phổi cảng giảm.

Ở Hồng Kông, một nghiên cứu hơn 200 phụ nữ đã tìm thấy rằng những

người ăn đậu hũ và các thực phẩm đậu tương khác hàng ngày đã giảm nguy

cơ lâm bệnh ung thư phổi đến 50 phần trăm so sánh với những người ăn 3 lần

một tháng [42].

Ung Thư Nhiếp Hộ Tuyến (Prostate Cancer)

Ở Hawaii, một nghiên cứu 8000 người Hoa Kỳ gốc Nhật kéo dài hai

mươi năm, đã cho thấy rằng những người gốc Nhật ăn đậu hũ một lần mỗi

tuần hay ít hơn có độ nguy cơ lâm bệnh ung thư nhiếp hộ tuyến nhiều hơn ba

lần những người ăn đậu hũ hàng ngày [36].

Thử Nghiệm Đậu tương Trong Phòng Thí Nghiệm

Năm 1989, Viện Đại học Alabama phổ biến một bản tin tức cho biết

kết quả cuộc thử nghiệm đậu tương và bệnh ung thư vú. Kết quả cho thấy

rằng nhóm chuột ăn đậu tương đã giảm 50 phần trăm ung thư vú so với nhóm

chuột không ăn. Kết quả này dẫn đến những cuộc thử nghiệm khác và cung

cấp dữ liệu căn bản chứng minh rằng đậu tương có tác dụng ngăn ngừa bệnh

ung thư.

Ngoài ra, các cuộc thí nghiệm súc vật khác trong phòng thí nghiệm cũng

cho thấy rằng đậu tương nguyên hay các sản phẩm đậu tương có tác dụng hữu

hiệu ngăn ngừa bệnh ung thư gan, thận, dạ dày, nhiếp hộ tuyến và vú.

Các khoa học gia từ lâu đã biết rằng khi thịt bò bằm (ground beef) được

chiên nóng ở nhiệt độ cao, sẽ trở thành "mutagenic", tức những chất có

khả năng biến đổi genetic và gây nên tế bào ung thư. Khi tiến sĩ Wang và

các nhà khoa học đồng nghiệp tiến hành thêm 10 phần trăm protein đậu

tương vào thịt bò bằm đã chiên, họ khám phá ra rằng protein đậu tương đã

ngăn chặn không cho tạo thành chất mutagenic. Vì thế để có sức khỏe tốt

hơn bạn nên ăn ít thịt bò hay tốt nhất là nên bỏ thịt bò và thay thế vào đó

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

là protein đậu tương [33] [47].

Một nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản cho biết rằng các sản

phẩm đậu tương bao gồm đậu hũ, sữa, miso (soy paste), tương và protein, đều

có tác dụng ngăn cản không cho lập thành hóa chất nitrits, tức chất hóa học có

thể kiến tạo hay kích thích mầm ung thư.

Một nghiên cứu khác của các nhà khoa học Nhật Bản cho biết miso,

một loại thức ăn phổ thông dưới dạng lên men của Nhật đã bảo vệ cơ thể khỏi

bị hư hoại của tia phóng xạ (radiation). Theo Dr. Shinichiro Akizuki thuộc

bệnh viện St. Francisco ở thành phố Nagasaki, cho hay những bác sĩ nạn nhân

của bom nguyên tử đã không bị những hư hoại gây ra bởi phóng xạ vì họ

uống loại soup miso. Các dữ liệu nghiên cứu khoa học nêu trên cho chúng ta

thấy rằng thực phẩm đậu tương che chở cho chúng ta chống lại các căn bệnh

ung thư [33] [47] [29].

1.2.4.2. Tiền mãn kinh ở phụ nữ

Mãn kinh là sự chấm dứt vĩnh viễn chu kỳ kinh nguyệt của phụ nữ.

Trước giai đoạn này người phụ nữ cảm thấy có những rối loạn từ thể chất đến

tâm thần qua các triệu chứng như khó ngủ, đổ mồ hôi, bốc hỏa, khô âm đạo.

Những triệu chứng này là do sự suy giảm hay ngừng sản xuất chất kích thích

tố nữ (female hormone estrogen) trong người khi buồng trứng không còn

mang noãn bào.

Phương pháp trị liệu thay thế chất kích thích tố nữ (hormone

replacement therapy) đã được áp dụng mà hai trong các thuốc đó là Premarin,

Fosamax (Alendronate). Tuy nhiên, phương pháp trị liệu này có những phản

ứng phụ không tốt như giảm lượng bạch huyết cầu, lên cân, nhức xương,

nhức đầu và gia tăng nguy cơ bị bệnh ung thư uterine. The North American

Menopause Society ước lượng rằng chỉ có từ 16 đến 20 phần trăm phụ nữ

Hoa Kỳ dùng hormones. Đa phần còn lại chỉ lấy thuốc rồi để trong tủ thuốc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

[5] [29].

Theo các nhà nghiên cứu y học, bẩy mươi lăm phần trăm phụ nữ Hoa Kỳ

và Âu Châu cho biết là bị các triệu chứng rối loạn như nói ở trên, nhưng chỉ

có khoảng hai mươi phần trăm phụ nữ Trung Hoa bị. Tỷ xuất bị bệnh ung thư

vú cũng rất thấp ở những phụ nữ Á Châu này. Những nghiên cứu đã chỉ ra,

thực phẩm đậu tương là thức ăn nồng cốt cho chế độ dinh dưỡng của họ.

Trong những hoạt chất thảo mộc được tìm thấy ở đậu tương và một vài thứ

hạt đậu khác thuộc loại phytoestrogen tức là một thứ kích thích tố thảo mộc

(plant estrogens).

Trong hạt đậu tương có chất phytoestrogen tên gọi là isoflavones. Các

nhà khoa học giải thích rằng phytoestrogen thay thế chất estrogen trong cơ thể

phụ nữ khi estrogen này bị suy giảm và ngăn chận không cho các triệu chứng

rối loạn như đã nói ở trên cũng như làm giảm mức độ nguy hiểm về bệnh tim

mạch và bệnh xốp xương, mà không có khuyến khích sinh bệnh ung thư vú.

Họ cũng giải thích thêm là hai hoạt chất trong isoflavones đậu tương là

genistein và daidzein vận hành giống như double agents: khi lượng estrogen

trong người phụ nữ lên cao, chúng vận hành như là kẻ chống đỡ, ngăn chận

một vài tác dụng của estrogen. Khi lượng estrogen xuống thấp, chúng thay thế

và vận hành như estrogen. Vì thế, trong tiền mãn kinh (premenopausal),

người phụ nữ có lượng cao hormone, phytoestrogen hành xử chống lại những

mấm mồng ung thư vú. Vào sau thời kỳ mãn kinh, phytoestrogens hành xử

như là estrogens, làm giảm thiểu những triệu chứng bốc hỏa và những triệu

chứng rối loạn khác, cùng là giảm tiến trình mất xương [26].

1.2.4.3. Tác dụng của isoflavone trên các bệnh tật khác

Tác dụng trên chuyển hoá của xương

Nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ gãy xương do loãng xương ở phụ nữ

châu Á thấp hơn hẳn so với ở các nước phương Tây. Sự khác biệt này có liên

quan tới sử dụng nhiều thức ăn chế từ Đậu tương. Hiệu lực của isoflavon Đậu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tương trên quá trình dinh dưỡng của xương ở phụ nữ sau mãn kinh đã cho

thấy tăng có ý nghĩa về mật độ khoáng ở xương (BMD) tại các đốt sống L2 -

L4 khi so sánh với phụ nữ theo chế độ ăn nghèo Đậu tương.

Hiệu lực của isoflavon Đậu tương trên chuyển hoá của xương cũng được

khẳng định trong các nghiên cứu lâm sàng khác và còn được xác minh qua

các nghiên cứu trên chuột cống cắt bỏ buồng trứng [52].

Isoflavon còn làm giảm nguy cơ loãng xương nhờ ức chế được hoạt tính

của huỷ cốt bào, nên có tác dụng hiệp đồng chống tiêu xương nhờ hoạt tính

estrogen của thuốc này.

Tác dụng trên tim mạch

Chế độ dinh dưỡng giàu Đậu tương sẽ làm giảm nguy cơ bệnh động

mạch vành (CHD). Isoflavon Đậu tương có những tác dụng khác nhau chống

rối loạn lipit - máu ở người mãn kinh, có thể cắt nghĩa được sự giảm các nguy

cơ tim mạch. Đậu tương và chiết xuất của Đậu tương cũng có những tác dụng

khác có lợi cho tim mạch, đã được sơ kết bởi nhóm các chuyên gia Hội Mãn

kinh Bắc Mỹ [12] [43].

Tác dụng trên các chức năng nhận thức

Nhiều nghiên cứu khoa học về tác dụng của isoflavone đậu tương đối với

điều trị suy giảm nhận thức và sa sút trí tuệ đã được tiến hành. Một nghiên

cứu quan sát thấy rằng những người đàn ông Hawaii đã tiêu thụ đậu phụ ít

nhất hai lần một tuần trong độ tuổi trung niên có nhiều khả năng duy trì trí

nhớ sau 20-25 năm sau đó hơn so với những người báo cáo tiêu thụ đậu phụ ít

hơn hai lần một tuần [44]. Trong một nghiên cứu ở Indonesia với những

người đàn ông lớn tuổi và phụ nữ, tiêu thụ bánh đậu tương lên men thể hiện

khả năng cải tiến bộ nhớ. Kết quả của những thử nghiệm lâm sàng ở phụ nữ

sau mãn kinh cho thấy tăng lượng isoflavone đậu tương sau 6 tháng có thể

dẫn đến những cải thiện trên một số bài kiểm tra nhận thức. Phụ nữ sau mãn

kinh được cung cấp isoflavone 60mg/ngày trong từ 6-12 tuần, thực hiện tốt

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

các bài kiểm tra trí nhớ ngắn hạn, linh hoạt về tinh thần, so với phụ nữ không

áp dụng đậu tương. Trong một thử nghiệm so sánh với giả dược, phụ nữ sau

mãn kinh được bổ sung 10 mg/ngày isoflavone đậu tương trong sáu tháng khả

năng ngôn ngữ lưu loát hơn phụ nữ dùng giả dược [20], [46].

1.3. Sinh tổng hợp isoflavone

1.3.1. Con đường sinh tổng hợp isoflavone

Isoflavonoid được hình thành bằng con đường tổng hợp sinh học cùng

với flavonoids. Đầu tiên, phenylalanine phản ứng với malonyl CoA tạo thành

4 hydroxycinnamoyl CoA. Dưới sự kiểm soát xúc tác của chalcone synthase,

4-CoA hydroxycinnamoyl ngưng tụ với ba phân tử malonyl CoA tạo thành

một chalcone. Isomerase chalcone xúc tác đóng vòng của vòng dị vòng.

Isoflavone synthase gắn một nhóm 2-hydroxyl, sau đó được gỡ bỏ bởi một

dehydratase isoflavone để tạo thành daidzein (7,4'-dihydroxyisoflavone) và

genistein (5,7,4'-trihydroxyisoflavone). Sinh tổng hợp các glycitein (7,4'-

dihydroxy-6-methoxyisoflavone), một isoflavone chính trong mầm đậu tương

không được hiểu rõ.

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp isoflavone [39]

Các isoflavone trong đậu tương sẽ được chuyển đổi thành 7- O -β-

glucoside bởi enzyme glucosyltransferase và sau đó đến 6 "-O-malonates bởi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

một enzyme khác là transferase malonyl [39].

1.3.2. Các enzyme tổng hợp isoflavone

Hai enzyme chìa khóa qua trọng trong con đường sinh tổng hợp

isoflavone ở cây đậu tương là chalcone isomerase (CHI) và isoflavone

synthase (IFS) [23]. Năm 1994, Heather I. Mckhann và Ann M. Hirsch đã

phân lập được 2 gen CHI ký hiệu là CHI1, CHI2 với kích thước lần lượt là

666 bp và 845 bp từ cDNA của cỏ linh lăng (Medicago sativa L.) [21].

Grotewold E. và Peterson T. đã phân lập được 1 gen CHI từ cây ngô và thấy

rằng các gen mã hóa một sản phẩm ZmCHI1 24,3 kDa tương ứng. Gen CHI1

ngô này có cấu trúc intron-exon và có bốn exon [19]. Đến năm 2010,

Soderlund C, cũng đã phân lập được 1 gen CHI1 từ mRNA của cây ngô với

chiều dài 1080 bp [38]. Terai Y. và cộng sự đã nghiên cứu phân lập được gen

CHI từ cDNA của cây sắn dây Pueraria lobata với kích thước gen là 675 bp

mã hóa một polypeptide 225 amino acid với trọng lượng phân tử 23,8kD. Các

CHI cDNA mã hóa đã được nhân bản gắn vào vector biểu hiện pET-3d và

biểu thành công trong Escherichia coli enzyme CHI có hoạt tính [41].

Năm 2003, Norimoto Shimada và cộng sự đã phân lập được 3 gen:

CHI1, CHI2 và CHI3 từ cDNA của cây Lotus japonicus và công bố trên ngân

hàng GenBank; CHI 1 với mã số AB054801, chiều dài 681 bp, mã hóa cho

chuỗi polypeptide 226 amino acid (24,4 kD); CHI2 mã số AB054802, chiều

dài 666 bp, mã hóa cho chuỗi polypeptide 221 amino acid (23,9 kD) và CHI3

với mã số AB073787, chiều dài 678 bp, mã hóa cho 225 amino acid (24,2 kD)

[32]. Gen CHI cũng được phân lập từ mRNA lá cây nho (Vitis vinifera L.) bởi

tác giả Gutha L. R. và đồng sự. Kết quả nghiên cứu phân lập được gen CHI có

chiều dài 979 bp, mã hóa cho 234 amino acid [20]. Gen CHI ở cây đậu tương

đã được các nhà khoa học quan tâm. Năm 2005, Ralston L. đã phân lập gen

CHI 1A từ mRNA cây đậu tương và thấy gen có chiều dài 1157 bp, mã hóa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

cho 128 amino acid [32].

Trong nghiên cứu phân lập gen IFS1 từ cỏ ba lá (Trifolium pratense) của

Bong Gyu Kim và cộng sự đã cho thấy gen IFS1 của cỏ ba lá có chiều dài

1575 bp, mã hóa cho 525 amino acid [14]. Gen IFS1 cũng đã được Misra P.

và cộng sự phân lập từ cDNA của cây Psoralea corylifolia, một cây dược liệu

quý của Ấn Độ. Gen có chiều dài 1563 bp và mã hóa cho 520 amino acid

[30]. Ở cây đậu tương, gen IFS1 đã được phân lập 2 gen đồng phân gồm IFS1

có chiều dài 1625 bp và IFS2 có chiều dài 1824 bp cùng mã hóa cho một sản

phẩm có 521 amino acid [17].

1.3.3. Gen tổng hợp isoflavone IFS2 ở cây đậu tương

Trong ngân hàng gen quốc tế (GenBank), gen IFS2 đã đượ Jung W. và

cộng sự công bố năm 2000 với mã số trên trang NCBI là NM_001251586.

Năm 2013 nhóm tác giả Artigot,M.-P., Dayde,J. and Berger,M. người Pháp

đã công bố trình tự gen IFS2 tổng hợp isoflavone ở đậu tương với mã số trên

Genbank JQ934960.

Thông tin về gen IFS2 của đậu tương trên NCBI cho thấy gen nằm trên

NST số 13. Số lượng nucleotide của gen là 1824 bp, từ vị trí số 1 đến vị trí

1824, mã hóa cho 521 amino acid, từ vị trí số 1 đến vị trí 521.

Hình 1.4. Sơ đồ mô tả gen IFS2 ở cây đậu tương [50]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu là 3 giống đậu tương DT22, DT26 và DT84 do Viện

Di truyền Nông nghiệp, trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ cung cấp.

Bảng 2.1. Đặc điểm các giống đậu tương nghiên cứu

Stt Đặc điểm Tên giống

Nguồn gốc và phương pháp Trung tâm Nghiên cứu Hoa trắng. Quả chín có màu nâu. Hạt

và Phát triển Đậu đỗ màu vàng sáng, rốn hạt màu nâu đen.

chọn tạo từ dòng đột Khối lượng 1000 hạt từ 140 - 150

biến của hạt lai (DT95 x gam. Thời gian sinh trưởng trung

ĐT12) và được Hội bình 85 - 90 ngày.. Giống ĐT22

đồng Khoa học Công kháng bệnh phấn trắng. 1 DT22

nghệ (Bộ NN&PTNT)

công nhận là giống mới

Quyết định số 219

QĐ/BNN-KHCN ngày

19/01/2006.

Viện di truyền nông Hoa tím. Quả khi chín màu vàng. Hạt

nghiệp tạo ra từ tổ hợp màu vàng tươi, rốn hạt màu nâu nhạt,

lai ĐT-80/ĐH4 Khối lượng 1000 hạt 160-180 gam.

(DDT96) bằng phương

pháp lai hữu tính kết 2 DT84

hợp gây đột biến thực

nghiệm bằng tác nhân

gamma Co60kral trên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

dòng lai F3-D333

Stt Đặc điểm Tên giống

Nguồn gốc và phương pháp Giống đậu tương ĐT26 Hoa màu trắng, quả chín có màu nâu,

do Trung tâm Nghiên có 30-55 quả chắc/cây, hạt vàng, rốn

cứu và Phát triển Đậu nâu đậm, Khối lượng 100 hạt (18-19

đỗ- Viện Cây lương thực g). Giống ĐT26 nhiễm nhẹ bệnh gỉ

và Cây thực phẩm chọn sắt, chịu giũi đục thân, chống đổ.

lọc từ tổ hợp lai giữa 3 DT26 ĐT2000 x ĐT12. Được

công nhận giống cho sản

xuất thử năm 2008 theo

Quyết định số 111/QĐ-

TT-CCN ngày 03 tháng

06 năm 2008.

2.2. Hóa chất thiết bị và địa điểm nghiên cứu

2.2.1. Hóa chất

Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ Anh,

Đức, Mỹ, Thụy Điển, Trung Quốc:

- Hóa chất tách DNA tổng số: gồm có đệm tách (Tris HCl 1M,

PH=8,NACl 5M, EDTA 0,5M, CTAB 4% H2O), đệm rửa (Tris HCl 1M ,

EDTA 0,5M, PH=8, Sobitol 2M, NaH2PO4 0,4%, H2O), dung dịch

chloroform/isoamyl ancolhol 24:1, dung dịch Isopropanol,...

- Hóa chất điện di: Đệm TAE 50X: 57,1 ml CH3COOH, 100ml

0,5M EDTA, 242g TRIS- BASE, đệm TAE 1X, agarose, loading dye,

ethidium bromide.

- Các hóa chất phục vụ nhân gen: Taq polymerase do hãng Fermentas

cung cấp. Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự gen IFS2 đã được

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

công bố trên ngân hàng gen quốc tế với mã số NM001249093.

- Hóa chất dùng trong biến nạp: Vector tách dòng pBT của Viện Công

nghệ Sinh học, môi trường LB, xgal, IPTG.

- Các bộ kit dùng cho phản ứng PCR QIAquick Gel Extraction Kit, tinh

sạch sản phẩm PCR AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer),…và một số

hóa chất khác.

2.2.2. Thiết bị

Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị đã sử dụng

STT Thiết bị Nguồn gốc, xuất xứ

1 Máy PCR Applied Biosystem - Mỹ

2 Bộ điện di Pharmacia Biotech, Scie-plas Ltd. - Anh

3 Bể ổn nhiệt Memmert - Đức

4 Máy ly tâm Thermo Sci Legend Micro 21R - Mỹ

5 Máy chụp ảnh gel Gel Logic Kodak 1500 - Mỹ

6 Máy lắc Vortex IKA Minishaker MS1 - Đức

8 Cân điện tử Precisa XB1200C - Đức

10 Máy cất nước Cascada Bio-Water - Pall Life - Mỹ/Anh

11 Máy đo quang phổ định lượng NanoDrop Lite Spectrophotometer - Mỹ

13 Tủ lạnh -20oC Sanyo - Nhật Bản

16 Tủ lạnh -4oC Sanyo - Nhật Bản

17 Máy lắc ấm Hàn Quốc

18 Bể ổn nhiệt BW-05G Jeiotech - Hàn Quốc

Cùng với các dụng cụ vô khuẩn cần thiết cho thí nghiệm bao gồm: Đĩa

Petri, pipet, ống nghiệm, que cấy, que trang, bình tam giác, đèn cồn,…

2.2.3. Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Khoa Khoa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và Phòng Thí

nghiện trọng điểm Công nghệ gen, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện

Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam .

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp phân tích hàm lượng isoflavone trong các mẫu đậu

tương nghiên cứu

Hạt đậu tương được sử dụng làm nguyên liệu để xác định hàm lượng

isoflavone theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tại Viện

Kiểm nghiệm an toàn Vệ Sinh Thực Phẩm quốc gia bằng phương pháp

HPLC. Mẫu được để khô, làm lạnh, sau đó nghiền thành bột mịn. Trộn 2g bột

mẫu với 10ml axetonitric (ACN) và 2 ml HCl 0,1N. Hỗn hợp được để trong

2h ở nhiệt độ phòng trước khi đem lọc qua giấy lọc Whatman. Sau khi lọc

kiệt, dịch cô được để lạnh khô ở -400C rồi hòa tan lại trong 10ml metanol

80% và lọc qua tia lọc 0.45µm, phân tích trên HPLC.

Phương pháp phân tích định lượng isoflavone được thực hiện theo

phương pháp AOAC Official 2006.07 và theo Hao Chen và cs (2001). HPLC

là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất

lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tùy thuộc vào ái lực của chất

phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác

nhau, do đó thứ tự khác nhau. Thành phần pha động đưa chất phân tích ra

khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp lý [34].

2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Ngâm ủ hạt đậu tương cho nảy mầm rồi gieo trên cát sạch, khi cây

được 5 - 7 ngày tuổi sử dụng lá để tách DNA tổng số. Để có thể thực hiện

phản ứng PCR nhân đoạn gen cần nghiên cứu, trước hết cần có DNA của

hệ gen làm khuôn.

Phương pháp tách DNA tổng số theo theo Gawel và đtg năm 1991 có cải

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tiến như sau:

- Quy trình tách DNA tổng số: Lấy 200 mg lá non nghiền trong nitơ

lỏng thành bột mịn. Bổ sung 0,8 ml đệm rửa, ly tâm 12000 vòng/ phút trong

15 phút, loại bỏ dịch nổi. Bước này làm 2 lần. Thêm 700 µl đệm tách, trộn

nhẹ. Ủ ở 65o C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5

phút. Thêm 600 µl Chloroform : Isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút (dùng máy

trộn càng tốt). Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút. Hút 500 µl dịch trong

ở pha trên sang ống 1,5 µl bỏ tủa. Thêm 500 µl Isopropanol, trộn nhẹ, đặt lên đá

(để tủ lạnh qua đêm) chờ có tủa trắng. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ

dịch, úp xuống giấy cho khô. Bổ sung 300 µl cồn 70% búng nhẹ. Ly tâm

13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ cồn (làm 2 lần). Làm khô DNA bằng

cách để trong box bật quạt. Hòa tan DNA trong 50 µl nước khử ion.

2.3.3. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số

 Phương pháp quang phổ hấp thụ.

DNA được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 260 nm và 280 nm.

Nồng độ DNA được tính theo công thức:

Nồng độ DNA (ng/µl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng

Độ sạch DNA = A260/A280

Trong đó: A260 là chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm

A280 là chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm.

Nếu tỷ lệ A260/A280 = 1,8 - 2,0 thì DNA đó là tinh sạch.

Mẫu được điện di kiểm tra trên gel agarose. Dựa vào hình ảnh

điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm

đã tách chiết.

2.3.4. Kỹ thuật PCR

Sau khi tách chiết được DNA tổng số, thực hiện khuếch đại trình tự gen

IFS2 bằng phản ứng PCR với cặp mồi IFS2-F và IFS2-R được thiết kế dựa

trên trình tự gen IFS2 đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế với mã số

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

JQ934960 có trình tự như sau:

Bảng 2.3. Cặp mồi nhân gen IFS2

Nhiệt độ Mồi Trình tự mồi (5’-3’) gắn mồi

58oC IFS2-F cggatccttggttttggctctgtttctgcact

58oC IFS2-R cgagctcgcatctaaactcctttcttaa

Thành phần phản ứng PCR nhân gen IFS2 của cây đậu tương được trình

bày ở bảng sau:

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen IFS2

STT Thành phần Thể tích (μl)

1 PCR Master Mix 12,5 µl

2 DNA tổng số (50ng/µl) 1 µl

3 Mồi IFS2-F (10pM/µl) 1 µl

4 Mồi IFS2-R (10pM/µl) 1 µl

9,5 µl 5 H2O

25 µl Tổng

Thực hiện phản ứng PCR nhân gen IFS2 với chu trình nhiệt như sau:

Bảng 2.5. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen IFS2

Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ

Biến tính 94o 3 phút 1

Biến tính 90o 30 giây

Gắn mồi 58o 30 giây 30

Kéo dài chuỗi 72o 90 giây

Hoàn tất kéo dài 72o 10 phút 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Kết thúc phản ứng 4o ∞

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel

agarose 0,8% với sự có mặt của marker chuẩn, nhuộm bản gel trong ethidium

bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. 2.3.5. Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được tinh sạch theo bộ kit AccuPrep PCR Purification

Kit của hãng Fermentas:

Quy trình làm sạch sản phẩm PCR như sau: Điện di sản phẩm PCR trên

gel agarose 0,8%, nhuộm và soi. Cắt lấy băng quan tâm (chứa đoạn gel có

kích thước yêu cầu). Bổ sung đệm hòa tan (GB - Gel binding buffer) theo tỷ

lệ Vmẫu : VGB = 1 : 5 (quy ước 1μl tương đương 1mg mẫu). Ủ ở 60oC trong 10

phút, khoảng 2-3 phút lắc nhẹ một lần, sau khi gel tan hết thì ủ thêm 5 phút để

gel tan hoàn toàn. Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột tinh sạch, ly tâm 13000

vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500μl đệm GB

vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Sau đó đem ly tâm 13000

vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bước này nhằm loại bỏ

hoàn toàn những thành phần gel agarose còn sót lại. Rửa màng lọc chứa DNA

bằng cách thêm 500μl đệm rửa WB (Washing buffer) lên cột. Ly tâm 13000

vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm lần hai để đảm bảo

loại bỏ hết dịch WB.Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 30μl dung

lịch đệm EL (Elution buffer) lên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút,

sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột, thu dịch chứa

mẫu DNA đã tinh sạch chuyển sang ống mới. Bảo quản ở -20oC. Điện di kiểm

tra sản phẩm làm sạch gen IFS2. 2.3.6. Kĩ thuật tách dòng gen

- Nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng

Sản phẩm PCR thu nhận được sau khi tinh sạch được gắn trực tiếp vào

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

vector tách dòng pBT. Thành phần của phản ứng gắn gen vào vector như sau:

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối gen IFS2 vào vector pBT

STT Thành phần Thể tích (µl)

1 2 H2O

2 1 Buffer T4 ligase (10X)

Enzyme nối 3 1

Vector Pbt 4 1

Gen IFS2 5 5

Tổng 10

Hỗn hợp trên được ủ ở nhiệt độ 22oC trong 1,5 giờ và sau đó được biến

nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α.

Hình 2.1. Cấu trúc vector pBT

- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α

Tế bào khả biến được lấy từ -80oC, làm tan dần trong đá trong

khoảng 30 phút. Lấy 5µl sản phẩm của phản ứng ghép nối gen cho vào ống

tế bào khả biến (50µl), đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều trong dịch tế bào

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

khả biến. Sau đó để sản phẩm plasmid tái tổ hơ ̣p trong đá 10 phút. Sốc nhiệt

bằng cách chuyển mẫu vào bể ổn nhiệt với nhiệt độ là 42ºC và ủ trong 90

giây. Lấy mẫu ra rồi đặt ngay vào đá trong 10 phút. Bổ sung 300µl LB lỏng

để nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 37oC trong 1 giờ. Ly tâm 5000 vòng ở 25ºC

trong 5 phút, loại bỏ gần hết dịch nổi, chỉ để lại khoảng 100µl dịch, trộn đều

sinh khối lắng để thành dạng huyền phù tế bào. Hút 100µl dịch tế bào và cấy

trải trên đĩa môi trường LB đặc bổ sung ampicillin 50mg/l, X-gal, IPTG. Nuôi

qua đêm ở 37ºC.

- Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR

Sau khi nuôi đĩa khuẩn đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, thấy xuất

hiện khuẩn lạc trắng. Chọn ra một số khuẩn lạc trắng để chạy phản ứng

colony - PCR với cặp mồi M13 được thiết kế dựa trên vector pBT để xác định

khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen đã đưa vào. Thành phần và chu kỳ nhiệt

được thể hiện ở bảng 2.7 và 2.8. Mẫu DNA được thay bằng khuẩn lạc. Sản

phẩm PCR chọn dòng được điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X.

Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh đèn cực tím.

Bảng 2.7. Thành phần của phản ứng colony - PCR

STT Thành phần Nồng độ

1 Nước khử ion 12,5 µl

2 Đệm PCR 10X 2,5 µl

2,5 µl 3 MgCl2 (25mM)

4 dNTPs (25mM) 2,5 µl

5 Mồi xuôi (10pmol/µl) 1 µl

6 Mồi ngược (10pmol/µl) 1 µl

Taq DNA polymerase 7 1 µl

8 Khuẩn lạc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

9 Tổng thể tích 25 µl

Bảng 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng colony- PCR

Bước Phản ứng Thời gian Chu kì Nhiệt độ ( ºC)

1 30

1 2 3 4 5 6 Biến tính Biến tính Gắn mồi Kéo dài chuỗi Hoàn tất kéo dài Kết thúc phản ứng 94o 94o 52o 72o 72o 4o 4 phút 30 giây 30 giây 90 giây 10 phút ∞ 1

- Tách plasmid tái tổ hợp

Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn dòng, tiến hành tách chiết plasmid bằng

bộ kit Plassmid Miniprep Kit của hãng Qiagen .

Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 5 phút, 4oC. Sau đó loại bỏ

dịch nổi, thu cặn. Bổ sung 100μl dung dịch Sol I (lạnh), sau đó lắc nhẹ dịch.

Bổ sung 200μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút. Bổ sung

150μl dung dịch Sol III (lạnh), đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút. Sau đó bổ

sung 500μl dung dịch chlorofom:isoamyl (24:1), đảo nhẹ và ly tâm 12000

vòng/phút trong 15 phút. Thu dịch nổi và bổ sung thể tích tương đương isopropanol (1:1), để ở nhiệt độ -20oC trong 20 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút

trong 15 phút, loại dịch nổi. Rửa tủa 2 lần với ethanol 70% (thể tích mỗi lần là

500μl). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Bỏ dịch, thu cặn, làm khô. Cho 40μl H2O có bổ sung RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ. Điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm bản

gel trong ethidium bromide, chụp ảnh dưới ánh đèn cực tím.

2.3.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotide

Các mẫu plasmid mang gen quan tâm có kích thước phù hợp với lý

thuyết được sử dụng để giải trình tự bằng máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems - Mỹ).

2.3.8. Phương pháp phân tích trình tự gen

Sử dụng phần mềm BLAST và DNAstar để phân tích và so sánh các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trình tự gen.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Hàm lượng isoflavone của các giống đậu tương nghiên cứu

Để có cơ sở so sánh trình tự gen và xác định mối liên quan giữa kiểu

gen và kiểu hình, hàm lượng isoflavone trong hạt của 3 giống đậu tương

DT22, DT26, DT84 đã được xác định tại Viện Kiểm nghiệm an toàn Vệ Sinh

Thực Phẩm Quốc gia bằng phương pháp HPLC. Kết quả thu được thể hiện ở

bảng 3.1:

Bảng 3.1 . Hàm lượng Isoflavone ở các giống đậu tương

Hàm lượng isoflavone Phương Chỉ tiêu Đơn vị pháp thử DT22 DT26 DT84

Isoflavone HPLC mg/100g 19,7 40,1 57,7

Kết quả bảng 3.1 cho thấy hàm lượng isoflavone trong hạt đậu tương là

khác nhau giữa các giống dao động từ 19,7mg/100g đến 57,7mg/100g . Trong

đó giống ĐT84 có hàm lượng cao nhất là 57,7mg/100g sau đó đến giống

ĐT26 có hàm lượng có hàm lượng 40,1mg/100g và thấp nhất là DT22 có hàm

lượng 19,7mg/100g. Giống DT84 và DT22 là giống chọn lọc từ tổ hợp lai

giữa các dòng đột biến, giống DT26 được chọn lọc bằng con đường lai hữu

tính (Bảng 2.1). Như vậy, sự khác nhau giữa các giống rất có thể liên quan

đến quá trình đột biến trong kiểu gen, các gen liên quan đến con đường tổng

hợp isoflavone có thể đã bị đột biến. Điều này chứng tỏ hàm lượng isoflavone

phụ thuộc vào bản chất di truyền của từng giống.

Từ kết quả phân tích hàm lượng isoflavone ở một số giống đậu tương

trên chúng tôi đã lựa chọn 2 giống DT84 (hàm lượng isoflavone cao) và DT22

(hàm lượng isoflavone thấp) để phân lập gen IFS2 nhằm so sánh trình tự gen

IFS2 của giống đậu tương có hàm lượng isoflavone cao và giống đậu tương

có hàm lượng isoflavone thấp nhằm xác định có sự liên quan giữa biến đổi vật

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

chất di truyền đến sự khác nhau của hàm lượng isoflavone hay không.

3.2. Kết quả nhân dòng và xác định trình tự gen IFS2

3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở mức phân tử.

Chất lượng của DNA tổng số có vai trò quan trọng quyết định sự thành công

của các thí nghiệm phân tích sinh học phân tử. Do đó, chúng tôi tiến hành

tách chiết DNA của 2 giống đậu tương nghiên cứu ở giai đoạn lá non 7 ngày

tuổi theo phương pháp của Gawel và Jarret (1991). Sản phẩm DNA tổng số

tách chiết được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó nhuộm

ethidium bromide và hiện băng bằng tia cực tím. Kết quả thể hiện trong hình 3.1.

Trong đó M: thang DNA 1kb; giếng 1: ĐT84; giếng 2: ĐT 22

Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose

Kết quả hình 3.1 cho thấy mẫu DNA thu được có băng sáng rõ, gọn và

ít bị đứt gãy. Độ tinh sạch và hàm lượng của DNA tổng số tách chiết từ 2

giống đậu tương được xác định bằng phương pháp đo trên máy quang phổ.

Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.2.

Bảng 3.2. Giá trị mật độ quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm và 280nm

của hai giống đậu tương DT84 và DT22

Tỷ số Hàm lượng DNA Tên giống A260 (nm) A280 (nm) A260/A280 (ng/µl)

DT84 0,225 0,121 1,86 2250

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DT22 0,282 0,148 1,90 2820

Qua bảng 3.2 cho thấy tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,8 -

2,0 chứng tỏ rằng các mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch cao, ít bị lẫn

protein có thể sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Hàm lượng DNA

từ 2250 đến 2820 ng/l. Như vậy, sản phẩm tách chiết DNA tổng số đảm bảo

độ sạch, chất lượng và hàm lượng cho các thí nghiệm về nhân dòng gen xác

định trình tự.

3.2.2. Kết quả nhân gen IFS2 ở cây đậu tương

Sử dụng DNA tổng số làm khuôn để khuếch đại trình tự gen IFS2 bằng

phản ứng PCR với cặp mồi IFS2-F và IFS2-R được thiết kế dựa trên trình tự

gen IFS2 đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế với mã số JQ934960.

Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện khác nhau và nhận thấy

rằng phản ứng PCR nhân gen xảy ra tối ưu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là

58oC. Sau 30 chu kỳ phản ứng, kết quả nhân gen được điện di kiểm tra trên

~1600bp

1500bp

gel agarose 0,8% cùng với DNA Marker 1kb( Hình 3.2).

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen IFS2

Trong đó M: thang DNA 1kb; giếng 1: ĐT84; giếng 2: ĐT 22

của 2 mẫu đậu tương DT84 và DT22

Hình 3.2 cho thấy băng DNA khuếch đại sáng rõ, gọn, không bị đứt gãy,

có kích thước khoảng 1600 bp phù hợp với tính toán lý thuyết khi thiết kế

mồi. Kết quả này chứng tỏ phản ứng PCR thành công, có thể đã nhân được

gen IFS2. Ðể có thể khẳng định đoạn DNA nhân bản được chính là gen IFS2

đậu tương, sản phẩm PCR tiếp tục tiến hành tinh sạch, tách dòng và xác định

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trình tự gen.

3.2.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR

Thông thường sau khi chạy PCR, ngoài đoạn gen quan tâm còn có các

sản phẩm phụ không mong muốn, các nucleotide dư thừa sau phản ứng, mồi,

enzyme... Những chất lẫn tạp này có thể ảnh hưởng đến các kết quả của quá

trình tách dòng. Vì vậy, để quá trình biến nạp đạt hiệu quả cao nhất, chúng tôi

tiến hành tinh sạch sản phẩm theo quy trình và hóa chất bằng bộ kít PCR

AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer).

Các đoạn gen sau khi tinh sạch xong sẽ được kiểm tra bằng điện di trên

gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR

1500bp

1600bp

được thể hiện ở hình 3.3.

Trong đó M: thang DNA 1kb; giếng 1: ĐT84; giếng 2: ĐT 22

Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR tinh sạch

Hình ảnh điện di sản phẩm làm sạch gen cho ta thấy một băng DNA duy

nhất với kích thước khoảng 1600bp, chứng tỏ đã thu nhận được đoạn gen

mong muốn. Các băng vạch rõ nét chứng tỏ các DNA không bị đứt gãy trong

quá trình tinh sạch, có thể tiến hành tiếp phản ứng ghép nối sản phẩm PCR

vào vector tách dòng pBT.

3.2.4. Kết quả tách dòng gen

Sản phẩm PCR nhân gen IFS2 sau khi tinh sạch được được gắn vào

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

vector pBT để tạo vector tái tổ hợp bằng enzyme nối T4 ligase. Vector tái tổ

hợp được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli DH5α bằng phương pháp sốc

nhiệt. Sau đó, cấy trải vi khuẩn E. coli DH5α đã biến nạp trên môi trường LB

đặc có bổ sung kháng sinh ampicillin, cơ chất X-gal, chất cảm ứng IPTG ở

37oC trong 16 giờ.

Sau thời gian nuôi, lấy ngẫu nhiên các khuẩn lạc màu trắng để kiểm tra

bằng phản ứng colony PCR với cặp mồi M13-F/M13-R nằm trên vector. Sản

phẩm colony- PCR bằng điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% trong dung

dịch TAE 1X, kết quả được thể hiện trên hình 3.4.

Trong đó M: thang DNA 1kb; giếng 1,2: ĐT84; giếng 3,4,5: ĐT 22

Hình 3.4. Hình ảnh sản phẩm colony-PCR

Kết quả hình 3.4 cho thấy, sản phẩm colony-PCR đều xuất hiện một

băng DNA đặc hiệu có kích thước khoảng hơn 1600 bp. Kích thước này phù

hợp với tính toán lý thuyết của gen IFS2 đã gắn vào vector pBT khi nhân

bằng cặp mồi M13. Điều này chứng tỏ, gen IFS2 đã gắn vào vector tách dòng

và các dòng khuẩn lạc trắng lựa chọn đều có mang gen IFS2. Các dòng vi

khuẩn E. coli có mang tái tổ hợp pBT-IFS2 của giống đậu tương DT22 và

DT84 đã được nhân nuôi và tách chiết tinh sạch plasmid. Sản phẩm tách

plasmid tái tổ hợp mang gen IFS2 đạt kết quả tốt, đảm bảo chất lượng và số

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

lượng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen IFS2 (hình 3.5).

Hình 3.5. Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp BT-IFS2

Trong đó M: thang DNA 1kb; X: đối chứng ; giếng 1: DT22; giếng 2: DT84

của giống đậu tương DT22 và DT84

3.2.5. Kết quả giải trình tự gen

Trình tự nucleotide của gen IFS2 đã tách dòng được đọc trên thiết bị giải

trình tự tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied

Biosystems) tại viện Công nghệ Sinh học.

So sánh trình tự thu được với cơ sở dữ liệu trình tự gen trong GenBank

nhận thấy hai trình tự thu được có độ tương đồng cao với các trình tự gen

IFS2 của cây đậu tương đã công bố. Như vậy, chúng tôi đã khuếch đại, tách

dòng và giải trình tự nucleotide thành công gen IFS2 của 2 giống đậu tương

DT84 và DT22.

Sử dụng phần mềm DNAstar và Blast phân tích, kết quả cho thấy gen

IFS2 của giống đậu tương DT22 có kích thước 1669bp DT84 có kích thước

1675bp với tỷ lệ các nucleotide thể hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Số lượng và tỷ lệ các nucleotide trong gen IFS2

của giống đậu tương DT84 và DT22

Nucleotide A T G C

Giống SL % SL % SL % SL %

DT22 447 26,8 406 24,34 408 24,46 407 24,4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DT84 446 26,64 408 24,37 412 24,61 408 24,37

Hình 3.6. Trình tự gen IFS2 của giống đậu tương DT22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(Vùng màu đen là trình tự intron)

Hình 3.7. Trình tự gen IFS2 của giống đậu tương DT84

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(Vùng màu đen là trình tự intron)

3.3. So sánh trình tự nucelotide của gen IFS2

Khi so sánh trình tự nucleotide gen IFS2 của giống đậu tương DT22

và DT84 với cơ sở dữ liệu gen IFS2 đã công bố trên GenBank chúng tôi nhận

thấy, có 01 đoạn intron có 136 nucleotide với trình tự (gtg agtttcctgc ttcattcatt

gatcgaaata tgcagtattt tgttaacaag agatcgagaa ttgacattta tatattcatg tggtggcaat

taattaacgg tacgcattct taatcgatat tgtgtatgtg cag) từ vị trí 865 đến 1000 của gen

IFS2 giống đậu tương DT22 và vị trí 871 đến 1006 của gen IFS2 giống đậu

tương DT84. Như vậy, trình tự mã hóa của gen IFS2 của giống đậu tương

DT22 gồm 1533 nucleotide và giống đậu tương DT84 gồm 1539 nucleotide.

Để so sánh trình tự nucleotide của gen IFS2 phân lập từ 2 giống đậu

tương nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các trình tự nucleotide mã hóa của

gen IFS2 đã công bố trên GenBank mang các mã số như sau:

Bảng 3.4. Các trình tự đoạn mã hoá của gen IFS2 mang mã số trên Ngân hàng

gen quốc tế NCBI được sử dụng để phân tích [50].

Mã số trên Năm công TT Quốc gia Tác giả NCBI bố

1 AY552613 Hàn Quốc 2005 Sohn, S.-I., et al.

Cheng,H., Yu,O. and EU391524 Trung Quốc 2008 2 Yu,D.

3 EU391523 Trung Quốc 2008 Cheng,H., et al.

4 JN133901 Pháp 2011 Artigot,M.-P., et al.

5 JQ934960 Pháp 2013 Artigot,M.-P., et al.

Sử dụng phần mềm DNAstar phân tích cho thấy, trình tự mã hóa của gen

IFS2 giống đậu tương DT22 tương đồng từ 99,8 đến 100% so với trình tự

IFS2 của đậu tương đã công bố (hình 3.8). Trong đó tương đồng cao nhất

(100%) với trình tự IFS2 có mã số JQ934960 (trình tự dùng để thiết kế mồi).

Trình tự mã hóa của gen IFS2 giống đậu tương DT84 tương đồng từ 99,6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

đến 99,8% so với trình tự IFS2 của đậu tương đã công bố (hình 3.8). Trong đó

tương đồng cao nhất (99,8%) với trình tự IFS2 có mã số JQ934960 (trình tự

dùng để thiết kế mồi) và trình tự IFS2 có mã số JN133901. Khi so sánh với

trình tự IFS2 của giống đậu tương DT22 cho thấy trình tự IFS2 của giống

DT84 tương đồng 99,8%. Sự sai khác nucleotide trong gen IFS2 của giống

DT84 so với giống DT22 và trình tự gen có mã số JQ934960 xảy ra ở các vị

trí vị trí 1188 (A → G), vị trí 1192 (T → C) và vị trí 1389 (G → T) (Hình

3.9). Sự sai khác này đã dẫn đến sự thay đổi bộ ba mã hóa tương ứng 396

(AAA→AAG), 398 (TGG→CGG) và 463 (TTG→TTT).

Hình 3.8. Hệ số tương đồng dựa vào trình tự mã hóa (CDS)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

của DT 84, DT22 và các trình tự tương đồng trên NCBI

Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide gen IFS2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

của giống DT84 và DT2 và trình tự tương đồng trên GenBank

Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide gen IFS2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

của giống DT84 và DT2 và trình tự tương đồng trên GenBank

Hình 3.10 So sánh trình tự nucleotide gen IFS2

của giống DT84 và DT2 và trình tự tương đồng trên GenBank

Hình 3.9c. So sánh trình tự nucleotide gen IFS2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

của giống DT84 và DT2 và trình tự tương đồng trên GenBank

Phân tích bằng phần mềm DNAstar cho thấy, trình tự protein suy

diễn IFS2 của giống đậu tương DT22 có 510 amino acid, trong đó có 71

amino acid có tính ba zơ mạnh (K, R), 61 amino acid có tính acid mạnh

(D, E), 194 amino acid có tính kỵ nước (A, I, L, F, W, V), 97 amino acid

có tính phân cực (N, C, Q, S, T, Y), còn lại là amino acid không phân cực.

Theo tính toán lý thuyết, protein IFS2 của giống đậu tương DT22 có khối

lượng 57,7 kDa, điểm đẳng điện Pi = 9,1. Mức độ tương đồng giữa trình

tự amino acid suy diễn của protein IFS2 của giống đậu tương DT22 với

trình tự amino acid suy diễn từ các trình tự gen IFS2 trên GenBank từ

98,1-100%. Trong đó tương đồng cao nhất (100%) với trình tự amino acid

có mã số AFJ80654 suy diễn từ trình tự nucleotide có mã số JQ934960

(trình tự dùng để thiết kế mồi).

Trình tự protein suy diễn IFS2 của giống đậu tương DT22 có 512

amino acid, trong đó có 72 amino acid có tính ba zơ mạnh (K, R), 61

amino acid có tính acid mạnh (D, E), 195 amino acid có tính kỵ nước (A,

I, L, F, W, V), 97 amino acid có tính phân cực (N, C, Q, S, T, Y), còn lại

là amino acid không phân cực. Theo tính toán lý thuyết, protein IFS2 của

giống đậu tương DT22 có khối lượng 57,9 kDa, điểm đẳng điện Pi = 9,2.

Mức độ tương đồng giữa trình tự amino acid suy diễn của protein IFS2

của giống đậu tương DT22 với trình tự amino acid suy diễn từ các trình tự

gen IFS2 trên GenBank từ 97,7-99,6%. Trong đó tương đồng cao nhất

(99,6%) với trình tự amino acid IFS2 của giống DT22 và trình tự amino

acid có mã số AFJ80654 suy diễn từ trình tự nucleotide có mã số

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

JQ934960 (trình tự dùng để thiết kế mồi) (hình 3.12).

Hình 3.10. Hệ số tương đồng trình tự amino acid suy diễn của giống đậu

tương DT22 và DT84 với các trình tự tương đồng trên GenBank

So sánh trình tự amino acid protein suy diễn IFS2 của giống đậu tương

DT22 với giống DT84 và trình tự AFJ80654 nhận thấy: sự sai khác nucleotide

gen IFS2 của giống DT84 dẫn đến sự thay đổi bộ ba mã hóa tương ứng 396

(AAA→AAG), 398 (TGG→CGG) và 463 (TTG→TTT). Tuy nhiên bộ ba mã

hóa 396 không làm thay đổi amino acid (đây là một đột biến vô nghĩa), bộ ba

mã hóa 398 làm thay đổi amino acid Tryptophan (W) thành Arginine (R), bộ

ba mã hóa 463 làm thay đổi amino acid Leucine (L) thành Phenylalanine (F)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

(hình 3.13).

Hình 3.11. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein IFS2 giống đậu tương

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DT22, DT84 và trình tự tương đồng trên NCBI

Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen IFS2 của

giống đậu tương DT84 có sự sai khác so với giống DT22. Sự sai khác này có

thể do trong quá trình tạo giống sử dụng phương pháp đột biến đã làm thay

đổi trình tự nucleotide dẫn đến sự thay đổi amino acid. Giống DT84 có hàm

lượng isoflavone cao hơn so với giống DT22 (bảng 3.1). Như vậy, rất có thể

sự thay đổi amino acid trong phân tử protein đã dẫn đến sự thay đổi hoạt tính

của enzyme isoflavone synthase 2 trong giống đậu tương DT84 làm tăng

cường khả năng tổng hợp isoflavone. Protein IFS2 của giống DT84 có thể là

một protein mới. Lần đầu tiên hai gen mã hóa protein IFS2 của hai giống đậu

tương DT84 và DT22 được nhân dòng ở Việt Nam bằng phương pháp PCR

với cặp mồi thiết kế đặc hiệu dựa vào trình tự nucleotide của gen mã hóa IFS2

đậu tương có mã số trên GenBank JQ934960.

Từ kết quả phân tích bằng phần mềm DNA star, cây quan hệ di truyền

dựa vào trình tự nucleotide và trình tự amino acid của gen IFS2 của đậu tương

DT22 và DT84 với các trình tự tương đồng công bố trên GenBank đã được

dựng (hình 3.12)

Hình 3.12. Cây quan hệ di truyền gen IFS2 và protein suy diễn của giống đậu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tương DT22 và DT84 với các trình tự tương đồng trên GenBank

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

1. Đã xác định được hàm lượng isoflavone có trong một số giống đậu

tương nghiên cứu. Giống DT84 có hàm lượng cao nhất, giống DT22 có hàm

lượng thấp nhất trong số các giống nghiên cứu.

2. Đã phân lập, tách dòng và xác định được trình tự nucleotide của gen

IFS2 của 2 giống đậu tương DT84 và DT22. Gen IFS2 của 2 giống đậu tương

DT22 có kích thước 1669bp tương đồng 100% và DT84 có kích thước

1675bp tương đồng 99,8% với trình tự gen IFS2 đã công bố trên GenBank.

3. Gen IFS2 của giống DT84 có 3 nucleotide sai khác so với gen IFS2

của giống DT22 và trình tự tương đồng trên GenBank. Trong 3 nucleotide

thay đổi có một nucleotide không làm thay đổi amino acid, 2 nucleotide làm

thay đổi amino acid ở vị trí 398 Tryptophan (W) thành Arginine (R) và vị trí

463 Leucine (L) thành Phenylalanine (F).

2. Đề nghị

Thiết kế vector biểu hiện mang gen IFS2 đã phân lập nhằm tạo cây đậu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

tương chuyển gen có hàm lượng isoflavone cao.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tiếng Việt:

1. Vũ Đình Chính (2010), Cây đậu tương và kỹ thuật trồng trọt, Nxb Nông

Nghiệp, Hà Nội.

2. Ngô Thế Dân (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

3. Đường Hồng Dật (2008), Cây đậu tương - Thâm canh tăng năng suất đẩy

mạnh phát triển, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

4. Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

5. Nguyễn Ý Đức (2000), Dinh dưỡng và sức khỏe, Nxb Y học, TP Hồ Chí Minh.

6. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội.

7. Lê Văn Việt Mẫn (chủ biên) (2010), Công nghệ chế biến thực phẩm, Nxb

Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh

8. Vũ Minh Sơn (2004), Công nghệ sinh học trong chọn giống cây trồng, ĐH

Nông nghiệp I, Hà Nội.

9. Nguyễn Việt Thái (2003), Kỹ thuật trồng cây đậu nành, Nxb Đà Nẵng.

10. Phạm Văn Thiều, (2002), Cây đậu tương - Kỹ thuật trồng và chế biến sản

phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

II. Tiếng Anh:

11. Accorsi Neto A., Haidar M., Simoes R., Simoes M., Soares J., Baracat E.

(2009), “Effects of isoflavones on the skin of postmenopausal women: a

pilot study”, Clinics (Sao Paulo), 64(6), pp. 505-510.

12. Anderson J.W., Johnstone B.M., Cook Newell M.E. (1995), “Meta-

analysis of effects of soy protein intake on serum lipids in humans”, New

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

England Journal of Medicine, 333, pp. 276-282.

13. Bolanos R., Del Castillo A., Francia J. (2010), “Soy isoflavones versus

placebo in the treatment of climacteric vasomotor symptoms: systematic

review and meta-analysis”, Menopause, 17(3), pp. 660-666.

14. Bong G.K., Song Y.K., Hee S.S., Chan L., Hor G.H., Su I.K., Joong H.A.

(2003), “Cloning and Expression of the Isoflavone Synthase Gene (IFS-

Tp) fromTrifolium pratense”, Mol. Cells, 15(3), pp. 301-306.

15. Eduardo F., Luis G., Gilda C., Elba L., Rodrigo M.C. and Ivan P. (2013),

“Soybean - Bio-Active Compounds", Agricultural and Biological

Sciences, 25(8), pp. 521-545.

16. Jin A.K., Seung B.H., Woo S.J., Chang Y.Y., Kyung H.M., Jae G.G., Li

M.C. (2007), “Comparison of isoflavones composition in seed, embryo,

cotyledon and seed coat of cooked with rice and vegetable soybean

(Glycine max L.) varieties”, Food Chemistry, 102 (27), pp. 738-744.

17. Jung W., Yu O., Lau S.M., O'Keefe D.P., Odell J., Fader G., McGonigle

B. (2000), “Identification and expression of isoflavone synthase, the key

enzyme for biosynthesis of isoflavones in legumes”, Nat Biotechnol, 18(2), pp. 208-212.

18. Gerald R., Christine B.S., Jan F., Dagmar F., Uwe W., Hannelore D.,

Wendy L.H., Peter D.W. (2008), “Dietary isoflavones in the prevention of

cardiovascular disease - A molecular Perspective”, Food and Chemical

Toxicology, 46 (8), pp. 1308-1319.

19. Grotewold E., Peterson T. (1994), “Isolation and characterization of a

maize gene encoding chalcone flavanone isomerase”, Mol Gen Genet,

24(2), pp. 1-8.

20. Gutha L.R., Casassa L.F., Harbertson J.F., Naidu R.A. (2010),

“Modulation of flavonoid biosynthetic pathway genes and anthocyanins

due to virus infection in grapevine (Vitis vinifera L.) leaves”, BMC Plant

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Biol, 23(10), pp. 187-196.

21. Heather I.M. and Ann M.H. (1994), “Isolation of chalcone synthase and

chalcone isomerase cDNAs from alfalfa (Medicago sativa L.): highest

transcript levels occur in young roots and root tips”, Plant Molecular

Biology, 24(1), pp. 767-777.

22. Ho S.C., Chan A.S., Ho Y.P. (2007), “Effects of soy isoflavone

supplementation on cognitive function in Chinese postmenopausal women: a

double-blind, randomized, controlled trial”, Menopause, 14(3), pp. 489-499.

23. Hyo K.K., Yun H.J., Il S.B., Jeong H.L., Min J.P., and Jeong K.K. (2005),

“Polymorphism and Expression of Isoflavone Synthase Genes from Soybean

Cultivars”, Mol. Cells, 19(1), pp. 67-73.

24. Keshun L. (2004), Soybeans as Functional Foods and Ingredients,

University of Missouri Columbia, Missouri, AOCS Publishing.

25. Kim D.H., Kim B.G., Lee H.J., Lim Y., Hur H.G., Ahn J.H. (2005),

“Enhancement of isoflavone synthase activity by co-expression of P450

reductase from rice”, Biotechnol Lett, 27(17), pp. 1291-1294.

26. Linlsakova P., Riecansky I., Jagla F. (2010), “The Physiological Actions

of Isoflavone Phytoestrogens”, Physiol. Res, 59(1), pp. 651-664.

27. Maria G.C., Miguel P. Matos, Maria T.C., Margarida M.C. (2007), “The

variability of isoflavones in soy seeds and the possibility of obtaining

extracts for over the counter tablet preparations that can be standardized”,

Industrial Crops and Products, 26 (2007), pp. 85-92.

28. Matsura M., Akio O. (2006), “β-Glucosidases from Soybeans Hydrolyze

Daidzin and Genistin”, Journal of Food Science, 58(1), pp. 144 - 147.

29. Messina M.J. (2003), “Emerging evidence on the role of soy in reducing

prostate cancer risk”, Nutr Rev, 61(4), pp. 117-131.

30. Misra P., Pandey A., Tewari S.K., Nath P., Trivedi P.K. (2010),

“Characterization of isoflavone synthase gene from Psoralea corylifolia: a

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

medicinal plant”, Plant Cell Rep, 29(7), pp. 747-55.

31. Mura L. R., Mandarino J.M.G., Carrpo M.C., Nepomuceno A.L., Ida E.I.

(2007), “Isoflavones content and ß- glucosidase activity in soybean

cultivars of different manurity groups”, Journal of Food Composition and

Analysis, 20 (1), pp. 19-24.

32. Norimoto S., Toshio A., Shusei S., Yasukazu N., Satoshi T., and Shin I.A.

(2003), “A Cluster of Genes Encodes the Two Types of Chalcone

Isomerase Involved in the Biosynthesis of General Flavonoids and

Legume-Specific 5-Deoxy(iso)flavonoids in Lotus japonicus”, Plant

Physiol, 131(3). pp. 941-951.

33. Pendleton J. M., Tan W.W., Anai S. (2008), “Phase II trial of isoflavone

in prostate-specific antigen recurrent prostate cancer after previous local

therapy”, BMC Cancer, 8(1), pp. 13.

34. O Yu, J Shi, AO Hession, CA Maxwell, B McGonigle, JT Odell (2005).

Metabolic engineering to increase isoflavone biosynthesis in soybean seed,

Phytochemistry 63, pp. 753-763.

35. Sacks F.M., Lichtenstein A., Van H.L., Harris W., Kris E.P., Winston M.

(2006), “Soy protein, isoflavones, and cardiovascular health: an American

Heart Association Science Advisory for professionals from the Nutrition

Committee”, American Circulation,113(7), pp. 1034-1044.

36. Setchell K.D., Brown N.M., Lydeking O.E. (2002), “The clinical

importance of the metabolite equol-a clue to the effectiveness of soy and

its isoflavones”, Japanese Nutrition, 132(12), pp. 3577-3584.

37. Shuichi K. (2006), “Fundamental concepts in the safety assessment of food

containing soy isoflavones for the purpose of specified health use”, Food

Safety Commission, Novel Foods Expert Committee, Japanese.

38. Soderlund C., Descour A., Kudrna D., Bomhoff M., Boyd L., Currie J.,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Angelova A., Collura K., Wissotski M., Ashley E., Morrow D., Fernandes

J., Walbot V., Yu Y. (2009), “Sequencing, mapping, and analysis of

27,455 maize full-length cDNAs”, PLoS Gene, 5(11), pp. 740-747.

39. Stephen B. (2010), “The Biochemistry, Chemistry and Physiology of the

Isoflavones in Soybeans and their Food Products”, Lymphatic research

and biology, 8(1), pp. 89-98.

40. Subramanian S., Graham M.Y., Yu O., Graham T.L. (2005), “RNA

interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in

tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to

Phytophthora sojae”, Plant Physiol, 137(4), pp. 1345-1353.

41. Terai Y., Fujii I., Byun S.H., Nakajima O., Hakamatsuka T., Ebizuka Y.,

Sankawa U. (1996), “Cloning of chalcone-flavanone isomerase cDNA from

Pueraria lobata and its overexpression in Escherichia coli”, Prot Expr Purif,

8(1), pp. 183-190.

42. Vantyghem S.A., Wilson S.M., Postenka C.O., Al-Katib W., Tuck A.B.,

Chambers A. F. (2005), “Dietary genistein reduces metastasis in a

postsurgical orthotopic breast cancer model” Cancer Res, 65(1), pp.

3396-3403.

43. Wang L.Q. (2002), “Mammalian phytoestrogens: enterodiol and

enterolactone”, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1(2), pp.

289-309.

44. Wei P., Liu M., Chen Y., Chen D.C. (2012), “Systematic review of soy

isoflavone supplements on osteoporosis in women”, Asian Pac J Trop

Med, 5(3), pp. 243-248.

45. White L.R., Petrovitch H., Ross G.W., et al (2000), “Brain aging and

midlife tofu consumption”, J Am Coll Nutr, 19(2), pp. 242-255.

46. Wiseman H., Casey K., Clarke B.D., Bowey E. (2002), “isoflaone

aglycone and gluconjugate content of high and low soy UK foods used in

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

nutritional studies”, J Agric Food Chem, 50 (1), pp. 1404-1410.

47. Yan L., Spitznagel E.L. (2009), “Soy consumption and prostate cancer risk in

men: a revisit of a meta-analysis”, Am J Clin Nutr, 89(4), pp. 1155-1163.

48. Zhao L., Brinton R.D. (2007), “WHI and WHIMS follow-up and human

studies of soy isoflavones on cognition”, Expert Rev Neurother, 7(11), pp.

1549-1564.

Internet

49. http://faostat.org.

50. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

51. USDA database

52. http://123doc.org/doc/s/thành+phần+và+hoạt+tính+isoflavone+

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

trong+đậu+nành.

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: So sánh trình tự gen liên quan đến tổng hợp isoflavone của 2 giống đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––––––

SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP ISOFLAVONE CỦA 2 GIỐNG ĐẬU TƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ––––––––––––––––––––––––

SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP ISOFLAVONE CỦA 2 GIỐNG ĐẬU TƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

MỞ ĐẦU

Đặc điểm sinh thái học của cây đậu tương

Nhiệt độ thích hợp ở giai đoạn nẩy mầm và giai đoạn cây con là từ 24 -

Amino acid

Giá trị

Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của các aglucon [18]

Hình 1.2. Cấu trúc hoá học của các ß-Glucozit [18]

Bảng 1.4. Hàm lượng isoflavone trong thực phẩm [51]

Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp isoflavone [39]

Hình 1.4. Sơ đồ mô tả gen IFS2 ở cây đậu tương [50]

Có thể bạn quan tâm

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận án Tiến Sĩ: : Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết từ cây Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)

Báo cáo thực tập: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (QUATEST 2)

Câu hỏi ôn tập môn Công nghệ sinh học nấm ăn và nấm dược liệu

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Công nghệ nông nghiệp năm 2025 - Sở GD&ĐT Cà Mau

Câu hỏi ôn tập kiểm tra học kì 2 môn Công nghệ chăn nuôi lớp 11 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Đề cương ôn tập học kì 2 môn Công nghệ nông nghiệp lớp 12 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Virus Real-time PCR

Bài giảng Công nghệ sản xuất enzym - Lê Ngọc Khánh

Đề khảo sát giữa học kì 2 môn Khoa học tự nhiên lớp 9 năm 2024-2025 có đáp án - Trường THCS Xuân Tiến (Đề số 02)

Định danh chủng vi khuẩn Bacillus subtilis R1 phân lập từ rơm có hoạt tính phân huỷ huyết khối

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Công nghệ sinh học nano năm 2021-2022

Bài giảng Công nghệ sinh học phân tử vi sinh vật - Trần Linh Thước

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Xuân Lộc, Đồng Nai

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ môi trường: Nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học theo mẻ (SBR) để xử lý nước thải sinh hoạt trong nhà cao tầng và khu dân cư quy mô tới 10000 người

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đột biến và đa hình của một số gen ở trẻ em mắc bệnh teo đường mật bẩm sinh

Đề thi kết thúc học phần học kì 2 môn Công nghệ sinh học dinh dưỡng năm 2023-2024 có đáp án

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Quản lý chất lượng sản phẩm năm 2023-2024

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok