Luận văn Thạc sĩ Sinh học thí nghiệm: Nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh bạc lá trên lúa của vật liệu nano Cu2O-Cu/Alginate

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:96

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học thí nghiệm "Nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh bạc lá trên lúa của vật liệu nano Cu2O-Cu/Alginate" trình bày các nội dung chính sau: Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh bạc lá trên cây lúa của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate và so sánh với thuốc bảo vệ thực vật thương mại Xantocin 40WP với mục tiêu định hướng sử dụng vật liệu như một chất kiểm soát bệnh bạc lá trên cây lúa, thay thế các loại thuốc bảo vệ thực vật truyền thống giúp phát triển nền nông nghiệp theo hướng an toàn, bền vững.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học thí nghiệm: Nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh bạc lá trên lúa của vật liệu nano Cu2O-Cu/Alginate

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẦN PHƯỚC THỌ TRẦN PHƯỚC THỌ SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN XANTHOMONAS SP. GÂY BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA CỦA VẬT LIỆU NANO Cu2O-Cu/ALGINATE LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM 2021 Thành phố Hồ Chí Minh – 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẦN PHƯỚC THỌ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN XANTHOMONAS SP. GÂY BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA CỦA VẬT LIỆU NANO Cu2O-Cu/ALGINATE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. BÙI ĐÌNH THẠCH Thành phố Hồ Chí Minh – 2021
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh bạc lá trên lúa của vật liệu nano Cu2O- Cu/alginate” là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Bùi Đình Thạch. Các số liệu, kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa được công bố ở các đề tài cùng cấp hoặc các công trình khoa học tương tự. Nếu có gì sai xót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả luận văn Trần Phước Thọ
ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của cá nhân và tập thể. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: TS. Bùi Đình Thạch, thầy đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và giúp đỡ tận tình để tôi hoàn thành luận văn này. TS. Bùi Duy Du và NCS. Lê Nghiêm Anh Tuấn, người đã giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện thí nghiệm và hoàn thiện nội dung của luận văn. Các Thầy, Cô giáo và cán bộ phòng Đào tạo sau đại học của Học viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình đào tạo Thạc sĩ. Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cung cấp cơ sở hạ tầng, trang thiết bị giúp tôi thực hiện các thí nghiệm. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và các bạn học viên lớp cao học Sinh học thực nghiệm khóa 2019 đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn!
iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT Ký hiệu/ Tiếng Anh Tiếng Việt từ viết tắt BVTV Bảo vệ thực vật CSB Chỉ số bệnh Fourier-transform infrared Phổ hồng ngoại biến đổi FT-IR spectroscopy Fourier HLPT Hiệu lực phòng trừ HLUC Hiệu lực ức chế Inductively coupled plasma Phương pháp khối phổ plasma ICP-MS mass spectrometry cảm ứng LD50 Lethal dose, 50% Liều lượng gây chết 50% NSXL Ngày sau xử lý PEG Poly ethylen glycol PVP Polyvinylpyrrolidone LB Luria Bertani Transmission electron Kính hiển vi điện tử truyền TEM microscopy qua TLB Tỷ lệ bệnh TLTK Tài liệu tham khảo UV-vis Utra Violet-Visible Quang phổ tử ngoại khả kiến XRD X-Ray diffraction Nhiễu xạ tia X
iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các phương pháp tổng hợp nano Cu2O ......................................... 10 Bảng 2.1. Thang phân 9 cấp độc tính đối với cây trồng .................................33 Bảng 3.1. Kích thước hạt nano Cu2O và Cu tính qua phổ XRD .....................38 Bảng 3.2. Độc tính cấp LD50 qua đường miệng trên chuột của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate............................................................................................ 41 Bảng 3.3. Tỷ lệ nhạy cảm da của chuột với vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate 42 Bảng 3.4. Hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. của vật liệu nano Cu2O- Cu/alginate...................................................................................................... 44 Bảng 3.5. Tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh bạc lá lúa trong thí nghiệm nhà lưới .... 46 Bảng 3.6. Hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá lúa trong thí nghiệm nhà lưới ...... 48 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate đến năng suất lúa ........................................................................................................................ 49 Bảng 3.8. Độc tính của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate đối với cây lúa ....... 50
v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá ................................................................. 5 Hình 1.2. Đặc trưng cấu trúc của alginate ..................................................... 11 Hình 1.3. Cơ chế phòng trừ vi khuẩn E. coli của CuO và Cu2O ................... 14 Hình 2.1. Quy trình tổng hợp vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate.......................22 Hình 2.2. Chuột được nuôi trong hộp nhựa có gắn nắp lưới ......................... 28 Hình 2.3. Chuột được đánh số thứ tự và ghi nhận trọng lượng ban đầu ........ 29 Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm và chuẩn bị thuốc thử ........................................ 32 Hình 3.1. Thay đổi màu sắc dung dịch trong quá trình khử Cu2+ ...................35 Hình 3.2. Ảnh chụp TEM và sự phân bố kích thước hạt nano Cu2O-Cu/alginate ........................................................................................................................ 36 Hình 3.3. Giản đồ XRD của alginate và nano Cu2O-Cu/alginate .................. 37 Hình 3.4. Phổ FT-IR của alginate chiết xuất rong nâu và nano Cu2O- Cu/alginate...................................................................................................... 38 Hình 3.5. Phổ UV-vis của alginate/phức Cu2+ và nano Cu2O-Cu/alginate.... 39 Hình 3.6. Sơ đồ mô phỏng mô phỏng phản ứng tạo cấu trúc nano lõi-vỏ Cu2O@Cu ....................................................................................................... 40 Hình 3.7. Các cá thể chuột ở nhóm thử nghiệm sau 48 giờ bôi dung dịch nano Cu2O-Cu/alginate............................................................................................ 42 Hình 3.8. Sự phát triển của vi khuẩn Xanthomonas sp. sau 24 giờ nuôi cấy ở các nghiệm thức .............................................................................................. 45 Hình 3.9. Sự phát triển của bệnh bạc lá trong thí nghiệm nhà lưới ở các nghiệm thức ................................................................................................................. 46 Hình 3.10. Sự phát triển của bệnh bạc lá lúa ở các nghiệm thức có xử lý trong thí nghiệm nhà lưới......................................................................................... 51
vi MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................. ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT ............................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................. iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ.........................................................v MỤC LỤC ...................................................................................................... vi MỞ ĐẦU...........................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................4 1.1. BỆNH BẠC LÁ LÚA ................................................................................4 1.1.1. Triệu chứng bệnh bạc lá lúa .................................................................4 1.1.2. Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa ...............................................................5 1.1.3. Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh bạc lá lúa ...........................6 1.1.4. Cách phòng trừ bệnh bạc lá lúa ...........................................................7 1.2. VẬT LIỆU NANO Cu2O-Cu/ALGINATE 8 1.2.1. Nano Cu và nano Cu 2O .........................................................................8 1.2.2. Các phương pháp tổng hợp nano Cu và nano Cu 2O..........................9 1.2.3. Alginate chiết xuất từ rong nâu Khánh Hòa .....................................11 1.2.4. Cơ chế kháng vi sinh vật của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate .......12 1.2.5. Độc tính của nano Cu và nano Cu2O .................................................14 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC....................15 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ......................................................15 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ......................................................17 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............21 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ......................................................................21 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................21 2.2.1. Phương pháp tổng hợp vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate .................21 2.2.2. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) .....................22 2.2.3. Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) ...................................................23 2.2.4. Phương pháp đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) ............24 2.2.5. Phương pháp đo phổ tử ngoại – khả kiến (UV-vis) ..........................25
vii 2.2.6. Phương pháp khối phổ plasma cảm ứng (ICP-MS) .........................26 2.2.7. Đánh giá độ độc của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate ......................27 2.2.7.1. Xác định độc tính qua đường miệng trên chuột ................................ 27 2.2.7.2. Xác định kích ứng da (nhạy cảm da) trên chuột................................ 28 2.2.8. Nghiên cứu hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm in vitro.......................................30 2.2.9. Nghiên cứu hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá lúa của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm nhà lưới..............................................31 2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................34 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................35 3.1. TỔNG HỢP VẬT LIỆU NANO Cu2O-Cu/ALGINATE .........................35 3.1.1. Kết quả xác định kích thước và sự phân bố kích thước hạt của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate ..........................................................................35 3.1.2. Nghiên cứu cấu trúc tinh thể của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate.36 3.1.3. Phổ FT-IR của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate ...............................38 3.1.4. Phổ UV-vis của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate ..............................39 3.1.5. Độc tính của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate ...................................41 3.1.5.1. Độc tính cấp đường miệng ................................................................ 41 3.1.5.2. Độc tính qua tiếp xúc da .................................................................... 41 3.2. HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN XANTHOMONAS SP. GÂY BỆNH BẠC LÁ TRÊN LÚA CỦA VẬT LIỆU Cu2O-Cu/ALGINATE ....................43 3.2.1. Nghiên cứu hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm in vitro.......................................43 3.2.2. Nghiên cứu hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate trong thí nghiệm nhà lưới..............................................45 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................53 4.1. KẾT LUẬN ..............................................................................................53 4.2. KIẾN NGHỊ..............................................................................................54 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ...............55 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................56 PHỤ LỤC .......................................................................................................65
1 MỞ ĐẦU Ở Việt Nam, lúa là cây lương thực chủ lực trong sản xuất nông nghiệp. Lúa gạo có vai trò quan trọng nhằm đảm bảo an ninh lương thực của Việt Nam nói riêng và nhiều quốc gia trên thế giới nói chung. Trong nhiều năm vừa qua, sản lượng sản xuất nông nghiệp của Việt Nam đã đạt được những tiến bộ đáng kể, trong đó cây lúa đóng vai trò chủ đạo, Việt Nam đã trở thành nước xuất khẩu gạo đứng thứ hai thế giới. Tuy nhiên, việc sản xuất lúa với cường độ cao và liên tục trên quy mô lớn và chuyên canh đã dẫn đến sự thoái hóa đất, việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) tổng hợp hữu cơ độc hại và thói quen sử dụng không đúng liều lượng đã làm phát sinh nhiều loại dịch bệnh khó kiểm soát, trong đó có bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trên cây lúa. Bệnh bạc lá lúa là một trong những dịch bệnh gây hại làm giảm năng suất nghiêm trọng, đặc biệt là đối với những giống lúa có năng suất cao ở Việt Nam và khu vực Đông Nam Á [1]. Bệnh bạc lá lúa diễn ra thường xuyên, hàng năm đặc biệt là trong vụ mùa khi độ ẩm không khí ở mức cao tại vùng đồng bằng sông Cửu Long – vựa lúa lớn nhất cả nước. Khi cây lúa bị nhiễm bệnh bạc lá thì năng suất có thể giảm lên đến 50%, thậm chí 100% tùy vào mức độ gây hại của bệnh [2]. Để giảm thiểu thiệt hại của bệnh bạc lá trên lúa, nông dân thường sử dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp như canh tác thích hợp, bón phân hợp lý, vệ sinh đồng ruộng, sử dụng giống lúa kháng bệnh bạc lá,… trong đó việc sử dụng thuốc BVTV là biện pháp quan trọng nhất được sử dụng phổ biến. Hiện nay, việc sử dụng thuốc BVTV có nguồn gốc tổng hợp hữu cơ và thói quen dùng không đúng liều lượng gây ảnh hưởng rất lớn đến môi trường và sức khỏe con người, đồng thời có khả năng làm xuất hiện các chủng vi sinh vật kháng thuốc nên ngày càng phải tăng liều lượng. Vì vậy, việc nghiên cứu tổng hợp những loại vật liệu mới, đạt hiệu quả cao trong phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa nhưng không gây tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người là cần thiết và cấp bách để phát triển nền nông nghiệp an toàn, bền vững theo xu hướng hội nhập quốc tế. Ngày nay, việc ứng dụng công nghệ nano trong nông nghiệp nhằm kiểm soát các vi sinh vật gây hại trên cây trồng được xem là hướng đi mới để phát triển nền nông nghiệp bền vững, kinh tế và an toàn hơn. Kim loại đồng (ký hiệu
2 Cu) và các hợp chất của kim loại Cu từ lâu đã được ứng dụng làm chất diệt khuẩn, diệt nấm [3,4]. Các hạt nano Cu có độc tính cao và chọn lọc với vi sinh vật mà không gây độc đối với các tế bào của con người và động vật ở nồng độ thấp [5], vì thế nó rất có tiềm năng sử dụng làm phân bón nano và thuốc BVTV kháng vi sinh vật gây hại trong ngành nông nghiệp. Nano kim loại Cu và các hợp chất nano của kim loại Cu như nano Cu2O, CuO, CuCl đã được các nhà khoa học nghiên cứu phát triển, định hướng làm chất kiểm soát vi sinh vật gây hại cây trồng trong thời gian gần đây do chúng có hiệu quả cao và chi phí sản xuất thấp. Cu2O-Cu ở kích thước nano có tính linh động, diện tích bề mặt riêng lớn và thể hiện hoạt tính xúc tác mạnh trong các phản ứng hữu cơ như gắn lên các nhóm chức enzyme của màng tế bào vi sinh vật (đặc biệt là nhóm sulfhydryl, rất nhạy cảm với ion Cu+) làm bất hoạt tác nhân gây bệnh [6]. Một số nghiên cứu về độc tính cho thấy vật liệu nano Cu, nano Cu2O ít gây độc đối với động vật máu nóng hơn các muối Cu2+ [7,8]. Ngoài việc có hiệu quả kiểm soát vi sinh vật gây hại trên cây trồng, vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate còn cung cấp dinh dưỡng vi lượng Cu và hoạt chất điều hòa sinh trưởng alginate là một polysaccharide cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng [9]. Trên thế giới, trong thập niên vừa qua, vật liệu nano Cu và hợp chất nano của Cu đã được nghiên cứu định hướng ứng dụng làm phân bón nano và thuốc BVTV nhằm gia tăng năng suất và bảo vệ cây trồng khỏi các loài vi sinh vật gây hại. Tuy nhiên, ở Việt Nam việc ứng dụng các hạt nano kim loại làm chất kiểm soát vi sinh vật gây hại trên cây trồng hiện nay số công trình công bố vẫn còn hạn chế. Hạt nano kim loại Cu, nano oxit kim loại CuO, Cu2O được ổn định bởi alginate có diện tích và năng lượng bề mặt lớn nên thể hiện khả năng kháng vi sinh vật vượt trội, chứa dinh dưỡng vi lượng và chất điều hòa sinh trưởng sinh học cần thiết cho sự phát triển của thực vật nên là loại vật liệu tiềm năng để ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp. Vì lý do trên, luận văn thạc sĩ chọn và thực hiện đề tài “Nghiên cứu hoạt tính kháng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh bạc lá trên lúa của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate”.
3 Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh bạc lá trên cây lúa của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate và so sánh với thuốc bảo vệ thực vật thương mại Xantocin 40WP với mục tiêu định hướng sử dụng vật liệu như một chất kiểm soát bệnh bạc lá trên cây lúa, thay thế các loại thuốc bảo vệ thực vật truyền thống giúp phát triển nền nông nghiệp theo hướng an toàn, bền vững. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Tổng hợp và xác định các tính chất hóa lý đặc trưng của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate. Nội dung 2: Thử nghiệm độc tính của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate trên chuột. Nội dung 3: Xác định nồng độ Cu của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate đạt 100% hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. trong thí nghiệm in vitro. Nội dung 4: Xác định nồng độ Cu của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate đạt > 90% hiệu lực phòng trừ bệnh bạc lá trên cây lúa trong thí nghiệm nhà lưới. Nội dung 5: Đánh giá ảnh hưởng của vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate đối với cây lúa. Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa khoa học: Xây dựng được quy trình công nghệ và xác định các tính chất hóa lý đặc trưng của loại vật liệu mới nano Cu2O-Cu/alginate và nghiên cứu hiệu lực ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh bạc lá trên lúa trong nghiên cứu in vitro và nhà lưới. Ý nghĩa thực tiễn: Vật liệu nano Cu2O-Cu/alginate là một loại vật liệu mới có độc tính thấp và có hiệu lực cao kháng vi khuẩn Xanthomonas sp. gây bệnh bạc lá trên lúa, vì vậy nó phù hợp cho việc định hướng sử dụng chúng làm chất kiểm soát bệnh cây trồng nhằm thay thế các thuốc BVTV độc hại đáp ứng nhu cầu phát triển nền nông nghiệp xanh, bền vững. Góp phần sản xuất ra các loại nông sản, đặc biệt là lúa đạt chất lượng, an toàn thực phẩm, đảm bảo tiêu chuẩn xuất khẩu.
4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. BỆNH BẠC LÁ LÚA Các dịch bệnh phổ biến trên cây lúa do vi khuẩn và vi nấm gây ra bao gồm bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae, bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas sp., bệnh thối bẹ lá do nấm Sarocladium oryzae và bệnh khô vằn do nấm Rhizoctonia solani gây ra. Trong đó, bệnh bạc lá lúa là một trong những bệnh có khả năng lây lan trên diện rộng, làm giảm năng suất lúa từ 20 – 50% và thậm chí là 100% nếu như không xử lý bằng thuốc BVTV kịp thời [2]. Bệnh bạc lá lúa hay còn gọi là bệnh cháy bìa lá được phát hiện đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1884. Sau đó, sự xuất hiện của nó đã được ghi nhận ở một số quốc gia khác như Úc, Bangladesh, Campuchia, Indonesia, Ấn Độ và Việt Nam,… [1]. Ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa có khả năng lây lan thành dịch không cao như các bệnh dịch hại khác như rầy nâu, đạo ôn nhưng hậu quả do bệnh bạc lá lúa cũng gây ra thiệt hại đáng kể, đặc biệt là vào những mùa vụ có độ ẩm không khí cao. Theo số liệu thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, tính từ đầu năm đến tháng 2 năm 2021, diện tích lúa bị thiệt hại do bệnh bạc lá gây ra là 7.197 ha, trong đó diện tích bị nhiễm nặng là 187 ha và tập trung ở các tỉnh phía Nam [10]. 1.1.1. Triệu chứng bệnh bạc lá lúa Triệu chứng đầu tiên của bệnh bạc lá là những vệt dài khoảng 2 – 3 cm xuất hiện ở mặt trên phiến lá. Những vệt này lớn dần và chuyển sang màu vàng trong vài ngày. Triệu chứng bệnh có thể xuất hiện một bên hay cả hai bên bìa lá. Bệnh nặng có thể làm toàn bộ lá lúa bị khô bạc trước khi lúa trổ và hạt lúa bị lép dẫn đến giảm năng suất đáng kể [11]. Vết bệnh bạc lá lúa xuất hiện từ mép lá, thường từ chóp lá, mút lá, sau đó lan dần vào trong phiến lá hoặc kéo dài theo gân chính, hoặc vết bệnh xuất hiện ngay giữa phiến lá và lan rộng ra mép lá. Thông thường ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ được phân biệt rõ ràng theo đường gợn sóng màu vàng hoặc viền nâu (hình 1.1). Trong điều kiện ẩm độ cao, trên bề mặt vết bệnh bạc lá xuất hiện những giọt dịch vi khuẩn có màu vàng đục, khi giọt dịch này keo đặc lại rất cứng và có màu nâu hổ phách [11].
5 Hình 1.1. Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá [12] 1.1.2. Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa Bệnh bạc lá gây hại trên cây lúa là do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra, đây là một trong những bệnh hại nguy hiểm đối với cây lúa trong cả hai vụ (vụ đông xuân và vụ hè thu) ở Việt Nam. Những năm gần đây bệnh gây thiệt hại rất nặng, đặc biệt là trên các giống lúa lai và lúa nếp [11]. Vi khuẩn Xanthomonas sp. có hình que, đầu tròn, kích thước nhỏ (0,4 – 0,7×0,7 – 2,0 µm), có khả năng di động với một trùng roi đơn cực, bao quanh tế bào là một màng nhầy [1]. Đây là loại vi khuẩn Gram âm và không sinh bào tử, khuẩn lạc hình tròn, lồi, bề mặt nhẵn, màu vàng. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 26 – 30°C, pH thích hợp là 6,8 – 7,0 và ẩm độ không khí trên 90% [13]. Vi khuẩn Xanthomonas sp. có thể tồn tại từ mùa vụ này sang mùa vụ khác trên các lá bị nhiễm bệnh và các mảnh vụn của lá, nhưng không tồn tại trong đất [14]. Rao (1987) cho rằng sự lây nhiễm bệnh bạc lá qua hạt giống có thể xảy ra vào mùa vụ hè, nhưng không thể xảy ra vào mùa vụ đông, vì vi khuẩn Xanthomonas sp. không thể phát triển trong thời tiết lạnh và khô [15]. Singh (1971) nhận thấy rằng vi khuẩn Xanthomonas sp. có thể tồn tại từ 15 – 38 ngày trong nước ruộng [16]. Trong tự nhiên, vi khuẩn Xanthomonas tồn tại rất nhiều chủng loại khác nhau, chúng rất khác nhau về độc lực và được phân biệt bởi các tác động của chúng trên các loại cây trồng khác nhau [17].
6 1.1.3. Đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh bạc lá lúa Bệnh bạc lá có thể phát sinh trong suốt thời kỳ sinh trưởng của cây lúa, các triệu chứng bệnh điển hình thường xuất hiện từ thời kỳ đẻ nhánh đến thời kỳ trổ bông và chín, đạt đỉnh ở giai đoạn trổ bông [18]. Bệnh bạc lá lúa được chia làm hai giai đoạn: Giai đoạn “Kresek” và giai đoạn cháy lá. Kresek là giai đoạn phá hoại nghiêm trọng nhất, toàn bộ lá của cây lúa chuyển sang màu vàng nhạt và héo. Nếu giai đoạn Kresek xảy ra trong thời kỳ đẻ nhánh sớm sẽ dẫn đến năng suất lúa bị giảm một phần hoặc mất toàn bộ. Cây lúa dưới 21 ngày tuổi dễ bị nhiễm giai đoạn Kresek khi nhiệt độ môi trường từ 28°C đến 34°C. Chính vì vậy, bệnh bạc lá lây lan dễ dàng hơn ở vùng có khí hậu ấm và ẩm [19,20]. Thời tiết ẩm ướt, mưa nhiều là điều kiện thuận lợi cho bệnh bạc lá phát sinh và lây lan, đặc biệt là trong mùa vụ hè thu. Bên cạnh đó, những ruộng lúa bón thừa đạm hoặc bón phân không cân đối làm cho cây lúa sinh trưởng xanh tốt, nhưng thân, lá mềm yếu do hàm lượng đạm tự do trong cây tích luỹ cao hoặc những ruộng trũng hoặc vùng lúa bị bóng cây che phủ thì cây dễ nhiễm bệnh hơn. Các giống lúa khác nhau thì mức độ mẫn cảm với bệnh bạc lá cũng khác nhau. Giai đoạn lúa làm đòng, trổ bông và chín sữa là giai đoạn lúa dễ nhiễm bệnh nhất và cũng gây thiệt hại năng suất cao nhất [11]. Vi khuẩn Xanthomonas sp. tồn tại chủ yếu trong hạt giống hoặc tàn dư cây bệnh, ngoài ra vi khuẩn còn tồn tại ở dạng giọt keo trên cỏ dại [21]. Vi khuẩn chủ yếu xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn thực vật làm nhiễm trùng toàn thân cây lúa. Sau một vài ngày, các tế bào vi khuẩn có thể lấp đầy các mạch xylem sau đó rỉ ra khỏi các lổ khí khổng của lá tạo thành các giọt dịch vi khuẩn trên bề mặt lá [22]. Khi gặp điều kiện thời tiết thuận lợi vi khuẩn lại tiếp tục phát sinh và gây hại. Vi khuẩn Xanthomonas sp. xâm nhập vào thực vật bằng cách chủ động là bơi, hoặc thụ động theo nước khi được rút vào lá. Sau khi xâm nhập vào tế bào biểu mô mặt dưới của lá, vi khuẩn Xanthomonas sp. phát triển trong khoảng gian bào và lây lan thông qua lỗ khí khổng ở đầu mút gây tổn thương dọc theo gân lá. Ngoài ra, vi khuẩn này còn có thể xâm nhập qua các vết thương cơ học trên lá, có thể gây ra bởi gió thổi mạnh làm lá lúa xây xát và lây lan từ lá này
7 sang các lá khác. Tùy vào mức độ bị tổn thương trên lá lúa mà bệnh phát sinh rộng hay hẹp [23]. 1.1.4. Cách phòng trừ bệnh bạc lá lúa Bệnh bạc lá lúa gây tổn thất nặng nề và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất lúa gạo trên toàn thế giới. Do vậy đòi hỏi phải có biện pháp nhằm chống lại sự bùng phát của dịch bệnh. Xử lý bệnh bạc lá trên lúa giai đoạn đầu rất quan trọng, bệnh cần được kiểm soát để ngăn chặn sự phát triển và giảm mức độ lây lan. Có rất nhiều biện pháp để ngăn ngừa và quản lý bệnh bạc lá trên cây lúa, chẳng hạn như xử lý hạt giống hoặc nhúng mạ vào thuốc kháng sinh trước khi gieo cấy để làm giảm mầm bệnh, sử dụng các giống lúa kháng bệnh bạc lá, sử dụng các hoạt chất kháng vi khuẩn sau khi sạ khoảng 20 – 30 ngày [24]. Tuy nhiên, sự suy giảm tính kháng bệnh của giống lúa thường xảy ra sau vài năm do sự thích nghi di truyền của mầm bệnh [25], thói quen sử dụng thuốc không đúng liều lượng của nông dân cũng tạo điều kiện cho mầm bệnh biến đổi và kháng thuốc nên lượng thuốc sử dụng phải tăng dần mới đạt hiệu quả kiểm soát bệnh. Bón phân cân đối ngay từ đầu vụ (không bón thúc đạm quá muộn, không bón dư đạm), tránh làm gãy, dập lá trong mùa mưa bão. Khi bệnh xuất hiện, dừng bón phân đạm, không phun các chất kích thích sinh trưởng, phân bón lá và duy trì mức nước trong ruộng từ 3 – 4 cm. Có thể kiểm soát dịch bệnh bằng các phương pháp khác như sử dụng các vi sinh vật đối kháng hoặc các chất chuyển hóa thứ cấp của chúng được coi là một công nghệ kiểm soát dịch bệnh an toàn, có tính khả thi và đã được nghiên cứu nhưng phương pháp này có chi phí cao, hiệu quả thấp hơn phương pháp xử lý hóa học [26]. Cho đến nay, các biện pháp sử dụng thuốc BVTV để kiểm soát bệnh bạc lá lúa vẫn là phương cách hữu hiệu nhất. Các loại thuốc BVTV thương mại đặc trị bệnh bạc lá lúa đã được Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn cấp phép lưu hành và thương mại thông dụng như Sasa 25WP, Kaisin 100WP, Xantocin 40WP, Kasumin 4SL và một số loại thuốc kháng sinh như Streptomycin, Streptocycline, Agrimycin, Propenazole. Hạn chế của chúng là thường có độ độc cao, nếu sử dụng thường xuyên sẽ gây độc đối với con người, hệ động thực vật trong môi trường và làm phát sinh các chủng vi sinh vật kháng thuốc. Khi
8 bệnh bạc lá phát triển trên đồng ruộng với triệu chứng rõ ràng thì việc xử lý bệnh bằng thuốc BVTV thường mang lại hiệu quả không cao, vì vậy việc thăm ruộng và phát hiện bệnh có vai trò quan trọng trong việc đảm bảo năng suất trong canh tác lúa [27]. Vì các lý do nêu trên, việc nghiên cứu những loại vật liệu mới khắc phụ được những nhược điểm của thuốc BVTV tổng hợp hữu cơ, chất kháng sinh để kiểm soát bệnh bạc lá trên cây lúa là cần thiết. Trong một thập kỷ qua, với sự phát triển của công nghệ nano, đã chế tạo được những hạt nano kim loại, oxit kim loại, nano polyme,… mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng chúng vào việc xử lý vi sinh vật gây bệnh thực vật. Trong các loại hạt nano thì nano Cu tỏ ra có hiệu quả hơn trong việc kháng lại vi sinh vật gây hại cây trồng, đồng thời chúng cũng là dinh dưỡng cần thiết cho thực vật trong quá trình quang hợp, tham gia vào quá trình phân mô để tăng trưởng cây trồng, đó là vật liệu tương lai để phát triển nền nông nghiệp an toàn và bền vững. 1.2. VẬT LIỆU NANO Cu2O-Cu/ALGINATE 1.2.1. Nano Cu và nano Cu2O Cu là nguyên tố hóa học trong bảng tuần hoàn có số hiệu nguyên tử 29, là kim loại dẻo, có tính dẫn điện và dẫn nhiệt cao nên được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: Xây dựng, vật liệu dẫn điện, dẫn nhiệt, vật liệu xúc tác quang, phát quang, quang điện tử [28]. Cu là nguyên tố vi lượng cần thiết cho các loài động, thực vật bậc cao, nó là thành phần của enzyme vận chuyển oxy trong cơ thể. Kim loại Cu và các hợp chất của Cu từ lâu đã được ứng dụng làm chất diệt khuẩn, diệt nấm và chất bảo quản gỗ [3,4]. Cu2O là một trong hai dạng oxit của Cu, có màu đỏ, rất bền với nhiệt (nóng chảy ở 1.240°C), không tan trong nước nhưng tan chậm trong môi trường kiềm đặc hoặc dung dịch NH3 đặc và tan tốt trong dung dịch axit. Cu2O có cấu trúc tinh thể lập phương tâm mặt (fcc), là kim loại bán dẫn không độc hại, giá thành rẻ và có nguồn nguyên liệu dồi dào [29]. Vật liệu Cu và Cu2O ở kích thước nanomet có diện tích bề mặt lớn nên thể hiện các tính chất dẫn điện, dẫn nhiệt, kháng khuẩn cao vượt trội so với trạng thái vật liệu khối [30]. Vì vậy, gần đây vật liệu nano Cu và nano Cu2O được quan tâm nghiên cứu sử dụng trong lĩnh vực công nghiệp điện tử, môi
9 trường và vật liệu kháng vi sinh vật phổ rộng đặc biệt là vi sinh vật gây hại cho thực vật. Tuy nhiên các hạt nano Cu và nano Cu2O luôn có xu hướng kết tụ, tiến lại gần nhau làm tăng kích thước hạt dẫn đến làm giảm hoạt tính sinh học [31], vì vậy trong quy trình chế tạo vật liệu nano cần phải sử dụng các chất ổn định là chất hoạt động bề mặt hoặc các polyme tự nhiên. Ưu điểm của vật liệu nano kim loại Cu và nano oxit Cu là được tổng hợp từ nguyên liệu thông dụng, có chi phí thấp hơn nano Ag [32]. Trong canh tác nông nghiệp, ngoài khả năng kháng vi sinh vật gây hại, các nano hợp chất của kim loại Cu còn cung cấp nguyên tố dinh dưỡng vi lượng rất cần thiết giúp điều hòa sinh trưởng và phát triển thực vật. Cụ thể Cu tham gia vào quá trình hình thành diệp lục và liên quan đến một số enzyme điều hòa các phản ứng sinh hóa của thực vật [9]. Đối với cơ thể con người, Cu cũng là dinh dưỡng thiết yếu, nó là thành phần trong một số enzyme hình thành hemoglobin, trao đổi carbohydrate, collagen, elastin, keratin có tác dụng chống oxy hóa [5]. 1.2.2. Các phương pháp tổng hợp nano Cu và nano Cu2O Các nghiên cứu về tổng hợp nano Cu và nano Cu2O trên thế giới hiện nay chủ yếu tập trung vào việc nghiên cứu thay đổi các yếu tố để tạo ra các hạt nano kim loại Cu và oxit Cu có kích thước nhỏ và nồng độ Cu cao hơn. Có thể tổng hợp các hạt Cu2O-Cu có kích thước nanomet bằng phương pháp hóa học hoặc phương pháp kết hợp hóa học và vật lý. Zhu và cộng sự (2004) đã tổng hợp các hạt nano Cu có kích thước khoảng 10 nm bằng cách khử CuSO4.5H2O với tác nhân khử là NaH2PO2 kết hợp chiếu xạ vi sóng [33]. Blosi và cộng sự (2011) tổng hợp nano Cu có kích thước hạt trung bình là 46 ± 9 nm bằng phương pháp polyol, sử dụng axit ascorbic làm chất khử và ổn định trong PVP [34]. Khan và cộng sự (2016) tổng hợp thành công các hạt nano Cu và Cu2O có kích thước hạt trung bình lần lượt là 28,73 nm và 25,19 nm bằng quá trình khử hóa học muối CuSO4.5H2O sử dụng tác nhận khử là axit ascorbic và được ổn định trong tinh bột [35]. Tổng hợp một số công nghệ điều chế các hạt nano Cu2O bằng các kỹ thuật khác nhau được trình bày trong bảng 1.1.
10 Bảng 1.1. Các phương pháp tổng hợp nano Cu2O Dạng Hình thái, Ghi chú về phương TT Phương pháp Nguyên liệu Điều kiện TLTK nano Kích thước pháp Nhiệt độ Đa tinh thể, Đồng trong dung dịch Năng lượng, nhiệt độ, áp 1 Chiếu laser cao, phun Hạt kích thước ~ [36] PVP suất cao, giá cao cắt laser 29 nm Kỹ thuật bay Hình cầu, kích Nhiệt độ và thế cao, giá Bay hơi đồng với sự có 150°C – Màng 2 hơi phản ứng thước thành cao, cần kiểm soát [37] mặt O2 plasma phản ứng 200°C mỏng hoạt hóa nanomet và giám sát chính xác Đòi hỏi nhiệt độ, năng Oxi hóa dây đồng trong lò Kích thước 30 3 Oxi hóa nhiệt 400 – 600°C Thanh lượng cao và kiểm soát [38] nung – 100 nm áp suất, giá thành cao Hình cầu, kích Nhiệt độ cao, giá thành Đồng nitrate trong dung 4 Phun nhiệt phân 450°C Hạt thước 50 – 80 cao, bắt buộc kiểm soát [39] môi etanol nm chính xác nhiệt độ Nhiệt độ và Yêu cầu về thiết bị đặc Đồng II acetate với 1% Tinh thể, kích 5 Siêu âm hóa học áp suất cục Hạt trưng, cần có nguồn năng [40] dung môi aniline-nước thước nano bộ cao lượng bên ngoài Rượu benzyl độc, các Đồng acetate và dung dịch Đa tinh thể, vấn đề an toàn, khó mở 6 Bức xạ vi sóng rượu benzyl, tổng hợp Nhiệt độ cao Hạt kích thước ~ [41] rộng quy mô, giá thành nhanh 38 nm cao 2+ Khử dung dịch Cu trong Đường kính ~ Nhiệt độ Đòi hỏi kiểm soát pH (7 7 Khử catốt dung dịch polyme hoặc Dây 100 nm, chiều [42] phòng – 10) và nhiệt độ chất hoạt động bề mặt dài ⁓ 16 µm
11 1.2.3. Alginate chiết xuất từ rong nâu Khánh Hòa Alginate là muối của axit alginic, nó là loại polyme sinh học có trong rong biển. Rong biển Việt Nam rất đa dạng và phong phú, đã phát hiện gần 700 loại, trong đó họ rong biển Mơ (Sargassaceae) là phổ biến nhất, có sản lượng cao nhất. Họ rong biển Mơ thuộc bộ rong biển đuôi ngựa (Fucales), ngành rong nâu (Phaeophyceae) tập trung tại khu vực biển miền Trung Nam Bộ từ Bình Định vào đến Bình Thuận, sản lượng rong biển ước tính khoảng 30.000 – 40.000 tấn, trong đó vùng biển Khánh Hòa chiếm sản lượng trên 11.000 tấn [43]. Rong nâu là loài thực vật có giá trị cao về mặt dinh dưỡng, dược liệu bao gồm các axit amin, protein, axit béo không bão hòa, các vitamin, khoáng chất, polyphenol, các hợp chất chứa iốt, laminarin, axit alginic và fucoidan. Trong đó, hàm lượng axit alginic trong rong biển dao động từ 29,1 – 40,6% trên trọng lượng chất khô. Ngoài ra rong biển còn chứa các hoạt chất khác như auxin, axit gibberellic, cytokinin nên còn được dùng làm chất kích thích tăng trưởng thực vật an toàn, hiệu quả [44]. Axit alginic là một copolyme được cấu tạo từ các gốc β-D-mannuronate và α-L-Guluronate bằng liên kết 1,4 glucoside (hình 1.2). Hình 1.2. Đặc trưng cấu trúc của alginate: a) Các monome của axit alginic, b) Cấu trúc chuỗi, cấu trúc dạng ghế, c) Các kiểu phân bố các khối trong mạch alginate [45]