Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng phương pháp ELISA gián tiếp xác định dư lượng fluoroquinolone trong sữa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

=============***=============

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HẮC BÁ THÀNH

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG FLUOROQUINOLONE TRONG SỮA

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

=============***=============

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG FLUOROQUINOLONE TRONG SỮA

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Hóa sinh thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14 Ngƣờ i hƣớ ng dẫn khoa ho ̣c: TS. NGUYỄN THỊ DIỆU THÚY Học viên: HẮC BÁ THÀNH

Hà Nội - 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 3

MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… 7 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU……………………………………….. 9 1.1. Kháng sinh nhóm Fluoroquilone……………………………………………… 9 1.1.1. Nguồn gốc và sự phát triển của kháng sinh nhóm Fluoroquilone…………… 9 1.1.2. Phân loại và cơ chế tác dụng………………………………………………… 9 1.1.3. Cấu trúc, đặc điểm một số kháng sinh thuộc họ Fluoroquinolone…………. 12 1.1.4. Ngƣỡng giớ i ha ̣n cho phép ở mô ̣t số thƣ̣c phẩm…………………………… 18 1.2. Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kháng sinh nhóm Fluoroquilone……. 22 1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và sắc ký khối phổ (LC-MS)…... 22 1.2.2. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme - Linked Immuno sorbent Assay)………… 23 1.2.2.1. Nguyên lý phƣơng pháp ELISA…………………………………………. 24 1.2.2.2. Các phản ứng ELISA…………………………………………………….. 25 b. ELISA gián tiếp (indirect ELISA)……………………………………………... 26 c. ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)……………………………………….. 28 1.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp ELISA……………………………………………. 29 1.4. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi……………………………… 29 1.5. Tác hại của Fluoroquinolone tồn dƣ trong thực phẩm………………………. 30 1.6. Tác hại của Fluoroquinolone đến môi trƣờng……………………………….. 31 ng 1.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc sử dụng ELISA phát hiện dƣ lƣợ Fluoroquilone……………………………………………………………………... 32 1.5.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc………………………………………………… 32 1.5.2. Các nghiên cứu trong nƣớc………………………………………………… 34 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP………………………………… 36 2.1. Vật liệu nghiên cứu………………………………………………………….. 36 2.1.1. Dụng cụ, thiết bị……………………………………………………………. 36 2.1.2. Hoá chất……………………………………………………………………. 36 2.1.3. Các dung dịch đệm…………………………………………………………. 37 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………….. 38 2.2.1. Mục tiêu của nghiên cứu…………………………………………………… 38 2.2.2. Địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu………………………………………… 38

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 4

2.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………… 38 2.2.3.1. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………….. 38 a. Phƣơng pháp tổng hơ ̣p hapten gắn LEV vớ i OVA/BSA……………………….. 38 b. Phƣơng pháp ta ̣o kháng thể đa dòng kháng LEV trên thỏ…………………….. 40 c. Phƣơng pháp ELISA gián tiếp xác đi ̣nh dƣ lƣơ ̣ng LEV………………………... 41 2.2.3.2. Giới hạn phát hiện nồng độ và độ đặc hiệu của nghiên cứu…………….. .44 2.2.3.4. Đánh giá hiệu suất thu hồi của LEV khi gây nhiễm nhân tạo……………. 44 2.2.3.3. Chuẩn bị mẫu sữa………………………………………………………… 45 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………. 47 3.1. Các thông số phản ứng ELISA gián tiếp…………………………………….. 48 3.2. Kết quả phản ứng ELISA gián tiếp………………………………………….. 48 3.5. Đánh giá độ ổn định của phƣơng pháp………………………………………..55 3.6. Phản ứng ELISA để xác định dƣ lƣợng LEV trong sữa……………………… 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………………… 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 59

Bảng 1.1. Giới hạn tồn dƣ tối đa của các Quinolone theo Quyết định số 2377/90/EC của Ủy ban Châu Âu [16] ......................................................................................... 19 Bảng 3.1. Kết quả đo OD450 trên phiến ELISA ........................................................ 47 Bảng 3.2. Kết quả đo OD450 trên phiến ELISA ........................................................ 48 Bảng 3.3. Bảng kết quả hiệu suất thu hồi ................................................................. 53

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lƣợng LEV ở các mẫu sữa……………………54

Hình 1. Cấu trúc phân tử gốc Fluoroquinolone.......................................................... 8

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ

Hình 2. Cấu trúc phân tử Danofloxacin ................................................................... 11

Hình 3. Cấu trúc phân tử Difloxacin ........................................................................ 11

Hình 4. Cấu trúc phân tử Enrofloxacin .................................................................... 12

Hình 5. Cấu trúc phân tử Ibafloxacin ....................................................................... 13

Hình 6. Cấu trúc phân tử Marbofloxacin ................................................................. 13

Hình 7. Cấu trúc phân tử Orbifloxacin ..................................................................... 14

Hình 8. Cấu trúc phân tử Sarafloxacin ..................................................................... 14

Hình 9. Cấu trúc phân tử Levofloxacin .................................................................... 15

Hình 10. Sơ đồ các phản ứng ILISA……………………………………………..23

Hình 11. Sơ đồ phản ứng ELISA gián tiếp .............................................................. 25

Hình 12. Tổng hợp liên hợp của LEV với OVA (LEV - OVA) .............................. 38

Hình 13. Sơ đồ ELISA gián tiếp cạnh tranh ………………………….………...41

Hình 14. Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn ...................................................... 51

Hình 15. Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn…………………………………49

Hình 16. Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn đƣợc xây dựng từ đƣờng chuẩn

gốc....................................................................................................................50

Hình 17. Cấu trúc phân tử của Fluoroquinolone………………………………..51

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 5

Hình 18. Biểu đồ tỷ lệ phản ứng chéo của Fluoroquinolone…………………...52

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ELISA HPLC

GC-MS

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 6

OD TMB EU FAO WHO MRLs FDA PBST PBS SD HPRO QĐ TT - BNN Enzym - Link Immuno sorbent Assay High Pressure Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) Gas Chromatography/Mass Spetrometry (Sắc ký khí - khối phổ) Optical Density (Mật độ quang học) 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine Liên minh Châu Âu Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc Tổ chức y tế thế giới Maximum Residual Limit Food and Drug Administration Phosphate buffer saline Tween Phosphate buffer saline Standard deviation (độ lệch chuẩn) Horseradish peroxidase Quyết định Thông tƣ - Bộ nông nghiệp

MỞ ĐẦU

Fluoroquilone là mô ̣t trong nhƣ̃ng nhóm kháng sinh tổng hơ ̣p hoá ho ̣c , có tác

dụng diệt khuẩn rộng hiệu quả, có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn một cách

nhanh chóng nên kháng sinh nhóm Fluoroquilone ngày càng đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng nhiều trong phòng và điều trị bệnh trong chăn nuôi và thuỷ sản. Trƣớc thực trạng nguy cơ

và kiểm soát dịch bệnh chƣa thật nghiêm ngặt, dƣ lƣợng của loại kháng sinh này

thƣờng tìm thấy trong nhiều sản phẩm nông nghiệp nhƣ thịt, cá, trứng, sữa,...Trong

quá trình nuôi dƣỡng, nếu không tuân thủ về thời gian dùng thuốc và thời gian sản

xuất hoặc chế biến thì sẽ dẫn đến lƣợng Fluoroquilone còn lại trong thịt, sữa, gia

cầm và thủy sản...Việc lạm dụng kháng sinh Fluoroquilone trong phòng bệnh,

điều trị, kích thích sinh trƣởng hay bảo quản đối với ngành chăn nuôi dẫn đến sự

tồn dƣ kháng sinh trong chăn nuôi, vì thế ảnh hƣởng nghiêm trọng đến môi

trƣờng và sức khoẻ ngƣời tiêu dùng.

Điều này gây nhiều mối nguy hiểm, hiện tƣợng kháng thuốc của một số vi

khuẩn nhƣ: Salmonella, Campylobaccer spp, Escherichia coli,…hậu quả là giảm

hiệu quả của kháng sinh nói chung, kháng sinh dòng Fluoroquilone nói riêng đối

với các chủng vi khuẩn. Để bảo vệ ngƣời tiêu dùng ở châu Âu, tổ chức EU đã thiết

lập giới hạn lớn nhất (MRLs) đối với dƣ lƣợng thuốc kháng sinh trong nguồn thực

phẩm khi cung cấp cho con ngƣời vào năm 1990. Theo sự kiểm tra và định lƣợng

của các chuyên gia phòng thí nghiệm, EU đã công bố “Council directive 96/23/EU

in 1996” [12], trong đó quy định rõ hàm lƣợng kháng sinh theo từng loại thực phẩm

và từng loại thuốc, ví dụ nhƣ với Enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò, lợn, gia

cầm (gà, vịt) là 30 µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg; Ở châu Âu, Hoa kỳ và các

nƣớc Bắc Mỹ đã cấm sử dụng kháng sinh họ Fluoroquinolon.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 7

Tồn dƣ kháng sinh trong thƣ̣c phẩm ảnh hƣở ng xấu đến sƣ́ c khoẻ cô ̣ng đồng và môi trƣờng . Đây là mô ̣t trong nhƣ̃ng nguyên nhân gây nên các bê ̣nh nan y , tăng nguy cơ di ̣ ƣ́ ng, tăng khả năng xuất hiê ̣n cá c nguồn gen kháng thuốc ở các chủ ng vi

(thịt, thuỷ hải sản ,

sinh vâ ̣t gây bê ̣nh . Viê ̣c tồn dƣ kháng sinh trong thƣ̣c phẩm trƣ́ ng, sƣ̃a,…) là rất phổ biến ở nƣớc ta . Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế mà quan trọng hơn là ảnh hƣởng đến uy tín các sản phẩm nông nghiê ̣p nƣớ c ta, ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sƣ́ c khoẻ con ngƣờ i và môi trƣờng.

Đã nhiều phƣơng pháp phân tích đƣợc nghiên cứu nhằm phát hiện dƣ lƣợng

kháng sinh Fluoroquilone trong thực phẩm nhƣ HPLC, LC-MS, GC-MS, … với độ

chính xác cao, bên cạnh các đặc điểm ƣu việt, phƣơng pháp trên yêu cầu cao về

thiết bị, hóa chất, trình độ sử dụng. ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)

là phƣơng pháp miễn dịch dựa trên phản ứng đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể đã

có ứng dụng nhiều trong xác định dƣ lƣợng kháng sinh trong thực phẩm, môi

trƣờng, y học…

Mục đích của nghiên cứu này là dựa trên các kết quả nghiên cứu đã có chúng

lƣơ ̣ng kháng sinh

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 8

tôi xây dƣ̣ng phƣơng pháp ELISA gián tiếp xác đi ̣nh dƣ Levofloxacin trong sƣ̃a ở điều kiê ̣n phòng thí nghiê ̣m.

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU

1.1. Kháng sinh nhóm Fluoroquilone

1.1.1. Nguồn gốc và sự phát triển của kháng sinh nhóm Fluoroquilone

Quinolone (Flumequin, Norfloxacin, Enrofloxacin, Ciprofloxacin,

Difloxacin, Marbofloxacin, Ofloxacin...) là nhóm kháng sinh nhân tạo gồm những

dẫn xuất của quinolein. Quinolone đầu tiên (acid nalidixic) có phổ kháng khuẩn

hẹp (tác dụng trên vi khuẩn Gram âm). Kháng sinh đầu tiên trong nhóm là acid

nalidixic đƣợc phát hiện vào năm 1962, đƣợc phân lập nhƣ một tạp chất trong sản

xuất quinine sau đó một loạt các quinolon thế hệ I đƣợc tổng hợp nhƣ cinoxacin,

oxolinic, pipermidic…Trong cấu trúc không gian không có nhân piperidin và

không có nguyên tử Flour. Quinolon thế hệ I có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng trên

vi khuẩn gram âm (trừ Pseudomonas aeruginosa) [1,10]. Hiện nay quinolon thế hệ

I nhanh chóng bị kháng thuốc nên hạn chế đƣợc sử dụng [11].

Quinolone đƣợc fluor hóa gọi là Fluoroquinolone đã đƣợc đƣa vào sử dụng

trong lâm sàng vào những năm 1970. Fluoroquinolone có phổ kháng khuẩn rộng,

tác dụng trên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng. Kháng sinh nhóm này phân bố

đồng đều cả trong dịch nội và ngoại bào, phân bố hầu hết các cơ quan: Phổi, gan,

mật, xƣơng, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não tủy... và qua đƣợc hàng rào nhau thai.

Fluoroquinolone bài thải chủ yếu qua đƣờng tiết niệu ở dạng còn nguyên hoạt chất

và tái hấp thu thụ động ở thận.[1,2,10] do vậy nhóm Fluoroquilone đƣợc sử dụng

trong y học, chăn nuôi thú y, thủy sản…[10,11].

1.1.2. Phân loại và cơ chế tác dụng

Fluoroquilone là gốc thuốc kháng sinh hiệu quả, phổ rộng đƣợc sử dụng

nhiều và phổ biến cả ở ngƣời và động vật (trong chăn nuôi gia súc, gia cầm và thủy

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 9

sản…). Tuy nhiên tác dụng phụ của chúng đã đƣợc xác nhận. Sử dụng quá liều và

tồn dƣ các gốc thuốc này trong thực phẩm là vấn đề không chỉ ở nƣớc ta mà còn ở

nhiều nƣớc trên thế giới.

Fluroquinolone là một trong những nhóm kháng sinh tổng hợp hoá học có

khả năng khuếch tán tốt trong mô bào, nhanh chóng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn

thông qua sự ức chế tổng hợp ADN (Brown, 1996) do đó đƣợc sử dụng phổ biến

và hiệu quả trong thú y. Tuy nhiên, việc sử dụng nhóm kháng sinh này trong chăn

nuôi thú y và thuỷ sản có tác dụng xấu đến môi trƣờng và sức khoẻ cộng đồng

(WHO, 1998). Nhóm Fluroquinolones đƣợc sử dụng trong thú ý gồm các loại sau:

Danofloxacin (Advocin, Advocid), Difloxacin (Dicural,Vetequinon),

Enrofloxacin (Baytril), Ibafloxacin (Ibaflin), Marbofloxacin (Marbocyl, Zenequin),

Orbifloxacin (Orbax, Victas), Sarafloxacin (Floxasol, Saraflox, Sarafin).

Hình 1. Cấu trúc phân tử gốc Fluoroquinolone

Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolone là hợp chất vòng thơm có chứa

N, vị trí thứ 4 có gắn nhóm ketone, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic. Các dẫn xuất

của quinolone gồm những hợp chất mà: Vị trí: Có gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị

trí 6: Có thể gắn thêm F; vị trí 2,6,8 có thể gắn thêm một nguyên tử N [15].

Cơ chế tác động của Fluoroquinolone là ức chế tổng hợp acid nucleic. Gốc

quinolone (acid nalidixic và các Fluoroquinolone) ức chế mạnh sự tổng hợp DNA

trong giai đoạn nhân đôi do ức chế enzyme DNA gyrase. Cơ chế tác động này hiệu

quả trên cả vi khuẩn gram dƣơng và gram âm. Các quinolon đều ức chế tổng hợp

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 10

AND - gyrase, là enzym mở vòng xoắn AND, giúp cho sự sao chép và phiên mã, vì

vậy ngăn cản sự tổng hợp AND của vi khuẩn. Ngoài ra còn tác dụng trên cả ARNm

nên ức chế tổng hợp protein vi khuẩn. Các quinolon đều là kháng sinh diệt khuẩn [10].

Quinolon thế hệ 1: Acid nalidixic, acid oxolinic, cinocacin, flumequin, acid

pipemidic, acid promidic…Quinolon thế hệ 1 chỉ ức chế AND- gyrase nên chỉ có

tác dụng diệt vi khuẩn gram âm đƣờng tiết niệu và đƣờng tiêu hóa, không có tác

dụng trên trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) [10,11].

Các Fluoroquinolon có tác dụng trên 2 enzym đích là AND gyrase và

topoisomerase IV của vi khuẩn, nên phổ kháng khuẩn rộng hơn. Hoạt tính kháng

khuẩn mạnh so với quinolon thế hệ 1 từ 10 - 30 lần [10]. Phổ kháng khuẩn của các

Fluoroquinolon gồm: E. coli, Salmonela, Shigella, Enterobacter, Neisseria spp, P.

aeruginosa, Eterococi, Enterococcus faecalis, Klebsiella spp, Proteus mirabilis,

Morganella morgani, Morganella catarrhalis, Haemophilus fluenzae, Bacteroides

fragilis, Streptococus pneumonia, Streptococcus aureus kể cả loại đã kháng

methicilin. Các vi khuẩn trong tế bào cũng bị ức chế bởi nồng độ Fluoroquinolon

trong huyết tƣơng nhƣ Chlamydia, Mycoplasma, Brucella, Mycobacterium [10].

Quinolon thế hệ 2: Rosoxacin, Norfloxacin, Lomefloxacin, Ofloxacin,

Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Enoxacin, có khác tƣơng đối về tác động gyrase và

topoisomerase IV: Trên vi khuẩn gram âm hiệu lực kháng gyrase mạnh hơn, còn

trên vi khuẩn gram dƣơng lại có hiệu lực kháng topoisomerase IV mạnh hơn thế hệ

1, đặc biệt là chúng có tác dụng trên Pseudomonas aeruginosa có tác dụng nhanh

và mạnh hơn do khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn cao hơn. Ngoài gram âm

chúng còn tác dụng trên cả gram dƣơng, trừ Pseudomonas aeruginosa [3,10,11].

Quinolon thế hệ 3: Amifloxacin, Levofloxacin, Lerofloxacin, Pefloxacin,

Rufloxacin, Sparfloxacin, Temafloxacin, Tosufloxacin tác động cân bằng trên 2

enzym, vì vậy phổ kháng khuẩn phổ rộng trên gram dƣơng kể cả Streptococus

pneuminiae nhƣng trên Pseudomonas aeruginosa tác dụng yếu hơn so với

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 11

Ciprofloxacin.

Quinolon thế hệ 4: Moxifloxacin, Trovafloxacin, phổ tác dụng trên tất cả các

loại vi khuẩn gram âm và gram dƣơng hiếu khí, trên Streptococus pneuminiae tác

dụng gấp 10 lần so với Ciprofloxacin và mạnh gấp 2 lần so với Sparfloxacin [10],

ngoài ra tất cả các kháng sinh trong nhóm còn có tác dụng trên vi khuẩn kỵ khí.

Riêng moxifloxacin nhạy cảm trở lại với các vi khuẩn kháng với các kháng sinh

nhóm quinolon [10,13,14].

Nhƣng cũng có thể do cơ chế ức chế tổng hợp acidnucleic này mà kháng sinh

nhóm Fluoroquinolone đƣợc cho là có nguy cơ gây đột biến gene, gây sẩy thai khi

sử dụng cho động vật mang thai và khuyến cáo là không nên sử dụng kháng sinh

nhóm Fluoroquinolone cho động vật mang thai, động vật sinh sản và làm giống.

Ngoài ra, sử dụng kháng sinh nhóm Fluoroquinolone có thể gây rối loạn phát triển

xƣơng. Nguyên nhân có thể do kháng sinh nhóm Fluoroquinolone có phản ứng các ion hóa trị II (Mg2+). Nghiên cứu của Jason et al. (2009) trên cừu non đã cho thấy

kháng sinh nhóm Fluoroquinolone đã gây tác động lớn, làm cho hệ xƣơng, sụn hầu

nhƣ không phát triển trong thời gian sử dụng kháng sinh nhóm này. Trƣớc đây, đã

có các nghiên cứu về việc ảnh hƣởng đến sự phát triển xƣơng, sụn của thú non

(chó, cừu) khi sử dụng kháng sinh nhóm Fluoroquinolone nhƣng do hiệu quả điều

trị và mức độ cần thiết của các kháng sinh nhóm kháng sinh này mà ngƣời ta đã bỏ

qua tác hại của nó. Bên cạnh đó, sự tồn lƣu thời gian dài sau khi sử dụng thuốc

kháng sinh nhóm Fluoroquinolone cũng là nguyên nhân dẫn đến việc hạn chế và

cấm sử dụng những kháng sinh thuộc nhóm này.

1.1.3. Cấu trúc, đặc điểm một số kháng sinh thuộc họ Fluoroquinolone

- Danofloxacin:

+ Tên khoa học: (1S)-1-Cyclopropyl-6-fluoro-1,4-dihydro-7-(5-methyl-2,5-

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 12

diazabicyclo[2.2.1]hept-2-yl)-4-oxo-3-quinoline cacboxylic axit methanesulphonate.

Hình 2. Cấu trúc phân tử Danofloxacin

+ Công thức phân tử: Danofloxacin - C19H20O3FN3 + Trọng lƣợng phân tử: 357,39 g/mol.

+ Nhiệt độ sôi: Danofloxacin 263°C.

+ Danofloxacin là một Fluoroquinolone tổng hợp với phổ rộng hoạt tính

kháng khuẩn. Nó đƣợc sử dụng trong điều trị các bệnh đƣờng hô hấp ở gà, trâu, bò

và lợn. Danofloxacin không có ý định để sử dụng trong chăn nuôi bò sữa sản xuất

sữa cho con ngƣời và không ở gà mái đẻ [15].

- Difloxacin:

+ Tên khoa học: 6-fluoro-1-(4-fluorophenyl)-7-(4-methylpiperazin-1-yl)-4-

oxoquinoline-3-carboxylic acid.

Hình 3. Cấu trúc phân tử Difloxacin

+ Công thức hóa học: C21H19F2N3O3.

+ Trọng lƣợng phân tử: 399 g/mol.

+ Difloxacin ức chế men gyrase DNA của vi khuẩn và các enzyme

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 13

topoisomerase II, ức chế sự sao chép AND và phiên mã, tác dụng trên vi khuẩn

gram âm và gram dƣơng. Difloxacin là một kháng sinh fluoroquinolone thƣờng

đƣợc sử dụng trong y học và thú y [15].

- Enrofloxacin:

Enrofloxacin là kháng sing thuộc nhóm Fluoroquinolone, loại PQ, có thể

chống vi khuẩn gram dƣơng và gram âm.

+ Tên khoa học: 1 - Cyclopropul - 7- (4 - ethylpiperazin-1-yl) - 6 fluoro - 1,4

- dihydro - 4 - oxo - 3 - quinolinecarboxylic acid.

Hình 4. Cấu trúc phân tử Enrofloxacin

+ Công thức hóa học: C19H22FN3O3

+ Trọng lƣợng phân tử: 359,4 g/mol + Nhiệt độ nóng chảy: 219 - 221oC

+ Tính chất: Là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nƣớc ở pH =

7, có hai giá trị pKa: Khoảng 5 và 8 - 9.

+ Enrofloxacin đƣợc đƣa vào gia súc, gia cầm dƣới dạng nguyên liệu thức ăn

chăn nuôi, hoặc do ngƣời chăn nuôi trộn vào thức ăn, hoặc vào môi trƣờng sống

của các loài thủy sản [15].

- Ibafloxacin:

+ Tên khoa học: 6,7-dihydro-5,8-dimethyl-9-fluoro-1-oxo-1H, 5H-benzo (i,j)

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 14

axit quinolizine-2-carboxylic.

Hình 5. Cấu trúc phân tử Ibafloxacin

+ Công thức hóa học: C15H14FNO3

+ Trọng lƣợng phân tử: 275 g/mol + Ibafloxacin là một kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolone, hoạt động bằng cách ngăn chặn một enzyme DNA gyrase, enzyme này chỉ đƣợc tìm thấy trong các tế bào của vi khuẩn, và không có một chức năng tƣơng tự trong tế bào động vật. Bằng cách ngăn chặn gyrase DNA và ngăn chặn tạo ra các protein phát triển [15].

- Marbofloxacin:

+ Tên khoa học: 9-fluoro-2,3-dihydro-3-methyl-10-(4-methyl-1-piperazinyl)-

7-oxo-7H pyridol (3,2,1-ij)(4,2,1) benzoxadiazin-6 axit carboxylic.

Hình 6. Cấu trúc phân tử Marbofloxacin

+ Công thức hóa học: C17H19FN4O4

+ Trọng lƣợng phân tử: 362,356 g/mol.

+ Ibafloxacin là một kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolone, làm suy yếu

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 15

các vi khuẩn gyrase DNA [15].

- Orbifloxacin:

+ Tên khoa học: 1-Cyclopropyl-7-[(3s, 5r-3,5-dimethylpiperazin-1-yl]-5,6,8-

trifluoro-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxylic acid.

Hình 7. Cấu trúc phân tử Orbifloxacin

+ Công thức hóa học: C19H20F3N3O3

+ Trọng lƣợng phân tử: 395,37 g/mol.

+ Orbifloxacin là diệt khuẩn chống lại một loạt các vi khuẩn gram âm và

gram dƣơng và có tác dụng hữu kháng khuẩn của nó thông qua sự can thiệp với các

enzyme của vi khuẩn DNA gyrase đó là cần thiết cho việc duy trì và tổng hợp DNA

của vi khuẩn [15].

- Sarafloxacin:

+Tên khoa học: 6-fluoro-1-(4-fluorophenyl)-4-oxo-7-piperazin-1ylquinoline-

3-carboxylic acid.

Hình 8. Cấu trúc phân tử Sarafloxacin + Công thức hóa học: C20H17F2N3O3

+ Trọng lƣợng phân tử: 385,36 g/mol.

+ Sarafloxacin là một kháng sinh Fluoroquinolone hoạt động bằng cách ức

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 16

chế các vi khuẩn DNA-topoisomerase II. Nó đã đƣợc đề xuất để sử dụng trong

nƣớc uống của gia cầm để điều trị vi khuẩn bệnh, và trong thức ăn cá để điều trị các

bệnh nhƣ nhọt, vibriosis và redmouth ruột [15].

- Levofloxacin:

+ Tên khoa học: (S)-9-fluoro-2,3-dihydro-3-methyl-10-(4-methylpiperazin-

1-yl)-7-oxo-7H-pyrido [1,2,3-de]-1,4-benzoxazine-6-carboxylic acid.

Hình 9. Cấu trúc phân tử Levofloxacin

+ Công thức hóa học: C18H20FN3O4.

+ Trọng lƣợng phân tử: 361,368 g/mol.

+ Cơ chế tác dụng của Levofloxacin là ức chế tổng hợp acid nucleic.

Levofloxacin có tác dụng diệt khuẩn do gắn với topoisomerase II của vi khuẩn

(AND - gyrase) và topoisomerase IV là những enzyme thiết yếu của vi khuẩn tham

gia xúc tác trong quá trình sao chép, phiên mã và sửa AND của vi khuẩn nên làm

mất hoạt tính enzyme. Do không có khả năng mở vòng xoắn để thực hiện việc sao

chép mã di truyền nên vi khuẩn bị tiêu diệt.

Levofloxacin là đồng phân L - isome của Ofloxacin, nó có tác dụng diệt

khuẩn mạnh gấp 8 - 128 lần so với đồng phân D - isome và mạnh gấp 2 lần so với

Ofloxacin racemic. Levofloxacin, cũng nhƣ các Fluoroquinolon khác là kháng sinh

phổ rộng có tác dụng trên nhiều vi khuẩn kỵ khí tốt hơn các Fluoroquinolon khác,

tuy nhiên tác dụng invitro trên Pseudomonas aeruginosa lại yếu hơn so với

Ciprofloxacin.

Sau khi dùng, levofloxacin đƣợc hấp thu nhanh và gần nhƣ hoàn toàn; nồng

độ đỉnh trong huyết tƣơng thƣờng đạt đƣợc sau 1 - 2 giờ; sinh khả dụng tuyệt đối

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 17

xấp xỉ 99%. Các thông số dƣợc động học của levofloxacin sau khi dùng đƣờng tĩnh

mạch và đƣờng uống với liều lƣợng tƣơng đƣơng và gần nhƣ nhau, do đó có thể sử

dụng hai đƣờng này thay thế cho nhau. Khoảng 30 - 40% Levofloxacin gắn với các

protein huyết tƣơng, trong vòng 3 ngày. Levofloxacin phân bố rộng rãi trong cơ

thể, kháng sinh thâm nhập tốt vào niêm mạc phế quản, phổi và dịch lót biểu mô hô

hấp, dịch bọng nƣớc ở da, tuyến tiền liệt và đạt nồng độ cao trong nƣớc tiểu, tuy

nhiên thuốc khó thấm vào dịch não tủy. Tỷ lệ gắn protein huyết tƣơng là 30 - 40%.

Levofloxacin rất ít chuyển hóa trong cơ thể và thải trừ qua nƣớc tiểu ở dạng còn

nguyên hoạt tính, chỉ dƣới 5% liều điều trị đƣợc tìm thấy trong nƣớc tiểu dƣới dạng

chất chuyển hóa desmathyl và N - oxid, các chất chuyển hóa này có rất ít hoạt tính

sinh học. Thời gian bán thải của Levofloxacin từ 6 - 8 giờ, kéo dài ở ngƣời bệnh

suy thận [4,13,14].

1.1.4. Ngƣỡng giớ i ha ̣n cho phép ở mô ̣t số thƣ̣c phẩ m

Ở Mỹ, cơ quan quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm của Mỹ (FDA: Food and

Drug Administration) đã không chấp nhận sự tồn lƣu kháng sinh nhóm

Fluoroquinolone trong sản phẩm thủy sản nhập khẩu. Ở châu Âu, EU đã thiết lập

giới hạn lớn nhất (MRLs - Maximum Residual Limit) đối với dƣ lƣợng thuốc trong

thực phẩm cung cấp cho con ngƣời vào những năm 1990. Trong “Council directive

96/23/EC in 1996” đã quy định rõ là Enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò, lợn,

gia cầm (gà, vịt) là 30 µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg. Ủy ban thực phẩm

CODEX thành lập bởi FAO và WHO đã quy định MRL đối với Danofloxacin và

Sarafloxacin dùng trong thú y ở các loại thịt, gan lợn, bò và gà tƣơng ứng trong

khoảng là 50 - 400 µg/kg và 10 - 80 µg/kg.

Trong Liên minh châu Âu, giới hạn dƣ lƣợng tối đa (MRL) của kháng sinh

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 18

trong sữa bột nhƣ benzylpenicillin, ampicillin, amoxicillin là 4 mg/kg.

Bảng 1.1. Giới hạn tồn dƣ tối đa của các Quinolone theo Quyết định số 2377/90/EC của Ủy ban Châu Âu [16]

Hoạt tính Loài Cơ quan Định lƣợng chất tồn dƣ

Danofloxacin Danofloxacin

Bò, cừu, dê, lợn Gia cầm Các loài khác

Difoxacin Difoxacin

Bò, cừu, dê Lợn Gia cầm Các loài khác

Enrofloxacin

Tổng của Enrofloxacin và Ciprofloxacin

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 19

Bò, cừu, dê Lợn, thỏ Thịt Mỡ Gan Thận Sữa Da và mỡ Gan Thận Thịt Mỡ Gan Thận Thịt Mỡ Gan Thận Thịt Da và mỡ Gan Thận Thịt Da và mỡ Gan Thận Thịt Da Gan Thận Thịt Mỡ Gan Thận Thịt Mỡ Gan Thận Giới hạn tồn dƣ tối đa (MRL) (µg/kg) 200 100 400 400 30 100 400 400 100 50 200 200 400 100 1400 800 400 100 800 800 300 400 1900 600 300 100 800 600 100 100 300 200 100 100 200 300

Gia cầm Các loài khác

Flumequin Flumequin

Bò, cừu, dê, lợn Gia cầm Cá thu khác

Sarafloxacin Sarafloxacin

Gà Cá hồi Bò, cừu, dê Thịt Mỡ Gan Thận Thịt Mỡ Gan Thận Thịt Mỡ Gan Thận Sữa Thịt Mỡ Gan Thận Da và thịt Thịt Mỡ Gan Thận Da và mỡ Gan Da và Thịt Sữa 100 100 200 300 100 100 200 200 200 300 500 1500 50 400 250 800 1000 200 200 250 500 1000 10 100 30 100 Levofloxacin

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 20

Fluroquinolone

Ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về sự tồn dƣ kháng sinh nhóm

Fluoroquinolone trong thực phẩm nói chung và sản phẩm thủy sản nói riêng (Trần

Minh Phú et al., 2008; Phạm Minh Đăng et al., 2008…). Theo Trần Minh Phú et al.

(2008), bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng đã xác định sự tồn lƣu của Enrofloxacin

trong thịt của cá tra nuôi. Cụ thể là cá ăn thức ăn có Enrofloxacin với hàm lƣợng

10,6 mg/kg thức ăn trong 7 ngày, tồn dƣ kháng sinh trong cá là 2.796 ± 482 µg/kg.

Sau 60 ngày ngừng cho ăn kháng sinh, tồn dƣ kháng sinh trong cá là 97,9 ± 66,5

µg/kg, cao hơn quy định của châu Âu. Nhƣ vậy, có thể nói kháng sinh Enrofloxacin

có sự tồn lƣu lớn, lâu sau khi sử dụng và ảnh hƣởng không tốt đến nguồn thực

phẩm của chúng ta [5].

Bộ thủy sản đã ra Quyết định 07/2005/QĐ-BTS ban hành ngày 24/02/2005

quy định danh mục 17 kháng sinh cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế sử

dụng, trong đó có nhóm Fluoroquinolone và Quyết định 26/2005/QĐ-BTS ban

hành ngày 18/08/2005 bổ sung nhóm kháng sinh Fluoroquinolone cấm sử dụng

trong sản xuất, kinh doanh thủy sản xuất khẩu vào thị trƣờng Mỹ và Bắc Mỹ. Các

Quyết định này đƣợc thay thế bởi Thông tƣ số 15/2009/TT-BNN ban hành ngày

17/03/2009 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, quy định danh mục thuốc,

hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng và hạn chế sử dụng. Fluoroquinolone vẫn bị cấm

sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản xuất khẩu vào thị trƣờng Mỹ và Bắc

Mỹ. Các kháng sinh Enrofloxacin, Ciprofloxacin, Ofloxacin bị cấm sử dụng trong

thú y. Một số kháng sinh quinolone nằm trong danh mục kháng sinh hạn chế sử

dụng trong sản xuất kinh doanh thủy sản.

Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã ra Quyết định số 3074/QĐ-

BNN-KHCN ngày 11/12/2012 về việc chỉ định phòng thử nghiệm ngành nông

nghiệp và phát triển nông thôn đã quy định xác định họ Fluoroquinolone bằng

phƣơng pháp LC/MS/MS trong thực phẩm và thủy sản với giới hạn phát hiện (nếu

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 21

có)/phạm vi đo là: 0,6 µg/kg.

1.2. Các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng kháng sinh nhóm Fluoroquilone

1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và sắc ký khối phổ (LC-MS)

Sắc ký lỏng cao áp: Quá trình tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận

chuyển và phân bố của các chất tan giữa hai pha khác nhau (pha động, pha tĩnh). Dung

dịch các chất phân tích khi vào cột sẽ đƣợc hấp thụ hay liên kết với pha tĩnh thùy

thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi pha động dịch chuyển với

một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lƣu giữ ra khỏi cột.

Tùy theo bản chất của pha tĩnh, bản chất của chất tan, bản chất của dung môi mà quá

trình rửa tách đƣợc các chất ra khỏi nhau. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đƣợc phát

hiện bởi detector và đƣợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đƣợc đƣa ra

máy in hoặc hiển thị trên màn hình. Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều

thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic. Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có

bao nhiêu thành phần thì sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt trên sắc đồ [7,8].

Phƣơng pháp sắc ký:

+ Là phƣơng pháp tách dành cho hỗn hợp mẫu.

+ Nhận dạng các mẫu dựa trên thời gian lƣu.

+ Cho phép phân tích định tính và định lƣợng.

+ Phân lập và tinh chế chất.

Sắc ký khối phổ: Phƣơng pháp phổ khối lƣợng là một trong những phƣơng

pháp phân tích công cụ quan trọng. Phổ khối lƣợng cung cấp các thông tin về phân

tích định tính, định lƣợng các nguyên tố, thành phần và cấu trúc của các hợp chất vơ

cơ và hữu cơ. Cơ sở của phƣơng pháp phổ khối lƣợng đối với các hợp chất hữu cơ là

sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa thành ion phân tử mang điện tích

dƣơng hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc theo sơ đồ sau bằng các phần tử

mang năng lƣợng cao.

Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại các ion mang

điện tích +2 hoặc ion âm, năng lƣợng bắn phá các phân tử thành ion phân tử khoảng

10ev, nhƣng với năng lƣợng cao thì ion phân tử có thể phá vỡ thành mảnh ion

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 22

dƣơng, hoặc các ion gốc, các gốc hoặc các phân tử trung hòa nhỏ hơn.

Sự bắn phá này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phƣơng pháp bắn phá và năng

lƣợng bắn phá. Quá trình này gọi là quá trình ion hóa. Ion phân tử và các ion mảnh là

các phần từ có khối lƣợng, nếu gọi khối lƣợng của một ion là m và điện tích của nó

là e thì tỷ lệ z = m/e đƣợc gọi là số khối, hiển nhiên các ion có khối lƣợng là m, 2m,

3m,…và điện tích tƣơng ứng bằng e, 2e, 3e,…có số khối z bằng nhau, ion phân tử

có số khối ký hiệu là M+.

Phƣơng pháp phổ khối lƣợng:

+ Là phƣơng pháp nhận dạng các lƣợng mẫu nhỏ.

+ Cung cấp phổ khối lƣợng của các hỗn hợp phức tạp

Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) và sắc ký khối phổ (LC - MS) đƣợc

sử dụng phổ biến trong phân tích dƣ lƣơ ̣ng . Mặc dù những phƣơng pháp này có độ

nhạy cao, phát hiện một cách có chọn lọc, song những thiết bị HPLC và LC - MS

rất phức tạp, tốn kém khi vận hành và đòi hỏi một lƣợng mẫu lớn và sạch. Ngoài ra,

giá thành cao và số lƣợng mẫu đƣợc phân tích ít làm cho chúng trở nên không phù

hợp với việc phân tích định lƣợng hàng ngày mà nhu cầu an toàn thực phẩm của

công chúng đòi hỏi [7,8].

1.2.2. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme - Linked Immuno sorbent Assay)

Enzyme - linked immunosorbent assay, hay còn gọi là ELISA,

enzymeimmunoassay hay EIA là kỹ thuật chẩn đoán dựa trên miễn dịch học rất phổ

biến trong rất nhiều lĩnh vực, từ y học, y dƣợc, thú y, sinh học, kiểm định thực

phẩm, môi trƣờng v.v…ELISA phổ biến rộng rãi nhờ vào những đặc tính có lợi cho

thực nghiệm của nó: Dễ thực hiện, tốc độ nhanh, chi phí thấp, dễ sản xuất, an toàn

với độ nhạy và độ đặc hiệu chấp nhận đƣợc.

Tiền thân của ELISA là kỹ thuật miễn dịch học phóng xạ (radioimmunoassay

- RIA), đƣợc phát triển bởi Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Aaron Berson

(xuất bản lần đầu tiên năm 1960; Nobel y học cho Rosalyn S. Yalow năm 1977).

Mặc dù phƣơng pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, tuy nhiên việc đánh

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 23

đấu bằng phóng xạ yêu cầu kỹ thuật cao, phức tạp, tốn kém, cũng nhƣ việc sử dụng

phải vô cùng cẩn thận vì khả năng gây nguy hiểm của phóng xạ đã đƣa đến nhu cầu

tìm kiếm các phƣơng pháp cải tiến thay thế. Để thay cho việc sử dụng chất đánh

dấu phóng xạ, ngƣời ta đã sử dụng kỹ thuật liên kết kháng nguyên hoặc kháng thể

với một enzyme (enzyme - linked) có khả năng thực hiện một phản ứng nhận biết

(ví dụ nhƣ gây đổi màu một chất). Quy trình liên kết enzyme đƣợc phát triển độc

lập bởi Stratis Avrameas và G.B. Pierce. Bên cạnh đó, việc cần phải loại bỏ các

kháng nguyên/kháng thể thứ cấp không gắn dẫn tới kỹ thuật cố định các kháng

nguyên/kháng thể sơ cấp (immunosorbent) đƣợc công bố bởi Wide và Jerker Porath

năm 1966. Năm 1971, hai nhóm nghiên cứu Peter Perlmann và Eva Engvall cùng

với Anton Schuurs và Bauke van Weemen đã độc lập công bố các bài báo tổng hợp

các kỹ thuật trên thành ELISA [17,18,19,20].

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần chính tham gia phản ứng là: Kháng

nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua các bƣớc:

Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể.

Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng

oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu

của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.

1.2.2.1. Nguyên lý phƣơng pháp ELISA

Theo nguyên lý cơ bản của miễn dịch học, mỗi một kháng nguyên (antigen)

có nhiều yếu tố kháng nguyên (epitope), mỗi một epitope có khả năng kết hợp với

một kháng thể (antibody) tƣơng ứng với nó. Hầu hết các kháng nguyên đều có một

hoặc vài epitope đặc trƣng cho nó, dựa trên đó mà ngƣời ta có thể xác định đƣợc

kháng nguyên. Bên cạnh đó, sự xuất hiện của kháng nguyên trong cơ thể trong một

số trƣờng hợp có khả năng kích thích cơ thể tạo ra kháng thể đơn dòng đặc hiệu để

chống lại kháng nguyên đó. Thông qua việc xác định kháng thể này ngƣời ta cũng

có thể gián tiếp xác định kháng nguyên trong cơ thể.

Dựa trên cơ sở đó, kỹ thuật ELISA đƣợc thiết lập nhằm chẩn đoán sự hiện

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 24

diện của một kháng nguyên hay kháng thể. Để xác định một yếu tố cần chẩn đoán

(kháng nguyên/kháng thể) ngƣời ta sử dụng một hoặc nhiều yếu tố phát hiện

(kháng thể/kháng nguyên/bổ thể) có phản ứng miễn dịch đặc hiệu với yếu tố cần

chẩn đoán. Các yếu tố phát hiện này đƣợc đánh dấu bằng enzyme sao cho phản ứng

miễn dịch với yếu tố cần chẩn đoán sẽ tạo nên sự thay đổi có thể nhận biết đƣợc

bằng mắtthƣờng hay thậm chí định lƣợng đƣợc bằng các công cụ so màu khác khi

cho cơ chất của enzyme đánh dấu vào.[17,18,19,20].

1.2.2.2. Các phản ứng ELISA

Phƣơng pháp ELISA đơn giản, nhƣng về hiệu quả của phƣơng pháp nhƣ độ

nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện cho đến về thực nghiệm nhƣ thời gian thực hiện,

độ phức tạp, chi phí cũng nhƣ khả năng hệ thống hóa thành bộ dụng cụ (KIT) để sản

xuất công nghiệp. Chính vì vậy, ngƣời ta đã không ngừng cải tiến phƣơng pháp này,

đƣa ra nhiều phƣơng pháp mới phù hợp với từng điều kiện, từng đối tƣợng khác nhau.

Cho đến nay, đã có rất nhiều biến thể của phƣơng pháp ELISA. Tuy nhiên nhìn chung,

tất cả các biến thể này có thể đƣợc phân loại nhƣ sau:

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 25

Hình 10. Sơ đồ các phản ứng ELISA

a. ELISA trực tiếp (direct ELISA)

Phƣơng pháp này ít đƣợc sử dụng trong ELISA định lƣợng mà thƣờng đƣợc

sử dụng cho ELISA định tính. Yếu tố cần chẩn đoán (ví dụ nhƣ kháng nguyên)

đƣợc cố định trực tiếp lên một bề mặt rắn và sau đó đƣợc xác định sự hiện diện

bằng yếu tố phát hiện.

Phƣơng pháp này có ƣu điểm là chỉ cần một lần ủ do đó tiết kiệm thời gian

và tối thiểu đƣợc việc kiểm soát các điều kiện trong quá trình thực hiện (thay đổi

nhiệt độ và buffer cho mỗi lần ủ, tính thời gian…). Tuy nhiên, nhƣợc điểm của nó

là nhuộm màu nền (background staining) cao do sự liên kết không đặc hiệu của

kháng thể với bề mặt rắn và các protein cố định trên bề mặt rắn. Việc đánh dấu

từng loại kháng thể sử dụng cho mỗi kháng nguyên cũng khá tốn kém, nhất là khi

phải chẩn đoán một số lƣợng lớn các loại kháng nguyên khác nhau. Ngoài ra,

phƣơng pháp này cũng có giới hạn phát hiện cao và cần một lƣợng lớn các yếu tố

cần chẩn đoán do sự liên kết kém hiệu quả của yếu tố này lên bề mặt rắn cũng nhƣ

sự cạnh tranh của các protein khác trong quá trình phản ứng miễn dịch.

b. ELISA gián tiếp (indirect ELISA)

Phƣơng pháp ELISA gián tiếp tƣơng tự nhƣ ELISA trực tiếp, nhƣng ở đây

ngƣời ta sử dụng tới hai lớp yếu tố phát hiện, và chỉ có lớp yếu tố phát hiện cuối

cùng mới mang enzyme.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 26

Sơ đồ phƣơng pháp gồm những bƣớc nhƣ sau:

Hình 11. Sơ đồ phản ứng ELISA gián tiếp

Phƣơng pháp này là chỉ cần tạo một loại kháng kháng thể mang enzyme để

nhận biết cho nhiều kháng nguyên khác nhau. Kháng thể sơ cấp cũng là những

protein và cũng mang những epitope của riêng nó. Nếu nhiều loại kháng thể khác

nhau đƣợc sản xuất từ cùng một loài sinh vật, tất cả các loại kháng thể này đều

mang những epitope chung đặc trƣng cho loài đó. Việc sản xuất một kháng kháng

thể có khả năng liên kết với epitope đó là hoàn toàn có thể, thông qua việc tiêm các

kháng thể trên vào một loài sinh vật khác. Phƣơng pháp này cũng cho giới hạn phát

hiện thấp hơn khoảng 10 lần so với ELISA trực tiếp, do khả năng liên kết nhiều

kháng kháng thể lên một phân tử kháng thể sơ cấp, làm tăng số lƣợng enzyme đƣợc

cố định. Tuy nhiên nhƣợc điểm của nó là tăng số bƣớc thực hiện do đó làm tăng

việc kiểm soát các điều kiện quá trình và kéo dài thời gian chẩn đoán. Nhằm tăng

khả năng phát hiện, ngƣời ta có thể sử dụng kỹ thuật nối cầu (brigde) bổ trợ cho

ELISA gián tiếp. Về nguyên tắc, kỹ thuật brigde cũng tƣơng tự nhƣ ELISA gián

tiếp, nhƣng ở đây sử dụng nhiều lớp yếu tố phát hiện hơn (trên hai lớp). Qua mỗi

lớp yếu tố phát hiện, tín hiệu lại đƣợc khuếch đại lên vài lần. Tuy nhiên cần lƣu ý là

càng nhiều lớp yếu tố phát hiện, số bƣớc thực hiện càng nhiều và sẽ kéo dài thời

gian, tăng thêm việc kiểm soát điều kiện cho từng quá trình, cũng nhƣ tăng khả

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 27

năng liên kết chéo giữa các yếu tố phát hiện với nhau.

c. ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)

ELISA cạnh tranh là phƣơng pháp ELISA rất hiệu quả cho định lƣợng các

yếu tố hiện diện trong mẫu với lƣợng nhỏ. ELISA cạnh tranh sử dụng một lƣợng

kháng nguyên cùng loại với kháng nguyên mà ta muốn định lƣợng trong mẫu

(kháng nguyên cạnh tranh) cho phản ứng miễn dịch với cùng một loại kháng thể

đặc hiệu cố định trên mặt rắn, sau đó đo lƣợng kháng nguyên cạnh tranh này thông

qua hoạt tính enzyme đƣợc liên kết với nó. Kháng nguyên cạnh tranh càng hiện

diện nhiều cho biết loại kháng nguyên đó trong mẫu càng ít và ngƣợc lại. Có ba

biến thể chính của phƣơng pháp này:

Phƣơng pháp bão hòa cân bằng tƣơng đối: Trong phƣơng pháp này kháng

nguyên mẫu (Ag) và kháng nguyên cạnh tranh (Agc) đƣợc cho phản ứng cùng lúc

với một kháng thể đƣợc cố định. Hai loại kháng nguyên sẽ phản ứng miễn dịch với

Ab theo một tỉ lệ tƣơng ứng với tỉ lệ nồng độ giữa hai loại kháng nguyên, từ đó có

thể xác định đƣợc nồng độ Ag khi đo tỉ lệ Agc còn lại sau phản ứng với lƣợng Agc

sử dụng ban đầu. Cần lƣu ý là lƣợng kháng nguyên cạnh tranh phải đƣợc biết trƣớc và phải dƣ để có thể bão hòa hết lƣợng kháng thể.

Phƣơng pháp bão hòa thứ tự: Phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng hơn

bão hòa cân bằng tƣơng đối. Khác với phƣơng pháp trên, với bão hòa thứ tự kháng

nguyên mẫu đƣợc cho phản ứng trƣớc. Sau đó, một lƣợng dƣ kháng nguyên cạnh

tranh đƣợc thêm vào để bão hòa lƣợng kháng thể còn trống. Hoạt tính enzyme đo

đƣợc sẽ cho biết lƣợng Agc phản ứng với kháng thể còn trống, từ đó tính đƣợc

lƣợng Ag đã chiếm chỗ kháng thể. Trong phƣơng pháp này, lƣợng Agc ban đầu không cần phải biết trƣớc, tuy nhiên vẫn cần phải dƣ để bão hòa lƣợng kháng thể

còn lại. Một biến thể của phƣơng pháp này đó là kháng thể Ab không đƣợc cố định

trƣớc, mà sau khi phản ứng lần lƣợt với kháng nguyên mẫu Ag và kháng nguyên

cạnh tranh Agc sẽ đƣợc cố định lại bằng cách phản ứng với kháng kháng thể AAb

đƣợc cố định trên mặt rắn.

Phƣơng pháp ức chế kháng thể (antibodies inhibition): Thay vì cố định

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 28

kháng thể lên mặt rắn, ngƣời ta cũng có thể cố định kháng nguyên cạnh tranh. Đầu

tiên, ngƣời ta sẽ cho kháng nguyên mẫu phản ứng với một lƣợng kháng thể biết

trƣớc. Sau đó, lƣợng kháng thể còn lại chƣa phản ứng sẽ đƣợc phản ứng với kháng

nguyên cạnh tranh và đƣợc cố định lại. Sau bƣớc rửa ta có thể đo lƣợng kháng thể

còn cố định lại và suy ra lƣợng kháng thể đã phản ứng với kháng nguyên mẫu.

1.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp ELISA

- Xác định nồng độ của kháng thể trong huyết thanh.

- Kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên.

- Phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm.

- Xác định sự có mặt của dƣợc phẩm.

- Xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học.

- Xác định dƣ lƣợng kháng sinh trong thực phẩm.

1.4. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi

Trong những năm gần đây, kháng sinh đƣợc sử dụng nhiều trong lĩnh vực nông

nghiệp đặc biệt là chăn nuôi. Theo số liệu của Ghislain Follet, tổng lƣợng kháng sinh

dùng trong y học và chăn nuôi ở các nƣớc châu âu là 10500 tấn (quy theo mức 100%

tinh khiết của các thành phần hoạt tính), trong đó 52% sử dụng trong y học, 33% trong

điều trị thú y và 15% nhƣ chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi. Trong đó, tỷ lệ các

loại kháng sinh đƣợc sử dụng trong chăn nuôi: Penicillin (9%); Tetracycline (66%);

Macrolid (12%); Aminoglycosid (4%); Fluoroquinolon (1%);

Trimethomprim/sulphamid (2%) và các kháng sinh khác (6%) [21].

Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của một số tác giả, kháng sinh đƣợc sử dụng tràn

lan trong thức ăn cho vật nuôi và tình trạng tồn dƣ kháng sinh trong thịt là phổ biển.

Các nghiên cứu đều cho rằng hầu hết các cơ sở chăn nuôi sử dụng kháng sinh không

hợp lý từ đó dẫn đến tình trạng tồn dƣ kháng sinh trong sản phẩm cao cấp hàng chục

tới hàng ngàn lần so với tiêu chuẩn quốc tế. Hiện nay, việc kiểm soát dƣ lƣợng kháng

sinh gặp rất nhiều khó khăn do thiếu kinh phí, thiếu trang thiết bị, thiếu hiểu biết của

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 29

ngƣời sử dụng.

Kết quả điều tra “Tình hình sử dụng kháng sinh và dƣ lƣợng kháng sinh trong

thịt gà tại các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp của thành phố Hồ Chí Minh” của Võ

Thị Trà An cho thấy có 8 loại kháng sinh đƣợc sử dụng phổ biến trong chăn nuôi gà

thịt công nghiệp trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh: Colistin (15,83%),

Enrofloxacin, Diaveridin (7,74%), Sulfadimidin (6,72%), Trimethoprim (6,38%),

Norfloxacin (5,79%), Oxytetracyclin (4,93%), Gentamycin (4,51%) và Acid oxolinic

(4%). Có 32,61% cơ sở sử dụng kháng sinh không hợp lý, trong đó sai về liều lƣợng

chiếm tỷ lệ cao nhất (23,3%). Số cơ sở không dùng thuốc đúng quy định chiếm

44,54%. Kiểm tra 70 mẫu thịt gà tại các cơ sở sử dụng không hợp lý phát hiện 42

(60%) mẫu thịt có tồn dƣ với các loại kháng sinh: Enrofloxacin, Norflxacin, Tylosin,

Tetracycline, Sulfadimidin, Sulfadiazine, Sulfaquinoxalin. Có mối liên quan giữa việc

ngƣng thuốc không đúng quy định với tình trạng tồn dƣ kháng sinh. 35,71% mẫu thịt

gà có tồn dƣ vƣợt quá giới hạn từ 2 - 400 lần so với tiêu chuẩn của Malaysia.

Trong các loại kháng sinh dùng cho chăn nuôi trên thị trƣờng không ít loại

không đảm bảo hàm lƣợng và chất lƣợng nên khi sử dụng chúng sẽ có ít hiệu quả.

Ngƣời chăn nuôi thƣờng phải dùng kết hợp nhiều loại kháng sinh khác nhau để phòng

và chữa bệnh. Do đó đã gây nên hiện tƣợng tồn dƣ kháng sinh trong sản phẩm động

vật nhƣ: thịt, sữa, trứng… Điều này gây nguy hại lớn cho sức khỏe cộng đồng, con

ngƣời sẽ bị nhiễm vi khuẩn kháng thuốc khi ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn. Đặc biệt

là sự kháng thuốc của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm.

1.5. Tác hại của Fluoroquinolone tồn dƣ trong thực phẩm

Tỷ lệ nhiễm dƣ lƣợng kháng sinh trong sản phẩm sữa đã đƣợc quan sát thấy

do sử dụng các loại kháng sinh khác nhau trong việc điều trị bệnh viêm

vú. Sundlof et al. [23] quan sát rằng Pencillins, Tetracycline, Sulphonamide và

Aminoglycosides đƣợc thƣờng xuyên nhất đƣợc sử dụng trong vật nuôi lấy sữa, dẫn

đến sự xuất hiện của dƣ lƣợng của kháng sinh trong sữa. Một số công bố có báo cáo

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 30

sự hiện diện của kháng sinh trong sữa sau khi điều trị các trƣờng hợp viêm vú.

Thuốc kháng sinh đƣợc sử dụng nhƣ tác nhân điều trị hoặc làm thức ăn bổ

sung trong sữa động vật dẫn đến sự tiết bã của họ Fluoroquinolone trong sữa [22].

Dƣ lƣơ ̣ng thuốc kháng sinh là một trong những nguyên nhân củ a tình trạng mất an toàn vệ sinh thực phẩm, gây tác hại đối với sức khỏe con ngƣời nhƣ dị ứng,

nhất là trƣờng hợp những ngƣời có cơ địa dị ứng với một loại thuốc nào đó.

Bên ca ̣nh đó , dƣ lƣơ ̣ng thuốc kháng sinh trong sƣ̃a bò còn gây nổi mề đay , ban đỏ, gây ngộ độc. Có một số loại kháng sinh còn bị cấm sử dụng trên thế giới do

gây các dạng thiếu máu và ở một số trƣờng hợp đặc biệt có thể dẫn đến tử vong .

Một số thuốc khác nếu tích lũy do dùng lâu ngày có thể gây suy gan , suy thận thậm chí gây ung thƣ, đột biến gen. Kháng sinh tồn dƣ trong sữa ức chế vi khuẩn sử dụng

trong chế biến sữa, gây khó cho chế biến fomat, sữa chua khi phải dùng vi khuẩn để

lên men.

Fluoroquinolones trong sữa không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và sự ổn định của

họ làm tăng nguy cơ tiếp xúc với con ngƣời và có thể gây bệnh truyền qua thực phẩm.

1.6. Tác hại của Fluoroquinolone đến môi trƣờng

Vừa qua, một nghiên cứu của Phó giáo sƣ, Tiến sĩ (PGS-TS) Nguyễn Đình

Tuấn, nguyên Hiệu trƣởng Trƣờng đại học Tài nguyên và Môi trƣờng TP HCM cùng

các cộng sự (2014) cho thấy vùng hạ lƣu sông Sài Gòn - Đồng Nai đã xuất hiện dƣ

lƣợng kháng sinh, nhiều nơi vƣợt quá tiêu chuẩn cho phép. Hiện nay, nƣớc ở hạ lƣu

sông Sài Gòn - Đồng Nai là nguồn nƣớc thô sau khi xử lý, đƣợc dùng để cung cấp

cho sinh hoạt của ngƣời dân ở thành phố Hồ Chí Minh.

Các kết quả nghiên cứu, đã cho thấy sự hiện diện của dƣ lƣợng kháng sinh

trong nƣớc thải của một số các công ty, xí nghiệp cũng nhƣ trong nƣớc sông Sài Gòn

- Đồng Nai ở vùng hạ lƣu. Đối với, dƣ lƣợng kháng sinh nhóm Fluoroquinolone là

41% trong mẫu nƣớc, 58% trong mẫu bùn, trầm tích, trong lúc quy trình xử lý nƣớc

thải hiện nay chƣa thể giải quyết vấn đề này, dƣ lƣợng kháng sinh sẽ tồn lƣu và tiếp

tục di chuyển ra môi trƣờng, sông suối...Tác hại của kháng sinh nhóm

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 31

Fluoroquinolone đƣợc cho là có nguy cơ gây đột biến gien, gây sẩy thai khi sử

dụng cho động vật mang thai. Bên cạnh đó, sự tồn lƣu trong thời gian dài sau khi

sử dụng Fluoroquinolone cũng là nguyên nhân dẫn đến việc hạn chế và cấm sử

dụng những kháng sinh thuộc nhóm này.

Thật ra, về mặt sinh hóa Fluoroquilone không phải là những chất mới nhƣng

theo các chuyên gia môi trƣờng thì nó đƣợc xếp vào nhóm các chất gây "ô nhiễm

mới" vì sự hiện diện của nó trong nguồn nƣớc thải sinh hoạt, công nghiệp hoặc

nông nghiệp, chảy ra sông, hồ, có khả năng gây ra các tác động tiêu cực đến con

ngƣời và hệ sinh thái. Nguy hiểm nhất là khi đổ vào sông, hồ, rồi nƣớc sông hồ

đƣợc xử lý thành nƣớc sinh hoạt thì rất ít ngƣời nhận biết đƣợc dƣ lƣợng kháng

sinh vì hàm lƣợng của nó rất nhỏ. Nhƣng một khi đã xâm nhập vào cơ thể ngƣời,

Fluoroquinolone gây ảnh hƣởng sức khỏe con ngƣời.

1.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc sử dụng ELISA phát hiện dƣ lƣợng

Fluoroquilone

1.5.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc

Jiang và c ộng sự (2011) đã phát triển và tối ƣu hóa phƣơng pháp ELISA

cạnh tranh gián tiếp (icELISA) phát hiện dƣ lƣợng Norfloxacin (NFL) trong gan

gà. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để tổng hợp các kháng nguyên nhân tạo NFL -

BSA, lớp phủ kháng nguyên của NFL - OVA và thỏ đã đƣợc sử dụng để sản xuất

các kháng thể đa dòng kháng NFLX. Phƣơng pháp icELISA để phát hiện định lƣợng

NFL trong gan gà. Phạm vi phát hiện là 0,006 - 38 ng/ml, với giá trị LOD và IC50

tƣơng ứng là 0,004 ng/ml và 0,48 ng/ml. Ngoại trừ cho một phản ứng chéo cao để

Ciprofloxacin (38%) và Sarafloxacin (33%). Sau khi tối ƣu hóa, pha loãng 10 lần

trong chiết xuất gan gà đã đƣa ra một đƣờng cong ức chế gần nhƣ tƣơng tự nhƣ trong

PBS đệm. Khi tăng vọt trong chiết xuất gan ở mức 8, 20, và 50 ng/ml, tỷ lệ thu hồi là

90 - 117,8% giữa các thí nghiệm, 97,5 - 114,4% cho các thí nghiệm tƣơng ứng. Các

độ lệch chuẩn tƣơng đối dao động 5,6 - 9,2% giữa các thí nghiệm và 5,9 - 11% cho

các thí nghiệm. Do đó, các nƣớc phát triển phƣơng pháp icELISA có thể đƣợc sử

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 32

dụng cho việc kiểm tra định lƣợng NFL dƣ lƣợng trong các mô thịt gà [24].

Jiang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu phát triển một xét nghiệm miễn dịch

xác dịch Fluoroquinolones chất gây ô nhiễm trong môi trƣờng nƣớc. Với mục đích

này, công nghệ NHS este sử dụng để tổng hợp các immunogen và lớp phủ kháng

nguyên Sarafloxacin (SAR). SDS - PAGE, quang phổ tia cực tím có thể nhìn thấy

và xác định quang phổ hồng ngoại cho thấy rằng kháng nguyên nhân tạo đã đƣợc

phức hợp thành công. Phƣơng pháp icELISA đƣợc xác định. Các phạm vi hoạt động

trong thí nghiện đã đƣợc xác định là 0,048 - 62,4 ng/ml, với LOD và IC50 giá trị tƣơng

ứng là 0,018 ng/ml và 2,5 ng/ml. Thí nghiệm này cho thấy một phản ứng chéo cao

Difloxacin (86,7%), Norfloxacin (63,2%) và Pefloxacin (33,8%). Khi áp dụng trong

nƣớc máy, nƣớc sông và mẫu nƣớc nuôi trồng thủy sản, cho Sarafloxacin, Difloxacin,

Norfloxacin và Pefloxacin là 89,5 - 119,5, 90.5 - 121,2, 92,1 - 118,6, và 88,2 -

116,8%, tƣơng ứng với hệ số biến thiên (CV) giá trị tất cả < 10%. Kết quả thí nghiệm

này có thể đƣợc sử dụng để phát hiện đồng thời Sarafloxacin, Difloxacin, Norfloxacin,

và Pefloxacin dƣ lƣợng trong mẫu nƣớc [25].

Huang và cộng sự (2014) đã nghiên cứu phát triển phƣơng pháp ELISA gián tiếp cạnh tranh để phát hiện dƣ lƣợng Danofloxacin trong sữa. DFL đã đƣợc sử dụng

nhƣ là một hapten đƣợc kết hợp với albumin huyết thanh bò (BSA) và BSA - DFL đã

đƣợc hình thành. Những con thỏ đƣợc gây miễn di ̣ch vớ i hapten và thu đƣơ ̣c kháng thể kháng DFL tƣ̀ huyết thanh thỏ . Các khảo nghiệm đƣợc cải thiện hiệu suất bằng cách sử dụng một kháng nguyên lớp phủ (DFL - OVA) là một liên hợp của DFL và

Ovalbumin (OVA). Cuối cùng, việc xác định dƣ lƣợng DFL bởi icELISA đã đƣợc

nghiên cứu. Các kết quả của thí nghiệm đã chứng minh rằng giới hạn phát hiện (LOD)

cho DFL là 29,24 µg/kg. Bên cạnh đó, các kháng thể đặc hiệu phản ứng liên quan chặt

chẽ với FQNs, bao gồm Ciprofloxacin (CIP), Ofloxacin (OFL), Sarafloxacin (SAL) và

Enrofloxacin (EFL). Tỷ lệ thu hồi trung bình của chất chuẩn (DFLX) là 91,45% với tỷ

lệ của 0,5 ~ 2000 µg/kg trong sữa, phƣơng pháp này đƣợc nghiên cứu để ứng dụng

xác định DFL trong sữa [26].

ZHANG và cộng sự (2011) đã nghiên cứu phát triển gián tiếp ELISA cạnh

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 33

tranh phát hiện đồng thời Enrofloxacin và Ciprofloxacin. Đƣợc thay đổi 1 - etyl - 3

(3-dimethylaminopropy) carbodiimit (EDC) phƣơng pháp đã đƣợc sử dụng để tổng

hợp kháng nguyên nhân tạo của Enrofloxacin (ENR) và thỏ New Zealand đã đƣợc

sử dụng để sản xuất kháng thể đa dòng kháng - ENR (pAb). Dựa trên các chuẩn độ,

icELISA đƣợc lập thành đƣờng cong chuẩn. Xét nghiệm này đã có một cấp bậc

tuyến tính 6 - 148,0 µg/kg (R2 = 0,9567) với một nửa nồng độ tối đa ức chế (IC50)

và giới hạn phát hiện (LOD) giá trị tƣơng ứng là 9,4 µg/kg và 0,2 µg/kg. Các pAb

có phản ứng chéo cao với Ciprofloxacin (CIP) (87%), các chất chuyển hóa chính

của ENR ở các mô. Sau khi tối ƣu hóa, các hiệu ứng ma trận có thể đƣợc bỏ qua

bằng cách sử dụng một lần 10x pha loãng trong thịt bò và pha loãng 20x lần trong

thịt lợn. Sự phục hồi tổng thể và hệ số biến thiên (CV) trong phạm vi tƣơng ứng là

86% - 109% và 6,8% - 13,1%. Có thể kết luận phƣơng pháp ELISA đƣợc xây

dựng phù hợp cho phát hiện đồng thời ENR và CIP trong mô động vật [27].

1.5.2. Các nghiên cứu trong nƣớc

Phạm Kim Đăng và c ộng sự (2008) đã ƣ́ ng du ̣ng phƣơng phá p ELISA để

phân tích tồn dƣ kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm ta ̣i mô ̣t số tỉnh ven biển khu vƣ̣c phía Bắc qua viê ̣c phân tích 90 mẫu tôm đƣơ ̣c lấy ở 4 đi ̣a phƣơng đa ̣i diê ̣n (Hà Nội , Quảng Ninh , Nam Đi ̣nh và Nghê ̣ An ). Kết quả phân tích sử dụng Kit ELISA (Cer, Bỉ) thu đƣơ ̣c cho thấy Kit ổn đi ̣nh và c ho ngƣỡng phát hiê ̣n 0,7 ppb. Kết quả phát hiện tồn dƣ 5 loại Quinolone (Enrofloxacin, Norfloxacin, Cipfloxacin, Danofloxacin và Acid oxolinic) trong mẫu vớ i nồng đô ̣ d ao đô ̣ng tƣ̀ 0,4 - 145 ppb, (LC- và kết quả này đƣợc khẳng định bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ

MS/MS) [9].

Các nhà khoa học thuộc phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, Trung tâm

nghiên cứu triển khai, khu công nghệ cao thành phố Hồ Chí Minh vừa công bố

hoàn thành nghiên cứu bộ kit ELISA phát hiện nhanh dƣ lƣợng kháng sinh

Enrofloxacin trong thủy sản. Theo Thạc sỹ Bùi Quốc Anh, tác giả của sản phẩm,

thì bộ kit này dựa trên cơ chế miễn dịch cạnh tranh giữa chất kháng sinh

Enrofloxacin và cộng hợp enzyme đánh dấu lên kháng thể đặc hiệu. Nồng độ

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 34

Enrofloxacin sẽ đƣợc hiển thị dựa trên mức độ phát quang của enzyme. Do đó, chỉ

cần căn cứ vào cƣờng độ hiện màu của giếng thử là có thể xác định đƣợc mẫu thủy

sản có nhiễm Enrofloxacin hay không và nhiễm với nồng độ bao nhiêu. Tất cả các

quy trình từ đƣa mẫu vào phân tích đến cho ra kết quả chỉ mất 30 phút, nhanh hơn

rất nhiều so với các phƣơng pháp khác. Bộ kit có độ nhạy cao, có khả năng phát

hiện dƣ lƣợng Enrofloxacin ở ngƣỡng phát hiện 1 ppb và có thể phân tích từ 50 đến

80 mẫu cùng một lúc. Ngoài ra, bộ kít này còn có các ƣu điểm: Thao tác đơn giản,

dễ thực hiện, không đòi hỏi các thiết bị đắt tiền, không cần nhân viên có chuyên

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 35

môn cao.

CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Dụng cụ, thiết bị

Thiết bị Hãng

Máy đọc ELISA Bio Rad 550, Đức

Đĩa ELISA M96V MaxiSorp, Đức

MáyVortex Janke & Kunkel, Đức

Máy ly tâm 5415C Eppendorf, Đức

Máy đo pH WTW

Cân phân tích Shimadzu, Nhật

Máy lắc S20 Đức

Máy khuấy từ VELP Scientifica

Micro pipet Eppendorf, Đức

Các loại dụng cụ thuỷ tinh Việt Nam.

2.1.2. Hoá chất

Tên hoá chất Hãng

Sigma - Aldrich

Rabbit anti-Mouse IgG Secondary Antibody - HRP conjugate (rAnti-IgG-HRP)

Levofloxacin (LEV) Sigma - Aldrich

Ofloxacin (OFL) Sigma - Aldrich

Garenoxacin (GAR) Sigma - Aldrich

Rufloxacin (RUF) Sigma - Aldrich

3,3’,5,5’ Tetramethylbezidine (TMB) Sigma - Aldrich

Albumin huyết thanh bò (BSA) Sigma - Aldrich

Ovalbumin (OVA) Sigma - Aldrich

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 36

N,N - dimethyl foromamide (DMF) Sigma - Aldrich

N,N - dicychlohexyl cacbodyimide (DDC) Sigma - Aldrich

N,N - hydroxy succinimide (NHF) Sigma – Aldrich

Và một số hoá chất chuyên dụng khác

2.1.3. Các dung dịch đệm

 Đệm PBS 80 mM pH7,2 (10x) 1000 ml

(Phosphate buffer saline)

24,34 g Na2HPO4 12H2O

1,44 g NaH2PO4 2H2O

NaCl 8,5 g

Thêm nƣớc cất 2 lần đến thể tích 1000 ml

Chỉnh pH dến 7,2 bằng HCl 37%

 Đệm PBST 8 mM pH 7,2 (1x) 1000 ml

(Phosphate buffer saline Tween)

Đệm PBS 80 mM pH 7,2 100 ml

Tween 20 0,5 ml

Thêm nƣớc cất 2 lần đến thể tích 1000 ml

 Đệm PBS 8 mM pH 7,2 (1x) 1000 ml

Đệm PBS 80 mM pH7,2 100 ml

Thêm nƣớc cất 2 lần đến thể tích 1000 ml

 Đệm Sodium acetat 0,1 M pH 5,5 100 ml

1,361 g CH3COONa

Thêm nƣớc cất 2 lần đến thể tích 100 ml

Chỉnh pH đến 5,5 bằng axit citric 0,1 M

100 ml  Đệm NaHCO3 0,13 M

1,08 g NaHCO3

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 37

Thêm nƣớc cất 2 lần đến thể tích 100 ml

 Dung dịch hiện màu

TMB (6 mg/ml pha trong DMSO) 400 µl

100 µl H2O2 1% (v/v)

Đệm Sodium acetate 0,1 M pH 5,5 25 ml

 Dung dịch (NH4)2SO4 bão hoà

 Dung dịch H2SO4 2N

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Mục tiêu của nghiên cứu

Xây dƣ̣ng phƣơng pháp ELISA gián tiếp xác đi ̣nh dƣ lƣơ ̣ng kháng sinh LEV

trong sƣ̃a trong điều kiê ̣n phòng thí nghiê ̣m.

2.2.2. Địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu

 Địa điểm:

1 - Nghiên cứu đƣợc tiến hành tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ Gen động vật -

Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2 - Phòng thí nghiệm Hóa enzyme, Khoa Hóa, Trƣờng ĐH Quốc gia

Lomonosov, CHLB Nga.

 Mẫu sữa: Sƣ̃a tƣơi thu mua tại các điểm kinh doanh quanh Hà Nội (Ba Vì,

Sơn Tây).

2.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.3.1. Nội dung nghiên cứu

a. Phƣơng phá p tổ ng hơ ̣p hapten gắ n LEV vớ i OVA/BSA

Kháng thể không hình thành nếu kích thích miễn dịch bằng các kháng nguyên

có trọng lƣợng phân tử thấp (khoảng 2.000 Da). Do đó, các phức hợp (hapten) của

LEV với một chất có trọng lƣợng phân tử cao (protein) đƣợc tổng hợp. Một nhóm

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 38

cacboxylic phản ứng xảy ra trong Fluoroquinolones. Tiêm chủng phức hợp với

cationized albumin huyết thanh bò (BSA) đã đƣợc tổng hợp, cho hấp thụ trong các

giếng, các phức hợp của LEV với OVA đã đƣợc tổng hợp [28 - 29].

Bƣớc thứ nhất là sự kích hoạt của nhóm carboxylic: Fluoroquinolone, 1-etyl

3(dimetylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride (EDC) và N-

hydroxysuccinimide (NHS) đƣợc hòa tan trong dimethylformamid (DMF) và ủ.

Bƣớc thứ hai hòa tan của protein (OVA/BSA) trong đệm carbonate (pH 9,5)

và ủ trong 1h ở nhiệt độ 4oC.

Bƣớc thứ ba là việc bổ sung các LEV để kích hoạt dung dịch protein và lắc

nhẹ, ủ ở nhiệt độ phòng.

Bƣớc thứ tƣ là sự thẩm tích các chất thừa không phản ứng có trọng lƣợng

phân tử thấp bằng cách thẩm tích trong nƣớc 3 - 5 ngày.

Cuối cùng chia nhỏ phức hợp thu đƣợc thành lƣợng nhỏ và lƣu trữ ở - 20oC.

Các bƣớc tiến hành tổng hợp hapten gắn LEV vớ i BSA/OVA.

- Hoạt hóa LEV: Hoà tan 15 µmol LEV + 30 µmol EDC + 30 µmol NHS

trong 1 ml dimethyformamide (DMF). Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ trong 2 h.

- Phản ứng gắn BSA/OVA với LEV: Nhỏ từng giọt LEV vào dung dịch

BSA/OVA đã hoạt hóa trong ống có khuấy sau đó cho thẩm tích (qua túi kích

thƣớc lỗ nhỏ có khả năng thấm một chiều), cho phép các chất (muối) có trọng

lƣợng phân tử thấp thấm ra ngoài, thu dịch bên trong túi thẩm tích.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 39

- Sử dụng LEV- cBSA để gây miễn dịch trên thỏ.

- Chất phủ kháng nguyên: LEV-N-C5-CO-N-OVA

Hình 12. Tổng hợp liên hợp của LEV với OVA (LEV - OVA)

b. Phƣơng phá p ta ̣o khá ng thể đa dòng khá ng LEV trên thỏ

Ðể có đƣợc kháng thể đa dòng, lớp nhũ tƣơng của liên hợp với chất bổ trợ

complete Freund’s trong dung dịch đƣợc chuẩn bị cho các miễn dịch đầu tiên và với

chất không bổ trợ incomplete Freund’s cho các tiêm chủng tiếp theo. Lớp nhũ tƣơng

đƣợc sử dụng để tiêm chủng cho thỏ tại 10 - 15 địa điểm dọc theo cột sống. Tiêm

chủng đƣợc lặp lại tại một thời gian nhất định trong chu trình miễn dịch. Sau nhiều

chu kỳ miễn dịch, lấy mẫu máu từ các tĩnh mạch sau lỗ tai. Sau đó, huyết thanh thu

đƣợc, ngƣời ta có thể thực hiện kết tủa bằng dung dịch bão hòa của ammonium

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 40

sulfate để cô lập các phần IgG. Các kháng thể thu đƣợc đƣợc đông khô hoặc bảo quản với 1 : 1 glycerol và bảo quản ở - 20oC.

Tiến hành chuẩn bị tạo kháng thể đa dòng

Kháng thể đa dòng thu đƣợc trên những con thỏ của giống California ở 3

tháng tuổi. Việc tiêm chủng đã đƣợc thực hiện trong khoảng thời gian hai tuần của

nhũ tƣơng tƣơi chuẩn bị (liên hợp 1 - 2 mg trong nƣớc) cho tiêm với chất bổ trợ

complete Freund’s tại nhiều địa điểm (lên đến 15 địa điểm) dọc theo cột sống. Vào

ngày thứ 8, sau mỗi lần tiêm thứ ba, lấy mẫu máu đã đƣợc thực hiện từ các tĩnh mạch

nhĩ phía sau lỗ tai bằng cách sử dụng ống nghiệm chân không với gel và chất đông

máu. Các huyết thanh đã đƣợc phân lập bằng cách ly tâm, và đƣợc tinh chế bằng kết tủa gấp ba lần bằng 50% ammonium sulfate ở +4oC để cung cấp cho các phần kháng

thể IgG, đƣợc hòa tan trong đệm phosphate. Các immune globulin phần thu đƣợc đã đƣợc pha trộn với glycerol ở tỉ lệ 1:1 và bảo quản ở - 20oC thu đƣợc kháng thể (Ab).

c. Phƣơng pháp ELISA giá n tiếp xá c đi ̣nh dƣ lƣơ ̣ng LEV

Nguyên lý xác định LEV dựa trên phản ứng miễn dịch cạnh tranh ELISA,

nhờ tính chất nhận biết đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên và khả năng tạo

phức hợp giữa kháng thể và một enzym. Sử dụng kháng thể đa dòng kháng LEV

trong phản ứng cạnh tranh giữa LEV tự do có trong mẫu và LEV-OVA gắn trên bề

mặt giếng. LEV trong các mẫu kiểm tra cạnh tranh với phức hợp LEV-OVA cố

định có trên giếng để gắn vào vùng liên kết kháng nguyên của kháng thể đa dòng

đặc hiệu kháng LEV (tạo trong thỏ). Sau đó, kháng thể thứ 2 đƣợc sử dụng là phức

hợp kháng thể kháng huyết thanh thỏ tạo trong chuột đƣợc đánh dấu enzyme HRP

(Rabbit anti - Mouse IgG Secondary Antibody - HRP conjugate). Tín hiệu màu sẽ

xuất hiện trên phiến nhựa khi xảy ra phản ứng giữa enzym trong phức hợp kháng

thể thứ 2 với cơ chất TMB đƣợc đƣa vào. Hàm lƣợng LEV trong mẫu tỷ lệ nghịch

với cƣờng độ màu, có nghĩa là những mẫu chứa lƣợng LEV lớn, đồng nghĩa với

việc HRP đƣợc gắn trên phiến nhỏ, sẽ cho cƣờng độ màu yếu (gọi là mẫu dƣơng

tính hay mẫu có hàm lƣợng LEV cao). Những mẫu chứa lƣợng LEV nhỏ (hoặc

không có), lƣợng HRP đƣợc gắn trên phiến lớn sẽ cho cƣờng độ màu cao tƣơng tự

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 41

nhƣ trƣờng hợp mẫu chuẩn (gọi là mẫu âm tính hay mẫu có hàm lƣợng LEV thấp).

Dựng đồ thị chuẩn xác định hàm lượng LEV

Đồ thị chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên kết quả đo mật độ quang học OD450

của phản ứng ELISA. Các bƣớc thực hiện phản ứng nhƣ sau:

Bƣớc 1: Phủ 200 µl LEV-OVA nồng độ 0,5 µg/ml trong dung dịch đệm PBS 80mM pH 7,2 vào mỗi giếng của phiến nhựa, ủ qua đêm ở 40C. Rửa phiến nhựa 3

lần bằng đệm PBST1x.

Bƣớc 2: Phủ 50 µl kháng thể đa dòng kháng LEV (độ pha loãng 5.000x) vào

các giếng. Thêm 50 µl mẫu chứa LEV ở các nồng độ khác nhau pha trong đệm PBS

80 mM. Ủ phiến nhựa ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Rửa phiến nhựa 2 lần bằng

PBST và 1 lần bằng PBS 8 mM pH 7,2.

Bƣớc 3: Bổ xung thêm 200 µl cộng hợp kháng thể thứ 2 (Rabbit anti-mouse

IgG Secondary Antibody - HRP conjugate) ở nồng độ pha loãng 10.000 lần trong

đệm PBS 80 mM pH 7,2 vào mỗi giếng. Ủ phiến nhựa ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ và có lắc nhẹ. Rửa bản nhựa 3 lần bằng dung dịch đệm PBST.

Bƣớc 4: Phủ vào mỗi giếng 200 µl dung dịch hiện màu (TMB ), ủ trong tối

30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó dừng phản ứng với 50 µl dung dịch H2SO4 2N.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 42

Bƣớc 5: Đọc kết quả ở bƣớc sóng 450 nm bằng máy đọc ELISA.

Hình 13. Sơ đồ ELISA gián tiếp cạnh tranh

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 43

Sơ đồ phản ứng ELISA gián tiếp cạnh tranh

2.2.3.2. Giới hạn phát hiện nồng độ và độ đặc hiệu của nghiên cứu

Để xác định đặc tính phân tích, chƣơng trình Origin 8.5 đƣợc sử dụng để xử lý

kết quả. Sự phụ thuộc của các dấu hiệu tƣơng đối logarit với nồng độ đƣợc vẽ, phần

tuyến tính đã đƣợc xác định và một phƣơng trình tuyến tính với hệ số xấp xỉ thu

đƣợc. Các giới hạn của nồng độ có thể phát hiện đƣợc coi là nồng độ mà tại đó các

dấu hiệu phân tích giảm 10%. Tức là, thay đổi từ đó dấu hiệu ở nồng độ bằng không.

Phạm vi của các nồng độ phát hiện là phạm vi của sự suy giảm tuyến tính

của dấu hiệu. Điều này thƣờng là các phần của chuẩn tƣơng ứng với 20 - 80% của

sự khác biệt giữa nồng độ tối đa của chất và giá trị của dấu hiệu hấp thụ.

Các kí tự cụ thể của quy trình đƣợc ƣớc tính bằng các phản ứng chéo với các

chất khác.

Tỷ lệ phản ứng chéo đƣợc xác định bằng các phƣơng trình sau đây:

CR, % = IC50 (LEV)/IC50 (X),

Trong đó:

IC50 (LEV) là nồng độ của LEV mà tại đó dấu hiệu hấp thụ 50% xảy ra.

IC50 (X) là nồng độ của các chất phản ứng chéo mà tại đó mức giảm của dấu

hiệu hấp thụ 50%.

2.2.3.3. Đánh giá hiệu suất thu hồi của LEV khi gây nhiễm nhân tạo

Kỹ thuật ELISA xác định LEV trong các mẫu được nhiễm nhân tạo

Bƣớc 1: Phủ 200 l LEV-OVA nồng độ 0,5 g/ml trong đệm PBS 80 mM

pH 7,2, ủ qua đêm ở 40C. Rửa phiến nhựa 3 lần bằng dung dịch PBST.

Bƣớc 2: Phủ vào mỗi giếng 50 l dung dịch pAb kháng LEV nồng độ pha

loãng 5.000x và 50 l dung dịch LEV đã đƣợc chủ động đƣa vào với với các nồng

độ pha loãng từ 0,5; 1,0; 1,5 và 3,0 ng/ml. Ủ phiến nhựa 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 44

Rửa phiến nhựa 3 lần bằng PBST.

Bƣớc 3: Bổ xung 200 l cộng hợp kháng thể 2 đƣợc pha loãng 10.0000 lần

trong đệm PBS 80 mM pH 7,2 vào mỗi giếng, ủ phiến nhựa ở nhiệt độ phòng trong

1 giờ. Rửa phiến nhựa 3 lần bằng dung dịch PBST.

Bƣớc 4: Thêm 200 l dung dịch hiện màu TMB, ủ tối 30 phút ở nhiệt độ

phòng. Sau đó dừng phản ứng với 50 l dung dịch H2SO4 2N.

Bƣớc 5: Đọc kết quả ở bƣớc sóng 450 nm bằng máy đọc ELISA.

Hiệu suất thu hồi LEV đƣợc tính theo công thức:

Trong đó: %R = (CLEV pƣ/CLEV) x 100%

R: Hiệu suất thu hồi LEV.

Lƣợng LEV đo đƣợc theo thực tế. CLEV pƣ:

Lƣợng LEV đƣa vào mẫu. CLEV :

2.2.3.4. Chuẩn bị mẫu sữa

Các phƣơng pháp chuẩn bị mẫu có thể khác nhau và thay đổi tùy thuộc vào

phƣơng pháp phân tích.

- Lấy 2 ml sữa sau đó đƣợc ly tâm trong 30 phút ở 10.000 rpm. Mẫu sữa sau

khi ly tâm sẽ đƣợc loại bỏ chất béo ở trên bằng cách sử dụng pipet hút phần sữa

bên dƣới cho vào ống đựng mẫu ghi số hiệu và bảo quản.

- Mẫu sữa đƣợc chuẩn bị bằng cách pha loãng 10 lần.

- Trong các nồng độ đã đƣợc pha loãng đo trực tiếp của Fluoroquinolone

trong sữa nguyên liệu.

Trong nghiên cứu này, trong các phƣơng pháp loại trừ ảnh hƣởng của chất

nền, chúng tôi so sánh các phƣơng pháp mô tả ở trên và các phƣơng pháp có chất

mặn ra sử dụng bão hoà amoni sulfat. Với việc bổ sung của chất bão hoà amoni

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 45

sunfat, các protein kết tủa và một lớp lipid đƣợc hình thành trên bề mặt. Vì vậy, nó

là cần thiết để cô lập hơn kết tủa chất lỏng và không làm ô nhiễm các mẫu sữa với

chất béo. Chúng tôi đã chuẩn bị một loạt các độ pha loãng và xác định mức độ pha

loãng cần thiết để loại bỏ hoàn toàn các chất nền. Dùng dung dịch (NH4)2SO4 bão

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 46

hòa để biến tính protein, mẫu sữa với (NH4)2SO4 bão hòa với tỷ lệ 3 : 2.

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

LEV đƣợc xác định dựa trên phản ứng cạnh tranh giữa LEV tự do có trong

mẫu (hoặc dung dịch chuẩn) và LEV ở dạng phức hợp LEV-OVA gắn trên phiến

nhựa với kháng thể đa dòng kháng LEV tạo miễn dịch trong thỏ. Lƣợng pAb đã

tham gia vào phản ứng cạnh tranh đƣợc xác định thông qua lƣợng cộng hợp kháng

thể thứ 2 kháng pAb (rabbit anti-mouse IgG, HRP conjugate -rAnti-IgG-HRP) sử

dụng trong phản ứng ELISA gián tiếp. Lƣợng enzym liên kết với kháng thể thứ 2

đƣợc xác định bằng phản ứng lên màu với cơ chất TMB. Xác định lƣợng LEV

thông qua cƣờng độ màu đo đƣợc ở bƣớc sóng 450 nm trên máy đọc ELISA.

Để thực hiện đƣợc nội dung trên, tiến hành các thí nghiệm sau:

- Trƣớc tiên phải tổng hợp phức hợp LEV gắn với protein OVA/BSA. LEV-

OVA đƣợc sử dụng trong phản ứng gắn kháng nguyên LEV lên phiến nhựa,

LEV-BSA đƣợc sử dụng gây miễn dịch tạo kháng thể đa dòng kháng LEV

trên thỏ.

- Gây miễn dịch trên thỏ tạo kháng thể đa dòng kháng LEV-BSA.

- Tối ƣu các điều kiện phản ứng ELISA cụ thể: Nồng độ LEV-OVA gắn lên

phiến nhựa, độ pha loãng pAb kháng LEV, độ pha loãng cộng hợp kháng thể

thứ 2 (rAnti-IgG-HRP).

- Tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn ELISA gián tiếp xác định LEV trong đệm,

trong sữa, đánh giá hiệu suất thu hồi, khả năng phản ứng chéo với các kháng

sinh cùng họ Fluoroquilone.

- Xác định LEV trong một số mẫu sữa.

Trong nghiên cứu này, do LEV là kháng sinh có trọng lƣợng phân tử nhỏ nên

không có khả năng gây miễn dịch tạo kháng thể. Vì thế, các phân tử nhỏ muốn sử

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 47

dụng trong mục đích gây miễn dịch phải đƣợc gắn với một phân tử có trọng lƣợng

phân tử lớn (phân tử protein). Chúng tôi tiến hành gắn LEV với BSA, ở dạng liên

kết này phức hợp có khả năng tạo miễn dịch trên thỏ.

Bề mặt giếng ELISA có bản chất polystyren có khả năng gắn các protein,

chính vì vậy, muốn gắn LEV lên bề mặt giếng, trƣớc tiên LEV cần đƣợc gắn với

phân tử protein (OVA). Ở dạng phức hợp này, OVA sẽ gắn lên bề mặt giếng

ELISA, phần LEV sẽ đƣợc bộ lộ trên bề mặt giếng, vừa đảm bảo đƣợc gắn lên

giếng, vừa đảm bảo vị trí không gian của nó trên bề mặt giếng cho phép liên kết

đặc hiệu với kháng thể đa dòng kháng LEV.

3.1. Các thông số phản ứng ELISA gián tiếp

- Nồng độ phức hợp kháng nguyên (LEV - OVA) đƣợc sử dụng là 0,5 µg/ml

- Độ pha loãng kháng thể đa dòng kháng LEV thích hợp: 5.000 x lần.

- Độ pha loãng cộng hợp kháng thể thứ 2 (rAnti-IgG-HRP): 10.000 x lần.

(Các thí nghiệm này được tiến hành tại phòng thí nghiệm của GS Eremin, phòng thí

nghiệm Hóa enzyme, Khoa Hóa, Trường ĐH Quốc gia Lomonosov, CHLB Nga).

3.2. Kết quả phản ứng ELISA cạnh tranh gián tiếp

Ý nghĩa của phản ứng ELISA cạnh tranh gián tiếp ở đây đƣợc thể hiện qua 2

tiêu chí:

- Cạnh tranh: Kháng nguyên tự do có trong mẫu và kháng nguyên cố định

trên phiến ELISA cạnh tranh với nhau trong liên kết đặc hiệu với kháng thể đa

dòng kháng LEV.

- Gián tiếp: Phản ứng phát hiện kháng thể thứ 2 (là kháng thể kháng huyết

thanh thỏ tạo trong chuột) ở dạng cộng hợp, chứ không phát hiện trực tiếp kháng

thể đa dòng kháng LEV.

Thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp để xây dựng đồ thị chuẩn xác định hàm

lƣợng LEV với độ pha loãng của kháng thể đa dòng kháng LEV là 5.000 lần và độ

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 48

pha loãng của cộng hợp kháng thể thứ 2 là 10.000 lần. Để xác định đƣờng cong

chuẩn, tiến hành pha loãng LEV gốc với các nồng độ từ 0,1 ng/l đến 1.000 ng/l .

Các bƣớc thí nghiệm đƣợc thực hiện nhƣ đã mô tả trong phần vật liệu và phƣơng

pháp (trang 39). Kết quả OD450 trên phiến ELISA trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả đo OD450 trên phiến ELISA

Giếng ELISA A/Ao

Nồng độ LEV (ng/µl) 1000 Tín hiệu ELISA (OD450) 0,286 ± 0,03 1 0,306

2 100 0,307 ± 0,08 0,329

3 10 0,418 ± 0,04 0,448

4 1 0,849 ± 0,03 0,911

5 0,1 0,921 ± 0,06 0,988

ĐC (-) 0 0,932 ± 0,03 1,0

Đồ thị LEV chuẩn cho thấy khoảng phát hiện LEV là từ 0,2 - 50 ng/ml, tại

khoảng này đồ thị có độ dốc lớn, tức là có sự biến thiên về giá trị OD450 khi có sự

biến thiên về nồng độ LEV. Khi nồng độ LEV trong mẫu thấp, có nghĩa là kháng

nguyên LEV gắn trên bề mặt giếng có nhiều cơ hội cạnh tranh với kháng nguyên

LEV tự do trong mẫu và liên kết với kháng thể đa dòng kháng LEV, tƣơng ứng với

lƣợng cộng hợp kháng thể thứ 2 gắn HRP cao, và tỷ lệ với cƣờng độ màu của phản

ứng cao. Ngƣợc lại, khi nồng độ LEV trong mẫu cao, có nghĩa kháng nguyên LEV

cố định ít cơ hội cạnh tranh với kháng thể đa dòng kháng LEV, tƣơng ứng với nó là

cƣờng độ màu của phản ứng ELISA thấp (bảng 3.2).

Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp ở nồng độ 0,2 ng/ml. Cũng sử dụng

phƣơng pháp này, Shanin và cs (2014) phát hiện đƣợc LEV trong khoảng từ giới

hạn thấp 0,03-0,41 ng/ml. Shanin và cs (2015) sử dụng phƣơng pháp miễn dịch

phân cực huỳnh quang (Fluorescene Polarization Immunoassay - FPIA) cho kết

quả phát hiện LEV từ 2,5 – 50 ng/ml . Tuy kết quả nghiên cứu của chúng tôi so với

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 49

nƣớc ngoài có thấp hơn nhƣng vẫn đảm bảo phát hiện tốt LEV trong ngƣỡng cho

phép của thực phẩm. Đƣờng chuẩn này đƣợc sử dụng song song trong các phép xác

định hàm lƣợng LEV trong mẫu sữa gây nhiễm và mẫu sữa thu trên thị trƣờng

[33,34].

Hình 14. Biểu đồ đƣờng chuẩn của LEV

Từ kết quả đƣờng chuẩn cho thấy khoảng xác định của phƣơng pháp, chúng

tôi tiến hành xây dựng đƣờng tuyến tính với khoảng nồng độ LEV thu hẹp trong

khoảng từ 0,2-10 ng/ml. Trong khoảng biến thiên này, hàm lƣợng LEV tỷ lệ nghịch

với cƣờng độ màu OD450, chính xác hơn là tỷ lệ nghịch với mức độ cạnh tranh. Kết

quả giá trị OD450 thu đƣợc trình bày trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả đo OD450 trên phiến ELISA

Nồng độ OD1 OD2 A/A0 LEV đƣa vào OD trung bình

0 0,856 0,898 0,877 1

0,2 0,748 0,718 0,733 0,835803877

0,5 0,695 0,667 0,681 0,776510832

1,0 0,552 0,558 0,555 0,632839225

2,0 0,481 0,481 0,481 0,548460661

4,0 0,373 0,379 0,376 0,428734322

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 50

10,0 0,309 0,331 0,320 0,364880274

Hình 15. Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn

Kết quả phân tích bằng phần mềm OriginPro 8.5.1 cho kết quả sau:

Equation y = a + b*x

Weight No Weighting

Residual Sum of Squares 0.00388

Pearson's r -0.98885

Adj. R-Square 0.97228

Value Standard Error

A/A0 Intercept 0.6431 0.01317

A/A0 Slope -0.30046 0.02263

Dựa vào kết quả phân tích trên, phƣơng trình tuyến tính xác định hàm lƣợng

LEV đƣợc viết nhƣ sau:

y = (-0,30046 ± 0,02263)x + (0,6431 ± 0,01317) với hệ số R2 = 0,97228.

Trong đó:

y là hàm lƣợng LEV (ng/ml)

x là tỷ số A/A0

Đƣờng cong tuyến tính đƣợc xây dựng từ đƣờng chuẩn thực (dạng điểm) nhờ

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 51

chức năng fitting của phần mềm OriginPro 8.5.1. Bƣớc này đƣợc thực hiện dựa trên

nguyên tắc: đƣờng tuyến tính chuẩn sẽ là đƣờng gần nhất so với đƣờng chuẩn thực. Mức độ fitting thể hiện ở hệ số R2 (R-square). R2 biến thiên từ 0-1, khi giá trị R2

càng gần tới 1 thể hiện mức đồng nhất giữa đƣờng cong thực và đƣờng chuẩn tuyến tính càng cao. Giá trị R2 càng thấp (gần giá trị 0) thể hiện mức độ đồng nhất giữa

đƣờng cong thực tế và đƣờng cong chuẩn thấp (đƣờng chuẩn tuyến tính khác xa so với đƣờng chuẩn thực). Kết quả phân tích thu đƣợc giá trị R2 là 0,97228, điều này

có nghĩa mức độ phù hợp giữa giá trị thực tế của thí nghiệm và đƣờng tuyến tính

cao.

Hình 16. Đồ thị tuyến tính nồng độ LEV chuẩn đƣợc xây dựng từ đƣờng chuẩn gốc.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 52

(Màu đen: Đƣờng chuẩn gốc; Màu đỏ: Đƣờng cong tuyến tính)

3.3. Độ đặc hiệu của phƣơng pháp ELISA

Một trong các tiêu chí quan trọng trong phản ứng ELISA là tính đặc hiệu.

Hơn nữa, nghiên cứu này sử dụng kháng thể đa dòng kháng LEV đƣợc tạo ra trong

thỏ. Do tính chất tƣơng tự về cấu trúc hoá học của các kháng sinh thuộc nhóm

Fluoroquinolone, phản ứng chéo giữa kháng thể kháng một loại kháng sinh này với

kháng sinh khác cùng họ có thể xảy ra. Các kháng sinh thuộc nhóm

Fluoroquinolone có chung cấu trúc vòng (hình 17).

Hình 17. Cấu trúc phân tử của Fluoroquinolone

Để đánh giá tính đặc hiệu của phƣơng pháp, chúng tôi tiến hành xác định

các phản ứng chéo với các kháng sinh khác trong nhóm Fluoroquinolone, cụ thể là

phản ứng ELISA xác định LEV đƣợc thay thế xác định các kháng sinh cùng họ.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 53

Kết quả phản ứng chéo đƣợc trình bày trong hình 18.

Hình 18. Biểu đồ tỷ lệ phản ứng chéo của Fluoroquinolone

Trong số các Fluoroquinolone kiểm tra, phản ứng ELISA gián tiếp cạnh

tranh sử dụng kháng thể đa dòng kháng LEV-BSA cho kết quả phản ứng chéo với

các kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolone lần lƣợt nhƣ sau: Ofloxacin (145%),

Marbofloxacin (82%), Ofloxacin (68%), Rufloxacin (67%) và Garenoxacin (24%)

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 54

cho phản ứng chéo.

3.4. Đánh giá độ ổn định của phƣơng pháp

Chúng tôi tiến hành kiểm tra độ ổn định của phƣơng pháp xác định hàm

lƣợng LEV thông qua kết quả hiệu suất thu hồi của phép thử. Phép kiểm tra ʻʻđƣa

vào - tìm thấyʼʼ đƣợc tiến hành bằng cách chủ động đƣa vào mẫu sữa 1 lƣợng xác

định LEV. Hàm lƣợng LEV đƣa vào sữa lần lƣợt từ 0,5; 1,0; 1,5 và 3,0 ng/ml. Kết

quả đƣợc trình bày ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Bảng kết quả hiệu suất thu hồi

LEV đƣa vào (ng/mL) 0,0 0,5 1,0 LEV xác định (ng/mL) 0 0,46 ± 0,01 1,03 ± 0,01 Thu hồi (%) 0 85 - 100 100 - 105

1,5 3,0 1,40 ± 0,10 2,78 ± 0,06 82 - 107 91 - 95

Kết quả ELISA cho thấy hiệu suất thu hồi LEV trong các mẫu thí nghiệm

dao động trong khoảng 82 - 107%. Hiệu suất thu hồi đƣợc cho là thích hợp trong

khoảng từ 60 - 160%. Kết quả thí nghiệm này cho thấy, hiệu suất thu hồi đạt đƣợc

nằm trong khoảng giới hạn.

3.5. Phản ứng ELISA để xác định dƣ lƣợng LEV trong sƣ̃a

Chúng tôi tiến hành khảo sát hàm lƣợng LEV trên các mẫu sữa bằng phƣơng

pháp ELISA gián tiếp cạnh tranh. Các mẫu sữa tƣơi thƣơng phẩm thu ở địa bàn

quanh Hà Nội ở dạng thanh trùng. Mẫu sữa sau khi xử lý bằng amonium sulphat

bão hoà theo mô tả trong phần phƣơng pháp nghiên cứu (trang 39), đƣợc đƣa vào

phân tích. So sánh kết quả các mẫu thí nghiệm với mẫu đối chứng âm và đối chứng

dƣơng cho thấy, trong số 12 mẫu thí nghiệm đƣa vào khảo sát, hàm lƣợng LEV có

tổng số 12 mẫu sữa và hỗn hợp sữa từ các nhà sản xuất khác nhau đã đƣợc mua để

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 55

phân tích kỹ thuật phát triển. Dựa vào nồng độ LEV chuẩn để tính hàm lƣợng LEV

ở các mẫu dƣơng tính. Trong số các mẫu kiểm tra, 3 mẫu đã xác định đó đã đƣa ra

kết quả dƣơng tính (5,36; 4,25 và 2,82 ng/m). Kết quả trình bày ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lƣợng LEV ở các mẫu sữa

Mẫu

Địa điểm thu mẫu Tản Lĩnh, Ba Vì

*) pha loãng mẫu 6 lần; **) pha loãng mẫu 10 lần

Yên Bài, Ba Vì 1* 4** 7** Kết quả ELISA 0,489 0,318 0,611 Hàm lƣợng LEV (ng/ml) 2,82 5,36 4,25

Fluroquinolone là một trong những nhóm kháng sinh tổng hợp hoá học có

khả năng khuyếch tán tốt trong mô bào, nhanh chóng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn

thông qua sự ức chế tổng hợp ADN (Brown, 1996) do đó đƣợc sử dụng phổ biến

và hiệu quả trong cả nhân y và thú y. Tuy nhiên việc sử dụng nhóm kháng sinh này

trong chăn nuôi thú y và thuỷ sản có tác dụng xấu đến môi trƣờng và sức khoẻ cộng

đồng (WHO, 1998). Nhóm Fluroquinolone đƣợc sử dụng trong thú ý gồm các loại

sau: danofloxacin (Advocin, Advocid), difloxacin (Dicural, Vetequinon),

enrofloxacin (Baytril), ibafloxacin (Ibaflin), marbofloxacin (Marbocyl,Zenequin),

orbifloxacin (Orbax,Victas), sarafloxacin (Floxasol, Saraflox, Sarafin).

Nghiên cứu của Jason et al. (2009) trên cừu non đã cho thấy kháng sinh

nhóm fluoroquinolone đã gây tác động lớn, làm cho hệ xƣơng, sụn hầu nhƣ không

phát triển trong thời gian sử dụng kháng sinh nhóm này. Trƣớc đây, đã có các

nghiên cứu về việc ảnh hƣởng đến sự phát triển xƣơng, sụn của thú non (chó, cừu)

khi sử dụng kháng sinh nhóm fluoroquinolone nhƣng do hiệu quả điều trị và mức

độ cần thiết của các kháng sinh nhóm kháng sinh này mà ngƣời ta đã bỏ qua tác hại

của nó. Bên cạnh đó, sự tồn lƣu thời gian dài sau khi sử dụng thuốc kháng sinh

nhóm fluoroquinolone cũng là nguyên nhân dẫn đến việc hạn chế và cấm sử dụng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 56

những kháng sinh thuộc nhóm này. Ở Mỹ, cơ quan quản lý thực phẩm và dƣợc

phẩm của Mỹ (FDA: Food and Drug Administration) đã không chấp nhận sự tồn

lƣu kháng sinh nhóm fluoroquinolone trong sản phẩm thủy sản nhập khẩu. Ở châu

Âu, EU đã thiết lập giới hạn lớn nhất (MRLs- Maximum Residual Limit) đối với

dƣ lƣợng thuốc trong thực phẩm cung cấp cho con ngƣời vào những năm 1990.

Trong “Council directive 96/23/EC in 1996” đã quy định rõ là Enrofloxacin trong

cơ, gan, thận của bò, lợn, gia cầm (gà, vịt) là 30 µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg.

Ủy ban thực phẩm CODEX thành lập bởi FAO và WHO đã quy định MRL đối với

Danofloxacin và Sarafloxacin dùng trong thú y ở các loại thịt, gan lợn, bò và gà

tƣơng ứng trong khoảng là 50-400 và 10-80 µg/kg.

Sữa là thực phẩm ngày càng đƣợc tiêu dùng với số lƣợng lớn, không chỉ ở

các nƣớc phát triển, mà ngay cả ở các nƣớc đang phát triển trong đó có Việt Nam.

Đối tƣợng chủ yếu tiêu thụ sản phẩm sữa là trẻ em. Việc lakm dụng kháng sinh

trong chăn nuôi, dẫn đến dƣ lƣợng của chúng trong thực phẩm là các sản phẩm từ

động vật cao, đặc biệt là sữa. Kết quả thí nghiệm trên cho thấy, hàm lƣợng LEV

phát hiện đƣợc trong 25% số mẫu phân tích, tuy nhiên hàm lƣợng LEV trong sữa

thấp, tất cả các mẫu đƣợc kiểm tra đáp ứng các nồng độ tối đa cho phép của

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 57

Fluoroquinolone trong sữa (100 µg/L).

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

1. Đã xây dựng đƣờng chuẩn hàm lƣợng LEV trong sữa bằng phƣơng pháp

ELISA gián tiếp cạnh tranh (với các điều kiện sau: Nồng độ phức hợp kháng

nguyên (LEV - OVA) phủ lên bề mặt giếng là 0,5 µg/ml; Độ pha loãng kháng thể

đa dòng kháng LEV và cộng hợp kháng thể thứ 2 (rAnti-IgG-HRP)lần lƣợt là:

5.000 lần và 10.000 lần). Khoảng phát hiện LEV trong sữa là 0,2 ng/ml - 50

ng/ml, giới hạn nồng độ phát hiện là 0,2 ng/ml.

2. Tỷ lệ phản ứng chéo của phản ứng ELISA gián tiếp cạnh tranh với các nhóm

kháng sinh thuộc Fluoroquinolone dao động trong khoảng 24-145%.

3. Đã xác định đƣợc 3 mẫu sữa dƣơng tính LEV trong số 12 mẫu sữa phân tích,

trong đó hàm lƣợng LEV đều nằm trong giới hạn cho phép của kháng sinh

nhóm Fluoroquilone trong thực phẩm.

Kiến nghị

1. Tiếp tục tối ƣu các điều kiện phản ứng ELISA cạnh tranh gián tiếp để nâng

cao độ nhạy, giới hạn và khoảng phát hiện của phƣơng pháp.

2. Phát triển phƣơng pháp dựa trên nguyên lý ELISA thành các dạng tiện lợi

hơn (que nhúng) nhằm đƣa ứng dụng trong thực tế phát hiện/định tính LEV

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 58

trong thực phẩm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Lƣơng Quốc Chính, Nguyễn Văn Chi, Nguyễn Hồng Hà (2010). Các thang

điểm thiết yếu sử dụng trong thực hành lâm sang. Nhà xuất bản y học, chƣơng

6, tr 36-38.

2. Đào Thị Vui (2007). Dược lý học. Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, tập 2, tr 130-183.

3. Phạm Thị Thu Lan và cộng sự (2008). “Đánh giá mức độ đề kháng của 5 vi

khuẩn thường gặp với các kháng sinh”. Thông tin dƣợc lâm sàng, nhà xuất

bản y học số 10/2008, tr 3-7.

4. Bộ y tế (2007). Dược thư Quốc Gia Việt Nam. Nhà xuất bản y hoc tr 324-

327;720-723; 812-813.

5. Nguồn từ UV-Việt Nam.

6. Thông tƣ số 03/2012/TT-BNNPTNT ngày 16/01/2012 sửa đổi Thông tƣ số

15/2009/TT-BNN ngày 17/03/2009 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

ban hành danh mục thuốc, hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng.

7. Bộ Y tế (2009). Hóa phân tích, Nhà xuất bản Y học.

8. Thái Phan Quỳnh Nhƣ (2005). “Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao”. Viện kiểm nghiệm - Bộ Y tế.

9. Phạm Kim Đăng và cộng sự (2008). “Ứng dụng phương pháp ELISA để phân

tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu

vực Bắc Bộ” Tạp chí khoa học và phát triển, tập VI, số 3, trƣờng ĐH Nông

nghiệp Hà Nôi.

Tiếng Anh

10. T.S. Jacoby, R.S. Kuchenbecker, R.P.dos Santos, L.Magedanz, P.Guzatto,

L.B, (2010). “Moreira Impact of hospital-wide infection tate, invasive

procedure use and antimicrobial consumption on bacterial resisstance inside

an intensive care unit”. Journal of Hospital Infection (75) pp 23-27.

11. Lorenzo Drago, Lucia Nicola, Roberto Mattina and Elena De Vecchi (2010),

“In vitro selection of resistance in Escherichia coli and Klebsiella spp. at in

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 59

vivo fluoroquinolone concentrations” BMC Microbiology 2010, pp10-119.

12. European Commission (1996) “Council directive 96/23/EC”.

13. George G. Zhanel, Daryl J. Hoban, Kris Schurek, James A. Karlowsky (2004)

“Role of efflux mechanisms on fluoroquinolone resistance in Streptococus

pneumonia and Pseudomonas aeruginosa”. International Journal of

Antimicrobial Agents 2004 (24), pp529-535.

14. Joel G. Hardman, ph.D and Lee E. Limbird, ph.D (2001). “Pharmacological

Basis of Therapeutics II”. New York, pp 1179-1182.

15. European Commission (2002) “Commission decision 2377/90/EC”.

16. R.H. Burdon, P.H. van Knippenberg (1985). Laboratory Techniques In

Biochemistry And Biology, volume 15, P. Tijssen, Practice And Theory Of

Enzyme Immunoassays, Elsevier, Amsterdam, Netherlands.

17. John M Walker (2008) Methods In Molecular Biology, volume 516, John A.

Crowther, The ELISAGuide Book, 2nd edition, Humana Press, Springer, New

York, USA.

18. John M Walker (1995) Methods In Molecular Biology, volume 42, John A.

Crowther, ELISA: Theory And Practice, Humana Press, Springer, New York,

USA.

19. IDEXX Laboratories, Inc (2007). ELISA Technical Guide.

20. Ghislain Follet (1997). Antibiotic resistance in the EU Science, Politics and

Policy. Number 3.2000, p.148-155.

21. STOLKER, AA and UA Brinkman (2005). Strategy analysis to analyze

residues veterinary medicines and growth promoting agents in animal food

production conclusion. Journal of Chromatography A. 1067: 15-53.

22. Sundlof, SF, JB Kaneene and R. Miller (1995). National Survey veterianrian

initiated drug use in lactating dairy cows. JA Vety. Med. Assoc. 207: 347-352.

23. Jiang (2011)“Development and Optimization of an Indirect Competitive

ELISA for Detection of Norfloxacin Residue in Chicken Liver”. International

Conference on Environmental Science and Technology IPCBEE vol.6 (2011)

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 60

24. Jiang (2010) “Development of an Immunoassay for Determination of

Fluoroquinolones Pollutantin Environmental Water Samples”. International

(2011) IACSIT Press, Singapore.

25. Huang (2014), International Food Research Journal 21(4): 1419-1424

“Development of an indirect competitive ELISA for detection of danofloxacin

residue in milk”.

26. Hai-tang ZHANG (2011), Zhang et al/JZhejiang Univ-Sci B (Biomed &

Biotechnol)12(11):884-891. “Development of an indirect competitive ELISA

for simultaneous detection of enrofloxacin and ciprofloxacin”.

27. Lu S., Zhang Y., Liu J., Zhao C., Liu W., and Xi R. J.Agric. Food Chem.

2006. vol. 54, p. 6995.

28. Chen, J.-J. and Jiang, J.-Q., Food Agric. Immunol.,2012, vol.24. no.3,p.331.

29. Cao, Z., Lu, S., Liu, J., Zhan, J., Meng, M., and Xi, R., Anal. Lett., 2011, vol.

44. No.6, p 1100.

30. Cao, Z., Meng, M., Lu, S., and Xi, R., Anal. Lett., 2011, vol.44, no. 6, p.1077.

31. Van Coillie E, de Block J, and Reybroeck W, J Agric. Food Chem., 2004.

vol.52, p4975.

Trích dẫn trang Web:

32. https://en.wikipedia.org.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 61

33. Shanin, A. R. Shaimardanov, Nguyen Thi Dieu Thuy, and S. A. Eremin 2015. Determination of Fluoroquinolone Antibiotic Levofloxacin in Urine by Fluorescence Polarization Immunoassay. Journal of Analytical Chemistry, 70(6): 712-717. 34. A. Shanin, N.T.D. Thuy, and S. A. Eremin 2014. Determination of Levofloxacin (the Levorotatory Stereoisomer of Ofloxacin) in Milk by an Indirect Enzyme_Linked Immunosorbent Assay. Moscow University Chemistry Bulletin, 69(3): 136–141.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 62

Kết quả phân tích bằng phần mềm OriginPro 8.5.1

Bài báo khoa học

Hắc Bá Thành1, Nguyễn Thị Thu2, S.A. Eremin3, I.A. Shanin3, Nguyễn Văn Cường2, Nguyễn Thị Diệu Thúy2(2014) 1)Sở Tài nguyên và Môi trường Thanh Hóa; 2)Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; 3)Trường ĐHTH Lô mô nô xốp.

“Xây dựng phƣơng pháp miễn dịch liên kết enzyme trực tiếp phát hiện dƣ lƣợng

Chloramphenocol trong sản phẩm sữa”, Tạp chí khoa học, Trƣờng Đại học Hồng

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 63

Đức (đã nhận bài).

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Xây dựng phương pháp ELISA gián tiếp xác định dư lượng fluoroquinolone trong sữa

HẮC BÁ THÀNH

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG FLUOROQUINOLONE TRONG SỮA

Hà Nội – 2015

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG FLUOROQUINOLONE TRONG SỮA

Mã số: 60 42 01 14 Ngƣờ i hƣớ ng dẫn khoa ho ̣c: TS. NGUYỄN THỊ DIỆU THÚY Học viên: HẮC BÁ THÀNH

Hà Nội - 2015

Có thể bạn quan tâm

Khảo sát sự lưu hành và tình trạng bảo hộ sau tiêm phòng vaccine viêm da nổi cục trên đàn bò tại tỉnh Long An

Định lượng GH (Growth Hormon)

Định lượng IgE (Immuglobulin E) (Bằng phương pháp ELISA)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu kỹ thuật trồng cải bó xôi (Spinacia spp.) trên hệ thống khí canh áp suất cao

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây xạ đen (Ehretia asperula) in vitro

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp. từ đất vùng rễ xoài có khả năng ức chế nấm Colletotrichum sp. gây bệnh thán thư trên xoài

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng tăng sinh của tế bào 3T3 trong điều kiện vi trọng lực mô phỏng

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tiêu thảo lá nhăn (Cryptocoryne wendtii) bằng hệ thống bioreactor

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu khả năng sử dụng mẫu lưu giữ trên thẻ tách huyết tương trong xét nghiệm theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đánh giá ảnh hưởng của nguyên bào sợi đến hiệu quả tạo phôi lợn Ỉ nhân bản

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính chống suy giảm trí nhớ và cơ chế tác dụng của dịch chiết hoa Thiên lý (Telosma cordata) trên mô hình tế bào thần kinh

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện và đánh giá hoạt tính sinh miễn dịch của protein P72 tái tổ hợp của virus gây bệnh dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever) trên Nicotiana benthamiana

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn tía quang hợp bản địa ứng dụng làm probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hệ gen ty thể người Việt Nam thuộc ba dân tộc Cống, Hoa và Sán Dìu

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu giải mã và phân tích đặc điểm phân tử virus PEDV gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn năm 2023 tại tỉnh Hưng Yên

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xác định biến đổi gen ở một số bệnh nhân thông liên nhĩ bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân tích toàn bộ hệ gen ty thể và đa hình nucleotide đơn vùng không trao đổi chéo của nhiễm sắc thể Y người Việt Nam thuộc năm dân tộc Pa Kô, Cơ-Tu, Rơ-Măm, Kinh miền Trung và Kinh miền Nam

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn có lợi sinh trưởng trong môi trường chứa tảo

Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh rụng lá Pestalotiopsis hại cây cao su tại một số vùng trồng chính của Việt Nam

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa

Luận án Tiến sĩ: Tổng hợp luật dẫn và điều khiển cho một lớp tên lửa đối hải trên cơ sở ứng dụng mạng nơ ron và hệ mờ

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu tổng hợp hệ điều khiển góc Pitch tua bin gió trong điều kiện có nhiễu tác động

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hóa học lipid của hai loài san hô thủy tức Millepora dichotoma và Millepora platyphylla ở Việt Nam

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu kiểm soát phân phối công suất kéo trên cầu chủ động của ô tô con bằng ABS

Luận án Tiến sĩ: Ứng dụng phản ứng Domino vào tổng hợp các dẫn xuất Podophyllotoxin, Pyrimidine và đánh giá hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học của cây chùm ngây (Moringa oleifera)

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu thành phần hóa học và ứng dụng ức chế ăn mòn cho thép của cao chiết xuất từ cây Lộc vừng thuộc họ Lecythidaceae

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok