Luận văn Thạc sĩ Vật lí: Xây dựng quy trình phân tích độc tố tetrodotoxins trong ốc biển ở Việt Nam bằng LC-MS/MS

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:73

Thêm vào BST

Báo xấu

11
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn "Xây dựng quy trình phân tích độc tố tetrodotoxins trong ốc biển ở Việt Nam bằng LC-MS/MS" được hoàn thành với mục tiêu nhằm đưa ra được quy trình xác định độc tố tetrodotoxins ở ốc biển có độ tin cậy và chính xác cao, phù hợp với điều kiện trang thiết bị tại Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Vật lí: Xây dựng quy trình phân tích độc tố tetrodotoxins trong ốc biển ở Việt Nam bằng LC-MS/MS

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi tự tìm hiểu và nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm trước pháp luật. Tác giả Võ Thị Đoan Trang
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ quý báu của các thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp. Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS. Đào Việt Hà đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện Hải dương học Nha Trang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành các học phần của luận văn và các thủ tục cần thiết. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của quý anh chị Phòng thí nghiệm về An toàn thực phẩm và môi trường (Khu vực miền Trung)- Viện Hải dương học Nha Trang; của quý thầy cô, anh chị học viên cao học các lớp CHE21A đang công tác và học tập tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang. Tôi cũng xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo Khánh Hòa, Ban lãnh đạo trường THPT Lý Tự Trọng, các anh chị em đồng nghiệp đã luôn tạo điều kiện trong công việc, động viên và trợ giúp tôi để tôi dành thời gian chuyên tâm học tập và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tác giả luận văn Võ Thị Đoan Trang
1 MỤC LỤC MỤC LỤC ........................................................................................................ 1 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT..................................... 4 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ........................................................................ 6 DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................. 8 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ........................................................................ 9 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 10 Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .................................................. 12 1.1.ĐỘC TỐ TETRODOTOXIN .................................................................... 12 1.1.1.Đặc tính, cấu trúc hóa học ...................................................................... 12 1.1.2.Một số dẫn chất của Tetrodotoxin.......................................................... 13 1.1.3.Độc tính Tetrodotoxin ............................................................................ 14 1.1.4.Cơ chế hoạt động.................................................................................... 14 1.1.5.Tetrodotoxins trong ốc biển ................................................................... 15 1.2.MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TETRODOTOXINS. ............. 16 1.2.1.Phương pháp thử nghiệm sinh học ......................................................... 16 1.2.1.1.Phương pháp sinh hóa chuột ............................................................... 16 1.2.1.2.Phương pháp thử nghiệm cảm ứng sinh học ....................................... 18 1.2.1.3.Thử nghiệm trên mô tế bào ................................................................. 18 1.2.1.4.Phương pháp thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme ..... 19 1.2.2.Phương pháp hóa học ............................................................................. 20 1.2.2.1.Phương pháp sắc ký lớp mỏng ............................................................ 20 1.2.2.2.Phương pháp quang phổ hồng ngoại ................................................... 20 1.2.2.3.Phương pháp sắc ký khí khối phổ ....................................................... 21 1.2.2.4.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................. 22 1.3.PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ ..................................... 26
2 1.3.1.Sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ ............................................................ 26 1.3.2.Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ ................................................................. 27 1.3.2.1.Pha động ................................................................................... 27 1.3.2.2.Hệ thống bơm ................................................................................... 27 1.3.2.3.Cột tách và pha tĩnh............................................................................ 27 1.3.2.4.Hệ tiêm mẫu ................................................................................... 28 1.3.2.5.Detector khối phổ ................................................................................ 28 1.3.3.Một số chế độ trong sắc ký lỏng khối phổ ............................................. 28 1.3.3.1.Chế độ quét ................................................................................... 28 1.3.3.2.Chế độ khảo sát ion chọn lọc .............................................................. 28 1.3.3.3.Chế độ khảo sát ion cô lập và khảo sát đa ion cô lập ......................... 29 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 30 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 30 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 30 2.1.2. Nguyên liệu, thiết bị .............................................................................. 30 2.1.2.1. Dung môi, hóa chất ............................................................................ 30 2.1.2.2. Thiết bị, dụng cụ phân tích................................................................. 30 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 31 2.2.1. Thu mẫu và bảo quản mẫu .................................................................... 31 2.2.2.Xây dựng quy trình phân tích................................................................. 31 2.2.2.1. Khảo sát điều kiện khối phổ xác định TTX ....................................... 31 2.2.2.2. Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................... 32 2.2.2.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ............................................................. 32 2.2.3. Đánh giá quy trình phân tích TTXs ...................................................... 33 2.2.3.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn ..................... 33 2.2.3.2. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ......................... 34
3 2.2.3.3. Độ chụm và độ đúng của phương pháp ............................................. 34 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 36 3.1. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH TTXs TRÊN THIẾT BỊ LC- MS/MS ............................................................................................................ 36 3.1.1. Khảo sát các điều kiện của detector khối phổ ....................................... 36 3.1.2. Khảo sát các điều kiện của hệ pha động ............................................... 37 3.1.2.1. Khảo sát chương trình gradient pha động .......................................... 38 3.1.2.2. Khảo sát tốc độ dòng .......................................................................... 40 3.2. KHẢO SÁT QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU ............................................... 43 3.2.1. Khảo sát nồng độ dung môi tách chiết .................................................. 45 3.2.2. Khảo sát thể tích dung môi rửa giải ...................................................... 47 3.3. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH........................................... 53 3.3.1.Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn ................................... 53 3.3.2. Giới giạn phát hiện và giới hạn định lượng .......................................... 55 3.3.3. Đánh giá độ chụm và độ đúng của phương pháp .................................. 56 3.4. PHÂN TÍCH MỘT SỐ MẪU ỐC THỰC TẾ ......................................... 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 63 PHỤ LỤC ....................................................................................................... 69
4 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Hiệp hội các nhà hóa AOAC Association of official analytical chemists phân tích chính thức. Axit ethylene diamine EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid tetraacetic Xét nghiệm hấp thụ miễn ELISA Enzyme linked immunosorbent assay dịch liên kết với enzyme Kỹ thuật ion hóa bằng ESI Electro spray ionization phun điện tử FLD Fluorescence detector Đầu dò huỳnh quang GC-MS Gas chromatography-Mass spectrometry Sắc ký khí ghép khối phổ IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao Liquid chromatography- Mass LC-MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ spectrometry LC- Liquid chromatography tandem mass Sắc ký lỏng khối phổ kép MS/MS spectrometry LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng Phương pháp sinh hóa MBA Mouse bioassay chuột Kỹ thuật khảo sát MRM Multiple reaction monitoring đa ion cô lập
5 Độc tố gây tê liệt ở PSP Paralytic shellfish poisons động vật có vỏ MU Mouse unit Đơn vị chuột SD Standard devitation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn Cảm biến cộng hưởng SPR Surface plasmon resonance plasmon bề mặt STX Saxitoxin Saxitoxin Kỹ thuật khảo sát SRM Selected reaction monitoring ion cô lập TTX Tetrodotoxin Tetrodotoxin Tetrodotoxin và các dẫn TTXs Tetrodotoxin analogues chất Phương pháp thử nghiệm TCBA Tissue culture bioassay trên mô tế bào RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối
6 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1. 1. Cấu trúc hóa học TTX .................................................................... 12 Hình 1. 2. Một số dẫn xuất của TTX .............................................................. 14 Hình 1. 3. Tetrodotoxin ngăn kênh vận chuyển natri .................................... 15 Hình 1. 4. Mẫu ốc Nassarius papillosus và Nassarius glans gây ngộ độc tại Vạn Ninh, Khánh Hòa ngày 11/9/2020 ........................................................... 16 Hình 1. 5. Phổ hồng ngoại của TTX .............................................................. 21 Hình 1. 6. Sắc ký đồ HPLC-FLD của TTXs chuẩn và ................................... 23 Hình 1. 7. Phổ khối phân giải LC-MS/MS của 3 loài (A) Oliva annulata, (B) Oliva lignaria, (C) Oliva hirasei và (D) TTX ............................................... 24 Hình 1.8. Sắc ký đồ LC-MS, mẫu chuẩn TTXs (A) và các mẫu thử F.niphobles (B), T.nigrovirids (C), T.biocellatus (D) ................................... 25 Hình 2. 1. Thiết bị LC-MS/MS tại phòng thí nghiệm về An toàn thực phẩm và môi trường (Khu vực miền Trung) ................................................................. 30 Hình 2. 2. Mẫu ốc (a) Nassarius glans, (b) Nassarius papillosus .................. 31 Hình 3. 1. Sắc ký đồ LC-MS/MS của TTXs chuẩn với các thế phân mảnh - 25V, -27V, -29V.............................................................................................. 36 Hình 3. 2. Sắc ký đồ LC-MS/MS của TTXs chuẩn với các thế phân mảnh - 38V, - 40V, -42V............................................................................................. 37 Hình 3. 3. Đồ thị chương trình gradient 1 ....................................................... 39 Hình 3. 4.Sắc ký đồ LC-MS/MS của TTXs chuẩn theo chương trình gradient 1 ....................................................................................................................... 39 Hình 3. 5. Đồ thị chương trình gradient 2 ....................................................... 40 Hình 3. 6. Sắc ký đồ LC-MS/MS của TTXs chuẩn theo chương trình gradient 2 ....................................................................................................................... 40 Hình 3. 7. Sắc ký đồ LC-MS/MS của TTXs chuẩn với tốc độ dòng 0,4 ml/phút ............................................................................................................ 41
7 Hình 3. 8. Sắc ký đồ LC-MS/MS của TTXs chuẩn với tốc độ dòng 0,6 ml/phút ............................................................................................................ 42 Hình 3. 9. Sơ đồ xử lý mẫu dự kiến ................................................................ 44 Hình 3. 10. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi TTXs................................................................................................................ 47 Hình 3. 11. Đồ thị ảnh hưởng của thể tích rửa giải đến hiệu suất thu hồi TTXs ....................................................................................................................... 50 Hình 3. 12. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu........................................................... 51 Hình 3. 13. Đồ thị sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ TTX ................. 54 Hình 3. 14. Đồ thị sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ 4-epiTTX ........ 54 Hình 3. 15. Đồ thị sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ 4,9-anhydroTTX . ....................................................................................................................... 55
8 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2. 1. Số lượng và khối lượng trung bình của 2 loài ốc bùn thu ở vùng biển Khánh Hòa............................................................................................... 31 Bảng 2. 2. Nồng độ dãy các dung dịch chuẩn ................................................. 34 Bảng 3. 1. Thông số điều kiện tối ưu phân tích TTXs bằng LC-MS/MS ....... 43 Bảng 3. 2. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi TTX ................................................................................................................. 45 Bảng 3. 3. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi 4- epiTTX ............................................................................................................ 46 Bảng 3. 4. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ acid acetic đến hiệu suất thu hồi 4,9-anhydroTTX.............................................................................................. 46 Bảng 3. 5. Kết quả ảnh hưởng thể tích rửa giải đến hiệu suất thu hồi TTX ... 48 Bảng 3. 6. Kết quả ảnh hưởng thể tích rửa giải đến hiệu suất thu hồi 4-epiTTX ......................................................................................................................... 49 Bảng 3. 7. Kết quả ảnh hưởng thể tích rửa giải đến hiệu suất thu hồi 4,9- anhydroTTX .................................................................................................... 49 Bảng 3. 8. Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ TTXs ........................... 53 Bảng 3. 9. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và đường chuẩn của TTXs ... 55 Bảng 3. 10. Độ lặp lại của phương pháp ......................................................... 57 Bảng 3. 11. Hiệu suất thu hồi của phương pháp ............................................. 57 Bảng 3. 12. Kết quả phân tích 15 mẫu ốc loài N. glans .................................. 59 Bảng 3. 13. Kết quả phân tích 20 mẫu ốc loài N. papillosus .......................... 60
9 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Sắc ký đồ LC-MS/MS phân tích các mẫu ốc N. glans ....... 69 Phụ lục 2. Sắc ký đồ LC-MS/MS phân tích các mẫu ốc N. papillosus 70
10 MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Độc tố sinh học biển ngày càng được quan tâm trên toàn thế giới, một trong số đó là Tetrodotoxins (TTXs). Tetrodotoxin là một chất độc thần kinh mạnh gây ra nhiều trường hợp ngộ độc dẫn đến tử vong ở người nhiều nơi trên thế giới. Việc phát hiện nhiều loài thủy hải sản chứa độc tố TTXs chẳng hạn như cá nóc, bạch tuộc đốm xanh, so biển, một số loài cua biển, ốc biển...đã thu hút sự quan tâm của giới khoa học và các nhà quản lý về an toàn thực phẩm biển. Do đó, ngoài các nghiên cứu về phân bố, thành phần, hàm lượng, độc tính...của độc tố này ở sinh vật, các nhà nghiên cứu còn tập trung phát triển các phương pháp phân tích xác định độc tố này, đặc biệt là các phương pháp thử nghiệm sinh học và phân tích hóa học. Ở Việt Nam, từ 2007 đến nay, mỗi năm đều ghi nhận các vụ ngộ độc TTXs trong ốc biển xảy ra chủ yếu ở các cùng ven biển Thanh Hóa, Ninh Thuận, Khánh Hòa...Mặc dù được rất nhiều sự quan tâm nghiên cứu về độc tố TTXs với các phương pháp, kỹ thuật phân tích khác nhau, nhưng đến nay ở Việt Nam chưa có nhiều công bố về về phân tích độc tố này ở ốc biển bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ kép LC-MS/MS. Đây là kỹ thuật hiện đại với độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác rất cao giúp phát hiện chính xác độc tố TTX và các đồng phân của nó, đáp ứng được tiêu chuẩn về số liệu độc tố TTXs trong sinh vật biển so với thế giới. Vì vậy, việc thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình phân tích độc tố tetrodotoxins trong ốc biển ở Việt Nam bằng LC-MS/MS” là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Mục đích nghiên cứu Đưa ra được quy trình xác định độc tố tetrodotoxins ở ốc biển có độ tin cậy và chính xác cao, phù hợp với điều kiện trang thiết bị tại Việt Nam. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát nồng độ acid acetic dùng tách chiết độc tố TTXs từ 1-2 loài ốc biển tự nhiên;
11 - Khảo sát một số điều kiện tách chiết và tinh sạch độc tố TTXs từ ốc biển; - Khảo sát một số điều kiện phân tích độc tố TTXs từ mẫu chiết bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ kép (LC-MS/MS). - Xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích độc tố trong ốc biển TTXs bằng phương pháp LC-MS/MS. - Đánh giá kết quả của quy trình thực nghiệm trên cơ sở so sánh, đối chiếu với số liệu kiểm chứng. Cơ sở khoa học và tính thực tiễn của đề tài Dựa trên những tiến bộ khoa học- kỹ thuật và công nghệ, trong luận án này tôi đề xuất nghiên cứu xây dựng quy trình thực nghiệm phân tích TTXs bằng LC-MS/MS, phù hợp với điều kiện trang thiết bị tại phòng thí nghiệm An toàn thực phẩm và môi trường (Khu vực miền Trung), Viện Hải dương học đảm bảo độ chính xác và tin cậy phương pháp phân tích. Đối tượng nghiên cứu là một số loài ốc biển thường gây ngộ độc tại vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa. Kết quả của đề tài là dẫn liệu khoa học tin cậy phục vụ công tác quản lý an toàn thực phẩm biển và là tiền đề cần thiết để có số liệu phân tích chính xác phục vụ cho những công trình công bố quốc tế về độc tố TTXs trong sinh vật biển tại Việt Nam. Những đóng góp của luận văn - Đề xuất được phương pháp tách chiết, tinh sạch độc tố TTXs trong mẫu ốc để phân tích bằng LC-MS/MS. - Xây dựng được quy trình phân tích độc tố TTXs trong mẫu ốc biển bằng (LC-MS/MS) có độ chính xác cao.
12 Chương 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. ĐỘC TỐ TETRODOTOXIN 1.1.1. Đặc tính, cấu trúc hóa học Tetrodotoxin là một trong những chất độc phi protein mạnh nhất cũng như chất độc tự nhiên biển được biết đến nhiều nhất. Năm 1909, Tiến sĩ Yoshizumi Tahara đưa ra xác nhận rằng cá nóc chứa một loại chất độc và đặt tên là Tetrodotoxin theo tên của họ cá nóc mà nó được phân lập lần đầu tiên- Tetraodontidae [1]. Cấu trúc của chất độc này đã được xác định bởi Tsuda và cộng sự [2], Goto và cộng sự [3]. TTX là dẫn xuất aminoperhydroquinaoline, hợp chất dị vòng có công thức phân tử C11H17O8N3 và có cấu trúc hóa học được mô tả như hình 1.1. Hình 1. 1. Cấu trúc hóa học TTX[3] TTX là (4R,4aR,5R,6S,7S,8S,8aR,10S,12S)-2-azaniumyliden-4,5,8,12- tetrahydroxy-6-(hydroxymethyl)-2,3,4,41,5,6,7,8-octahydro-1H-8a,10- mathano-5,7-(epoxymethanoxy)quinazolin-10-olat. Hoạt tính của TTX được quyết định bởi các nhóm chức quan trọng bao gồm: (1) Nhóm guanidine có điện tích dương của 3 nguyên tử nitơ (Hình 1.1); (2) Vòng pyrimidine (Hình 1.1), ba nhóm hydroxyl (có chức năng ổn định phức hợp liên kết giữa TTX và các kênh natri bề mặt pha lỏng)
13 Về đặc tính, TTX là một loại bột không màu. TTX trở nên sẫm màu ở khoảng 220oC nhưng không nóng chảy [4], có cấu trúc lưỡng cực [5] tan trong nước, bền nhiệt. Sự có mặt nhóm guanidine perhydroquinazoline (guanidin có tính bazơ mạnh) trong phân tử làm cho TTX dễ tan trong dung dịch axit. Ngoài ra do TTX cấu trúc ester nên dễ bị thủy phân trong dung dịch có tính axit mạnh hoặc kiềm mạnh. Môi trường để đảm bảo cấu trúc TTX ổn định trong dung dịch là trong axit hữu cơ yếu [6]. Phân tử TTX có 6 nhóm OH ở vị trí C 4, C6, C8, C9, C10, C11 ở mỗi vị trí gắn thêm nhóm guaidin có tính kiềm mạnh Cấu trúc TTX thay đổi liên quan đến một hay nhiều nhóm OH, chúng có ái lực với màng tế bào não, ở đó có chứa nhiều kênh vận chuyển ion Na +. Nghiên cứu cho thấy kênh vận chuyển ion Na+ bị đóng khi dùng TTX với nồng độ 1,8 nM [7]. 1.1.2. Một số dẫn chất của Tetrodotoxin Trong tự nhiên, TTX cùng tồn tại với các dẫn xuất của nó. Cho đến nay đã có 30 cấu trúc của TTX đã được báo cáo và độc tính thay đổi tùy theo cấu trúc [8]. Các dẫn xuất deoxy của TTX thì ít độc hơn TTX nhưng các dẫn xuất hydroxyl độc hơn TTX. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện các dẫn chất của TTX như 4-epiTTX; 4,9-anhydroTTX; 5,6,11-trideoxyTTX [8] trong trứng loài cá nócFugu poecilonotus và Fugu pardalis [9]; 6-epiTTX trong cá nóc Spheroids Spengler [10] và các loài khác như loài sa giông Cynops ensicauda [11], ốc Nassarius glans, bạch tuộc đốm xanh Hapalochlaena [12]…Một số cấu trúc của các dẫn xuất TTXs được mô tả trong hình 1.2.
14 Hình 1. 2. Một số dẫn xuất của TTX [8] 1.1.3. Độc tính Tetrodotoxin Độc tính của TTX thường được biết đến độc hơn một nghìn lần so (1200 lần) với Cyanua và hiện chưa có thuốc giải độc đặc hiệu [9]. Trong các thử nghiệm sinh học trên chuột, liều gây chết trung bình LD 50 được phát hiện là 10 µg/kg khi ăn phải chất độc và từ 1 đến 2 mg TTX là đủ để gây chết cho một người trưởng thành [13], [14]. Theo nghiên cứu của Kao [15], liều gây chết tối thiểu của TTX trên một số loài động vật qua đường tiêm dưới da như [10]: ếch: 5 µg/kg; gà mái: 6 µg/kg; chuột nhắt: 8 µg/kg; bồ câu 2,7 µg/kg; thỏ: 8 µg/kg; mèo: 10 µg/kg. 1.1.4. Cơ chế hoạt động Cơ chế gây độc của TTX trong cơ thể là ức chế kênh trao đổi ion natri vận động qua màng tế bào thần kinh với LD50 9µg/kg (tiêm phúc mạc). TTX hoạt động bằng cách chặn các kênh natri, làm mất sự lan truyền tín hiệu thần kinh đến màng tế bào quan trọng của tế bào cơ tim, cơ xương, hệ thần kinh trung ương và ngoại biên [16] dẫn đến các triệu chứng điển hình và thậm chí nặng nhất là tử vong [17], [13].
15 Hình 1. 3. Tetrodotoxin ngăn kênh vận chuyển natri [13] Cấp độ của triệu chứng ngộ độc TTXs được Tani và cộng sự đưa ra năm 2009 [18]. Cấp độ 1 bao gồm các dấu hiệu tê liệt bao gồm tê môi và đầu lưỡi và các vấn đề tiêu hóa như nôn mửa. Cấp độ 2 là tê liệt lan đến tứ chi, đau đầu. Cấp độ 3 làm tăng các triệu chứng thần kinh cơ (như chứng khó nuốt, chứng mất ngôn ngữ, hôn mê, mất phối hợp, mất điều hòa, cảm giác bồng bềnh, liệt dây thần kinh sọ, cơ co giật) và đi kèm các triệu chứng tim mạch (hạ huyết áp hoặc tăng huyết áp, rối loạn nhịp tim, nhịp tim nhanh và bất thường, tím tái, xanh xao, khó thở). Trong những trường hợp nghiêm trọng dẫn đến cấp độ 4, nạn nhân tê liệt hoàn toàn, suy tim và dẫn đến tử vong. 1.1.5. Tetrodotoxins trong ốc biển Các vùng biển trên thế giới có rất nhiều thủy sản chứa độc tố TTXs sinh sống, đặc biệt ở các vùng biển nhiệt đới. Trong đó, độc tố TTXs trong một số loài ốc biển đã được ghi nhận bởi nhiều nhóm nghiên cứu như Noguchi và cộng sự [19], Hwang và cộng sự [20], Taniyama và cộng sự [18], Đặng Quốc Minh và cộng sự [21]. Độc tố TTX được tìm thấy trong nhiều loài ốc như ốc mặt trăng (Turban), ốc đụn (The top of shells), ốc hương Nhật Bản (Babylonia japonica), ốc bùn (Niotha, Zeuxis)...Từ năm 1985 đến 2004, tại Trung Quốc đã có ít nhất 28 vụ ngộ độc. Ngoài ra, một số trường hợp được ghi nhận do ngộ độc TTXs khi ăn ốc biển tại Đài Loan, Nhật Bản, Brunei [22], [23], [19], [20]. Độc tính TTXs tính theo đơn vị chuột (MU) trong loài Nassarius glans theo ghi nhận của Tani từ 725 đến 9860 MU/cá thể [15]. Tại Việt Nam, từ năm 2006 đến 2020, tình hình ngộ độc ốc biển do TTXs xảy ra rải rác ở các địa phương ven biển như Quảng Ngãi, Bình Thuận,
16 Khánh Hòa... gây ra một số trường hợp tử vong. Theo khảo sát, đa số các loài ốc này thuộc họ Nasariidae cụ thể là ốc bùn răng cưa có tên khoa học Nassarius papillosus và ốc bùn bóng, có tên khoa học Nassarius glans [16], [21]. Theo nghiên cứu Đặng Quốc Minh và cộng sự, các loài N. Pullus, N. conoidalis conoidalis và N. glans được xác định chứa hàm lượng cao độc tố TTXs, trung bình từ 368-2625 MU/cá thể, độc tính vượt ngưỡng cho phép [16]. Hình 1. 4. Mẫu ốc Nassarius papillosus và Nassarius glans gây ngộ độc tại Vạn Ninh, Khánh Hòa ngày 11/9/2020 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TETRODOTOXINS. Quy trình xác định độc tố TTXs trong sinh vật biển nói chung cũng như trong ốc biển nói riêng đã được nghiên cứu rộng rãi bởi các nhà khoa học. Có một số phương pháp khác nhau đã được phát triển nhưng nhìn chung tập trung vào 2 nhóm phương pháp chính. 1.2.1. Phương pháp thử nghiệm sinh học 1.2.1.1. Phương pháp sinh hóa chuột Xét nghiệm sinh hóa chuột MBA (Mouse bioassay) là phương pháp chính để phát hiện độc tố trong động vật có vỏ được áp dụng nhiều nước trên thế giới. Trong các xét nghiệm sinh học trên chuột, chất chiết từ mẫu được đưa vào cơ thể động vật thí nghiệm và sau đó thời gian chết được theo dõi.
17 Để biết nồng độ TTX trong mẫu nghiên cứu, thử nghiệm sinh học trên chuột được thực hiện bằng cách tiêm phúc mạc. Sau khi tiêm chất chiết TTX, chuột thử nghiệm bắt đầu xuất hiện các dấu hiệu và triệu chứng đặc trưng như cào xước vai, miệng bằng chân sau, yếu dần đến liệt ở chân sau, cử động không phối hợp, thở nông, co giật, nhảy, tiếp theo là suy hô hấp và cuối cùng bi chết. Độc tính của chất chiết chứa TTX được biểu thị bằng đơn vị chuột MU. Quy định đơn vị chuột (MU) là lượng độc tố TTX tối thiểu gây chết chuột có trọng lượng 18 - 20 g trong vòng 30 phút. Hashimoto và Noguchi [9] đã xác định chính xác hàm lượng độc tố TTX ở của cá bống tượng sử dụng đường cong này quan hệ giữa liều lượng và thời gian chết của chuột. Một loạt các dung dịch thử nghiệm được chuẩn bị bằng cách pha loãng dịch chiết độc tố chưa biết với acid acetic 0,1%. Một lượng nhỏ các dung dịch này được tiêm vào màng bụng một nhóm chuột. Đường cong thời gian chết được vẽ dựa vào giá trị trung bình của thời gian chuột chết ở mỗi nồng độ pha loãng. Để xác định độc tố trong động vật chân bụng biển (Nassarius glans) trong vụ ngộ độc ốc biển gây tử vong trên đảo TungSa ở Đài Loan vào tháng 4 năm 2004, Hwang và cộng sự [24] đã thu thập 20 mẫu ốc gây ngộ độc để làm mẫu phân tích. Các mô mềm tách ra được làm nhuyễn với acid axetic 1% trong methanol trong vòng 5 phút và ly tâm. Dịch chiết được làm khô ở 45oC sử dụng hệ thống cô quay chân không và được kiểm tra độc tính TTX trên dòng chuột nhắt trắng ICR khỏe mạnh, khối lượng từ 18-20 gam. Kết quả xác định được độc tính trung bình của từng mẫu ốc N. glans khác nhau trong nghiên cứu này là 5.1886 ±1.959 MU. MBA cho đến nay vẫn được sử dụng trong một số trường hợp. Tuy nhiên, do có một số hạn chế như lý do đạo đức, việc sử dụng MBA đối với một số nhóm độc tố biển chỉ là phương pháp tham khảo. Ngoài ra, MBA không thể cung cấp thông tin về thành phần độc tố cũng như phân biệt được TTXs với các chất độc thần kinh khác như chất độc gây tê liệt ở động vật có vỏ (PSP) ở một số loài động vật biển chứa đồng thời cả 2 loại này. Thêm vào đó, các nhược điểm khác của kỹ thuật này còn tồn tại, như thời gian thử nghiệm kéo dài, thiếu tính đặc hiệu và dẫn đến các kết quả dương tính giả
18 cao. Vì những lý do này, nhu cầu phát triển các phương pháp thay thế MBA đã được nghiên cứu rộng rãi. 1.2.1.2. Phương pháp thử nghiệm cảm ứng sinh học Một trong những phương pháp giúp phát hiện độc tố nhanh chóng là cảm biến cộng hưởng plasmon bề mặt SPR (Surface Plasmon Resonance). SPR cho phép xác định các thông số động học của tương tác phân tử, nhưng nó cũng được sử dụng để định lượng chất phân tích trong các nền mẫu phức tạp. Năm 2013, Campbell và cộng sự [27] đã phát triển phương pháp xét nghiệm SPR phát hiện TTX đơn giản và nhanh chóng ở động vật chân bụng ở Châu Âu. Mô mềm động vật chân bụng hoặc cá nóc được chiết bằng dung dịch đệm natri axetat, pH =5,0. Dịch chiết được pha loãng 1:20 trong dung dịch đệm pH =7,4. Dung dịch kháng thể được trộn với lượng bằng nhau của dung dịch hiệu chuẩn hoặc mẫu và được tiêm trên bề mặt chip với tốc độ dòng 12 µl/phút trong 2 phút. Việc đọc các đơn vị đáp ứng của thiết bị được thực hiện 10 giây trước và 30 giây sau mỗi lần bơm để xác định sự khác biệt về đơn vị của đáp ứng thiết bị tương đối với từng chất hiệu chuẩn hoặc mẫu. Bề mặt chip được tái sinh bằng hỗn hợp với tỉ lệ 1:1 acid clohydric (10 nM) và dung dịch natri dodecyl sulfate 1% có pH 1,75. Một chu kỳ phân tích điển hình được hoàn thành trong khoảng 6 phút và mỗi chất chuẩn được phân tích lặp lại [9]. Quy trình chiết xuất đơn đã được áp dụng để thúc đẩy tính nhanh chóng của thử nghiệm. Việc chuẩn bị mẫu đơn giản này cho phép chiết xuất 40 mẫu mỗi giờ với tốc độ phát hiện nhanh 6 phút mỗi lần phân tích. Tuy nhiên SPR có độ nhạy kém hơn thử nghiệm sinh học truyền thống vì phương pháp này chịu ảnh hưởng lớn bởi các điều kiện bên ngoài. Tất cả các yếu tố làm thay đổi chỉ số khúc xạ trên bề mặt cảm biến làm cản trở quá trình phân tích như nền mẫu không đồng nhất, phức tạp và các liên kết không đặc hiệu [28]. 1.2.1.3. Thử nghiệm trên mô tế bào Phương pháp thử nghiệm trên mô tế bào TCBA (Tissue Culture Bioassay) này có thể thay thế cho MBA. TCBA phát hiện cả TTX và STX do