Luận văn Thạc sĩ Vật lý: Hiệu ứng đám đông đại phân tử đối với tính chất cuốn của protein

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:47

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung nghiên cứu bao gồm: Nghiên cứu ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên nhiệt độ chuyển pha cuốn; nghiên cứu ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên độ ổn định của trạng thái cuốn. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Vật lý: Hiệu ứng đám đông đại phân tử đối với tính chất cuốn của protein

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TẠ THỊ QUYÊN HIỆU ỨNG ĐÁM ĐÔNG ĐẠI PHÂN TỬ ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CUỐN CỦA PROTEIN LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LÝ Hà Nội – 2019
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TẠ THỊ QUYÊN HIỆU ỨNG ĐÁM ĐÔNG ĐẠI PHÂN TỬ ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CUỐN CỦA PROTEIN Chuyên ngành: Vật lý lý thuyết và vật lý toán Mã số: 8440103 LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LÝ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS. TS. Trịnh Xuân Hoàng Hà Nội – 2019
LỜI CẢM ƠN Với tình cảm chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy giáo, cô giáo đã tham gia giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian triển khai đề tài. Đặc biệt, Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất tới Thầy - PGS. TS. Trịnh Xuân Hoàng, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới: Ban Giám đốc, Phòng đào tạo của Học Viện Khoa Học Công Nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Ban Giám hiệu cùng toàn thể đồng nghiệp trường THPT Yên Khánh B - Ninh Bình đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu đề tài của mình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, đặc biệt là chồng và các con tôi đã luôn ở bên, yêu thương, động viên, cổ vũ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khoá học này. Mặc dù đã có rất nhiều cố gắng, song do thời gian nghiên cứu có hạn, kinh nghiệm nghiên cứu chưa nhiều, nên khó tránh khỏi những thiếu sót. Tác giả kính mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của Hội đồng khoa học, các thầy giáo, cô giáo và các bạn đồng nghiệp. Hà Nội, ngày 15 tháng 6 năm 2019 Tác giả luận văn TẠ THỊ QUYÊN 1
MỤC LỤC Mở đầu ...........................................................................................................3 Chương 1: Tổng quan về cuốn protein và hiệu ứng đám đông đại phân tử......6 1.1. Các thông tin cơ bản về protein ......................................................7 1.2. Hiện tượng cuốn protein trong ống nghiệm ....................................8 1.3. Mô hình hai trạng thái trong cuốn protein .......................................9 1.4. Hiệu ứng đám đông đại phân tử đối với cuốn protein ...................10 1.5. Lý thuyết hạt tỷ lệ ........................................................................12 Chương 2: Các mô hình và phương pháp mô phỏng ......................................22 2.1. Mô hình Go cho protein ................................................................24 2.2. Mô hình đại phân tử đám đông .....................................................26 2.3. Phương pháp động lực học phân tử dựa trên phương trình Langevin ..............................................................................................................28 2.4. Phương pháp phân tích biểu đồ có trọng số ................................32 Chương 3: Một số kết quả nghiên cứu ...........................................................33 3.1. Ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên nhiệt độ chuyển pha cuốn ....................................................................................................34 3.2. Ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên độ ổn định của trạng thái cuốn ......................................................................................................37 Kết luận ........................................................................................................41 Tài liệu tham khảo .......................................................................................42 2
Mở đầu Ngày nay, với cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật phát triển mạnh mẽ và sự bùng nổ thông tin trên nhiều lĩnh vực, thế giới đang bước vào thời đại của toàn cầu hoá, con người ngày càng khẳng định vị thế trong quá trình phát triển của nhân loại. Cùng với đó, nhu cầu chăm sóc, bảo vệ sức khoẻ ngày càng được tăng cường, y học ngày càng phát triển. Vật lý sinh học là môn khoa học liên ngành, ứng dụng lý thuyết và phương pháp của khoa học vật lý vào các vấn đề sinh học, y học. Phạm vi nghiên cứu của vật lý sinh học rất rộng, trải từ phân tích trình tự ADN tới các mạng nơ-ron thần kinh. Trong vật lý sinh học, nghiên cứu về protein là một trong những hướng nghiên cứu quan trọng, do protein là các phân tử thực hiện hầu hết các chức năng của cơ thể sống. Các nghiên cứu về protein nói riêng và các phân tử sinh học nói chung trong những năm gần đây đã mang lại nhiều hiểu biết về cơ chế phân tử của các quá trình xảy ra trong cơ thể sống, góp phần đáng kể vào các tiến bộ trong y học, trong đó có việc xác định nguyên nhân của các loại bệnh và tìm ra thuốc điều trị bệnh. Trong vật lý sinh học, một hiệu ứng hiện nay đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu là hiệu ứng đám đông đại phân tử (macromolecular crowding effect), nghĩa là ảnh hưởng của môi trường đậm đặc các đại phân tử bên trong tế bào lên các quá trình xảy ra trong đó. Tỷ lệ thể tích lên tới 40% bị chiếm bởi các đại phân tử trong tế bào được cho là có ảnh hưởng lớn đến sự ổn định và chức năng của protein. Đám đông đại phân tử cũng được cho là làm tăng khả năng kết tụ của các protein, được biết là nguyên nhân của nhiều loại bệnh liên quan tới thần kinh như Alzeihmer, Parkison. Việc nghiên cứu các quá trình sinh hoá trong điều kiện thực tế với sự hiện diện của đám đông đại phân tử là thực sự cần thiết cho hiểu biết của chúng ta về sự sống ở cấp độ phân tử. Tuy vậy, các hiểu biết về hiệu ứng đám đông đại phân tử vẫn còn rất 3
hạn chế do tính phức tạp của vấn đề nghiên cứu cũng như những khó khăn khi thực hiện các thí nghiệm bên trong tế bào. Xuất phát từ thực trạng đó, với mục đích nghiên cứu sâu hơn về quá trình cuốn protein đồng thời góp phần áp dụng hiệu quả trong việc nghiên cứu các cơ chế gây ra các bệnh tật là những vấn đề có ý nghĩa to lớn đối với sức khoẻ con người, do đó tôi chọn đề tài nghiên cứu “Hiệu ứng đám đông đại phân tử đối với tính chất cuốn của protein”. Nghiên cứu hiệu ứng đám đông đại phân tử lên tính chất cuốn của protein giúp ta hiểu rõ hơn về hành xử của protein môi trường tế bào, tạo cơ sở cho việc tìm ra cơ chế gây bệnh và nghiên cứu các ứng dụng trong y sinh học. Đối tượng nghiên cứu là các protein nhỏ đơn miền, được biết có khả năng cuốn nhanh chóng trong môi trường ống nghiệm không có sự hiện diện của đám đông đại phân tử. Các nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên nhiệt độ chuyển pha cuốn. 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên độ ổn định của trạng thái cuốn. Một số nghiên cứu trước đây đã đề cập tới các nội dung trên. Điểm mới của nghiên cứu trong luận văn này là chúng tôi sẽ so sánh kết quả cho 2 protein với cấu trúc trạng thái tự nhiên khác nhau nhằm làm rõ hơn mức độ ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên các protein có cấu trúc khác nhau. Ngoài ra, các kết quả tính toán trong luận văn cho 2 protein này cũng nhằm kiểm tra lại các kết quả của các nghiên cứu trước đây cho các protein khác. Nghiên cứu trong luận văn sử dụng các mô hình đơn giản hóa, bao gồm mô hình Go cho protein và mô hình quả cầu với thế năng đẩy cho các đại phân tử. Phương pháp động lực học phân tử với phương trình Langevin được sử dụng để mô phỏng động lực học của hệ protein và các phân tử đám đông. 4
Để tính toán các đại lượng cân bằng nhiệt động như nhiệt dung riêng, năng lượng tự do một cách hiệu quả, luận văn sử dụng phương pháp phân tích biểu đồ có trọng số. Luận văn gồm 3 chương: - Chương 1: Tổng quan về cuốn protein và hiệu ứng đám đông đại phân tử. - Chương 2: Các mô hình và phương pháp mô phỏng. - Chương 3: Một số kết quả nghiên cứu. Kèm theo các chương này là phần kết luận và tài liệu tham khảo. 5
Chương 1: Tổng quan về cuốn protein và hiệu ứng đám đông đại phân tử 1.1 Các tính chất cơ bản của protein 1.1.1 Thành phần hóa học của protein Protein là các đại phân tử sinh học lớn chứa một hoặc nhiều các amino acid. Protein thực hiện rất nhiều chức năng bên trong sinh vật, bao gồm các phản ứng trao đổi chất, xúc tác, sao chép DNA, đáp ứng lại kích thích, và vận chuyển phân tử từ một vị trí đến vị trí khác. Các protein khác nhau chủ yếu ở trình tự của các axit amin trong cấu tạo của chúng, mà trình tự này bị chi phối bởi trình tự nucleotide của các gen quy định tương ứng, và ở kết quả của giai đoạn cuốn protein (protein folding) thành những cấu trúc 3 chiều quyết định chức năng của nó. Protein là một chuỗi polymer đơn tuyến hợp thành bởi 20 loại axit amin, còn gọi là chuỗi polypeptide. Trong 20 loại amino acid này, 19 loại có cấu trúc cơ bản giống nhau như Hình 1.1(a). Mỗi amino acid có một nguyên tử C trung tâm gọi là C  liên kết với một nguyên tử H, một nhóm car- boxyl COOH, một nhóm amin NH2, và một chuỗi bên (side chain) R. Loại amino acid thứ 20 còn lại là proline có cấu trúc tương tự như các amino acid khác, nhưng nguyên tử C thuộc chuỗi bên của nó liên kết với nguyên tử N của nhóm amin tạo thành mạch vòng (Hình 1.1 (b)). Hình 1.1 a) Cấu trúc chung của amino acid. b) Cấu trúc của proline. 6
Các tính chất vật lý và hoá học của chuỗi bên xác định các đặc tính của amino acid, qua đó quyết định vai trò của amino acid trong chuỗi polypeptide. Dựa trên các tính chất này, các amino acid có thể phân thành các nhóm không phân cực (kị nước), phân cực (ưa nước), tích điện âm (nếu chuỗi bên mang điện tích âm), và tích điện dương (nếu chuỗi bên mang điện tích dương). Chuỗi polypeptide được tạo thành bởi phản ứng trùng ngưng các amino acid loại bỏ đi các phân tử nước được tạo thành từ nhóm OH của nhóm car- boxyl và H của nhóm amin. Phản ứng này tạo ra các liên kết peptide (Hình 1.2) là liên kết cộng hoá trị giữa nguyên tử C của nhóm carboxyl và nguyên tử N của nhóm amin kề nhau. Các nguyên tử này cùng với các nguyên tử C  tạo thành bộ khung cho chuỗi polypeptide gọi là mạch xương sống (backbone) của chuỗi polypeptide. Toả ra từ bộ khung này là các chuỗi bên của các amino acid. Liên kết peptide tạo ra tính định hướng cho chuỗi polypeptide, các nguyên tử N của nhóm amin đều nằm cùng một phía của nguyên tử C . Phía còn lại là các nguyên tử C của nhóm carboxyl. Nhóm amin duy nhất không tham gia liên kết peptide tạo thành đầu N của chuỗi polypeptide. Đầu còn lại là đầu C. Quá trình dịch mã trong ribosome được tiến hành từ đầu N đến đầu C của chuỗi để tạo ra cấu trúc bậc nhất của protein. Hình 1.2 Chuỗi polypeptide hình thành bởi các liên kết peptide giữa các amino acid. 7
Protein được sinh tổng hợp trong tế bào bởi các ribosome. Kích thước của một protein có thể đo bằng số lượng amino acid chứa trong nó hoặc bằng tổng khối lượng phân tử, mà thông thường tính bằng đơn vị Dalton (đồng nghĩa với đơn vị khối lượng nguyên tử), hoặc đơn vị dẫn xuất kilo-Dalton (kDa). Các protein tổng hợp bởi nấm men trung bình dài 466 amino acid và có khối lượng trung bình 53 kDa. Protein lớn nhất từng được biết đến là titin, một thành phần của đơn vị cơ bản sợi cơ vân (muscle sarcomere), với khối lượng phân tử 3.000 kDa và chứa tới 27.000 amino acid. 1.1.2 Cấu trúc của protein Cấu trúc bậc 1: Là trình tự của các amino acid trong chuỗi polypeptide của protein. Cấu trúc bậc 2: Là tương tác không gian giữa các gốc axit amino ở gần nhau trong chuỗi polypeptide. Cấu trúc được bền vững chủ yếu nhờ liên kết hydro hình thành giữa các liên kết peptide ở kề gần nhau, cách nhau những khoảng xác định dọc theo trình tự chuỗi. Các cấu trúc bậc 2 của phân tử pro- tein bao gồm xoắn α (α-helix), phiến β (β-sheet) và các khúc ngoặt (turn). Bởi vì cấu trúc bậc 2 mang tính cục bộ, nhiều vùng với các cấu trúc bậc 2 khác nhau có thể tồn tại trong cùng một phân tử protein. Cấu trúc bậc 3: là hình dạng 3 chiều tổng thể của một phân tử protein đơn nhất; hay mối quan hệ không gian giữa các cấu trúc bậc 2 với nhau. Nói chung cấu trúc bậc 3 được giữ ổn định bởi các tương tác phi cục bộ, phần lớn bởi sự hình thành một lõi kị nước (hydrophobic core), và ngoài ra được giữ ổn định bởi các cầu muối (salt bridge), liên kết hydro, liên kết disulfide. Thuật ngữ “cấu trúc bậc 3” thường được sử dụng mang nội dung đồng nghĩa với thuật ngữ cuốn hoặc gấp protein. Cấu trúc bậc 3 kiểm soát chức năng cơ bản của protein. 8
Cấu trúc bậc 4: là cấu trúc hình thành bởi một số phân tử protein liên kết với nhau (chuỗi polypeptide), mà hay gặp thuật ngữ tiểu đơn vị protein trong trường hợp này, mà chức năng của cấu trúc bậc 4 hoạt động như một phức hợp protein. 1.1.3 Các tương tác của protein Protein là một hệ phức tạp với nhiều loại tương tác có cường độ mạnh, yếu khác nhau. Để nghiên cứu protein chúng ta cần nắm rõ các loại tương tác này, vai trò và cường độ của chúng đối với từng bậc cấu trúc. Liên kết peptide: là liên kết cộng hoá trị dọc theo chuỗi polypeptide. Đây là liên kết cơ bản hình thành nên cấu trúc bậc một của protein. Liên kết peptide có thể bị phá vỡ bởi môi trường axit trong dạ dày và các enzyme protease trong hệ tiêu hóa. Cầu disulfide: là liên kết cộng hoá trị hình thành giữa hai nguyên tử lưu huỳnh (−S−S−) của hai amino acid loại cysteine. Liên kết này chỉ xuất hiện trong các protein có chứa cysteine. Cầu disulfide có thể bị phá hủy khi môi trường có tính khử mạnh. Khi cầu disulfide bị huỷ, các hoạt tính sinh học và tính chất hoá lý của protein bị biến đổi mạnh. Liên kết tĩnh điện: Giữa một số nguyên tử hay nhóm nguyên tử tích điện có tương tác Coulomb. Chuỗi bên của các amino acid mang điện tích trái dấu có thể tạo thành các liên kết tĩnh điện mạnh gọi là cầu muối (salt bridge). Liên kết hydro: Bản chất của liên kết hydro chính là tương tác tĩnh điện giữa hai nguyên tử hay nhóm nguyên tử bị phân cực (thường xảy ra giữa nguyên tử H của nhóm amin phân cực dương và nguyên tử O của nhóm carboxyl phân cực âm). Liên kết hydro thường có tính lặp lại và đóng vai trò rất lớn trong việc hình thành và giữ ổn định cấu trúc không gian bậc cao. Đặc biệt, các xoắn α và phiến  được ổn định bởi các liên kết hydro. 9
Tương tác Van der Waals xuất hiện khi các nguyên tử ở khá gần nhau. Khi khoảng cách giữa các nguyên tử rất nhỏ, chúng đẩy nhau. Ở khoảng cách lớn, chúng hút nhau. Thế năng tương tác này cũng giúp hình thành và ổn định cấu trúc bậc cao, tuy nhiên độ lớn của tương tác Van der Waals yếu hơn liên kết hydro vài lần. Tương tác kỵ nước: là hệ quả của các tương tác phức tạp giữa các phân tử nước với chuỗi bên của các amino acid và giữa các phân tử nước với nhau, trong đó có sự liên quan tới việc hình thành các cấu trúc của nước xung quanh các phân tử chất hoà tan. Kết quả của tương tác kỵ nước là sự liên kết giữa các phân tử kỵ nước nằm gần nhau. Phân tử nước có mômen lưỡng cực, tương tác mạnh với các amino acid theo hai nhóm: nhóm kỵ nước (hydrophobic group) và nhóm phân cực (polar group). Các chuỗi bên kỵ nước thường quay vào phía trong của protein để tránh tiếp xúc với nước, do đó, bị dồn lại gần nhau làm xuất hiện tương tác Van der Waals giữa chúng. Các chuỗi bên phân cực thường có xu hướng nằm trên bề mặt của protein. Mặc dù vậy, trên bề mặt protein vẫn tồn tại khoảng 30% các chuỗi bên kỵ nước. Cường độ của các tương tác của protein có thể chia thành hai nhóm. Các liên kết cộng hoá trị (liên kết peptide, cầu disulfide) mạnh và bền hơn nhiều các tương tác không cộng hoá trị (liên kết hydro, tương tác Van der Waals, tương tác kỵ nước, liên kết tĩnh điện). Các liên kết thuộc nhóm thứ nhất khó có thể bị phá vỡ bởi dao động nhiệt trong khi các liên kết thuộc nhóm thứ hai có thể bị kích thích và bị phá vỡ ở nhiệt độ phòng. Vì vậy, các tính chất động học và nhiệt động của protein phụ thuộc chủ yếu vào nhóm liên kết không cộng hoá trị này. 1.2 Quá trình cuốn protein Để tạo ra những protein với đầy đủ chức năng, tế bào phải thực hiện những quá trình cực kỳ nghiêm ngặt. Trước tiên, các ribosome nối các amino 10
acid lại thành các chuỗi polypeptide không phân nhánh (là cấu trúc bậc một của protein). Mỗi chuỗi polypeptide này sau đó được cuộn chặt, biến đổi thành cấu hình lập thể chính xác mang cấu trúc bậc 3 và có thể là bậc 4. Cấu hình này gọi là trạng thái tự nhiên (native state) của protein. Với hầu hết protein, trạng thái tự nhiên là duy nhất và là cấu hình bền vững nhất. Hoạt tính sinh học của protein chỉ thể hiện khi nó nằm ở trạng thái tự nhiên. Theo góc nhìn nhiệt động học thì trạng thái tự nhiên là trạng thái có năng lượng tự do thấp nhất. Hiện tượng cuốn protein được nghiên cứu đầu tiên bởi Anfinsen và những năm 1950. Các thí nghiệm của Anfinsen cho thấy protein có thể duỗi ra và cuốn lại về trạng thái tự nhiên một cách thuận nghịch khi các điều kiện dung môi thay đổi tương ứng. Điều này đưa ông kết luận rằng trình tự amino acid trong chuỗi polypeptide là đủ để xác định cấu trúc ba chiều của trạng thái tự nhiên của protein. Mối liên hệ giữa trình tự amino acid trong protein và cấu trúc 3 chiều của nó còn được gọi là mã di truyền bậc 2. Quá trình cuốn protein là quá trình chuỗi polypeptide biến đổi động lực học từ trạng thái duỗi với cấu trúc bậc một tới trạng thái tự nhiên của protein. Trong những điều kiện nhất định, quá trình biến đổi động lực học từ cấu trúc bậc một có thể cho sản phẩm là một cấu hình khác với cấu hình tự nhiên của protein, gọi là quá trình cuốn lỗi (misfolding). Protein sẽ mất đi các chức năng sinh học vốn có khi nằm ở trạng thái cuốn lỗi. Quá trình cuốn protein có thể coi là quá trình tiến về trạng thái tự nhiên có năng lượng cực tiểu trên một địa hình năng lượng xác định bởi năng lượng của tất cả các trạng thái trong không gian cấu hình. Người ta cho rằng quá trình cuốn là quá trình ngẫu nhiên trên một địa hình năng lượng dạng phễu, theo đó quá trình cuốn là quá trình giảm năng lượng đồng thời với giảm en- tropy về trạng thái tự nhiên. Do sự cạnh tranh và xung đột giữa các tương tác, 11
nên địa hình năng lượng là một bề mặt gồ ghề với các rào thế và cực tiểu địa phương. Protein chỉ có thể cuốn nhanh chóng nếu nó có một địa hình năng lượng đủ trơn mượt. 1.3 Mô hình hai trạng thái trong cuốn protein Động học của quá trình cuốn của đa số các protein nhỏ, đơn miền có thể được mô tả bởi mô hình hai trạng thái. Đây là một mô hình cơ bản trong lý thuyết về tốc độ phản ứng, đã được áp dụng cho nhiều loại quá trình khác nhau như phản ứng hóa học, các quá trình khuyếch tán, ngưng tụ v.v. Trong mô hình hai trạng thái cho cuốn protein, giản đồ năng lượng tự do được đặc trưng bởi một rào thế lớn ngăn cách trạng thái cuốn (trạng thái tự nhiên) và trạng thái duỗi (không cuốn) như trong giản đồ mô tả trên Hình 1. Trong giản đồ này, trạng thái cuốn (N – native) và duỗi (U – unfolded) tương ứng với các cực tiểu của năng lượng tự do theo tiến trình phản ứng. Trạng thái chuyển tiếp (TS - transition state) nằm ở đỉnh rào thế năng lượng tự do. Độ chênh lệch năng lượng tự do giữa trạng thái cuốn và trạng thái duỗi đặc trưng có mức độ ổn định của protein được gọi là năng lượng tự do cuốn (folding free energy) Δ F ≡ Δ F N −U = F N − F U . Hình 1.3: Giản đồ năng lượng tự do của protein trong mô hình hai trạng thái. 12
Độ cao bờ thế năng lượng tự do cuốn được định nghĩa bằng Δ F N =F TS − F U . Độ cao bờ thế năng lượng tự do duỗi Δ F U =F TS − F N . Các bờ thế này quyết định tốc độ cuốn (kf) và tốc độ duỗi (ku) theo định luật Van’t Hoff – Arrhennius: − Δ F N ,U k f ,u =ν 0 exp ( kB T , ) (1.1) trong đó v0 là hằng số, T là nhiệt độ và kB là hằng số Boltzmann. ∆FN,U phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, áp suất, nồng độ chất làm duỗi trong các thí nghiệm. Các nghiên cứu thí nghiệm của quá trình cuốn thường thực hiện bằng cách thay đổi nhanh chóng điều kiện dung môi để protein chuyển từ trạng thái không cuốn sang trạng thái cuốn và ngược lại. Trong giới hạn cho phép, có thể coi rằng ∆FN,U phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của hoá chất làm duỗi protein trong dung dịch. Do đó, theo phương trình (1.1), ln(kf) và ln(ku) cũng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ chất làm duỗi. Động học của protein trong mô hình hai trạng thái tuân theo hệ phương trình chủ ∂ PN =k f P U −k u P N , (1.2) ∂t ∂ PU =k u P N −k f P U , (1.3) ∂t trong đó PN và PU lần lượt là xác suất tìm thấy hệ ở trạng thái N và U. Sử dụng các điều kiện biên ta thu được nghiệm của phương trình có dạng: ∞ 0 ∞ − kt P N ( t ) =P N +( P N − P N ) e . (1.4) 0 ∞ Động học trong đó k = kf + ku , P N là xác suất ban đầu, P N là xác suất tìm thấy hệ ở trạng thái cuốn khi hệ ở cân bằng nhiệt động khi t → ∞ . Như vậy, hai 13
đặc trưng chính của mô hình hai trạng thái là: logarit của tốc độ cuốn và duỗi phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ chất làm duỗi và quá trình hồi phục tuân theo hàm mũ. Trong thực nghiệm, thông thường những protein nhỏ đơn miền có động học thoả mãn hai tính chất này. Chúng được gọi là các protein hai trạng thái. 1.4 Hiệu ứng đám đông đại phân tử Môi trường trong tế bào là một môi trường không đồng nhất, tập trung đông đúc các đại phân tử. Số lượng, chủng loại, nồng độ phân tử trong bào tương phụ thuộc vào loại tế bào và chu kỳ của tế bào. Tổng lượng protein trong tế bào ước tính cỡ 50 − 400 mg/ml tương ứng với cỡ từ 5 − 40% tổng thể tích (Hình 1.1). Môi trường đông đúc như vậy được biết đến với tên gọi “đám đông đại phân tử” [1] và có ảnh hưởng lớn tới các tính chất của các phân tử trong tế bào cũng như các quá trình xảy ra trong tế bào [2,3]. Ví dụ, đám đông đại phân tử được biết làm tăng khả năng kết dính giữa DNA và enzyme DNA polymerase trong các quá trình sao chép và nhân đôi DNA [4], đẩy mạnh sự liên kết giữa các protein [5], và cải thiện hiệu quả hoạt động của các chaperonin [3]. Người ta cũng chỉ ra rằng đám đông đại phân tử làm tăng tính ổn định và tốc độ cuốn của protein [6], nhưng đồng thời cũng làm tăng khả năng kết tụ của protein [7]. Việc quá trình cuốn của protein xảy ra trong một không gian bị lấp đầy đáng kể bởi các đại phân tử dẫn đến các câu hỏi là: Làm thế nào để protein cuốn và thực hiện chức năng trong một môi trường đông đúc như vậy? Liệu các kết quả thực nghiệm về các tính chất của protein được thực hiện trong môi trường pha loãng có phản ánh chính xác những gì xảy ra trong cơ thể hay không và có thể chấp nhận ở mức độ nào? Câu hỏi đầu tiên có ý nghĩa cơ bản đối với hiểu biết của chúng ta về protein, trong khi câu hỏi thứ hai cũng rất quan trọng bởi hầu hết các thông tin hiện có về quá trình cuốn của protein đều 14
nhận được từ các thí nghiệm trong đó protein nằm trong một dung dịch pha loãng trong ống nghiệm. Các thí nghiệm này thường sử dụng các dung dịch loãng nhất có thể để tránh các điều kiện không lý tưởng và tập trung vào tính chất của protein tinh khiết. Trong tế bào, sự xuất hiện của các đám đông đại phân tử đã phá vỡ các điều kiện lý tưởng như trong ống nghiệm. Hình 1.4: Hình ảnh mô phỏng mô tả mật độ đông đúc của các đại phân tử bên trong tế bào [14]. Hiệu ứng cơ bản của đám đông đại phân tử được cho là gây ra bởi thể tích loại trừ bị chiếm bởi các phân tử đám đông và không thể tiếp cận được đối với các phân tử khác. Trong cuốn protein, sự thăng giáng của các không gian trống còn lại trở nên bất lợi đối với trạng thái duỗi của protein nhiều hơn so trạng thái cuốn, do trạng thái duỗi cần một không gian lớn hơn. Đây chính là cơ sở của một số lý thuyết về hiệu ứng đám đông dựa trên lý thuyết hạt điều chỉnh tỷ lệ (scaled particle theory - SPT) [8, 9, 10]. Những lý thuyết này cho phép tính toán sự thay đổi năng lượng tự do cuốn của protein, là sự chênh lệch năng lượng tự do ở trạng thái cuốn so với trạng thái duỗi, gây ra bởi sự có mặt của các phân tử đám đông. Các nghiên cứu mô phỏng đã khẳng định lại vai 15
trò của thể tích loại trừ [11, 12]. Ngoài ra, các ảnh hưởng của đám đông lên cuốn protein được chỉ ra là cho các kết quả tương tự như các hiệu ứng gây ra bởi sự hạn chế về không gian [10, 13]. Mặc dù vậy, các nghiên cứu thực nghiệm cho đến nay vẫn đưa ra các kết quả không hoàn toàn thống nhất về ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên cuốn protein. Các nghiên cứu về hiệu ứng đám đông đại phân tử trong hơn 30 năm gần đây đã thu được những hiểu biết đáng kể. Ngoài các tương tác phức tạp giữa protein và các phân tử đám đông, có thể kể ra hai hiệu ứng quan trọng và trực tiếp mà môi trường đông đúc bên trong tế bào tác động lên protein, là hiệu ứng thể tích loại trừ (excluded volume effect) và hiệu ứng rút kiệt (depletion effect). Hiệu ứng thể tích loại trừ khiến cho protein bị thay đổi không gian cấu hình, và bị giam cầm trong một khu vực linh động tạo ra các khác biệt so với quá trình cuốn trong một dung dịch pha loãng. Hiệu ứng rút kiệt có bản chất liên quan đến entropy của các phân tử đám đông [15] khiến cho các protein có xu hướng co cụm lại gần nhau, giúp ổn định các phức hệ protein nhưng cũng làm tăng khả năng kết tụ. Các nghiên cứu thực nghiệm và mô phỏng gần đây đã làm rõ hơn các hiệu ứng này. Trong hầu hết các trường hợp, nghiên cứu thực nghiệm và mô phỏng cho thấy đám đông đại phân tử làm tăng sự ổn định cuốn của protein chống lại khả năng biến tính do tác động hoá học và nhiệt độ. Khả năng tăng sức đề kháng với biến tính nhiệt độ thay đổi đáng kể từ protein này đến protein khác. Pielak và các đồng nghiệp [16, 17] tìm thấy hai kết quả trái ngược nhau. Hai tác nhân polymer PVP và Ficoll có tác dụng ổn định cuốn cho protein CI2 phù hợp với các nghiên cứu khác [18, 19]. Trong khi đó, hai tác nhân protein lysozyme và huyết thanh bò (BSA) dẫn đến sự bất ổn nhẹ. Kết luận này trái ngược với những hiểu biết hiện nay về ảnh hưởng của đám đông đại phân tử lên sự ổn định cuốn của protein. Gần đây, các dữ liệu thực nghiệm của phòng 16
thí nghiệm Pielak được Zhou tái phân tích [20], theo đó tác giả đưa ra gợi ý rằng hiệu ứng trái ngược của các tác nhân đám đông polymer và protein lên sự ổn định cuốn của CI2 là do sự khác biệt trong nhiệt độ khảo sát và do hai loại tác nhân có tương tác hút khác nhau lên protein CI2. Tác giả cũng dự đoán rằng đối với một protein nhất định, mỗi đám đông đại phân tử có một giá trị nhiệt độ chuyển giao tại đó ảnh hưởng của đám đông thay đổi từ mất ổn định sang ổn định. Do đó nhiệt độ thử nghiệm đóng một vai trò quan trọng trong hiệu ứng đám đông lên sự ổn định cuốn. Phù hợp với kỳ vọng này, ảnh hưởng của đám đông PVP và Ficoll làm tăng sự ổn định cuốn của CI2 được đo ở nhiệt độ cao 37oC, trong khi đó hiệu ứng gây mất ổn định bởi lysozyme và BSA được đo ở nhiệt độ thấp 20oC. Tiên đoán là đám đông PVP và Ficoll sẽ gây mất ổn định ở nhiệt độ thấp và ngược lại lysozyme và BSA sẽ làm tăng sự ổn định cuốn ở nhiệt độ cao hơn. Trong khi dự đoán này vẫn chưa được kiểm tra, phòng thí nghiệm của Gruebele hiện đã công bố kết quả ảnh hưởng của đám đông protein (subL) làm tăng sự ổn định cuốn của protein λ 6−85 [21] và của enzim phosphoglycerate bên trong tế bào [22] đều ở nhiệt độ cao. Tóm lại, nhiệt độ được tiên đoán đóng vai trò quyết định ảnh hưởng thực sự của đám đông lên sự ổn định cuốn của protein trong các sinh vật chịu nhiệt. Các nghiên cứu cho thấy đám đông đại phân tử làm tăng nhẹ tốc độ cuốn của protein [23, 24]. Cụ thể, tốc độ cuốn lại của carbonic anhydrase tăng trong sự có mặt của Ficoll 70 [25]. Tương tự, tốc độ cuốn lại của VlsE [26], apoflavodoxin [27], và apocytochrome b562 [28] cũng tăng trong sự hiện diện của các đám đông như Ficoll, Dextran hoặc PEG nhưng tốc độ duỗi lại không bị ảnh hưởng. Kết quả thu được khi nghiên cứu sự cuốn lại của carbonic anhydrase cho thấy tổng lượng protein được cuốn thành công giảm xuống khi có mặt đám đông Ficoll, nghĩa là hiệu quả cuốn giảm [25]. Kết quả này thống nhất 17
với các nghiên cứu của Dobson [23, 24] cho rằng đám đông làm giảm khả năng cuốn lại do kết tụ. Tuy nhiên, vai trò của đám đông đại phân tử trong môi trường nội bào lên sự cuốn hỏng của protein chưa được hiểu biết rõ ràng. Trong một nghiên cứu gần đây của nhóm Ma [29] cho thấy các hiệu ứng trái ngược của đám đông đại phân tử lên sự cuốn lỗi của protein. Đám đông đại phân tử làm tăng sự hình thành các sợi kết tụ đối với protein Tau của người (protein Tau hình thành sợi kết tụ trong não gây ra bệnh Alzheimer) nhưng ức chế sự hình thành sợi amyloid trong các protein prion của thỏ (là một trong số ít loài đề kháng với bệnh) và lysozyme trong lòng trắng trứng gà. Các tác giả đề xuất rằng các protein dễ bị kết tụ thành sợi và có liên quan đến các bệnh dễ bị cuốn lỗi dưới ảnh hưởng của đám đông hơn trong dung dịch pha loãng. Ngược lại, các protein không liên quan đến các bệnh ít có khả năng hình thành kết tụ trong các điều kiện đông đúc. 1.5 Lý thuyết hạt tỷ lệ Lý thuyết hạt tỷ lệ (scaled particle theory - SPT) được đưa ra đầu tiên bởi Reiss và các đồng nghiệp [30] để ước tính sự thay đổi thế hoá học khi chèn một hạt mới vào trong một chất lỏng có chứa rất nhiều các hạt khác với giả thiết các hạt có kích thước đáng kể. Lý thuyết hạt điều chỉnh tỷ lệ lúc đầu chỉ được xây dựng được cho hệ chất lỏng chỉ chứa một loại hạt là các quả cầu cứng với cùng kích thước, sau đó được mở rộng cho dung dịch chứa nhiều loại hạt hình cầu cứng với bán kính khác nhau. Nó cũng áp dụng khá tốt cho các hệ gồm các hạt không phải hình cầu [31]. Xét một dung dịch có thể tích V chứa N đại phân tử đám đông có kích thước giống nhau. Gọi Rc là bán kính của các đại phân tử. Tỷ lệ thể tích bị chiếm chỗ bởi các đại phân tử được ký hiệu là c. Theo lý thuyết hạt điều chỉnh tỷ lệ, khi chèn một quả cầu cứng với bán kính R vào dung dịch, sự thay đổi năng lượng tự do (thế hóa học) được cho bởi 18