LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: "PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG"

Chia sẻ: Cung Ru | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:44

Thêm vào BST

Báo xấu

208
lượt xem 57
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu sưu tập và cung cấp dữ liệu về vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá tra bị xuất huyết nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, đồng thời cũng so sánh kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bộ kít API 20E. Kết quả đề tài đã thu được 5/17 ao cá bị xuất huyết, phân lập được 28 chủng vi khuẩn Aeromonas.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: "PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THANH PHÚ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THANH PHÚ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH 2009
LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành gửi lời biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh, cô Nguyễn Thị Thu Hằng và chị Nguyễn Hà Giang đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này. Tôi cũng xin cảm ơn đến tất cả quí thầy cô và cán bộ Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ đã chỉ dẫn tận tình và truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quí báo trong thời gian học ở trường. Đồng thời cảm ơn đến tất cả các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K31, tập thể anh em P6C1 cùng gia đình đã hết lòng giúp đỡ động viên tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Xin chân thành cảm ơn! i
TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu sưu tập và cung cấp dữ liệu về vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá tra bị xuất huyết nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, đồng thời cũng so sánh kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bộ kít API 20E. Kết quả đề tài đã thu được 5/17 ao cá bị xuất huyết, phân lập được 28 chủng vi khuẩn Aeromonas. Tám chủng vi khuẩn đại diện gồm SĐ2.1T, SĐ2.2T, CA1.2T, CA1.3TT, TN1.1T, TN2.4TT, TN2.1G và CS2.3T đã được kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa bằng bộ kít API 20E và phương pháp sinh hóa truyền thống dựa theo cẩm nang của Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993). Kết quả định danh của hai phương pháp trong nghiên cứu này không có sự khác biệt lớn, cả 8 chủng vi khuẩn được định danh đều là vi khuẩn A.hydrophila. ii
MỤC LỤC TÓM TẮT ......................................................................................................................... i LỜI CẢM TẠ...................................................................................................................ii MỤC LỤC.......................................................................................................................iii DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................................... iv DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................................... v PHẦN I GIỚI THIỆU ...................................................................................................... 1 PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU................................................................................. 2 2.1 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam và Đồng Bằng Sông Cửu Long...................... 2 2.1.1 Ở Việt Nam ................................................................................................. 2 2.1.2 Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long .................................................................... 2 2.2 Tình hình bệnh cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long........................................... 4 2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila ......................................................................... 6 PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................... 8 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................................ 8 3.2 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 8 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 8 3.2.2 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ............................................................. 8 3.3 Hóa chất ............................................................................................................... 8 3.3.1 Các hóa chất và môi trường dùng để phân lập vi khuẩn ............................. 8 3.3.2 Các hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bộ kít API 20E .................................................... 9 3.4 Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 9 3.4.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển.............................................................. 9 3.4.2 Phân lập vi khuẩn........................................................................................ 9 3.4.3 Nuôi tăng sinh vi khuẩn ............................................................................ 10 3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn....................................................................... 10 3.5.1 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống ................ 10 3.5.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E ................................................. 11 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 14 4.1 Kết quả ............................................................................................................... 14 4.1.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila................................. 14 4.1.2 Định danh vi khuẩn phân lập bằng phương pháp sinh hóa truyền thống.. 15 4.1.3 Định danh vi khuẩn phân lập bằng bộ kít API 20E................................... 20 4.2 Thảo luận............................................................................................................ 22 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT........................................................................... 24 5.1 Kết luận .............................................................................................................. 24 5.2 Đề xuất ............................................................................................................... 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 25 PHỤ LỤC....................................................................................................................... 29 iii
DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Các chỉ tiêu định danh A. hydrophila bằng phương pháp sinh hóa truyền thống. Bảng 3.2 Các chỉ tiêu định danh A. hydrophila bằng bộ kít API 20E. Bảng 4.1 Kết quả thu mẫu. Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của 8 chủng vi khuẩn phân lập. Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa bằng bộ kít API 20E. iv
DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1 Cá bị xuất huyết. Hình 4.2 Hình dạng vi khuẩn A. hydrophila ở vật kính 100X. Hình 4.3 Khuẩn lạc vi khuẩn A. hydrophila trên môi trường TSA. Hình 4.4 Khuẩn lạc vi khuẩn A. hydrophila trên môi trường Aeromonas agar. Hình 4.5 Kết quả phản ứng decarboxylase. Hình 4.6 Kết quả phản ứng citrate. Hình 4.7 Các phản ứng sử dụng đường. Hình 4.8 Kết quả định danh bằng bộ kít API 20E. v
PHẦN I GIỚI THIỆU Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng đất giàu tiềm năng được thiên nhiên ưu đãi có lợi thế rất lớn để phát triển nuôi trồng thủy sản. Trong những năm gần đây nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL đã có những bước phát triển vượt bậc mang lại hiệu quả kinh tế cao, đặc biệt cá tra đang là đối tượng nuôi chiến lược, thu lại nguồn ngoại tệ rất lớn. Đến tháng 08 năm 2007, toàn vùng ĐBSCL có tổng diện tích nuôi cá tra, ba sa trên 5.600 ha, so với năm 2000, diện tích này tăng trên 10 lần và dự báo sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới (Chu Thạch, 2007). Tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt mức 4 tỷ USD (VASEP, 2008). Tuy nhiên do sự gia tăng quá mức của phong trào nuôi cá tra trong khi trình độ kỹ thuật của người nuôi chủ yếu chỉ dựa vào kinh nghiệm. Mặt khác do phát triển tự phát thiếu qui hoạch, mật độ thả nuôi cao và công tác quản lý dịch bệnh còn hạn chế nên dịch bệnh thường xuyên xảy ra gây thiệt hại cho người nuôi. Theo Từ Thanh Dung (2005) tần số xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản do vi khuẩn chiếm tới 50,9%. Theo điều tra của Nguyễn Thanh Phương và ctv (2007) thì số nông hộ nuôi cá tra ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện vào mùa lũ chiếm tới 88%. Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) thì Aeromonas là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên nhiều loài cá, trong các loài vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là loài gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất (Lewis and Plumb, 1979). Đề tài “Phân lập và định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long” được thực hiện nhằm sưu tập và cung cấp dữ liệu về vi khuẩn A. hydrophila trên cá tra bị bệnh xuất huyết nuôi ở ĐBSCL. Đề tài bao gồm các nội dung: (1) Thu mẫu và phân lập vi khuẩn A. hydrophila từ cá tra bị bệnh xuất huyết; (2) Xác định các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn A. hydrophila phân lập từ cá tra bệnh xuất huyết bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bằng bộ kít API 20E. Trang 1
PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam và ĐBSCL 2.1.1 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam Trong những năm gần đây ngành nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam cùng với sự phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới đã không ngừng phát triển mạnh mẽ có mức tăng trưởng kinh tế cao trong xuất khẩu thuỷ sản. Theo số liệu của Hải quan, tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt mức 4 tỷ USD. Mười tháng đầu năm, xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3,828 tỷ USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái (Bộ thủy sản, 2007). Riêng nghề nuôi cá tra cũng có những bước phát triển rất vượt bậc không những ở quy mô diện tích mà còn có sự gia tăng mật độ nuôi ở mức độ thâm canh hóa. Năng suất cá tra nuôi ao ở một số vùng đã tăng đến 350 - 500 tấn/ha/vụ, thậm chí đến 700 tấn/ha/vụ, do mật độ nuôi đã tăng lên đến 40 - 50 con/m2 (Nguyễn Thanh Phương và ctv, 2007). Mặc dù trong những năm qua nghề nuôi cá tra ở Việt Nam có những bước thăng trầm do giá cả không ổn định, chịu tác động của nhiều vụ kiện bán phá giá, yêu cầu về kỹ thuật an toàn vệ sinh thực phẩm ngày một khắc khe. Đặc biệt các thị trường lớn như Mỹ, Nhật, EU đòi hỏi rất nghiêm ngặt về chất lượng sản phẩm. Sản phẩm cá tra thịt trắng có nhu cầu ngày càng cao là những thách thức đặt ra cho các nhà doanh nghiệp chế biến xuất khẩu và người nuôi. Theo Bộ Thủy Sản (2007) sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng từ 720.000 tấn ở năm 2000 lên đến 1.256.938 tấn năm 2004. Năm 2005, sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt 1.437.355 tấn và giá trị xuất khẩu khoảng 1.627,3 triệu USD. Năm 2006, sản lượng nuôi trồng thủy sản của cả nước đạt 1.694.271 tấn, trong đó sản lượng cá tra chiếm 825.000 tấn. 2.1.2 Tình hình nuôi cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Đồng Bằng Sông Cửu Long là nơi có tiềm năng nuôi cá tra rất lớn, đã có truyền thống nuôi cá tra từ lâu đời, cùng với lợi thế về diện tích mặt nước, hàng năm vùng không ngừng nâng cao về mặt sản lượng cá tra, basa xuất khẩu. Tính từ năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 Trang 2
tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước. Chỉ trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so với năm trước, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, số lượng cá tra xuất khẩu được 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch so với năm 2006 (Quang Hải, 2008). Theo số liệu đến tháng 08 năm 2007, toàn vùng ĐBSCL có tổng diện tích nuôi cá tra, ba sa trên 5.600 ha. So với năm 2000, diện tích này đã tăng trên 10 lần và dự báo sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới (Chu Thạch, 2007). An Giang là tỉnh có nghề nuôi cá tra phát triển nhất ở ĐBSCL, chiếm 90% tổng kim ngạch xuất khẩu của tỉnh. Sản lượng cá tra nuôi của tỉnh An Giang tăng từ 25 đến 27%/năm và chiếm 70% sản lượng cá tra nuôi của khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong quí I/2008, An Giang đạt sản lượng nuôi cá tra trên 90.000 tấn, tăng 63% so cùng kỳ. Chủ tịch Hiệp hội nuôi và chế biến xuất khẩu thủy sản An Giang (AFA) cho biết: sản lượng cá tra nuôi của tỉnh An Giang quí II/2008 lứa đầu thu hoạch khoảng 25.000 tấn. Trong khi cá nguyên liệu cần cho các nhà máy chế biến trong tỉnh trên 100.000 tấn/quí. Hiện nay, sản phẩm cá tra xuất khẩu đang thuận lợi cả về thị trường và giá cả, giá xuất sản phẩm cá tra thịt trắng từ 3,2 đến 3,4 USD/kg (4 tháng đầu năm giá xuất bình quân 2,8 USD/kg) (Huy Bình, 2008). Còn Đồng Tháp tuy vào mùa thu hoạch rộ cá tra cũng đối mặt với nhiều khó khăn như doanh nghiệp không đủ vốn để mua cá nguyên liệu, người nuôi cá tra không đủ tiền mua thức ăn cho cá phải “treo” ao... nhưng kim ngạch xuất khẩu thủy sản, mà chủ lực là cá tra, ba sa, vẫn tăng khá. Hiện nay, thủy sản là mặt hàng xuất khẩu chính yếu, chiếm gần 70% tổng kim ngạch xuất khẩu toàn tỉnh Đồng Tháp. Từ đầu năm đến nay, các doanh nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu trên địa bàn tỉnh Đồng Tháp đã chế biến 83.101 tấn thủy sản, đồng thời xuất khẩu trên 62.509 tấn thủy sản, trị giá hơn 179 triệu USD, tăng 61,92% về sản lượng và 47,14% về giá trị (Sở Công Thương Đồng Tháp, 2009). Và theo báo cáo của Sở Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn tỉnh Vĩnh Long, mặc dù trong thời gian gần đây giá cá tra nguyên liệu giảm ở mức thấp gây khó khăn cho các hộ nuôi nhưng diện tích ao, hầm nuôi cá tra trên địa bàn tỉnh vẫn duy trì ở mức 334 ha. Sản lượng cá tra trong tháng 8 này ước đạt khoảng 11.030,5 Trang 3
tấn, sản lượng từ đầu năm đến hết tháng 8/2008 khoảng 85.030 tấn (tăng gần 11.000 tấn so với cuối tháng 6/2008). Theo dự báo của Sở Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn, đến hết năm 2008 sản lượng cá tra công nghiệp ước tính đạt khoảng 122.000 tấn (Mỹ Trung, 2008). 2.2 Tình hình bệnh trên cá tra ở ĐBSCL Cá tra, basa cũng như nhiều loài cá nước ngọt khác, dễ bị nhiễm nhiều loại bệnh phổ biến, các tác nhân gây bệnh cho cá gồm 2 nhóm là các bệnh truyền nhiễm (do virus, vi khuẩn và ký sinh trùng) và tác nhân không truyền nhiễm do môi trường, dinh dưỡng. Theo Từ Thanh Dung (2005) thì tần số xuất hiện bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản là cao nhất với 50,9%. Cũng theo điều tra của Lê Phú Khởi (2006) tại An Giang đã ghi nhận được một số bệnh xuất hiện trên cá tra với tần suất khác nhau từ năm 2004 trở lại đây là: bệnh đốm đỏ, mủ gan, ký sinh trùng, thối đuôi, vàng da, đường ruột, nổ mắt, tuột nhớt, rong bè (bỏ ăn), sưng thận, nấm, thối mang. Trong đó bệnh mủ gan xảy ra với tần suất cao nhất. Vi khuẩn E.ictaluri được Hawke (1979) phân lập đầu tiên trên cá Nheo nuôi tại châu Mỹ (Ictalurus punctatus) và được xác định là nguyên nhân gây bệnh ESC (Enteric septicaemia of catfish). Còn ở Việt Nam E.ictaluri gây bệnh trên cá tra được gọi bệnh mủ gan. Bệnh được ghi nhận đầu tiên ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 trên cá tra nuôi bè với dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan (Ferguson và ctv, 2001). Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) vùng ĐBSCL bệnh mủ gan xuất hiện đầu tiên ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang các vùng lân cận. Đặc biệt những năm gần đây bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng. Cá bị bệnh mủ gan không có dấu hiệu bất thường bên ngoài. Ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi. Tuy nhiên ở giai đoạn này nếu không phát hiện sớm và môi trường nuôi quá bẩn thì bệnh cá sẽ trở nên trầm trọng hơn và rất khó khăn trong điều trị. Khi bị bệnh nặng hơn, cá có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu môn. Bên trong nội tạng (gan, thận, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính 1 - 3mm và các cơ quan này sưng to và có hiện tượng nhũn ở thận. Bệnh mủ gan có thể xảy ra trên cá tra nuôi ở tất cả các giai đoạn, tỉ lệ hao hụt có thể lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003), tỉ lệ hao hụt ở cá tra giống Trang 4
có thể từ 10 - 90%, nhưng gây thiệt hại kinh tế lớn nhất là ở giai đoạn cá có trọng lượng từ 300 - 500g (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Đầu năm 2006, bệnh mủ gan đã gây thiệt hại nghiêm trọng với cá tra nuôi thâm canh ở hai tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết lên tới 60% (Bộ tài nguyên môi trường Việt Nam, 2006). Kết quả điều tra của Từ Thanh Dung (2005) cho biết bệnh mủ gan thường bắt đầu xuất hiện vào tháng 5 và phát triển mạnh nhất vào khoảng tháng 7 đến tháng 10 rồi giảm xuống ở các tháng còn lại. Đặc biệt bệnh mủ gan xuất hiện cao nhất vào thời gian lũ về với tỉ lệ 85,4% số hộ nuôi cá ở An Giang bị nhiễm bệnh (Trần Anh Dũng, 2005). Lê Thị Bé Năm (2002) cũng cho rằng bệnh xuất hiện mạnh vào mùa lũ trong năm, nước đục mang nhiều phù sa, chất lượng nước biến động, đồng thời nước chảy mạnh làm cá dễ bị sốc, giảm khả năng đề kháng đối với mầm bệnh. Ngoài ra, Trương Quốc Phú (2004) còn cho rằng nhiệt độ nước dao động trong khoảng 26 - 28oC là điều kiện tốt cho vi khuẩn E. ictaluri phát triển và gây bệnh. Bên cạnh đó, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila cũng là một loại bệnh phổ biến, xuất hiện hầu như quanh năm trên cá tra và cá basa nuôi bè. Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, có dấu hiệu bệnh lý bên ngoài là xuất huyết trên gốc các vi và xoang miệng. Bên trong thấy xuất huyết ở cơ, ruột, mô mỡ, kèm theo những dấu hiệu khác như trương bụng hay lỡ loét ở gốc vi đuôi và vi hậu môn (Phan Văn Ninh và ctv, 1993). Bệnh xuất huyết gây tổn thất cho người nuôi về sản lượng và chất lượng sản phẩm khi xuất bán. Trường hợp cấp tính có thể gây tử vong cao đến 80 - 90% những trường hợp mãn tính thịt cá có nhiều điểm xuất huyết màu đỏ và sẽ bị loại bỏ hay hạ phẩm cấp trong quá trình chế biến xuất khẩu (Hứa Thị Phượng Liên, 1998). Bệnh vàng da trên cá tra là một bệnh mới xuất hiện gần đây cũng gây thiệt hại lớn cho ngành thủy sản. Tác nhân gây ra bệnh thì chưa được xác định rõ ràng. Phan Thị Hừng (2004) cho biết cá tra vàng da lượng hồng cầu của máu cá chỉ còn 50% so với cá khỏe. Phạm Thanh Hương (2006) cũng có kết luận tương tự khi đưa ra tỷ lệ giảm hồng cầu của cá tra vàng da là 20%. Đồng thời, Lê Thành Cường (2006) cũng nhận xét trên cá tra bị vàng da thì lượng máu cá không có nhiều và máu không có màu đỏ như cá khỏe, quan sát mẫu nhuộm máu thấy hồng cầu bị biến dạng nhiều. Ngoài ra, một tác nhân khác cũng được đề cập đến là kí sinh trùng, đặc biệt là giun tròn với đặc tính thích chui vào ống mật làm viêm nhiễm đường mật, tắc ống mật gây vàng da. Tuy nhiên, tác giả Lê Thành Cường (2006) Trang 5
thì cho rằng kí sinh trùng không phải là tác nhân gây bệnh vàng da ở cá tra tại ĐBSCL. 2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila Vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, Aeromonas là vi khuẩn Gram âm, di động, hình que, hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, khử nitrate, có khả năng lên men, oxidase dương tính, kháng với O/129 bao gồm A. hydrophila, A.caviae, A.sorbia… (Từ Thanh Dung, 2005). Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm trùng máu hay bệnh sởi…Nguyên nhân của bệnh là do vi khuẩn A. hydrophila gây ra (theo Bergey 1957, trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005). Trong các loài vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là loài gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, vi khuẩn này gây bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết ở những loài cá nuôi và cá tự nhiên (Lewis and Plumb, 1979). Theo Bùi Quang Tề (2006) cá bị nhiễm A. hydrophila có biểu hiện chung là da thường đổi màu tối, không có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các đốm xuất huyết đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, xuất huyết hậu môn, mắt lồi đục. Ở cá tra và cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mở xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột dạ dày và bóng hơi đều xuất huyết, xoang bụng chứa nhiều dịch nhờn mùi hôi thối. Cá trê giống bị bệnh thường tách đàn treo râu. Theo thí nghiệm cảm nhiễm của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì cá tra sau khi cảm nhiễm với A. hydrophila có biểu hiện xuất huyết trên thận, hậu môn sưng đỏ, các tia vây xuất huyết,…nhưng không gây chết hàng loạt trong thời gian 7 ngày thí nghiệm. Thu mẫu cá chết phân lập chỉ có một loài duy nhất là A. hydrophila. A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java - Indonesia và gây tỉ lệ chết từ 80 - 90% (Angka, 1990). Năm 1982 Saitanu và ctv đã tìm thấy vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá chép (Saitanu et al., 1982). Vi khuẩn này còn gây bệnh xuất huyết trên cá trê trắng giống (Clarias batrachus) và là tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá basa nuôi trong bè gỗ (Tanasomwang và Saitanu, 1979). Vi khuẩn A. hydrophila còn được tìm thấy trên bệnh phẩm cá trê (Clarias sp) (trích dẫn bởi Trần Anh Dũng, 2005). Cũng theo điều tra của Trần Anh Dũng (2005) vào thời gian lũ rút, các hộ nuôi cá tra ao ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện rất cao, với 85.4% hộ đã ghi nhận. Trang 6
Bệnh do A. hydrophila trên cá chình thường xuất hiện vào mùa xuân - hè, nhiệt độ nước khoảng 17 - 22oC, khoảng nhiệt độ này cũng được cho là khoảng nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn này phát triển (Esteve et al., 1993). Bên cạnh đó, Groberg khi gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá hồi đã kết luận tỉ lệ chết thường cao ở 20,5oC và 17oC, tỉ lệ chết thấp hơn ở 15oC và 12oC, ở 9oC hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không thấy cá chết (trích dẫn bởi Roselynn and Stevenson, 1988). Trong báo cáo của Rahman et al., (2000) ông cho rằng vi khuẩn A. hydrophila có độc lực cao nhất khi to = 17oC (LD50=106.03 CFU/ml) và 25oC (LD50=106.53 CFU/ml) đối với thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá vàng (Carassius auratus). Bên cạnh đó, Azad et al., (2001) gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila trên cá rô phi bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn 107 CFU/ml đã gây chết 80% cá thí nghiệm. Năm 2001 trong thí nghiệm của mình, Đoàn Nhật Phương tiến hành gây cảm nhiễm 15 chủng A. hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 103 CFU/ml đến 107 CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn độc lực mạnh có LD50 lần lượt là 3,68x106 CFU/ml (chủng A4); 2,64x106 CFU/ml và 4,52x106 CFU/ml (chủng A11); 1,96x106 CFU/ml và 1,45x107 CFU/ml (chủng A13). Trang 7
PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu - Thu mẫu cá tra từ các ao nuôi thâm canh ở Vĩnh Long, Đồng Tháp và Cần Thơ. - Phân tích mẫu tại các phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12 năm 2008 đến tháng 05 năm 2009. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Ðối tượng nghiên cứu - Cá tra có dấu hiệu xuất huyết được thu mẫu trong ao nuôi thâm canh ở Vĩnh Long, Đồng Tháp và Cần Thơ. 3.2.2 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu - Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn, bộ tiểu phẩu, khay nhựa. - Pipet, ống nghiệm, ống đong. - Lame, lamella, đĩa petri, giấy nhôm. - Kính hiển vi, giấy lau kính hiển vi. - Chai nấu môi trường, cá từ, bình tam giác, cốc thủy tinh. - Đầu cole, ống hút, găng tay. - Tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm, tủ lạnh. - Bếp nấu môi trường, nồi thanh trùng. - Cân điện tử, lò viba, máy lắc. - Các vật liệu khác … 3.3 Hóa chất 3.3.1 Các hóa chất và môi trường dùng để phân lập vi khuẩn - Cồn 70o, cồn 96o. - Tryptone soya agar (TSA), nutrient agar (NA). Trang 8
3.3.2 Các hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kít API 20E - Vaseline. - Bộ hóa chất nhuộm Gram. - Dung dịch H2O2. - Que thử oxidase. - Môi trường O/F, glucose, parafin. - Nước cất. - Bộ kít API 20E (bộ test và thuốc thử: TDA, IND, VP). - Các loại hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn theo phương pháp sinh hóa truyền thống. 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển - Dự kiến thu khoảng 90 mẫu ở 15 ao, mỗi ao thu ít nhất 4 cá bệnh và 2 cá khỏe. - Cá thu có dấu hiệu bệnh lý và còn sống. - Mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong thùng mướp có sục khí và được phân tích ngay. Chỉ sử dụng những mẫu còn sống. 3.4.2 Phân lập vi khuẩn - Mẫu cá dùng để lấy mẫu vi khuẩn phải còn sống. - Trước khi giải phẩu đặt cá trên khay sạch. Quan sát cá bằng mắt thường, ghi nhận tất cả các biểu hiện bên ngoài: vết thương, điểm xuất huyết, mùi và các triệu chứng của bệnh. - Cá được tiệt trùng bên ngoài bằng cồn 70o và lau sạch. Sau đó, dùng dao kéo đã tiệt trùng để mổ cá. Khi mổ tránh làm vỡ các cơ quan nội tạng. - Hơ que cấy vi sinh trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ và để nguội. - Quan sát và ghi nhận các dấu hiệu bên trong. - Lấy mẫu vi sinh ở 3 cơ quan gan, thận, tỳ tạng cấy trên môi trường NA. - Ủ đĩa trong tủ ấm 28oC sau 18 - 24 giờ. Ghi nhận màu sắc hình dạng khuẩn lạc, tiến hành tách ròng cho đến khi đạt đĩa cấy thuần. Các thao tác trên được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Trang 9
3.4.3 Nuôi tăng sinh vi khuẩn - Trước khi nuôi tăng sinh các chỉ tiêu cơ bản gồm nhuộm Gram, tính di động, oxidase, catalase và phản ứng O/F phải được kiểm tra. - Sau đó chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm 5ml NB đã tiệt trùng đặt trên máy lắc (200 vòng/phút) sau 18 - 24 giờ đọc kết quả. 3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn 3.5.1 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống Các chỉ tiêu sinh hóa được xác định theo phương pháp của Barrow và Feltham (1993). Cách tiến hành, thành phần môi trường và cách pha chế được trình bày ở phụ lục 1. Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Các chỉ tiêu định danh vi khuẩn A. hydrophila bằng phương pháp sinh hóa truyền thống. STT Chỉ tiêu 1 Nhuộm Gram 2 Hình dạng 3 Sinh sắc tố 4 Di động 5 Sinh catalaza 6 Sinh oxidaza 7 Phản ứng lên men yếm khí 8 Phản ứng lên men hiếu khí 9 Arginine 10 Lysine 11 Ornithine 12 Mọc trên môi trường Aeromonas 13 Sinh gas từ glucose 14 Thuỷ phân aesculine 15 Sinh ureaza 16 Sử dụng citrate 17 Sinh amylaza 18 Sinh indole 19 Phản ứng VP 20 Thuỷ phân Tween 80 21 Tạo nitrit từ nitrat 22 Mọc ở 0% NaCl 23 Mọc ở 3% NaCl Trang 10
24 Mọc ở 6% NaCl 25 Mọc ở 7% NaCl 26 Mọc ở 10% NaCl 27 Mọc trên thạch TCBS 28 Kháng với O/129 Sử dụng 29 Arabinose 30 Cellobiose 31 Galactose 32 Glycerol 33 Lactose 34 Mannitol 35 Trehalose 36 Sucrose 37 Glucose 38 Salicin 39 Xylose 3.5.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E - Định danh theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux). - Các chỉ tiêu định danh bằng bộ kít API 20E được trình bày ở bảng 3.2. - Các chỉ tiêu nhuộm Gram, di động, oxidase, catalase và phản ứng O/F của vi khuẩn được kiểm tra trước khi định danh bằng kít API 20E. Phương pháp thực hiện - Dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng, lắc trộn đều. - Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm khi ủ trong tủ ấm. - Dùng pipet với đầu cole tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô của bộ kít. Nhỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô ngoại trừ 3 ô CIT, VP, GEL thì nhỏ đầy, 5 ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE cho thêm parafin tiệt trùng để tạo điều kiện yếm khí. - Đậy nắp khay lại và ủ trong tủ ấm ở 28oC. Trang 11
Bảng 3.2: Các chỉ tiêu định danh A. hydrophila bằng bộ kít API 20E. Chỉ tiêu Âm tính Dương tính ONPG Không màu Vàng ADH Vàng Đỏ/ cam LDC Vàng Đỏ/cam ODC Vàng Đỏ/cam CIT Vàng Xanh/xanh lá H2S Không màu Đen URE Vàng Đỏ/cam TDA Vàng Nâu sậm IND Vàng Đỏ (2 phút) VP Không màu Hồng/đỏ (10 phút) GEL Không màu (còn kết tủa đen) Đen GLU Xanh/xanh lá Vàng MAN Xanh/xanh lá Vàng INO Xanh/xanh lá Vàng SOR Xanh/xanh lá Vàng RHA Xanh/xanh lá Vàng SAC Xanh/xanh lá Vàng MEL Xanh/xanh lá Vàng AMY Xanh/xanh lá Vàng Ghi chú: - ONPG: ortho - nitrophenyl galactosidase - GEL: gelatin - ADH: arginine dihydrolase - GLU: glucose - LDC: lysine decarboxylase - MAN: mannitol - ODC: ornithine decarboxylase - INO: inositol - CIT: citrate - SOR: sorbitol - H2S: sinh H2S - RHA: rhamnose - URE: urea - SAC: sucrose - TDA: tryptophane deaminase - MEL: melibiose - IND: indole - AMY: amygdaline - VP: phản ứng Voges - Proskauer - ARA: arabinnose Đọc kết quả: sau 18 - 24h. - Kiểm tra và ghi nhận tất cả các chỉ tiêu không cần cho thêm thuốc thử đọc kết quả dựa vào bảng bên trên. - Các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử. Trang 12
TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Một màu đen xuất hiện thì kết quả phản ứng là dương tính (+), màu vàng thì kết quả phản ứng âm tính (-). IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND. Đợi 2 phút. Một vòng màu đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính (+), màu vàng là phản ứng âm tính (-). VP: Thêm một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP1,VP2. Đợi ít nhất 10 phút, màu hồng hoặc đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính (+). Nếu màu hồng nhạt xuất hiện trong vòng 10 - 12 phút là phản ứng âm tính (-). Trang 13