LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E"

Chia sẻ: Cung Ru | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:50

Thêm vào BST

Báo xấu

120
lượt xem 28
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chủng vi khuẩn tham khảo E223 cùng với 2 chủng C1, C2 phân lập trực tiếp từ cá bệnh và 4 chủng trong tủ âm của khoa thủy sản CAF258, CAF255, 2B1, 3B3 được sử dụng cho việc dịnh danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kiểm tra API 20E. Sau khi phục hồi trên TSA tiến hành test các chỉ tiêu cơ bản gồm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học API 20Enghiên cứu SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ tập và LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC LUẬN VĂN TỐT NGH IỆP ĐẠI HỌ C NGÀNH NUÔI TRỒ NG THỦY SẢN NGÀNH NUÔ I TRỒNG THỦY SẢN CH UYÊN NGÀNH BỆNH HỌ C TH ỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG TÌM HIỂU SỰ KHÁC NHAU VỀ CÁC CHỈ TIÊU SINH LÝ VÀ SINH HÓA GIỮA CÁC DÒNG VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri XÁC ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HÓA TRUYỀN THỐNG VÀ API 20E Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC LUẬN VĂN TỐT NGH IỆP ĐẠI HỌ C NGÀNH NUÔI TRỒ NG THỦY SẢN NGÀNH NUÔ I TRỒNG THỦY SẢN CH UYÊN NGÀNH BỆNH HỌ C TH ỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH NGUYỄN THỊ TIÊN 2008
LỜI CẢM ƠN Được làm luận văn tốt nghiệp là mong muốn của rất nhiều sinh viên, trong đó có bản thân tôi. Tuy nhiên để có thể hoàn thành luận văn này là cả một quá trình phấn đấu, phải mất nhiều thời gian và công sức để nghiên cứu, đồng thời phải được sự hướng dẫn nhiệt tình của thầy cô. Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa thủy sản trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô bộ môn sinh học và bệnh thủy sản đã truyền đạt những kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong thời gian tôi theo học và nghiên cứu tại trường. Xin cám ơn gia đình đã động viên giúp đỡ không chỉ về vật chất mà cả về tinh thần từ khi tôi bước chân vào trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh và chị Nguyễn Thị Tiên đã tận tình giúp đỡ trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Xin gởi lời cám ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng và thầy Đoàn Nhật Phương đã Trung tâm Họctâm động viên trongThơthời gian làm cố học tập và nghiên cứu nhiệt tình quan liệu ĐH Cần suốt @ Tài liệu vấn học tập. Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến tập thể lớp nuôi trồng và bệnh học thủy sản K30 đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. i
TÓM TẮT Chủng vi khuẩn tham khảo E223 cùng với 2 chủng C1, C2 phân lập trực tiếp từ cá bệnh và 4 chủng trong tủ âm của khoa thủy sản CAF258, CAF255, 2B1, 3B3 được sử dụng cho việc dịnh danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kiểm tra API 20E. Sau khi phục hồi trên TSA tiến hành test các chỉ tiêu cơ bản gồm. Tất cả các chủng đều có đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri như dạng hình que, gram âm, cho phản ứng oxidase âm tính, có khả năng lên men và oxi hóa đường glucose, không có khả năng sinh khí H2S và không tạo sản phẩm indole. Hầu hết các chỉ tiêu đều giống nhau ở cả 2 phương pháp. Đề tài cũng tiến hành điện di, kết quả sản phẩm PCR có sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri tất cả đều hện vạch tại vị trí 407pb. Chọn ngẫu nhiên 5 chủng CAF258, E223, 3B3, C1 và C2 tiến hành gây cảm nhiễm. Kết quả 3 bể CAF28, C1 và C2 cá có xuất hiện dấu hiệu bệnh lý. Sau khi tái phân lập và tái định danh tất cả các chủng đều có đặc điểm giống chủng ban đầu, cho kết quả PCR giống nhau (hiện vạch 407 bp). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ii
MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................i TÓM TẮT.............................................................................................................ii MỤC LỤC ...........................................................................................................iii DANH SÁCH BẢNG .......................................................................................... iv DANH SÁCH HÌNH............................................................................................. v Chương I : Giới thiệu ............................................................................................ 1 Chương II: Lược khảo tài liệu ............................................................................... 3 2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cá ......................................................................... 3 2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh trên cá tra ở ĐBSCL ........................................... 3 2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá da trơn ................................. 4 2.31. Bệnh xuất huyết............................................................................................ 4 Trung tâm Họcgan trên cá tra ................................................................................ 5cứu 2.3.2 Bệnh mủ liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên 2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp.................................................................. 8 Chương III: Nội dung và phương pháp nghiên cứu.............................................. 11 3.1 Thời gian và địa điểm.................................................................................... 11 3.1.1 Thời gian .................................................................................................... 11 3.1.2 Địa điểm..................................................................................................... 11 3.2 Nội dung thực hiện ........................................................................................ 11 3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ....................................................................... 11 3.3.1 Vật liệu....................................................................................................... 11 3.3.2 Thiết bị....................................................................................................... 11 3.4 Thuốc thử, môi trường dùng cho nghiên cứu ................................................. 12 3.3.4 Số chủng vi khuẩn cần thiết ........................................................................ 12 3.5 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 13 iii
3.5.1 Số chủng vi khuẩn cần thiết ........................................................................ 13 3.5.2 Nguồn vi khuẩn .......................................................................................... 13 3.5.3 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn ...................................... 14 3.5.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống. .................................. 14 3.5.5 Định danh vi khuẩn bằng bộ kit API20E..................................................... 15 3.5.6 Phương pháp PCR ...................................................................................... 16 3.5.7 Thí nghiệm gây cảm nhiễm......................................................................... 17 Chương IV: Kết quả- thảo luận ........................................................................... 19 4.1 Phương pháp sinh hóa truyền thống............................................................... 19 4.2 Kết quả test API ............................................................................................ 21 4.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng PCR .......................................................... 23 4.4 Kết quả gây cảm nhiễm và tái định danh vi khuẩn ......................................... 24 4.5 Thảo luận ...................................................................................................... 28 Trung tâmV: Kết luận – ĐHxuất ............................................................................ 32cứu Chương Học liệu Đề Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên 5.1 Kết luận......................................................................................................... 32 5.2 Đề xuất.......................................................................................................... 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 33 iv
DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn sử dụng cho đề tài ............................. 13 Bảng 3.2: Bảng test các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn ..................................... 14 Bảng 3.3: Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng bộ kít API 20E ......................................................................................... 15 Bảng 3.4: Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng PCR ................................. 16 Bảng 4.5: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi bằng phương pháp sinh hóa truyền thống ..................................................... 19 Bảng 4.6: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi bằng bộ kit API 20E ..................................................................................... 22 Bảng 4.7: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp sinh hóa truyền thống .................................................................................................... 26 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ hình Tài sinh lýhọc tập và nghiên cứu Bảng 4.8: Kết quả phân tích các chỉ tiêu @ thái, liệu và sinh hóa các chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng bộ kít API 20E ................ 27 Bảng 4.9: Các đặc điểm khác nhau giữa loài E. ictaluri với các loài khác thuộc nhóm Enterobacteriaceace (OIE, 2003) ............................................................ 29 v
DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 3.1: Các bước chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm ............................................... 18 Hình 4.2: Hình nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri................................................. 20 Hình 4.3: Khả năng lên men và oxi hóa đường glucose của E. ictaluri ................ 20 Hình 4.4: Kết quả âm tính với indole cua vi khuẩn E. ictaluri ............................. 21 Hình 4.5: Khả năng thủy phân ornithine và lysine của E. ictaluri ........................ 21 Hình 4.6: Kết quả test API của vi khuẩn E. ictaluri ............................................. 23 Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng vi khuẩn E. ictaluri............. 23 Hình 4.8: Thận cá tra nhiễm dòng vi khuẩn CAF258........................................... 25 Hình 4.9: Dấu hiệu bên ngoài của cá tra gây cảm nhiễm dòng E. ictaluri ............ 25 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vi
CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Một trong bảy vùng kinh tế quan trọng của cả nước Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có nhiều điều kiện tự nhiên thuận lợi cho nuôi trồng thủy sản phát triển. Trong những năm gần đây nuôi trồng thủy sản đã đóng góp đáng kể vào kim ngạch xuất khẩu ở Việt Nam, tạo công ăn, việc làm, tăng thu nhập, xóa đói giảm nghèo cho các vùng nông thôn. Nổi bật là nghề nuôi cá tra do đây là đối tượng dễ nuôi, mau lớn, chất lượng thịt ngon, có khả năng thích ứng cao với điều kiện môi trường khắc nghiệt. Năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước (www.fistenet.gov.vn) Tuy nhiên khi diện tích nuôi được mở rộng, nghề nuôi được thâm canh hóa nhất là nuôi với mật độ cao thì vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và gây thiệt hại cũng nhiều hơn. Có thể nói trong những năm gần đây nghề nuôi thủy sản đang phải đương đầu với tình trạng dịch bệnh bùng nổ do sự suy thoái về môi trường và lây lan của mầm bệnh. Trong đó bệnh truyền nhiễm mà nhất là bệnh vi khuẩn đã và đang gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài gan đã học tập và nghiên cứu sản lượng cá nuôi với sự nổi bật là bệnh mủ liệu gây thiệt hại không nhỏ về kinh tế cho nhiều hộ nuôi. Các kết quả nghiên cứu gần đây xác định bệnh mủ gan là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra, bệnh xảy ra trên cá tra nuôi ở tất cả các giai đoạn, tỉ lệ hao hụt có thể lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003). Hiện nay phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra phổ biến là phương pháp sinh hóa sử dụng phương pháp kiểm tra xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20E. Tuy nhiên, chưa có những thông tin về sự đồng nhất hay sai khác khi xác định đặc tính sinh lý và sinh hóa của hai phương pháp này khi định danh vi khuẩn E. ictaluri. Đề tài “Tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kít API 20E” được thực hiện nhằm tìm ra những chỉ tiêu sinh hóa giống và khác nhau khi sử dụng hai phương pháp nêu trên, góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra. 1
Mục tiêu nghiên cứu So sánh các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn E. ictaluri được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kit API 20E. Nội dung nghiên cứu  Xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa các dòng vi khuẩn E. ictaluri xác định bằng phương pháp truyền thống.  Xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa các dòng vi khuẩn E. ictaluri bằng bộ kit API 20E.  Xác định kết quả định danh bằng phương pháp PCR Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2
CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh cá Bệnh cá được bắt đầu nghiên cứu từ cuối thế kỷ XIX nhưng cơ bản vẫn mô tả các dấu hiệu lâm sàng. Sang đầu thế ký XX các nhà khoa học thế giới đã bắt đầu nghiên cứu các triệu chứng cũng như tác nhân gây bệnh trên cá. Năm 1904, Bruno Hofer người Đức đã viết cuốn sách “Father of fish Pathology” (Bùi Quang Tề, 2006). Viện sĩ V.A. Dogiel thuộc viện hàn lâm khoa học Liên Xô cũ là người có công lớn khi viết phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng trên cá (1929), mở đầu cho việc nghiên cứu ký sinh trùng trên cá. Năm 1939 ông cũng cho xuất bản quyển “Bacterial Disease of Fish”. Những năm 1930 bệnh truyền nhiễm của cá đã được nghiên cứu trong các phòng thí nghiệm. Năm 1949 nhà khoa học người Liên Xô E. M. Lyaiman cho xuất bản sách giáo khoa về bệnh cá (Bùi Quang Tề, 2006). Kết quả nghiên cứu các tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản đến nay rất phong phú, bệnh virút của cá đến nay đã phân loại được hơn 60 loại virút Trung tâm Họchọ có cấu trúc ADNThơARN Tài Quanghọc tập Ở Việt Nam bộ cứu thuộc 5 liệu ĐH Cần hoặc @ (Bùi liệu Tề, 2006). và nghiên môn bệnh cá được Hà Ký thành lập năm 1960. Sau đó được đưa vào giảng dạy trong các trường đại học. Từ cuối năm 1960 trở lại đây hàng loạt nghiên cứu về bệnh của động vật thủy sản được tiến hành: Nghiên cứu ký sinh trùng và bệnh của các loài cá nước ngọt miền Bắc Việt Nam của tiến sĩ Hà Ký, 1961- 1967 (Bùi Quang Tề, 2006). Công trình nghiên cứu khu hệ ký sinh trùng của một số loài cá nước ngọt Đồng Bằng Sông Cửu Long của Bùi Quang Tề và ctv,1984-1990 (Trích lược bởi Trần Thị Ngọc Hân, 2006) Nghiên cứu khu hệ ký sinh trùng cá nước ngọt miền Trung và Tây Nguyên của Nguyễn Thị Muội và ctv, 1981- 1985 (Trích lược bởi Trần Thị Ngọc Hân, 2006)…. 2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh xảy ra trên cá tra ở ĐBSCL Tính từ năm 2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy sản của cả nước. Trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so 3
với năm trước. Từ đó, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, số lượng cá tra xuất khẩu được 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch so với năm 2006 (www.fistenet.gov.vn) Tuy nhiên khi mật độ nuôi quá dày nhưng lại không đồng đều về kỹ thuật, môi trường nuôi sẽ bị ô nhiễm tạo điều kiện cho dịch bệnh xảy ra. Dịch bệnh trên cá tra xảy ra quanh năm kể cả mùa khô, mùa mưa, nhưng nặng nhất vào lúc giao mùa, mùa nước đổ, thời tiết thay đổi đột ngột sẽ làm tăng tần số xuất hiện bệnh. Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) thì tần số xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản là vi khuẩn (50,9%), virút (24,6%), ký sinh trùng (21,1%), nấm (3,4%) (trích dẫn bởi Lê Phú Khởi, 2006). Cũng theo điều tra của Lê Phú Khởi (2006) tại An Giang đã ghi nhận được một số bệnh xuất hiện trên cá tra với tần suất khác nhau từ năm 2004 trở lại đây là: bệnh đốm đỏ, mủ gan, ký sinh trùng, thối đuôi, vàng da, đường ruột, nổ mắt, tuột nhớt, rong bè (bỏ ăn), sưng thận, nấm, thối mang. Trong đó 3 bệnh là gan có mủ, đốm đỏ và ký sinh trùng xảy ra với tần suất cao nhất. Kết quả này cũng phù hợp với điều tra của Nguyễn Chính (2005) là tình hình bệnh trên cá tra nhìn chung chưa thấy phát sinh bệnh mới mặc dù tỉ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm ngày càng cao hơn. Trung tâm Học liệuE. ictaluri gây bệnh @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2.3 Vi khuẩn ĐH Cần Thơ trên cá da trơn 2.3.1 Bệnh xuất huyết Vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh xuất huyết được phân lập đầu tiên trên cá nheo Mỹ bởi Hawke (1979). Năm 1999, Austin đã phát hiện ra vi khuẩn này gây bệnh nhiễm trùng máu cấp tính (enteric septicemia of catfish - ESC) trên cá nheo mỹ, gây thiệt hại lớn cho ngành công nghiệp nuôi cá nheo (Hawke và ctv,1998). Plumb, 1999 cho biết bệnh do vi khuẩn E. ictaluri xảy ra trên cá trơn vào mùa có nhiệt độ thấp. Trên cá nheo, bệnh ESC thường xảy ra vào cuối mùa xuân đến đầu mùa hè và trong suốt mùa thu khi nhiệt độ nước khoảng 18 - 28C. Theo mô tả của Inglis và ctv (1993), khi cá bị bệnh trên đầu xuất hiện những vết loét, cá bơi lờ đờ trên mặt nước, bơi xoay tròn với tư thế đầu trên đuôi dưới, sưng tấy ở da, miệng, nắp mang và bụng, phù mắt. Bên trong xoang bụng có chất dịch màu vàng, thận và tỳ tạng sưng to, quan sát mô và các cơ quan có hiện tượng xuất huyết, đặc biệt là có những đốm trắng ở gan. Bệnh này bên cạnh xuất hiện trên cá nheo nuôi ở miền Đông Nam Mỹ, thì bệnh cũng được tìm thấy ở Indiana, Idaho, California, Arizona và New Mexico. 4
Ngoài cá nheo, các loài blue catfish (Ictalurus furcatus), white catfish (Ictalurus melas) cũng nhạy cảm với E. ictaluri (Plumb và Sanchez, 1983) và theo ghi nhận của Kasornchandra và ctv (1987) thì vi khuẩn này cũng được tìm thấy trên cá trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan. Hawke và ctv (1998) mô tả đặc điểm của vi khuẩn E. ictaluri là loài vi khuẩn thuộc nhóm Enterobacteriaceace, vi khuẩn Gram âm, di động yếu ở 25-30 C, ở nhiệt độ cao hơn không di động, H2S và indole âm tính, có khả năng lên men O/F, phát triển chậm trên môi trường thạch, trên môi trường BHI (brain heart infusion) sau 36 - 48 giờ ở 28 - 30C hình thành khuẩn lạc nhỏ, không phát triển ở 37C (Plumb, 1999). Năm 1986, Shotts và ctv tiếp tục nghiên cứu về đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn E. ictaluri, ngoài các đặc điểm trên thì vi khuẩn này còn cho phản ứng cytochrome oxidase, có khả năng lên men glucose và sinh sản phẩm NO3- từ NO2- (trích dẫn bởi Lê Minh Đương, 2007) Vi khuẩn này tồn tại trong môi trường nước thời gian ngắn hay dài còn tuỳ theo nhiệt độ. Nếu nhiệt độ nước là 5C thì vi khuẩn có thể tồn tại trong ao 15 ngày nhưng khi nhiệt độ nước tăng lên 25C thì thời gian sống của chúng rút ngắn chỉ còn khoảng 10 ngày. Tuy nhiên trong lớp bùn đáy ao vi khuẩn này có Trung tâm Họctại khoảng 15Cần ở 5C, 45 ngày ở liệu học ngày ở 25C (Plumb cứu thể tồn liệu ĐH ngày Thơ @ Tài 18C và 95 tập và nghiên 1999) 2.3.2 Bệnh mủ gan trên cá tra Năm 2001, Ferguson và ctv phát hiện đầu tiên bệnh mủ gan trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 và gọi là bệnh BNP (bacillary necrosis of Pangasius). Theo Từ Thanh Dung và ctv (2005) ở Việt Nam, vùng ĐBSCL bệnh mủ gan xuất hiện đầu tiên ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang các vùng lân cận. Đặc biệt những năm gần đây bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng. Tỷ lệ hao hụt lớn ở cá giống nhưng gây thiệt hại kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá có trọng lượng từ 300- 500g. Nguyễn Quốc Thịnh (2002) kết luận khi cá bị bệnh mủ gan biểu hiện bên ngoài không có gì đặc biệt, một số có hiện tượng xuất huyết ở các vi, có khi xuất huyết toàn thân, khi giải phẫu và quan sát nội tạng thấy có nhiều đốm trắng trên gan, thận và tỳ tạng. Thêm vào đó, trong xoang bụng có chứa dịch 5
hơi đặc. Khi cấy những đốm trắng lên môi trường agar sau 24 - 48 giờ thấy xuất hiện các khuẩn lạc rất thuần. Tác nhân gây bệnh mủ gan được xác định là Edwardsiella ictaluri (Từ Thanh Dung và ctv, 2005) Mùa vụ xuất hiện và mức độ gây thiệt hại: Bệnh mủ gan thường xuất hiện vào mùa lũ, cao điểm vào tháng 7, 8. Tuy nhiên trong hai năm gần đây bệnh này xuất hiện trên cá tra hầu như quanh năm. Trong 1 vụ nuôi bệnh mủ gan có thể xuất hiện 3-4 lần. Tỉ lệ hao hụt lên đến 10-15%, tùy thuộc vào chế độ chăm sóc và quản lý (Từ Thanh Dung và ctv, 2005) Dấu hiệu bệnh lý Cá bị bệnh không có những dấu hiệu bệnh lý bất thường, ở giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi nhưng giảm ăn. Một số trường hợp cá có biểu hiện gầy, bơi lờ đờ da nhợt nhạt có biểu hiện xuất huyết trên da và hậu môn. Dấu hiệu bệnh lý đặt thù nhất là bên trong nội quan các cơ quan gan, thận, tỳ tạng xuất hiện những đốm trắng đường kính 1-3 mm, các cơ quan này sưng to và có biểu hiện nhũng ở thận (Ferguson và ctv, 2001) Kết quả nghiên cứu mô bệnh học cá tra bị bệnh trắng gan của Nguyễn Quốc Thịnh và ctv (2003) cho thấy có nhiều hiện tượng thay đổi về cấu trúc đặc biệt Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệuxuất huyết vàvà nghiên cứu là ở gan, thận, tỳ tạng có hiện tượng xung huyết, học tập nhiều vùng bị hoại tử trầm trọng. Vi khuẩn cũng được tìm thấy trên mẫu mô của tất cả các cơ quan này, những vi khuẩn này tạo thành bó ở rìa các vết hoại tử. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa E. ictaluri là loài thuộc họ Enterobacteriaceace, vi khuẩn gram âm, hình que và có kích thước biến đổi, không di động hoặc di động yếu, lên men, cho phản ứng catalate dương tính và oxidase âm tính, phản ứng indole và H2S âm tính. Vi khuẩn E. ictaluri phát triển tốt ở 28C sau 24-48 giờ tạo thành những khuẩn lạc kích thước rất nhỏ (Từ Thanh Dung và ctv, 2005). Năm 2004, Từ Thanh Dung và ctv phân lập được 108 dòng vi khuẩn thuộc loài E. ictaluri từ 181 mẫu cá tra bệnh. Vi khuẩn này sau khi phát triển 24 giờ trên môi trường TSA tạo thành những khuẩn lạc có màu trắng, không có nhân, rìa có dạng không đồng nhất. Đồng thời vi khuẩn này cũng có một số đặc điểm khác với mô tả của Plumb (1993) như có dạng que và có kích thước biến đổi (trích lược bởi Từ Thanh Dung và ctv, 2004), phát triển tốt ở 28C, phát triển yếu ở 37C, điều này lý giải tại sao E. ictaluri cho tới nay chỉ phát hiện trên cá mà chưa tìm thấy ở các loài động vật máu nóng khác như chim, gia súc, heo, động vật có vú ở biển. 6
Độc lực của vi khuẩn E. ictaluri Đã có nhiều tác giả tiến hành thí nghiệm gây cảm nhiễm xác định khả năng gây bệnh của vi khuẩn E. ictaluri trên nhiều đối tượng khác nhau bằng phương pháp tiêm hoặc ngâm với các mật độ vi khuẩn khác nhau. Newton và ctv (1989), tiến hành ngâm cá nheo trong dung dịch có mật độ vi khuẩn E. ictaluri là 5x108 CFU/ml nhận thấy có 93% cá nheo bị nhiễm và biểu hiện bệnh ESC (trích dẫn bởi Plumb, 1999). Năm 1993, để kiểm tra đường xâm nhập của vi khuẩn E. ictaluri vào hệ tiêu hóa cá, Baldwin và Newton tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trên 140 cá nheo mỹ (khoảng 8-10 tháng tuổi) bằng phương pháp đưa vi khuẩn vào hệ tiêu hóa với mật độ 1x10 9 CFU/ml. Kết quả tại thời điểm 0,25 giờ đã tìm thấy vi khuẩn ở thận trước. Hai nhà khoa học là Williams và Laurence (2005) đã sử dụng phương pháp tiêm vi khuẩn E. ictaluri so sánh với phương pháp ngâm trên cá nheo Mỹ ở các mật độ tăng dần. Đối với E. ictaluri R4383 WT (dùng phương pháp tiêm) với mật độ 5,2x103 CFU/ml, 5,2x104 CFU/ml, 5,2x105 CFU/ml thì tỷ lệ cá chết lần lượt là 67,2%, 100% và 100%. Trong khi đó E. ictaluri R4383 WT (dùng phương pháp ngâm) với mật độ 5,7x103 CFU/ml, 5,7x10 4 CFU/ml, 5,7x105 Trung tâm Học liệu ĐH Cầnthì tỷ lệ cá chết lần lượt học tập và nghiên cứu CFU/ml, 5,7x106 CFU/ml Thơ @ Tài liệu là 63,5%, 98,7%, 100% và 100%. Qua thí nghiệm này họ kết luận không có sự khác nhau về tỷ lệ chết giữa hai phương pháp ngâm và tiêm. Phan Thị Mỹ Hạnh (2004) tiến hành thí nghiệm một số yếu tố ảnh hưởng của bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri gây ra trên cá tra ở ĐBSCL đưa ra kết luận mật độ vi khuẩn khác nhau sẽ ảnh hưởng khác nhau đến khả năng nhiễm bệnh mủ gan trên cá tra. Khi ngâm cá với mật độ vi khuẩn là 1,5x102 và 1,5x10 3 CFU/ml thì tỉ lệ cá chết dao động từ 56,6-56,7%. Lương Trần Thục Đoan (2006) đã chứng minh rằng ngâm cá tra với mật độ vi khuẩn 1x107 CFU/ml trong 1h, thời gian thí nghiệm 10 ngày, tỉ lệ cá chết là 75% so với hai nồng độ còn lại là 1x105 CFU/ml và 1x106 CFU/ml và đưa ra kết luận rằng mật độ vi khuẩn 1x107 CFU/ml có độc lực cao nhất. Ở một số thí nghiệm khác, Trần Thị Ngọc Hân (2006) khảo sát sự biến đổi cấu trúc mô học của cá tra bệnh mủ gan bằng cách gây cảm nhiễm cá tra với dòng vi khuẩn E. ictaluri ở các mật độ vi khuẩn lần lượt là 1x105, 1x10 6, 1x107 CFU/ml (phương pháp ngâm) và 104, 105 và 106 CFU/ml (phương pháp tiêm), theo dõi tỷ lệ cá chết trong thời gian 10 ngày thì thấy cso sự biến đổi về mặt cấu trúc ở các mô thận, gan, tỳ tạng là nhiều nhất. 7
Phương pháp sinh hóa truyền thống: Sinh hóa truyền thống là phương pháp có từ rất lâu đời, được ứng dụng nhiều trong thủy sản và mang lại kết quả to lớn, định danh thành công các loài vi khuẩn trong môi trường nước, góp phần vào việc nghiên cứu, tìm ra tác nhân gây bệnh. Không phải tác giả nào cũng đưa ra các chỉ tiêu giống nhau để định danh vi khuẩn, chẳng hạn chỉ tiêu này là quan trọng cho loài này nhưng lại không cần thiết cho loài khác, nhưng nhìn chung tất cả đều dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản. Người ta chia vi khuẩn thành các nhóm khác nhau, nhóm vi khuẩn gram âm và gram dương, nhóm di động hay không di động mà từ đó có hướng đi khác nhau cho từng loài vi khuẩn. Việc định danh vi khuẩn dùng sơ đồ gia phả đã được áp dụng bởi nhiều tác giả, và định danh ra các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio, Edwardsiella, Aeromonas…. Năm 2004, Buller dùng phương pháp định danh truyền thống với 41 chỉ tiêu cho các chủng E. ictaluri để kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa. Tương tự, thì Plumb và ctv (1983) cũng đã dùng test sinh hóa truyền thống, kiểm tra các đặc điểm sinh hóa và sinh lý của E. ictaluri với 47 chỉ tiêu. Bộ kít API 20E Kit API 20E là bộ kit do hãng bioMerieux sản xuất, nó được dùng cho việc định danh các loài vi khuẩn gram âm, hình que. Mặc dù API là phương pháp được ứng dụng cho việc định danh các loài vi khuẩn trên động vật nhưng ngày Trung tâm Học liệudụng rộng rãiThơ @ Tài do cáchọc tậpnhanhnghiên cứu nay cũng sử ĐH Cần trong thủy sản liệu thao tác và đơn giản không mất nhiều thời gian, cho kết quả sớm. Cùng với phương pháp sinh hóa truyền thống API được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu các giống loài vi khuẩn. Cụ thể năm 2002, Crumlish và ctv đã sử dụng API để kiểm tra các đặc tính sinh lý, sinh hóa loài E. ictaluri trên cá tra ở 2 tỉnh An Giang và Cần Thơ. Một nghiên cứu gần đây của Buller (2004) dùng kit API 20E không chỉ cho chủng E. ictaluri mà còn cho các loài khác. Hàng loạt các đề tài nghiên cứu của Lương Trần Thục Đoan (2006), Tiết Ngọc Trân (2007), Lê Minh Đương (2007) cũng đã sử dụng kit API 20E để kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của E. ictaluri. 2.4 Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction- PCR) do Karl mullis và cộng sự phát minh năm 1985 (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007). Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn sau: a. Giai đoạn biến tính: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ 8
cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là 94-95C trong vòng 30 giây đến 1 phút. b. Giai đoạn lai: nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70C, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. c. Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên 72C, đó là điều kiện tốt nhất để cho Taq polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho ADN polymerase hoạt động. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự ADN cần khuyếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử ADN khuôn được nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo. Do đó sau mỗi chu kỳ số lượng ADN được tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2n bản ADN từ một khuôn ban đầu. Ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR là một công cụ hữu hiệu trong việc phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virút, ký sinh trùng và nấm. Một số mầm bệnh Trung tâm Học liệu trọng ởCầnnuôi hiện nay được chẩn học bằng PCR nghiên cứu thủy sản quan ĐH tôm Thơ @ Tài liệu đoán tập và gồm: virút đốm trắng (WSSV), virút đầu vàng (YHV), virút gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo lập biểu mô (IHHNV), virút gây hội chứng Taura (TSV) (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007). Phương pháp phức hợp PCR (multiplex PCR - mPCR) là một dạng biến hóa của PCR. Phương pháp này cho phép phát hiện đồng thời nhiều loại bệnh, giúp tiết kiệm công sức lẫn chi phí xét nghiệm. Đối với virút đặc biệt là virút trên tôm, mPCR đã có những bước phát triển mới phát hiện nhiều loại bệnh cùng lúc, đem lại các kết quả chẩn đoán nhanh, chính xác, tiết kiệm nhiều thời gian và công sức. Cụ thể Yang và ctv (2006), đã phát triển phương pháp m-PCR phát hiện đồng thời hai loại virút IHHNV và WSSV trên tôm he. Với đoạn mồi I 2814, I 3516 và W1, W2 lần lượt cho hai loại bệnh trên với trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR lần lượt là 703 và 824 bp. Wongteerasupaya và ctv (1998) đã phát triển phương pháp mRT- PCR phát hiện đồng thời cả ARN và ADN của hai loại virút khác nhau trên tôm là YHV và WSSV, chúng hiện là nguyên nhân gây thiệt hại nghiêm trọng và phổ biến trong nuôi tôm công nghiệp ở Thái Lan và châu Á. Phương pháp cho phép 9
chẩn đoán nhanh bằng cách thực hiện một bước ly trích cả RNA và DNA sử dụng TrizolTM. Acid nucleic sau khi ly trích được khuếch đại bằng mRT-PCR dùng qui trình RT-PCR một bước với mồi 10F-144R cho YHV và WSV4.2F- WSV4.2R3 cho WSSV. Năm 2008, Khawsak và ctv đã tìm ra một phản ứng mRT-PCR có thể phát hiện cùng lúc 6 loại virus ở tôm là YHV, WSSV, TSV, HPV, IHHNV và MBV trên tôm he. Sáu cặp mồi khuếch đại các acid nucleic cho kết quả là các sản phẩm với các kích thước khác nhau. Những cặp mồi đặc hiệu cao và không gắn vào những acid nucleic của tôm và virút khác. Độ nhạy của phương pháp mRT-PCR là 0.15 pg IHHNV, 0.15 pg TSV, 1 pg HPV, 1.5 pg MBV, 5 pg WSSV và 10 pg YHV. Phương pháp này được thử trên 42 mẫu bao gồm tất cả mô của tôm post và gan tụy của tôm sú đã chọn từ những ao ở trung tâm và vùng phía Nam Thái Lan từ năm 2002 - 2005 được kiểm tra bằng phương pháp mRT-PCR. Kết quả cho thấy rằng ảnh hưởng đơn lẻ là chủ yếu và WSSV là phổ biến nhất tại thời điểm đó. Gần đây, Panangala và ctv (2007) vừa được công bố phương pháp mPCR có thể xác định cùng lúc cả ba loài vi khuẩn gây bệnh trên cá, đó là Flavobacterium columnare (504pb), Edwardsiella ictaluri (407pb), và Aeromonas hydrophila (209pb). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 10
CHƯƠNG III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Thời gian Từ tháng 01/2008 đến 05/2008. 3.1.2 Địa điểm - Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản Khoa Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ. - Phòng thí nghiệm gây cảm nhiễm Khoa Thủy sản, trường Đại Học Cần Thơ. 3.2 Nội dung thực hiện - Phục hồi vi khuẩn từ nguồn vi khuẩn liệt kê ở Bảng 3.1 - Nuôi tăng sinh vi khuẩn. Trung tâm Học liệu ĐH khuẩn theo phươngTài liệu học tập và nghiên cứu - Định danh vi Cần Thơ @ pháp truyền thống. - Định danh vi khuẩn bằng kit API 20E. - Dùng phương pháp PCR khẳng định kết quả định danh. - Tiến hành thí nghiệm gây cảm nhiễm, tái phân lập và tái định danh vi khuẩn. 3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 3.3.1 Vật liệu  Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn,  Đĩa petri, ống nghiệm,  Ống đong, lame, lamella,  Chai nấu môi trường, bình tam giác,  Cá từ, pipet, đầu cone, ống hút, găng tay,  Các vật liệu nghiên cứu khác, v.v…. 3.3.2 Thiết bị  Kính hiển vi,  Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy, 11
 Bếp nấu môi trường, máy lắc, nồi thanh trùng,  Máy ly tâm, máy chu kỳ nhiệt, máy ủ nhiệt, máy so màu quang phổ,…  Cân điện tử, lò viba, bộ điện di….  Các thiết bị khác, v.v…. 3.4 Hóa chất, thuốc thử và môi trường dùng cho nghiên cứu  Cồn 700, cồn 960.  Môi trường phục hồi và nuôi cấy vi khuẩn: EIA (edwardsiella ictaluri agar), TSA (tryptone soya agar; Merck), NB (nutrient broth; Merck)  Bộ kít API 20E (bộ test + thuốc thử: TDA, IND, VP) (BIO MÉRIEUX). Môi trường  Các môi trường đường (glucose, arabinose, rhamnose, sorbitol, manitol, innositol, sucrose) (Merck) dùng để kiểm tra khả năng lên men của vi khuẩn.  Môi trường OF (Merck) dùng để kiểm tra khả năng oxi hóa và lên men của vi khuẩn.  Môi trường thạch Simon Citrate (Merck) dùng để kiểm tra khả năng sử Trung tâm Học liệu ĐH Cầncủa vi khuẩn.Tài liệu học tập và nghiên cứu dùng nguồn cacbon Thơ @  Môi trường MR-VP (Voges Proskauer; Merck) dùng cho phản ứng VP.  Môi trường NB (nutrient broth; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh indole.  Môi trường decarboxylase (Himedia) + yeast extract (Merck) + 1% acid amin (arginine, lysine và ornithin) (Merck) dùng kiểm tra khả năng khử amino acid.  Môi trường 0.1% pepton (Himedia) + 0.2% KH2PO4 (Merck) + 0.0012% phenol red (Merck) +0.1% glucose + 2% ure (Merck) dùng kiểm tra khả năng sử dụng urea của vi khuẩn.  Môi trường TSI (triple sugar iron; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh khí H2S của vi khuẩn. Thuốc thử  Dung dịch oxy già H2O2 3% cho phản ứng catalase.  Que thử Oxidase (Merck).  Đĩa ONPG (Ortho-nitrophenyl galactosidase; Merck)  Thuốc thử Kovac’s (Merck) cho phản ứng sinh indole. 12