LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP" XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH ĐỤC CƠ CỦA Macrobrachium rosenbergii Nodavirus và Extra Small Virus TRÊN TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii)"

Chia sẻ: Cung Ru | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

105
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Theo kết quả nghiên cứu những năm gần đây cho thấy bệnh đục cơ trên tôm càng xanh ngày càng gia tăng, gây thiệt hại không nhỏ cho người nuôi tôm càng xanh ở Cần Thơ nói riêng và cả nước nói chung. Do đó việc xác định khả năng gây bệnh đục cơ của Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNv) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) được thực hiện nhằm tìm hiểu khả năng gây bệnh đục cơ của MrNV và XSV. Kết quả nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu tôm thí nghiệm thăm...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP" XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH ĐỤC CƠ CỦA Macrobrachium rosenbergii Nodavirus và Extra Small Virus TRÊN TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii)"

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THANH TIẾN XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY BỆNH ĐỤC CƠ CỦA Macrobrachium rosenbergii Nodavirus và Extra Small Virus TRÊN TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
TÓM TẮT Theo kết quả nghiên cứu những năm gần đây cho thấy bệnh đục cơ trên tôm càng xanh ngày càng gia tăng, gây thiệt hại không nhỏ cho người nuôi tôm càng xanh ở Cần Thơ nói riêng và cả nước nói chung. Do đó việc xác định khả năng gây bệnh đục cơ của Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNv) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) được thực hiện nhằm tìm hiểu khả năng gây bệnh đục cơ của MrNV và XSV. Kết quả nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu tôm thí nghiệm thăm dò và xác định LD50 trên tôm giống.Và theo phương pháp mô học và RT-PCR. -1- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
LỜI CẢM TẠ Tôi xin cảm ta cô Đặng Thị Hoàng Oanh, anh Hoàng Tuấn, anh Lê Hữu Thôi đã hướng dẫn tận tình khi tôi thực hiện đề tài này và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Xin trân trọng cảm tạ quí thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này. Để có được kết quả ngày hôm nay, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả quí thầy cô của Trường, Khoa Thủy Sản, Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản đã giáo dục, truyền đạt các kiến thức cần thiết cho bản thân tôi để em thực hiện đề tài này. Lời cảm tạ cuối cùng xin được dành cho ngoại và mẹ tôi đã nuôi dưỡng, bảo bọc và tạo mọi điều kiện để tôi có thể tiếp thu một nền giáo dục tốt nhất và có được thành quả như ngày hôm nay. NGUYỄN THANH TIẾN Đại học Cần Thơ, niên khóa 2005 - 2009 -2- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Thủy sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam nói chung và của Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng. Trong vòng 10 năm từ 1995 đến 2005, diện tích nuôi trồng thủy sản vùng ĐBSCL đã tăng hơn 2,37 lần và sản lượng tăng vọt 3,68 lần. Đây là khu vực có nhiều điều kiện thuận lợi cho việc phát triển nuôi trồng thủy sản, tổng diện tích nuôi thủy sản nước ngọt và nước lợ vào khoảng 685.000 ha, sản lượng gần 1,5 triệu tấn/năm, chiếm hơn 70% sản lượng thủy sản nuôi của cả nước (riêng cá tra, cá basa diện tích nuôi toàn vùng gần 5.000ha, tổng sản lượng năm 2007 khoảng 1 triệu tấn) với nhiều loại hình canh tác khác nhau. Bên cạnh các đối tượng phổ biến trên thị trường ngày nay như: cá tra, basa và một số loài tôm biển thì càng xanh cũng là đối tượng đang được chú ý tới. Diện tích nuôi tôm càng xanh tại các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tăng nhanh trong những năm gần đây và hiện đạt gần 5.000ha, tăng gấp 10 lần so với thời điểm 5 năm trước đây. Việc tăng nhanh diện tích và mật độ nuôi tôm càng xanh ở Cần Thơ đã tạo điều kiện cho nhiều bệnh phát triển. Một số bệnh thường gặp ở tôm càng xanh như: bệnh đóng rong, đen mang, bệnh mềm vỏ, bệnh đốm nâu, bệnh phồng mang… đặc biệt là bệnh đục cơ đã gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm ở Cần Thơ. Bệnh đục cơ trên tôm càng xanh ở Cần Thơ ngày càng diễn biến phức tạp. Để tìm ra nguyên nhân và phương pháp phòng bệnh nhằm giảm thiệt hại về kinh tế cho người nuôi tôm ở Cần Thơ. Để góp phần ổn định năng suất và chất lượng con giống thì đề tài “Xác định khả năng gây bệnh đục cơ của Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNv) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii)“ là hết sức cấp thiết nhằm mục tiêu: Tìm hiểu khả năng gây bệnh đục cơ của MrNV và XSV. Nội dung của đề tài: 1. Thực hiện thí nghiệm thăm dò xác định khả năng gây bệnh đục cơ của MrNV và XSV phân lập từ tôm càng xanh bị bệnh đục cơ. 2. Xác định LD50 của MrNV và XSV trên tôm càng xanh -3- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU Tình hình nuôi tôm càng xanh Việt Nam có nhiều tiềm năng để phát triển nuôi trồng thuỷ sản ở khắp mọi miền đất nước cả về nuôi biển, nuôi nước lợ và nuôi nước ngọt. Đến năm 2003, đã sử dụng 612.778 ha nước mặn, lợ và 254.835 ha nước ngọt để nuôi thuỷ sản. Trong đó, đối tượng nuôi chủ lực là tôm với diện tích 580.465 ha. Diện tích nuôi tôm càng xanh tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long đã tăng nhanh trong những năm gần đây và hiện đạt gần 5.000ha, tăng gấp 10 lần so với thời điểm 5 năm trước đây. Diện tích nuôi tôm càng xanh tập trung lớn nhất tại các tỉnh hai bên bờ sông Tiền và sông Hậu như An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Bến Tre và Thành phố Cần Thơ. Năm 2007 diện tích nuôi thuỷ sản của Thành Phố Cần Thơ là 15.245 ha gồm cá ao, cá tra, cá ruộng và tôm càng xanh, tăng 5% so với năm 2006. Sản lượng thu hoạch 175.083 tấn, trong đó cá tra đạt 154.564 tấn vượt kế hoạch 14,4%, tôm càng xanh 268 tấn. Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản 2.2.1 Tình hình dịch bệnh trên tôm càng xanh Theo tổng hợp nhiều nghiên cứu bệnh trên tôm càng xanh ở khu vực ĐBSCL, kết quả cho thấy một số bệnh xuất hiện trên tôm càng xanh như: An giang, bệnh do các sinh vật bám 44%, bệnh đen mang 28%, bệnh có những đốm nâu 28 %. Bệnh do nguyên sinh động vật: Epistylis, Zoothamnium, Vorticella, và Acineta, ở trên mang 32 %, bề mặt cơ thể 32%, chân bơi 31%. Ngoài ra bệnh còn có thêm một số sinh vật kí sinh khác được tìm thấy các tỉnh lân cận Đồng Tháp, Trà Vinh và Cần Thơ, sinh vật bám gây bệnh nhiều trên mô hình nuôi tôm lúa luân canh (Dat and Oanh, 2002). Bên cạnh đó tôm càng xanh bị bệnh do một số loài vi khuẩn thuộc các nhóm sau: Vibrio gây chết tôm giai đoạn post-larve với tỉ lệ chết từ 18-80% trong 48 giờ, ngoài ra còn có nhóm vi khuẩn thuộc Aeromonas, Speudomonas,… 2.2.2 Một số bệnh do vi khuẩn trên tôm càng xanh 2.2.2.1 Bệnh do vi khuẩn Vibrio Tác nhân gây bệnh thường là các vi khuẩn :Vibrio anguillarium, V.alginolyticus, V.parahacmolyticus, V. harveyi và những loài khác. Khi nuôi -4- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
ở mật độ quá dày, cho ăn quá nhiều và quản lý môi trường ao nuôi không tốt sẽ làm bệnh xuất hiện. Ở Thái Lan bệnh do vi khuẩn gây ảnh hưởng nặng nề đến các trại giống, tỉ lệ chết có thể lên đến 100% và khi bệnh xuất hiện thì hầu hết các trại sản xuất tôm giống đều bị thất bại hoàn toàn (AAHRI,1997 trích dẫn bởi Phạm Minh Trúc 2009 ). Ở Trung Quốc, theo Xianle and Huang (2003) tỉ lệ chết thường là 30-50% tôm ở giai đoạn hậu ấu trùng. Nếu giai đoạn giống bị nhiễm bệnh thì gây tổn thất nặng hơn hay mất trắng. Do vậy, các trại giống thường sử dụng thuốc kháng sinh để ngăn chặn bệnh xảy ra và điều này có thể làm xuất hiện nhiều dòng vi khuẩn kháng thuốc. 2.2.2.2 Bệnh đốm nâu Nguyên nhân gây ra bệnh này là sự liên kết của nhiều tác nhân: hóa học, dinh dưỡng, lý học. Vi khuẩn và nấm là tác nhân lây nhiễm thứ hai. Các vi khuẩn gồm: Aeromonas sp., Pseudomonas sp.. Tôm bị bệnh có dấu hiệu bị hoại tử, sưng viêm và đốm đen trên thân và phụ bộ. tỉ lệ chết không đáng kể nhưng nó làm giảm giá trị kinh tế của tôm, theo Sandifer và Smith (1995) đây là bệnh thường xảy ra ở ao nuôi tôm đặc biệt là hệ thống nuôi tôm công nghiệp mật độ dày . 2.2.2.3 Bệnh hoại tử do vi khuẩn (Bacterial Necrosis) Bệnh này ảnh hưởng đến ấu trùng của tôm càng xanh giai đoạn 4-5 và gây tỉ lệ chết 100% trong vòng 48h ở Taihiti. Dấu hiệu bệnh lý của bệnh này là cơ thể tôm hơi xanh hoặc đổi màu, ruột trắng ấu trùng yếu và lắng xuống đáy bể , có những đốm nâu trên anten và phụ bộ (Aquacop, 1977 trích dẫn bởi Phạm Minh Trúc 2009 ) 2.2.2.4 Bệnh do vi khuẩn dạng sợi Bệnh này thường do các vi khuẩn dạng sợi: Leucothrix sp., Thiprix sp., Flexibacter sp., Cytophaga sp., và Flavobacterium sp gây ra. Nhiễm bệnh vào tất cả các giai đoạn phát triển của tôm. Bệnh này có thể gây chết 80% hay hơn thế nữa trong vài ngày đến vài tuần. Ở ấu trùng và tôm bột vi khuẩn phát triển trên bề mặt cơ thể, nhất là trên các lông và phụ bộ. Ở tôm lớn, vi khuẩn hiện diện trên các lông tơ của chân bụng, chân ngực, chân đuôi, vảy râu, phụ bộ miệng và mang. Tôm nhiễm nặng, mang xuất hiện màu vàng đến xanh. Vi khuẩn dạng sợi gây cản trở hô hấp, lột vỏ, bắt mồi, gây chậm lớn hay gây chết tôm. (Từ Thanh Dung, 2008) 2.2.3 Bệnh do dinh dưỡng và môi trường 2.2.3.1 Bệnh đen mang -5- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Nguyên nhân gây ra bệnh đen mang là do đáy ao nuôi bị nhiễm bẩn. Khi kiểm tra thấy khí độc (Ammonia) ở đáy ao cao vì có nhiều bùn đáy và vật chất hữu cơ dư thừa ( thức ăn thừa - do thức ăn nhiều tôm ăn không hết, từ tảo chết v.v..). Bệnh này thường xuất hiện trong ao nuôi với mật độ cao, trong ao nuôi theo hệ thống không thay nước hoặc ít thay nước. Khi tôm mắc bệnh mang xuất hiện màu đen và đôi lúc có các chất hữu cơ hoặc vô cơ bám vào mang tôm. Nếu không xử lý kịp thời sẽ làm tôm nhiễm bệnh từ vi khuẩn. Bình thường bệnh đen mang xảy ra lúc tôm lớn (tôm được hai tháng rưỡi tới ba tháng trở lên). ( ) 2.2.3.2 Bệnh do sinh vật bám Nguyên nhân của bệnh này là do Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Acineta, hoặc các loại Protozoa bám trên vỏ và mang tôm làm tôm stress nếu bị nặng thường tôm sẽ không thể lột vỏ được. Kiểm tra tôm trong sàn ăn (vó), thấy vỏ tôm bị bẩn giống như có nhớt bám trên vỏ tôm và nhiều khi thấy có rong là do tảo bám trên vỏ tôm, vỏ tôm không sạch. Sau khi bị nhiễm bệnh, tôm giảm ăn, từ từ yếu đi, nằm vùi trong đống bùn ao. Nếu không trị kịp thời tôm sẽ chết vì nhiễm các tác nhân gây bệnh cơ hội (vi khuẩn). Ở trung Quốc, bệnh này thường nghiêm trọng hơn vào mùa sản xuất giống. Các loài kí sinh trùng tấn công vào các ao ương, chúng sẽ sinh sản một cách nhanh chóng và gây chết tôm giống. Nếu gặp môi trường xấu, giàu chất dinh dưỡng thì tỉ lệ chết có thể lên đến 60-80% (Xianle và Huang, 2003). Các nghiên cứu về bệnh đục cơ 2.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Theo tổng hợp nhiều nghiên cứu bệnh trên tôm càng xanh ở cả nước nói chung và ở ĐBSCL nói riêng. Ngoài ra bệnh thường gặp trên tôm càng xanh còn bị bệnh do một số loài vi khuẩn thuộc các nhóm: Vibrio gây chết tôm ở giai đoạn Post-larve với tỉ lệ chết 18-80% trong 48 giờ ngoài ra còn có các nhóm vi khuẩn thuộc Aeromonas, Speudomonas,…. Theo Bùi Quang Tề (2003) cho rằng tác nhấn gây bệnh đục cơ trên tôm càng xanh là do vi khuẩn Lactoccocus garvieae. Bệnh đục cơ ở Thành phố Cần Thơ từ năm 2004 đến nay ngày càng gia tăng. Năm 2004 bệnh đục cơ đã gây thiệt hại 10ha diện tích nuôi tôm càng xanh ở Cờ Đỏ và gây hao hụt từ 60-70%. Năm 2005, bệnh đục cơ gây thiệt hại một số mô hình nuôi ở Cờ Đỏ, mức độ hao hụt từ 70-100%. Từ đầu năm 2006 đến nay, tình hình bệnh đục cơ lại xuất hiện ở một số trại giống trên địa bàn -6- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Thành phố Cần Thơ gây hao hụt lớn cho các ao nuôi thịt và tỷ lệ hao hụt lên đến 70-100% sau 1 tuần thả nuôi. Thành phố Cần Thơ, nơi tập trung khá nhiều trại giống tôm càng xanh và là nơi có vùng nuôi tôm thương phẩm tương đối lớn gần 400ha. 2.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Nash et al. (1987) cho rằng bệnh hoại cơ (trắng cơ) có dấu hiệu bệnh và mô học tương tự như bệnh đục cơ gây hao hụt lên đến 60% tôm bột 28 ngày tuổi (PL-28) ở các hệ thống ương thâm canh ở Thái Lan. Tôm bệnh có những vùng trắng đục trên cơ (Akiyama et al. 1982; Nash et al. 1987; Broch, 1988). Tôm chết có liên quan đến hoại tử cơ khắp cơ thể tôm. Bệnh này được phát sinh ở nhiều trại giống khi điều kiện môi trường thay đổi đột ngột. Ngoài ra bệnh hoại tử cơ có thể xảy ra 1-2 ngày sau khi thả nuôi thịt. Chen et al.(2001) cho rằng bệnh đục cơ trên tôm càng xanh xảy ra ở Đài Loan năm 1999, tỷ lệ chết 30-75%. Tác giả này cho rằng tác nhân gây bệnh là do vi khuẩn Lactoccocus garvieae. Bệnh đục cơ do vi khuẩn gây ra có liên quan đến sự sốc môi trường như nhiệt độ và pH. Trung Quốc là nước có diện tích và sản lượng tôm càng xanh lớn nhất thế giới với 33.000ha nuôi và sản lượng đạt 100.000 tấn năm 2001 (Qian et al, 2003). Trong những năm gần đây nghề nuôi tôm của quốc gia này bị thiệt hại nặng nề do ảnh hưởng của bệnh đục cơ, tỷ lệ hao hụt lên đấn 100% ỏ các trại giống và bệnh này đã phát triển nhanh chóng đến các vùng nuôi tôm cua Trung Quốc (Qian et al, 2003). Theo Qian et al (2003) thì có ít nhất 1 loại virus là tác nhân gây bệnh đục cơ. Yang et al (2003) cho rằng tôm càng xanh là loài nhạy cảm với bệnh đục cơ, bệnh trắng đuôi hay bệnh hoại tử và bệnh này xuất hiện ở Trung Quốc từ nguồn tôm giống nhập từ Thái Lan. Bệnh đục cơ xuất hiện ở Quảng Đông sau đó lây sang các tỉnh khác với tỷ lệ nhiễm từ 60-90% và tỷ lệ chết >50% ở cỡ tôm 2-8cm. Bệnh thường xuất hiện từ tháng 4 đến tháng 6 hằng năm và chủ yếu là ở ấu trùng. Tôm bị đục cơ có biểu hiện ban đầu là xuất hiện những đốm trắng ở đuôi, tiếp theo tôm ngừng lột xác, bỏ ăn, giảm vận động, phần cơ bị đục, sau đó là toàn thân có màu trắng (cả đầu) và chết hoại tử. Nguyên nhân gây bệnh có thể là ký sinh trùng, vi khuẩn và dinh dưỡng kém. Điều kiện môi trường xấu cũng là nguyên nhân gây bệnh đục cơ (Yang et al, 2003) Sahul Hameed et al, (2004) đã mô tả chi tiết tác nhân gây bệnh đục cơ là do 2 loại virus Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNV) và Extra small -7- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
virus (XSV). Tuy nhiên tác nhân gây bệnh đục cơ của từng loại virus chưa rõ. Ngoài ra, tác giả còn trình bày phương pháp chẩn đoán bệnh đục cơ bằng phương pháp RT-PCR. Theo Pillai et al, (2005) thì tôm càng xanh là loài có giá trị kinh tế được nuôi thâm canh ở miền Nam Ấn Độ. Nền công nghiệp nuôi tôm đã bị thiệt hại về kinh tế trong những năm gần đây vì bệnh đục cơ với tỷ lệ hao hụt lên đến 100% ở các trại giống và các ao ương và dấu hiệu bệnh là xuất hiện đốm trắng trên cơ thể, đặc biệt là ở đuôi (Sahul Hameed et al, 2004). Phương pháp phòng trị bệnh đục cơ 2.4.1 Các biện pháp phòng bệnh đục cơ do virus Theo Sahul Hameed et al (2004) cho rằng biện pháp để quản lý bệnh đục cơ với tác nhân là virus là kiểm soát chất lượng tôm mẹ và tôm giống. Tác giả còn khuyến cáo thường xuyên vệ sinh trại sản xuất giống, ao nuôi, các dụng cụ sản xuất, nước thải…Bên cạnh kiểm soát chặt chẽ quy trình sản xuất giống và quy trình nuôi thương phẩm. Theo Singh và Kumar (2005), hiện tại chưa có biện pháp xử lý hữu hiệu đối với bệnh đục cơ. Thực hành quản lý tốt ở các trại giống và ao nuôi góp phần giảm thiểu sự lây lan mầm bệnh. Theo Bonami và Winada (2005), không có biện pháp xử lý tác nhân gây bệnh là virus, các trại sản xuất giống và ao nuôi nên thực hành quản lý tốt hơn để giảm thiểu sự lây lan và tác động của bệnh đục cơ. 2.4.2 Các biện pháp phòng trị bệnh đục cơ do vi khuẩn Phòng bệnh: không để tôm bị sốc vì môi trường nuôi xấu; nhiệt độ trong ao để biến thiến trong ngày quá 30C, thiếu oxy vào buổi sáng, pH=7.5-8.5; H2S=0,01mg/l. Bón vôi CaCO3 với liều lượng 1-2kg/100m3 nước ao. Cho ăn vitamin C với liều lượng 2-3g/kg thức ăn, mỗi tháng 2 đợt, mỗi đợt 1 tuần (Bùi Quang Tề, 2003) Trị bệnh: cho ăn một số kháng sinh Amikacin hoặc Ciprofloxancin liều lượng 100mg/kg tôm/ngày thứ 1 và từ ngày thứ 2-7 cho ăn liều 50mg/kg tôm/ngày. (Bùi Quang Tề, 2003) -8- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
CHƯƠNG III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian : từ tháng 1 đến tháng 5 năm 2009 - Địa điểm : Khoa Thủy Sản – Đại Học Cần Thơ 3.2 Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ - Bể Composite 100 lít, 500lít, 1000 lít - Máy sục khí, ống dẫn khí,… - Kim tiêm, cối sứ - Kẹp, kéo, bi nghiền mẫu, găng tay. - Ống eppendorf 0,2 ml/0,5 ml, 1,5 ml. - Hộp đầu cone và đầu cone 10 µl, 200 µl, 1000 µl. - Pipet, micropipette 0,5 - 10 µl / 2 - 20 µl, 2 - 200 µl, 100 - 1000 µl. - Ống đong 100 ml, chai chịu nhiệt 250 ml, cốc 250 ml. - Máy ủ nhiệt, máy ly tâm, máy nghiền mẫu, máy so màu quang phổ, máy luân nhiệt, tủ âm, nồi áp suất. - Cân điện tử, lò vi sóng, bộ điện di, máy chụp hình gel. - Lamella, lame, kính hiển vi Hoá chất - Dung dịch Davidson’s AFA - Dung dịch TN buffer - Cồn tuyệt đối, xylen, parafin, sáp ong - Hematoxylin, acid alcohol, Eosin, nước cất, nước máy. - Canada balsam. - TRIzol reagent, Chloroform, Isoamylalcohol, Ethanol, TE buffer. - Agarose, dung dịch TAE 0,5 X, Ethidium bromide (10 mg/ml), dung dịch nạp mẫu (6X Loading Dye), thang ADN. - Enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase), PCR buffer (10mM Tris- HCl, pH 8,8, 50mM KCl, 1,5mM MgCl2, 0,1% Trixton X-100), 10 mM dNTPs mix (dNTA, dNTT, dNTG, dNTC), Taq ADN polymerase, mồi. -9- PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Bảng 3.1: Trình tự mồi sử dụng (theo Hameed et al., 2004) Tên mồi Trình tự MrNV2aF 5’-GCG TTA TAG ATG GCA CAA GG-3’ MrNV2aR 5’-AGC TGT GAA ACT TCA ACT GG-3’ XSV-F 5'-GGA GAA CCA TGA GAT CAC G-3' XSV-R 5'-CTG CTC ATT ACT GTT CGG AGT C-3' 3.3 Vật liệu nghiên cứu - Mẫu tôm bệnh đục cơ được thu từ các ao nuôi thịt và được xác định nhiễm MrNv và XSV bằng phương pháp RT-PCR được sử dụng để ly trích MrNv và XSV gây cảm nhiễm. - Tôm càng xanh: tôm giống(PL20), tôm thịt (20g). 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Chuẩn bị vi-rút gây cảm nhiễm (Hameed et al., 2006). - Các mẫu tôm bị bệnh đục cơ nặng được thu về từ các ao nuôi và trữ trong tủ âm -800C. - Khi chuẩn bi vi-rút để gây cảm nhiễm thì tôm được rã đông và lột vỏ để lấy những phần cơ mềm và cho vào cối sứ nghiền thật nhuyễn. - Phần cơ đã được nghiền nghuyễn được cho vào ống Falcol tiệt trùng và cho dung dịch TN buffer vào với tỷ lệ 10:1 với phần cơ. - Sau đó, ly tâm với vận tốc 4000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. - Dùng kim tiêm rút phần dịch phía trên cho vào ống eppendorf 1.5ml tiệt trùng rồi tiếp tục ly tâm với vận tốc 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. - Sau đó rút phần dịch phía trên và lọc qua lưới 0.22 µm và giữ ở -800C cho đến khi sử dụng. - Dung dịch vi-rút được xác định có chứa MrNV và XSV bằng phương pháp RT-PCR 3.4.2 Phương pháp ly trích RNA (Sử dụng Trizol) - Cho 5-10 tôm bột vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 750 µl trizol. - Nghiền mẫu, đảo nhẹ tuýp vài giây và giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. - Chuyển phần dịch trong sang một ống eppendof 1,5µl khác. - 10 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
- Thêm 200 µl chloroform/1ml Trizol. Vortex kỹ trong 15 giây và giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 2-80C - Chuyển phần trong phía trên sang một ống eppendorf 1,5 ml mới - Thêm 375 µl isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút. - Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 2-80C, sau đó rút bỏ isopropanol. - Rửa phần viên bằng bằng 500 µl ethanol 80%. - Trộn đều bằng vortex và ly tâm 7.500 vòng/phút trong 5 phút ở 2-80C, loại bỏ phần nước. - Để khô ethanol tự nhiên trong 2-3 phút, sau đó làm khô phần viên bằng cách ủ ở 700C trong 2-3 phút. - Hòa tan phần viên với 40 µl TE buffer, trữ -800C. 3.4.3 Phương pháp đo hàm lượng ARN bằng máy so màu quang phổ Hàm lượng ARN của mẫu được xác định bằng máy so màu quang phổ sử dụng bước sóng 260 nm và 280 nm. - Đầu tiên sử dụng 500µl nước cất để tạo mẫu blank. Thông thường đo mẫu nước cất 3 lần rồi mới đo mẫu ARN ly trích. - Đo hàm lượng ARN mẫu ly trích (pha loãng hàm lượng ARN ly trích gốc với nước ra 100 lần: 1 µl ARN và 99 µl nước cất). - Nhấn nút đo để đọc số trên máy. Khi có kết quả ta tính toán hàm lượng ARN theo công thức: [ARN]( µg/ml) = Giá trị đo ở 280nm x 40 x độ pha loãng 3.4.4 Phương pháp RT-PCR phát hiện MrNV và XSV Khuếch đại DNA (Sử dụng kit ABGen) Bảng 3.2: Thành phần hóa chất tham gia phản ứng Hoá chất/Dung dịch Nồng độ Thể tích Nước 1-Step 0,5 X Verso Enzyme 1,25 U F-Primer (MrNV2a+XV) 400 nM R-Primer (MrNV2a+XV) 400 nM RT Enhancer 50 U Mạch khuôn RNA 200ng Tổng 50µl - 11 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Điều kiện phản ứng 500C trong 15 phút 950C trong 2 phút Sau đó 950C trong 20 giây 550C trong 30 giây 720C trong 1 phút Lặp lại chu kỳ trên 35 lần 720C trong 5 phút Giữ ở 200C Chuẩn bị phản ứng - Việc chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng RT-PCR được thực hiện dựa theo số lượng mẫu cần phân tích. Mỗi lần chuẩn bị mẫu cần tính thêm 1 đối chứng dương và 1 đối chứng âm. - Trộn đều hóa chất theo các thành phần như bảng trên - Cho 49 µl hỗn hợp vào ống eppendorf đã được ghi tên. - Thêm 1 µl RNA hoặc mẫu đối chứng vào mỗi phản ứng. - Thực hiện phản ứng PCR với chu kỳ nhiệt nêu trên. - Sau khi phản ứng kết thúc, sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V trong khoảng thời gian từ 60 phút. Điện di và đọc kết quả Chuẩn bị gel - Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch (1% agarose). - Đun nóng dung dịch agarose bằng lò vi sóng cho tới khi agarose tan hoàn toàn. Sau đó, để dung dịch agarose nguội khoảng 50-600C, cho Ethidium bromide (nồng độ 10 mg/ml) vào và đổ từ từ agarose vào khay đựng gel đã chuẩn bị trước. Thể tích gel tuỳ thuộc vào khay gel. (Nếu thể tích gel là 30 ml thì cho 2 µl Ethidium bromide, nếu thể tích gel là 120 ml thì cho 5µl Ethidium bromide) - 12 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
- Khi gel đặc lại, cẩn thận gỡ lược gel và các keo dán ở 2 bên ra khỏi khay đựng gel. Gel sẽ được điện di. Điện di - Đầu tiên, đặt gel vào bồn điện di (phân tử ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương vì ADN mang điện tích âm), thêm dung dịch điện di TAE 0,5X vào bồn cho tới khi dung dịch này vừa bao phủ gel. - Dùng pipette hút 10 μl mẫu cần phân tích trộn với 1 giọt dung dịch nạp mẫu cho vào từng giếng một. - Phải dùng thang ADN cho từng gel để xác định trọng lượng phân tử của mẫu phân tích. - Sau đó, nối bồn điện di với nguồn điện di, điều chỉnh dòng điện là 100V và thực hiện quá trình điện di. Ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển đến khoảng 1/2 đến 2/3 gel. Sau đó tiến hành đọc kết quả. Đọc kết quả Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu của MrNV là 425 bp và của XSV là 500 bp. 3.4.5 Gây cảm nhiễm thăm dò Dùng kim tiêm rút 50 µl dung dịch có chứa virus đã được chuẩn bị sẵn tiêm vào các cá thể tôm đã được bố trí. Tôm được tiêm ở đốt thứ 4 của tôm. Sau đó quan sát trong 10 ngày. Mỗi ngày cho tôm ăn 2 lần (sáng 6h30, chiều 17h00). Khoảng 4-5 ngày shiphone bể 1 lần và cấp nước vào. Cách 2 giờ quan sát 1 lần, ghi nhận số lượng tôm chết và dấu hiệu bệnh lý của tôm. 3.4.6 Xác định LD50 3.4.6.1 Chuẩn bị vi-rút 3.4.6.2 Bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm trên tôm giống. Chuẩn bị bể và bố trí thí nghiệm - Các bể và các dụng cụ thí nghiệm được tiệt trùng bằng Chlorine nồng độ 100-200 ppm - Sau đó, nước được lấy vào 10 bể 20 lít, mỗi bể khoảng 5 lít nước, sử dụng Chlorine cho vào mỗi bể với nồng độ 30ppm và sục khí liên tục 4-5 ngày cho hết Chlorine. - Nước được thử lại bằng bộ test Chlorine để xem còn Chlorine hay không (nước được lấy vào cốc 10ml và nhỏ 2-3 giọt dung dịch test để 5 phút, nếu - 13 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
thấy có màu vàng cam thì nước còn Chlorine và nếu thấy nước không đổi màu thì Chlorine đã hết, tôm có thể được thả vào). - Sau đó tôm được thu từ trại giống về và trữ trong bể 1m3 để thuần khoảng 2-3 ngày. Trước khi tôm được thả vào bể kiểm tra tôm lại và chọn những cá thể khỏe và không nhiễm MrNV va XSV (xác định bằng RT-PCR và mô học) để gây cảm nhiễm. - Tôm được bố trí vào 10 bể 20 lít đã chuẩn bị trước. Sau 1 ngày tiến hành gây cảm nhiễm Cách bố trí thí nghiệm - Tôm được bố trí 100 PL/bể và được bố trí vào 10 bể - Tôm được bố trí ngẫu nhiên, chọn 2 bể làm đối chứng. - Bể đối chứng không ngâm dịch vi-rút, các bể còn lại được ngâm dịch vi- rút theo nồng độ giảm dần. (1/5000; 0,5/5000; 0,25/5000; 0,125/5000, đơn vị tính: ml) Các chỉ tiêu thu thập - Ghi nhận số tôm chết trong 10 ngày. - Phát hiện MrNV và XSV từ tôm bệnh bằng RT-PCR Hình 2: Bể bố trí thí nghiệm tôm giống - Tính LD50 theo phương pháp của Reed & Muench, 1938. (Tỷ lệ nhiễm (chết)>50%) – 50% Index = (Tỷ lệ nhiễm (chết)>50%) – (Tỷ lệ nhiễm (chết)
Chỉ số này được áp dụng cho nồng độ có tỷ lệ gây nhiễm (hay gây chết) trên 50%, từ đó ta tìm được độ pha loãngmà tại đó lương virus trong dung dịch có thể đủ để gây nhiễm (hay gây chết) 50% tôm được cảm nhiễm. Dung dịch virus ở nồng độ pha loãng này chứa 1 liều SID50 (hay LD50) trên một thể tích dịch virus gây nhiễm tương ứng. 3.4.7 Phương pháp cố định (Lightner, 1996) Chuẩn bị dung dịch Davidson’s AFA theo công thức: - Ethyl alcohol 95% 330ml - Formalin 200ml - Acid acetic 115ml - Nước cất 335ml Các bước cố định mẫu - Dùng kéo cắt 1 đường trên lớp vỏ kitin, từ đốt bụng thứ 6 đến cuống mắt (lưu ý không được cắt sâu đến lớp mô). Đường rạch trên khu vực đầu nên là 1 đường giữa của mặt lưng và chỉ ở 1 phần bên. Trong khi đó, ở khu vực bụng đường rạch là đường giữa. - Đối với tôm lớn hơn 12g, nên cắt đôi tại vị trí nối của phần đầu và phần bụng, và tiếp tục chia phần bụng làm 2. - Cho tôm vào dung dịch cố định. Cho phép để ở nhiệt độ phòng trong thời gian là 24-72 giờ, thời gian cố định phụ thuộc vào kích cỡ tôm (tôm lớn hơn thì thời gian cố định dài hơn). - Chuyển tôm sang cồn 50-70% để bảo quản mẫu. Thời gian để trong cồn thì không giới hạn 3.4.7.1 Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô a Cắt tỉa định hướng Đối với tôm lớn hơn 3cm cần phải cắt tôm ra thành những phần nhỏ tại các vị trí khác nhau. Sau đó lấy những phần nhỏ của tôm cho vào khuôn nhựa xử lý mẫu. - 15 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
b Xử lý mẫu Tiếp theo quá trình cắt tỉa định hướng là quá trình xử lý mẫu. Bảng 3.3: Qui trình xử lý mẫu mô tôm được cài đặt trong máy xữ lý mô (Coolidge & Hoqward, 1997. (Trích bởi: Shreck & Moyle, 1999) STT Hóa chất sử dụng Kích cỡ khối tôm/Thời gian > 5mm < 5mm < 3mm < 1mm 1 Cồn 80% 30' 20’ 10’ 5’ 2 Cồn 95% 60’ 20’ 10’ 5’ 3 Cồn 95% 30’ 30’ 10’ 5’ 4 Cồn 100% 60’ 40’ 20’ 5’ 5 Cồn 100% 180’ 40’ 20’ 5’ 6 Cồn 100% 180’ 40’ 20’ 5’ 7 Cồn 100% 180’ 60’ 30’ 5’ 8 Xylen 30’ 20’ 20’ 5’ 9 Xylen 30’ 30’ 20’ 5’ 10 Parafin + Xylen (7:3) 60’ 60’ 20’ 5’ 11 Parafin + sáp ong (1:1) 60’ 60’ 30’ 5’ 12 Parafin + sáp ong 60’ 60’ 30’ 5’ Sau khi hoàn thành bước cài đặt chương trình xử lý mô thì tiến hành cho sọt chứa mẫu mô tôm vào lọ số 1 và cho chương trình được cài đặt trên vận hành. c Đúc khối Sau quá trình xử lý, chuyển khuôn nhựa sang vị trí số 2 của máy đúc khối. Để khối mô trong parafin khoảng 30 phút, sau đó tiến hành đúc khối. Mẫu mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành đúc khối bằng parafin nóng chảy ở 650C. Định hướng mẫu mô cho đúng, cẩn thận cho mẫu parafin nóng chảy vào khuôn. Để đảm bảo mẫu được giữ đúng vị trí thì cho khuôn đúc qua khu vực làm lạnh nhanh để cố định vị trí của mẫu trong khuôn. Khi mẫu mô được tẩm vào trong parafin, đặt khuôn nhựa xử lý có ký hiệu mẫu lên trên. Tiếp theo đặt khuôn mẫu qua ngăn làm lạnh nhanh để parafin rắn lại, sau đó tách parafin ra khỏi khuôn. d Cắt lát mẫu mô Chuẩn bị máy cắt đặt dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặt. Độ lệch của lưỡi dao với mặt cắt của khối mẫu tạo thành 1 góc khoảng 15-300. Khối mẫu sẽ được cắt thành các lát cắt khi tay quay của máy xoay tròn, sau mỗi vòng xoay sẽ có 1 lát cắt được hình thành. - 16 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
Cắt mẫu Trước khi tiến hành cắt mẫu, phải điều chỉnh độ dày của lát cắt. Có thể bắt đầu bằng những lát cắt 12-16 µm. Khi cắt đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày của lát cắt theo yêu cầu cụ thể của từng loại mẫu mô hoặc mục đích của nghiên cứu. Dán lát cắt vào phiến kính (lame) Chuẩn bị dụng cụ và dung dịch - Phiến kính (lame) - Nước ấm nhiệt độ khoảng 400C - Bàn sấy nhiệt độ khoảng 500C Phương pháp dán mẫu Sử dụng nước ấm khoảng 400C, cho lát cắt vào chậu nước ấm. Sau khi lát cắt giãn thẳng trong chậu nước, nhúng phiến kính vào ngay bên dưới lát cắt, cẩn thận đính một đầu lát cắt vào phiến kính, điều chỉnh lát cắt đúng hướng, từ từ rút phiến kính ra khỏi mặt nước, lát cắt sẽ được dán chặt vào phiến kính. Sau khi dán lát cắt, tiến hành làm khô tiêu bản bằng bàn sấy ở nhiệt độ 500C để loại bỏ paraffin. e Nhuộm màu Phương pháp nhuộm màu bằng Hematoxylin và Eosin (H&E) Bảng 3.4: Qui trình được cài đặt trong máy nhuộm mẫu mô tự động như sau: STT Hóa chất sử dụng Thời gian 1 Xylen 5 phút 2 Xylen 5 phút 3 Xylen 5 phút 4 Cồn 100% 5 phút 5 Cồn 100% 5 phút 6 Cồn 70% 2 phút 7 Nước cất 5 phút 8 Hematoxylin 1 phút 9 Nước máy 5 phút 10 1% acid alcohol 10 giây 11 Nước máy 1 phút 12 Eosin 2 phút 13 Cồn 95% 5 phút - 17 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
14 Cồn 100% 5 phút 15 Cồn 100% 5 phút 16 Xylen 5 phút 17 Xylen 5 phút Sau khi cài đặt, cho phiến kính có chứa mẫu vào trong giá và cho vào máy nhuộm với chương trình đã cài đặt trên. Với phương pháp nhuộm này, nhân tế bào sẽ bắt màu xanh dương. Vùng tế bào chất với lưới nội chất (tế bào gan, tuyến tụy ngoại tiết) có màu xanh nhạt hay tím. Phần tế bào chất còn lại sẽ dao động quanh màu hồng sậm. Sử dụng keo để dán tiêu bản vĩnh viễn. Nhỏ 1 giọt keo lên trên “slide” dán “lamella” lên trên ngay vùng có miếng mô. Thao tác này cần làm nhanh để tránh sự xâm nhập của hơi nước trong không khí vào miếng mô. - 18 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com
CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thí nghiệm thăm dò Sau khi tôm được tiêm và được theo dõi trong 2 tuần tôm chết ít, tôm bệnh biểu hiện bệnh rất rõ .Tôm kém ăn, hoạt động chậm chạp, cơ phần đuôi chuyển màu trắng đục (thường là những vệt màu trắng đục, đưa tôm ra ánh sáng mặt trời thấy rõ các vết trắng đục) sau lan dần lên phía đầu ngực, tôm bệnh nặng chuyển sang màu trắng đục Sau đó quan sát các cá thể tôm có biểu hiện bệnh đục cơ, và các cá thể đó được xét nghiệm bằng phương pháp RT-PCR. Và kết quả như sau: 6 500bp 500bp 425bp 400bp 100bp Hình 4.2: Hình RT-PCR phát hiện MrNV và XSV Giếng 1: đối chứng ( - ); Giếng 2: đối chứng ( + ); Giếng 3: mẫu 1; Giếng 4: mẫu 2; Giếng 5: mẫu 3; Giếng 6: mẫu 4 Trong 4 mẫu được kiểm tra thì cả 4 mẫu đều dương tính với 2 vi-rút MrNV và XSV. G5 (mẫu 1), G8 (mẫu 4) nhiễm XSV, G6 (mẫu 2) nhiễm MrNV và G7 mẫu 3) nhiễm cả 2 MrNV và XSV. Theo Cheng& Chen (1998a) thì bệnh đục cơ trên tôm càng xanh là do vi khuẩn gây ra và cũng giống với kết luận của Bùi Quang Tề (2003) đã từng công bố. - 19 - PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com