Mối liên quan giữa SNP72 gen P53 và SNP309 gen MDM2 với nguy cơ ung thư phổi

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> MỐI LIÊN QUAN GIỮA SNP72 GEN P53 VÀ SNP309 GEN MDM2<br /> VỚI NGUY CƠ UNG THƯ PHỔI<br /> Trần Khánh Chi, Trần Huy Thịnh<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Đa hình thái nucleotid đơn (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) tại vị trí codon 72 trên exon 4 gen<br /> p53 với sự biến đổi nucleotid G > C làm thay đổi acid amin Arg > Pro và SNP 309 T > G gen MDM2 đã được<br /> công bố có mối liên quan với ung thư phổi. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu trên Thế giới vẫn chưa được<br /> khẳng định nhất quán trên các quần thể nghiên cứu khác nhau. Đề tài được thực hiện nhằm xác định nguy<br /> cơ mắc ung thư phổi liên quan đến SNP Arg72Pro gen p53 và SNP 309 T ˃ G gen MDM2. 208 bệnh nhân<br /> được chẩn đoán xác định ung thư phổi nguyên phát tại Trung tâm Hô hấp, Trung tâm Y học Hạt nhân và<br /> Ung bướu – Bệnh viện Bạch Mai và 173 người không mắc ung thư phổi được lựa chọn nghiên cứu; tiến<br /> hành phân tích một số đặc điểm về lâm sàng và xác định SNP Arg72Pro gen p53, SNP 309 T ˃ G gen<br /> MDM2 liên quan đến nguy cơ gây ung thư phổi. Kết quả ghi nhận kiểu gen SNP309 GG của gen MDM2 làm<br /> gia tăng nguy cơ ung thư phổi 1,7 lần với OR = 1,7; 95%CI = 1,4 - 2,7 và 1,8 lần ở nam giới với OR = 1,8;<br /> 95%CI = 1,02 - 3,2 theo mô hình gen lặn; không ghi nhận được mối liên quan giữa SNP Arg72Pro gen p53<br /> với nguy cơ mắc ung thư phổi (OR = 0,79; 95%CI = 0,45 - 1,36). Kiểu gen GG của gen MDM2 làm tăng nguy<br /> cơ ung thư theo mô hình gen lặn. Chưa thấy được sự tương quan giữa SNP Arg72Pro gen p53 với nguy cơ<br /> mắc ung thư phổi.<br /> Từ khóa: SNP Arg72Pro gen p53, gen MDM2, SNP 309 T ˃ G gen MDM2, ung thư phổi<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ung thư phổi là nguyên nhân gây tử vong<br /> hàng đầu trên Thế giới và Việt Nam [1]. Bên<br /> cạnh yếu tố nguy cơ chính là hút thuốc lá, các<br /> nhà khoa học hiện nay tập trung vào nghiên<br /> cứu vai trò của kiểu gen trong việc xác định<br /> những cá thể nhạy cảm với ung thư, trong đó<br /> có ung thư phổi. Kiểu gen nhạy cảm với ung<br /> thư có thể được hình thành từ tính đa hình<br /> của các gen mã hoá tổng hợp nên các phân<br /> tử protein tham gia vào quá trình chuyển hoá<br /> các hợp chất gây ung thư, kiểm soát chu kỳ tế<br /> bào, sửa chữa các tổn thương DNA và chết<br /> theo chương trình của tế bào [2].<br /> <br /> Gen p53 là gen áp chế ung thư nằm tại vị<br /> trí p13.3 của nhiễm sắc thể (NST) số 17, mã<br /> hóa protein p53 có trọng lượng phân tử 53kDa<br /> - một protein trong nhóm điều hòa chu kỳ tế<br /> bào. Con đường tín hiệu p53 có vai trò trung<br /> tâm trong quá trình ngăn chặn sự phát sinh<br /> ung thư nhờ khả năng dừng chu kỳ tế bào và<br /> gây chết theo chương trình của tế bào<br /> (apoptosis) khi có sự tổn thương DNA không<br /> được sửa chữa hay xuất hiện sự hoạt hoá các<br /> oncogen. Đột biến gen p53 gặp khá phổ biến<br /> trong nhiều loại ung thư trong đó có ung thư<br /> phổi và được nhiều nghiên cứu trên thế giới<br /> cũng như tại Việt Nam đề cập đến [3].<br /> Gen MDM2 nằm trên nhánh dài của nhiễm<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Trần Khánh Chi, Bộ môn Hóa sinh,<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> <br /> sắc thể số 12 giữa vị trí vùng 14 băng 3 đến<br /> <br /> Email: chibish@gmail.com<br /> <br /> vùng 15. MDM2 là yếu tố điều hoà âm tính<br /> <br /> Ngày nhận: 23/12/2016<br /> <br /> trong con đường tín hiệu p53 do có thể gắn<br /> <br /> Ngày được chấp thuận: 26/2/2017<br /> <br /> trực tiếp với protein p53 và ức chế hoạt tính<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> 1<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> của chúng. Đồng thời MDM2 còn thúc đẩy quá<br /> <br /> tâm Y học hạt nhân và Ung bướu - Bệnh viện<br /> <br /> trình giáng hoá protein p53 trong tế bào thông<br /> <br /> Bạch Mai được chẩn đoán xác định bằng mô<br /> <br /> qua con đường ubiquitin hoá [4].<br /> <br /> bệnh học.<br /> <br /> Đa hình Arg72Pro trên exon 4 của gen p53<br /> <br /> - 173 mẫu máu của nhóm chứng không<br /> <br /> nằm trong vùng giàu prolin, có vai trò quan<br /> <br /> mắc các loại ung thư, tương ứng về tuổi và<br /> <br /> trọng đối với chức năng apoptosis của protein<br /> <br /> giới với nhóm bệnh.<br /> <br /> p53. Sự thay thế nucleotid G > C tại codon 72<br /> dẫn đến bộ ba CGC mã hóa cho arginin bị<br /> <br /> 2. Phương pháp<br /> <br /> thay đổi thành bộ ba CCC mã hóa cho prolin<br /> <br /> - Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu máu<br /> <br /> [5]. Biến thể Arg tăng cường quá trình apop-<br /> <br /> theo phương pháp sử dụng enzyme protease<br /> <br /> tosis và ức chế sự biến đổi của tế bào. Ngược<br /> <br /> K và phenol: chloroform: isoamyl alcohol.<br /> <br /> lại, biến thể Pro tăng cường quá trình phiên<br /> <br /> - Xác định kiểu gen SNP Arg72Pro gen<br /> <br /> mã của các gen sửa chữa DNA. Nhiều nghiên<br /> <br /> p53<br /> <br /> cứu cho thấy, đa hình Arg72Pro có tương<br /> <br /> (Restriction Fragment Length Polymorphism -<br /> <br /> bằng<br /> <br /> phương<br /> <br /> pháp<br /> <br /> RFLP<br /> <br /> -<br /> <br /> PCR<br /> <br /> quan với nguy cơ mắc và tiến triển của một số<br /> <br /> PCR).<br /> <br /> bệnh lý ung thư như ung thư vú, đại tràng,<br /> <br /> + Khuếch đại vùng gen chứa SNP<br /> <br /> phổi, gan và cổ tử cung. Bên cạnh đó, nhiều<br /> <br /> Arg72Pro của gen p53 bằng phương pháp<br /> <br /> nghiên cứu về tính đa hình thái của gen<br /> <br /> PCR, sử dụng cặp mồi đặc hiệu:<br /> <br /> MDM2 ghi nhận SNP quan trọng nhất nằm ở<br /> <br /> F: 5’ - CTG GTA AGG ACA AGG GTT GG - 3’.<br /> <br /> vị trí 309 - SNP309 (rs2279744), trong đó sự<br /> <br /> R: 5’ - ACT GAC CGT GCA AGT CAC AG - 3’.<br /> <br /> biến đổi từ nucleotid T thành nucleotid G đã<br /> được chứng minh làm tăng ái lực của sự hoạt<br /> hóa phiên mã Sp1 dẫn đến sự biểu hiện ở<br /> mức độ cao hơn mRNA và protein của MDM2<br /> gây ức chế con đường tín hiệu p53 [6 - 8]. Đa<br /> hình thái này được chỉ ra liên quan đến nhiều<br /> loại ung thư trong đó có ung thư phổi. Tuy<br /> nhiên, các kết quả nghiên cứu trên thế giới<br /> vẫn chưa được khẳng định nhất quán trên các<br /> quần thể nghiên cứu khác nhau.<br /> Đề tài được tiến hành nhằm xác định nguy<br /> cơ mắc ung thư phổi liên quan đến SNP<br /> Arg72Pro trên exon 4 gen p53 và SNP 309 T<br /> ˃ G gen MDM2.<br /> <br /> + Phân tích RFLP: đoạn gen được nghiên<br /> cứu chứa trình tự nhận biết của enzyme BstUI<br /> (CGCG) tại vị trí codon 72. Khi BstUI cắt<br /> đoạn gen sẽ tạo ra các đoạn DNA có kích<br /> thước 165 bp và 231 bp, tương ứng với kiểu<br /> allele Arg (wild type - GG). Khi base G bị thay<br /> thế bởi base C sẽ làm mất trình tự nhận biết<br /> của enzyme BstUI, do đó đoạn gen sẽ không<br /> bị cắt, tương ứng với kiểu allele Pro (mutant<br /> type - CC).<br /> - Xác định kiểu gen SNP 309 của gen<br /> MDM2 bằng phương pháp RFLP - PCR:<br /> + Khuếch đại vùng gen SNP309 của gen<br /> MDM2 bằng phương pháp PCR, sử dụng cặp<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> mồi đặc hiệu:<br /> <br /> 1. Đối tượng<br /> <br /> F: 5’ - CGCGGGAGTTCAGGGTAAAG - 3’.<br /> <br /> - 208 mẫu máu của bệnh nhân ung thư<br /> <br /> R: 5’ - CTGAGTCAACCTGCCCACTG - 3’.<br /> <br /> phổi nguyên phát tại Trung tâm Hô hấp, Trung<br /> <br /> + Phân tích RFLP: đoạn gen được nghiên<br /> <br /> 2<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> cứu chứa trình tự nhận biết của enzym<br /> <br /> CI, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, p < 0,05.<br /> <br /> MspA1i (CCG ↓ CTG) tại vị trí SNP309. Bình<br /> <br /> 3. Đạo đức trong nghiên cứu<br /> <br /> thường vị trí SNP309 của gen MDM2 là T,<br /> không chứa vị trí nhận biết của enzym<br /> <br /> Đề tài đã được thông qua Hội đồng đạo<br /> <br /> MspA1i, đoạn gen được khuếch đại không bị<br /> <br /> đức của Trường Đại học Y Hà Nội theo quyết<br /> <br /> cắt và giữ nguyên kích thước 157bp, tương<br /> <br /> định số 118/HĐĐĐ-ĐHYHN ngày 31/11/2013.<br /> <br /> ứng với kiểu allele T (wild type - TT). Khi có<br /> <br /> Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào<br /> <br /> đột biến thay thế base T bởi base G sẽ xuất<br /> <br /> nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi<br /> <br /> hiện trình tự nhận biết của enzym MspA1i, do<br /> <br /> nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia<br /> <br /> đó đoạn gen bị cắt và tạo ra các đoạn DNA có<br /> <br /> vào nghiên cứu. Các thông tin cá nhân được<br /> <br /> kích thước 48 bp và 109 bp, tương ứng với<br /> <br /> đảm bảo bí mật.<br /> <br /> kiểu allele G (mutant type - GG).<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> <br /> Xử lý số liệu: Sử dụng phần mềm SPSS<br /> 1. Đặc điểm chung của đối tượng<br /> nghiên cứu<br /> <br /> 16.0, tính toán tỷ suất chênh OR, 95%.<br /> <br /> Bảng 1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu<br /> Nhóm ung thư phổi<br /> <br /> Nhóm chứng<br /> <br /> Đặc điểm<br /> <br /> p<br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Nam<br /> <br /> 158<br /> <br /> 76<br /> <br /> 110<br /> <br /> 63,6<br /> <br /> Nữ<br /> <br /> 50<br /> <br /> 24<br /> <br /> 63<br /> <br /> 36,4<br /> <br /> Giới<br /> Tuổi (năm)<br /> <br /> 60,27 ± 9,07<br /> K biểu mô tuyến<br /> <br /> 158<br /> <br /> 75,9<br /> <br /> K biểu mô vảy<br /> <br /> 14<br /> <br /> 6,7<br /> <br /> K biểu mô tế bào nhỏ<br /> <br /> 20<br /> <br /> 9,6<br /> <br /> K biểu mô loại khác<br /> <br /> 16<br /> <br /> 7,8<br /> <br /> 61,73 ± 11,99<br /> <br /> 0,18<br /> <br /> Mô bệnh học<br /> <br /> + Tuổi trung bình của nhóm bệnh là 60,27 ± 9,07 không khác biệt với tuổi của nhóm chứng là<br /> 61,17 ± 11,99, tỷ lệ nam/nữ là 3,16/1.<br /> + Ung thư biểu mô tuyến gặp nhiều nhất chiếm 75,9%.<br /> 2. Kết quả phân tích RFLP - PCR của SNP Arg72Pro gen p53 và SNP309 T ˃ G gen<br /> MDM2<br /> 2.1. Kết quả phân tích RFLP-PCR của SNP Arg72Pro gen p53<br /> Sản phẩm cắt của đoạn gen SNP Arg72Pro bởi enzyme BstUI gồm các đoạn DNA có kích<br /> thước khác nhau, phù hợp với tính toán lý thuyết. Mẫu mang kiểu gen Arg/Arg gồm 2 băng DNA<br /> có kích thước 165 bp và 231 bp (giếng 2, 3, 8). Mẫu mang kiểu gen Pro/Pro gồm 1 băng DNA có<br /> kích thước 396 bp (giếng 1, 5, 6, 10). Mẫu mang kiểu gen dị hợp tử Arg/Pro gồm 3 băng DNA có<br /> kích thước 165bp, 231bp và 396bp (giếng 4, 7, 9, 11, 12) (hình 1).<br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> 3<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10<br /> <br /> 11<br /> <br /> 12<br /> <br /> MK<br /> <br /> 396bp<br /> <br /> 400bp<br /> <br /> 231bp<br /> 165bp<br /> <br /> 200bp<br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen p53 mang SNP Arg72Pro<br /> bằng enzym BstUI<br /> M: Thang chuẩn 100bp; Giếng 2, 3, 8: kiểu gen đồng hợp tử Arg/Arg; Giếng 1, 5, 6,10: kiểu<br /> gen đồng hợp tử Pro/Pro; Giếng 4, 7, 9, 11, 12: kiểu gen dị hợp tử Arg/Pro.<br /> 2.2. Kết quả phân tích RFLP - PCR của SNP309 T ˃ G gen MDM2<br /> M<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> 8<br /> <br /> 9<br /> <br /> 10<br /> <br /> 11<br /> <br /> 200bp<br /> <br /> 157bp<br /> 109bp<br /> <br /> 100bp<br /> <br /> 48bp<br /> <br /> Hình 2. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen MDM2 mang SNP309 T ˃ G<br /> bằng enzym MspA1i<br /> M: Thang chuẩn 100bp. Giếng 1, 5, 8: kiểu gen đồng hợp tử TT; Giếng 2 ,4 ,6, 7, 10, 11: kiểu<br /> gen đồng hợp tử GG; Giếng 3, 9: kiểu gen dị hợp tử TG.<br /> Sản phẩm cắt gen MDM2 mang SNP309 bởi enzym MspA1i gồm các đoạn DNA có kích<br /> thước khác nhau, phù hợp với tính toán lý thuyết. Mẫu mang kiểu gen đồng hợp tử T/T gồm 1<br /> băng DNA có kích thước 157bp (giếng 1, 5, 8). Mẫu mang kiểu gen đồng hợp tử G/G gồm 2 băng<br /> DNA có kích thước 109 bp và 48 bp (giếng 2 ,4 ,6, 7, 10, 11 ). Mẫu mang kiểu gen dị hợp tử T/G<br /> gồm 3 băng DNA có kích thước 157bp, 109 bp và 48 bp (giếng 3, 9).<br /> <br /> 4<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bảng 2. Tần số các kiểu gen SNP Arg72Pro gen p53 và SNP309 T ˃ G gen MDM2<br /> ở nhóm ung thư phổi và nhóm chứng<br /> Kiểu gen<br /> <br /> Ung thư phổi (n = 208)<br /> <br /> Nhóm chứng (n = 173)<br /> <br /> OR (95%CI)<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Arg/Arg (GG)<br /> <br /> 53<br /> <br /> 25,5<br /> <br /> 44<br /> <br /> 25,4<br /> <br /> 1,00 (Reference)<br /> <br /> Arg/Pro (GC)<br /> <br /> 102<br /> <br /> 49<br /> <br /> 73<br /> <br /> 42,2<br /> <br /> 1,16 (0,7 - 1,9)<br /> <br /> Pro/Pro (CC)<br /> <br /> 53<br /> <br /> 25,5<br /> <br /> 56<br /> <br /> 32,4<br /> <br /> 0,79 (0,45 - 1,36)<br /> <br /> TT<br /> <br /> 59<br /> <br /> 28,4<br /> <br /> 43<br /> <br /> 24,9<br /> <br /> 1,00 (Reference)<br /> <br /> TG<br /> <br /> 90<br /> <br /> 43,2<br /> <br /> 97<br /> <br /> 56,1<br /> <br /> 0,68 (0,42 - 1,1)<br /> <br /> GG<br /> <br /> 59<br /> <br /> 28,4<br /> <br /> 33<br /> <br /> 19<br /> <br /> 1,31 (0,73 - 2,33)<br /> <br /> TT + TG<br /> <br /> 149<br /> <br /> 71,6<br /> <br /> 140<br /> <br /> 80,9<br /> <br /> 1,00 (Reference)<br /> <br /> GG<br /> <br /> 59<br /> <br /> 28,4<br /> <br /> 33<br /> <br /> 19,1<br /> <br /> 1,7(1,04 - 2,73)<br /> <br /> SNP Arg72Pro<br /> <br /> SNP309 T ˃ G<br /> <br /> GG với TT + TG<br /> <br /> Kiểu gen dị hợp tử Arg/Pro codon 72 gen p53 và SNP 309TG đều chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả<br /> nhóm bệnh và nhóm chứng. SNP 309GG làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi 1,7 lần theo mô<br /> hình gen lặn. Chưa ghi nhận được mối liên quan có ý nghĩa giữa SNP Arg72Pro gen p53 với<br /> nguy cơ mắc ung thư phổi.<br /> Bảng 3. Tần số các kiểu gen SNP Arg72Pro gen p53 và SNP 309 T ˃ G gen MDM2<br /> theo giới tính<br /> <br /> Giới<br /> <br /> Kiểu gen<br /> <br /> Ung thư phổi<br /> (n = 208)<br /> n<br /> <br /> %<br /> <br /> Nhóm chứng<br /> (n = 173)<br /> n<br /> <br /> OR (95% CI)<br /> <br /> %<br /> <br /> SNP Arg72Pro<br /> 158<br /> <br /> Nam<br /> <br /> 110<br /> <br /> Arg/Arg (GG)<br /> <br /> 40<br /> <br /> 25,3<br /> <br /> 30<br /> <br /> 27,2<br /> <br /> 1,00 (Reference)<br /> <br /> Arg/Pro (GC)<br /> <br /> 76<br /> <br /> 48,1<br /> <br /> 45<br /> <br /> 41<br /> <br /> 1,27 (0,7 - 2,3)<br /> <br /> Pro/Pro (CC)<br /> <br /> 42<br /> <br /> 25,6<br /> <br /> 35<br /> <br /> 31,8<br /> <br /> 0,9 (0,47 - 1,73)<br /> <br /> 50<br /> <br /> 63<br /> <br /> Arg/Arg (GG)<br /> <br /> 13<br /> <br /> 14<br /> <br /> 1,00 (Reference)<br /> <br /> Arg/Pro (GC)<br /> <br /> 26<br /> <br /> 28<br /> <br /> (0,44 - 6,66)<br /> <br /> Nữ<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> 5<br /> <br />