Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu sự biến đổi thành phần gen nhân ITS-2, 28S rRNA và gen ty thể COX1 của loài sán lá gan lớn Fasciola ssp dạng thuần và dạng lai gây bệnh trên động vật tại Việt Nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -------------------

NguyÔn thÞ hoa ¸nh

NGHI£N CøU BIÕN §æi thµnh phÇn gen nh©n its-2, 28s

rrna vµ gen ty thÓ cox1 cña loµi s¸n l¸ gan lín

fasciola ssp d¹ng thuÇn vµ d¹ng lai g©y bÖnh

trªn ®éng vËt t¹i viÖt nam

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-------------------

NGUYỄN THỊ HOA ÁNH

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02 01

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ BÍCH NGA

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI THÀNH PHẦN GEN NHÂN ITS-2, 28S rRNA VÀ GEN TY THỂ COX1 CỦA LOÀI SÁN LÁ GAN LỚN FASCIOLA SSP DẠNG THUẦN VÀ DẠNG LAI GÂY BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT TẠI VIỆT NAM

THÁI NGUYÊN - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi trực tiếp thực hiện và một số

kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu trình bày trong luận văn

là hoàn toàn trung thực và chính xác.

Ngày…… tháng ….. năm 201…

Học viên

Nguyễn Thị Hoa Ánh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến:

- TS. Nguyễn Thị Bích Nga là người đã trực tiếp hướng dẫn, tạo mọi điều kiện

thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành luận văn.

- Cảm ơn các cán bộ của Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học nơi

tôi thực tập đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn của mình.

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến:

- Ban Giám đốc Đại học Thái Nguyên, Ban Giám hiệu Trường Đại học

Khoa học, Phòng Đào tạo và Quan hệ Quốc tế, Khoa Khoa học sự sống - Trường

Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên

- Sự tài trợ kinh phí của Quỹ phát triển Khoa học và công nghệ quốc gia

(Nafosted) cho đề tài mã số 106-YS.02-2013.06 do TS Nguyễn Thị Bích Nga làm

chủ nhiệm.

- Cuối cùng tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến những người thân

đã luôn khuyến khích,động viên cũng như chia sẻ những khó khăn với tôi trong

suốt quá trình học tập và hoàn thành nghiên cứu của mình.

Học viên

Nguyễn Thị Hoa Ánh

iii

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii

MỤC LỤC ............................................................................................................ iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................... v

DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................. vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................. vii

MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3

1.1. Giới thiệu về loài sán lá gan lớn..................................................................... 3

1.1.1.Vị trí phân loại sán lá gan lớn trong hệ thống phân loại động vật ............... 3

1.1.2.Đặc điểm hình thái học của sán lá gan lớn Fasciola sp................................ 3

1.1.3.Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của sán lá. ................................................ 5

1.1.4.Trứng sán lá gan lớn ..................................................................................... 8

1.1.5.Sán trưởng thành .......................................................................................... 9

1.2. Đặc điểm của bệnh do sán lá gan lớn ............................................................ 10

1.2.1.Cơ chế sinh bệnh ........................................................................................ 10

1.2.2. Đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá Fasciola ở trâu, bò ở Việt Nam .................. 12

1.3. Tầm quan trọng của nghiên cứu giám định loài bằng phương pháp sinh học

phân tử giải trình tự ............................................................................................. 17

1.3.1. Giới thiệu sơ bộ hệ gen nhân ribosomal DNA (rDNA) ............................ 18

1.3.2. Hệ gen DNA ty thể .................................................................................... 19

CHƯƠNG 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 22

2.1. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 22

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. ............................................................... 22

2.3. Dụng cụ và thiết bị và hóa chất .................................................................... 22

2.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị ............................................................................... 22

2.3.2. Hóa chất ..................................................................................................... 22

2.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 23

2.4.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu Fasciola sp ................................ 24

2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ....................................................... 24

2.4.3. Thiết kế mồi, thực hiện PCR gen ITS2, 28S và gen cox1 ........................ 25

2.4.4. Phương pháp giải trình tự .......................................................................... 27

2.4.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu .................................................... 28

CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ............................... 30

3.1. Thu nhận gen ITS-2 trong chẩn đoán phân biệt ........................................... 30

3.1.1. Thu thập mẫu sán lá gan lớn và phân loại hình thái ................................. 30

3.1.2. Sử dụng gen ITS-2 trong chẩn đoán phân biệt .......................................... 30

3.2. Kết quả thu nhận gen 28s và xây dựng cây phả hệ ...................................... 35

3.3. Kết quả thu nhận chuỗi gen ty thể COX1 .................................................... 39

3.3.1. Kết quả giải trình tự gen cox1 của Fasciola sp Việt Nam và so sánh với

các loài thuộc lớp sán lá Trematoda .................................................................... 41

3.3.2. Xây dựng mối quan hệ phả hệ giữa các loài thuộc lớp sán lá ................... 47

KẾT LUẬN ......................................................................................................... 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 54

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleotide

AST Abnormal Spermatogenic Type

NST Normal Spermatogenic Type

Cox1 cytochrome oxidase subunit 1

ITS-2 Second internal transcribed spacer

Rdna Ribosome DNA

SLGL Sán lá gan lớn

PCR Polymerase chain reaction

ddNTP dideoxyrinonucleotide triphosphate

dNTP deoxyrinonucleotide triphosphate

bp Cặp bazơ (base pair)

TAE Tris base-Acetic-EDTA

PAGE Điện di gel polyacylamid

EtBr Ethidium Bromide

EDTA Ethylene Diamine Tetraacemic Acid

OD Mật độ quang học

Kb Kilobase

Kda Kilodalton

µl Microlitre

µm Micrometer

mm Millimeter

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1. Danh sách các mồ i dù ng trong phản ứ ng PCR thu nhận gen ITS-2, 28S

và COX1. ............................................................................................................. 25

Bảng 3.1. So sánh các nucleotide ở các vị trí biến đổi của vùng giao gen ITS-2

của các mẫu sán lá gan lớn ở các vùng địa lý và vật chủ khác nhau .................. 33

Bảng 3.2. Các mẫu cung cấp chuỗi gen 28S trong nghiên cứu .......................... 36

Bảng 3.3. Các mẫu sán lá Trematoda trong Ngân hàng gen cung cấp chuỗi cox1

sử dụng so sánh đối chiếu trong nghiên cứu ....................................................... 40

Bảng 3.4. Tỷ lệ tương đồng trình tự amino acid gen cox1 của các loài sán lá thuộc

lớp Trematoda ..................................................................................................... 46

vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Hình ảnh mô tả hình thái của sán lá gan lớn Fasciola sp ..................... 4

Hình 1.2. Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của SLGL Fasciola sp ký sinh vật chủ

ở động vật và người ............................................................................................... 5

Hình 1.3. Hình ảnh của trứng sán lá gan lớn Fasciola sp phóng đại 400 lần dưới

kính hiển vi điện tử. ............................................................................................... 8

Hình 1.4. Hình thể sán lá gan lớn Fasciola sp trưởng thành ................................ 9

Hình 1.5. Mô hình cấu trúc ribosome DNA của gen nhân và vùng gen cần nghiên

cứu 18

Hình 1.6. Mô hình cấu trúc DNA của hệ gen ty thể. .......................................... 20

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu giải mã hệ gen ty thể Fasciola sp. .......... 23

Hình 3.1. Hình ảnh sán lá gan lớn FspNB-VN và FspCB-VN trong nghiên cứu ........... 30

Hình 3.2. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của vùng gen ITS-2. ........................ 31

Hình 3.3. So sánh trình tự chuỗi nucleotide ITS-2của 16 mẫu Fasciola sp.. ...... 32

Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR gen 28S với cặp mồi U28SF – U28SR. ......... 35

Hình 3.5. Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa mẫu Fasciola sp xác trên lập dựa trên

thành phần nucleotide gen 28S ribosome bằng chương trình MEGA6.06 . ............. 38

Hình 3.6. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của gen cox1 với cặp mồiFSP12F –

FGHR2. ............................................................................................................... 40

Hình 3.7. Trình tự amino acid suy diễn của FspNB-VN và FspCB-VN so sánh với

các chuỗi gen cox1 thuộc lớp sán lá Trematoda...........................................44

Hình 3.8. Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ về loài giữa các mẫu sán lá dựa trên

thành phần amino acid của gen cox1 bằng chương trình MEGA6.. ................... 48

MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Bệnh sán lá gan lớn (fascioliasis) do hai loài Fasciola hepatica và Fasciola

gigantica thuộc họ Fasciolidaekí sinh trên động vật nhai lại (trâu, bò, dê, cừu…)

và đang dần thích ứng gây bệnh trên người.

Trước đây, các đặc tính hình thái học (morphology), sinh thái học (ecology)

và huyết thanh học (serology) thường sử dụng trong chẩn đoán cũng đã đáp ứng

được phần lớn yêu cầu về phân loại sinh vật trong đó có ngành ký sinh trùng

[5],[18].

Tuy nhiên nếu phân loại sán lá gan chỉ dựa vào hình thái thì rất khó phân

định. Đặc biệt đã có hiện tượng lai và dạng trung gian (hybrid form) trong quần thể

sán lá gan đã được phát hiện, đó là hệ gen có sự trộn lẫn của F. hepatica và F.

gigantica (Fh/Fg), trong đó hệ gen nhân tế bào mang gen từ dòng bố (F. hepatica)

và hệ gen ty thể (F. gigantica) mang tính di truyền theo dòng mẹ [7].

Bệnh sán lá gan lớn hiện nay được coi là bệnh ký sinh trùng mới nổi bị

lãng quên (neglected emerging infectious disease) và đang được tổ chức y tế thế

giới (WHO) quan tâm.

Sán lá gan lớn gây bệnh ở người, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng, do

chúng gây ra các tổn thương bệnh lý ở hệ thống gan mật, gây can xi hóa đường

mật, ký sinh lạc chỗ hoặc di chuyển lạc lên não… gây tổn thương nặng ở nhu mô

gan làm suy gan dẫn đến tử vong [4], [7], [17]. Một số trường hợpdo bệnh sán lá

gan lớn ở người gây phản ứng viêm, xơ hóa gan, dẫn đến chẩn đoán bị nhầm là

bệnh ung thư gan [2], [5].

Đối với động vật ăn cỏ (trâu, bò, dê, cừu…) khi nhiễm sán lá gan lớn làm

giảm trọng lượng của con vật, ốm yếu, thiếu máu bệnh lý, con vật không sinh sản,

gây thiệt hại lớn về kinh tế [11].

Vì vậy việc phát hiện sớm và xác định chính xác loài Fasciola gây bệnh là

rất cần thiết, có ý nghĩa thực tiễn trong chẩn đoán và điều trị. Chẩn đoán, giám định

và phân biệt loài Fasciola được thực hiện bằng các phương pháp sinh học phân tử

dựa trên các chỉ thị gen nhân và ty thể.

Xuất phát từ yêu cầu đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự

biến đổi thành phần gen nhân ITS-2, 28S rRNA và gen ty thể COX1 của loài sán lá

gan lớn Fasciola sp dạng thuần và dạng lai gây bệnh trên động vật tại Việt Nam”.

Mục tiêu của đề tài

- Giải trình tự và phân tích gen nhân ITS-2, gen 28S của sán lá gan lớn dạng

thuần và xác định dạng laigây bệnh trên động vậttại Việt Nam.

- Giải mã gen COX1 của hệ gen ty thể F. hepatica và F. gigantica dạng thuần

và dạng lai, phân tích đặc điểm di truyền.

- Xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự của gen ITS-2, 28S rRNA và COX1

trong phân loại.

Nội dung nghiên cứu

- Thu nhận và sàng lọc các mẫu của Fasciola sp, giám định bằng hình thái

học nhận dạng dòng lai dựa vào vùng gen của hệ gen nhân ITS-2 để phân biệt

Fasciolagigantica và Fasciola dạng lai (hybrid), so sánh phân tích dữ liệu trình

tự của gen ITS-2 và gen 28S, xây dựng cây phả hệ.

- Thu nhận gen ty thể COX1 của gen ty thể, phân tích trình tự

nucleotide/amino acid, xem xét mối quan hệ tiến hóa di truyền phả hệ.

- Phân tích biến đổi di truyền và dịch tễ học phân tử: xác định khác biệt của

trình tự hệ gen nhân vùng ITS-2, 28S và COX1 của F. hepatica và F. gigantica

(thuần và lai).

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Góp phần cung cấp trình tự các chuỗi gen ITS-2, 28S và cox1 của sán lá

gan lớn Fasciola sp ở Việt Nam.

- Ngoài ra các kết quả chính xác của sinh học phân tử cho phép ứng dụng

những hướng mới và rất có thể sẽ làm thay đổi một phần hệ thống phân loại về ký

sinh trùng trong nghiên cứu dịch tễ học phân tử và phân loại loài.

- Sử dụng các số liệu của hệ gen ty thể để ứng dụng phát triển các phương

pháp chẩn đoán phân tử trong phòng và điều trị bệnh sán lá gan lớn ở người và

động vật tại Việt Nam.

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về loài sán lá gan lớn

1.1.1. Vị trí phân loại sán lá gan lớn trong hệ thống phân loại động vật

Theo Skarjabin cs. (1997) [67], sán lá gan lớn kí sinh và gây bệnh cho trâu

bò được xếp trong hệ thống phân loại động vật như sau:

Ngành: Plathelminthes (Schneider, 1873)

Phân ngành: Platodes (Leuckart, 1854)

Lớp: Trematoda (Rudolphi, 1808)

Phân lớp: Prosostomadidea (Skrjabin và Guschanskaja, 1926)

Bộ: Fasciolida (Skrjabin et Schulz, 1937)

Phân bộ : Fasciolata (Skrjabn et Schulz, 1937)

Họ : Fasciotidae (Railliet, 1985)

Phân họ : Fasciolinae (Stiles et Hasall, 1898)

Giống : Fasciola (Linnaeus, 1758)

Loài : Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758)

Loài : Fasciola gigantica (Cobbold, 1888).

1.1.2. Đặc điểm hình thái học của sán lá gan lớn Fasciola sp

Cũng như nhiều loài sán lá khác, sán lá gan lớn thuộc dạng sinh sản lưỡng

tính có thể thụ tinh chéo hoặc tự thụ tinh. Sán lá có giác miệng và giác bụng, giác

bụng không nối với cơ quan tiêu hóa. Sán lá không có hệ hô hấp, tuần hoàn và cơ

quan thị giác, ở giai đoạn mao ấu có dấu vết sắc tố mắt. Hệ sinh dục rất phát triển

với cả hệ sinh dục đực và cái trong cùng một cơ thể, tử cung sán lá chứa đầy trứng

(Hình 1.1).

Có thể phân biệt 2 loài sán lá gan thuộc giống Fasciola như sau:

- Loài F.gigantica (Cobbold, 1885): Có chiều dài gấp 3 lần chiều rộng, vai

không có hoặc không nhìn rõ rệt, nhánh ruột chia tỏa ra nhiều nhánh ngang.

F.gigantica (có nghĩa là sán khổng lồ), có kích thước chiều dài 25 – 75mm, chiều

rộng 3 – 12mm, u lồi hình nón của đầu là phần tiếp theo của thân, vì vậy nó không

có vai như loài khác của giống Fasciola, hai rìa bên thân sán lá song song với

nhau, đầu cuối của thân tù. Giác bụng tròn lồi ra. Ruột, tuyến noãn hoàng, buồng

trứng và tinh trùng đều phân nhánh. Trứng hình bầu dục, màu vàng nâu, phôi bào

to đều và xếp kín vỏ. Kích thước trứng 0,125 – 0,170 × 0,06 – 0,10mm (Hình

1.1A).

Hình 1.1. Hình ảnh mô tả hình thái của sán lá gan lớn Fasciola sp

A. Fasciola gigantica ; B : Fasciola hepatica [71]

- Loài F. hepatica (Linnaeus, 1758): loài này thân rộng, đầu lồi và nhô ra

phía trước làm cho sán có vai, nhánh ruột chia ít nhánh ngang hơn. F. hepatica

(nghĩa là sán ở gan) dài 18 – 51mm, rộng 4 - 13mm, phần trước thân nhô ra tạo

cho sán có vai bè ra hai bên. Hai rìa thân sán không song song với nhau mà phình

ra ở chỗ vai rồi thót lại ở đoạn cuối thân. Những ống dẫn tuyến noãn hoàng chạy

ngang, chia vùng giữa của sán lá thành phần trước và phần sau của thân. Phần sau

thân có tinh hoàn và bộ phận sinh dục đực. Tinh hoàn phân nhiều nhánh xếp chỗ

sau thân. Tử cung ở phần giữa thân trước tạo nên một mạng lưới rối như tơ vò.

Buồng trứng phân nhánh nằm ở sau tử cung. Trứng của sán lá

F. hepatica có màu sắc, hình thái tương tự như trứng của loài F.gigantica, kích

thước 0,13 – 0, 145 × 0,07 – 0,09mm (Hình 1.1B).

1.1.3. Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của sán lá.

Chu kỳ sinh học của sán lá Fasciola đã được Leukart (1882) nghiên cứu ở

Đức và Thomas (1882) nghiên cứu ở Anh. Chu kỳ sinh trưởng và phát triển (vòng

đời) của SLGL Fasciola sp được trình bày ở Hình 1.2.

Hình 1.2. Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của SLGL Fasciola sp ký sinh vật chủ ở động vật và người [71]

Quá trình Fasciola sp trưởng thành sinh sống trong ống dẫn mật của trâu,

bò, dê. Sau khi thụ tinh mỗi sán lá đẻ hàng chục vạn trứng. Những trứng này cùng

dịch mật vào ruột, sau đó theo phân ra ngoài. Nếu gặp được điều kiện thuận lợi

như nước mưa cuốn trôi xuống các vũng nước, ao, hồ, ruộng nước ở nhiệt độ 15 – 300C, pH = 5 - 7,7, có điều kiện ánh sáng thích hợp thì sau 10 – 25 ngày trứng nở

thành miracidium bơi tự do trong nước. Nếu thiếu ánh sáng miracidium không có

khả năng thoát vỏ nhưng vẫn có thể tồn tại 8 tháng trong vỏ. Miracidium có hình

tam giác, xung quanh thân có lông và có thể di chuyển được trong nước. Khi gặp

vật chủ trung gian thích hợp (ốc Lymnaea sp). Miracidium xâm nhập vào tế bào ốc

và phát triển thành bào ấu (Sporocyst). Những miracidium không gặp vật chủ trung

gian thì sẽ rụng lông, rữa dần và chết.

Bào ấu (Sporocyst) hình túi, màu sán lá được bao bọc bởi lớp màng mỏng,

các tế bào ngọn lửa hoạt động thành hình hầu, ống ruột và các đám phôi. Trong 1

ốc có thể có 1 - 2 ấu trùng. Khoảng 3 – 7 ngày, bào ấu sinh sản vô tính cho ra

nhiều redia (lôi ấu). Một bào ấu sinh ra 5 – 15 lôi ấu.

Redia hình suốt chỉ, ít hoạt động, có miệng, hầu, ruột, hình túi đơn giản. Có

2 hệ: Redia thế hệ I và redia thế hệ II cùng phát triển trong ốc – vật chủ trung gian. Ở nhiệt độ 160C hoặc thấp hơn, lôi ấu chỉ sinh sản Redia I và dừng phát triển, ở nhiệt độ thích hợp (20 – 300C), sau 29 – 35 ngày, lôi ấu biến thành vĩ ấu (cercaria).

Một redia có thể sinh ra 12 – 20 cercaria.

Cercaria (vĩ ấu) là ấu trùng sống ở pha sống tự do của sán lá gan, có cấu tạo

thân hình tròn lệch, đuôi dài hơn thân giúp vĩ ấu di chuyển dễ dàng trong nước.

Cấu tạo của vĩ ấu gồm giác miệng, giác bụng, hầu, thực quản và ruột phân thành

2 nhánh.

Theo Giniecisz – Kaija (1960), trong cơ thể cercaria có những dạng

glycogen cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của ấu trùng, đặc biệt là cho

sự vận động không ngừng của đuôi. Đuôi là cơ quan vận động của vĩ ấu. Theo

một số tác giả đuôi làm nhiệm vụ thay đổi vị trí của ấu trùng tronh môi trường

nước. Nhờ sự hoạt động tích cực của đuôi mà vĩ ấu tiếp cận để bám vào các cây

thủy sinh, tạo thành kén (Adolescaria).

Từ khi miracidium chui vào ốc đến khi phát triển thành cercaria cần khoảng

thời gian 50 – 80 ngày. Sau khi phát triển thành thục, cercaria thoát khỏi vỏ ốc, ra

môi trường bên ngoài, bơi tự do trong nước, có kích thước 0,28 mm– 0,30 mm

chiều dài và 0,23 mm chiều rộng. Sau vài giờ bơi trong nước, cercaria rụng đuôi

tiết chất nhầy xung quanh thân nếu gặp không khí khô rất nhanh, lúc này cercaria

đã biến thành adolesscaria.

Adolescaria hình khối tròn, bên trong chứa phôi hoạt động, phôi có giác

miệng, giác bụng, ruột phân nhánh và túi bài tiết, adolescaria thường ở trong nước

hoặc bám vào cây cỏ thủy sinh. Nếu trâu, bò, nuốt phải adolescaria vào đến dạ

dày và ruột, lớp vỏ ngoài được phân hủy, ấu trùng được giải phóng và di chuyển

đến ống mật bằng 3 con đường.

- Một số ấu trùng dùng tuyến xuyên qua niêm mạc ruột, vào tĩnh mạch ruột,

qua tĩnh mạch vào gan, xuyên qua nhu mô vào ống mật.

- Một số ấu trùng khác cũng dùng tuyến xuyên chui qua thành ruột vào

xoang bụng đến gan, xuyên qua vỏ gan vào ống mật.

- Một số ấu trùng từ tá tràng, ngược dòng dịch mật để lên ống dẫn mật.

Sau khi vào ống dẫn mật, ấu trùng kí sinh ở đó và phát triển thành sán lá

gan trưởng thành. Theo Skerman (1966), thời gian hoàn thành vòng đời là 9 – 117

ngày. Fasciola trưởng thành có thể kí sinh trong ống dẫn mật của trâu bò 3 – 5 năm,

có khi tới 11 năm.

Theo Phan Địch Lân [13], tác giả sách Bệnh ngã nước trâu bò, NXB Nông

nghiệp Hà Nội cho biết, khoa học thú y nước ta đã nghiên cứu thành công vòng đời của sán lá gan trong điều kiện nhiệt độ thích hợp (28-300C) có ốc vật chủ trung

gian là Lymnae swinhoei và Lymnae viridis, vật chủ cuối cùng (trâu, bò, dê, cừu)

thì vòng đời sán lá gan ở nước ta được xác định với các mức thời gian sau:

- Ở ngoài thiên nhiên:trứng sán lá gan phát triển thành mao ấu (Miracidium)

trong khoảng 14 -16 ngày.

- Ở trong ốc vật chủ trung gian: mao ấu (Miracidum) phát triển thành lôi ấu

(Redia) cần 8 – 21 ngày. Lôi ấu (Redia) phát triển thành vĩ ấu (cercaria) non cần

7 – 14 ngày, thành vĩ ấu trưởng thành 13 – 14 ngày.

- Ở ngoài ốc vật chủ trung gian: vĩ ấu phát triển thành kén (Adolescaria)

sau 2 giờ.

- Ở trâu, bò: Khi trâu, bò, bê nghé nuốt phải adolescaria, sau 79 – 88 ngày

trong ống dẫn mật của trâu bò đã có sẵn sán lá gan trưởng thành đẻ trứng theo

phân ra ngoài.

Điều kiện nhiệt độ và độ ẩm của nước ta rất thuận lợi cho sự nhiễm và gây

bệnh sán lá gan (kế cả gây nhiễm và nhiễm tự nhiên). Ở những vùng có mầm bệnh

tồn tại, trung bình 3 tháng sán lá gan lại hoàn thành vòng đời trong cơ thể trâu,

bò, nghĩa là trâu cứ trong vòng 3 tháng lại sản sinh ra một đời sán lá gan mới, gây

tình trạng bội nhiễm sán lá gan, vì vậy cường độ nhiễm tăng lên theo tuổi thọ trâu,

bò.

1.1.4. Trứng sán lá gan lớn

Hình thái: trứng SLGL có kích thước lớn nhất trong các loài sán lá, trứng

có màu vàng, hình elip đối xứng qua trục dọc, vỏ có nắp ở một đầu (Hình 1.3).

Kích thước: trứng sán lá gan có kích thước trung bình (140-172,3 × 80-

89,6) µm, dao động (130-150 x 60-90) μm có khi tới 152-198 x 72-94 μm

[Tomimura, Nishitani., 1976]. Trứng SLGL có phổ dao động kích thước rộng là

do chúng tồn tại dưới 2 thể: nhị bội (diploid form) và tam bội (triloid form).

Sức đề kháng của trứng: Trứng sán lá gan được thải theo phân động vật

mắc bệnh ra ngoài môi trường ngoại cảnh. Trứng rất nhảy cảm với môi trường

khô hạn và tác động trực tiếp của ánh sáng mặt trời. Ở trong phân khô, phôi ngừng

phát triển và trứng sẽ chết sau 8 – 9 ngày.

Hình 1.3. Hình ảnh của trứng sán lá gan lớn Fasciola sp phóng đại 400 lần dưới

kính hiển vi điện tử [71].

Trong điều kiện khô hạn, vỏ trứng bị nhăn nheo, biến đổi hình dạng,

miracidium bị chết trong vỏ trứng sau 1 – 1,5 ngày. Ở môi trường ẩm ướt, trứng

có khả năng sống rất lâu (trong phân hơi ẩm chúng tồn tại đến 8 tháng). Dưới ánh

nắng chiếu trực tiếp, trứng chết nhanh. Phôi bị chết sau 2 ngày ở nhiệt độ thấp (-

50C → -150C). Nhiệt độ 10 - 200C trứng ngừng phát triển. Nhiệt độ 40 – 500C,

phôi chết sau vài phút [8].

1.1.5. Sán trưởng thành

Sán lá gan lớn Fasciola sp trưởng thành có dạng giống hình chiếc lá, thân

dẹt và bờ mỏng, kích thước 20-30 x10-12 mm, màu trắng hồng hoặc xám đỏ, giác

miệng (oral sucker) nhỏ, kích thước 1 mm, giác bụng (ventral suckers) to hơn,

kích thước 1,6 mm. Cơ thể sán được bao phủ bởi một lớp cutile mỏng và có nhiều

chóp nhỏ. Chúng thường “bám dính” với nhiều cơ quan khác của vật chủ thông

qua các giác hút (một giác hút ở phía trước gọi là giác miệng và một cái còn lại ở

giữa gọi là giác bụng). Miệng thường nằm ngay ở giác miệng và nối với manh

tràng, chia hai nhánh và mỗi nhánh mở rộng về một phía của cơ thể. Đặc điểm

chính của sán lá gan lớn là sự có mặt của các tế bào hình ngọn lửa trong hệ bài

tiết của sán (Hình 1.4).

Sán lá gan lớn sinh sản lưỡng tính, bộ phận sinh dục có lỗ nằm gần giác

bụng. Cũng như nhiều loài sán lá khác, sán lá gan lớn lưỡng tính, có thể thụ tinh

chéo hoặc tự thụ tinh, trong cơ thể sán có cả cơ quan sinh dục đực và cái. Hệ thống

sinh dục rất phát triển, tử cung sán chứa đầy trứng. Sán có giác bụng và giác

miệng, giác miệng đóng kín và không nối với cơ quan tiêu hóa. Sán không có hệ

thống tuần hoàn, hô hấp và cơ quan thị giác, hệ bài tiết ở cuối thân.

Hình 1.4. Hình thể sán lá gan lớn Fasciola sp trưởng thành [70]

Cơ quan sinh dục đực bao gồm một hay nhiều tinh hoàn kết nối với một

ống đơn thuần hoặc một ống dẫn tinh lớn, nhờ vào một ống ngắn hoặc ống dẫn

tinh. Ống dẫn tinh sẽ kết thúc bằng một cơ quan sinh dục đực. Cơ quan sinh dục

cái bao gồm một buồng trứng duy nhất kết nối với ống dẫn trứng. Ống dẫn trứng

nối với vài ống hoặc ống noãn hoàng. Ống dẫn trứng nối tiếp với ootype rồi được

bao quanh bởi một khối tuyến ngoại tiết (tuyến Mehlis). Tử cung nằm ở cuối của

ootype. Sự tự thụ tinh hiếm khi xảy ra trong các loài sán lá.

SLGL có cả những loại sinh tinh bất thường (abnormal spermatogenic type

(AST) bao gồm nhiễm sắc thể nhị bội (diploid form), tam bội (triloid form) và đa

bội mà không thụ tinh và loại sinh tinh bình thường (normal spermatogenic type

(NST) của Fasciola sp được tìm thấy ở một số quốc gia châu Á như Trung Quốc,

Đài Loan, Ấn Độ, Nepal, Philippines, Thái Lan và Việt Nam. AST xảy ra đặc biệt

ở Nhật Bản và Hàn Quốc. Tại vùng Đông Nam Á, loài sán có loại AST cùng khu

vực phân bố với NST của F. hepatica và NST của F. gigantica. Tương tự, tại châu

Phi, chủ yếu gặp chủng F. gigantica. Ngược lại, ở châu Âu, phần Nam và Bắc

Mỹ, châu Đại Dương là các địa danh phân bố chủ yếu của loài sán lá gan lớn F.

hepatica.

1.2. Đặc điểm của bệnh do sán lá gan lớn

1.2.1. Cơ chế sinh bệnh

Theo các nhà ký sinh trùng học, sán lá gan gây bệnh ở vật chủ bằng tác

động của độc tố, sự chiếm đoạt dinh dưỡng và tác động mang trùng. Khi trâu bò

mới nhiễm bệnh, sán lá non di chuyển trong cơ thể làm tổn thương ở ruột, thành

mạch máu, nhu mô gan. Một số ấu trùng có thể di chuyển “lạc chỗ” đến phổi,

lách, cơ hoành, tuyến tụy…gây tổn thương hoặc xuất huyết nặng hoặc nhẹ. Sán lá

non xuyên qua các nhu mô gan làm các tổ chức gan bị phá hoại tạo ra các đường

di hành đầy máu và mảnh tổ chức gan bị phá hủy. Gan bị viêm từ nhẹ đến nặng

tùy theo số lượng ấu trùng nhiễm vào cơ thể. Trâu bò có thể thiếu máu do xuất

huyết, có thể chết do mất máu.

Tác động ảnh hưởng của sán lá còn tiếp tục khi sán lá đã đi vào ống dẫn

mật, tiếp tục tăng lên về kích thước và phát triển thành sán lá trưởng thành xuyên

qua kích thích niêm mạc ống mật bằng các gai cutin trên cơ thể gây viêm ống mật.

Số lượng sán lá nhiều có thể làm tắc ống mật, mật ứ không xuống ruột được sẽ

tràn vào máu gây hiện tượng hoàng đản.

Trong quá trình ký sinh sán lá thường xuyên tiết độc tố. Độc tố tác động

vào thành ống mật và mô gan, gây biến đổi đại thể và vi thể làm tăng quá trình

viêm. Đồng thời độc tố của sán lá còn hấp thu vào máu gây hiện tượng trúng độc

toàn thân, gây hủy hoại máu, làm biến chất protein trong máu, làm Albumin giảm,

Globumin tăng. Độc tố của sán lá còn làm tăng nhiệt độ cơ thể, tăng bạch cầu (đặc

biệt là bạch cầu ái toan) và tác động vào thần kinh, làm cho con vật có triệu chứng

thần kinh (run rẩy, siêu vẹo…). Độc tố của sán lá gan tác động vào thành mạch

máu, làm tăng tính thẩm thấu của thành mạch, gây hiện tượng thủy thũng, làm

cho máu đặc lại. Cũng do tác động của độc tố nên giữa các tiểu thùy gan có hiện

tượng thẫm nhiễm huyết thanh và tế bào, hình thành nên các mô liên kết mới dọc

theo các vách ngăn của tiểu thùy gan và quanh ống mật, vì vậy các ống mật này

cũng dày lên. Quá trình viêm kéo dài làm cho các tế bào yêu cầu tăng sinh, thay

thế những tế bào nhu mô gan, gây hiện tượng sơ gan và teo gan.Khi trâu bò nhiễm

sán lá gan nặng, hiện tượng sơ gan chiếm diện tích lớn của gan, làm cho chức

năng gan bị phá hủy. Từ đó dẫn đến hàng loạt các rối loạn khác như: rối loạn cơ

năng dạ dày – ruột, thiếu máu, suy nhược, gầy dần, cổ chướng, xoang phúc mạc

tích nước.

Một tác động quan trọng của Fasciola khi ký sinh ở vật chủ là chiếm đoạt

dinh dưỡng. Dinh dưỡng của sán lá gan là máu trâu, bò mà nó ký sinh. Bằng

phương pháp phóng xạ, người ta đã thấy mỗi sán lá ký sinh ở ống dẫn mật lấy

0,2ml máu mỗi ngày. Như vậy nếu trâu bò nhiễm ít sán là thì vai trò chiếm đoạt

dinh dưỡng không rõ, Nhưng nếu trâu bò có hàng trăm, hàng nghìn sán lá ký sinh

thì lượng máu mất đi rất nhiều.

Ngoài các tác động gây bệnh trên, trong khi di hành, sán lá non còn mang

theo các loại vi trùng từ bên ngoài vào máu, gan và những cơ quan khác, gây

những bọc mủ hoặc gây bệnh truyền nhiễm ghép với bệnh sán lá gan.

Tất cả những tác động kể trên của sán lá gan lớn làm cho sức đề kháng của

trâu, bò giảm sút nghiêm trọng dễ mắc các bệnh khác hoặc làm cho các bệnh trong

cơ thể trâu, bò nặng thêm lên.

Daves (1958) nhận xét rằng, gia súc bị suy nhược và thiếu máu là do độc

tố của F.gigatica, độc tố của sán lá còn tác động gây hiện tượng protein trong

huyết thanh biến chất lượng Albumin giảm và Globumin tăng. Davtjan (1962) đã

chứng minh, quá trình dị ứng của cơ thể trâu bò và kết quả tác động của các kháng

nguyên sinh ra từ sán lá với kháng thể xuất hiện trong tổ chức gan, và các chất

sinh ra từ các tổ chức khác bị hủy hoại. Quá trình dị ứng dẫn đến những rối loạn

đầu tiên, biểu hiện bằng hiện tượng suy dinh dưỡng, thiếu vitamin A, bằng sự tăng

quá nhiều bạch cầu ái toan trong cơ thể.

Sán lá gan thường gây tổn thương gan và có thể gây nên những biến chứng

nặng nề ở vật chủ. Trâu bò được xem là vật chủ chính của sán lá gan lớn và người

là vật chủ tình cờ do ăn phải rau sống hoặc uống nước bị nhiễm ấu trùng sán lá

gan lớn [68].

1.2.2. Đặc điểm dịch tễ bệnh sán lá Fasciola ở trâu, bò tại Việt Nam

Tại Việt Nam bệnh phát hiện ở khắp các tỉnh trên cả nước. Houmeder

(1938) đã điều tra và thấy, trâu, bò ở miền Bắc Việt Nam đều nhiễm sán lá

F.gigantica với tỷ lệ là 64,7% ở trâu, 23.5% ở bò và đặc biệt có 2% nhiễm sán lá

gan ở người.

Ở trâu trưởng thành mắc bệnh sán lá gan do F.gigantica với tỷ lệ nhiễm

50% - 70%. Theo Phan Địch Lân (1980), mổ khám 1043 trâu ở Thái Nguyên, số

trâu nhiễm sán là 57%, trong đó có nhiều gan phải hủy bởi do số lượng sán lá quá

nhiều. Kết quả điều tra ở huyện Bình Lục – Hà Nam, tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở trâu

là 51,2 – 57,5% [21].

Theo tác giả Đoàn Văn Phúc đã kiểm tra 64 bò tại trại bò sữa Hà Nội, thấy

tỷ lệ nhiễm sán lá Fasciola là 73,43%. Tác giả còn cho biết, bệnh sán lá gan đã

ảnh hưởng rõ rệt đến sức khỏe và sản lượng sữa của đàn bò [14]. Tỷ lệ trâu bò

khu vực Hà Nội nhiễm sán lá gan tỷ lệ 53,41% [15].

Kết quả kiểm tra trâu, bò ở một số địa phương xung quanh Hà Nội, Bắc

Giang, Thái Nguyên, Hòa Bình, tỷ lệ nhiễm sán lá gan là 44,53%. Trong đó, trâu

nhiễm 33,92%, bò nhiễm 54,21% [22].

Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá gan ở gia súc nhai lại phụ thuộc vào các

yếu tố sau:

- Yếu tố thời tiết, khí hậu và mùa vụ

Thời tiết khí hậu của một vùng, một khu vực có liên quan trực tiếp đến sự

tồn tại của ốc – vật chủ trung gian của sán lá gan. Điều kiện ẩm ướt, mưa nhiều

tạo ra môi trước nước, giúp ốc nước ngọt sống và sinh sản thuận lợi.

Trâu bò bị nhiễm sán lá gan đều tăng lên vào mùa vật chủ trung gian phát

triển. Những năm mưa nhiều, tỷ lệ nhiễm sán lá gan tăng lên so với những năm

nắng ráo và khô hạn. Mùa vụ gắn liền với sự thay đổi thời tiết, khí hậu. Mùa hè

thu, số lượng gia súc bị nhiễm sán lá gan tăng cao hơn so với các mùa khác trong

năm. Cuối mùa thu và mùa đông bệnh thường phát ra [8], [10], [20], [21].

- Yếu tố vùng và địa hình

Vùng và địa hình là hai khái niệm khác nhau song có liên quan chặt chẽ với

nhau. Các vùng khác nhau có địa hình không giống nhau. Địa hình là yếu tố quan

trọng quyết định sự khác nhau giữa các vùng.

Các vùng khác nhau trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đều

thuộc bốn loại địa hình: Ven biển, đồng bằng, trung du và miền núi.

Hầu hết các nhà ký sinh trùng học đều thống nhất rằng, gia súc nhai lại ở

vùng đồng bằng nhiễm sán lá gan nhiều nhất, tỷ lệ và cường độ nhiễm giảm dần

đối với đàn gia súc ở vùng ven biển, vùng trung du và vùng núi. Về nguyên nhân

dẫn đến quy luật này, một số tác giả đều giải thích do vùng đồng bằng có nhiều

ao, hồ, kênh, rạch, có điều kiện cho ốc – vật chủ trung gian sống và sinh sản. Các

điều kiện địa hình khác thì vấn đề này hạn chế hơn ở vùng đồng bằng [8], [20],

[41], [58].

Theo số liệu đã điều tra 7359 trâu, bò ở miền Bắc Việt Nam, kết quả cho

thấy: Trâu, bò ở vùng đồng bằng nhiễm sán lá gan cao nhất, sau đó đến vùng trung

du, vùng ven biển và vùng núi. Bình quân tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở các vùng điều

tra như sau: vùng đồng bằng từ 19,6% - 61,3%; vùng trung du 16,4% - 50,2%; vùng

ven biển 13,7% - 39,6%; vùng núi 14,7% - 44%). Tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở trâu bò

qua mổ khám vùng đồng bằng là 88%, vùng trung du là 77,6% [13].

- Yếu tố loài và tuổi vật chủ cuối cùng

Các loài nhai lại đã được thuần hóa như trâu, bò, dê, cừu đều nhiễm sán

lá Fasciola. Ngoài ra các loài nhai lại hoang dã cũng nhiễm sán lá này (hươu,

nai, hoẵng…), cũng có trường hợp thỏ, ngựa, lợn kểcả người cũng có thể

nhiễm sán Fasciola.

Ở nước ta, loài gia súc nhiễm sán lá Fasciolanhiều nhất là trâu (79,6%), bò

ít hơn (36%), dê ít nhất (20%). Sở dĩ trâu nhiễm sán lá gan nhiều nhất là đặc tính

ưa nước của chúng (thích ăn gần chỗ có nước, đằm, tắm trong nước và uống nước

ở vũng, ao, kênh rạch) trong khi bò và dê ít ưa nước hơn [8] , [21].

Về mối liên quan giữa tỷ lệ, cường độ nhiễm sán lá gan và tuổi vật chủ, các

tác giả đều thống nhất rằng, tuổi trâu, bò càng cao tỷ lệ và cường độ nhiễm càng

tăng lên. Một điều dễ nhận thấy là trâu, bò tuổi càng tăng lên (thời gian sống càng

dài) thì sự tiếp xúc với môi trường ngoại cảnh càng nhiều, cơ hội gặp và nuốt phải

nang ấu (Adolescaria) càng cao. Mặt khác sán lá Fasciola trưởng thành có thời

gian ký sinh ở trâu bò nhai lại tương đối dài (3 đến 5 năm, thậm chí lên tới 11

năm). Đó chính là cơ sở khoa học giải thích cho quy luật nhiễm theo tuổi vật chủ

của sán lá Fasciola sp.

Theo tác giả Phan Địch Lân cho biết, trâu dưới 3 năm tuổi chỉ nhiễm

sán lá gan 17,2 -22%; trâu 3 – 5 năm tuổi nhiễm sán lá gan 31,2% -40,2%;

trâu 5 – 8 năm tuổi nhiễm 42,4% - 57,5%; trâu 8 năm tuổi nhiễm56,8% -

66,3%; trâu ở độ tuổi phế canh (loại thải) khi mổ khám thấy tỷ lệ nhiễm cao

tới 84,6% (những trâu này tỷ lệ nhiễm rất nặng, gan phải hủy bỏ toàn bộ do

quá nhiều sán ký sinh) [13].

Nguồn gieo rắc bệnh chủ yếu là trâu, bò, dê, cừu… và những dã thú mang

Fasciola. Trứng sán lá gan theo phân của trâu bò ra ngoài tự nhiên. Hàng năm mỗi

sán lá gan đẻ ra hàng chục vạn trứng. Vì vậy mỗi trâu, bò mang sán lá gan hàng

năm thải khối lượng trứng khá lớn ra đồng cỏ và các bãi chăn thả. Những đồng cỏ

ẩm thấp lầy lội là những nơi cần thiết để mầm bệnh phát triển và xâm nhập vào

trâu bò, đồng thời cho trứng nở thành Miracidium và thuận lợi cho vật chủ trung

gian tồn tại và phát triển.

- Vật chủ trung gian của Fasciola sp

Sự phân bố của các loài ốc – vật chủ trung gian của san lá gan phụ thuộc

vào các vùng địa lý khác nhau. Vật chủ trung gian của sán lá Fasciola là các loài

ốc nước ngọt Lymnaea: L. auricularia, ở nhật Bản là L. pervia, ở Indonesia, ở

Philippine là L. viridis, ở Hungari là G. truncatula [8].

Ốc G. truncatula là loài ốc nhỏ, dài 10mm, rộng 5mm, vỏ màu xám, đầu

dài, có 4 - 5 gai thịt. Nhiệt độ tốt nhất để loài ốc này phát triển là 20 – 220C, pH

6,6 – 8,6, sinh sản mạnh từ tháng 4 đến tháng 9.

Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của ốc là 15 - 260C, khi ở nhiệt độ

này chúng có thể đẻ số lượng trứng rất lớn [40]. Trứng nở trong vòng 2 tuần và

trong một tháng ốc trưởng thành. Một con ốc trong vòng 10 -12 tuần có thể sinh

sản ra hàng ngàn con ốc, ở dưới 100C ốc không phát triển và ngừng hoạt động. Tuy

nhiên, ốc có thể chui vào bùn và sống trong điều kiện bất lợi nhiều tháng.

Phan Địch Lân và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm sinh học của ốc – vật

chủ trung gian của F. gigantica ở miền Bắc Việt Nam. Tác giả cho biết, vật chủ

trung gian của sán lá Fasciola là hai loại ốc nước ngọt thuộc giống Lymnae với

tên gọi là ốc vành tai (L.swinshoei) và ốc chanh (L. viridis). Loài L. swinshoei cỏ

vỏ mỏng, dễ vỡ, không có nắp miệng, kích thước 20mm, vòng xoắn cuối cùng rất

lớn, chiếm gần hết phần thân, vỏ loe ra như vành tai. Loài L. viridis cũng có vỏ

mỏng, không có nắp miệng, kích thước 10mm, vỏ dễ vỡ, có 4 – 5 vòng xoắn cuối

cùng lớn.

Ốc L. viridis thường sống ở những nơi có nước xâm nhập lớn, đẻ trứng thành

ổ 7 – 10 trứng, sau 7 ngày nở thành ốc con, ốc L. swinshoei thường sống trôi nổi ở

cống, rãnh, ao, hồ, đẻ trứng quanh năm, mỗi ổ có 60 – 150 trứng. Trong điều kiện

nhiệt độ của nước ta ốc đẻ quanh năm và quanh năm có ốc con nở ra.

Loài ốc L. swinshoei phân bố nhiều hơn ở đồng bằng, trong khi ốc L. viridis

phân bố nhiều hơn ở vùng núi, trung du và ven biển. Theo kết quả nghiên cứu của

tác giả thì cà hai loài ốc này đều xuất hiện trong cả 12 tháng của năm, nhưng mật

độ (tính trên 1m2) khác nhau theo từng vùng: vùng đồng bằng, mật độ ốc L.

swinshoei cao hơn và phân bố đều hơn trong năm. Cụ thể ở Mỹ Hào (Hưng Yên)

bình quân mật độ là 110,4 con/ m2, ở Bình Lục (Hà Nam) 116,2 con/ m2, còn ốc

L.viridis thì xuất hiện với mật độ cao hơn ở các vùng núi là 75%, trung du 66,5%,

ven biển 42%. Từ đó, tác giả nhận xét rằng, L. swinshoei chịu nước hơn, L.viridis

chịu cạn hơn [13].

Sự tồn tại và phát triển quanh năm, ở tất cả các vùng ốc – vật chủ trung gian

là điều kiện quan trọng nhất làm cho tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở trâu bò cao và phổ

biến ở tất cả các vùng. Nước ta được xếp vào 1 trong 5 nước ở châu Á trồng lúa

nước có đàn trâu, bò có tỷ lệ bệnh nhiễm sán lá gan cao nhất. Kết quả điều tra ở

một số vùng cho thấy:

Ở 11 tỉnh miền núi, tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở trâu, bò là 39%

Ở 4 tỉnh trung du, tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở trâu, bò là 42,2 %

Ở 5 tỉnh thuộc vùng đồng bằng, tỷ lệ nhiễm sán lá gan là 57,5%

Ở 6 tỉnh thuộc vùng ven biển, tỷ lệ nhiễm sán lá gan là 36,7%

Kết quả điều tra giữa tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá gan của ốc – vật chủ trung

gian với tỷ lệ nhiễm sán lá gan của trâu, bò có mối tương quan thuận, nghĩa là nếu

tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá gan nước ngọt cao thì tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở trâu, bò

khu vực đó cũng cao [9].

Khi phát triển đến giai đoạn nang ấu (Adolescaria), sức đề kháng của chúng

tăng lên rõ rệt. Adolescaria có khả năng tồn tại ở (-40C - 60C), ở điều kiện nhiệt

độ bình thường những Adolescaria có trong cỏ khô bị ẩm và trong môi trường

nước có thể tồn tại đến trên 5 tháng [41].

1.3. Tầm quan trọng của nghiên cứu giám định loài bằng phương pháp sinh

học phân tử giải trình tự

Trước đây, các đặc tính hình thái học (morphology), sinh thái học (ecology)

và huyết thanh học (serology) thường sử dụng trong chẩn đoán cũng đã đáp ứng

được phần lớn yêu cầu về phân loại sinh vật trong đó có ngành ký sinh [5], [18].

Đặc điểm hình thái học của F. hepatica là loài này có kích thước bề dài ngắn hơn

và có bề ngang rộng hơn F. gigantica [1]. Giữa hai loài nàycó nhiều trường hợp tồn

tại ở dạng lưỡng bội (diploid), tam bội (triploid), đa bội (mixoploid) và nhiều khi tồn

tại ở dạng hình thái học trung gian (intermediate form) thuộc loài khuyết sản nên khó

xác định chính xác về loài và dễ gây nhầm lẫn trong chẩn đoán [39], [47], [53], [55],

[65].

Hiện nay, sự phát triển của sinh học phân tử trong chẩn đoán đã giúp phân định

được loài ký sinh trùng có liên quan mật thiết với nhau mà nếu chỉ dựa trên hình thái

học đơn thuần sẽ không thể phân tách ra được. Đây là trường hợp phân loại ở SLGL

của Nhật Bản và Hàn Quốc, ở Ai Cập và cả ở Việt Nam - nơi mà giữa F.

hepatica và F. gigantica thường khó phân định chính xác loài [25], [53], [54].

Giải trình tự nucleotide rất có giá trị trong chẩn đoán khi phân biệt giữa các

loài Fasciola sp. với nhau, chẳng hạn nucleotide của vùng giao gen trong hệ gen

nhân (second internal transcribed spacer-ITS2), kết hợp trình tự nucleotide của

nad1 (NADH dehydrogenase subunit1) và cox1 (cytochrome oxidase subunit 1)

của gen ty thể [23], [33], [37], [39].

Kỹ thuật giải trình tự vùng ITS-2 và vùng D2 trong phân tử 28S rRNA của hệ

gen nhân hoặc giải trình tự thông qua đầu dò (probe) DNA cũng được phổ biến và được

coi là một công cụ dịch tễ học để kiểm tra vật chủ trung gian ốc nhiễm SLGL [42]. Bằng

kỹ thuật giải trình tự ITS-2 và vùng D2 trong phân tử gen 28S của gen nhân, các nhà

khoa học đã tìm thấy sự lai chéo nội loài giữa F. hepatica và F. gigantica trên mẫu bệnh

phẩm của Hàn Quốc và Nhật Bản [24], [35], [38], [47], [55].

Tại Việt Nam, gần đây một số tác giả trong nước bắt đầu ứng dụng các kỹ

thuật sinh học phân tử, công nghệ gen trong lĩnh vực ký sinh trùng và đặc biệt nghiên

cứu về sán lá gan lớn trong hơn 10 năm nay và cũng đã có một số thành tựu đáng kể,

đó là phương pháp định loại SLGL ở người và gia súc bằng chỉ thị DNA [19], [29],

thẩm định các mẫu bệnh phẩm có nguồn gốc vật chủ khác nhau gây bệnh trên người

và gia súc ở Việt Nam thuộc loài F. gigantica [6], [3], [65], [46].

1.3.1. Giới thiệu sơ bộ hệ gen nhân ribosomal DNA (rDNA)

Vùng gen ribosome (rDNA) là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosome, có

nhiều bản sao và không mã hóa cho bất kỳ protein nào. Đây là vùng gen bảo tồn

nên được xem là cơ sở chính xác để tìm ra sự tương đồng và khác biệt của các

sinh vật cùng loài hay khác loài, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quá

trình tiến hóa, phát sinh loài và phát hiện lai giữa các loài.

Vùng gen rDNA chứa 5' external transcribed sequence (5' ETS), 18S rRNA,

ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA và 3' ETS. Gen ITS-1 và ITS-2 (internal

transcribed spacer 1 and 2) với hai đầu biên là IGS (intergenic spacer là vùng

kém bảo tồn nhất của rDNA) (Hình 1.5).

Vùng 5,8S – rDNA là vùng có kích thước rất nhỏ và ít có sự biến đổi [60].

Vùng ITS - rDNA là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù chúng thường được sử

dụng trong nghiên cứu tiến hóa của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên

vùng này thường để xác định các biệt hóa trong cùng loài để xác lập phả hệ di

truyền [32].

Hình 1.5. Mô hình cấu trúc ribosome DNA của gen nhân và vùng gen nghiên cứu (vùng gen ITS-2 và gen 28S được đánh dấu bằng khoanh vòng) [46].

Các cặp mồi (primer) thường được thiết kế trên những oligonucleotide

có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất các sinh vật cùng loài nhằm khuếch

đại các vùng tương đương dùng trong so sánh, tạo phả hệ di truyền. Ngoài ra

nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn

dùng trong phát hiện và định danh sinh vật [62].

Trong nghiên cứu, chúng tôi thiết kế các primer cũng dựa trên các

vùng của hệ gen nhân là ITS-2 và gen 28S của cấu trúc ribosome DNA (rDNA)

(Hình 1.5).

Vùng gen ITS-2 và 28S thu nhận bằng phương pháp PCR, giải trình tự

nuleotide và so sánh với các cơ sở dữ liệu có trong Ngân hàng gen (GenBank)

để xác định tên loài, tuy nhiên nếu chỉ dựa vào vùng ITS-rDNA sẽ không hoàn

toàn chính xác vì trong các loài vẫn có sự tương đồng lớn về trình tự vùng

này và đây là vùng rất bảo tồn. Do vậy, cần kết hợp giải trình tự các vùng gen

chuyên biệt của hệ gen nhân song song với hệ gen ty thể chẳng hạn như gen

atp6,cob, cox1, nad1...trong các nghiên cứu thẩm định và chẩn đoán.

1.3.2. Hệ gen DNA ty thể

DNA ty thể quy định tính di truyền theo dòng mẹ, có kích thước khoảng

16 - 30 kb, bao gồm 36 - 37 gen mã hóa cho sản phẩm protein và một số vùng

không mã hóa cần thiết cho sự sao chép và phiên mã (Hình 1.6).

Ngoài các gen mã hóa protein, hệ gen ty thể ký sinh trùng và động vật còn

có 2 gen RNA ribosome (rRNA) là 12S rRNA (hay rrnS) và 16S rRNA (hay

rrnL), 22 gen RNA vận chuyển (tRNA) và một vùng không gen không mã hóa

protein, có độ dài ngắn phụ thuộc vào từng loài động vật [28], [48], [34].

Hình 1.6. Mô hình cấu trúc DNA của hệ gen ty thể. Vùng gen COX1 trong nghiên cứu được đánh dấu bằng vòng tròn [46].

Những ưu điểm của hệ gen ty thể:

- Kích thước hệ gen ty thể nhỏ hơn so với hệ gen nhân tế bào, ty thể chứa

đầy đủ các gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào nên DNA ty thể được

coi là đối tượng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen về chẩn đoán, giám định,

phân loại, dịch tễ học và di truyền quần thể [28], [48].

- Gen ty thể trong cùng loài hoặc có quan hệ cận loài sinh học có tính bảo

tồn rất cao nên bất kỳ sự thay đổi nhỏ nào cũng là giá trị được phản ánh trong

giám định, phân loại và nghiên cứu di truyền học [31].

- Hệ gen ty thể cung cấp nguồn dữ liệu quý giá về chỉ thị phân tử trong

nghiên cứu về mối quan hệ giữa loài và loài (nội loài và ngoại loài) trong giám

định phả hệ và dịch tễ học [66]. Ngoài ra, sự hiểu biết đây đủ về hệ gen ty thể của

ký sinh trùng còn có giá trị lớn trong chẩn đoán và phòng chống bệnh nhằm tìm

kiếm các loại hóa chất, hóa dược đặc hiệu trong phòng và điều trị bệnh hiệu quả

[34], [48].

Đối với Fasciola sp và bệnh SLGL, việc chẩn đoán bằng chỉ thị ty thể

(mitochondrial marker) kết hợp với chỉ thị hệ gen nhân (nuclear marker) đã làm sáng

tỏ nhiều vấn đề về phân loại, phân bố, hiện tượng lai trong quần thể, di truyền phân

tử và tiến hóa loài [24], [38], [39], [46], [47], [51], [52], [55].

Thông tin về dữ liệu gen học của toàn bộ hệ gen ty thể mới chỉ mang tính

chất cục bộ đối với mỗi quốc gia, đặc biệt là ở Việt Nam khi nổi cộm vẫn là đã

phát hiện loài lai kí sinh gây bệnh không những ở động vật mà còn trên người

với số ca bệnh ngày càng tăng, thì những dữ liệu về toàn bộ một hệ gen ty thể và

vùng giao gen IGS hoàn chỉnh không có nhiều để so sánh. Trong tổng số hơn 30

hệ gen của các loài sán dẹt đã được giải mã toàn bộ hệ gen ty thể mới chỉ có dữ

liệu của một loài SLGL F. hepatica của Úc (Australia) đã được giải trình tự và

công bố và số đăng ký trong Ngân hàng gen là AF216697 [45].

Hiện nay, sử dụng phương pháp sinh học phân tử PCR và giải trình tự không

những giúp làm sáng tỏ mối quan hệ dịch tễ học của bệnh, mà còn cho phép chẩn

đoán bệnh một cách chính xác với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp cung cấp

thông tin về nguồn và đường lan truyền của các tác nhân gây bệnh để có thể đề

xuất biện pháp điều trị can thiệp phù hợp.

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Mẫu bệnh phẩm sán lá gan lớn trưởng thành được phân lập từ trâu, bò tại một

số địa phương của Việt Nam được thu tại vùng núi phía Bắc thuộc tỉnh Cao Bằng và

vùng đồng bằng thuộc tỉnh Ninh Bình. Chọn lọc sơ bộ hình thái để tiến hành tách

DNA tổng số.

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 10/2014 – 06/2015.

Địa điểm nghiên cứu: tại phòng Miễn Dịch học, Viện Công nghệ sinh học thuộc

Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

2.3. Dụng cụ và thiết bị và hóa chất

2.3.1. Dụng cụ, trang thiết bị

- Máy PCR PTC-100 (MJ. Research Inc., Mỹ).

- Máy ly tâm eppendorf (Centrifuge 5415D).

- Máy soi gel và chụp ảnh Dolphin- Wealtec (Mỹ).

- Bộ điện di ngang và nguồn điện di (Bio-Rad).

- Box cấy vô trùng

- Máy lắc có điều nhiệt để nuôi tế bào.

- Máy hút chân không Speed-Vac - Máy vortex,lò vi sóng,tủ lạnh -20oC, tủ lạnh-80oC(SANYO-Nhật Bản)…

- Các bộ pipetman (10µl, 20µl, 100µl, 1000µl) của hãng Gilson (Pháp),

đầu côn các loại, đĩa petri, chai pyrex các loại pha môi trường và ống nuôi vi

khuẩn…

2.3.2. Hóa chất

+ Các loại hóa chất:

- Yeast extract (DIFCO-Mỹ); trypton (DIFCO-Mỹ); EDTA, SDS, tris

(Sigma-Mỹ),acid acetic (Merk-Đức); kanamycin, ampicilin (Merk-Đức); x-gal

(Sigma-Mỹ),agarose (Sigma-Mỹ), cồn tuyệt đối (Prolabo-Pháp)…

+ Các bộ kit sử dụng:

- Kit tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Bioneer (Hàn Quốc)

- Kit tinh sạch elution “thôi gel” của Qiagen (Mỹ)

- Các loại enzym giới hạn EcoRI, BamHI, NotI, SmaI, DraI… của các hãng New

England - BioLabs (Mỹ), Fermentas (Lithuania).

Các nghiên cứu được thực hiện tại phòng Miễn dịch học thuộc Viện Công

nghệ sinh học với các trang thiết bị của phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ

gen, kết hợp với một số đơn vị trong và ngoài nước trong quá trình giải trình tự.

2.4. Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu được trình bày ở Hình 2.1.

Mẫu SLGL

Tách DNA tổng số

Thực hiện PCR

Giải trình tự (Sequencing)

Xử lý chuỗi nucleotide

Truy cập ngân hàng gen

Phân tích đặc tính SHPT

Xây dựng cây phả hệ

Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu giải mã hệ gen ty thể Fasciola sp.

2.4.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu Fasciola sp

Mẫu bệnh phẩm được rửa sạch bằng nước muối sinh lý và cố định trong

cồn 70% và bảo quản lạnh ở -200C, cho đến khi sử dụng.

Các mẫu sán được cắt lấy một phần nhỏ ở rìa để tách DNA tổng số. Tách

chiết bằng bộ kit QIAampDNA Mini kit (QIAGEN Inc). Các DNA tổng số sẽ

được dùng làm nguyên liệu khuôn, cho phản ứng PCR trong nghiên cứu.

2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số của từng mẫu riêng biệt được tách chiết bằng QIAamp DNA

Mini kit (QIAGEN Inc. (Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA tổng số

được kiểm tra nồng độ bằng cách đo OD (Optical Density) trên máy đo quang phổ

kế Nanodrop 1000 spectrophotometer hoặc điện di trên thạch agarose 1%.

Cách tiến hành:

Sử dụng bộ kit “Qiagen Genomic DNA Extraction Kit“ của hãng QIAGEN

(Mỹ) để tách DNA tổng số:

Bước 1: Mẫu vật sau khi được xử lý rửa bằng nước nhiều lần để loại bỏ hết

cồn trong quá trình bảo quản mẫu, cắt 2 bên rìa của con sán (~25 mg); nghiền mẫu

trong bộ cối chày nhựa thành dạng huyễn dịch đồng nhất.

Bước 2: Thêm 200µl dung dịch tissue lysis buffer (ATL). Bổ sung 20µl

proteinase K (50mg/ml) + 4µl Rnase – A (100mg/ml), ủ trong bể điều nhiệt ở 550C

trong 2 - 3 giờ, thỉnh thoảng vortex cho đến khi mô được phân hủy hoàn toàn.

Bước 3: Bổ sung 200 µl dung dịch binding buffer (AL), lắc mạnh rồi ủ ở

700C trông 30 phút.

Bước 4: Thêm 200µl dung dịch izopropanol – 2 , vortex khoảng 15 giây.

Bước 5: chuyển toàn bộ hỗn dịch sang cột có màng lọc, ly tâm 10.000

vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ phần dung dịch phía dưới cột lọc.

Bước 6: Thêm 500µl dung dịch washing buffer 1 (AW1) vào cột lọc để rửa

DNA đã bám vào màng của cột lọc, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch

ly tâm bên dưới cột.

Bước 7: Thêm 500µl dung dịch (Washinh buffer 2) AW2 vào cột lọc để rửa

DNA, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch ly tâm bên dưới. Ly tâm lại

13.000 vòng/ phút trong 1 phút (để làm khô màng).

Bước 8: Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml mới, thêm 60 µl dung

dịch elution buffer (EL), để ở nhiệt độ phòng trong 2 – 5 phút. Sau đó ly tâm

13000 vòng/phút trong 2 phút. Bỏ cột, giữ lại dịch bên dưới.

Ghi ký hiệu mẫu DNA tổng số và bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng.

2.4.3. Thiết kế mồi, thực hiện PCR gen ITS2, 28S và gen cox1

2.4.3.1. Thiết kế mồi

Đoạn gen cox1 của hệ gen ty thể sán lá gan Fasciola chứa gen mã hóa

protein cox1; gen ITS-2 và gen 28S là đoạn gen không mã hóa trong hệ gen nhân

được lựa chọn để thu nhận gen bằng phương pháp PCR và giải trình tự, phân tích

và so sánh với các loài sán lá gan và sán lá khác.

Các mồi được thiết kế dựa trên trình tự các gen có trong ngân hàng gen. Mồi

đặc hiệu được sử dụng 3SF-BD2R, U28SF-U28SR, FSP12F-FGHR2 (bảng 2.1)

Bả ng 2.1.Danh sách cá c mồi dù ng trong phả n ứ ng PCR thu nhận gen ITS-2, 28S và COX1.

Chuỗi Tên Kích thước Trình tự chuỗi primer (5’→ 3’) gen primer chuỗi gen

3SF GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG ~ 556 bp ITS2 BD2R TATGCTTAAATTCAGCGGGT

U28SF CTAACAAGGATTCCCTTAGTAAC ~ 1,2 kb 28S U28SR GTCTTTCGCCCCTATACTCAC

FSP12F GGTAATTATTTGCCTTTGC ~ 1,6 kb COX1 FGHR2 AAACCAACCTCACAGCAAACC

2.4.3.2. Phương pháp thực hiện PCR và điện di kiểm tra sản phẩm

Mẫu được kiểm tra hình thái học để sàng lọc lựa chọn các mẫu cần tách

DNA, thực hiện PCR sử dụng vùng giao gen ITS-2 giữa gen 5.8S và 28S ribosome

của hệ gen nhân. Ngoài ra còn sử dụng các cặp mồi được thiết kế cho phản ứng

PCR nhân vùng gen cox1 của hệ gen ty thể và gen 28S của gen nhân trong nghiên

cứu về loài sán lá gan lớn Fasciola sp.

Gen 28 S: Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt: 94oC/5 phút

(1 chu kỳ); 35 chu kỳ cho các bước: (94oC/30 giây; 50oC/30 giây; 72oC/2 phút);

72oC/10 phút (1 chu kỳ cuối cùng); bảo quản sản phẩm tạm thời ở 4oC

Cox1: Sử dụng bộ kit PCR Master mix (Fermentas) thực hiện PCR. Hỗn

hợp PCR (50 µl), gồm 25 µl PCR mastermix (Fermentas), 2 µl mỗi loại mồi (10

pmol/µl), 3 µl khuôn DNA, 2 µl DMSO (dimethyl sulfoxide) và 16 µl nước khử

ion DEPC. Phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện trên máy MJ PTC-100

(USA), chu trình nhiệt gồm: 1 chu kỳ ở 95oC/5 phút, 35 chu kỳ ở [94oC/1 phút,

52oC/3 phút; 72oC/2 phút], chu kỳ cuối ở 72oC/10 phút

Nguyên lý của điện di:

Dựa trên tính chất hóa học của acid nucleic là: các acid nucleic mang điện

tích âm trong môi trường pH trung tính do đó các gốc phosphat ở khung

phosphatdieste trong cấu trúc hóa học, dưới tác dụng của điện trường không đổi

chúng di chuyển về cực dương và dừng lại ở điểm có pH đẳng điện (pHi) đặc

trưng của mỗi phân tử acid nucleic, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước

phân tử acid nucleic (loại có trọng lượng phân tử lớn di chuyển chậm hơn loại có

trọng lượng phân tử nhỏ) và môi trường đệm điện di. Sản phẩm PCR được kiểm

tra bằng điện di trên gel agarose 1% sử dụng bộ điện di DNA (Bio-Rad) và chụp

hình sản phẩm điện di trên máy soi gel.

Các bước tiến hành:

Chuẩn bị gel agarose 1%: Lấy 0,4g agarose nguyên chất (dạng bột), cho

vào cốc đong thủy tinh chịu nhiệt đổ vào đó 40ml dung dịch TAE 1 lần (TAE có

thành phần gồm: Tris, acid acetic glacial, EDTA), cho vào lò vi sóng đặt nóng

chảy trong 2 phút sao cho agarose 1% tan chảy hết. Đổ thạch đã tan chảy vào hệ

thống điện di đã gài sẵn lược có nhiều răng, đổ thạch ngập răng lược khoảng 0,5

mm và để nguội ở nhiệt độ phòng (khoảng 20-30 phút). Khi nguội các răng lược

tạo thành các lỗ để tra mẫu vật vào kiểm tra.

- Dìm ngập khay thạch trong hộp điện di chứa đệm TAE 1 lần.

- Tra mẫu: Lấy 10µl sản phẩm PCR trộn với 2µl chỉ thị màu xanh (xanh

Bromophenol) tra riêng biệt vào từng giếng.

- Tra chỉ thị phân tử: Lấy 6µl chỉ thị phân tử DNA marker, ở đây chúng tôi

sử dụng DNA của thực khuẩn thể lamda (λ) được cắt bằng enzyme giới hạn

HindIII. Chỉ thị phân tử DNA được cắt thành 8 phân đoạn có độ dài: 23,1kb;

9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,56kb; 0,125kb. Nhờ chỉ thị phân tử DNA mà

có thể xác định được chiều dài đoạn DNA cần nghiên cứu.

- Chạy điện di ở 100V trong thời gian khoảng 30 - 35 phút.

- Nhuộm gel chứa sản phẩm PCR trong dung dịch Ethidium Bromide

(2µg/µl) trong 10 phút.

- Rửa gel bằng nước cất sau đó đưa bản gel lên soi qua tia cực tím (UV) và

chụp ảnh trên máy Dolphin-DOC (Wealtech-Mỹ).

2.4.4. Phương pháp giải trình tự

Phương pháp giải trình tự (sequencing) dựa và hoạt động của enzyme DNA

– polymerase trong quá trình tổng hợp DNA, enzyme DNA – polymerase xúc tác

gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3‘ có chứa nhóm

(OH)- tự do, khi gặp nucleotide không chứa nhóm 3‘-OH (ddNTP) thì phản ứng

tổng hợp dừng lại. Đặc trưng của phương pháp này là dùng ddNTP (bị mất 2

nguyên tử oxy ở vị trí cacbon 3 và 4) để dừng phản ứng một cách ngẫu nhiên. Kết

quả là tạo ra các đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau và chỉ sai khác nhau một

nucleotide.

Kỹ thuật này kết hợp ba bước của một chu kỳ nhiệt phản ứng PCR, bao gồm:

vùng liên kết, mồi bám và enzym Taq-polymerase cùng các điều kiện thích hợp.

Thành phần tổng hợp DNA là hai loại NTP bao gồm deoxy NTP (dNTP)

và 1% dideoxy NTP (ddNTP) tương ứng (lượng nhỏ ddNTP so với dNTP nên

thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP được sử dụng cho phản ứng nối dài chuỗi đơn

nucleotide dừng lại ngẫu nhiên).

Chuỗi DNA sản phẩm được xác định trình tự theo chiều 5‘→3‘ dùng thuốc

nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye) để đánh dấu, sử dụng thạch polyacrylamide

và quét tia lazer dọc theo chuỗi để đọc trình tự. Phân tích tự động bằng máy với

các chương trình phần mềm tin–sinh học.

Chuỗi DNA cuối cùng thu nhận được bao giờ cũng được xác định theo

chiều 5‘→3‘. Mỗi lần giải tình tự, chuỗi thô (có thành phần DNA ban đầu chưa

được xử lý) có độ dài khoảng vài trăm đến vài nghìn nucleotide, thông thường là

từ 500 -1000 nucleotide.

2.4.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Trình tự DNA thu nhận được từ máy giải trình tự, được cung cấp ở hai

dạng: chuỗi nucleotide thô ở dạng chữ (.txt) và chuỗi nucleoide ở dạng giản đồ

chromatogram (.ab1). Chuỗi ở dạng (.txt) cho phép nhận biết chuỗi giải trình tự

có đạt yêu cầu hay không, còn chuỗi nucleotide ở dạng (.ab1) cho phép đưa các

chương trình chuyên biệt (ví dụ: Chromas, BioEdit, SeqEd) để phân tích, biên tập

chuỗi thô với mục đích xác định chính xác từng nucetide để có chuỗi cuối cùng

(chuỗi tinh hay chuỗi đã biên tập). Cuối cùng, chuỗi đã được biên tập (edited)

được sử dụng ở dạng .txt, vì ở dạng này, tất cả các chương trình tin-sinh học phân

tích gen (ví dụ: MEGA, GeneDoc, Mac Vector) đều có thể nhận biết.

Các chuỗi nucleotide hay amino acid được so sánh, sắp xếp và tính toán

mức độ đồng nhất (identity) và tương đồng (homology) bằng chương trình

GeneDoc2.7 làm dữ liệu chuyển nạp vào MEGA6.06 cho phân tích phả hệ.

* Chương trình so sánh và phân tích GeneDoc:

GeneDoc là một chương trình nổi (interface application) được lập trình cho

máy tính PC sử dụng hệ Window, dùng để mở file, đọc và phân tích file ở dạng

.msf (multiple sequence file [56].

Sử dụng chương trình GeneDoc cho phép xác định trình tự amino acid suy

diễn, đưa ra cấu hình của các chuỗi đã được so sánh để chuyển nạp và MEGA cho

phân tích phả hệ.

* Chương trình phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA):

MEGA (Molecular Eolutionary Genetics Analysis) làm một chương trình

nối giao diện (interface application) được lập trình dễ sử dụng cho các nhà nghiên

cứu di truyền học phân tử với mục đích so sánh đối chiếu các chuỗi gen đồng chức

năng từ các chủng loài trong cùng giống/chi thuộc cùng một họ từ đó suy ra mối

quan hệ nguồn gốc và phả hệ ở góc độ tiến hóa phân tử [61].

* Xử lý số liệu trong nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xử lý giản đồ chromatogram của chuỗi

nucleotide thô bằng chương trình SeqEdv1.03, sau đó so sánh các chuỗi sử dụng

chương trình AsemblyLIGN v1.9 và phân tích thành phần nucleotide và amino

acid hoặc các đặc tính gen và chuỗi polypeptide bằng hệ chương trình MacVector

8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính Macintosh. Các trình tự nucleotide hay amino

acid được sắp xếp và tính toán mức độ tương đồng bằng chương trình GeneDoc

2.7, phân tích và xây dựng phả hệ bằng chương trình MEGA6.06 [61], trên máy

tính PC.

Các chuỗi gen cox1, ITS-2 và 28S được sử dụng để phân tích, so sánh về

thành phần nucleotide và amino acid, cũng như phân tích mối quan hệ phả hệ giữa

các chủng Fasciola sp của Việt Nam và thế giới. So sánh đối chiếu, phân tích mối

quan hệ phả hệ giữa các chuỗi thu nhận trong nghiên cứu với các chuỗi đã công

bố của Việt Nam và thế giới đă đăng ký trong Ngân hàng gen.

Mối quan hệ phả hệ nguồn gốc dựa trên trình tự nucleotide hoặc amino acid

của một phân đoạn gen giữa các chủng Fasciola sp sử dụng bằng phương pháp

“kết nối liền kề“ (NJ, Neighbour-Joining), với hệ số kiểm định tin tưởng

(bootstrap) là 1000 lần [61].

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1. Thunhận gen ITS-2 trong chẩn đoán phân biệt

3.1.1. Thu thập mẫu sán lá gan lớn và phân loại hình thái

Các mẫu sán lá gan lớn gây bệnh trên bò của địa danh tỉnh Cao Bằng và

trên trâu tỉnh Ninh Bình được thu nhận và bảo quản trong cồn 70o. Tổng mẫu của

tỉnh Ninh Bình gồm 05 mẫu; số mẫu của tỉnh Cao Bằng gồm 16 mẫu.

Hình 3.1. Hình ảnh sán lá gan lớn FspNB-VN và FspCB-VN trong nghiên cứu

Sơ bộ phân loại về hình thái, chúng tôi chọn 01 con sán lá gan lớn có hình

dạng dài giống F. gigantica (Hình 3.1A) được ký hiệu là FspNB-VN và 01 con

của Cao Bằng (Hình 3.1B), chọn con số 11 có hình dạng giống chiếc lá và bề

ngang ngắn, giống F. hepatica, ký hiệu là FspCB-VN để tách DNA tổng số bằng

bộ kit QIAamp DNA Mini kit (Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

3.1.2. Sử dụng gen ITS-2 trong chẩn đoán phân biệt

Mẫu sán lá gan lớn FspCB-VN (Cao Bằng) và FspNB-VN (Ninh Bình)

được tách DNA tổng số làm khuôn cho phản ứng PCR. Các chuỗi gen ITS-2 được

nhân lên bằng phản ứng PCR với các cặp mồi 3SF – BD2R. Vùng giao gen ITS-

2 có độ dài khoảng 550 bp (gồm cả phần 5,8S và 28S của mồi bám vào). Kết quả

PCR được trình bày ở hình 3.2.

1. Sản phẩm PCR của mẫu FspNB có kích thước ~ 0,5 kb;

2. Sản phẩm PCR của mẫu FspCB có kích thước ~ 0,5 kb;

Hình 3.2. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR của vùng gen ITS-2.

M: Chỉ thị phân tử Lamda cắt bằng enzyme HindIII

Hình ảnh ở hình 3.2 cho thấy, sản phẩm PCR có độ dài đúng với dự kiến

(~ 0,5 kb) là một băng DNA sáng rõ, đơn băng chứng tỏ cặp mồi bám đặc hiệu và

chu trình nhiệt phù hợp. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit AccuPrep™

Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc).

Sử dụng chuỗi nucleotide của FspNB-VN và FspCB-VN để blast vào Ngân

hàng gen thu nhận các chuỗi tương ứng. So sánh và đối chiếu trình tự gen ITS-2

của 16 chuỗi, trong đó gồm: 2 chuỗi trong nghiên cứu và 14 chuỗi nucleotide gen

ITS-2 đã đăng ký trong Ngân hàng gen được sắp xếp và trình bày ở hình 3.3.

Hình 3.3. So sánh trình tự chuỗi nucleotide ITS-2của 16 mẫu Fasciola sp. Dấu (.) biểu thị sự giống nhau. Sự sai khác được thể hiện bằng các chữ cái (7 vị trí). Vị trí 327 được đóng khung đã được xác định đây là vị trí phân biệt nhận biết giữa Fassciola gigantiaca thuần (pure) và Fasciola hepatica với loài lai. Hai mẫu FspNB-VN và FspCB-VN được so sánh và sắp xếp ở hàng trên cùng.

Kết quả ở hình 3.3 cho thấy, chuỗi ITS-2 ở Việt Nam và thế giới được chia làm hai loại: loại có độ dài 361 nucleotide và loại có độ dài 362 nucleotide, có sự sai khác ở 7 vị trí chính giữa F.gigantia và F.hepaticavà các loại trung gian: 207 (C/T), 231 (C/T), 270 (T/C), 276 (T/C), 327 (-/T), 334 (A/G), 341(T/A). Vị trí 327 có thêm nucleotide là Thymine (T) trong ITS-2 của F.hepatica, đây là chỉ thị có tính quyết định phân biệt giữa F.gigantica (361 nucleotide) và F.hepatica (362 nucleotide). Như vậy, 16 chuỗi ITS-2 so sánh được chia làm hai nhóm đại diện F.gigantica và F.hepatica tạo nên các dòng thuần và dòng lai trong quần thể Fasciola sp.

Bảy vị trí biến đổi của nucleotide đã được xác định trên trình tự của gen ITS-2 (danh sách được liệt kê ở bảng 3.1), trong đó tại vị trí 327 thì mẫu FspCB- VN có Thymine, còn mẫu FspNB-VN không có nucleotide tại vị trí 327. Vùng giao gen ITS-2 của các mẫu sán lá gan lớn của 16 chuỗi so sánh đối chiếu có độ dài khác nhau: 361 bp hoặc 362 bp, chênh lệch nhau bởi một nucleotide(T) ở vị trí 327 (Hình 3.3).

Trình tự nucleotide gen ITS-2 của 2 mẫu sán lá gan lớn FspCB-VN và FspNB-VN được so sánh với ITS-2 của mẫu FgIN của Indonesia (đặc trưng cho F. gigantica thuần) và mẫu Fasciola Fh-FR của Pháp (đặc trưng cho loài F. hepatica thuần) với một số mẫu thu ở các vật chủ khác nhau. Mẫu Fsp-GHL- 2014-CN của Trung Quốc là mẫu tham chiếu cho loài lai.

Trong quá trình phân tích và nghiên cứu, chúng tôi đã chú trọng vấn đề thu thập các mẫu tương ứng từ các mẫu có nguồn gốc ở các nước đại diện châu lục (châu Âu, châu Á, châu Mỹ) và trên các đối tượng vật chủ khác nhau (trâu, bò, dê, cừu, người...) có trong ngân hàng gen hoặc từ tài liệu tham khảo để so sánh đối chiếu (Bảng 3.1), trong đó gồm các mẫu nguồn gốc Việt Nam, Thái Lan, Trung Quốc, Nhật Bản, Pháp, Tây Ban Nha, Ireland, Indonesia và Uruguay.

Gen ITS-2 đã được sử dụng nhiều trong việc định loài và đặc biệt đối với loài sán lá gan lớn [24], [39], [47]. Sự khác nhau giữa số lượng của các cặp nucleotide của gen ITS-2 là một đặc điểm để phân biệt giữa hai loàiF. gigantica và F. hepatica: Sự thiếu hụt 1 cặp nucleotide ở vị trí số 327 của ITS-2 làm cho tổng số cặp nucleotide còn 361, cho phép xác định gen ITS-2 đó sẽ thuộc về nhóm F. gigantica và số cặp nucleotide là 362 thì gen ITS-2 thuộc nhóm F. hepatica.

Bảng 3.1. So sánh các nucleotide ở các vị trí biến đổi của vùng giao gen ITS-2

của các mẫu sán lá gan lớn ở các vùng địa lý và vật chủ khác nhau

Số TT

Vị trí biến đổi trong gen ITS-2

Đánh giá phân loại

Ký hiệu

Nguồn gốc Vật chủ

Cơ sở dữ liệu

207 231 270 276 327 334 341

1 FspNB-VN

Việt Nam Trâu

C

T

-

A

T NC này

F. giantica -like*

2 FspCB-VN

Việt Nam

Bò

T

A

T NC này

Cừu

C

T

A

A AJ557570

T

3 Fsp(He1)- CN

Trung Quốc

F. hepatica- like* F. hepatica- like*

FspSaita-JP

Nhật Bản

Bò

C

T AB207151

T

-

A

F. giantica - like*

Fg(GX)-CN

Trâu

A AJ557569 F. giantica

T

-

A

C

Trung Quốc

Thái Lan

Cattle

T AB207149 F. giantica

T

-

A

C

6 Fg-TL 7

EU260057

F. giantica

FspBDB-VN Việt Nam

Bò

T

-

A

C

Fg(IndoT)

Indonesia

Cattle

T AB010977 F. giantica

T

-

A

C

Fh-UR

Uruguay

Cattle

T AB010974 F. hepatica

C

T

G

T

FspHokai-JP Nhật Bản

Bò

T AB207150 F. hepatica

C

T

G

T

Fh-IR

Ireland

Cattle

T AB207148 F. hepatica

C

T

G

T

Fh(Ca)SP

N/A

T AJ272053 F. hepatica

C

T

G

T

Tây Ban Nha

1 13

Fh-FR

Pháp

Bò sữa T

A AB557567 F. hepatica

C

T

G

T

Bò sữa

T

G

T KF543341

Fsp-GHL- 2014-CN

Trung Quốc

F. hepatica- like*

Thai lan

Người

T

C

T

G

T KF687908

F. hepatica- like*

Fsp(hu)- 2015-TL

16 Fsp-

Việt Nam

Cattle

T

C

T

G

T AB536918

F. hepatica- like

Khanhct11.2- VN

Ghi chú: F. giantica -like:dạng trung gian giống F. gigantica; F. hepatica - like: dạng trung gian giống F. hepatica. Mẫu sốTT (8) Fg(IndoT) tham chiếu cho F.gigantica dạng thuần; (11) Fh-FR tham chiếu cho F. hepatica; (14):Fsp-GHL-2014-CN tham chiếu cho dạng lai (hybrid form).

Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả khi giám

định gen của các mẫu sán ở vùng Đông và Đông Nam Á: Trung Quốc [35], Hàn

Quốc [24], Việt Nam [39], [47], [55], đó cũng là những bằng chứng để khẳng định

khả năng hình thành một số dạng di truyền (genotype) mới trong quần thể sán lá

gan lớn tại Việt Nam và thế giới [2], [46].

3.2. Kết quả thu nhận gen 28s và xây dựng cây phả hệ

23,1 kb

2 kb

1,2 kb

564 bp

B

Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR gen 28S với cặp mồi U28SF – U28SR.

M: Thang chỉ thị phân tử Lamda cắt bằng HindIII.

1. FspNB-VN

2. FspCB-VN

Các mẫu DNA của FspNB-VN và FspCB-VN được thực hiện phản ứng

PCR với cặp mồi U28SF – U28SR, gen 28S có độ dài theo dự kiến khoảng 1,2

kb. Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 1%.

Kết quả được thể hiện ở hình 3.4 cho thấy sản phẩm PCR của FspNB-VN

và FspCB-VN có kích thước đúng như dự kiến. Sản phẩm PCR là 1 băng DNA

sáng rõ, chứng tỏ cặp mồi thiết kế đặc hiệu và chu trình nhiệt phù hợp và tối ưu.

Giải trình tự nucleotide gen 28S và xây dựng mối quan hệ phả hệ

Sản phẩm PCR gen 28S của FspNB-VN và FspCB-VN được tiến hành giải

trình tự trực tiếp, sau khi giải trình tự chuỗi nucleotide sẽ được xử lý/biên tập và

sử dụng các chuỗi này để so sánh, đối chiếu với các chuỗi gen 28S ribosome có

trong Ngân hàng gen.

Dựa vào kết quả giải trình tự gen 28S của FspNB-VN và FspCB-VN, các

chuỗi nucleotide thô được xử lý bằng chương trình Chrommas và SeqEdv1.03, sử

dụng các chuỗi này blast vào ngân hàng gen để thu thập các chuỗi gen 28S tương

ứng. Danh sách liệt kê các trình tự nucleotide của gen 28S thuộc họ Fasciolidae sử

dụng để phân tích và so sánh trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.2.

Trình tự chuỗi nucleotide gen 28S được trình bày ở phần Phụ lục 1. Giản đồ

giải trình tự gen 28S được trình bày minh họa ở phần phụ lục 2. Do gen giải trình tự

trực tiếp, hai đầu bám của mồi nên chuỗi nucleotide có độ dài khoảng 1000 bp.

Bảng 3.2. Các mẫu cung cấp chuỗi gen 28S trong nghiên cứu

Số

Số đăng ký

Ký hiệu tên mẫu/loài

Quốc gia

TT

Ngân hàng gen

FspNB-VN (Fasciola sp)

Việt Nam

Nghiên cứu này

FspCB-VN (Fasciola sp)

Việt Nam

Nghiên cứu này

FgigSN (Fasciola gigantica)

Senegal

AY222245

Fgig-TH (Fasciola gigantica)

Thái Lan

HM004190

FgigKE (Fasciola gigantica)

Kenya

EU025873

FgET (Fasciola gigantica)

Ethiopia

Lê Thanh Hòa và cs

FhEQB (Fasciola hepatica)

Equador

Lê Thanh Hòa và cs

FhEQB (Fasciola hepatica)

Equador

Lê Thanh Hòa và cs

FspEQO (Fasciola sp)

Equador

Lê Thanh Hòa và cs

10 FhAus (Fasciola hepatica)

Australia

Lê Thanh Hòa và cs

11 FhBe (Fasciola hepatica)

Belgium

Lê Thanh Hòa và cs

12 FhepEG (Fasciola hepatica)

Ai Cập

EU025874

13 FhepSA (Fasciola hepatica)

Ả rập Saudi

AY222244

14 FmagUS (Fasioloides magna)

Mỹ

EU025872

15 FjacLK (Fasciola jacksoni)

Srilanca

EU025871

16 FbusVN (Fasciolopsis buski)

Việt Nam

EU025870

Gen 28S được xem là vùng bảo tồn nên là cơ sở chính xác để tìm ra sự

tương đồng và khác biệt của các sinh vật trong cùng một loài hay khác loài, nó

đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu về tiến hóa, phát sinh loài và phát

hiện hiện tượng lai giữa các loài [46].

Kết quả xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide của 16 chuỗi gen 28S

được trình bày ởhình 3.5. Trong số các chuỗi gen 28S ở bảng 3.2 có sử dụng một số

chuỗi 28S đã được giải trình tự nhưng chưa công bố trên Ngân hàng gen, đây là những

dữ liệu đang trong giai đoạn thực hiện tiếp tục nghiên cứu của đề tài [6].

Cây phả hệhình 3.5 cho thấy, chuỗi gen 28S ribosome đã có sự phân chia

thành 2 nhóm trong quần thể của Fasciola sp tại Việt Nam. Loài Fascioloides

magna là sán lá gan lớn ở hươu và động vật hoang dã (số đăng ký EU022872) và

F. jacksoni làsán lá gan lớn ở loài voi(số đăng ký EU025871) tạo nên sự phân

nhánh cơ sở trung gian giữa Fasciola sp với Fasciolopsis buski (sán lá ruột lớn)

và nằm riêng biệt như một nhóm ngoại hợp (outgroup) (Hình 3.5).

Hình 3.5. Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa mẫu Fasciola sp xác trên lập dựa trên thành

phần nucleotide gen 28S ribosome bằng chương trình MEGA6.06 (phương pháp kết nối liền

kề NJ, sử dụng độ tin cậy 1000 bootstrap). Các mẫu Fasciola sp sử dụng tham chiếu là các

mẫu có số đăng ký Ngân hàng gen. Ký hiệu (♦) là các mẫu trong nghiên cứu.

Hai mẫu của Việt Nam FspNB-VN và FspCB-VN sau khi giải trình tự được

blast vào ngân hàng gen thu thập các chủng làm tham chiếu (Hình 3.5). Trong cây

phả hệ, mẫu FspNB-VN (Ninh Bình) thuộc nhóm F. gigantica, có quan hệ gần

với Fgig-KE của Kenya (số đăng ký Ngân hàng gen là EU025873); FgigSN(số

đăng ký AY22245) và FgigTH của Thái Lan (số đăng ký: HM004190). Ở nhóm

thứ 2, mẫu FspCB-VN trong nghiên cứu nằm trong nhóm của F. hepatica, trong

đó có các chủng chuẩn F. hepatica của Australia, Belgium và cùng với FhepEG

(số đăng ký: EU025874) của Ai Cập và FhepSA (số đăng ký: AY222244) của Ả

rập Saudi (Hình 3.5).

Qua phân tích mối quan hệ loài của gen 28S hai mẫu Fasciola sp của Việt

Nam cho thấy, mẫu FspCB-VN (Cao Bằng) có khả năng thuộc vềF. hepatica, một

trong những vấn đề quan tâm hiện nay cần làm sáng tỏ là liệu ở Việt Nam có loài

này hay không, do gần đây phát hiện nhiều dạng trung gian hay dạng lai giữa F.

hepatica x F. gigantica [46], [2].

Như vậy, gen 28S của hai mẫu FspNB-VN và FspCB-VN thu tại Việt Nam đã

được giải trình tự và phân tích mối quan hệ phả hệ cùng với các mẫu khác trong

họ Fasciolidae.

Chỉ thị phân tử của gen 28S cho thấy quần thể Fasciola sp tại Việt Nam có

hai nhóm thuộc F. gigantica và F. hepatica, trong đó có mẫu FspCB-VN có khả

năng thuộc F. hepatica.

Sự đa dạng trong quần thể Fasciola spp và việc phát hiện mẫu FspCB-VN trong

nghiên cứu này gần với F. hepatica cần được nghiên cứu thêm về quan hệ loài nhằm

làm sáng tỏ sán lá gan lớn gây bệnh trên người và động vật tại Việt Nam.

3.3. Kết quả thu nhận chuỗi gen ty thể cox1

Gen ty thể cox1(cytochrome oxidase subunit1)của 2 mẫu sán lá được thu

nhận, qua phân tích di truyền và cây phả hệ cho thấyF. gigantica dạng thuần là

FspNB-VN và FspCB-VN (dạng lai của Việt Nam). Kỹ thuật PCR được thực hiện

để thu nhận gen cox1 có độ dài khoảng 1,6 kb.

Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận gen cox1 của FspNB-VN và

FspCB-VN được trình bày ởhình 3.6.

Hình 3.6. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR của gen cox1 với cặp mồi

FSP12F – FGHR2.

M: Thang chỉ thị phân tử Lamda cắt bằng HindIII.

1. FspNB-VN

2. FspCB-VN

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên agarose 1%; Kết quả PCR cho

sản phẩm đúng với dự kiến (~ 1,6 kb).

Tên mẫu/loài

Quốc gia

Ký hiệu

Bảng 3.3. Các mẫu sán lá Trematoda trong Ngân hàng gen cung cấp chuỗi cox1 sử dụng so sánh đối chiếu trong nghiên cứu Số TT

Số đăng ký Ngân hàng gen

FspNB-VN

Việt Nam Nghiên cứu này

FspCB-VN

Việt Nam Nghiên cứu này

Fgig-ID

Indonesia

Lê Thanh Hòa và cs

Csin-VN

Việt Nam

Oviv-VN

Việt Nam

Fbus(human)- VN Fbus(swine)- VN

Htai-VN

Việt Nam

Ejap-VN

Việt Nam

Phet-VN

Việt Nam

Pohi-JP

Việt Nam

Lê Thanh Hòa và cs Lê Thanh Hòa và cs Lê Thanh Hòa và cs Lê Thanh Hòa và cs Lê Thanh Hòa và cs Lê Thanh Hòa và cs Lê Thanh Hòa và cs Lê Thanh Hòa và cs

KF543343

FspGLH-CN

KF543342

Fgig-CN

Sán lá gan lớn (Fasciolagigantica) dạng thuần Sán lá gan lớn (Fasciola sp) dạng lai Sán lá gan lớn (Fasciolagigantica) dạng thuần Sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis) Sán lá gan nhỏ (Opisthorchis viverrini) Sán lá ruột lớn (Fasciolopsis buski) ở người Sán lá ruột lớn(Fasciolopsis buski) ở lợn Sán lá ruột nhỏ (Haplorchis taichui) Sán lá ruột (Echinochasmus japonicus) Sán lá phổi (Paragonimus heterotremus) Sán lá phổi (Paragonimus ohirai) Fasciola sp (dạng lai - hybrid) Fasciola gigantica (dạng thuần) 14 Fasciola hepatica 15 Clonorchis sinensis

AF216697 FJ381664

Fhep-AU Csin-RU

16 Clonorchis sinensis

JF729303

Csin-CN

Trung Quốc Trung Quốc Australia Nga Trung Quốc Hàn Quốc Lào Nga

Csin-KR Oviv-LA Ofel-RU

Htai-LA

Lào

JF729304 17 Clonorchis sinensis JF739555 18 Opisthorchis viverrini EU921260 19 Opisthorchis felineus 20 Paragonimus westermani (3n) Pwes(2n)-KR Hàn Quốc AF219379 21 Haplorchis taichui KF214770 22 Paragonimus westermani(2n) Pwes(2n)-KR Hàn Quốc AF540958

Sfal-VN

Việt Nam

Sán lá ruột nhỏ (Stellantchasmus falcatus)

Lê Thanh Hòa và cs

3.3.1. Kết quả giải trình tự gen cox1 của Fasciola sp Việt Nam và so sánh với

các loài thuộc lớp sán lá Trematoda

Hai mẫu sán lá gan lớn Fasciolasp trong nghiên cứu là FspNB-VN đã được

xác định là F. gigantica dạng thuần và FspCB-VN thuộc dạng lai dựa trên cơ sở

phân tích phân biệt gen nhân ITS-2. Gen cox1 có độ dài 1542 basepair (bp) mã

hóa 513 amino acid (aa).

Gen ty thể cox1(cytochrome oxidase subunit1)của 23 mẫu thuộc lớp sán lá

Trematoda đã được thu nhận và phân tích di truyền và phả hệ, trong đó gồm 3

mẫu sán lá gan lớn Fasciola:FspCB-VN (dạng lai); F. gigantica dạng thuần

FspNB-VN của Việt Nam và Fgig-ID của Indonesia; ngoài ra 9 mẫu có gen cox1

khác loài trong cùng lớp sán lá của một nhóm nghiên cứu khác (Lê Thanh Hòa và

cs) cũng được đưa vào so sánh cùng với FspNB-VN và FspCB-VN.

Để có tầm nhìn toàn diện tổng thể về mối quan hệ giữa các loài trong lớp

sán lá Trematoda của 23 mẫu, bao gồm: 2 mẫu FspCB-VN (dạng lai); FspNB-VN

dạng thuần của F. gigantica; 07 mẫu sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis (Csin-

VN) và Opisthorchis viverrini (Oviv-VN); 2 mẫu sán lá ruột Fascioplopsis buski

(Fbus(hu)-VN và Fbus(sw)-VN); 4 mẫu sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui (Htai-

VN); sán lá ruột Stellantchasmus falcatus (Sfal-VN); 1 mẫu sán lá ruột

Echinochasmus japonicus (Ejap-VN); 4 mẫu sán lá phổi Paragonimus

heterotremus (Phet-VN); P. ohirai (Pohi-JP). So sánh trình tự nucleotide của 23

mẫu cho thấy chuỗi gen cox1 có độ dài từ 1533-1560 bp, mã hóa 510-519 amino

acid, tùy loài (Hình 3.7).

Kết quả ởhình 3. 7cũng chỉ ra rằng: nhóm các mẫu Fasciolasp có rất ít sai

khác về thành phần amino acid giữa mẫu thuộc dạng lai của Việt Nam (FspCB-

VN)với mẫu của Trung Quốc (FspGHL-CN) cũng như giữa F. gigantica dạng

thuần Việt Nam với Indonesia và Trung Quốc.Như vậy, gen cox1 của Fasciola sp

(dạng lai) vẫn thuộc về F. gigantica. Tuy nhiên, có những vị trí mà amino acid

của Fasciola sp dạng lai của Việt Nam (FspCB-VN) và Trung Quốc (FspGHL-

CN) giống hoàn toàn với F. hepatica Fh-Aus (Australia) nhưng sai khác hoàn toàn

với F. gigantica dạng thuần của Việt Nam (FspNB-VN) và dạng thuần của

Indonesia (Fgig-ID) và Trung Quốc (Fgig-CN), cụ thể tại các vị trí: V35I;

M83L;G327S; I336V; R480C; N487S (Hình 3.7).

Trình tự 23 chuỗi amino acid suy diễn của gen cox1 được trình bày ởhình 3.7.

Kết quả cho thấy chuỗi polypeptide của gen cox1 trong cùng loài F. gigantica

có một số vị trí sai khác: V36I; M83L; G327S; T336V; Tại vị trí 445 có 1 amino acid

của Fasciolidae bị xóa (delete), tương tự ở Parogominidae cũng bị xóa 1 amino acid

tại vị trí này; tại vị trí 452 của Opithorchidae (bao gồm cả 2 loài Clonorchis sinensis

và Opithorchis sp) cũng bị xóa đi 1 amino acid (Hình 3.7).

g n ơ ư t

- -

a d o t a m e r T

- -

d i c d a i o c a n i o m n a i m ó a c ó g c n ô g h n k ô h ó k đ ó í r đ t ị í v r t i ị ạ v t i n ạ ê t l n i e ó l n i ó ) - n ( ) g - n ( a u g ấ n d h ; g c n ạ g ú h u c ấ d a ủ ; c g n u ú ệ h i h c ý a ủ k c i á u c ệ i ữ h h ý c k c á i á c c g ữ n h ằ c b c ị h á c t u g ể n i ằ b b c ị ợ h ư t đ u ể d i i b c a c ợ o ư n i đ m d a i c a

ì

o n i m a

a d o t a m e r T

á á l l n n á á s s p p ớ ớ l l c c ộ ộ u u h h t t 1 1 x x o o c c n n e e g g i i ỗ ỗ u u h h c c c c á á c c i i ớ ớ v v h h n n á á s s o o s s N N V V B B C C p p s s F F à à v v N N V V B B N N p p s s F F a a ủ ủ c c n n ễ ễ i i d d y y u u s s d d i i c c a a o o n n i i m m a a ự ự t t h h n n ì ì r r T T . . 7 0 . 1 3 . 3 h n h ì n H H

g n ứ

ề ề v v c c á á h h k k i i a a s s ự ự S S . . a a c c i i t t n n a a g g i i g g F. F. i i à à o o l l c c ộ ộ u u h h t t N N V V B B N N p p s s F F u u ẫ ẫ m m a a ủ ủ c c g g n n ứ ứ g g n n ơ ơ ư ư t t d d i i c c a a o o n n i i m m a a ự ự t t h h n n ì ì r r t t c c á á c c i i ớ ớ v v g g n n ố ố i i g g ị ị h h t t u u ể ể i i b b ) ) . . ( ( u u ấ ấ D D : : ú ú h h c c i i h h G G

Như vậy, gen cox1 của Fasciola sp dạng lai, mặc dù có thành phần amino

acid khác với loài F. hepatica, nhưng cũng không giống hoàn toàn với F.

gigantica (dạng thuần) mà có cơ sở để tạo nên một phân nhóm trung gian giữa F.

gigantica và F. hepatica, tạo nên một khả năng thuộc loài trung gian như nhận

định của một số nghiên cứu gần đây [47], [63].

Bảng 3.4. Tỷ lệ tương đồng trình tự amino acid gen cox1của các loài sán lá

thuộc lớp Trematoda.

1

2

3

4

5

6

7

11

12

13

14

15

16

17

18

20

21

22

23

8

9

10

19

1

2

3

4

5

6

100

7

8

9

100

10

11

12

13

14

15

16

17

18

100

19

20

21

22

23

Ghi chú:1. FspNB-VN; 2. FspCB-VN; 3. Fgig-CN; 4. Fgig-ID; 5. Fsp-GHL-CN; 6.

Fhep-AU; 7. Fbus(hu)-VN 8. Fbus(sw)-VN; 9. Csin-CN; 10. Csin-KR; 11. Csin-RU;

12. Csin-VN; 13. Oviv-VN; 14. Oviv-LA; 15. Ofel-RU; 16. Phet-VN; 17. Pohi-JP;

18. Pwes(2n)-KR; 19. Pwes(3n)-KR; 20. Ejap-VN; 21. Htai-LA; 22. Htai-VN; 23.

Sfal-VN.

Kết quả ởbảng 3.4 cho thấy:

Đối với nhóm sán lá gan lớn Fasciola sp, hai mẫu FspNB-VN và FspCB-

VN có tỷ lệ tương đồng amino acid so với các mẫu của Fasciola của Trung Quốc,

Indonesia là 97 - 99% và so với F. hepatica của Australia là 93%. Nhóm sán lá

ruột Fasciolopsis buski có 2 mẫu của Việt Nam(Fbus(hu)-VN và Fbus(sw)-

VNcógen cox1rất bảo tồn trong cùng nhóm và không phụ thuộc vào đối tượng ký

chủ là động vật hay ở người, tỷ lệ tương đồng là 100%. Nhóm sán lá gan nhỏ

Clonorchis và Opisthorchis thì Csin-VN(Việt Nam)có tỷ lệ tương đồngvới Csin-

CN (Trung Quốc) và Csin-KR (Hàn Quốc) là 99%. Nhóm sán lá phổi

Paragonimus gồm hai mẫu Phet-VN (Việt Nam) và Pohi-JP (Nhật Bản) có tỷ lệ

tương đồng trong nhóm là 96%. Nhóm sán lá ruột nhỏ có mẫu Htai-VN so với

mẫu Htai-LA (Lào) tương đồng là 99%.

Mẫu sán lá ruột là Ejap-VN (Việt Nam) có tỷ lệ tương đồng 77-78% so với

nhóm Fasciolavà 71-73% so với H. taichui; mẫu Stellantchasmus falcatus (Sfal-

VN, Việt Nam) tỷ lệ tương đồng là 83% so với các mẫu thuộc sán lá ruột nhỏ (H.

taichui) do chúng cùng trong họ Heterophyidae.

Như vậy, qua phân tích kết quả ởbảng 3.3 thấy rằng tỷ lệ tương đồng

giữa các loài trong cùng họ là rất cao (98-100%); nhưng khác họ là thấp hơn

nhiều (thậm chí chỉ ở mức 66%, giữa họ Fasciolidae với họ Opisthorchiidae)

(Bảng 3.3).

3.3.2. Xây dựng mối quan hệ phả hệ giữa các loài thuộc lớp sán lá

Cây phả hệ xây dựng dựa trên trình tự amino acid của 23 chuỗi gen cox1 của

các loài thuộc lớp sán lá Trematoda có xuất xứ từ Việt Nam, Trung Quốc, Nga, Hàn

Quốc, Nhật Bản, Lào, Indonesia và Australia, được trình bày ởhình 3.8.

Kết quả cho thấy, có 5 nhóm được phân định thuộc vào các họ: Fasciolidae;

Opisthorchiidae; Heterophyidae; Echinostomatidae và Paragonimidae (Hình 3.8):

1- Nhóm thuộc họ Fasciolidae: hai mẫu sán lá gan lớn Fasciola sp của Việt

Nam trong nghiên cứu là FspCB-VN và FspNB-VN trong đó, có hai phân nhóm

gồm: i) Mẫu FspCB-VN cùng nhánh với FspGHL-CN (dạng lai) của Trung Quốc

[50]; ii) Mẫu FspNB-VN cùng nhánh với F. gigantica dạng thuần của Trung Quốc

(mẫu Fgig-CN) và Indonesia (Fgig-ID); iii) Mẫu Fhep-AU (F. hepatica,

Australia) tạo nên một nhánh riêng biệt.

2- Nhóm thuộc họ Opisthorchiidae, gồm phân nhóm sán lá gan nhỏ

Clonorchissinensis (Csin-VN) cùng nhóm với các mẫu của Trung Quốc (Csin-

CN); Hàn Quốc (Csin-KR); Nga (Csin-RU) và phân nhóm Opisthorchis viveriini

(mẫu Oviv-VN, Việt Nam; Oviv-LA, Lào). Mẫu Ofel-RU thuộc loài Opisthorchis

felineus tạo thành nhánh riêng với các phân nhóm trên.

3- Nhóm sán lá ruột nhỏ thuộc họ Heterophyidae bao gồm Haplorchis

taichui (mẫu Việt Nam, Htai-VN và mẫu Lào, Htai-LA) cùng với một mẫu của

loài Stellantchasmus falcatus (Sfal-VN).

Hình 3.8. Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ về loài giữa các mẫu sán lá dựa trên thành phần amino acid của gen cox1 bằng chương trình MEGA6. Ký hiệu (●) là mẫu Fasciola được sử dụng trong nghiên cứu này.

4- Nhóm các mẫu sán lá phổi bao gồm Paragonimus heterotremus (Phet-

VN) cùng hợp thành một nhóm với P. westermani của Hàn Quốc (mẫu Pwes(2n)-

KRvà Pwes(3n)-KR) và P. ohirai (mẫu Pohi-JP) của Nhật Bản, thuộc họ

Paragonimidae.

5-Mẫu Ejap-VN của loài Echinochasmus japonicus (họ Echinostomatidae)

đứng thành một nhánh riêng, nhưng rất gần với các loài thuộc họ Fasciolidae

Sán lá gan lớn thuộc giống Fasciola ở Việt Nam từ trước đến nay đã được

xác định là Fasciola gigantica, tuy nhiên, một số cá thể có hình thái giống F.

hepatica (F. hepatica – like) trong đó gen ITS-2 của hệ gen nhân giống với F.

hepatica còn hệ gen ty thể lại giống với F. gigantica, dẫn đến phát hiện có sự lai

chéo loài trong tự nhiên giữa F. hepatica và F. gigantica [46], [47], [55].

Trong nghiên cứu chúng tôi cũng đã phát hiện mẫu FspCB-VN tại Cao Bằng

là mẫu sán lá gan thuộc dạng lai (hybrid form). Điều này cũng là minh chứng một

lần nữa khẳng định trong quần thể sán lá gan lớn tại Việt Nam chắc chắn đã có sự

hiện diện và tồn tại “nguồn gốc thủy tổ” của F. hepatica từ trước đây. Cần có thêm

các nghiên cứu giải trình tự về các gen/toàn bộ hệ gen của con lai để xem xét, phân

tích về khoảng cách di truyền và mức độ tiến hóa loài của loài này.

BÀN LUẬN CHUNG

Gen ITS-2: Sử dụng chỉ thị di truyền vùng giao gen ITS-2 cùng với gen

28S (thuộc hệ gen nhân) và gen cox1 (thuộc hệ gen ty thể) trong thẩm định loài

bằng sinh học phân tử đối với sán lá gan lớn gây bệnh ở trâu (FspNB-VN) và bò

(FspCB-VN) đã được thực hiện. Kết quả cho thấy ở cả hai mẫu trong nghiên cứu

có gen cox1 (ty thể) không biến đổi và được di truyền theo dòng mẹ F. gigantica,

trong khi đó vùng giao gen ITS-2 (nhân) đã phân ra hai loại mới: loại trung gian

giống như F. gigantica like và loại trung gian giống như F. hepatica like dựa trên

biến đổi các nucleotide ở 7 vị trí của vùng giao gen ITS-2. Tại vị trí 327 ở vùng

giao gen ITS-2 có giá trị phân biệt dòng bố và tính lai ngoại loài (và lai chéo

ngược) giữa F. hepatica và F. gigantica.

Đối với 2 mẫu FspCB-VN và FspNB-VN, khi so sánh với các chủng khác

được phân lập trên trâu, bò, dê, cừu và người cho thấy: FspNB-VN thuộc F.

gigantica, còn mẫu FspCB-VN thuộc dạng lai giữa (F. gigantica x F. hepatica), kích

thước gen ITS-2 của FspCB-VN là 362 nucleotide và có thêm nucleotide T (Thymin)

ở vị trí 327. Xét về phân loại theo hình thái học (Hình 3.1.1), sán lá gan trưởng thành

FspCB-VN có hình dạng giống F.hepatica. Chủng này được kết luận là F.gigantica

lai với F.hepatica, trong đó: F.gigantica thuộc dòng mẹ và F. hepatica thuộc dòng

bố. Điều này khẳng định rõ ràng rằng F.hepatica đã xuất hiện trong quần thể sán lá

gan Việt Nam tạo khởi đầu cho tiến hóa lai với F. gigantica.

Khi sử dụng ITS-2 xây dựng cây phả hệ cũng chia làm hai nhóm: Nhóm

thứ nhất là F. gigantica và F. gigantica-like, trong đó gồm các chủng thuần nhất

F.gigantica của Việt Nam và thế giới, nhóm thứ hai là F. hepatica và F. hepatica-

like, trong đó có các chủng thuần nhất và các chủng không thuần nhất có hiện

tượng của loài lai (hybrid). Những chủng không thuần nhất này có hệ gen ty thể

thuộc loài F. gigantica. Các chủng này mang hệ gen nhân của loài F. hepatica và

hệ gen ty thể của F. gigantica. Mặc dù có thể chúng ta chưa biết đã xảy ra bao

nhiêu thế hệ lai nhưng rõ ràng đã có sự tái tổ hợp gen nhân của dòng bố F. hepatica

với hệ gen ty thể của dòng mẹ F. gigantica, và dòng lai này cứ thế lai tiếp với F.

gigantica cung cấp ty thể dòng mẹ.

Đối với gen 28S:Một phần gen 28S ribosome (~1000 bp) của 2 mẫu sán lá

gan lớn Fasciola sp (FspNB-VN và FspCB-VN) đã được giải trình tự và so sánh

với các gen 28S tương ứng của F. hepatica vàF. gigantica cùng một số loài thuộc

họ Fasciolidae,bao gồm:F. jacksoni, Fasciolopsis buski và Fascioloides magna, có

trong Ngân hàng gen. Phân tích phả hệ gen 28S cho thấy:

- Mẫu là FspCB-VN nằm trong nhóm của F. hepatica cùng với mẫu của

Equador là FspEQO; mẫu của Ai Cập là FhepEG (số đăng ký: EU025874) và mẫu

của Arab Saudi FhepSA (số đăng ký: AY222244); mẫu FhBe (Bỉ); FhAus (Úc) và.

- Mẫu FspNB-VN (F. gigantica) có quan hệ gần với FgigTH (F. gigantica,

số đăng ký: HM004190).

- Việc phát hiện FspCB gần với F. hepatica cần được nghiên cứu thêm để

phân định đặc tính và làm sáng tỏ về loài của mẫu này.

Gen ty thể cox1: Sử dụng đơn thuần một phần của gen ty thể là chuỗi gen

cox1 (~ 1,6 kb) dựa trên trình tự nucleotide xây dựng cây phả hệ cũng được chia

làm hai nhóm: một nhóm thuần nhất của F. hepatica và một nhóm bao gồm tất cả

các chủng F. gigantica và F. gigantica-like, trong đó có các chủng của Việt Nam.

Điều này chứng tỏ, tất cả các chủng này, bất luận dạng thuần hay dạng lai đều có

hệ gen ty thể thuộc loài F. gigantica di truyền dòng mẹ. Dạng trung gian này xuất

hiện ởcảmẫu sán thu được trâu, bò và trên người. Đây là một bằng chứng cho dạng

gen lai giữa 2 loại sán lá gan lớn tại Việt Nam cũng như Đông Nam Á. Điều này,

góp phần giải thích cơ chế gây bệnh sán lá gan lớn trên người của Việt Nam

và Đông Nam Á có những nét đặc trưng không giống như các vùng khác trên thế

giới. Đây chính là một sự đa dạng sinh học và phức tạp của các loài ký sinh trùng

truyền lây từ động vật sang người [2].

Như vậy chứng tỏ đã có sự tạo dòng lai ngoại loài (introgressive

hybridization) hay lai chéo ngược, trong dân gian còn gọi là hiện tượng "lại giống"

ở động vật mà một số dòng lai và dòng thuần F. gigantica đều có khả năng tìm

kiếm thích ứng và gây bệnh trên người.

Lai chéo loài ở Fasciolasp đã được phát hiện nhiều nơi trên thế giới và ghi

nhận như một hiện tượng tự nhiên giữa hai loài F. hepatica và F. gigantica tạo ra

dạng trung gian (hybrid form/intermediate forms) [24], [26], [50], [63], [64] và

đây cũng là hiện tượng tiến hóa rất phổ biến trong lớp Trematoda với những dẫn

chứng cụ thể ở loài sán máng Schistosoma[36], [59], sán lá phổi Paragonimus

[30]; hoặc ở các loài sán dây Taenia thuộc lớp Cestoda [57]. Vấn đề là ở chỗ,

trong dạng lai giữa hai loài, loài nào cho hệ gen nhân và loài nào cho hệ gen ty

thể.

Đối với Fasciola sp. dạng lai, cho đến nay, hệ gen ty thể của chúng có thành

phần giống với F. gigantica [26], [47], [55], [63] cũng như khẳng định của kết

quả nghiên cứu sử dụng gen cox1 được trình bày trong nghiên cứu này.

Lai ngoại loài là hiện tượng tiến hóa bất thường chỉ gặp ở lớp sán lá

(Trematoda) nói chung và như vậy kết quả của chúng tôi cũng đã minh có dòng

lai giữa { F.gigantica (bố)- F.gigantica (mẹ)} trong loài sán lá gan lớn gây bệnh

trên gia súc (trâu, bò) ở Việt Nam.

Đây là vấn đề hiện nay đang cần được các nhà khoa học trong nước và trên

thế giới quan tâm xem xét và có những nghiên cứu tiếp theo một cách sâu sắc có

hệ thống hơn.

KẾT LUẬN

1) Gen ITS-2 đã được sử dụng làm chỉ thị phân tử để phân biệt 2 mẫu

Fasciola sp: trong đó mẫu FspNB-VN (Ninh Bình) thuộc Fasciola gigangtica;

mẫu FspCB-VN thuộc dạng lai (hybrid form)

2) Gen 28S của 2 mẫu Fasciola.spp thu tại Việt Nam (FspNB-VN và FspCB-

VN) đã được giải trình tự và phân tích mối quan hệ phả hệ. Chỉ thị phân tử của gen

28S cũng cho thấy quần thể Fasciola spp tại Việt Nam có hai nhóm thuộc F.

gigantica và F. hepatica, trong đó có mẫu FspCB-VN có khả năng thuộc F. hepatica.

3) Gen cox1 của 02 mẫu sán lá gan lớn FspNB-VN và FspCB-VN đã được

giải trình tự. Kích thước của gen cox1 là 1542 nucleotide, mã hóa 513 amino

acid.Tỷ lệ tương đồng amino acid gen cox1của Fasciola sp trong cùng một loài

có sự bảo tồn cao từ 97 - 99%.

Sự đa dạng trong quần thể Fasciola sp cần được nghiên cứu thêm về quan

hệ loài nhằm làm sáng tỏ sán lá gan lớn gây bệnh trên người và động vật để có

biện pháp phòng chống và điều trị bệnh chính xác và phù hợp.

KIẾN NGHỊ

Cần tiếp tục giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể của FspCB-VN và thu thập

thêm các mẫu sán lá gan lớn tại Việt Nam trên các đối tượng vật chủ khác nhau

để có thể xác định tính lai chéo tự nhiên trong quần thể sán lá gan lớn và xây dựng

mô hình tiến hóa theo vùng địa lý hoặc địa danh phân bố ở Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyễn Quốc Doanh, Lê Thanh Hoà (2006), “Một số đặc điểm hình thái và phân

tử của sán lá gan (Fasciola spp) ở bò của tỉnh Nghệ An và Cao Bằng”, Tạp chí

Khoa học kỹ thuật Thú y, 13(5), tr. 59 - 67.

2. Trần Thanh Dương, Nguyễn Thu Hương, Nguyễn Thị Hương Bình (2013), “Dạng

lai trong mẫu sán lá gan lớn trên trâu bò và người tại Quảng Ngãi”, Tạp chí Y học

thực hành,(1), tr. 48 - 52.

3. Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hoà (2004), “Xác định thành phần loài SLGL trên

người Việt Nam từ trứng phân lập trong phân người bằng phương pháp phân tử

hệ gen ty thể”, Tạp chí Y học thực hành, 463(7), tr. 42 - 46.

4. Nguyễn Văn Đề, Đỗ Tuấn Anh (2011), “Nhiễm sán lá gan lớn trên nhóm bệnh

nhân được chẩn đoán là “u gan” tại các bệnh viện Hà Nội 2006-2010”, Tạp chí Y

học Thực hành, (8), tr. 169 - 171.

5. Nguyễn Văn Đề (2012), “Cập nhật bệnh ký sinh trùng ở Việt Nam”, Hội nghị

khoa học quốc tế Mekong Health III – Kỷ niệm 110 năm thành lập Trường Đại

học Y Hà Nội, tr. 9 - 12.

6. Lê Thanh Hoà, Nguyễn Văn Đề (2002), “Xác định SLGL (Fasciola gigantica) ở

Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử hệ gen ty thể sử dụng gen nad1

(nicotinamide dehydrogenase subunit 1)”, Tạp chí phòng chống sốt rét và các

bệnh ký sinh trùng, (3), tr. 41 - 48.

7. Lê Thanh Hòa (2007), “Chỉ thị di truyền phân tử sử dụng trong giám định, chẩn

đoán, phân loại, phả hệ, dịch tễ học và di truyền quần thể ký sinh trùng”, Tạp chí

Y học thành phố Hồ Chí Minh, (11), tr. 9 - 14.

8. Phạm Văn Khuê và Phan Lục (1996), Ký sinh trùng thú y, Nhà xuất bản nông

nghiệp Hà Nội, tr. 53 - 62.

9. Nguyễn Trọng Kim (1997), Nghiên cứu sự liên quan đến tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán

lá gan ở ốc (KCTG) với tỷ lệ nhiễm sán lá ở trâu bò (KCTC) để đánh giá tình hình

dịch tế của bệnh ở một số vùng miền Bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ nông nghiệp,

Viện khoa học kỹ thuật Việt Nam, Hà Nội.

10. Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Quang Tuyên (1999), Giáo trình ký sinh trùng thú

y, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 37 - 46.

11. Nguyễn Thị Kim Lan, Nguyễn Thị Lê, Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Văn Quang

(2008), Giáo trình ký sinh trùng học thú y, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội,

tr. 103 - 110.

12. Phan Địch Lân (1985), “Những nghiên cứu về sán lá gan và bệnh sán lá gan ở

trâu bò ở nước ta”, Khoa học kỹ thuật thú y, (6), tr. 29 – 32.

13. Phan Địch Lân (1994, 2004), Bệnh ngã nước trâu bò, Nhà xuất bản nông nghiệp

Hà Nội, tr. 5 - 55.

14. Đoàn Văn Phúc, Nguyễn Thị Hiền Thảo, Vũ Thị Thận (1980), “Dùng Dertil cho

uống tẩy sán lá gan trâu Việt Nam”, Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú

y (1968 – 1978), Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội.

15. Đoàn Văn Phúc, Vương Đức Chất, Dương Thanh Hà (1995), “Kết quả điều tra

nhiễm sán lá gan trâu, bò khu vực Hà Nội và ứng dụng điều trị”, Công nghiệp và

nông nghiệp thực phẩm, Tạp chí khoa học công nghệ và QLKT, Hà Nội.

16. Huỳnh Hồng Quang, Nguyễn Văn Khá (2008), “Bệnh SLGL trẻ em: đặc điểm lâm

sàng, cận lâm sàng và hiệu quả phác đồ điều trị Triclabendazole tại khu vực miền

Trung-Tây Nguyên, 2005-2007”, Tạp chí y dược học quân sự, 33(2), tr. 59 - 66.

17. Huỳnh Hồng Quang, Nguyễn Văn Văn (2011), “SLGL lạc chỗ ở người: Báo cáo

loạt ca bệnh và tổng hợp y văn thế giới và Việt Nam 2000-2011, Công trình

NCKH về bệnh truyền nhiễm và HIV/AIDS giai đoạn 2009 – 2011”, Tạp chí Y

học thực hành số 781-2011, ISSN 1859 - 1663, Bộ Y tế xuất bản, tr.118-123.

18. Phạm Văn Thân, Huỳnh Hồng Quang (2007), “Đặc điểm sinh học và vài nét về

dịch tễ học bệnh SLGL (Fasciola hepatica và Fasciola gigantica)”, Tạp chí y học

thực hành thành phố Hồ Chí Minh, (11), tr.2 - 6.

19. Đặng Tất Thế, Lê Quang Hùng, Cao Văn Viên (2003), “Định loại sán lá gan lớn

(giống Fasciola) ở người và gia súc bằng chỉ thị DNA”, Tạp chí Sinh học, 25(4),

tr. 47 - 52.

20. Trịnh Văn Thịnh (1963), Ký sinh trùng thú y, Nhà xuất bản nông thôn, Hà Nội, tr.

281 – 292.

21. Trịnh Văn Thịnh, Đỗ Dương Thái (1978), Công trình nghiên cứu ký sinh trùng

thú y ở Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, (2).

22. Lương Thị Tố Thu, Bùi Khánh Linh (1996), “Tình hình nhiễm sán lá gan

(Fasciola) và kết quả thử nghiệm Fasinex tẩy sán lá gan cho trâu bò”, Tạp chí

khoa học kỹ thuật thú y, 3(1), tr. 74 – 81.

Tiếng Anh

23. Adlard RD, Barker SC, Blair D, Cribb TH, (1993), “Comparison of the second

internal transcribed spacer (ribosomal DNA) from populations and species of

Fasciolidae (Digenea)”, Int J Parasitol, 23, pp. 423-425.

24. Agatsuma T, Arakawa Y, Iwagami M, Honzako Y, Cahuaningsin U, Kang SY,

Hong SJ(2000), “Molecular evidence of natural hybridization between”, Fasciola

hepatica and F. Gigantica, Parasitol Int, 49, pp. 231-238.

25. Amer S, Dar Y, Ichikawa M, Fukuda Y, Tada C, Itagaki T, Nakai Y (2011),

“Identification of Fasciola species isolated from Egypt based on sequence

analysis of genomic (ITS1 and ITS2) and mitochondrial (NDI and COI) gene

markers”, Parasitol Int, 60(1), pp. 5 - 12.

26. Amor N, Halajian A, Farjallah S, Merella P, Said K, Ben Slimane B (2011),

“Molecular characterization of Fasciola spp. from the endemic area of northern

Iran based on nuclear ribosomal DNA sequences”, Exp Parasitol,128(3), pp.

196-204.

27. Blair D, Agatsuma T, Watanobe T, Okamoto M and Ito A (1997), “Geographical

genetic structure within the human lung fluke”, Paragonimus westermani,

detected from DNA Sequences, Parasitology, 115, pp. 411-417.

28. Boore JL (1999), “Animal mitochondrial genomes”, Nucleic Acids Res, 27(8),

pp. 1767-1178.

29. Dang TT, Nawa Y (2005), “Fasciola and Fascioliasis in Vietnam”, Asian

Parasitol, 1, pp. 57 - 60.

30. Doanh PN, Guo Z, Nonaka N, Horii Y, Nawa Y (2013), “Natural hybridization

between Paragonimus bangkokensis and Paragonimus harinasutai”, Parasitol

Int,62(3), pp. 240-245.

31. Fritzscha G, Schjegel M, Stadler PF (2006), “Alignments of mitochondrial

genome arrangements: applications to metazoan phylogeny”, J Theor Biol, 21,

240(4), pp. 511-520.

32. Guarro J, GenéJ, Stchigel AM (1999), “Review: Developments in fungal

taxonomy”, Clin Microbiol Rev, 12(3), pp. 454-500.

33. Hashimoto KT, WatanobeC, Liu CX, Init I, Blair D, Ohnishi S, Agatsuma T (1997),

“Mitochondrial DNA and nuclear DNA indicate that the Japanese Fasciola species

is F. gigantica”, Parasitol Res, 83, pp. 220-225.

34. Hu M, Gasser RB (2006), “Mitochondrial genomes of parasitic nematodes-

progress and perspectives”, Trends Parasitol, 22(2), pp. 78-84.

35. Huang YW, He B, Wang CR, Zhu XQ (2004), “Characterisation of Fasciola

species from Mainland China by ITS-2 ribosomal DNA sequence”, Vet

Parasitol, 120, pp. 75–83.

36. Huyse T, Van den Broeck F, Hellemans B, Volckaert FA, Polman K (2013),

“Hybridisation between the two major African schistosome species of humans”,

Int J Parasitol,43(8), pp. 687-689.

37. Itagaki T and Tsutsumi KI (1998), “Triploid form of Fasciola in Japan: genetic

relationships between Fasciola hepatica and Fasciola gigantica determined by

ITS-2 sequence of nuclear rDNA”, International Journal for Parasitology, 28,

pp. 777-781.

38. Itagaki T, Kikawa M, Sakaguchi K, Shimo J, Terasaki K, Shibahara T and

Fukuda K (2005), “Genetic characterization of parthenogenetic Fasciola sp. in

Japan on the basis of the sequences of ribosomal and mitochondrial DNA”,

Parasitolology, 131, pp. 679-685.

39. Itagaki T, Sakaguchi K, Terasaki K, Sasaki O, Yoshihara S, Van Dung T (2009),

“Occurrence of spermic diploid and aspermic triploid forms of Fasciola in

Vietnam and their molecular characterization based on nuclear and

mitochondrial DNA”, Parasitol Int, 58, pp. 81-85.

40. Jogen Hansen and Brian perry (1994), The epidemiology, diagnosis and control

of Helminth parasites of Ruminants, Hand bock, pp. 32 - 33.

41. Kaufmann J (1996), Parasitic infection of domestic animal, Birkhauser verlag,

Basel, Boston, Berlin, pp. 90 – 94.

42. Kramer F, Schnieder T (1998), “Sequence heterogeneity in a repetitive DNA

element of Fasciola”, Int J Parasitol, 28(12), pp. 1923-1929.

43. Le TH, Blair D and McManus DP (2002), “Mitochondrial genomes of parasitic

flatworms”, Trends in Parasitology, 18, pp. 206-213.

44. Le TH, Blair D, McManus DP (2000a), “Mitochondrial genomes of human

helminths and their use as markers in population genetics and phylogeny”, Acta

Tropica, 77(3), p. 243-256.

45. Le TH, Blair D, McManus DP (2001), “Complete DNA sequence and gene

organization of the mitochondrial genome of the liver fuke, Fasciolahepatica L.

(Platyhelminthes; Trematoda)”, Parasitology, 123(6), pp. 609-621.

46. Le TH, De NV, Agatsuma T, Blair D, Vercruysse J, Dorny P, Nguyen TGT, and

McManus DP (2007), “Molecular confirmation that Fasciola gigantica can

undertake aberrant migrations in human hosts”, Journal of Clinical

Microbiology, 45(2), pp. 648 – 650.

47. Le TH, Van De N, Agatsuma T, Nguyen TGT, Nguyen QD, McManus DP and

Blair D (2008), “Human fascioliasis and the presence of hybrid/ introgressed

forms of Fasciola hepatica and Fasciola gigantica in Vietnam”, Int J Parasitol,

38, pp. 725 – 730.

48. Le TH, Blair D, Agatsuma T, Humair PF, Campbell NJ, Iwagami M, Littlewood,

DT, Peacock B, Johnston DA, Bartley J, Rollinson D, Herniou EA, Zarlenga DS

and McManus DP (2000b), “Phylogenies inferred from mitochondrial gene

orders-a cautionary tale from the parasitic flatworms”, Mol Biol Evol,17(7), pp.

1123-1125.

49. Liu F, Chen P, Cui SJ, Wang ZQ, Han ZG (2008), “SjTPdb: integrated

transcriptome and proteome database and analysis platform for Schistosoma

japonicum”, BMC Genomics,9, pp. 304.

50. Liu GH, Gasser RB, Young ND, Song HQ, Ai L. and Zhu XQ (2014), “Complete

mitochondrial genomes of the ‘intermediate form’ of Fasciola and Fasciola

gigantica, and their comparison with F. hepatica”, Parasites & Vectors, 7, pp.

150.

51. Lotfy WM, Brant SV, DeJong RJ, Le TH, Demiaszkiewicz A, et al (2008),

“Evolutionary origins, diversification, and biogeography of liver flukes

(Digenea, Fasciolidae)”, Am J Trop Med Hyg,79, pp. 248–255.

52. Mas-Coma S, Valero MA, Bargues MD (2009), “Fasciola, lymnaeids and human

fascioliasis with a global overview on disease transmission, epidemiology,

evolutionary genectics, molecular epidemiology and control”, Adv Parasitol, 69,

pp. 41-146.

53. Nguyen ST, Nguyen DT, Van Nguyen T, Huynh VV, Le DQ, Fukuda Y, Nakai

Y (2012), “Prevalence of Fasciola in cattle and of its intermediate host Lymnaea

snails in central Vietnam”, Trop Anim Health Prod, 44(8), pp. 1847-1853.

54. Nguyen TG, Le TH, Dao TH, Tran TL, Praet N, Speybroeck N, Vercruysse J,

Dorny P (2011), “Bovine fasciolosis in the human fasciolosis hyperendemic

Binh Dinh province in Central Vietnam”, Acta Trop,117(1), pp. 19-22.

55. Nguyen TGT, De NV, Vercruysse J, Dorny P, Le TH (2009), “Genotypic characterization

and species identification of Fasciola spp. with implications regarding the

isolatesinfecting goats in Vietnam”, Exp Parasitol, 123, pp. 354-361.

56. Nicholas KB anh HB Nicholas (1999), GeneDoc: a tool for editing and

annotating multiple sequence aglignments, Distributed by authors.

57. Okamoto M, Nakao M, Blair D, Anantaphruti MT, Waikagul J, Ito A (2010),

“Evidence of hybridization between Taenia saginata and Taenia asiatica”,

Parasitol Int, 59(1), pp. 70-74.

58. Soulsby EJL (1982), Helminth, Arthropod an protozoa of domestic animal, lea,

Febiger – Philadelphia, pp. 40 – 71.

59. Steinauer ML, Hanelt B, Mwangi IN, Maina GM, Agola LE, Kinuthia JM,

Mutuku MW, Mungai BN, Wilson WD, Mkoji GM, Loker ES

(2008),“Introgressive hybridization of human and rodent schistosome parasites

in western Kenya”, Mol Ecol,17(23), pp. 5062-5074.

60. Szymanski M, Barciszewska MZ, Barciszewski J, and ErdmannVA(2000), “5S

ribosomal RNA database Y2K”, Nucleic Acids Res, 28, pp. 166 – 167.

61. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, and Kumar S (2013),“MEGA6:

Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0”, Mol Biol Evol, 30, pp.

2725-2729.

62. Van de peer Y, Chapelle S, De Wachter R (1996), “A quantitative map of

nucleotide substitution rates in bacterial rRNA”, Nucleic Acids Res,24(17), pp.

3381-3391.

63. Walker SM, Prodöhl PA, Hoey EM, Fairweather I, Hanna RE, Brennan G,

Trudgett A(2012), “Substantial genetic divergence between morphologically

indistinguishable populations of Fasciola suggests the possibility of cryptic

speciation”, Int J Parasitol,42(13-14), pp. 1193-1199.

64. Wannasan A, Khositharattanakool P, Chaiwong P, Piangjai S, Uparanukraw P,

Morakote N (2014), “Identification of Fasciola species based on mitochondrial

and nuclear DNA reveals the co-existence of intermediate Fasciola and Fasciola

gigantica in Thailand”, Exp Parasitol,146, pp. 64-70.

65. Xuan Le T, Hung NT, Waikagul J (2005), “Cutaneous fascioliasis: a case report

in Vietnam”, Am J Trop Med Hyg, 72(5), pp. 508 - 509.

66. Zarowiecki MZ, Huyse T, Littlewood DT (2007), “Making the most of

mitochondrial genomes-markers for phylogeny,molecular ecology and barcodes

in Schistosoma (Platyhelminthes: Digenea)”, Int J Parasitol, 37(12), pp. 1401-

18.

Tài liệu dịch

67. Skrjabin KI và Petrov AM (1977), Nguyên lý môn giun tròn thú y, Bùi Lập và

Đoàn Thị Băng Tâm dịch từ nguyên bản tiếng Nga, Nhà xuất bản khoa học và

kỹ thuật, Hà Nội, (1), tr. 56 – 57.

Tài liệu từ mạng internet

68. Hồ Việt Mỹ, Lê Quang Hùng, Trần Thị Kim Dung, Đặng Tất Thế (2000),

http://www.dostbinhdinh.org.vn/kyYeu/KyyeuSTKT1997-

2007/Giaidoan2002-2003/P101 - 102.htm

69. http://iranhelminthparasites.com/species/fasciola.htm

70. Sách “Ký sinh trùng và côn trùng y học, Học viện Quân y, 2008

71. www.dpd.cdc.gov/dpdx và Viện sốt rét kí sinh trùng và côn trùng Trung ương

PHỤ LỤC

Phụ lục 1.Trình tự nucleotide gen 28S * 20 * 40 * 60 * FspNB-VN : AATGAGGGTGAAAAGCCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCCAGTATCTTCCTGAGCAGACCTTGGAGTCGG : 75 FspCB-VN : AATGAGGTTAAAAGCCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCCAGTATCTTCTTGAGCAGACCTTGGAGTCGGG : 75 FgigSN-AY2 : AATGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCAGTATCTTCCTGAGCGGACCTTGGAGTCGGGT : 75 FgigTH-HM0 : AATGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCAGTATCTTCCTGAGCAGACCTTGGAGTCGGGT : 75 FgigKE-EU0 : AATGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCAGTATCTTCCTGAGCGGACCTTGGAGTCGGGT : 75 FgET : AATGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCCAGTATCTTCTTGAGCGGACCTTGGAGTCGGG : 75 FgEQB : AATGAGGGTGAAAGGCCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCAGTATCTCCCTGAGCAGACCTTGGAGTCGGG : 75 FhEQB : AATGAGGGTGAAAGGCCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCCAGTATCTTCCCTGAGCAGACCTTGGAGTCG : 75 FspEQO : AATGAAGGTGAAAGGCCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGGATGGCCCAGTATCTTCCTGAGCAGACCTTGGAGTCGG : 75 FhAus : AATGAAGGGGAAAAGGCCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCCAGTATCTTCCTGAGCAGACCTTGGAGTCG : 75 FhBe : AATGAGGGTGAAAAGGCCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCCAGTATCTTCCCTGAGCAGACCTTGGAGTC : 75 FhepEG-EU0 : AATGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCAGTATCTTCCTGAGCAGACCTTGGAGTCGGGT : 75 FhepSA-AY2 : AATGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCAGTATCTTCCTGAGCAGACCTTGGAGTCGGGT : 75 FjacLK-EU0 : ATTGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCAGTATCTTCCTGAGCAGACCTTGGAGTCGGGT : 75 FmagUS-EU0 : AGTGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGATTCAGAATGGCCAGTATCTTCCTGAGCAGACCTTGGAGTCGGGT : 75 FbusVN-EU0 : AGTGAGGGTGAAAGGCCCGTGGGGGTGGAGACTCAGATTGGACAGTATCTCCCTGAGCAGACCTTGGAGTCGGGT : 75 80 * 100 * 120 * 140 * FspNB-VN : GTTGTTTGTGAATGCAGCCC-AAAGCGGGTGGTAAACTCCATCCAAAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAGC : 149 FspCB-VN : TTGTTTGTGAATGCAGCCC-AAAGCGGGTGGTAAACTCCATCCCAAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAGCG : 149 FgigSN-AY2 : TGTTTGTGAATGCAGCCC-AAAGCGGGTGGTAAACTCCATCC-AAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAGCGA : 148 FgigTH-HM0 : TGTTTGTGAATGCAGCCC-AAAGCGGGTGGTAAACTCCATCC-AAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAGCGA : 148 FgigKE-EU0 : TGTTTGTGAATGCAGCCC-AAAGCGGGTGGTAAACTCCATCC-AAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAGCGA : 148 FgET : TTGTTTGTGAATGCAGCCCAAAAGCGGGTGGTAAACTCCATCCCAAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAGCG : 150 FgEQB : TTGTTTGTGAATGCAGCCC-AAAGCGGGTGGTAAACTCCATCCCAAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAGCG : 149 FhEQB : GGTTGTTTGTGAATGCAGCCCCAAAGCGGGTGGTAAACTCCATCCCAAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAG : 150 FspEQO : GTTGTTTGTGAATGCAGCCCAAAAGCGGGTGGTAAACTCCATCCCAAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAGC : 150 FhAus : GGTTGTTTGTGAATGCAGCCCAAAAGCGGGTGGTAAACTCCATCCCAAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAG : 150 FhBe : GGGTTGTTTGTGAATGCAGCCCCAAAGCGGGTGGTAAACTCCATCCCAAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATA : 150 FhepEG-EU0 : TGTTTGTGAATGCAGCCC-AAAGCGGGTGGTAAACTCCATCC-AAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAGCGA : 148 FhepSA-AY2 : TGTTTGTGAATGCAGCCC-AAAGCGGGTGGTAAACTCCATCC-AAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAGCGA : 148 FjacLK-EU0 : TGTTTGTGAATGCAGCCC-AAAGCGGGTGGTAAACTCCATCC-AAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAGCGA : 148 FmagUS-EU0 : TGTTTGTGAATGCAGCCC-AAAGCGGGTGGTAAACTCCATCC-AAGGCTAAATACTAGCACGAGTCCGATAGCGA : 148 FbusVN-EU0 : TGTTTGTGAATGCAGCCC-AAAGTGGGTGGTAAACTCCATCC-AAGGCTAAATACTTGCACGAGTCCGATAGCGA : 148 160 * 180 * 200 * 220 FspNB-VN : GAACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGTA : 224 FspCB-VN : AACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGTAA : 224 FgigSN-AY2 : ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGTAAA : 223 FgigTH-HM0 : ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGTAAA : 223 FgigKE-EU0 : ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGTAAA : 223 FgET : AACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGTAA : 225 FgEQB : AACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGTAA : 224 FhEQB : CGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGT : 225 FspEQO : GAACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGTA : 225 FhAus : CGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGT : 225 FhBe : GCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGG : 225 FhepEG-EU0 : ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGTAAA : 223 FhepSA-AY2 : ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGTAAA : 223 FjacLK-EU0 : ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGTAAA : 223 FmagUS-EU0 : ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGTAAA : 223 FbusVN-EU0 : ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGTACTTTGAAGAGAGAGTAAACAGTGCGTGAAACCGTTCAGAGGTAAA : 223 * 240 * 260 * 280 * 300 FspNB-VN : AACAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGAGCTTGGTCATATTGGTTGTG : 299 FspCB-VN : ACAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGAGCTTGGTCATATTGGTTGTGT : 299 FgigSN-AY2 : CAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGAGCTTGGTCATATTGGTTGTGTG : 298 FgigTH-HM0 : CAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGAGCTTGGTCATATTGGTTGTGTG : 298 FgigKE-EU0 : CAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGAGCTTGGTCATATTGGTTGTGTG : 298 FgET : ACAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGAGCTTGGTCATATTGGTTGTGT : 300 FgEQB : ACAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGAGCTTGGTCATATTGGTTGTGT : 299 FhEQB : AAACAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGAGCTTGGTCATATTGGTTGT : 300 FspEQO : AACAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGAGCTTGGTCATATTGGTTGTG : 300 FhAus : AAACAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGAGCTTGGTCATATTGGTTGT : 300 FhBe : TAAACAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGAGCTTGGTCATATTGGTTG : 300 FhepEG-EU0 : CAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGAGCTTGGTCATATTGGTTGTGTG : 298 FhepSA-AY2 : CAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGAGCTTGGTCATATTGGTTGTGTG : 298 FjacLK-EU0 : CAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGTGTGGCATGAGCTTGGTCATGTGGGTTGTGTG : 298 FmagUS-EU0 : CAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCCGAGGATTCAGCTGGTGAGTATGGCATGATCTTGGTCATATGGGTTGTGTG : 298 FbusVN-EU0 : CAGGTGGAGTTGAACTGCAAGCTCTGAGGATTCAGCTGGTGAGATTGGCATGATCTTGGTCATGTGGGTTGTGTT : 298 * 320 * 340 * 360 * FspNB-VN : TGCTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCTCCGCTTCGGTGGGGATGCGCGAATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCCG : 374 FspCB-VN : GCTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCCCCGCTTCGGTGGGGATGCGCGAATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCCGG : 374 FgigSN-AY2 : CTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCTCCGCTTCGGTGGGGATGCGCGAATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCCGGG : 373 FgigTH-HM0 : CTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCTCCGCTTCGGTGGGGATGCGCGAATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCCGGG : 373 FgigKE-EU0 : CTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCTCCGCTTCGGTGGGGATGCGCGAATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCCGGG : 373 FgET : GCTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCTCCGCTTCGGTGGGGATGCGCGAATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCCGG : 375 FgEQB : GCTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCCCCGCTTCGGTGGGGATGCGCGAATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCCGG : 374

FhEQB : GTGCTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCCCCGCTTCGGTGGGGATGCGCGAATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCC : 375 FspEQO : TGCTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCCCCGCTTCGGTGGGGATGCGCGAATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCCG : 375 FhAus : GTGCTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCCCCGCTTCGGTGGGGATGCGCGAATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCC : 375 FhBe : TGTGCTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCCCCGCTTCGGTGGGGATGCGCGAATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCC : 375 FhepEG-EU0 : CTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCCCCGCTTCGGTGGGGATGCGCGAATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCCGGG : 373 FhepSA-AY2 : CTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCCCCGCTTCGGTGGGGATGCGCGAATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCCGGG : 373 FjacLK-EU0 : CTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCCCCGCTTCGGCGGGGGTGCGCGTATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCCGGG : 373 FmagUS-EU0 : CTCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCCCCGCTTCGGCGGGGGTGCGCGTATCACTCATCAGGTGTTGTGCGCCCGGG : 373 FbusVN-EU0 : ATCGGGTCTGCTTAGCTGCAGGTCCCCGCTTCGGCGGGGGTGCGCGAATCACTTATCAAGTGTTGTGCGCCCGGT : 373 380 * 400 * 420 * 440 * FspNB-VN : GGTACTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGACGTTGCTGTCTGGCTGTTGC : 449 FspCB-VN : GTACTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGACGTTGCTGTCTGGCTGTTGCG : 449 FgigSN-AY2 : TACTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGACGTTGCTGTCTGGCTGTTGCGG : 448 FgigTH-HM0 : TACTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGACGTTGCTGTCTGGCTGTTGCGG : 448 FgigKE-EU0 : TACTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGACGTTGCTGTCTGGCTGTTGCGG : 448 FgET : GTACTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGACGTTGCTGTCTGGCTGTTGCG : 450 FgEQB : GTACTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGACGTTGCTGTCTGGCTGTTGCG : 449 FhEQB : GGGTACTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGACGTTGCTGTCTGGCTGTTG : 450 FspEQO : GGTACTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGACGTTGCTGTCTGGCTGTTGC : 450 FhAus : GGGTACTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGACGTTGCTGTCTGGCTGTTG : 450 FhBe : CGGGTACTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGACGTTGCTGTCTGGCTGTT : 450 FhepEG-EU0 : TACTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGACGTTGCTGTCTGGCTGTTGCGG : 448 FhepSA-AY2 : TACTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGACGTTGCTGTCTGGCTGTTGCGG : 448 FjacLK-EU0 : TATTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGGCGTTGCCGTCTGGCTGTTGCGG : 448 FmagUS-EU0 : TGTTGACGGACCTGCTTGCCAGTGCACTTTCTCGGAGTGTTCACCACGACCGGCGTTGCTGTCTGACTGTTGCGG : 448 FbusVN-EU0 : TAATGACGAGCCCGCTCGCCAGTGCACTTTCTCAGAGTGTTCACCACGACCGGCGTTGCCGTCTGGCTGTTGCGG : 448 460 * 480 * 500 * 520 FspNB-VN : GGTTAAACCGGCTTGGTAGGGTCCTTGTGTCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATCG : 524 FspCB-VN : GTTAAACCGGCTTGGTAGGGTCCTTGTGTCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATCGT : 524 FgigSN-AY2 : TTAAACCGGCTTGGTAGGGTCCTTGTGTCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATCGTG : 523 FgigTH-HM0 : TTAAACCGGCTTGGTAGGGTCCTTGTGTCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATCGTG : 523 FgigKE-EU0 : TTAAACCGGCTTGGTAGGGTCCTTGTGTCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATCGTG : 523 FgET : GTTAAACCGGCTTGGTAGGGTCCTTGTGTCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATCGT : 525 FgEQB : GTTAAACCGGCTTGGTAGGGTCCTTGTGTCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATCGT : 524 FhEQB : CGGTTAAACCGGCTTGGTAGGGTCCTTGTGTCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATC : 525 FspEQO : GGTTAAACCGGCTTGGTAGGGTCCTTGTGTCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATCG : 525 FhAus : CGGTTAAACCGGCTTGGTAGGGTCCTTGTGTCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATC : 525 FhBe : GCGGTTAAACCGGCTTGGTAGGGTCCTTGTGTCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAACCCGTTGTGCGATTTAT : 525 FhepEG-EU0 : TTAAACCGGCTTGGTAGGGTCCTTGTGTCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATCGTG : 523 FhepSA-AY2 : TTAAACCGGCTTGGTAGGGTCCTTGTGTCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATCGTG : 523 FjacLK-EU0 : TTAAACCGGCCTGGTAGGGTCCTTGTGGCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATTGTG : 523 FmagUS-EU0 : TTAAACCGGTTTGGTAGGGTCCTTGTGGCCTTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCCGTTGTGCGATTTATCGTG : 523 FbusVN-EU0 : TTAAACCGGCCTGGTAGGGTCCTTGTGGCTCTGCTAGGTCGGGATGGCAGGTAGCCTGTTGTACAATTTATTGTG : 523 * 540 * 560 * 580 * 600 FspNB-VN : TGCTTTGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGGGC : 599 FspCB-VN : GCTTCGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGGGCG : 599 FgigSN-AY2 : CTTTGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGGGCGT : 598 FgigTH-HM0 : CTTCGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGGGCGT : 598 FgigKE-EU0 : CTTTGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGGGCGT : 598 FgET : GCTTTGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGGGCG : 600 FgEQB : GCTTCGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGGGCG : 599 FhEQB : GTGCTTCGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGGG : 600 FspEQO : TGCTTCGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGGGC : 600 FhAus : GTGCTTCGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGGG : 600 FhBe : CGTGCTTCGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGG : 600 FhepEG-EU0 : CTTCGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGGGCGT : 598 FhepSA-AY2 : CTTCGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGGGCGT : 598 FjacLK-EU0 : CTTCGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGCCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCTTGCGGGCGT : 598 FmagUS-EU0 : CTTCGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTACGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCGTGCGGGCGT : 598 FbusVN-EU0 : CTCCGGGTGTAATAGCCGACTGCTTCGGTTCTGTGCGGTGCGTCGGAGACGGCGGCTTGTTGTGCTTGCAGGCGT : 598 * 620 * 640 * 660 * FspNB-VN : GTGCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTGT : 674 FspCB-VN : TGCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTGTC : 674 FgigSN-AY2 : GCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGT-AATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTGTCG : 672 FgigTH-HM0 : GCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTGTCG : 673 FgigKE-EU0 : GCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTGTCG : 673 FgET : TGCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTGTC : 675 FgEQB : TGCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTGTC : 674 FhEQB : CGTGCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTG : 675 FspEQO : GTGCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTGT : 675 FhAus : CGTGCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTG : 675 FhBe : GCGTGCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGT : 675 FhepEG-EU0 : GCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTGTCG : 673 FhepSA-AY2 : GCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTGTCG : 673 FjacLK-EU0 : GCCTGTCGCGCCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTGTCG : 673 FmagUS-EU0 : GCCTGTCGCGTCGGCGGCTCTGGGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATGCAGGCCAGGTGATGGCTCGGTGTCG : 673 FbusVN-EU0 : GCCTGCTGTGCTGGCGGCTCTGAGTCTGGTTGCCTTGTTGCTTGTGAATACAAGCCAGGTGATGGCTTGGTGTCG : 673 680 * 700 * 720 * 740 * FspNB-VN : CGTTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCT : 749 FspCB-VN : GTTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTG : 749 FgigSN-AY2 : TTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGA : 747 FgigTH-HM0 : TTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGA : 748 FgigKE-EU0 : TTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGA : 748

FgET : GTTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTG : 750 FgEQB : GTTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTG : 749 FhEQB : TCGTTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACC : 750 FspEQO : CGTTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCT : 750 FhAus : TCGTTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACC : 750 FhBe : GTCGTTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCAC : 750 FhepEG-EU0 : TTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGA : 748 FhepSA-AY2 : TTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGA : 748 FjacLK-EU0 : TTCGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTGAAAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGA : 748 FmagUS-EU0 : TTCGGCCGGCGGTTGCGTCTGTTGCACTTTGAWAGGGCCCACAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGA : 748 FbusVN-EU0 : TTTGGTCGGCGGTTGCGTTTGTTGCACTTTAAAAGGGCCCATAGTCTGTGGTGTAGTGGTAGACTATCCACCTGA : 748 760 * 780 * 800 * 820 FspNB-VN : GACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGCA : 824 FspCB-VN : ACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGCAG : 824 FgigSN-AY2 : CCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAAACTGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGCAGT : 822 FgigTH-HM0 : CCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGCAGT : 823 FgigKE-EU0 : CCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGCAGT : 823 FgET : ACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGCAG : 825 FgEQB : ACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGCAG : 824 FhEQB : TGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGC : 825 FspEQO : GACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGCA : 825 FhAus : TGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGC : 825 FhBe : CTGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCG : 825 FhepEG-EU0 : CCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGCAGT : 823 FhepSA-AY2 : CCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGCAGT : 823 FjacLK-EU0 : CCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGCAGT : 823 FmagUS-EU0 : CCCGTCNNGAAACWCGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGAAGT : 823 FbusVN-EU0 : CCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGAGTAACATGTGCGCGAGTCATTGGGCGTTACGAAACCCAAAGGCGCAGT : 823 * 840 * 860 * 880 * 900 FspNB-VN : GTGAAAGTGAAGGCTCGGCTTGTCTGGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCTTC : 899 FspCB-VN : TGAAAGTGAAGGCTCGGCTTGTCTGGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCTTCG : 899 FgigSN-AY2 : GAAAGTGAAGGCTCGGCTTGTCTGGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCTTCGA : 897 FgigTH-HM0 : GAAAGTGAAGGCTCGGCTTGTCTGGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCTTCGA : 898 FgigKE-EU0 : GAAAGTGAAGGCTCGGCTTGTCTGGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCTTCGA : 898 FgET : TGAAAGTGAAGGCTCGGCTTGTCTGGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCTTCG : 900 FgEQB : TGAAAGTGAAGGCTCGGCTTGTCTGGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCTTCG : 899 FhEQB : AGTGAAAGTGAAGGCTCGGCTTGTCTGGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCTT : 900 FspEQO : GTGAAAGTGAAGGCTCGGCTTGTCTGGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCTTC : 900 FhAus : AGTGAAAGTGAAGGCTCGGCTTGTCTGGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCTT : 900 FhBe : CAGTGAAAGTGAAGGCTCGGCTTGTCTGGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCT : 900 FhepEG-EU0 : GAAAGTGAAGGCTCGGCTTGTCTGGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCTTCGA : 898 FhepSA-AY2 : GAAAGTGAAGGCTCGGCTTGTCTGGGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCTTCGA : 898 FjacLK-EU0 : GAAAGTAAAGGCTTGGCTTGTCTGAGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACCACCAAGCTTCGA : 898 FmagUS-EU0 : GAAAGTAAAGGCTCGGCTTGTYTGAGCTGAGGWGAGATCCTGTCSTTTCTCATGCCCGGTACTACCAAGCTTCGA : 898 FbusVN-EU0 : GAAAGTAAAGGCTTGGCTTGTCTGAGCTGAGGTGAGATCCTGTCGTTTCTCATGCGCGGTACTACCAAGCTTCGA : 898 * 920 * 940 * 960 * FspNB-VN : GAGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGCA : 974 FspCB-VN : AGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGCAT : 974 FgigSN-AY2 : GCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGCATG : 972 FgigTH-HM0 : GCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGCATG : 973 FgigKE-EU0 : GCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGCATG : 973 FgET : AGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGCAT : 975 FgEQB : AGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGCAT : 974 FhEQB : CGAGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGC : 975 FspEQO : GAGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGCA : 975 FhAus : CGAGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGC : 975 FhBe : TCGAGCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAG : 975 FhepEG-EU0 : GCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGCATG : 973 FhepSA-AY2 : GCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGCATG : 973 FjacLK-EU0 : GCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCGGCCTCGAGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGCATG : 973 FmagUS-EU0 : GCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTAGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGCATG : 973 FbusVN-EU0 : GCGGCAGGCGCATCACCGGCCCGTCCCATGGCGTGGAGGCAGCCTCGTGCTTGCTCATCGTCGGGGCGGAGCATG : 973 980 * 1000 * 1020 * 1040 FspNB-VN : TGAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA-- : 1039 FspCB-VN : GAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA--- : 1038 FgigSN-AY2 : AGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA---- : 1035 FgigTH-HM0 : AGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA---- : 1036 FgigKE-EU0 : AGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA---- : 1036 FgET : GAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA--- : 1039 FgEQB : GAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA--- : 1038 FhEQB : ATGAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA- : 1041 FspEQO : TGAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA-- : 1040 FhAus : ATGAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA- : 1041 FhBe : CATGAGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA : 1042 FhepEG-EU0 : AGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA---- : 1036 FhepSA-AY2 : AGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA---- : 1036 FjacLK-EU0 : AGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA---- : 1036 FmagUS-EU0 : AGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA---- : 1036 FbusVN-EU0 : AGCGTACATGTTGAGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGCGCAGGTTGAAGCCAGAGGAAA---- : 1036

Phụ lục 2. Giản đồ giải trình tự nucleotide gan 28S của FspCB-VN và FspNB-VN

Phụ lục 3. Trình tự nucleotide gen cox1 * 20 * 40 * 60 * FspNB-VN-c : GTGAATTATATTAGTTGATTGTTTACGTTAGATCATAAGCGTGTTGGTTTGATTTATATGTTGATTGGTCTTTGG : 75 FspCB-VN-c : GTGAATTATATTAGTTGATTGTTAACGTTAGATCATAAGCGTGTTGGTTTGATTTATATGTTGATTGGTCTTTGG : 75 Fhep-AU-co : GTGAAGTATATGAGTTGGTTGTTTACGTTGGATCATAAGCGTGTTGGTTTGATTTATATGGTTATTGGTCTTTGG : 75 FspGHL-CN- : GTGAATTATATTAGTTGATTGTTTACGTTAGATCATAAGCGTGTTGGTTTGATTTATATGTTGATTGGTCTTTGG : 75 Fgig-CN-co : GTGAATTATATTAGTTGATTGTTTACGTTAGATCATAAGCGTGTTGGTTTGATTTATATGTTGATTGGTCTTTGG : 75 Fgig-ID-co : GTGAATTATATTAGTTGGTTGTTTACGTTAGATCATAAGCGTGTTGGTTTGATTTATATGTTGATTGGTCTTTGG : 75 Fbus(human : GTGAGATATTTTGGTTGGTTGTTTACTTTAGATCATAAGCGTATTGGTTTTGTTTATTTGGTAGTTGGTTTGTGG : 75 Fbus(swine : GTGAGATATTTTGGTTGGTTGTTTACTTTAGATCATAAGCGTATTGGTTTTGTTTATTTGGTAGTTGGTTTGTGG : 75 Csin-CN-co : GTGTCTGCGATATGGCTCCTTACTATGGATCATAAGCGTATAGGTGTTATTTATATGATTCTTGGGATCTGGGGT : 75 Csin-KR-co : GTGTCTGCGATATGGCTCCTTACTATGGATCATAAGCGTATAGGTGTTATTTATATGATTCTTGGGATCTGGGGT : 75 Csin-RU-co : GTGTCTGCGATATGGCTCCTTACTATGGATCATAAGCGTATAGGTGTTATTTATATGATTCTTGGTATCTGGGGT : 75 Csin-VN-co : GTGTCTGCGATATGGCTCCTTACTATGGATCATAAGCGTATAGGTGTTATTTATATGATTCTTGGGATCTGGGGT : 75 Oviv-TH-co : GTGTCTACGATATGACTTCTTACAATGGATCATAAGCGTATTGGTGTTATTTACATGATTTTGGGGGTCTGAGGT : 75 Oviv-CN-co : GTGTCTACGATATGGCTTCTTACAATGGATCATAAGCGTATTGGTGTTATTTACATGATTTTGGGGGTCTGAGGT : 75 Ofel-RU-co : GTGTCTGCGATATGGCTTTTTACTATGGATCATAAGCGTATTGGTATTATTTATATGATTTTGGGTGTGTGAGGC : 75 Phet-VN-co : ATGTTTACTTGGTTGTTTACTTTAGATCATAAGCGTATAGGTGTGATTTACATGGTCTTGGGTGTGTGGTGTGGA : 75 Pohi-JP-co : ---ATGACTTGATTATTTACTTTGGATCATAAGCGTATTGGTATGATTTACATGGTCTTGGGTGTGTGAGGTGGA : 72 Pwes(2n)-K : ATGTTTACTTGGTTGTTCACTTTGGATCACAAGCGTATCGGGATGATTTACATGGTTTTGGGGATTTGGGGAGGA : 75 Pwes(3n)KR : ATGTTTACTTGGTTGTTCACTTTGGATCACAAGCGTATCGGGATGATTTACATGGTTTTGGGGATTTGGGGAGGA : 75 Ejap-VN-co : ATGATGTGGATGACTTGGTTATTTACTTTAGATCATAAGCGAATTGGTTTAATTTATATGTTGATTGGGGTATGA : 75 Htai-KR-co : ATGTTGACTTGATTATTGACTTTGGATCATAAGCGAATAGGGTTGATATATATGATTGTTGGAGTGTGAGGGGGC : 75 Htai-LA-co : ATGTTGACTTGATTATTGACTTTGGATCATAAGCGAATAGGGTTGATATATATGATTGTTGGAGTGTGAGGGGGC : 75 Htai-VN-co : ATGTTGACTTGATTATTGACTTTGGATCATAAGCGAATAGGGTTGATATATATGATTGTTGGAGTGTGAGGGGGC : 75 Sfal-VN-co : GTGTTGCTCTGGTTTTTTACGCTGGATCATAAGCGTGTTGGTATGATTTATTTTCTTTTGGGTGTATGGGGAGGC : 75 80 * 100 * 120 * 140 * FspNB-VN-c : GGGGGATTTTTTGGTCTTTCTTTGAGTGTTTTGGTTCGTTTGAATTATTTGGATCCTTATTTTAATTTGGTGTCC : 150 FspCB-VN-c : GGTGGATTTTTTGGTCTTTCTTTGAGTATTTTGGTTCGTTTGAATTATTTGGATCCTTATTTTAATTTGGTGTCC : 150 Fhep-AU-co : GGGGGGTTTTTTGGTCTTTCTTTGAGGGTGTTGGTTCGTTTGAATTATTTAGATCCATATTTTAATTTGGTTTCT : 150 FspGHL-CN- : GGTGGATTTTTTGGTCTTTCTTTGAGTATTTTGGTTCGTTTGAATTATTTGGATCCTTATTTTAATTTGGTGTCC : 150 Fgig-CN-co : GGTGGATTTTTTGGTCTTTCTTTGAGTATTTTGGTTCGTTTGAATTATTTGGATCCTTATTTTAATTTGGTGTCT : 150 Fgig-ID-co : GGGGGATTTTTTGGTCTTTCTTTGAGTGTTTTGGTTCGTTTGAATTATTTGGATCCTTATTTTAATTTGGTGTCC : 150 Fbus(human : AGAGGGTTTTTGGGTTTGTCGTTGAGTATGTTGATTCGTTTAAAATATTTGGATCCTTATTATAATTTGATTTCT : 150 Fbus(swine : AGAGGGTTTTTGGGTTTGTCGTTGAGTATGTTGATTCGTTTAAAATATTTGGATCCTTATTATAATTTGATTTCT : 150 Csin-CN-co : GGATTTTTGGGTCTTGGGTTGAGGTTTCTTATACGAGTGAATTATTTTGATCCTTACTTTAATGTTATTTCATCA : 150 Csin-KR-co : GGATTTTTGGGTCTTGGGTTGAGGTTTCTTATACGAGTGAATTATTTTGATCCTTACTTTAATGTTATTTCATCA : 150 Csin-RU-co : GGATTTTTGGGTCTTGGGTTGAGGTTTCTTATACGAGTGAATTATTTTGATCCTTACTTTAATGTTATTTCATCA : 150 Csin-VN-co : GGATTTTTGGGTCTTGGGTTGAGGTTTCTTATACGAGTGAATTATTTTGATCCTTACTTTAATGTTATTTCATCA : 150 Oviv-TH-co : GGATTTTTGGGCCTGGGGCTTAGGTTTCTTATACGAGTTAATTATTTTGATCCTTATTTTAATATTGTTTCTCCG : 150 Oviv-CN-co : GGATTTTTGGGCCTGGGGCTTAGGTTTCTTATACGAGTTAATTATTTTGATCCTTATTTTAATATTGTTTCTCCG : 150 Ofel-RU-co : GGGTTTACAGGATTGAGGTTGAGGTTTCTTATACGGATAAATTATTTTGATCCCTATTTTAATGTTGTTTCTCCC : 150 Phet-VN-co : TTTTTGGGGCTCTCTTTAAGGATGTTGATTCGCTTGAACTA-CTTGGATCCTTACTACAATATTGTTTCGTCGGA : 149 Pohi-JP-co : TTTATTGGACTTTCTTTAAGAATGTTAATTCGTTTGAATTATCTTG-ATCCGTATTATAATATTGTCTCGTCGGA : 146 Pwes(2n)-K : TTTCTGGGTCTTTCTCTGAGGATGTTGATTCGTCTGAACTA-CCTGGATCCTTACTACAACATTGTCTCGTCGGA : 149 Pwes(3n)KR : TTTCTGGGTCTTTCTCTGAGGATGTTGATTCGTCTGAACTA-CCTGGATCCTTACTACAACATTGTCTCGTCGGA : 149 Ejap-VN-co : GGGGGTTTTTTGGGTCTTTCTTTGAGTTTGTTGATACGTTTGAAATATTTGGATCCTTATTTTAATTTGATAATA : 150 Htai-KR-co : TTTTTAGGTCTTTCTTTGAGGTTTTTGATCCGTGTTAACTACTTGGATCCTTACTATAATGTTGTATCCCCAGAG : 150 Htai-LA-co : TTTTTAGGTCTTTCTTTGAGGTTTTTGATCCGTGTTAACTACTTGGATCCTTACTATAATGTTGTATCCCCAGAG : 150 Htai-VN-co : TTTTTAGGTCTTTCTTTGAGGTTTTTGATCCGTGTTAACTACTTGGATCCTTACTATAATGTTGTATCCCCAGAG : 150 Sfal-VN-co : TTTTTGGGGCTTTCTTTGAGCTTTCTTATTCGGGTAAAATACTTGGATCCTTATTTTAAAGTCGTTTCGTCGGAT : 150 160 * 180 * 200 * 220 FspNB-VN-c : CCTGAGGTTTATAATTATGTTGTGACGGGACATGGGGTTATTATGATTTTTTTCTTTTTGATGCCTGTGTTGATT : 225 FspCB-VN-c : CCTGAGGTTTATAATTATGTTGTGACGGGACATGGGGTTATTATGATTTTTTTCTTTTTGATGCCTGTGTTGATT : 225 Fhep-AU-co : CCTGAAGTTTATAATTATGTTGTTACTGGGCATGGGATTATAATGATTTTTTTCTTTTTGATGCCGGTGTTGATT : 225 FspGHL-CN- : CCTGAGGTTTATAATTATGTTGTGACGGGACATGGGGTTATTATGATTTTTTTCTTTTTGATGCCTGTGTTGATT : 225 Fgig-CN-co : CCTGAGGTTTATAATTATGTTGTGACGGGGCATGGTGTTATTATGATTTTTTTCTTTTTAATGCCTGTGTTGATT : 225 Fgig-ID-co : CCTGAGGTTTATAATTATGTTGTGACGGGACATGGGGTTATTATGATTTTTTTCTTTTTGATGCCTGTGTTGATT : 225 Fbus(human : CCGGAGGTGTATAATTATTTGGTTACAGGTCATGGTATAGTGATGATTTTTTTTTTTCTGATGCCTGTGTTGATA : 225 Fbus(swine : CCGGAGGTGTATAATTATTTGGTTACAGGTCATGGTATAGTGATGATTTTTTTTTTTCTGATGCCTGTGTTGATA : 225 Csin-CN-co : GATGTTTATAATTATGTGGTTACTAGGCATGGGGTTGCTATGATTTTTTTCTTCTTGATGCCTGTTCTTGTGGGC : 225 Csin-KR-co : GATGTTTATAATTATGTGGTTACTAGGCATGGGGTTGCTATGATTTTTTTCTTCTTGATGCCTGTTCTTGTGGGC : 225 Csin-RU-co : GATGTTTATAATTATGTGGTTACTAGGCATGGGGTTGCTATGATTTTTTTCTTCTTGATGCCTGTTCTTGTGGGC : 225 Csin-VN-co : GATGTTAATAATTATGTGGTTACTAGGCATGGGGTTGCTATGATTTTTTTCTTCTTGATGCCTGTTCTTGTGGGC : 225 Oviv-TH-co : GATGTTTATAATTATATTGTTACGAGTCATGGGATAGCTATGATCTTTTTCTTTTTAATGCCTGTTCTTATTGGT : 225 Oviv-CN-co : GGTGTTTATAATTATATTGTTACGAGTCATGGGATAGCTATGATCTTTTTCTTTTTAATGCCTGTTCTTATTGGT : 225 Ofel-RU-co : GATGTATATAATTACGTTGCTACTAGTCATGGGGTTGCCATGATTTTTTTTTTCTTAATGCCGGTTTTAATAGGG : 225 Phet-VN-co : GGTTTACAATTACGTGATAACGAATCATGGTGTTGCTATGATTTTTTTCTTTTTGATGCCTGTCTTGATAGGCGG : 224 Pohi-JP-co : GGTTTACAATTATGTGATAACTAATCATGGGGTTGCTATGATTTTCTTTTTTTTGATGCCTGTGTTGATAGGAGG : 221 Pwes(2n)-K : GGTTTACAACTATGTGCTGACCAATCATGGGGTCGCCATGATTTTCTTTTTCCTGATGCCTGTTTTGATAGGGGG : 224 Pwes(3n)KR : GGTTTACAACTATGTGCTGACCAATCATGGGGTCGCCATGATTTTCTTTTTCCTGATGCCTGTTTTGATAGGGGG : 224 Ejap-VN-co : CCTGAGGTATATAATTATGTGATTACTTGACATGGGATAGTGATGATTTTCTTTTTTTTGATGCCTGTTTTGATA : 225 Htai-KR-co : GTTTATAATTATGTAATTACTAGGCATGGTATTGCGATGATTTTTTTTTTCTTAATGCCGGTTTTGATTGGGGGG : 225 Htai-LA-co : GTTTATAATTATGTAATTACTAGGCATGGTATTGCGATGATTTTTTTTTTCTTAATGCCGGTTTTGATTGGGGGG : 225 Htai-VN-co : GTTTATAATTATGTAATTACTAGGCATGGTATTGCGATGATTTTTTTTTTCTTAATGCCGGTTTTGATTGGGGGG : 225 Sfal-VN-co : GTTTACAACTACATAATTACAAGGCATGGGATAGCGATGATTTTCTTTTTCTTGATGCCCGTGTTAATTGGTAGG : 225 * 240 * 260 * 280 * 300 FspNB-VN-c : GGGGGGTTTGGTAaTTATTTAATGCCTTTGCTTTTGGGTATTCCTGATTTGAATTTGCCTCGTTTAAATGCTTTG : 300 FspCB-VN-c : GGGGGGTTTGGTAATTATTTATTGCCTTTGCTTTTGGGTATTCCTGATTTGAATTTACCTCGTTTAAATGCTTTG : 300 Fhep-AU-co : GGGGGTTTTGGTAATTATTTGTTGCCTTTATTGTTAGGTATTCCTGATTTGAATTTGCCTCGTTTAAATGCTTTG : 300 FspGHL-CN- : GGGGGGTTTGGTAATTATTTATTGCCTTTGCTTTTGGGTATTCCTGATTTGAATTTACCTCGTTTAAATGCTTTG : 300

Fgig-CN-co : GGGGGGTTTGGTAATTATTTATTGCCTTTGCTTTTGGGTATTCCTGATTTGAATTTGCCTCGTTTAAATGCTTTG : 300 Fgig-ID-co : GGGGGGTTTGGTAATTATTTATTGCCTTTGCTTTTGGGTATTCCTGATTTGAATTTGCCTCGTTTAAATGCTTTG : 300 Fbus(human : GGTGGTTTTGGTAATTATTTGTTACCGTTGTTGTTAGGGATAGGTGATTTGAATTTACCTCGTGTAAATGCTTTG : 300 Fbus(swine : GGTGGTTTTGGTAATTATTTGTTACCGTTGTTGTTAGGGATAGGTGATTTGAATTTACCTCGTGTAAATGCTTTG : 300 Csin-CN-co : GGTTTTGGTAACTACCTGCTGCCTCTGTTACTTGGTTTATCAGATTTGAATTTGCCTCGTTTGAAAGCTCTAAGC : 300 Csin-KR-co : GGTTTTGGTAACTACCTGCTGCCTCTGTTACTTGGTTTATCAGATTTGAATTTGCCTCGTTTGAAAGCTCTAAGC : 300 Csin-RU-co : GGTTTTGGTAACTACCTACTGCCTCTGTTACTTGGTTTATCAGATTTGAATTTGCCTCGTTTGAAAGCTCTAAGC : 300 Csin-VN-co : GTTTTTGGTAACTACCTGCTGCCTCTGTTACTTGGTTTATCAGATTTGAATTTGCCTCGTTTGAAAGCTCTAAGT : 300 Oviv-TH-co : GGGTTTGGTAATTATTTATTGCCCTTGTTGTTGGGTTTATCGGACTTGAATTTGCCCCGTTTAAAAGCGTTGAGT : 300 Oviv-CN-co : GGGTTTGGTATTTATTTATTGCCCTTGTTGTTGGGTTTATCGGACTTGAATTTGCCCCGTTTAAAAGCGTTGAGT : 300 Ofel-RU-co : GGTTTTGGTAAATATTTGTTGCCTCTGTTGCTGGGTTTGTCGGATTTAAATTTACCCCGTTTGAAAGCTTTAAGT : 300 Phet-VN-co : GTTTGGTAATTATCTTCTTCCGTTGTTGTTAGGTATTCCTGATCTGAAACTTCCTCGTTTGAAAGCTCTTAGGGC : 299 Pohi-JP-co : ATTCGGTAATTATCTTCTTCCTCTTTTATTGGGTATACCTGATTTGAATCTTCCTCGTTTGAAAGCTCTTAGGGC : 296 Pwes(2n)-K : GTTTGGTAATTACCTCCTCCCTCTTTTGCTAGGAATTCCTGATCTGAGGTTACCTCGCTTGAAAGCTCTTAGGGC : 299 Pwes(3n)KR : GTTTGGTAATTACCTCCTCCCTCTTTTGCTAGGAATTCCTGATCTGAGGTTACCTCGCTTGAAAGCTCTTAGGGC : 299 Ejap-VN-co : GGGGGGTTTGGTAAATACTTGTTACCTTTATTGTTAGGATTACCTGATTTGAATTTGCCTCGTTTAAAAGCTTTA : 300 Htai-KR-co : TTTGGAAAATATCTGTTGCCCCTGTTGTTGGGGCTTCCTGATTTGAATTTACCCCGTTTAAATGCCCTTAGAGCT : 300 Htai-LA-co : TTTGGAAAATATCTGTTGCCCCTGTTGTTGGGGCTTCCTGATTTGAATTTACCCCGTTTAAATGCCCTTAGAGCT : 300 Htai-VN-co : TTTGGAAAATATCTGTTGCCCCTGTTGTTGGGGCTTCCTGATTTGAATTTACCCCGTTTAAATGCCCTTAGAGCT : 300 Sfal-VN-co : TTTGGTAATTATTTGTTGCCGCTGCTGTTGGGGTTGCCGGATCTTACTTTGCCTCGGTTAAAAGCCTTTAGTGCC : 300 * 320 * 340 * 360 * FspNB-VN-c : AGTGCTTGGTTGTTGCTTCCTGCTTGTGTTTGTTTGTCGTTTGGTTTGATGGGGGGTATGGGTGTTGGTTGGACT : 375 FspCB-VN-c : AGTGCTTGGTTGTTGCTTCCTGCTTGTGTTTGTTTGTCGTTTGGTTTGATGGGGGGTATGGGTGTTGCTTGGACT : 375 Fhep-AU-co : AGTGCTTGGTTGTTATTTCCTGCTTGTGTTTGTTTGCCTTTTGGTTTGATAGGGGGTGTAGGTGTTGGTTGAACT : 375 FspGHL-CN- : AGTGCTTGGTTGTTGCTTCCTGCTTGTGTTTGTTTGTCGTTTGGTTTGATGGGGGGTATGGGTGTTGGTTGGACT : 375 Fgig-CN-co : AGTGCTTGGTTGTTGCTTCCTGCTTGTGTTTGTTTGTCGTTTGGTTTGATGGGGGGTATGGGTGTTGGTTGGACT : 375 Fgig-ID-co : AGTGCTTGGTTGTTGCTTCCTGCTTGTGTTTGTTTGTCGTTTGGTTTGATGGGGGGTATGGGTGTTGGTTGGACT : 375 Fbus(human : AGAGTGTGGTTGTTATTGCCATCCTGCGTTTGTTTGGCTTTGAGTTTGATAGGGGGTGCTGGTGTTGGTTGAACT : 375 Fbus(swine : AGAGTGTGGTTGTTATTGCCATCCTGCGTTTGTTTGGCTTTGAGTTTGATAGGGGGTGCTGGTGTTGGTTGAACT : 375 Csin-CN-co : GTGTGGTTGTTGGTTCCTTCGGCTGTTTGTTTTAGTCTTAGGATGTATGGTGGTGCTGGGGTTGGGTGGACTTTT : 375 Csin-KR-co : GTGTGGTTGTTGGTTCCTTCGGCTGTTTGTTTTAGTCTTAGGATGTATGGTGGTGCTGGGGTTGGGTGGACTTTT : 375 Csin-RU-co : GTGTGGTTGTTGGTTCCTTCGGCTGTTTGTTTTAGTCTTAGGATGTATGGTGGTGCTGGGGTTGGGTGGACTTTT : 375 Csin-VN-co : GTGTGGTTGTTGGTTCCTTCGGCTGTTTGTTTTAGTCTTAGGATGTATGGTGGTGCTGGGGTTGGGTGGACTTTT : 375 Oviv-TH-co : GTTTGGTTGTTGGTTCCTTCCGCCGTCTGTTTTAGTCTGAGGATGTATGGTGGAGCTGGTGTAGGTTGAACTTTT : 375 Oviv-CN-co : GTTTGGTTGTTGGTTCCTTCCGCCGTCTGTTTTAGTCTGAGGATGTATGGTGGGGCTGGTGTAGGTTGAACTTTT : 375 Ofel-RU-co : GTGTGGTTATTGGTTCCTTCGGCTTTATGCTTTAGGTTGAGAATGTATGGTGGGGCTGGAGTTGGGTGAACTTTT : 375 Phet-VN-co : TTGATTAATGCTTCCTTCGGCGGTTTGCCTTAGTGTGAGAATGTTAGGAGGTGCAGGAGTGGGGTGGACCTTTTA : 374 Pohi-JP-co : TTGATTAATGCTTCCTTCTGCTGTTTGTCTTAGTTTGAGCATGCTAGGAGGGGCAGGAGTAGGATGAACCTTCTA : 371 Pwes(2n)-K : TTGGTTGATGCTTCCTTCTGCTGTCTGTCTCAGTTTGAGGATGTTAGGTGGTGCAGGTGTGGGTTGGACTTTTTA : 374 Pwes(3n)KR : TTGGTTGATGCTTCCTTCTGCTGTCTGTCTCAGTTTGAGGATGTTAGGTGGTGCAGGTGTGGGTTGGACTTTTTA : 374 Ejap-VN-co : AGTGCTTGATTGTTGTTACCTTCTGCGGTTTGTTTGGGGATGAGGATGATTGGGGGTGCTGGAGTAGGTTGGACA : 375 Htai-KR-co : TGGTTAATGATTCCTTCCGCTGTTTGTTTTGGGTTAAGTATGTTTGGGGGGTCTGGGGTTGGCTGGACTTTTTAT : 375 Htai-LA-co : TGGTTAATGATTCCTTCCGCTGTTTGTTTTGGGTTAAGTATGTTTGGGGGGTCTGGGGTTGGCTGGACTTTTTAT : 375 Htai-VN-co : TGGTTAATGATTCCTTCTGCTGTTTGTTTTGGGTTAAGTATGTTTGGGGGGTCTGGGGTTGGCTGGACTTTTTAT : 375 Sfal-VN-co : TGATTGATGGTTCCTGCGTCTATCAGGTTTGGTTTGAGGATGATAGGAGGATCGGGGGTTGGTTGGACTTTTTAT : 375 380 * 400 * 420 * 440 * FspNB-VN-c : TTCTATCCTCCTCTTTCTAGATTGGATTATTCTGGTTGGGGGGTTGATTTTTTAATGTTTTCCCTTCATTTGGCT : 450 FspCB-VN-c : TTCTATCCTCCTCTTTCTAGATTGGATTTTTCTGGTTGGGGAGTTGATTTTTTAATGTTTTCTCTTCATTTGGCT : 450 Fhep-AU-co : TTTTATCCACCTCTTTCTAGGTTGGATTATTCTAGGTGGGGGGTTGATTTTTTGATGTTTTCTCTTCATTTGGCT : 450 FspGHL-CN- : TTCTATCCTCCTCTTTCTAGATTGGATTTTTCTGGTTGGGGAGTTGATTTTTTAATGTTTTCTCTTCATTTGGCT : 450 Fgig-CN-co : TTTTATCCCCCTCTTTCTAGTTTGGATTATTCTGGTTGGGGGGTTGATTTTTTAATGTTTTCTCTTCATTTGGCT : 450 Fgig-ID-co : TTCTATCCTCCTCTTTCTAGATTGGATTATTCTGGTTGGGGGGTTGATTTTTTAATGTTTTCCCTTCATTTGGCT : 450 Fbus(human : TTTTATCCTCCTCTGTCTGCTTCAGGTTATTCTGGTTGGGGGGTGGATTTTATGATGTTTTCTTTGCATTTGGCC : 450 Fbus(swine : TTTTATCCTCCTCTGTCTGCTTCAGGTTATTCTGGTTGGGGGGTGGATTTTATGATGTTTTCTTTGCATTTGGCC : 450 Csin-CN-co : TATCCTCCTCTTTCTGCTAGAGATTATAGAGGTTGAGGGGTTGATTTTTTAATGTTTTCGCTTCATTTGGCTGGG : 450 Csin-KR-co : TATCCTCCTCTTTCTGCTAGAGATTATAGAGGTTGAGGGGTTGATTTTTTAATGTTTTCGCTTCATTTGGCTGGG : 450 Csin-RU-co : TATCCTCCTCTTTCTGCTAGAGATTATAGAGGTTGAGGGGTTGATTTTTTAATGTTTTCGCTTCATTTGGCTGGG : 450 Csin-VN-co : TATCCTCCTCTTTCTGCTAGAGATTATAGAGGTTGAGGGGTTGATTTTTTAATGTTTTCGCTTCATTTGGCTGGG : 450 Oviv-TH-co : TATCCCCCTCTATCTGCTGGTGATTATAGGGGCTGGGGCGTTGACTTTCTGATGTTTTCCCTTCATTTGGCTGGG : 450 Oviv-CN-co : TATCCCCCTCTATCTGCTGGTGATTATAGGGGCTGGGGCGTTGATTTTCTGATGTTTTCCCTTCATTTGGCTGGG : 450 Ofel-RU-co : TATCCTCCCCTGTCTTCTGGTGATTATAGGGGGTGGGGAGTTGATTTTTTGATGTTTTCTCTTCATTTGGCTGGA : 450 Phet-VN-co : TCCCCCTCTTTCGGGTGGTGATTATTCTGGTTGGGGTACGGATTTTTTGATGTTTTCTCTTCATTTGGCTGGTCT : 449 Pohi-JP-co : TCCGCCTTTATCAGGTGGGGATTATTCTGGGTGAGGTACAGATTTTTTGATGTTTTCTCTTCATTTGGCGGGGTT : 446 Pwes(2n)-K : TCCTCCTCTCTCGGGAGGTGATTACTCTGGCTGGGGTGTGGATTTTTTGATGTTCTCTCTTCATCTGGCTGGTCT : 449 Pwes(3n)KR : TCCTCCTCTCTCGGGAGGTGATTACTCTGGCTGGGGTGTGGATTTTTTGATGTTCTCTCTTCATCTGGCTGGTCT : 449 Ejap-VN-co : TTTTATCCTCCTCTTTCTGGAGTAGGTTATTCAgGTTGGGGTGTGGATTTTTTAATGTTTGCTTTACATTTGGCT : 450 Htai-KR-co : CCCCCCCTGTCTTCTAGGGATTATAGGGGTTGGGGTGTTGACTTTCTTATGTTTTCTTTACATTTGGCGGGGTTA : 450 Htai-LA-co : CCCCCCCTGTCTTCTAGGGATTATAGGGGTTGGGGTGTTGACTTTCTTATGTTTTCTTTACATTTGGCGGGGTTA : 450 Htai-VN-co : CCCCCCCTGTCTTCTAGGGATTATAGGGGTTGGGGTGTTGACTTTCTTATGTTTTCTTTACATTTGGCGGGGTTA : 450 Sfal-VN-co : CCTCCTCTTTCTTCGGGTGATTACAGAGGATGGGGAGTGGATTTTCTTATGTTTTCTCTGCATCTTGCTGGGCTG : 450 460 * 480 * 500 * 520 FspNB-VN-c : GGTGTTTCTAGTCTTTTGGGTTCTATTAAATTTATTTGTACTATTTTGGAGGTTATGTTGGGCGAGGGTATTGGT : 525 FspCB-VN-c : GGTGTTTCTAGTCTTTTGCGTTCTATTAAATTTATTTGTACTATTTTGGAGGTTATGTTGGGTGAGGGTATTGGT : 525 Fhep-AU-co : GGGGTTTCTAGTCTTTTAGGTTCTATTAAATTTATTTGTACTATTTTAGAGGTTATGTTGGATGAGGGTACGGGT : 525 FspGHL-CN- : GGTGTTTCTAGTCTTTTGGGTTCTATTAAATTTATTTGTACTATTTTGGAGGTTATGTTGGGTGAGGGTATTGGT : 525 Fgig-CN-co : GGTGTTTCTAGTCTTTTGGGTTCTATTAAATTTATTTGTACTATTTTGGAGGTTATGTTGGGCGAGGGTACTGGT : 525 Fgig-ID-co : GGTGTTTCTAGTCTTTTGGGTTCTATTAAATTTATTTGTACTATTTTGGAGGTTATGTTGGGTGAGGGTATTGGT : 525 Fbus(human : GGGGTATCTAGTATTTTTAGTTCTATTAAATTTATTTGTACTATAGTTGAGGTTATGTTTGAGGAAGGTACAGGT : 525 Fbus(swine : GGGGTATCTAGTATTTTTAGTTCTATTAAATTTATTTGTACTATAGTTGAGGTTATGTTTGAGGAAGGTACAGGT : 525 Csin-CN-co : TTATCGAGTCTTTTTGGATCTTTGAAATTTATTTGTACAATATGGTCTGCCGCGGATAGGCGGGTGAGGGAACGA : 525 Csin-KR-co : TTATCGAGTCTTTTTGGATCTTTGAAATTTATTTGTACAATATGGTCTGCCGCGGATAGGCGGGTGAGGGAACGA : 525 Csin-RU-co : TTATCGAGTCTTTTCGGATCTTTGAAATTTATTTGTACAATATGGTCTGCCGCGGATAGGCGGGTGAGGGAACGA : 525 Csin-VN-co : TTATCGAGTCTTTTTGGATCTTTGAAATTTATTTGTACAATATGGTCTGCCGCGGATAGGCGGGTGAGGGAACGA : 525 Oviv-TH-co : TTATCTAGTCTTTTTGGGTCCTTGAAATTTATTTGTACTATATGGTCAGCAATGGATAGTCGGATTTTGGAGCGT : 525 Oviv-CN-co : TTATCTAGTCTTTTTGGGTCCTTGAAATTTATTTGTACTATATGGTCAGCAATGGATAGTCGGATTTTGGAGCGT : 525

Ofel-RU-co : TTGTCTAGTCTTTTTGGGTCTTTGAATTTTATCTGTACTATTTGGTCTGCCATGGATAAGCGGGTTTTGGAGCGT : 525 Phet-VN-co : TTCTAGTCTTTTTGGTTCGTTGAAATTTATTTGTACTATCGTCAGGGCGTTGTGTGAGCATACTGTGGGTCGGAG : 524 Pohi-JP-co : ATCTAGTCTTTTGGGTTCCTTAAATTTTATTTGTACTATTGTTAGGGCGTTATGCGAGCATACGGTGGGTCGTAG : 521 Pwes(2n)-K : CTCGAGCCTTCTTGGTTCCTTGAAATTCATTTGCACCATTGTTAGGGCGTTGTGTGAGCACACTGTGGGTCGCAG : 524 Pwes(3n)KR : CTCGAGCCTTCTTGGTTCCTTGAAATTCATTTGCACCATTGTTAGGGCGTTGTGTGAGCACACTGTGGGTCGCAG : 524 Ejap-VN-co : GGTGTCTCTAGTTTACTTGGTTCAATAaATTTTATTTGTACAATTGTGGAGGTGATGTTGGAGGAGAGTACTGCT : 525 Htai-KR-co : TCTAGTCTGTTTGGTTCTTTAAACTTTATTTGTACAATAATGAGGGCTATGAGTAATGATACCAGGGAGCGGTAC : 525 Htai-LA-co : TCTAGTCTGTTTGGTTCTTTAAACTTTATTTGTACAATAATGAGGGCTATGAGTAATGATACCAGGGAGCGGTAC : 525 Htai-VN-co : TCTAGTCTGTTTGGTTCTTTAAACTTTATTTGTACAATAATGAGGGCTATGAGTAATGATACCAGGGAGCGGTAC : 525 Sfal-VN-co : TCTAGGGTGTTTGGGTCACTGAATTTTGTTTGTACTATCCTGGAGGTGATGCTGGGAAGGATGAGCGAGCGGTAT : 525 * 540 * 560 * 580 * 600 FspNB-VN-c : CGTCATAGTATTTTAGTTTGGGCTTATTTGTTTACTTCTATTTTGTTGTTATTGTCTTTGCCGGTTTTAGCTGCT : 600 FspCB-VN-c : CGTCATAGTATTTTAGTTCGGGCTTATTTGTTTACTTCTATTTTGTTGTTATTGTCTTTGCCGGTTTTAGCTGCT : 600 Fhep-AU-co : CGGCATAGTATTTTGGTTTGGGCTTATCTATTTACTTCTGTTTTATTGTTGTTGTCATTGCCTGTTTTGGCTGCT : 600 FspGHL-CN- : CGTCATAGTATTTTAGTTCGGGCTTATTTGTTTACTTCTATTTTGTTGTTATTGTCTTTGCCGGTTTTAGCTGCT : 600 Fgig-CN-co : CGTCATAGTATTTTAGTTTGGGCTTATTTGTTTACTTCTATTTTGTTGTTGTTGTCTTTGCCGGTTTTAGCTGCT : 600 Fgig-ID-co : CGTCATAGTATTTTAGTTTGGGCTTATTCGTTTACTTCTATTTTGTTGTTATTGTCTTTGCCGGTTTTAGCTGCT : 600 Fbus(human : CGTTTGAGTATTTTGGTTTGGGCTTATTTGTTTACTTCTATTTTATTGCTTTTATCTTTGCCTGTATTAGCTGCT : 600 Fbus(swine : CGTTTGAGTATTTTGGTTTGGGCTTATTTGTTTACTTCTATTTTATTGCTTTTATCTTTGCCTGTATTAGCTGCT : 600 Csin-CN-co : CACTCTATAATAGTTTGGGCTTATTTGTTTACGTCTATCTTGTTGTTGGGTACGTTGCCTGTTTTAGCTGCTGGT : 600 Csin-KR-co : CACTCTATAATAGTTTGGGCTTATTTGTTTACGTCTATCTTGTTGTTGGGTACGTTGCCTGTTTTAGCTGCTGGT : 600 Csin-RU-co : CACTCTATAATAGTTTGGGCTTATTTGTTTACGTCTATCTTGTTGTTGGGTACGTTGCCTGTTTTAGCTGCTGGT : 600 Csin-VN-co : CACTCTATAATAGTTTGGGCTTATTTGTTTACGTCTATCTTGTTGTTGGGTACGTTGCCTGTTTTAGCTGCTGGT : 600 Oviv-TH-co : CATTCAATTATAGTGTGGGCTTATATGTTTACTTCAATTTTGTTGCTGGGTACGTTGCCCGTTTTGGCGGCTGGT : 600 Oviv-CN-co : CATTCAATTATAGTGTGGGCTTATATGTTTACTTCAATTTTGTTGCTGGGTACGTTGCCCGTTTTGGCGGCTGGT : 600 Ofel-RU-co : CATTCTATCATAATTTGGGCTTATCTATTTACTTCTTTTTTGTTGTTGGGTACATTGCCTGTTTTGGCGGCTGCT : 600 Phet-VN-co : GTCTATAATTGTTTGGGCCTATCTTTTTACGTCTATCTTGTTGCTTCTTTCTTTGCCGGTGCTTGCTGCTGCGAT : 599 Pohi-JP-co : GTCTATAATTGTTTGGGCGTATCTTTTTACGTCTGTTTTGTTACTACTTTCTTTACCAGTATTAGCGGCTGCAAT : 596 Pwes(2n)-K : GTCAATAATTGTCTGGGCTTATCTCTTCACCTCTGTTCTGCTGCTCCTCTCTTTACCTGTGCTTGCTGCTGCGAT : 599 Pwes(3n)KR : GTCAATAATTGTCTGGGCTTATCTCTTCACCTCTGTTCTGCTGCTCCTCTCTTTACCTGTGCTTGCTGCTGCGAT : 599 Ejap-VN-co : CGTCATAGGGTGTTGGTTTGAGGGTATTTGTTCACGTCGATCTTGTTGTTGCTtTCTTTGCCTGtATTAGCGGCT : 600 Htai-KR-co : TCTATTGTGGTTTGGGCTTATTTGTTTACTTCTATTCTTTTGTTGCTTTCGTTACCAGTGCTAGCTGCGGGTATA : 600 Htai-LA-co : TCTATTGTGGTTTGGGCTTATTTGTTTACTTCTATTCTTTTGTTGCTTTCGTTACCAGTGCTAGCTGCGGGTATA : 600 Htai-VN-co : TCTATTGTGGTTTGGGCTTATTTGTTTACTTCTATTCTTTTGTTGCTTTCGTTACCAGTGCTAGCTGCGGGTATA : 600 Sfal-VN-co : TCAATCATTGTTTGGGCGTATCTTTTTACTTCAATTTTGCTTTTGTTGTCGTTGCCTGTGTTGGCTGCGGGTATT : 600 * 620 * 640 * 660 * FspNB-VN-c : GCTATTACTATGTTGTTGTTTGATCGTAAATTTAGTTCTGCTTTTTTTGATCCTATGGGGGGTGGCGATCCTGTC : 675 FspCB-VN-c : GCTATTACTATGTTGTTGTTTGATCGTAAATTTAGTTCTGCTTTTTTTGATCGTATGGGGGGTGGTGATCCTGTC : 675 Fhep-AU-co : GCTATTACTATGTTGTTATTTGATCGTAAATTTGGTTCTGCTTTTTTTGATCCTATGGGAGGTGGGGATCCTGTT : 675 FspGHL-CN- : GCTATTACTATGTTGTTGTTTGATCGTAAATTTAGTTCTGCTTTTTTTGATCCTATGGGGGGTGGTGATCCTGTC : 675 Fgig-CN-co : GCTATTACTATGTTGTTGTTTGATCGTAAATTTAGTTCTGCTTTTTTTGATCCTATGGGGGGTGGCGATCCTGTC : 675 Fgig-ID-co : GCTATTACTATGTTGTTGTTTGATCGTAAATTTAGTTCTGCTTTTTTTGATCCTATGGGGGGTGGCGATCCTGTC : 675 Fbus(human : GCTATAACTATGTTATTGTTTGATCGTAGTTTTGGGTCTGCATTTTTTGATCCTATGGGGGGGGGAGATCCGGTG : 675 Fbus(swine : GCTATAACTATGTTATTGTTTGATCGTAGTTTTGGGTCTGCATTTTTTGATCCTATGGGGGGGGGAGATCCGGTG : 675 Csin-CN-co : ATAACTATGCTTCTTTTTGATCGTAAATTTGGTACAGTGTTTTTTGATCCGTCGGGTGGGGGTGATCCTTTGTTG : 675 Csin-KR-co : ATAACTATGCTTCTTTTTGATCGTAAATTTGGTACAGTGTTTTTTGATCCGTCGGGTGGGGGTGATCCTTTGTTG : 675 Csin-RU-co : ATAACTATGCTTCTTTTTGATCGTAAATTTGGTACAGTGTTTTTTGATCCGTCGGGTGGGGGTGATCCTTTGTTG : 675 Csin-VN-co : ATAACTATGCTTCTTTTTGATCGTAAATTTGGTACAGTGTTTTTTGATCCGTCGGGTGGGGGTGATCCTTTGTTG : 675 Oviv-TH-co : ATAACTATGCTTCTTTTTGATCGTAAATTTGGTACTGTGTTTTTTGATCCGTCTGGGGGTGGTGATCCGTTGTTG : 675 Oviv-CN-co : ATAACTATGCTTCTTTTTGATCGTAAATTTGGTACTGTGTTTTTTGATCCGTCTGGGGGTGGTGATCCGTTGTTG : 675 Ofel-RU-co : ATAACCATGCTTCTTTTTGATCGTAATTTTGGTACTGTGTTTTTTGATCCATCCGGTGGGGGTGATCCTGTGTTA : 675 Phet-VN-co : TACCATGCTTTTGTTTGATCGAAAATTTAGTTCTGCTTTTTTTGACCCCCTTGGTGGTGGTGATCCTGTTTTATT : 674 Pohi-JP-co : TACCATGCTTTTGTTTGATCGTAAATTTAGTTCTGCTTTTTTTGATCCCTTGGGTGGAGGTGATCCTGTTTTGTT : 671 Pwes(2n)-K : CACCATGCTTTTGTTCGATCGGAAATTTAGTTCTGCCTTTTTTGATCCGTTGGGGGGTGGAGATCCCGTTTTGTT : 674 Pwes(3n)KR : CACCATGCTTTTGTTCGATCGGAAATTTAGTTCTGCCTTTTTTGATCCGTTGGGGGGTGGAGATCCCGTTTTGTT : 674 Ejap-VN-co : GCTATTACGATGTTGTTGTTTGATCGTAAATTTGGGGCTTCATTTTTTGATCCGATGGGAGGTGGGGATCCTGTG : 675 Htai-KR-co : ACGATGCTTTTGTTTGATCGTAAATTTAGCTCTTCTTTTTTTGATCCATTGGGAGGGGGGGACCCTGTCTTGTTC : 675 Htai-LA-co : ACGATGCTTTTGTTTGATCGTAAATTTAGCTCTTCTTTTTTTGATCCATTGGGAGGGGGGGACCCTGTCTTGTTC : 675 Htai-VN-co : ACGATGCTTTTGTTTGATCGTAGATTTAGCTCTTCTTTTTTTGATCCATTGGGAGGGGGGGACCCTGTCTTGTTC : 675 Sfal-VN-co : ACCATGCTTCTTTTTGATCGTAACTTTGGTTCTGCCTTTTTTGATCCTTTGGGTGGGGGAGACCCCGTTTTGTTC : 675 680 * 700 * 720 * 740 * FspNB-VN-c : TTATTTCAGCATTTGTTTTGGTTTTTTGGTCATCCGGAGGTTTATGTTTTAATTTTGCCTGGGTTTGGGGTTATT : 750 FspCB-VN-c : TTATTTCAGCATTTGTTTTGGTTTATTGGTCATCCGGAAGTTTATGCTTTGATTTTGCCTGGGTTTGGAGTTATT : 750 Fhep-AU-co : TTATTTCAGCATTTGTTTTGGTTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTATGTTTTGATTTTACCCGGGTTTGGGGTTATT : 750 FspGHL-CN- : TTATTTCAGCATTTGTTTTGGTTTATTGGTCATCCGGAAGTTTATGCTTTGATTTTGCCTGGGTTTGGAGTTATT : 750 Fgig-CN-co : TTATTTCAGCATTTGTTTTGGTTTTTTGGTCATCCGGAGGTTTATGTTTTAATTTTGCCTGGGTTTGGGGTTATT : 750 Fgig-ID-co : TTATTTCAGCATTTGTTTTGGTTTTTTGGTCATCCGGAGGTTTATGTTTTAATTTTGCCTGGGTTTGGGGTTATT : 750 Fbus(human : TTGTTTCAGCATTTGTTTTGGTTTTTTGGGCATCCCGAGGTGTATGTTTTGATTTTGCCAGGGTTTGGTGTGATT : 750 Fbus(swine : TTGTTTCAGCATTTGTTTTGGTTTTTTGGGCATCCCGAGGTGTATGTTTTGATTTTGCCAGGGTTTGGTGTGATT : 750 Csin-CN-co : TTTCAGCATATGTTTTGGTTTTTTGGTCATCCTGAGGTGTATGTGTTAATATTGCCGGGGTTTGGTATGATTAGT : 750 Csin-KR-co : TTTCAGCATATGTTTTGGTTTTTTGGTCATCCTGAGGTGTATGTGTTAATATTGCCGGGGTTTGGTATGATTAGT : 750 Csin-RU-co : TTTCAGCATATGTTTTGGTTTTTTGGTCATCCTGAGGTGTATGTGTTAATATTGCCGGGGTTTGGTATGATTAGT : 750 Csin-VN-co : TTTCAGCATATGTTTTGGTTTTTTGGTCATCCTGAGGTGTATGTGTTAATATTGCCGGGGTTTGGTATGATTAGT : 750 Oviv-TH-co : TTTCAACATATGTTTTGGTTTTTCGGTCATCCGGAAGTATACGTGTTGATTTTGCCAGGATTCGGTATGATTAGT : 750 Oviv-CN-co : TTTCAACATATGTTTTGGTTTTTCGGTCATCCGGAAGTATACGTGTTGATTTTGCCAGGATTCGGTATGATTAGT : 750 Ofel-RU-co : TTTCAGCATATGTTTTGGTTTTTTGGTCATCCGGAGGTGTATGTGTTAATATTGCCGGGGTTTGGAATGATTAGT : 750 Phet-VN-co : TCAACACCTTTTTTGGTTTTTTGGCCATCCGGAGGTGTATGTTTTAATTTTGCCTGGATTTGGTGTTGTGAGACA : 749 Pohi-JP-co : CCAGCATTTGTTTTGGTTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTATGTTTTAATTTTACCAGGATTTGGGATTGTGAGACA : 746 Pwes(2n)-K : TCAGCATTTGTTTTGGTTCTTTGGGCATCCGGAGGTGTATGTCCTGATTTTGCCTGGGTTTGGTATCGTGAGCCA : 749 Pwes(3n)KR : TCAGCATTTGTTTTGGTTCTTTGGGCATCCGGAGGTGTATGTCCTGATTTTGCCTGGGTTTGGTATCGTGAGCCA : 749 Ejap-VN-co : TTGTTTCAGCATTTATTTTGGTTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTATGTTTTAATTTTGCCTGCTTTTGGAGTAATT : 750 Htai-KR-co : CAGCATATGTTTTGGTTTTTTGGGCACCCCGAAGTTTACGTTCTTATCCTCCCAGGGTTTGGTATAGTGAGACAC : 750 Htai-LA-co : CAGCATATGTTTTGGTTTTTTGGGCACCCCGAAGTTTACGTTCTTATCCTCCCAGGGTTTGGTATAGTGAGACAC : 750 Htai-VN-co : CAGCATATGTTTTGGTTTTTTGGGCACCCCGAAGTTTACGTTCTTATTCTCCCAGGGTTTGGTATAGTGAGACAC : 750

Sfal-VN-co : CAGCATATGTTTTGATTCTTTGGTCATCCCGAGGTTTACGTTTTGATTCTCCCTGGGTTTGGTATTGTTAGTCAT : 750 760 * 780 * 800 * 820 FspNB-VN-c : AGTCATATTTGTATGACTTTGACTAATAATGATTCTTTATTTGGTTATTATGGTCTTATTTTGGCCATGGCTGCT : 825 FspCB-VN-c : AGTCATATTTGTATGACTTTGACTAATAATGATTCTTTATTTGGTTATTATGGTCTTATTTTGGCTATGGCTGCT : 825 Fhep-AU-co : AGTCATATTTGTGTGACTTTAACTAATAATGATTCTTTGTTTGGTTATTATGGTCTTATTTTAGCTATGGCTGCT : 825 FspGHL-CN- : AGTCATATTTGTATGACTTTGACTAATAATGATTCTTTATTTGGTTATTATGGTCTTATTTTGGCTATGGCTGCT : 825 Fgig-CN-co : AGCCATATTTGTATGACTTTGACTAATAATGATTCTTTATTTGGTTATTATGGTCTTATTTTGGCTATGGCTGCT : 825 Fgig-ID-co : AGTCATATTTGTATGACTTTGACTAATAATGATTCTTTATTTGGTTATTATGGTCTTATTTTGGCTATGGCTGCT : 825 Fbus(human : AGACATATTTGTGTTACTTTGACTAATAAAGATTCTTTGTTTGGTTATTATGGGCTTGTTTTGGCTATGGCTGCT : 825 Fbus(swine : AGACATATTTGTGTTACTTTGACTAATAAAGATTCTTTGTTTGGTTATTATGGGCTTGTTTTGGCTATGGCTGCT : 825 Csin-CN-co : CACATTTGTACTACTTTAACAGGTAAAGATTCGTTGTTTGGTTATGGGGGCTTGGTGTTGGCTATGTTTGCTGTA : 825 Csin-KR-co : CACATTTGTACTACTTTAACAGGTAAAGATTCGTTGTTTGGTTATGGGGGCTTGGTGTTGGCTATGTTTGCTGTA : 825 Csin-RU-co : CACATTTGTACTACTTTAACAGGTAAAGATTCGTTGTTTGGTTATGGGGGCTTGGTGTTGGCTATGTTTGCTATA : 825 Csin-VN-co : CACATTTGTACTACTTTAACAGGTAAAGATTCGTTGTTTGGTTATGGGGGCTTGGTGTTGGCTATGTTTGCTATA : 825 Oviv-TH-co : CATATCTGTACTACGTTAACTGGTAATGATTCTTTGTTCGGTTATGGGGGTTTGGTGTTGGCCATGTTTGCTATA : 825 Oviv-CN-co : CATATCTGTACTACGTTAACTGGTAATGATTCTTTGTTCGGTTATGGTGGTTTGGTGTTGGCCATGTTTGCTATA : 825 Ofel-RU-co : CATGTTTGTACGACTCTAACAGGGAAAGATTCCCTATTTGGTTATGGTGGTTTGGTGTTAGCCATGTTTGCTATA : 825 Phet-VN-co : TATCTGCATGACTTTGACTAATAAAGATTCTTTGTTTGGTTATTATGGCTTGGTTTTTGCTATGGGGGCTATTGT : 824 Pohi-JP-co : TATTTGTATGACTCTAACTAATAAAGATTCGTTGTTTGGTTATTATGGATTGGTGTTTGCTATGGGGGCGATTGT : 821 Pwes(2n)-K : CATTTGCATGACCCTGACCAACAACGATTCCTTGTTCGGGTACTACGGGCTGGTGTTTGCGATGGGGGCCATTGT : 824 Pwes(3n)KR : CATTTGCATGACCCTGACCAACAACGATTCCTTGTTCGGGTACTACGGGCTGGTGTTTGCGATGGGGGCCATTGT : 824 Ejap-VN-co : AGGCATATTTGTGTAACGCTGACTAATAAAGATTCTTTATTTGGTTATTATGGTTTGGTGTTAGCTATGGCGGCT : 825 Htai-KR-co : ATTTGTAGGACGTTAACAAATAAAGATTCCTTGTTTGGTTATGGGGGTTTAGTTCTTGCTATGTTTTCTATAGTC : 825 Htai-LA-co : ATTTGTAGGACGTTAACAAATAAAGATTCCTTGTTTGGTTATGGGGGTTTAGTTCTTGCTATGTTTTCTATAGTC : 825 Htai-VN-co : ATTTGTAGGACGTTAACAAATAAAGATTCCTTGTTTGGTTATGGGGGTTTAGTTCTTGCTATGTTTTCTATAGTC : 825 Sfal-VN-co : GTTTGCATGACTCTAACGAACAATGATTCCTTGTTTGGTTACGGGGGTCTGGTCCTTGCTATGTTTTCTATTGTC : 825 * 840 * 860 * 880 * 900 FspNB-VN-c : ATAGTATGTTTGGGTAGTGTTGTTTGGGCTCATCATATGTTTATGGTGGGTTTGGATGTACATACTGCTGTTTTT : 900 FspCB-VN-c : ATAGTATGTTTGGGTAGTGTTGTTTGGGCTCATCATATGTTTATGGTGGGTTTGGATGTACATACTGCTGTTTTT : 900 Fhep-AU-co : ATAGTATGTTTAGGTAGTGTTGTTTGGGCTCATCATATGTTTATGGTGGGTTTGGATGTGCATACTGCTGTTTTT : 900 FspGHL-CN- : ATAGTATGTTTGGGTAGTGTTGTTTGGGCTCATCATATGTTTATGGTGGGTTTGGATGTACATACTGCTGTTTTT : 900 Fgig-CN-co : ATAGTATGTTTGGGTAGTGTTGTTTGGGCTCATCATATGTTTATGGTGGGTTTGGATGTACATACTGCTGTTTTT : 900 Fgig-ID-co : ATAGTATGTTTGGGTAGTGTTGTTTGGGCTCATCATATGTTTATGGTGGGTTTGGATGTACATACTGCTGTTTTT : 900 Fbus(human : ATAGTTTGTTTGGGTAGTATAGTTTGGGCACATCATATGTTTATGGTTGGTTTGGATGTGCATACTGCTGTTTTT : 900 Fbus(swine : ATAGTTTGTTTGGGTAGTATAGTTTGGGCACATCATATGTTTATGGTTGGTTTGGATGTGCATACTGCTGTTTTT : 900 Csin-CN-co : GTTTGTCTGGGTAGGGTGGTTTGAGCTCATCATATGTTTACTGTTGGGCTGGATTTGGGGACTGCTGTTTTTTTT : 900 Csin-KR-co : GTTTGTCTGGGTAGGGTGGTTTGAGCTCATCATATGTTTACTGTTGGGCTGGATTTGGGGACTGCTGTTTTTTTT : 900 Csin-RU-co : GTTTGTCTGGGTAGGGTGGTTTGAGCTCATCATATGTTTACTGTTGGGCTGGATTTGGGGACTGCTGTTTTTTTT : 900 Csin-VN-co : GTTTGTCTGGGTAGGGTGGTTTGAGCTCATCATATGTTTACTGTTGGGCTGGATTTGGGGACTGCTGTTTTTTTT : 900 Oviv-TH-co : GTCTGTTTAGGAAGGGTGGTTTGGGCTCATCATATGTTTACGGTTGGGCTGGATTTGGGCACCGCTGTGTTTTTT : 900 Oviv-CN-co : GTCTGTTTAGGAAGGGTGGTTTGGGCTCATCATATGTTTACGGTTGGGCTGGATTTGGGCACCGCTGTGTTTTTT : 900 Ofel-RU-co : GTTTGTTTGGGTAGTGTGGTTTGAGCTCATCATATGTTTACTGTAGGATTAGATTTAGGGACTGCTATTTTTTTT : 900 Phet-VN-co : GTGTTTGGGGAGGGTTGTTTGAGCGCACCACATGTTTATGGTTGGTTTAGATGTTAAGACTGCTGTTTTTTTTAG : 899 Pohi-JP-co : GTGTTTGGGAAGTGTTGTCTGGGCCCACCATATGTTTATGGTTGGTTTGGATGTTAAGACTGCAGTATTTTTCAG : 896 Pwes(2n)-K : GTGTCTGGGTAGTGTTGTGTGGGCGCATCACATGTTCATGGTTGGTTTGGATGTCAAGACTGCTGTTTTCTTTAG : 899 Pwes(3n)KR : GTGTCTGGGTAGTGTTGTGTGGGCGCATCACATGTTCATGGTTGGTTTGGATGTCAAGACTGCTGTTTTCTTTAG : 899 Ejap-VN-co : ATTGTGTGTCTGGGTAGTATAGTTTGGGCACATCATATGTTTATGGTTGGGTTGGATATAGATACCGCGGTGTTT : 900 Htai-KR-co : TGTTTGGGGAGTGTTGTTTGAGCTCATCATATGTTTATGGTTGGGTTGGATGTTAAGACGGCTGTTTTTTTTAGT : 900 Htai-LA-co : TGTTTGGGGAGTGTTGTTTGAGCTCATCATATGTTTATGGTTGGGTTGGATGTTAAGACGGCTGTTTTTTTTAGT : 900 Htai-VN-co : TGTTTGGGGAGTGTTGTTTGAGCTCATCATATGTTTATGGTTGGGTTGGATGTTAAGACGGCTGTTTTTTTTAGT : 900 Sfal-VN-co : TGTCTGGGGAGTATTGTTTGGGCACATCATATGTTTATGGTAGGTCTGGATTTGAAGACTGCGGTATTTTTTAGG : 900 * 920 * 940 * 960 * FspNB-VN-c : TTTAGTTCTGTTACTATGGTTATTGGTATTCCTACAGGGATTAAGGTTTTTTCTTGGTTAATAATGTTGGGGGGT : 975 FspCB-VN-c : TTTAGTTCTGTTACTATGGTTATTGGTATCCCTACCGGGATTAAGGTTTTTTCTTGGTTAATAATGTTGGGGGGT : 975 Fhep-AU-co : TTTAGTTCTGTTACTATGGTTATTGGTATTCCTACAGGTATTAAGGTCTTTTCCTGGTTGATAATGTTGGGGGGG : 975 FspGHL-CN- : TTTAGTTCTGTTACTATGGTTATTGGTATCCCTACCGGGATTAAGGTTTTTTCTTGGTTAATAATGTTGGGGGGT : 975 Fgig-CN-co : TTTAGTTCTGTTACTATGGTTATTGGTATTCCTACTGGGATTAAGGTTTTCTCTTGATTAATAATGTTGGGGGGT : 975 Fgig-ID-co : TTTAGTTCTGTTACTATGGTTATTGGTATTCCTACAGGGATTAAGGTTTTTTCTTGGTTAATAATGTTGGGGGGT : 975 Fbus(human : TTTAGTTCTGTTACTATGGTGATTAGTATTCCCACAGGTATTAAGGTTTTTTCTTGGTTGATAATGTTAGGGGGG : 975 Fbus(swine : TTTAGTTCTGTTACTATGGTGATTAGTATTCCCACAGGTATTAAGGTTTTTTCTTGGTTGATAATGTTAGGGGGG : 975 Csin-CN-co : AGCTCGGTTACTATGATTATAGGTGTGCCTACGGGGATCAAGGTTTTTTCATGATTATATATGCTTGCTGGAACT : 975 Csin-KR-co : AGCTCGGTTACTATGATTATAGGTGTGCCTACGGGGATCAAGGTTTTTTCATGATTATATATGCTTGCTGGAACT : 975 Csin-RU-co : AGCTCGGTTACTATGATTATAGGTGTGCCTACGGGGATCAAGGTTTTTTCATGATTATATATGCTTGCTGGAACT : 975 Csin-VN-co : AGCTCGGTTACTATGATTATAGGTGTGCCTACGGGGATCAAGGTTTTTTCATGATTATATATGCTTGCTGGAACT : 975 Oviv-TH-co : AGCTCGGTTACTATGATTATAGGGGTTCCTACTGGAATAAAGGTTTTTTCTTGGTTGTATATGCTTGCGGGTACT : 975 Oviv-CN-co : AGCTCGGTTACTATGATTATAGGGGTTCCTACTGGAATAAAGGTTTTTTCTTGGTTGTATATGCTTGCGGGTACT : 975 Ofel-RU-co : AGTTCAGTTACTATGATCATTGGTGTACCTACAGGGATAAAGGTTTTTTCTTGATTATACATGCTTGCCGGTACT : 975 Phet-VN-co : TTCTGTTACTGGGGTGATTGGGATTCCCACAGGGATTAAGGTTTTTTCTTGGTTGTTTATGTTGGGGGGGACTCG : 974 Pohi-JP-co : ATCTGTTACGGGGGTGATAGGTATTCCTACAGGGATTAAGGTTTTTTCTTGGTTATTTATGTTAGGGGGTACTCG : 971 Pwes(2n)-K : TTCTGTCACGGGAGTGATTGGGATACCCACGGGGATTAAGGTTTTCTCTTGGTTGTTCATGCTGGGTGGAACTCG : 974 Pwes(3n)KR : TTCTGTCACGGGAGTGATTGGGATACCCACGGGGATTAAGGTTTTCTCTTGGTTGTTCATGCTGGGTGGAACTCG : 974 Ejap-VN-co : TTTAGGTCTGTGACGATGGTTATTGGTATCCCTACAGGCATTAAGGTTTTTTCTTGGTTGGTTATGTTAAGTGGT : 975 Htai-KR-co : TCTGTGACCATGGTTATAGGAGTCCCCACAGGTATAAAGGTTTTTTCTTGGCTGTATATGTTGGCGGGAAGTCGG : 975 Htai-LA-co : TCTGTGACCATGGTTATAGGAGTCCCCACAGGTATAAAGGTTTTTTCTTGGCTGTATATGTTGGCGGGAAGTCGG : 975 Htai-VN-co : TCTGTGACCATGGTTATAGGAGTCCCCACAGGTATAAAGGTTTTTTCTTGGCTGTATATGTTGGCGGGAAGTCGG : 975 Sfal-VN-co : TCTGTAACTATGATTATCGGTGTTCCTACAGGTATTAAGGTGTTTTCGTGGTTGTATATGTTGGCTGGAAGCCGT : 975 980 * 1000 * 1020 * 1040 * FspNB-VN-c : GGTGGTTCTGTTCGTATTTGGGATCCTGTTATATGATGGATTGTTGGTTTTGTTGTTTTGTTTACTATTGGTGGG : 1050 FspCB-VN-c : GGTAGTTCTGTTCGTATTTGGGATCCTGTTGTATGATGGATTGTTGGTTTTGTTGTTTTGTTTACTATTGGTGGG : 1050 Fhep-AU-co : GGTAGTTCTGTTCGTATATGGGATCCTGTTGTGTGGTGAATTATAGGGTTTATTGTTTTATTTACTATTGGTGGG : 1050 FspGHL-CN- : GGTAGTTCTGTTCGTATTTGGGATCCTGTTGTATGATGGATTGTTGGTTTTGTTGTTTTGTTTACTATTGGTGGG : 1050 Fgig-CN-co : GGTAGTTCTGTTCGTATTTGGGATCCTGTTGTATGATGGATTGTTGGTTTTGTTGTTTTGTTTACTATTGGTGGG : 1050 Fgig-ID-co : GGTGGTTCTGTTCGTATTTGGGATCCTGTTATATGATGGATTGTTGGTTTTGTTGTTTTGTTTACTATTGGTGGG : 1050 Fbus(human : GGTAGATTTGTTCGTATTTGGGATCCCATAGTGTGATGAATTGTGGGGTTTGTTGTGTTGTTTACTATAGGGGGG : 1050

Fbus(swine : GGTAGATTTGTTCGTATTTGGGATCCCATAGTGTGATGAATTGTGGGGTTTGTTGTGTTGTTTACTATAGGGGGG : 1050 Csin-CN-co : CGGGAGCGTCTATGAGACCCAATCATGTGGTGGATAATCGGGTTTGTGGTGCTTTTCACTATAGGCGGGGTTACT : 1050 Csin-KR-co : CGGGAGCGTCTATGAGACCCAATCATGTGGTGGATAATCGGGTTTGTGGTGCTTTTCACTATAGGCGGGGTTACT : 1050 Csin-RU-co : CGGGAGCGTCTATGAGATCCAATCATGTGGTGGATAATCGGGTTTGTGGTGCTTTTCACTATAGGCGGGGTTACT : 1050 Csin-VN-co : CGGGAGCGTCTATGAGATCCAATCATGTGGTGGATAATCGGGTTTGTGGTGCTTTTCACTATAGGCGGGGTTACT : 1050 Oviv-TH-co : CGTGAGCGTTTTTGGGACCCGATTATGTGGTGGATAGTTGGGTTCGTAGTACTTTTTACTATAGGGGGGGTTACC : 1050 Oviv-CN-co : CGTGAGCGTTTTTGGGACCCGATTATGTGGTGGATAGTTGGGTTCGTAGTACTTTTTACTATAGGGGGGGTTACC : 1050 Ofel-RU-co : CGAGATCGTCTTTGGGATCCGATTATGTGGTGGATAATCGGATTTATAGTGCTTTTTACTATAGGTGGGGTTACT : 1050 Phet-VN-co : TTTACGGTTTTGAGATCCGGTGGTTTGGTGAATTTTAGGCTTTATTTTTCTTTTTACTATTGGTGGTGTAACTGG : 1049 Pohi-JP-co : TCTACGGTTTTGGGATCCTGTAATATGATGAATTCTTGGGTTTATCTTTTTGTTTACAATAGGGGGTGTAACTGG : 1046 Pwes(2n)-K : TTTGCGGTTTTGGGATCCTGTTTTGTGGTGAATTCTTGGGTTTATCTTCCTGTTCACCATAGGTGGTGTGACCGG : 1049 Pwes(3n)KR : TTTGCGGTTTTGGGATCCTGTTTTGTGGTGAATTCTTGGGTTTATCTTCCTGTTCACCATAGGTGGTGTGACCGG : 1049 Ejap-VN-co : AGGATGTCTCGTTTAGGGGACCCTATAATTTGGTGGATTGTGGGGTTTATAGGATTGTTCACTATAGGGGGAGTG : 1050 Htai-KR-co : GGCCGGTTTTGGGATCCGATAATGTGGTGGATATTGGGTTTTATTGTCTTATTTACTATCGGGGGGGTGACCGGG : 1050 Htai-LA-co : GGCCGGTTTTGGGATCCGATAATGTGGTGGATATTGGGTTTTATTGTCTTATTTACTATCGGGGGGGTGACCGGG : 1050 Htai-VN-co : GGCCGGTTTTGGGATCCGATAATGTGGTGGATATTGGGTTTTATTGTCTTATTTACTATCGGGGGGGTGACCGGG : 1050 Sfal-VN-co : GGCCGTTTTTGAGATCCGGTGATGTGGTGGATACTGGGATTCATCGTCTTGTTTACCATCGGGGGTATTACGGGT : 1050 1060 * 1080 * 1100 * 1120 FspNB-VN-c : GTTACTGGTATTATGCTTTCTGCTTCTCTTTTGGATACGTTGCTTCATGATACGTGGTTTGTGGTTGCTCATTTT : 1125 FspCB-VN-c : GTTACTGGTATTATGCTTTCTGCTTCTCTTTTGGATACGTTGCTTCATGATACGTGGTTTGTGGTTGCTCATTTT : 1125 Fhep-AU-co : GTTACTGGTATTATGCTTTCTGCTTCTCTTTTGGATACTTTGCTTCATGATACATGGTTTGTGGTTGCTCATTTT : 1125 FspGHL-CN- : GTTACTGGTATTATGCTTTCTGCTTCTCTTTTGGATACGTTGCTTCATGATACGTGGTTTGTGGTTGCTCATTTT : 1125 Fgig-CN-co : GTTACTGGTATTATGCTTTCTGCTTCTCTTTTGGATACGTTGCTTCATGATACGTGGTTTGTGGTTGCTCATTTT : 1125 Fgig-ID-co : GTTACTGGTATTATGCTTTCTGCTTCTCTTTTGGATACGTTGCTTCATGATACGTGGTTTGTGGTTGCTCATTTT : 1125 Fbus(human : GTTACTGGTATTATGCTTTCTGCTTCTATTTTGGATACTTTGTTGCATGATACTTGGTTTGTTGTGGCTCATTTC : 1125 Fbus(swine : GTTACTGGTATTATGCTTTCTGCTTCTATTTTGGATACTTTGTTGCATGATACTTGGTTTGTTGTGGCTCATTTC : 1125 Csin-CN-co : GGGATAGTTCTTTCTGCTTCTGTAATTGATGCCTTGTTTCATGATACTTGGTTTGTTATTGCTCATTTTCATTAT : 1125 Csin-KR-co : GGGATAGTTCTTTCTGCTTCTGTAATTGATGCCTTGTTTCATGATACTTGGTTTGTTATTGCTCATTTTCATTAT : 1125 Csin-RU-co : GGGATAGTTCTTTCTGCTTCTGTAATTGATGCCTTGTTTCATGATACTTGGTTTGTTATTGCTCATTTTCATTAT : 1125 Csin-VN-co : GGGATAGTTCTTTCTGCTTCTGTAATTGATGCCTTGTTTCATGATACTTGGTTTGTTATTGCTCATTTTCATTAT : 1125 Oviv-TH-co : GGTATAGTTCTTTCTGCTTCGGTTATAGATGCTTTATTTCATGATACTTGATTTGTTATAGCTCATTTTCATTAT : 1125 Oviv-CN-co : GGTATAGTTCTTTCTGCTTCGGTTATAGATGCTTTATTTCATGATACTTGATTTGTTATAGCTCATTTTCATTAT : 1125 Ofel-RU-co : GGGATAGTTCTTTCTGCCTCTGTGATTGATGCTCTTTTTCATGATACATGATTCGTTATTGCCCACTTTCATTAT : 1125 Phet-VN-co : GATTATTTTGTCTTCTTCTATTTTGGATAGTCTGTTACATGATACCTGGTTTGTTGTTGCTCACTTTCACTATGT : 1124 Pohi-JP-co : AATTATCTTGTCTTCTTCTATTTTGGACAGTTTATTGCATGACACTTGGTTTGTTGTTGCACATTTCCATTATGT : 1121 Pwes(2n)-K : CATCATTCTGTCCTCCTCCATACTGGATAGTCTGTTGCATGATACGTGGTTCGTCGTGGCTCATTTTCATTACGT : 1124 Pwes(3n)KR : CATCATTCTGTCCTCCTCCATACTGGATAGTCTGTTGCATGATACGTGGTTCGTCGTGGCTCATTTTCATTACGT : 1124 Ejap-VN-co : ACTGGGATTATGTTGTCTGCTTCTATATTGGATACTTTGTTGCATGATACTTGGTTTGTGGTGGCCCATTTTCAT : 1125 Htai-KR-co : ATTGTGTTGTCTTCTTCTATAATGGATACTTTGTTGCATGACACTTGATTTGTAATAGCTCACTTTCATTATGTT : 1125 Htai-LA-co : ATTGTGTTGTCTTCTTCTATAATGGATACTTTGTTGCATGACACTTGATTTGTAATAGCTCACTTTCATTATGTT : 1125 Htai-VN-co : ATTGTGTTGTCTTCTTCTATAATGGATACTTTGTTGCATGACACTTGATTTGTAATAGCTCATTTTCATTATGTT : 1125 Sfal-VN-co : GTAGTGCTTTCGTCTTCTGTGATGGATACTTTGATGCACGATACTTGATTTGTTATTGCTCATTTTCATTACGTT : 1125 * 1140 * 1160 * 1180 * 1200 FspNB-VN-c : CATTATGTTCTTTCTTTAGGTTCTTATAGTAGTGTTGTTATCTCTTTTATTTGGTGGTGGCCTATTGTTACGGGT : 1200 FspCB-VN-c : CATTATGTTCTTTCTTTAGGTTCTTATAGTAGTGTTGTTATCTCTTTTATTTGGTGGTGGCCTATTGTTACGGGT : 1200 Fhep-AU-co : CATTATGTTCTTTCTTTAGGGTCTTATAGAAGTGTTGTTATCTCTTTTATTTGGTGGTGGCCTGTTGTGACTGGT : 1200 FspGHL-CN- : CATTATGTTCTTTCTTTAGGTTCTTATAGTAGTGTTGTTATCTCTTTTATTTGGTGGTGGCCTATTGTTACGGGT : 1200 Fgig-CN-co : CATTATGTTCTTTCTTTAGGTTCTTATAGTAGTGTTGTTATCTCTTTTATTTGGTGGTGGCCTATTGTTACGGGT : 1200 Fgig-ID-co : CATTATGTTCTTTCTTTAGGTTCTTATAGTAGTGTTGTTATCTCTTTTATTTGGTGGTGGCCTATTGTTACGGGT : 1200 Fbus(human : CATTATGTTCTTTCATTAGGTTCTTATAGGAGTGTTGTTATATCTTTTATTTGATGGTGGCCAATAATTACTGAT : 1200 Fbus(swine : CATTATGTTCTTTCATTAGGTTCTTATAGGAGTGTTGTTATATCTTTTATTTGATGGTGGCCAATAATTACTGAT : 1200 Csin-CN-co : GTTTTATCCCTAGGGTCGTTTAGGACGGTTGTTATTTCTGTAATTTGGTGATGACCTGTGTTTACGGGGTATAGC : 1200 Csin-KR-co : GTTTTATCCCTAGGGTCGTTTAGGACGGTTGTTATTTCTGTAATTTGGTGATGACCTGTGTTTACGGGGTATAGC : 1200 Csin-RU-co : GTTTTATCCCTAGGGTCGTTTAGGACGGTTGTTATTTCTGTAATTTGGTGATGACCTGTGTTTACGGGGTATAGC : 1200 Csin-VN-co : GTTTTATCTTTAGGGTCGTTTAGGACGGTTGTTATTTCTGTAATTTGGTGATGACCTGTGTTTACGGGGTATAGC : 1200 Oviv-TH-co : GTGCTGTCATTAGGATCCTTTAGAACGGTGGTTATATCCGTTGTTTGGTGGTGGCCTGTTTTTACTGGTTACAGT : 1200 Oviv-CN-co : GTGCTGTCATTAGGATCCTTTAGAACGGTGGTTATATCCGTTGTTTGGTGGTGGCCTGTTTTTACTGGTTATAGT : 1200 Ofel-RU-co : GTTTTATCCTTGGGATCTTTTAGTACTGTTGTTATATCAATGATTTGGTGGTGGCCTGTGTTTACCGGGTTTAGC : 1200 Phet-VN-co : TCTATCTTTGGGATCTTATAGAACTGTGGTGATATCCCTCTTGTGATGATGGCCGGTTGTCACCGGGTTTAGCTT : 1199 Pohi-JP-co : TTTATCCCTGGGATCTTATAGCACTGTTGTAATATCCCTTCTGTGATGGTGGCCTATTGTGACCGGGTTTAGTTT : 1196 Pwes(2n)-K : CTTGTCTCTGGGGTCCTACAGGACCGTAGTGATATCCCTGTTGTGGTGGTGGCCCGTTGTTACGGGGTTCAGTTT : 1199 Pwes(3n)KR : CTTGTCTCTGGGGTCCTACAGGACCGTAGTGATATCCCTGTTGTGGTGGTGGCCCGTTGTTACGGGGTTCAGTTT : 1199 Ejap-VN-co : TATGTTTTATCCTTGGGTTCATATAGTGGTGTTGTGATTTCGTTTTTGTGGTGGTGGCCTATTATAACGGGGTAT : 1200 Htai-KR-co : TTATCGTTAGGTTCTTATAGGTCGGTGGTGATATCTATGATTTGATGATGGCCTGTGATAGTGGGTTATAGGTTG : 1200 Htai-LA-co : TTATCGTTAGGTTCTTATAGGTCGGTGGTGATATCTATGATTTGATGATGGCCTGTGATAGTGGGTTATAGGTTG : 1200 Htai-VN-co : ttatcgTTAGGTTCTTATATGTCgGTGGTGATATCTATGATTTGATGATGGCCTGTGATAGTGGGTTATAGGTTG : 1200 Sfal-VN-co : TTGTCTTTAGGATCGTACAGTACTGTTGTAATCTCGTTGATCTGGTGGTGGCCTGCAGTTGTTGGGTCGAGACTT : 1200 * 1220 * 1240 * 1260 * FspNB-VN-c : TATAGGTTGAATCTTTTTATGTTGCAGGGGCATTGGTTTGTTTCCATGGTTGGGTTTAATATGTGTTTTTTCCCT : 1275 FspCB-VN-c : TATAGGTTGAATCTTTTTATGTTGCAGGGGCATTGGTTTGTTTCCATGGTTGGGTTTAATATGTGTTTTTTCCCT : 1275 Fhep-AU-co : TATAGTTTGAATCTTTTCATGTTGCAAGGTCATTGGGTTGTTTCTATGATTGGGTTTAATATGTGTTTTTTCCCT : 1275 FspGHL-CN- : TATAGGTTGAATCTTTTTATGTTGCAGGGGCATTGGTTTGTTTCCATGGTTGGGTTTAATATGTGTTTTTTCCCT : 1275 Fgig-CN-co : TACAGGTTGAATCTTTTTATGTTGCAGGGGCATTGGTTTGTTTCCATGGTTGGGTTTAATATGTGTTTTTTCCCT : 1275 Fgig-ID-co : TATAGGTTGAATCTTTTTATGTTGCAGGGGCATTGGTTTGTTTCCATGGTTGGGTTTAATATGTGTTTTTTCCCT : 1275 Fbus(human : TATAGTTTAAAAGTTTCTTTGTTGCAAGGTCATTGGATTGTTTCTATGTTTGGTTTTAATTTGTGTTTTTTTCCG : 1275 Fbus(swine : TATAGTTTAAAAGTTTCTTTGTTGCAAGGTCATTGGATTGTTTCTATGTTTGGTTTTAATTTGTGTTTTTTTCCG : 1275 Csin-CN-co : TTAAATAAGTATCTATTGATGGCTCATTGAGGTGTATCGATGACGGGGTTTAATCTCTGTTTTTTTCCTATGCAT : 1275 Csin-KR-co : TTAAATAAGTATCTATTGATGGCTCATTGAGGTGTATCGATGACGGGGTTTAATCTCTGTTTTTTTCCTATGCAT : 1275 Csin-RU-co : TTAAATAAGTATCTATTGATGGCTCATTGAGGTGTATCGATGACGGGGTTTAATCTCTGTTTTTTTCCTATGCAT : 1275 Csin-VN-co : TTAAATAAGTATCTATTGATGGCTCATTGAGGTGTATCGATGACGGGGTTTAATCTCTGTTTTTTTCCTATGCAT : 1275 Oviv-TH-co : TTAAATAAGTATTTATTAATGGCTCATTGAGGTGTCTCAATGTTAGGGTTCAATCTGTGTTTCTTTCCAATGCAC : 1275 Oviv-CN-co : TTAAATAAGTATTTATTAATGGCTCATTGAGGTGTCTCAATGTTAGGGTTCAATCTATGTTTCTTTCCAATGCAC : 1275 Ofel-RU-co : CTTAACAAGTATTTGTTAGTGGCTCATTGAGGTGTGTCAATGATAGGGTTTAATCTTTGTTTCTTCCCAATGCAT : 1275 Phet-VN-co : GAATAAGTATTTGTTGCAGGGTCATTGGGTGGCATCTATGGTGGGGTTTAATCTGTGTTTTTTTCCCATGCATTA : 1274 Pohi-JP-co : AAATAAGTATTTGTTGCAAGGGCATTGGGTGGCATCAATGGTAGGGTTTAATTTTTGTTTTTTCCCCATGCATTA : 1271

Pwes(2n)-K : GAATAAGTACCTGTTGCAGGGTCATTGGGTGAGGTCGATGCTGGGGTTTAACCTTTGTTTTTTTCCGATGCATTA : 1274 Pwes(3n)KR : GAATAAGTACCTGTTGCAGGGTCATTGGGTGAGGTCGATGCTGGGGTTTAACCTTTGTTTTTTTCCGATGCATTA : 1274 Ejap-VN-co : AGGTTAAATCGTTTATTATTGTGGGGACATTGAATTGTTTCGATGATAGGGTTTAATTTGTGTTTTTTCCCTATG : 1275 Htai-KR-co : AAAAAGTACTTGTTGATGGCTCATTGGGGGGTGTCAATGGTTGGATTCAATTTGTGTTTTTTTCCTATGCATTTT : 1275 Htai-LA-co : AAAAAGTACTTGTTGATGGCTCATTGGGGGGTGTCAATGGTTGGATTCAATTTGTGTTTTTTTCCTATGCATTTT : 1275 Htai-VN-co : AAAAAGTACTTGTTGATGGCTCATTGGGGGGTGTCAATGGTTGGATTTAATTTGTGTTTTTTTCCTATGCATTTT : 1275 Sfal-VN-co : AAAAAGTATTTATTGATGGGCCATTGGGGTGTGTCGATGATAGGTTTTAACTTGTGCTTTTTCCCGATGCACTTT : 1275 1280 * 1300 * 1320 * 1340 * FspNB-VN-c : ATGCATTATCTTGGTATGTGTGGTTTGCCGCGTCGTGTTTGTGTTTATGATCCTGATTTTTATTGGCTTAGTGTT : 1350 FspCB-VN-c : ATGCATTATCTTGGTATGTGTGGTTTGCCGCGTCGTGTTTGTGTTTATGATCCTGATTTTTATTGGCTTAGTGTT : 1350 Fhep-AU-co : ATGCACTACCTTGGTATGGCGGGGTTGCCTCGCCGGGTTTGTGTTTATGATCCGGATTTTTATTGGCTTAGTGTT : 1350 FspGHL-CN- : ATGCATTATCTTGGTATGTGTGGTTTGCCGCGTCGTGTTTGTGTTTATGATCCTGATTTTTATTGGCTTAGTGTT : 1350 Fgig-CN-co : ATGCATTATCTTGGTATGTGTGGTTTGCCGCGTCGTGTTTGTGTTTATGATCCTGATTTTTATTGGCTTAGTGTT : 1350 Fgig-ID-co : ATGCATTATCTTGGTATGTGTGGTTTGCCGCGTCGTGTTTGTGTTTATGATCCTGATTTTTATTGGCTTAGTGTT : 1350 Fbus(human : ATGCATTATTTGGGTATGTCTGGGCTTCCTCGCCGGGTGTGTGTTTATGATCCTGATTTTTATTGACTTAATGTG : 1350 Fbus(swine : ATGCATTATTTGGGTATGTCTGGGCTTCCTCGCCGGGTGTGTGTTTATGATCCTGATTTTTATTGACTTAATGTG : 1350 Csin-CN-co : TTTTTAGGTGTTTATGGGCTTCCACGTCGGGTGTGTTTGTATGAGCCCTGCCTTCAGTGGTTGAATACTTTGTGT : 1350 Csin-KR-co : TTTTTAGGTGTTTATGGGCTTCCACGTCGGGTGTGTTTGTATGAGCCCTGCCTTCAGTGGTTGAATACTTTGTGT : 1350 Csin-RU-co : TTTTTAGGTGTTTATGGGCTTCCACGTCGGGTGTGTTCGTATGAGCCTTGCTTTCAGTGGTTGAATACTTTGTGT : 1350 Csin-VN-co : TTTTTAGGTGTTTATGGGCTTCCACGTCGGGTGTGTTCGTATGAGCCCTGCTTTCAGTGGTTGAATACTTTGTGT : 1350 Oviv-TH-co : TTTTTAGGTATTTACGGTCTTCCACGTCGTGTGTGTTCTTATGAGCCTTGTTTTCAGTGGGTGAATACTGTGTGT : 1350 Oviv-CN-co : TTTTTAGGTATTTACGGTCTTCCACGTCGCGTGTGTTCTTACGAGCCTTGTTTTCAGTGGGTGAATACTGTGTGT : 1350 Ofel-RU-co : TTTTTAGGCGTTTATGGACTACCGCGTCGGGTGTGTTCATATGAGCCTTGTTTTCAGTGGATAAATACTTTGTGT : 1350 Phet-VN-co : CCTTGGGGCTTATGGTCTTCCTCGGCGGGTGTGTAACTATGAGCCTGCTTTTCAGTGGCTAAATAATGTTTCTTC : 1349 Pohi-JP-co : TCTTGGGGCTTATGGTCTTCCACGTCGGGTGTGTAACTATGAGCCGGCCTTTCAGTGATTAAACAATATTTCTTC : 1346 Pwes(2n)-K : CCTCGGAGCTTACGGTCTCCCACGTCGGGTGTGTAACTATGAGCCCGCCTTTCAGTGGTTGAACAAAATCTCCTC : 1349 Pwes(3n)KR : CCTCGGAGCTTACGGTCTCCCACGTCGGGTGTGTAACTATGAGCCCGCCTTTCAGTGGTTGAACAAAATCTCCTC : 1349 Ejap-VN-co : CATTATTTTGGGTTGCAGGGGTTACCACGTCGTGTTTGTGTTTTTGATCCTGAGTTTTGTTGGTTGAATTTTATT : 1350 Htai-KR-co : TTAGGGTTTCAGGGTTTACCTCGTCGGGTGTGTGTTTATGAGCCTTGTTTTCAGTGGTTGAAAACTATGGCTAGG : 1350 Htai-LA-co : TTAGGGTTTCAGGGTTTACCTCGTCGGGTGTGTGTTTATGAGCCTTGTTTTCAGTGGTTGAAAACTATGGCTAGG : 1350 Htai-VN-co : TTAGGGTTTCAGGGTTTACCTCGTCGGGTGTGTGTTTATGAGCCTTGTTTTCAGTGGTTGAAAACTATGGCTAGG : 1350 Sfal-VN-co : TTAGGGTTGCATGGTCTTCCTCGTCGGGTGTGTGTTTATGAGCCGGCCTTTCAGTGGTTGAATAGTATATCAACT : 1350 1360 * 1380 * 1400 * 1420 FspNB-VN-c : GTTTCTAGAGTAGGTGCTTTTATTTCTGCTGGTAGTGCTTTTTTGTTTTTGTTTGTTTTGTGGGAGTCTTTTGTT : 1425 FspCB-VN-c : GTTTCTAGAGTAGGTGCTTTTATTTCTGCTGGTAGTGCTTTTTTGTTTTTGTTTGTTTTGTGGGAGTCTTTTGTT : 1425 Fhep-AU-co : GTTTCTAGTTTAGGTGCTCTTGTCTCGGCAGGTAGTGCCTTTTTGTTTGTGTTTATTTTGTGGGAGTCCTTTGTT : 1425 FspGHL-CN- : GTTTCTAGAGTAGGTGCTTTTATTTCTGCTGGTAGTGCTTTTTTGTTTTTGTTTGTTTTGTGGGAGTCTTTTGTT : 1425 Fgig-CN-co : GTTTCTAGAGTAGGTGCTTTTATTTCTGCTGGTAGTGCTTTTTTGTTTTTGTTTGTTTTGTGGGAGTCTTTTGTT : 1425 Fgig-ID-co : GTTTCTAGAGTAGGTGCTTTTATTTCTGCTGGTAGTGCTTTTTTGTTTTTGTTTGTTTTGTGGGAGTCTTTTGTT : 1425 Fbus(human : TTATCAAGTTTAGGGGGTGTGGTATCAACTGTAAGGGCCTTTTTTCTTTTTTTTGTTTTATGGGAGTCTTGTGTG : 1425 Fbus(swine : TTATCAAGTTTAGGGGGTGTGGTATCAACTGTAAGGGCCTTTTTTCTTTTTTTTGTTTTATGGGAGTCTTGTGTG : 1425 Csin-CN-co : AGGATGGGGGCGATTTTTTCGGTTTTCAGTGGGTTTACGCTTATGTATATTGTTTGAGAATCTATGGCTGTTTGT : 1425 Csin-KR-co : AGGATGGGGGCGATTTTTTCGGTTTTCAGTGGGTTTACGCTTATGTATATTGTTTGAGAATCTATGGCTGTTTGT : 1425 Csin-RU-co : AGGATGGGGGCGATTTTTTCGGTTTTCAGTGGGTTTACGCTTATGTATATTGTTTGAGAATCTATGGCTGTTTGT : 1425 Csin-VN-co : AGGATGGGGGCGATTTTTTCGGTTTTCAGTGGGTTTACGCTTATGTATATTGTTTGAGAATCTATGGCTGTTTGT : 1425 Oviv-TH-co : AGAGTTGGTGGTATCTTTTCTGTGTTTAGTGGTTTTACCCTGATATACGTTATTTGGGAGTCTATGGCGGTGCGT : 1425 Oviv-CN-co : AGAGTTGGTGGTATCTTTTCTGTGTTTAGTGGTTTTACCCTGATATACGTTATTTGGGAGTCTATGGCGGTGCGT : 1425 Ofel-RU-co : AGTATAGGTGGGATATTCTCGGTTTTTAGGGGGTTTACTCTTATGTATATAGTTTGGGAGTCGATAGCTGTGAGT : 1425 Phet-VN-co : TGTTGGTGCTTTAGTTTCTGTGGTTAGGGCCTTTTTTTTGGTTTTTATTCTATGGGAGTCTTTGGTTGTGGGTAA : 1424 Pohi-JP-co : TGTTGGAGCTTTAATTTCTGTGGTTAGGGCTTTTTTTTTGGTTTTTATTCTTTGAGAGTCTCTTGTGGTTGGAAA : 1421 Pwes(2n)-K : TGTGGGGGCGCTGGTTTCTGTTGTCAGTGCTTTTTTTTTGGTTTTTATCCTTTGGGAGTCTCTCGTTGTTGGGAA : 1424 Pwes(3n)KR : TGTGGGGGCGCTGGTTTCTGTTGTCAGTGCTTTTTTTTTGGTTTTTATCCTTTGGGAGTCTCTCGTTGTTGGGAA : 1424 Ejap-VN-co : TGTAGGTTGGGCGGTATTCTTTCTGCAAGGAGTGCTTTTTTtTTTGTATATATTTTGTGGGAGTCTTATACTGTG : 1425 Htai-KR-co : TTGGGGGGACTTCTTTCTGTTTTTAGGGGGTTTATGTTAGCTTTCATTTTATGAGAGTCGTTGTCTGTGGGTAAT : 1425 Htai-LA-co : TTGGGGGGACTTCTTTCTGTTTTTAGGGGGTTTATGTTAGCTTTCATTTTATGAGAGTCGTTGTCTGTGGGTAAT : 1425 Htai-VN-co : CTGGGGGGACTTCTTTCTGTTTTTAGGGGGTTTATGTTAGCTTTCATTTTATGAGAGTCGTTGTCTGTGGGTAAT : 1425 Sfal-VN-co : ATGGGGGGTCTGATTTCTGTGTTCAGCGGATTTGTTTTGTTGTATATACTCTGGGAGTCGTTGGTTGTGGGTAAT : 1425 * 1440 * 1460 * 1480 * 1500 FspNB-VN-c : GTTGGTAATCGTGTTGTTTCGTCTTGAGGTAACAGTTCGTTAGTGTTGAATGTTATTACTTTACCTGGCCCTCAG : 1500 FspCB-VN-c : GTTGGTAATTGTGTTGTTTCGTCTTGAGGTAGCAGTTCGTTAGTATTGAATGTTATTACTTTGCCTGGCCCTCAG : 1500 Fhep-AU-co : GTAGGTAATTGTGTTGTCTCTTCTTGAGGTAGCAGGTCTTTAGTGTTGAATGTTATTACTTTGCCAGGTCCTCAA : 1500 FspGHL-CN- : GTTGGTAATTGTGTTGTTTCGTCTTGAGGTAGCAGTTCGTTAGTATTGAATGTTATTACTTTGCCTGGCCCTCAG : 1500 Fgig-CN-co : GTCGGTAATCGTGTTGTTTCGTCTTGAGGTAACAGTTCGTTAGTGTTGAATGTTATTACTTTACCTGGCCCTCAG : 1500 Fgig-ID-co : GTTGGTAATCGTGTTGTTTCGTCTTGAGGTAATAGTTCGTTAGTGTTGAATGTTATTACTTTACCTGGCCCTCAG : 1500 Fbus(human : ATAGGTAATCGGGTACTTTCTGTTTGGGGTTCCGGTTCTTTGATTTTGAATGTTGTTACTTTACCTAGACCTCAG : 1500 Fbus(swine : ATAGGTAATCGGGTACTTTCTGTTTGGGGTTCCGGTTCTTTGATTTTGAATGTTGTTACTTTACCTAGACCTCAG : 1500 Csin-CN-co : AACCGTGTCATTAATCTGTGGGGCGGGGCTCATGTTGTTTTTAATGTTTTGGTGAATCCGATTGGGGCGCATAGT : 1500 Csin-KR-co : AACCGTGTCATTAATCTGTGGGGCGGGGCTCATGTTGTTTTTAATGTTTTGGTGAATCCGATTGGGGCGCATAGT : 1500 Csin-RU-co : AACCGTGTCATTAATCTGTGGGGCGGGGCTCATGTTGTTTTTAATGTTTTGGTGAATCCGATTGGGGCACATAGT : 1500 Csin-VN-co : AACCGTGTCATTAATCTGTGGGGCGGGGCTCATGTTGTTTTTAATGTTTTGGTGAATCCGATTGGGGCGCATAGT : 1500 Oviv-TH-co : AATCGTGTAGTTAAATTGTGAGGGGGGGCTCATGTTGTGTTTAATGTGTTAGTTAATCCCGTTGGGATGCATAGC : 1500 Oviv-CN-co : AATCGTGTAGTTAAATTGTGAGGGGGGGCTCATGTTGTGTTTAATGTGTTAGTTAATCCCGTTGGGATGCATAGC : 1500 Ofel-RU-co : AATCGTGTAGTTCATTTGTGGGGTGGAGCCCATGTTGTGTTTAACGTTTTGGTTAATCCAATTGGGGCACATAGT : 1500 Phet-VN-co : TCGTGTTGTTGGTGTTTGGGGTACTAAAGCCCTGGTTATGAATGCCTTAGTTACTCCAGTTCCCCATCACAGTGT : 1499 Pohi-JP-co : TCGTGTTGTTGGGGTTTGAGGTAGCAAATCTTTGGTTATGAATGCTTTGGTTACTCCTGTGCCTCATCATAGGGT : 1496 Pwes(2n)-K : TCGTGTCGTGGGTATCTGGGGTACGAATGCTTTAGTGGTGAATGCGTTGGTGACGCCTGTGCCGCATCACAGGAT : 1499 Pwes(3n)KR : TCGTGTCGTGGGTATCTGGGGTACGAATGCTTTAGTGGTGAATGCGTTGGTGACGCCTGTGCCGCATCACAGGAT : 1499 Ejap-VN-co : AAGAAAGTGGTAGTGTCTTGTTGGGGTAGAAATTCTTTGGTGCTTAAAGTAGTTACTTTACCTCTACCACATCAT : 1500 Htai-KR-co : CGGGTGATAGGGTTATGGGGTAGTAAAGCCTTGGTTTTAAAAGTAGTAACTTCTCCTGTVCCGCATCATTGTAGT : 1500 Htai-LA-co : CGGGTGATAGGGTTATGGGGTAGTAAAGCCTTGGTTTTAAAAGTAGTAACTTCTCCTGTVCCGCATCATTGTAGT : 1500 Htai-VN-co : CGGGTGATAGGGTTATGGGGTAGTAAAGCCTTGGTTTTAAAAGTAGTAACTTCTCCTGTGCCGCATCATTGTAGT : 1500 Sfal-VN-co : CGGGTTATTGGGCTATGGGGAAGTAATGGGTTGATTTTAAATGTTGTTACCCTGCCAGTACCCCATCATTTTAGT : 1500

* 1520 * 1540 * 1560 FspNB-VN-c : CATAATAGTTATATGAATGGTGCGGGTCGTTGAGTTTTTTAG--------------------- : 1542 FspCB-VN-c : CATAATAGTTATATGAATGGTGCGGGTCGTTGAGTTTTTTAG--------------------- : 1542 Fhep-AU-co : CATAATAGTTATATGAATGGTGTTGGTCGCTGGGTTTTTTAG--------------------- : 1542 FspGHL-CN- : CATAATAGTTATATGAATGGTGCGGGTCGTTGAGTTTTTTAG--------------------- : 1542 Fgig-CN-co : CATAATAGTTATATGAATGGTGCGGGTCGTTGAGTTTTTTAG--------------------- : 1542 Fgig-ID-co : CATAATAGTTATATGAATGGTGCGGGTCGTTGAGTTTTTTAG--------------------- : 1542 Fbus(human : CATAAAGGTTATATGACTGGGGGTTGTCGGTGGTGTGCTTAG--------------------- : 1542 Fbus(swine : CATAAAGGTTATATGACTGGGGGTTGTCGGTGGTGTGCTTAG--------------------- : 1542 Csin-CN-co : CCTTATCTTCATTATCCTGTTTGTTGAGTTCCGAGTGAGATTCGACGGTTGGGGGTGTAA--- : 1560 Csin-KR-co : CCTTATCTTCATTATCCTGTTTGTTGAGTTCCGAGTGAGATTCGACGGTTGGGGGTGTAA--- : 1560 Csin-RU-co : CCTTATCTTCATTATCCTGTTTGTTGAGTTCCGAGTGAGATTCGACGGTTGGGGGTGTAA--- : 1560 Csin-VN-co : CCTTATCTTCATTATCCTGTTTGTTGAGTTCCGAGTGAGATTCGACGGTTGGGGGTGTAA--- : 1560 Oviv-TH-co : TCTTACTTATATTATCCTGTTTGTTGACTTCCCGCCGGGGGCCGTGTTTAG------------ : 1551 Oviv-CN-co : TCTTACTTATATTATCCTGTTTGTTGACTTCCCGCCGGGGGCCGTGTTTAG------------ : 1551 Ofel-RU-co : TCTTATTTACATTATCCCATTTGTTGGATGCCTAGAGGGGGCCGGCGATTGGAGGGGGTGTAG : 1563 Phet-VN-co : TTATATCAGTGGGCCGTCTCGTTGGCTTTCTTTTTAG-------------------------- : 1536 Pohi-JP-co : TTACATTAGTGGGCCGTCTCGTTGGCTTTCTTTTTAG-------------------------- : 1533 Pwes(2n)-K : TTACATCAGTGGGCCGTCGCGGTGGCTTTCTTTTTAG-------------------------- : 1536 Pwes(3n)KR : TTACATCAGTGGGCCGTCGCGGTGGCTTTCTTTTTAG-------------------------- : 1536 Ejap-VN-co : GGGGATTATATTCATACTTCAATACATTGGGTGTTTTAG------------------------ : 1539 Htai-KR-co : TATATGAGTGAGCCGGTAACGTGGTTTTATCGTTGGTATTAG--------------------- : 1542 Htai-LA-co : TATATGAGTGAGCCGGTAACGTGGTTTTATCGTTGGTATTAG--------------------- : 1542 Htai-VN-co : TATATGAGTGAGCCGGTAACGTGGTTTTATCGTTGGTATTAG--------------------- : 1542 Sfal-VN-co : TATGTGGGTGAGCCGTGCACTTGGCTTAAGGGTGTGTCGGTTTAG------------------ : 1545