Nghiên cứu chiết xuất flavonoid toàn phần từ cúc hoa vàng

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT FLAVONOID TOÀN PHẦN<br /> TỪ CÚC HOA VÀNG (Chrysanthemum indicum L.)<br /> Nguyễn Trọng Điệp*; Nguyễn Minh Chính*<br /> Nguyễn Tùng Linh*; Nguyễn Thanh Hải**<br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ Cúc hoa vàng (CHV) để bào chế các chế phẩm thuốc.<br /> Từ nghiên cứu, đã lựa chọn đƣợc phƣơng pháp chiết xuất với thông số của quy trình: chiết<br /> siêu âm tần số 60 MHz; dung môi: ethanol 50%; nhiệt độ: 600C; chiết 2 lần với tỷ lệ dung<br /> môi/dƣợc liệu mỗi lần 10/1; thời gian chiết: 60 phút/lần. Hàm lƣợng flavonoid toàn phần<br /> đạt 12,54 mg/g (hiệu suất 96,84%), cao hơn gấp 1,3 lần so với phƣơng pháp chiết nóng<br /> (900C, 6 giờ, tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu 20/1).<br /> * Từ khóa: Cúc hoa vàng; Flavonoid toàn phần; Chiết xuất.<br /> <br /> STUDY ON THE EXTRACTION OF TOTAL FLAVONOIDS<br /> FROM FLOS CHRYSANTHEMI INDICI<br /> SUMMARY<br /> Study on the extraction of flavonoid from flos chrysanthemi indici to prepare drugs.<br /> The optimized extraction procedure was as followed: ultrasonic frequency 60 MHz, extraction<br /> solvent of 50% ethanol, temperature of 60oC, extracted 2 times with the solvent/solid ratio<br /> of 10/1 in 60 minutes/times, total flavonoid extracted was 12.54 mg/g (yield: 96.84%), 1.3<br /> times higher than that of hot extraction (90oC, 6 hours, solvent/herb ratio of 20/1).<br /> * Key words: Chrysanthemum indicum L.; Total flavonoid; Ultrasonic extraction.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Cúc hoa vàng (Chrysanthemum<br /> indicum L.) là dƣợc liệu đƣợc trồng<br /> rộng rãi ở khu vực Đông Á, trong đó có<br /> Việt Nam. Một số nghiên cứu cho thấy<br /> CHV có tác dụng kháng khuẩn, kháng<br /> <br /> virut, kháng viêm, giảm đau, hạ sốt,<br /> chống oxy hóa, ức chế sự phát triển của<br /> tế bào ung thƣ, chống dị ứng, điều chỉnh<br /> đáp ứng miễn dịch tế bào, dịch thể và<br /> hoạt động thực bào của bạch cầu đơn<br /> nhân, ức chế HIV týp 1 nhân lên... [2, 3].<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Trường Đại học Quốc gia Hà Nội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Trọng Điệp (nguyentrongdiepqy@yahoo.com.vn)<br /> Ngày nhận bài: 1/10/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/11/2013<br /> Ngày bài báo được đăng: 20/11/2013<br /> <br /> 38<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> CHV có chứa tinh dầu, flavonoid,<br /> phenolic, polysaccharid, carotenoid,<br /> sesquiterpen, axít amin… Trong đó,<br /> flavonoid là thành phần hóa học quan<br /> trọng, liên quan đến một số tác dụng<br /> chính của CHV [1, 2].<br /> Hiện nay, để chiết xuất flavonoid từ<br /> nguồn nguyên liệu tự nhiên, một số kỹ<br /> thuật mới nhƣ chiết xuất với tác động<br /> của siêu âm, vi sóng, chiết xuất siêu tới<br /> hạn… đã đƣợc phát triển và ứng dụng,<br /> nhằm thay thế cho các kỹ thuật chiết<br /> xuất thông thƣờng. Do các kỹ thuật này<br /> có nhiều ƣu điểm nhƣ giảm lƣợng dung<br /> môi tiêu thụ, rút ngắn thời gian chiết,<br /> tăng hiệu suất và chất lƣợng của dịch<br /> chiết [4, 5]. Tuy nhiên, nghiên cứu về<br /> chiết xuất flavonoid từ CHV để ứng<br /> dụng vào bào chế thuốc ở Việt Nam<br /> chƣa đƣợc công bố, trong khi đây là<br /> nguyên liệu đƣợc sử dụng phổ biến để<br /> làm thuốc. Vì vậy, chúng tôi tiến hành<br /> nghiên cứu này nhằm: Xây dựng được<br /> quy trình chiết xuất flavonoid từ CHV.<br /> Kết quả nghiên cứu là tiền đề quan trọng<br /> để bào chế dịch chiết góp phần phát triển<br /> các chế phẩm thuốc từ CHV.<br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên liệu và thiết bị.<br /> * Nguyên liệu:<br /> - Dƣợc liệu: hoa khô của cây CHV<br /> (Chrysanthemum indicum L.) thu hái tại<br /> Văn Lâm, Hƣng Yên vào tháng 9 - 2011,<br /> <br /> đạt tiêu chuẩn DĐVN IV. Nguyên liệu<br /> đƣợc sấy khô, nghiền mịn, rây qua rây<br /> có cỡ mắt rây 0,315 mm.<br /> - Hóa chất: quercetin chuẩn (Hãng<br /> Sigma Aldrich, Hàn Quốc); hóa chất<br /> phân tích: methanol, ethanol 96%, AlCl3...<br /> đạt tiêu chuẩn phân tích.<br /> * Thiết bị, dụng cụ:<br /> Thiết bị chiết xuất siêu âm: SONY<br /> MEDI SM30-CEP (Hàn Quốc), dung<br /> tích bình chiết 30 lít, tần số siêu âm 60<br /> MHz với 8 đầu siêu âm, nhiệt độ chiết<br /> đến 1000C, có thể lựa chọn chế độ chiết<br /> xuất và cô đặc khác nhau; máy quang<br /> phổ: Specord 40 Analytikjena (Đức).<br /> Cân phân tích Mettler Tolendo ML204<br /> (Thụy Sỹ) có độ chính xác đến 0,1 mg.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Phương pháp định lượng flavonoid<br /> toàn phần:<br /> Tiến hành theo phƣơng pháp quang<br /> phổ UV-Vis [8]:<br /> - Dung dịch làm phản ứng: dung dịch<br /> AlCl3 2% pha trong methanol; dung dịch<br /> chuẩn: dung dịch quercetin chuẩn trong<br /> ethanol 50% nồng độ 20 µg/ml; chuẩn bị<br /> dung dịch thử: với mẫu dƣợc liệu, cân<br /> chính xác 4,0 g bột dƣợc liệu, thêm 200<br /> ml ethanol 50%, chiết soxhlet ở 600C<br /> trong 4 giờ, sau đó, thu lấy phần dịch<br /> chiết, bổ sung ethanol 50% vừa đủ 200<br /> ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm, thu lấy<br /> phần dịch lọc; với mẫu dịch chiết: lọc bỏ<br /> 10 ml dịch lọc đầu, lấy phần dịch lọc sau.<br /> 41<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> - Tiến hành: cho 5 ml dung dịch<br /> quercetin chuẩn hoặc mẫu thử trộn đều<br /> với 5 ml dung dịch AlCl3 2%. Sau 30 phút,<br /> đo mật độ quang ở bƣớc sóng 415 ηm.<br /> Mẫu trắng là mẫu dung dịch thử hoặc<br /> chuẩn đƣợc thêm cùng lƣợng methanol<br /> nhƣng không có AlCl 3. Hàm lƣợng<br /> flavonoid toàn phần (mg/g) đƣợc tính<br /> theo quercetin chuẩn.<br /> * Phương pháp chiết xuất flavonoid<br /> từ CHV:<br /> - Phƣơng pháp chiết siêu âm: tiến<br /> hành trên thiết bị chiết siêu âm SM30.<br /> Cài đặt các thông số về nhiệt độ, thời<br /> gian chiết, chế độ làm việc. Khi thiết bị<br /> đạt đƣợc thông số về nhiệt độ, cho nguyên<br /> liệu (khoảng 200 g) vào bình chiết trung<br /> gian đặt trong bể siêu âm, thêm dung môi<br /> và chiết xuất theo điều kiện xác định cho<br /> từng thí nghiệm. Sau chiết xuất, thu lấy<br /> dịch chiết, lọc và xác định hàm lƣợng<br /> flavonoid toàn phần. Trƣờng hợp chiết<br /> 2 lần, sau khi chiết lần 1, thu dịch chiết,<br /> ép kiệt bã, thêm tiếp dung môi lần 2 vào<br /> tiếp tục chiết xuất.<br /> - Phƣơng pháp chiết nóng: tiến hành<br /> tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp chiết siêu<br /> âm, nhƣng không có tác động của sóng<br /> siêu âm.<br /> - Khảo sát các thông số của quy trình:<br /> thông số đầu vào là loại dung môi, tỷ lệ<br /> dung môi/dƣợc liệu, số lần chiết, thời gian<br /> <br /> và nhiệt độ chiết; thông số đầu ra là hàm<br /> lƣợng flavonoid toàn phần (mg) chiết<br /> đƣợc trên 1 g nguyên liệu tính theo công<br /> thức sau:<br /> Flavonoid (mg/g) =<br /> <br /> C × n × V × 100<br /> M × (100-h)<br /> <br /> C: nồng độ flavonoid toàn phần trong<br /> dịch chiết tính theo quercetin (mg/ml);<br /> V: thể tích dịch chiết (ml); M: khối lƣợng<br /> dƣợc liệu (g); n: hệ số pha loãng; h: độ ẩm<br /> dƣợc liệu (%).<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả định lƣợng flavonoid<br /> trong CHV.<br /> Bảng 1: Kết quả định lƣợng flavonoid<br /> toàn phần trong CHV.<br /> CHV<br /> (g)<br /> <br /> HÀM<br /> ẨM<br /> (%)<br /> <br /> ĐỘ<br /> HẤP<br /> THỤ<br /> <br /> FLAVONOID<br /> TOÀN PHẦN<br /> (mg/g)<br /> (n = 6)<br /> <br /> 4,07<br /> <br /> 8,15<br /> <br /> 0,2843<br /> <br /> 12,95 ± 0,40<br /> <br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử<br /> dụng phƣơng pháp soxhlet để chiết xuất,<br /> xác định hàm lƣợng flavonoid trong CHV,<br /> đồng thời là phƣơng pháp chuẩn dùng để<br /> đánh giá hiệu suất khi chiết xuất. Kết quả<br /> định lƣợng cho thấy: hàm lƣợng flavonoid<br /> toàn phần tính theo quercetin trong CHV là<br /> 12,95 ± 0,40 mg/g theo dƣợc khô kiệt.<br /> 42<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> 2. Kết quả khảo sát phƣơng pháp chiết xuất.<br /> Bảng 2: Điều kiện và kết quả chiết xuất flavonoid trong CHV bằng siêu âm và<br /> chiết nóng.<br /> PHƢƠNG<br /> PHÁP CHIẾT<br /> <br /> DƢỢC<br /> LIỆU<br /> (g)<br /> <br /> Chiết siêu âm<br /> <br /> 205,0<br /> 202,8<br /> <br /> Chiết nóng<br /> <br /> 202,2<br /> 203,9<br /> <br /> ĐỘ<br /> ẨM<br /> <br /> DUNG<br /> MÔI<br /> <br /> Ethanol<br /> 8,76%<br /> 50%<br /> <br /> HIỆU<br /> TỶ LỆ DUNG NHIỆT THỜI<br /> FLAVONOID SUẤT<br /> MÔI/DƢỢC<br /> ĐỘ<br /> GIAN<br /> (mg/g)<br /> CHIẾT<br /> LIỆU<br /> CHIẾT CHIẾT<br /> (%)<br /> <br /> 10/1<br /> <br /> 600C<br /> <br /> 1 giờ<br /> <br /> 9,72<br /> <br /> 75,04<br /> <br /> 10/1<br /> <br /> 900C<br /> <br /> 1 giờ<br /> <br /> 6,01<br /> <br /> 46,42<br /> <br /> 10/1<br /> <br /> 900C<br /> <br /> 6 giờ<br /> <br /> 8,14<br /> <br /> 62,83<br /> <br /> 20/1<br /> <br /> 900C<br /> <br /> 6 giờ<br /> <br /> 9,75<br /> <br /> 75,29<br /> <br /> Với phƣơng pháp chiết nóng ở 900C,<br /> khi lƣợng dung môi gấp 10 lần dƣợc<br /> liệu, sau 1 và 6 giờ chiết đƣợc lần lƣợt<br /> 6,01 và 8,14 mg/g flavonoid (hiệu suất<br /> 46,42 và 62,83%). Khi tăng lƣợng dung<br /> môi lên gấp 20 lần, sau 6 giờ chiết đƣợc<br /> 9,62 mg/g flavonoid (hiệu suất 74,32%).<br /> Khi chiết siêu âm ở 600C với lƣợng<br /> dung môi gấp 10 lần dƣợc liệu, sau 1 giờ<br /> chiết đƣợc 9,72 mg/g flavonoid (hiệu<br /> suất 75,04%). Nhƣ vậy, sự tác động của<br /> sóng siêu âm đã làm tăng lƣợng flavonoid<br /> chiết đƣợc, rút ngắn thời gian chiết,<br /> giảm nhiệt độ và lƣợng dung môi so với<br /> phƣơng pháp chiết nóng. Vai trò của<br /> sóng siêu âm là tạo ra hiệu ứng vật lý<br /> và cơ học, dẫn đến phá vỡ màng tế bào,<br /> tạo điều kiện thuận lợi cho các hoạt chất<br /> giải phóng trong dƣợc liệu, làm tăng sự<br /> <br /> thâm nhập của dung môi vào dƣợc liệu<br /> và làm tăng chuyển khối. Do vậy, làm<br /> tăng hiệu suất chiết, rút ngắn thời gian,<br /> giảm nhiệt độ, giảm lƣợng dung môi<br /> tiêu thụ [4, 5].<br /> Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi<br /> lựa chọn phƣơng pháp chiết siêu âm để<br /> khảo sát tiếp các thông số của quy trình<br /> chiết xuất nhƣ: loại dung môi, tỷ lệ dung<br /> môi/dƣợc liệu, số lần chiết, nhiệt độ và<br /> thời gian chiết xuất.<br /> 3. Khảo sát lựa chọn các thông số<br /> quy trình chiết xuất.<br /> * Ảnh hưởng của dung môi chiết xuất:<br /> Tiến hành chiết siêu âm CHV 2 lần,<br /> mỗi lần có tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu<br /> là 10/1 trong 60 phút/lần với dung môi<br /> 42<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013<br /> <br /> là nƣớc và ethanol (EtOH) có nồng độ<br /> khác nhau.<br /> <br /> Hình 1: Ảnh hƣởng của dung môi chiết<br /> đến hàm lƣợng flavonoid chiết đƣợc.<br /> Nồng độ ethanol tăng từ 0 - 50%, đã<br /> làm tăng đáng kể lƣợng flavonoid chiết<br /> đƣợc. Nhƣng khi tiếp tục tăng nồng độ<br /> ethanol lên 60, 70 và 80%, lƣợng flavonoid<br /> chiết đƣợc lại hơi giảm xuống. Lƣợng<br /> flavonoid chiết đƣợc tăng thể hiện rõ<br /> nhất ở lần chiết 1. Ở lần chiết thứ 2,<br /> lƣợng flavonoid chiết đƣợc tăng dần khi<br /> tăng nồng độ ethanol từ 0 - 50%, sau đó<br /> giảm dần khi nồng độ ethanol tăng dần.<br /> Sau 2 lần chiết, lƣợng flavonoid chiết<br /> đƣợc cao nhất khi chiết với dung môi<br /> ethanol 50%. Điều này có thể do ethanol<br /> 50% có khả năng hòa tan flavonoid tốt<br /> hơn cả dạng aglycol và glycosid trong<br /> CHV, làm tăng tổng lƣợng flavonoid<br /> trong dịch chiết. Từ kết quả trên, chúng<br /> tôi lựa chọn dung môi là ethanol 50% để<br /> khảo sát tiếp.<br /> * Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi dược<br /> liệu và số lần chiết:<br /> <br /> Tiến hành chiết xuất siêu âm CHV<br /> với ethanol 50% trong 60 phút, nhiệt độ<br /> 600C với số lần chiết và tỷ lệ dung môi/<br /> dƣợc liệu khác nhau.<br /> <br /> Hình 2: Ảnh hƣởng của số lần chiết và<br /> tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu đến hàm lƣợng<br /> flavonoid chiết đƣợc.<br /> (Ghi chú: 1 lần × 10 (20; 30; 40; 50):<br /> chiết lần 1 với tỷ lệ dung môi gấp 10 lần<br /> dược liệu (20; 30; 40; 50); 2 lần × 10 × 10<br /> (7,5; 5): chiết lần 2 với tỷ lệ dung môi<br /> lần 1 gấp 10 và lần 2 gấp 10 lần dược<br /> liệu (7,5; 5)).<br /> Chiết 1 lần với tỷ lệ dung môi/dƣợc<br /> liệu tăng dần từ 10 - 50 lần đã làm tăng<br /> lƣợng flavonoid toàn phần chiết đƣợc,<br /> đặt biệt, khi tỷ lệ này tăng trong khoảng<br /> từ 10 - 30 lần. Khi tỷ lệ dung môi/dƣợc<br /> liệu tăng trên 30 lần (40 và 50 lần),<br /> flavonoid chiết đƣợc tăng lên không<br /> đáng kể. Khi chiết 2 lần, lần thứ nhất với<br /> cùng tỷ lệ dung môi/dƣợc liệu là 10/1,<br /> nhƣng lần thứ 2 lần lƣợt là 10/1, 7,5/1 và<br /> 5/1 đã làm giảm dần lƣợng flavonoid<br /> toàn phần chiết đƣợc. Trƣờng hợp khi<br /> chiết xuất với cùng tỷ lệ dung môi/dƣợc<br /> liệu, nhƣng chia làm 2 lần chiết (tỷ lệ<br /> mỗi lần là 10/1) thu đƣợc 12,54 mg/g<br /> 43<br /> <br />