Nghiên cứu chiết xuất naringin bằng dung môi ethanol từ cùi bưởi (Citrus maxima)

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT NARINGIN BẰNG DUNG MÔI<br /> ETHANOL TỪ CÙI BƢỞI (CITRUS MAXIMA)<br /> Nguyễn Cẩm Vân*; Nguyễn Minh Chính*; Đào Văn Đôn*<br /> Nguyễn Tuấn Quang*; Nguyễn Quỳnh Ngọc*; Nguyễn Văn Thuận**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: xây dựng quy trình chiết xuất naringin từ cùi Bưởi bằng dung môi ethanol.<br /> Đối tượng và phương pháp: tiến hành thực nghiệm để khảo sát lựa chọn các yếu tố và xây<br /> dựng quy trình chiết xuất naringin từ cùi Bưởi được thu mua tại Hà Nội. Kết quả: điều kiện chiết<br /> xuất naringin tối ưu bằng dung môi ethanol bao gồm: phương pháp chiết siêu âm có gia nhiệt,<br /> 0<br /> dung môi ethanol 70%, tỷ lệ dung môi/dược liệu (10/1), nhiệt độ chiết xuất 55 , chiết 3 lần, mỗi<br /> lần chiết 1 giờ. Hiệu suất chiết naringin của quy trình là 85,6% và độ tinh khiết của naringin đạt<br /> 94,1%. Kết luận: đã khảo sát lựa chọn các yếu tố và xây dựng được quy trình chiết naringin từ<br /> cùi Bưởi bằng dung môi an toàn, rẻ tiền và hiệu suất chiết cao (85,6%).<br /> * Từ khóa: Cùi Bưởi; Chiết xuất; Naringin; Ethanol.<br /> <br /> Study on the Extraction of Naringine by Ethanol from Citrus Maxima<br /> Summary<br /> Aims: To establish the procedure to extract naringine from citrus maxima using ethanol.<br /> Subjects and methods: Conducting experiments to investigate and select factors and establish<br /> the procedure to extract naringine from citrus maxima bought in Hanoi. Results: Conditions for<br /> optimal extraction of naringine using ethanol including using ultrasonic extraction with heat;<br /> 0<br /> ethanol 70%; the ratio of the solvent/herbal (10/1); the extraction temperature at 55 celsius;<br /> 03 times of extraction with 60 minutes each. The efficiency of this naringine extraction<br /> procedure reached 85.6% and purity of naringine was 94.1%. Conclusion: The factors have<br /> been investigated and selected and the procedure of extracting naringine from citrus maxima<br /> using ethanol solvent has been established with safety, low cost and high efficiency (85.6%).<br /> * Key words: Citrus maxima; Extraction; Naringine; Ethanol.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bưởi (Citrus maxima) là loại cây ăn<br /> quả, được trồng phổ biến ở nước ta và<br /> trên thế giới [5]. Ngày nay, trước sự phát<br /> <br /> triển của khoa học và kinh tế, các bộ<br /> phận trước đây được coi là dư thừa như<br /> vỏ quả, cùi, hạt, lá cây đã được chú ý đến<br /> và dần đưa vào nghiên cứu trong một số<br /> Ngành Dược phẩm, Thực phẩm, Mỹ phẩm.<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bệnh viện Quân y 7<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn TuÊn Quang (dsquang2000@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 22/08/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 14/12/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 30/12/2014<br /> <br /> 19<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> Naringin - một hợp chất thuộc nhóm<br /> flavonoid có trong vỏ các loài Citrus nói<br /> chung, trong cùi Bưởi nói riêng đã được<br /> nghiên cứu và công bố một số tác dụng<br /> như chống lão hóa, làm giảm cholesterol,<br /> ngăn ngừa cao huyết áp, giảm tai biến tim<br /> mạch, làm lành vết loét dạ dày, phòng<br /> chống ung thư và có tác dụng làm đẹp da<br /> [6, 7]. Đã có nhiều công trình nghiên cứu,<br /> chiết xuất narigin bằng một số phương<br /> pháp khác nhau, nhưng các phương<br /> pháp này hoặc phải dùng thiết bị phức<br /> tạp, hoặc phải dùng dung môi độc hại,<br /> gây ô nhiễm môi trường, không an toàn<br /> cho sức khỏe [2, 3, 4]. Do đó, cần có<br /> nghiên cứu chiết xuất hoạt chất này bằng<br /> dung môi an toàn, rẻ tiền để đạt hiệu quả<br /> cao, chính vì vậy dung môi ethanol được<br /> lựa chọn cho nghiên cứu này.<br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết<br /> bị.<br /> - Nguyên liệu: cùi Bưởi được thu mua<br /> tại khu vực ngoại thành Hà Nội, mẫu tại<br /> Khoa Dược liệu, Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu Dược, Học viện Quân y.<br /> - Hoá chất: naringin chuẩn của Sigmaaldrich, MeOH, acetonitril đạt tiêu chuẩn<br /> HPLC. EtOH đạt tiêu chuẩn tinh khiết<br /> phân tích.<br /> - Dụng cụ - thiết bị: hệ thống HPLC<br /> WATERS 2695D, detector PDA, 4 kênh<br /> dung môi; thiết bị siêu âm gia nhiệt<br /> Memmert GmbH+ Co. KG D-91126<br /> Schwabach FRG (Đức); bình chiết và các<br /> dụng cụ thủy tinh khác,..<br /> <br /> 20<br /> <br /> Tiến hành thí nghiệm tại Trung tâm<br /> Đào tạo - Nghiên cứu Dược, Học viện<br /> Quân y.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Định lượng naringin bằng HPLC:<br /> - Xử lý mẫu cùi Bưởi: cân chính xác<br /> 0,5 g bột cùi Bưởi khô (bột khô mịn), cho<br /> vào bình cầu 250 ml, thêm chính xác 50<br /> ml MeOH. Ðun sôi hồi lưu 30 phút, làm<br /> mát. Bổ sung MeOH vừa đủ, trộn đều và<br /> ly tâm. Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước<br /> khi phân tích HPLC.<br /> - Xử lý mẫu sản phẩm chiết xuất<br /> naringin: cân chính xác 1,5 mg mẫu cho<br /> vào bình định mức 25 ml, thêm MeOH<br /> vừa đủ tới vạch, trộn đều. Lọc qua màng<br /> lọc 0,45 µm trước khi phân tích HPLC.<br /> - Điều kiện HPLC: cột RP18 (4,6 x 250<br /> mm; 5 µm); detector UV: 283 nm; pha<br /> động: acetonitril: axít phosphoric 0,5%<br /> (20:80, v/v); tốc độ dòng: 1 ml/phút; thể<br /> tích bơm mẫu: 20 µl.<br /> - Đánh giá: hàm lượng naringin chiết<br /> theo công thức:<br /> x<br /> <br /> HLNaringin (%) =<br /> 10-4<br /> C: nồng độ naringin trong dung dịch<br /> mẫu thử (µg/ml); V: thể tích methanol<br /> (ml); M: khối lượng dược liệu (g); a: hàm<br /> ẩm dược liệu (%).<br /> * Xây dựng quy trình chiết xuất:<br /> - Khảo sát lựa chọn phương pháp<br /> chiết xuất: chiết Shoxlet, chiết ngấm kiệt<br /> và chiết siêu âm gia nhiệt.<br /> + Chiết siêu âm: 50 g bột cùi Bưởi<br /> được chiết với 200 ml ethanol 960 ở nhiệt<br /> độ 750C. Sau 1 giờ, gạn lấy dịch chiết.<br /> Chiết tiếp tục bã dược liệu với ethanol<br /> (200 ml x 2 lần).<br /> + Chiết Shoxlet: chiết 50 g bột cùi Bưởi<br /> với 200 ml ethanol 960. Sau 6 giờ, gạn lấy<br /> dịch chiết.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> + Chiết ngấm kiệt: cho 50 g bột cùi<br /> Bưởi vào bình ngấm kiệt, thêm ethanol<br /> 960 tới ngập dược liệu 2 - 3 cm. Sau 24<br /> giờ, rút từ từ dịch chiết, đồng thời bổ sung<br /> dung môi vào bình ngấm kiệt. Tiến hành<br /> chiết tới khi thu được 300 ml dịch chiết.<br /> <br /> - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng:<br /> nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi/dược<br /> liệu; số lần chiết xuất; nhiệt độ và thời<br /> gian chiết xuất.<br /> - Dịch chiết ethanol được cô chân không<br /> ở nhiệt độ 500C tới cao 1/1.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả định lƣợng naringin trong nguyên liệu cùi Bƣởi.<br /> Đánh giá hàm lượng naringin trong nguyên liệu cùi Bưởi bằng HPLC.<br /> Bảng 1: Kết quả định lượng naringin trong cùi Bưởi (n = 5).<br /> (mg)<br /> 0,4956<br /> <br /> 15,57 ± 0,4<br /> <br /> 9,48<br /> <br /> 3,58 ± 1,4<br /> <br /> Hàm lượng naringin trong mẫu nghiên cứu là 3,58 ± 1,4%. Dược điển Việt Nam<br /> chưa có quy định cho hàm lượng naringin tối thiểu trong cùi Bưởi. Tuy nhiên, Dược<br /> điển Trung Quốc quy định naringin trong cùi Bưởi không thấp hơn 3,5% [1]. Như vậy,<br /> mẫu cùi Bưởi khảo sát đạt tiêu chuẩn chất lượng về hàm lượng naringin theo quy định<br /> của Dược điển Trung Quốc. Đây là cơ sở để tính hiệu suất chiết của quy trình.<br /> 2. Kết quả lựa chọn phƣơng pháp chiết.<br /> Tiến hành khảo sát các phương pháp chiết xuất: chiết siêu âm, chiết Shoxlet, chiết<br /> ngấm kiệt như mô tả trên. Lượng mẫu chiết 50 g bột cùi Bưởi khô.<br /> Bảng 2: Kết quả chiết xuất naringin theo các phương pháp chiết khác nhau (n = 5).<br /> (g)<br /> <br /> Siêu âm (1)<br /> <br /> 1,44 ± 1,1<br /> <br /> 52,90 ± 0,8<br /> <br /> 43,90 ± 1,1<br /> <br /> Shoxlet (2)<br /> <br /> 1,45 ± 0,7<br /> <br /> 53,20 ± 2,4<br /> <br /> 44,53 ± 2,9<br /> <br /> Ngấm kiệt (3)<br /> <br /> 1,10 ± 2,5<br /> <br /> 60,55 ± 0,7<br /> <br /> 38,38 ± 3,0<br /> <br /> Phương pháp ngấm kiệt cho hiệu suất<br /> chiết 38,38%, thấp hơn nhiều so với<br /> phương pháp chiết siêu âm và chiết<br /> Shoxlet (p < 0,05). Do đó, phương pháp<br /> này không được lựa chọn cho nghiên cứu<br /> tiếp theo. Tuy nhiên, tạp chất của phương<br /> pháp ngấm kiệt ít hơn so với phương<br /> pháp chiết siêu âm và chiết Shoxlet, do<br /> không bị tác động bởi nhiệt độ (tác nhân<br /> 21<br /> <br /> p1-2 > 0,1<br /> p1-3 < 0,05<br /> <br /> làm tạp tan nhiều trong dung môi chiết<br /> xuất). Vì vậy, trong một số nghiên cứu<br /> vẫn có thể sử dụng phương pháp này.<br /> Hiệu suất chiết của phương pháp chiết<br /> siêu âm và phương pháp chiết Shoxlet<br /> tương đương nhau (43,90 ± 1,1% và<br /> 44,53 ± 2,9%) (p > 0,1). Tuy nhiên, so với<br /> phương pháp chiết siêu âm, phương<br /> pháp chiết Shoxlet có thời gian chiết dài,<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến<br /> quá trình chiết xuất khó thực hiện hơn.<br /> Hơn nữa, phương pháp chiết Shoxlet chỉ<br /> có thể triển khai ở quy mô nhỏ trong<br /> phòng thí nghiệm, khó có khả năng triển<br /> khai ở quy mô công nghiệp. Vì vậy,<br /> phương pháp chiết siêu âm được lựa<br /> chọn để tiếp tục nghiên cứu.<br /> 3. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh<br /> hƣởng đến quá trình chiết xuất.<br /> Tiến hành chiết xuất naringin trong cùi<br /> Bưởi theo quy trình gồm các thông số<br /> sau: bột cùi Bưởi: 15 g cho mỗi lần chiết;<br /> dung môi chiết: hỗn hợp ethanol - nước;<br /> phương pháp chiết: siêu âm có gia nhiệt.<br /> Khảo sát các thông số: nồng độ ethanol,<br /> tỷ lệ dung môi/dược liệu, nhiệt độ chiết<br /> <br /> xuất, số lần chiết xuất và thời gian chiết<br /> xuất.<br /> Sau khi chiết, gộp các dịch chiết, cô<br /> đến cao đặc. Hòa tan nóng bằng 100 ml<br /> nước, để ở nhiệt độ phòng đến khi xuất<br /> hiện tủa, lọc thu tủa và sấy ở 55oC đến<br /> khô, thu được sản phẩm flavonoid thô.<br /> Xác định hàm lượng naringin trong sản<br /> phẩm thô.<br /> 4. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của<br /> nồng độ ethanol.<br /> Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của<br /> nồng độ ethanol đến hiệu suất chiết xuất<br /> (nồng độ: 96%, 80%, 70% và 40%) theo<br /> các điều kiện như trên.<br /> <br /> Bảng 3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết tới hiệu suất chiết (n = 5).<br /> (g)<br /> Ethanol 96% (1)<br /> <br /> 0,43 ± 0,7<br /> <br /> 58,96 ± 1,9<br /> <br /> 48,70 ± 2,5<br /> <br /> Ethanol 80% (2)<br /> <br /> 0,54 ± 1,9<br /> <br /> 59,82 ± 1,7<br /> <br /> 62,27 ± 2,2<br /> <br /> Ethanol 70%(3)<br /> <br /> 0,56 ± 1,3<br /> <br /> 60,20 ± 1,0<br /> <br /> 64,11 ± 2,1<br /> <br /> Ethanol 40% (4)<br /> <br /> 0,31 ± 4,1<br /> <br /> 49,62 ± 1,1<br /> <br /> 29,83 ± 5,1<br /> <br /> Trong số các nồng độ ethanol khảo<br /> sát, ethanol 70% là dung môi chiết xuất<br /> được khối lượng flavonoid toàn phần lớn<br /> nhất (0,56 g), đồng thời hàm lượng<br /> naringin trong cắn chiết cũng cao nhất<br /> (64,12%). Vì vậy, ethanol 70% được lựa<br /> chọn là dung môi chiết xuất cho các khảo<br /> sát tiếp theo.<br /> <br /> p3-1 < 0,05<br /> p3-2 > 0,1<br /> p3-4 < 0,05<br /> p3-5 > 0,1<br /> <br /> 5. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của<br /> tỷ lệ dung môi - dƣợc liệu.<br /> Tiến hành khảo sát các tỷ lệ dung<br /> môi/dược liệu: 5/1; 7/1; 10/1; 12/1. Hiệu<br /> suất chiết và hàm lượng flavonoid thô<br /> chiết với tỷ lệ dung môi khác nhau.<br /> <br /> Bảng 4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi - dược liệu tới hiệu suất chiết<br /> (n = 5).<br /> (g)<br /> <br /> 22<br /> <br /> 5/1 (1)<br /> <br /> 0,43 ± 3,7<br /> <br /> 59,50 ± 1,7<br /> <br /> 48,66 ± 5,1<br /> <br /> 7/1 (2)<br /> <br /> 0,51 ± 0,9<br /> <br /> 59,56 ± 1,2<br /> <br /> 57,80 ± 1,5<br /> <br /> 10/1 (3)<br /> <br /> 0,60 ± 0,9<br /> <br /> 60,32 ± 1,2<br /> <br /> 69,65 ± 1,3<br /> <br /> 12/1 (4)<br /> <br /> 0,60 ± 2,2<br /> <br /> 61,68 ± 1,3<br /> <br /> 71,45 ± 3,3<br /> <br /> p3-1 < 0,05<br /> p3-2 < 0,05<br /> p3-4 > 0,1<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015<br /> <br /> Tỷ lệ dung môi/dược liệu (5/1) cho<br /> hiệu suất chiết thấp nhất (48,66%). Khi<br /> tăng tỷ lệ dung môi, hiệu suất chiết cũng<br /> tăng lên, cao nhất ở tỷ lệ 12/1 (71,45%),<br /> khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa<br /> tỷ lệ 10/1 (69,65%) và tỷ lệ 12/1 (71,45%)<br /> (p > 0,1). Từ kết quả khảo sát trên, chúng<br /> <br /> tôi lựa chọn tỷ lệ dung môi/dược liệu là<br /> 10/1 cho các khảo sát tiếp theo.<br /> 6. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của<br /> nhiệt độ chiết xuất.<br /> Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của<br /> nhiệt độ tới hiệu suất chiết ở các nhiệt độ<br /> sau: nhiệt độ phòng, 550C và 780C.<br /> <br /> Bảng 5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất chiết (n = 5).<br /> (g)<br /> <br /> Nhiệt độ phòng (1)<br /> <br /> (%)<br /> <br /> (%)<br /> <br /> 0,44 ± 3,6<br /> <br /> 59,72 ± 1,4<br /> <br /> 50,85 ± 4,1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0,60 ± 0,8<br /> <br /> 61,32 ± 1,1<br /> <br /> 70,96 ± 1,7<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0,62 ± 1,7<br /> <br /> 59,96 ± 1,4<br /> <br /> 71,34 ± 1,4<br /> <br /> 55 C (2)<br /> 78 C (3)<br /> <br /> Tăng nhiệt độ chiết xuất đã làm tăng<br /> lượng flavonoid chiết được. Kết quả này<br /> có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Ở nhiệt<br /> độ phòng, lượng flavonoid chiết được đạt<br /> 0,4444 g (hiệu suất 50,85%), nhưng khi<br /> tăng nhiệt độ lên 550C, làm tăng đáng kể<br /> lượng flavonoid chiết được (0,6040 g,<br /> hiệu suất 70,96%). Tuy nhiên, khi tiếp tục<br /> tăng nhiệt độ lên nhiệt độ sôi của dung<br /> môi (780C), khối lượng cắn flavonoid thu<br /> <br /> P2-1 < 0,05<br /> P2-3 > 0,1<br /> <br /> được tăng lên không đáng kể (0,6212 g,<br /> hiệu suất 71,34%). Do vậy, chiết xuất ở<br /> 550C là thích hợp nhất trong nghiên cứu này.<br /> 7. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của<br /> số lần chiết xuất.<br /> Tiến hành chiết xuất dược liệu với số<br /> lần chiết khác nhau: 1 lần, 2 lần, 3 lần và<br /> 4 lần.<br /> <br /> Bảng 6: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết tới hiệu suất chiết (n = 5).<br /> (g)<br /> <br /> 1 lần (1)<br /> <br /> 0,29 ± 0,4<br /> <br /> 59,84 ± 0,9<br /> <br /> 33,26 ± 1,1<br /> <br /> 2 lần (2)<br /> <br /> 0,55 ± 0,4<br /> <br /> 61,30 ± 1,0<br /> <br /> 64,27 ± 1,2<br /> <br /> 3 lần (3)<br /> <br /> 0,61 ± 0,6<br /> <br /> 61,08 ± 1,6<br /> <br /> 71,10 ± 1,7<br /> <br /> 4 lần (4)<br /> <br /> 0,62 ± 0,7<br /> <br /> 61,32 ± 0,5<br /> <br /> 72,52 ± 1,0<br /> <br /> Khi tăng số lần chiết, lượng flavonoid<br /> toàn phần chiết được cũng tăng lên.<br /> Lượng flavonoid thu được chủ yếu ở lần<br /> chiết 1 và 2. Ở lần chiết 3 và 4, lượng<br /> flavonoid thu được giảm.<br /> Khi tăng số lần chiết xuất naringin từ 1<br /> lần lên 4 lần, hiệu suất chiết tăng theo<br /> 23<br /> <br /> P3-1 < 0,05<br /> P3-2 > 0,1<br /> P3-4 > 0,1<br /> <br /> tương ứng từ 33,26 - 72,52%. Hiệu suất<br /> chiết 4 lần là 72,52% so với chiết 3 lần<br /> là 71,10%, khác biệt này không có ý nghĩa<br /> thống kê (p > 0,1). Do đó, chiết xuất 3<br /> lần là phù hợp, vì tiếp tục tăng số lần<br /> chiết thì lượng hoạt chất tăng lên không<br /> đáng kể.<br /> <br />