Nghiên cứu chọn tạo giống ngô cho vùng khó khăn

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ CHO VÙNG KHÓ KHĂN<br /> TS. Lương Văn Vàng<br /> Viện Nghiên cứu Ngô<br /> SUMMARY<br /> Research on maize breeding for abiotic stress region<br /> The title “Research on maize breeding for abiotic stress region” was carried out by Maize Research<br /> Institute for the period 2011 - 2015. After more than two years of implementation based on the<br /> traditional method of breeding combining with marker assisted selection, the results was achieved in<br /> accordance with the objectives as: 1) a single drought tolerant hybrid VS36 was temporarily released to<br /> production by Ministry of Agriculture and Rural Development; 2) some potential inbred lines such as<br /> 103/, LS6/Msto, LS5/NK43, VHK4, VHA5, VHA1, G5011, VHB3, VHB6 were developed 3) Some promising<br /> crosses of CN 11-2, VS 71, H11-9, VS101, VS104, VS106, H08-7, VS90, VS686, VS89, VS90, VS8N,<br /> VS80 were also developed and; 4) 5 national papers/reports were published on Vietnam Agricultural<br /> Science and Technology magazine<br /> Keywords: Drought tolerance, abiotic stress.<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ *<br /> Ngô, lúa mỳ, lúa nước là ba cây lương thực<br /> hàng đầu trên thế giới và là cây thức ăn chăn nuôi<br /> quan trọng nhất hiện nay. Ngành sản xuất ngô thế<br /> giới tăng liên tục từ đầu thế kỷ 20 đến nay, nhất<br /> là trong gần 50 năm qua, ngô là cây trồng có tốc<br /> độ tăng trưởng cao nhất trong các cây lương thực<br /> chủ yếu về cả ba chỉ tiêu chính là năng suất, diện<br /> tích và sản lượng.<br /> Tuy nhiên, hiện nay việc phát triển ngô trên<br /> thế giới đang gặp phải khó khăn do sự biển đổi khí<br /> hậu, trái đất nóng lên làm thay đổi các vùng đất<br /> trồng trọt. Đất đai bị hạn hán, nhiễm chua phèn,<br /> nhiễm mặn, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất<br /> nông nghiệp nói chung và sản xuất ngô nói riêng.<br /> Do vậy, các nhà khoa học trên thế giới đã tập<br /> trung nghiên cứu chọn tạo các giống mới và các<br /> biện pháp kỹ thuật nhằm tăng cường hiệu quả của<br /> sản xuất ngô trên các vùng đất khó khăn.<br /> Ở Việt Nam, việc chọn tạo các giống ngô<br /> cho vùng khó khăn (hạn, nhiễm phèn, mặn)<br /> chưa được đầu tư nghiên cứu và các sản phẩm<br /> chưa phong phú để người sản xuất có thể lựa<br /> chọn áp dụng. Để đảm bảo lương thực cho nhu<br /> cầu con người thì việc khai thác các vùng đất có<br /> điều kiện canh tác khó khăn là rất cần thiết. Đối<br /> với ngành sản xuất ngô thì mục tiêu nghiên cứu<br /> chọn tạo các giống có khả năng chống chịu với<br /> điều kiện bất thuận được các chương trình chọn<br /> giống quan tâm.<br /> Với mục tiêu: Sử dụng phương pháp tiên tiến<br /> kết hợp với truyền thống để chọn tạo và phát<br /> <br /> Người phản biện: TS. Mai Xuân Triệu.<br /> <br /> 348<br /> <br /> triển được bộ giống ngô lai chịu hạn, chua phèn<br /> cho năng suất cao (7 - 8 tấn/ha), thích hợp cho<br /> các vùng khó khăn, cụ thể:<br /> - Chọn lọc được 3 - 5 dòng thuần có đặc<br /> điểm nông sinh học tốt, chịu hạn, chịu chua phèn,<br /> có khả năng kết hợp cao phục vụ lai tạo giống<br /> ngô cho vùng khó khăn<br /> - Tạo được 2 giống ngô chịu hạn cho vùng<br /> miền núi phía Bắc và Tây Nguyên, 1 giống ngô<br /> chịu phèn cho vùng duyên hải Nam Trung Bộ và<br /> đồng bằng sông Cửu Long, năng suất đạt 7 - 8<br /> tấn/ha.<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Vật liệu<br /> - Tập đoàn dòng thuần có đời tự phối từ S2<br /> đến S10 của Viện Nghiên cứu Ngô.<br /> - Các tổ hợp lai (THL) từ kết quả lai thử<br /> các dòng triển vọng.<br /> - Các THL triển vọng được xác định qua<br /> thử nghiệm.<br /> - Các giống triển vọng trong so sánh và<br /> khảo nghiệm.<br /> - Hệ thống dung dịch dưỡng (thí nghiệm<br /> chịu phèn mặn): Yoshida (IRRI, 1997).<br /> - Các hóa chất và vật tư cần thiết cho thí<br /> nghiệm Marker phân tử.<br /> 2.2. Phương pháp<br /> 2.2.1. Thu thập vật liệu, chọn tạo và duy trì các<br /> dòng bằng phương pháp tự phối, sib.<br /> <br /> Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br /> <br /> 2.2.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử (MAS) trong<br /> chọn tạo dòng chịu hạn, phèn - mặn<br /> <br /> 2.2.2. Đánh giá khả năng chịu hạn và phèn - mặn<br /> của các dòng trong nhà lưới, ngoài đồng ruộng<br /> thông qua một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá.<br /> * Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng<br /> ở giai đoạn cây con: Theo dõi mức độ héo của<br /> cây sau 1 3, 5 7 ngày gây hạn; theo dõi mức độ<br /> phục hồi của cây sau 1, 3, 5, 7 ngày tưới đủ ẩm<br /> trở lại (Thang điểm của CIMMYT).<br /> * Đánh giá khả năng chịu phèn, mặn của các<br /> dòng trong chậu và nhà lưới: Ngô được gieo nẩy<br /> mầm trong khay, 5 ngày sau mọc bổ sung 50mM<br /> NaCl, 2 ngày tiếp theo bổ sung đủ lượng muối<br /> cho từng công thức; dung dịch dưỡng được thay<br /> 4 ngày/lần; Đo đếm chiều dài thân lá/rễ ở 17<br /> ngày sau cấy và khối lượng khô thân lá/rễ khi sấy<br /> khô tuyệt đối (Sấy khô tuyệt đối ở nhiệt độ 75oC<br /> cho đến khi trọng lượng không thay đổi,)<br /> Cấp<br /> 1<br /> 3<br /> 5<br /> 9<br /> 10<br /> <br /> Triệu chứng<br /> Cây phát triển bình thường<br /> Chóp lá hoặc phân nửa của lá có<br /> vết trắng, lá cuốn lại<br /> Phát triển chậm lại, hầu hết lá<br /> bị cuốn<br /> Ngừng phát triển, hầu hết lá bị khô,<br /> nõn bị chết<br /> 100% cây chết hoặc khô<br /> <br /> - Tách chiết ADN theo phương pháp của<br /> Saghai - Maroof (1984).<br /> - Xác định đoạn gen mang gen chịu hạn,<br /> phèn - mặn bằng trình tự các mồi theo phương<br /> pháp PCR của Matsuoka và cộng sự (2000).<br /> 2.2.5. Đánh giá khả năng kết hợp của các dòng<br /> bằng phương pháp lai đỉnh (Top Cross) và lai<br /> luân phiên (Diallen Cross).<br /> 2.2.6. Thí nghiệm khảo sát và so sánh các THL<br /> bố trí theo sơ đồ Alpha lattice và RCBD; theo dõi<br /> theo hướng dẫn của CIMMYT và Viện Nghiên<br /> cứu Ngô.<br /> 2.2.7. Khảo nghiệm giống mới: Theo tiêu chuẩn<br /> ngành 10 TCN 314 - 2006.<br /> <br /> Đánh giá<br /> Chống chịu tốt<br /> Chống chịu<br /> <br /> III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> <br /> Chống chịu<br /> trung bình<br /> Chống chịu<br /> kém<br /> Chống chịu<br /> rất kém<br /> <br /> 3.1. Thu thập vật liệu, thanh lọc, tạo mới và<br /> duy trì các dòng<br /> Năm 2011, gieo 250 nguồn vật liệu, xác định<br /> được các dòng 103/, LS6/Msto, LS5/NK43,<br /> AT4.2, AT5 - 2, 30Y87 - 1, NOV517, AT4.3, L<br /> Đ 22, SR1, SR2, V67.4, VHK4, VHA5, Thịnh<br /> ngô số 8, VHA1, G5011, VHB3, VHB6 chịu hạn<br /> tốt, chống đổ khá. Năm 2012, qua đánh giá các<br /> dòng lựa chọn trong năm 2011 đã khẳng định lại<br /> được các dòng 103/, LS6/Msto, LS5/NK43,<br /> VHA5, VHB3, G5011 có nhiều đặc điểm quí,<br /> phù hợp với mục tiêu của đề tài.<br /> <br /> 2.2.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các vật<br /> liệu qua thí nghiệm đồng ruộng, điều khiển tưới ở<br /> giai đoạn 7 - 9 lá - chín sữa; theo dõi hình thái<br /> cây, mức độ héo của lá, chênh lệch tung phấn phun râu, khả năng chống chịu sâu bệnh chính,<br /> tổng số lá xanh còn lại, tỷ lệ bắp trên cây, chiều<br /> dài bắp hữu hiệu, tỷ lệ đuôi chuột, năng suất và<br /> các yếu tố cấu thành năng suất.<br /> <br /> Bảng 1. Đặc điểm nông sinh học chính của các dòng triển vọng nhất<br /> Chiều cao (cm)<br /> <br /> Số<br /> nhánh<br /> cờ<br /> <br /> Dài bắp<br /> (cm)<br /> <br /> ĐK bắp<br /> (cm)<br /> <br /> Số hàng<br /> hạt<br /> <br /> Số hạt<br /> <br /> NSLT<br /> (tạ/ha)<br /> <br /> 13,6<br /> <br /> 13,9<br /> <br /> 36,6<br /> <br /> Cây<br /> <br /> Bắp<br /> <br /> Chiều dài<br /> cờ (cm)<br /> <br /> VHK4.4<br /> <br /> 156,0<br /> <br /> 76,0<br /> <br /> 33,0<br /> <br /> 12,0<br /> <br /> 12,3<br /> <br /> 4,0<br /> <br /> 2<br /> <br /> SV3.1<br /> <br /> 202,2<br /> <br /> 116,0<br /> <br /> 25,0<br /> <br /> 16,0<br /> <br /> 14,5<br /> <br /> 4,1<br /> <br /> 13,7<br /> <br /> 16,8<br /> <br /> 34,5<br /> <br /> 3<br /> <br /> SA501<br /> <br /> 141,0<br /> <br /> 63,0<br /> <br /> 26,0<br /> <br /> 8,0<br /> <br /> 12,8<br /> <br /> 3,8<br /> <br /> 11,8<br /> <br /> 18,0<br /> <br /> 36,3<br /> <br /> 4<br /> <br /> NOVBO<br /> <br /> 142,0<br /> <br /> 66,0<br /> <br /> 33,0<br /> <br /> 9,4<br /> <br /> 9,5<br /> <br /> 3,9<br /> <br /> 12,1<br /> <br /> 16,4<br /> <br /> 30,5<br /> <br /> TT<br /> <br /> Dòng<br /> <br /> 1<br /> <br /> 5<br /> <br /> VHB3<br /> <br /> 177,0<br /> <br /> 88,0<br /> <br /> 34,0<br /> <br /> 15,8<br /> <br /> 12,7<br /> <br /> 4,2<br /> <br /> 12,7<br /> <br /> 17,7<br /> <br /> 45,8<br /> <br /> 6<br /> <br /> LS5/NK43<br /> <br /> 142,0<br /> <br /> 64,0<br /> <br /> 34,0<br /> <br /> 14,4<br /> <br /> 12,9<br /> <br /> 4,1<br /> <br /> 12,6<br /> <br /> 18,6<br /> <br /> 40,8<br /> <br /> 7<br /> <br /> LS6/Msto<br /> <br /> 155,0<br /> <br /> 72,0<br /> <br /> 28,0<br /> <br /> 16,4<br /> <br /> 11,8<br /> <br /> 4,0<br /> <br /> 12,7<br /> <br /> 16,5<br /> <br /> 42,0<br /> <br /> 8<br /> <br /> TL160.1<br /> <br /> 142,0<br /> <br /> 56,0<br /> <br /> 35,0<br /> <br /> 16,4<br /> <br /> 10,9<br /> <br /> 3,8<br /> <br /> 11,9<br /> <br /> 18,4<br /> <br /> 36,1<br /> <br /> 9<br /> <br /> VHA5<br /> <br /> 142,0<br /> <br /> 84,0<br /> <br /> 31,0<br /> <br /> 15,8<br /> <br /> 9,8<br /> <br /> 3,7<br /> <br /> 11,7<br /> <br /> 17,0<br /> <br /> 44.6<br /> <br /> 10<br /> <br /> TL160.2<br /> <br /> 169,0<br /> <br /> 78,0<br /> <br /> 32,0<br /> <br /> 19,4<br /> <br /> 9,7<br /> <br /> 4,1<br /> <br /> 12,2<br /> <br /> 16,5<br /> <br /> 32.3<br /> <br /> 11<br /> <br /> VHA1<br /> <br /> 161,0<br /> <br /> 92,0<br /> <br /> 32,0<br /> <br /> 8,0<br /> <br /> 11,4<br /> <br /> 3,9<br /> <br /> 12,3<br /> <br /> 18,3<br /> <br /> 37,5<br /> <br /> 12<br /> <br /> G5011<br /> <br /> 167,0<br /> <br /> 94,0<br /> <br /> 30,0<br /> <br /> 10,6<br /> <br /> 11,7<br /> <br /> 3,9<br /> <br /> 12,3<br /> <br /> 15,4<br /> <br /> 40.2<br /> <br /> 13<br /> <br /> 103/<br /> <br /> 152,0<br /> <br /> 62,0<br /> <br /> 34,0<br /> <br /> 10,8<br /> <br /> 12,5<br /> <br /> 4,1<br /> <br /> 12,4<br /> <br /> 18,2<br /> <br /> 41,1<br /> <br /> 349<br /> <br /> VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br /> <br /> Dòng LS5/NK43<br /> <br /> Dòng LS6/Msto<br /> <br /> Dòng VHA5<br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh một số dòng triển vọng<br /> Qua theo dõi, đánh giá và chọn lọc trên đồng<br /> ruộng cho thấy, các dòng được đánh giá tốt trong<br /> các vụ của năm 2011 và 2012 đều cho kết quả tốt<br /> <br /> trong vụ Xuân 2013. Hầu hết các dòng này đều<br /> biểu hiện chịu nắng nóng, ít đổ, gãy, ít nhiễm sâu<br /> bệnh, kết hạt tốt, năng suất dòng khá.<br /> <br /> 3.2. Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng chịu phèn mặn trong chậu và nhà lưới<br /> 3.2.1. Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn<br /> Năm 2011, đánh giá 32 tổ hợp lai và 48 dòng, kết quả trong bảng 2 và 3.<br /> Bảng 2. Thống kê một số chỉ tiêu theo dõi của 32 tổ hợp lai<br /> TT<br /> <br /> Chỉ tiêu<br /> <br /> 1<br /> <br /> Dài thân lá<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> Số THL<br /> <br /> Giá trị thấp nhất/cao nhất<br /> <br /> < 30cm<br /> <br /> 4<br /> <br /> STM12<br /> <br /> 30≤ (cm) < 40<br /> <br /> 25<br /> <br /> 40cm<br /> <br /> 3<br /> <br /> STM28<br /> <br /> < 15cm<br /> <br /> 1<br /> <br /> STM32<br /> <br /> 15≤ (cm) < 20<br /> <br /> 12<br /> <br />  20cm<br /> <br /> 19<br /> <br /> STM6<br /> <br /> < 0,3g<br /> <br /> 5<br /> <br /> STM8<br /> <br /> 0,3 ≤ (g) < 0,4<br /> <br /> 13<br /> <br /> 0,4 ≤ (g) < 0,5<br /> <br /> 13<br /> <br />  0,5 g<br /> <br /> 1<br /> <br /> STM28<br /> <br /> < 0,2g<br /> <br /> 3<br /> <br /> STM4<br /> <br /> 0,2 ≤ (g) < 0,3<br /> <br /> 25<br /> <br />  0,3 g<br /> <br /> 4<br /> <br /> Dài rễ<br /> <br /> Khối lượng khô thân lá<br /> <br /> Khối lượng khô rễ<br /> <br /> Kết quả bảng 2 cho thấy: Sau 17 ngày nuôi<br /> cấy trong dung dịch dưỡng có bổ sung NaCl theo<br /> các công thức thì giữa các giống khác nhau có sự<br /> 350<br /> <br /> STM28<br /> <br /> sai khác chắc chắn về 4 chỉ tiêu theo dõi. Đối với<br /> các dòng nghiên cứu cũng có kết luận tương tự<br /> (bảng 3).<br /> <br /> Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br /> <br /> Bảng 3. Thống kê một số chỉ tiêu theo dõi của 48 dòng<br /> TT<br /> <br /> Chỉ tiêu<br /> <br /> 1<br /> <br /> Dài thân lá<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> Số dòng<br /> <br /> Giá trị thấp nhất/cao nhất<br /> <br /> < 20cm<br /> <br /> 10<br /> <br /> STM84<br /> <br /> 20≤ (cm) < 30<br /> <br /> 32<br /> <br />  30cm<br /> <br /> 6<br /> <br /> STM46<br /> <br /> < 10cm<br /> <br /> 11<br /> <br /> STM59<br /> <br /> 10≤ (cm) < 15<br /> <br /> 31<br /> <br /> 15cm<br /> <br /> 6<br /> <br /> STM46<br /> <br /> STM84<br /> <br /> Dài rễ<br /> <br /> Khối lượng khô thân lá<br /> < 0,1g<br /> <br /> 9<br /> <br /> 0,1 ≤ (g) < 0,2<br /> <br /> 34<br /> <br />  0,2 g<br /> <br /> 5<br /> <br /> STM35, 38<br /> <br /> STM49, 70<br /> <br /> Khối lượng khô rễ<br /> < 0,1g<br /> <br /> 17<br /> <br /> 0,1 ≤ (g) < 0,2<br /> <br /> 31<br /> <br />  0,2 g<br /> <br /> 0<br /> <br /> Xác định sơ bộ được các tổ hợp có khả năng<br /> chống chịu mặn khá là STM14, STM15, STM25.<br /> Kết hợp đánh giá cảm quan xác định được một số<br /> dòng có lá còn xanh ở CT4 là STM38, 46, 52, 58,<br /> 60, 65, 66, 69, 71,77, 79.<br /> <br /> - Nồng độ muối thấp ảnh hưởng không<br /> nhiều, trong một số trường hợp còn kích thích<br /> sinh trưởng thân lá và rễ của các tổ hợp lai. Tuy<br /> nhiên, khi tăng độ mặn thì hầu hết các chỉ tiêu<br /> sinh trưởng đều có hướng giảm.<br /> <br /> Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu phèn<br /> mặn của một số THL trong năm 2012 với phương<br /> pháp tương tự đã đưa ra một số nhận định sau:<br /> <br /> - Xác định được một số THL chịu tốt trong<br /> môi trường mặn ở giai đoạn cây con là CN12 - 2,<br /> VS91, VS93, H12 - 2, H11 - 8 và SB12 - 24.<br /> <br /> Hình 2. Thí nghiệm chịu phèn - mặn trong chậu và nhà lưới<br /> 3.2.2. Đánh giá khả năng chịu hạn trong dung<br /> dịch polyetylen glycol 20%<br /> Kết quả sau khi xử lý bằng dung dịch PEG<br /> 20% cho thấy:<br /> - Các THL có khả năng chịu hạn là VS71,<br /> KH11 - 1, CN11 - 2 và VS36.<br /> <br /> - Các dòng mẹ CN11 - 3, TBD2, VHB6, mẹ<br /> CN09 - 4, mẹ CN11 - 2 có khả năng chịu hạn tốt<br /> nhất.<br /> Năm 2012, thí nghiệm được thực hiện với 43<br /> THL. Kết quả theo dõi cho thấy có 5 THL có khả<br /> năng chịu hạn cao nhất là H11 - 8, VS2An, SB12<br /> - 8,TB4,VS80 (đều có chiều dài rễ trên 4cm)<br /> 351<br /> <br /> VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br /> <br /> 3.2.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của một số<br /> dòng và THL trong chậu<br /> Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây<br /> con của một số tổ hợp lai và dòng trong năm 2011<br /> cho thấy: Trong 26 tổ hợp lai, các THL VS36,<br /> VS71, CN11 - 2 và H3 chịu hạn tương đương đối<br /> chứng C919 và VN8960; trong 46 dòng sau khi gây<br /> hạn và tưới lại 7 ngày, không có dòng nào phục hồi<br /> <br /> 100%, chỉ có 5/46 dòng có khả năng phục hồi<br /> >75% là mẹ CN11 - 2 (82,1%), bố CN11 - 3<br /> (81,3%), CN11 - 1 (81,1%), cặp bố, mẹ CN09 - 4<br /> (78,2%; 79,2%) và dòng HD5.<br /> Năm 2012, theo dõi, đánh giá 43 tổ hợp lai<br /> cho thấy có 6 THL có khả năng chịu hạn cao, có<br /> tỷ lệ phục hồi trên 70% là SB12 - 2, H11 - 8,<br /> SB12 - 6, SB12 - 26,TB4,VS89.<br /> <br /> Hình 3. Hình ảnh thí nghiệm đánh giá chịu hạn trong phòng<br /> 3.2.4. Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của<br /> các THL ngoài đồng ruộng<br /> Theo dõi mức độ héo lá của 18 dòng tham<br /> gia các thí nghiệm ở giai đoạn trỗ cờ, tung phấn,<br /> phun râu bộ lá lúc thu hoạch cho thấy, phản ứng<br /> của các THL với điều kiện hạn hoàn toàn khác<br /> biệt, các THL VS71, H11 - 7, VS91 và VS103<br /> không bị héo ở giai đoạn tung phấn phun râu mà<br /> còn giữ được bộ lá xanh bền khi thu hoạch.<br /> Kết quả theo dõi năng suất cho thấy, các<br /> THL ở thí nghiệm gây hạn đều thấp hơn so với<br /> các thí nghiệm tưới đủ ẩm từ 0,47 đến 9.91 tạ/ha,<br /> các THL có chênh lệch thấp là VS71, H11 - 7,<br /> VS91 và VS103 dưới 2,0 tạ/ha.<br /> <br /> 3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn, phèn - mặn<br /> của một số dòng bằng marker phân tử:<br /> Kết quả tách chiết và đánh giá nồng độ ADN<br /> tổng số<br /> Kết quả tách chiết ADN cho thấy, các mẫu<br /> DNA có giá trị OD260/OD280 biến thiên từ 1.8 đến<br /> 2.0. Kiểm tra sản phẩm tách chiết ADN bằng<br /> phương pháp điện di trên gel agarose 1% (hình 4)<br /> cho thấy, các mẫu tách chiết được có nồng độ<br /> DNA tổng số cao; băng điện di DNA gọn, sáng<br /> nét thể hiện độ tinh sạch cao.<br /> <br /> Hình 4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm ADN tổng số<br /> <br /> 352<br /> <br />