intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Nghiên cứu chọn tạo giống ngô cho kháng thuốc trừ cỏ bằng phương pháp lai trở lại

Chia sẻ: Nguyễn Văn H | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:11

106
lượt xem
2
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Nghiên cứu chọn tạo giống ngô cho kháng thuốc trừ cỏ bằng phương pháp lai trở lại” được thực hiện theo định hướng trên với mục tiêu: Tạo được 2-3 dòng ngô biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ bằng kỹ thuật lai trở lại; 1-2 giống ngô lai triển vọng mang gen kháng thuốc trừ cỏ.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu chọn tạo giống ngô cho kháng thuốc trừ cỏ bằng phương pháp lai trở lại

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ CHO KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ<br /> BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TRỞ LẠI<br /> TS. Phan Xuân Hào<br /> Viện Nghiên cứu Ngô<br /> SUMMARY<br /> Breeding for herbicide tolerance in Maize by backcrossing<br /> The tolerance to Glyphosate has transferred into some promising inbreed lines by backcross method.<br /> The new inbred lines and hybrids are the similar to initial ones regarding to the phenotypes and yield.<br /> The presence of CP4 EPSPS gene and OPT/mepsps fragments in the donor, eight herbicide - tolerant<br /> maize lines and four hybrids derived from these have asserted by PCR and southern blot technique. In<br /> general, there are no significant difference in the degrees of damage of major diseases and the above ground insects among initial and new developed maize lines and hybrids.<br /> Keywords: Glyphosate, backcross, inbred lines.<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ *<br /> Mặc dù hiện nay vẫn còn một số quan điểm<br /> khác nhau về vấn đề cây trồng biến đổi gen<br /> (GMO), nhưng với việc mở rộng nhanh diện tích<br /> chỉ sau một thời gian ngắn đã khẳng định ý nghĩa<br /> của thành tựu này đối với nhân loại.<br /> Việc chuyển các gen kháng sâu và kháng<br /> thuốc trừ cỏ vào ngô ở Mỹ chỉ thực hiện theo công<br /> nghệ sinh học cho một số dòng, sau đó chuyển vào<br /> các dòng khác bằng phương pháp lai trở lại, kể cả<br /> nhiều tính trạng như giống ngô Smart stax [8]. Các<br /> công ty hạt giống vừa và nhỏ ở Mỹ cũng chuyển<br /> các gen được mua bản quyền vào các dòng hiện có<br /> của họ bằng phương pháp lai trở lại [7]. Có thể<br /> chuyển các gen mới vào các dòng bố hoặc mẹ, con<br /> lai sẽ có tính trạng kết hợp [8]. Đề tài “Chọn tạo<br /> giống ngô kháng thuốc trừ cỏ (KTTC) bằng<br /> phương pháp lai trở lại” được thực hiện theo định<br /> hướng trên với mục tiêu: Tạo được 2 - 3 dòng ngô<br /> biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ bằng kỹ thuật lai<br /> trở lại; 1 - 2 giống ngô lai triển vọng mang gen<br /> kháng thuốc trừ cỏ.<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Vật liệu<br /> Các dòng thuần ngô bình thường: DF1, DF2,<br /> DF4, DF5, DF7, CML161, 2A, 2B, H14, H65,<br /> Người phản biện: TS. Mai Xuân Triệu.<br /> <br /> H171, H020 và các dòng kháng thuốc trừ cỏ<br /> glyphosate cùng loại<br /> *Thí nghiệm PCR và Southern:<br /> Sử dụng 24 nguồn vật liệu ngô bao gồm: 1<br /> nguồn cho gene (donor) và 8 dòng ngô thường, 3<br /> giống ngô lai thường của các dòng, 08 dòng<br /> backcross, 4 giống lai giữa các dòng backcross.<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> - Tạo các dòng mới bằng phương pháp lai lại<br /> và tự phối.<br /> - Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị<br /> phân tử SSR và phần mềm NTSYSpc.<br /> - Phân tích PCR tiến hành với cặp mồi đặc<br /> hiệu cho gen KTTC.<br /> - Tách chiết ADN theo phương pháp của<br /> Saghai - Maroof (1984) [10].<br /> - Phương pháp PCR theo phương pháp của<br /> Grohmann và cộng sự (2009) [4].<br /> - Phân tích sự kiện chuyển gene và vật liệu<br /> thường sử dụng 03 trình tự mồi theo phương<br /> pháp nghiên cứu của Heck và cộng sự (2005) [5].<br /> - Phân tích đoạn OPT/m - epsps sử dụng 02<br /> trình tự mồi theo phương pháp PCR của<br /> Matsuoka và cộng sự (2000) [6].<br /> - Thí nghiệm Southern blot thực hiện theo<br /> phương pháp của Breitler và cộng sự (2004).<br /> 337<br /> <br /> VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br /> <br /> Bảng 1. Danh sách và trình tự các mồi cho thí nghiệm PCR<br /> TT<br /> <br /> Tên mồi<br /> <br /> Trình tự<br /> <br /> 1<br /> <br /> Primer D<br /> <br /> 5’ - GCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG - 3’<br /> <br /> 2<br /> <br /> Primer E<br /> <br /> 5’ - CAGCATCAGCGCTCGAAAGTTTCGTCAA - 3’<br /> <br /> 3<br /> <br /> Primer F<br /> <br /> 5’ - GGCAGGGTGTTGTTGTCCATTTTATGG - 3’<br /> <br /> 4<br /> <br /> Primer OTP5<br /> <br /> 5’ - ACGGTGGAAGAGTTCAATGTATG - 3’<br /> <br /> 5<br /> <br /> PrimerEPS3<br /> <br /> 5’ - TCTCCTTGATGGGCTGCA - 3’<br /> <br /> Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt<br /> Thành phần<br /> DNA<br /> <br /> Nồng độ cuối<br /> <br /> Bước<br /> <br /> 50ng DNA<br /> <br /> 1<br /> <br /> Nhiệt độ - Thời gian<br /> 0<br /> <br /> 95 C - 2 phút<br /> <br /> 0,1uM Primer<br /> <br /> 2<br /> <br /> 94 C - 30 giây<br /> <br /> MgCl2<br /> <br /> 1,5mM Mg+<br /> <br /> 3<br /> <br /> 60 C - 30 giây<br /> <br /> dNTP<br /> <br /> 0,2uM dNTPs<br /> <br /> 4<br /> <br /> 72 C - 1 phút<br /> <br /> Taq buffer<br /> <br /> 1 X Taq buffer<br /> <br /> 5<br /> <br /> 72 C - 10 phút<br /> <br /> Nước<br /> <br /> -<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4 C - bảo quản<br /> <br /> Taq<br /> <br /> 1,5 U Taq<br /> <br /> 7<br /> <br /> Kết thúc<br /> <br /> - Đánh giá an toàn sinh học - khảo nghiệm<br /> hạn chế:<br /> Đối với giống ngô KTTC, những sinh vật<br /> không chủ đích được chọn để đánh giá là tập hợp<br /> các loài chân khớp trong sinh quần cây ngô và<br /> các vật gây bệnh hại cây ngô.<br /> Tiến hành điều tra 5 lần vào các thời điểm:<br /> Lần 1: Vào giai đoạn khoảng V10 - V15,<br /> Lần 2: Vào giai đoạn khoảng V18 - VT,<br /> Lần 3: Vào giai đoạn khoảng R1,<br /> Lần 4: Vào giai đoạn khoảng R2,<br /> Lần 5: Vào giai đoạn khoảng R3 - R4.<br /> Một số chỉ tiêu liên quan đến đa dạng loài<br /> được tính theo Odum (1971) [9]<br /> <br /> 338<br /> <br /> 1 chu kỳ<br /> <br /> 0<br /> <br /> Primer<br /> <br /> - Thí nghiệm khảo sát, đánh giá các THL:<br /> Đánh giá sinh trưởng, phát triển và khả năng<br /> kháng thuốc trừ cỏ trong điều kiện hạn chế,<br /> cách ly.<br /> <br /> Chu kỳ<br /> <br /> 0<br /> <br /> 36 chu kỳ<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1 chu kỳ<br /> <br /> 0<br /> <br /> Các bệnh đốm lá lớn (Helminthoporium<br /> turcicum), đốm lá nhỏ (Helminthoporium<br /> maydis), gỉ sắt (Puccinia maydis), đốm nâu<br /> (Physoderma maydis), khô vằn (Rhizoctonia<br /> solani) được đánh giá vào thời điểm 80 - 85 ngày<br /> sau gieo. Tỷ lệ bệnh, mức độ nhiễm bệnh đánh<br /> giá theo thang điểm từ 1 - 9.<br /> III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1. Kết quả chọn tạo dòng ngô kháng thuốc<br /> trừ cỏ (KTTC)<br /> Duy trì, đánh giá các đặc tính nông học,<br /> khả năng KTTC glyphosate và khả năng kết<br /> hợp của 20 dòng KTTC ở thế hệ BC4S4. Kết<br /> quả cho thấy, các dòng KTTC Glyphosate ổn<br /> định; một số đặc tính nông học cơ bản đã hoàn<br /> toàn giống với các dòng bình thường cùng<br /> loại; các dòng KTTC có biểu hiện sinh trưởng<br /> và phát triển khỏe hơn, cây chắc, lá xanh bền,<br /> bông cờ to, ít nhiễm sâu bệnh.<br /> <br /> Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br /> <br /> Bảng 3. Một số đặc điểm chính của các dòng triển vọng<br /> Bệnh khô vằn<br /> <br /> Bệnh đốm lá<br /> <br /> Dài bắp<br /> <br /> TL hạt/bắp<br /> <br /> Năng suất<br /> <br /> (điểm)<br /> <br /> (điểm)<br /> <br /> (cm)<br /> <br /> (%)<br /> <br /> (tạ/ha)<br /> <br /> Dòng<br /> CG<br /> <br /> BT<br /> <br /> CG<br /> <br /> BT<br /> <br /> CG<br /> <br /> BT<br /> <br /> CG<br /> <br /> BT<br /> <br /> CG<br /> <br /> BT<br /> <br /> DF5<br /> <br /> 113<br /> <br /> 114<br /> <br /> 145,4<br /> <br /> 140,5<br /> <br /> 14,6<br /> <br /> 14,0<br /> <br /> 76,7<br /> <br /> 75,4<br /> <br /> 28,5<br /> <br /> 26,4<br /> <br /> DF7<br /> <br /> 107<br /> <br /> 108<br /> <br /> 124,7<br /> <br /> 123,6<br /> <br /> 12,2<br /> <br /> 11,3<br /> <br /> 72,4<br /> <br /> 70,3<br /> <br /> 21,2<br /> <br /> 20,5<br /> <br /> DF4<br /> <br /> 113<br /> <br /> 115<br /> <br /> 156,5<br /> <br /> 155,3<br /> <br /> 11,5<br /> <br /> 10,4<br /> <br /> 75,5<br /> <br /> 75,0<br /> <br /> 27,7<br /> <br /> 26,2<br /> <br /> CML161<br /> <br /> 116<br /> <br /> 116<br /> <br /> 150,3<br /> <br /> 148,7<br /> <br /> 14,5<br /> <br /> 14,2<br /> <br /> 73,2<br /> <br /> 72,6<br /> <br /> 26,5<br /> <br /> 25,3<br /> <br /> 02A<br /> <br /> 112<br /> <br /> 113<br /> <br /> 137,8<br /> <br /> 133,6<br /> <br /> 12,0<br /> <br /> 11,6<br /> <br /> 71,6<br /> <br /> 71,2<br /> <br /> 24,6<br /> <br /> 23,5<br /> <br /> 02B<br /> <br /> 116<br /> <br /> 117<br /> <br /> 156,5<br /> <br /> 152,8<br /> <br /> 13,7<br /> <br /> 13,2<br /> <br /> 71,4<br /> <br /> 70,7<br /> <br /> 23,5<br /> <br /> 21,4<br /> <br /> DF2<br /> <br /> 117<br /> <br /> 118<br /> <br /> 152,8<br /> <br /> 152,0<br /> <br /> 14,7<br /> <br /> 14,0<br /> <br /> 76,8<br /> <br /> 75,3<br /> <br /> 27,6<br /> <br /> 25,7<br /> <br /> DF1<br /> <br /> 120<br /> <br /> 121<br /> <br /> 151,4<br /> <br /> 148,7<br /> <br /> 11,4<br /> <br /> 11,0<br /> <br /> 72,3<br /> <br /> 71,5<br /> <br /> 20,3<br /> <br /> 19,2<br /> <br /> 24,9<br /> <br /> 23,5<br /> <br /> TB<br /> CV (%)<br /> <br /> 12,2<br /> <br /> LSD.05<br /> <br /> 2,34<br /> <br /> Ghi chú: CG: KTTC; BT: Bình thường, KV: Khô vằn.<br /> <br /> Hình 1. Hình thái bắp của một số dòng<br /> Các dòng KTTC có hình dạng bắp gần đồng<br /> nhất so với các dòng bình thường. Tuy nhiên, do<br /> có đời tự phối ít (BC4S2 - S4) nên vẫn có xu thế<br /> bắp dài và to hơn.<br /> 3.2. Đánh giá đa dạng di truyền các vật liệu<br /> mới tạo ra bằng chỉ thị phân tử SSR<br /> Kết quả ở sơ đồ phả hệ cho thấy hệ số<br /> <br /> tương đồng di truyền của các dòng biến thiên<br /> trong khoảng từ 0.23 - 1.00. Nhìn chung,<br /> khoảng cách di truyền của các dòng tương đối<br /> lớn, cho thấy các dòng tương đối khác biệt nhau<br /> về vật chất di truyền. Hình 2 cho thấy ở hệ số<br /> tương đồng di truyền 0.24, các dòng ngô chia<br /> làm 3 nhóm chính.<br /> <br /> 339<br /> <br /> VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br /> <br /> H1<br /> H1.1<br /> H97<br /> Q59<br /> H9<br /> H14<br /> H264<br /> H240<br /> H250<br /> H226<br /> H228<br /> H6.1<br /> H6.2<br /> H63<br /> H095<br /> H14.1<br /> H276<br /> H67<br /> H54<br /> H1.2<br /> H2<br /> H2.1<br /> H13.2<br /> H26<br /> H59<br /> H82<br /> H230<br /> HP7<br /> H7.1<br /> H7.2<br /> H21<br /> H3.2<br /> H901<br /> H3A<br /> H84<br /> H70<br /> H093<br /> H333<br /> H64<br /> D55<br /> NS25<br /> H65<br /> H53<br /> H95.2<br /> NX18<br /> H171<br /> H29<br /> H414<br /> H17<br /> H60<br /> H46<br /> H8.1<br /> H8.2<br /> H171.<br /> H5.1<br /> H5.2<br /> H4<br /> H4.1<br /> H80<br /> H65.1<br /> H603<br /> DF9<br /> 51<br /> H20<br /> H3.1<br /> H3.3<br /> H672<br /> H19<br /> H866<br /> H18<br /> <br /> H 171. 1<br /> <br /> 0.24<br /> <br /> 0.43<br /> <br /> 0.62<br /> <br /> 0.81<br /> <br /> 1.00<br /> <br /> Coefficient<br /> Hình 2. Sơ đồ phả hệ của 70 dòng ngô phân tích dựa trên 35 chỉ thị SSR<br /> 3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen mới<br /> 3.3.1. Thí nghiệm PCR<br /> <br /> Năm 2011<br /> <br /> - Kết quả tách chiết DNA thu được các mẫu<br /> có hàm lượng DNA cao, nồng độ từ 100 ug/ml<br /> đến 300 ug/ml (hình 3).<br /> <br /> Năm 2012<br /> <br /> Hình 3. Ảnh điện di DNA genome của các mẫu ngô<br /> 340<br /> <br /> Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br /> <br /> - Kết quả phân tích sự kiện chuyển gene<br /> KTTC Glyphosate bằng 3 trình tự mồi D, E, F<br /> (hình 4 và 5) năm 2011 cho thấy: Ở nguồn vật<br /> liệu cho gene sản phẩm PCR được nhân bởi cặp<br /> mồi D và F có độ dài khoảng trên 600bp và 8<br /> dòng ngô thường có sản phẩm PCR được nhân<br /> <br /> bởi cặp mồi E và F khoảng trên 200bp; 8 dòng<br /> ngô KTTC (BC4F4) thể hiện sản phẩm PCR ở cả<br /> 2 đoạn trên 600bp và trên 200bp. Đối với các<br /> giống ngô thường và các giống ngô KTTC kết<br /> quả PCR cũng thể hiện tương tự như đối với các<br /> dòng (hình 5).<br /> <br /> Hình 4. Kết quả PCR 16 dòng ngô bằng 3 trình tự mồi D, E và F. (giếng 1: Thang chuẩn 100bp;<br /> giếng 2: Đối chứng âm; giếng 3: Nguồn cho gene; giếng 4 - 11: 8 dòng ngô thường;<br /> giếng 12 - 18: 8 dòng ngô BC4F4)<br /> <br /> Hình 5. Kết quả phân tích PCR 7 giống ngô bằng 3 trình tự mồi D, E và F. (giếng 1: Thang<br /> <br /> chuẩn 100bp; giếng 2: đối chứng âm; giếng 3: Nguồn cho gene; giếng 4 - 6: 3 giống ngô<br /> thường; giếng 7 - 10: 4 giống ngô lai giữa các dòng BC4F4)<br /> Năm 2012, kết quả điện di phân tích sự có<br /> mặt của gen CP4 EPSPS bằng 3 trình tự mồi D,<br /> E, F cho kết quả tương tự như năm 2011. Điều<br /> này khẳng định chắc chắn sự có mặt của gen<br /> <br /> Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm PCR<br /> của 20 dòng ngô bằng 3 trình tự mồi D, E, F.<br /> (giếng M: Thang chuẩn 100bp; giếng 1: Đối<br /> chứng âm; giếng 2: Đối chứng dương; giếng<br /> 3 - 12: 10 dòng ngô thường; giếng 13 - 22: 10<br /> dòng ngô BC4S4)<br /> <br /> KTTC Glyphosate CP4 EPSPS trong các dòng<br /> mới và các tổ hợp lai có các dòng đó tham gia<br /> (bảng 6 và 7).<br /> <br /> Hình 7. Kết quả phân tích PCR 12 giống ngô bằng<br /> 3 trình tự mồi D, E, F. (giếng M : Thang chuẩn<br /> 100bp; giếng 1: Đối chứng âm; giếng 2: Nguồn vật<br /> liệu cho gen; giếng 3 - 5: LVN4;<br /> giếng 6 - 8: LVN14; giếng 9 - 11: LVN10;<br /> giếng 12 - 14: 2AB)<br /> <br /> 341<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
22=>1