Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br />
<br />
NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ CHO KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ<br />
BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TRỞ LẠI<br />
TS. Phan Xuân Hào<br />
Viện Nghiên cứu Ngô<br />
SUMMARY<br />
Breeding for herbicide tolerance in Maize by backcrossing<br />
The tolerance to Glyphosate has transferred into some promising inbreed lines by backcross method.<br />
The new inbred lines and hybrids are the similar to initial ones regarding to the phenotypes and yield.<br />
The presence of CP4 EPSPS gene and OPT/mepsps fragments in the donor, eight herbicide - tolerant<br />
maize lines and four hybrids derived from these have asserted by PCR and southern blot technique. In<br />
general, there are no significant difference in the degrees of damage of major diseases and the above ground insects among initial and new developed maize lines and hybrids.<br />
Keywords: Glyphosate, backcross, inbred lines.<br />
<br />
I. ĐẶT VẤN ĐỀ *<br />
Mặc dù hiện nay vẫn còn một số quan điểm<br />
khác nhau về vấn đề cây trồng biến đổi gen<br />
(GMO), nhưng với việc mở rộng nhanh diện tích<br />
chỉ sau một thời gian ngắn đã khẳng định ý nghĩa<br />
của thành tựu này đối với nhân loại.<br />
Việc chuyển các gen kháng sâu và kháng<br />
thuốc trừ cỏ vào ngô ở Mỹ chỉ thực hiện theo công<br />
nghệ sinh học cho một số dòng, sau đó chuyển vào<br />
các dòng khác bằng phương pháp lai trở lại, kể cả<br />
nhiều tính trạng như giống ngô Smart stax [8]. Các<br />
công ty hạt giống vừa và nhỏ ở Mỹ cũng chuyển<br />
các gen được mua bản quyền vào các dòng hiện có<br />
của họ bằng phương pháp lai trở lại [7]. Có thể<br />
chuyển các gen mới vào các dòng bố hoặc mẹ, con<br />
lai sẽ có tính trạng kết hợp [8]. Đề tài “Chọn tạo<br />
giống ngô kháng thuốc trừ cỏ (KTTC) bằng<br />
phương pháp lai trở lại” được thực hiện theo định<br />
hướng trên với mục tiêu: Tạo được 2 - 3 dòng ngô<br />
biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ bằng kỹ thuật lai<br />
trở lại; 1 - 2 giống ngô lai triển vọng mang gen<br />
kháng thuốc trừ cỏ.<br />
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
2.1. Vật liệu<br />
Các dòng thuần ngô bình thường: DF1, DF2,<br />
DF4, DF5, DF7, CML161, 2A, 2B, H14, H65,<br />
Người phản biện: TS. Mai Xuân Triệu.<br />
<br />
H171, H020 và các dòng kháng thuốc trừ cỏ<br />
glyphosate cùng loại<br />
*Thí nghiệm PCR và Southern:<br />
Sử dụng 24 nguồn vật liệu ngô bao gồm: 1<br />
nguồn cho gene (donor) và 8 dòng ngô thường, 3<br />
giống ngô lai thường của các dòng, 08 dòng<br />
backcross, 4 giống lai giữa các dòng backcross.<br />
2.2. Phương pháp nghiên cứu<br />
- Tạo các dòng mới bằng phương pháp lai lại<br />
và tự phối.<br />
- Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị<br />
phân tử SSR và phần mềm NTSYSpc.<br />
- Phân tích PCR tiến hành với cặp mồi đặc<br />
hiệu cho gen KTTC.<br />
- Tách chiết ADN theo phương pháp của<br />
Saghai - Maroof (1984) [10].<br />
- Phương pháp PCR theo phương pháp của<br />
Grohmann và cộng sự (2009) [4].<br />
- Phân tích sự kiện chuyển gene và vật liệu<br />
thường sử dụng 03 trình tự mồi theo phương<br />
pháp nghiên cứu của Heck và cộng sự (2005) [5].<br />
- Phân tích đoạn OPT/m - epsps sử dụng 02<br />
trình tự mồi theo phương pháp PCR của<br />
Matsuoka và cộng sự (2000) [6].<br />
- Thí nghiệm Southern blot thực hiện theo<br />
phương pháp của Breitler và cộng sự (2004).<br />
337<br />
<br />
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br />
<br />
Bảng 1. Danh sách và trình tự các mồi cho thí nghiệm PCR<br />
TT<br />
<br />
Tên mồi<br />
<br />
Trình tự<br />
<br />
1<br />
<br />
Primer D<br />
<br />
5’ - GCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG - 3’<br />
<br />
2<br />
<br />
Primer E<br />
<br />
5’ - CAGCATCAGCGCTCGAAAGTTTCGTCAA - 3’<br />
<br />
3<br />
<br />
Primer F<br />
<br />
5’ - GGCAGGGTGTTGTTGTCCATTTTATGG - 3’<br />
<br />
4<br />
<br />
Primer OTP5<br />
<br />
5’ - ACGGTGGAAGAGTTCAATGTATG - 3’<br />
<br />
5<br />
<br />
PrimerEPS3<br />
<br />
5’ - TCTCCTTGATGGGCTGCA - 3’<br />
<br />
Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt<br />
Thành phần<br />
DNA<br />
<br />
Nồng độ cuối<br />
<br />
Bước<br />
<br />
50ng DNA<br />
<br />
1<br />
<br />
Nhiệt độ - Thời gian<br />
0<br />
<br />
95 C - 2 phút<br />
<br />
0,1uM Primer<br />
<br />
2<br />
<br />
94 C - 30 giây<br />
<br />
MgCl2<br />
<br />
1,5mM Mg+<br />
<br />
3<br />
<br />
60 C - 30 giây<br />
<br />
dNTP<br />
<br />
0,2uM dNTPs<br />
<br />
4<br />
<br />
72 C - 1 phút<br />
<br />
Taq buffer<br />
<br />
1 X Taq buffer<br />
<br />
5<br />
<br />
72 C - 10 phút<br />
<br />
Nước<br />
<br />
-<br />
<br />
6<br />
<br />
4 C - bảo quản<br />
<br />
Taq<br />
<br />
1,5 U Taq<br />
<br />
7<br />
<br />
Kết thúc<br />
<br />
- Đánh giá an toàn sinh học - khảo nghiệm<br />
hạn chế:<br />
Đối với giống ngô KTTC, những sinh vật<br />
không chủ đích được chọn để đánh giá là tập hợp<br />
các loài chân khớp trong sinh quần cây ngô và<br />
các vật gây bệnh hại cây ngô.<br />
Tiến hành điều tra 5 lần vào các thời điểm:<br />
Lần 1: Vào giai đoạn khoảng V10 - V15,<br />
Lần 2: Vào giai đoạn khoảng V18 - VT,<br />
Lần 3: Vào giai đoạn khoảng R1,<br />
Lần 4: Vào giai đoạn khoảng R2,<br />
Lần 5: Vào giai đoạn khoảng R3 - R4.<br />
Một số chỉ tiêu liên quan đến đa dạng loài<br />
được tính theo Odum (1971) [9]<br />
<br />
338<br />
<br />
1 chu kỳ<br />
<br />
0<br />
<br />
Primer<br />
<br />
- Thí nghiệm khảo sát, đánh giá các THL:<br />
Đánh giá sinh trưởng, phát triển và khả năng<br />
kháng thuốc trừ cỏ trong điều kiện hạn chế,<br />
cách ly.<br />
<br />
Chu kỳ<br />
<br />
0<br />
<br />
36 chu kỳ<br />
<br />
0<br />
<br />
0<br />
<br />
1 chu kỳ<br />
<br />
0<br />
<br />
Các bệnh đốm lá lớn (Helminthoporium<br />
turcicum), đốm lá nhỏ (Helminthoporium<br />
maydis), gỉ sắt (Puccinia maydis), đốm nâu<br />
(Physoderma maydis), khô vằn (Rhizoctonia<br />
solani) được đánh giá vào thời điểm 80 - 85 ngày<br />
sau gieo. Tỷ lệ bệnh, mức độ nhiễm bệnh đánh<br />
giá theo thang điểm từ 1 - 9.<br />
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
3.1. Kết quả chọn tạo dòng ngô kháng thuốc<br />
trừ cỏ (KTTC)<br />
Duy trì, đánh giá các đặc tính nông học,<br />
khả năng KTTC glyphosate và khả năng kết<br />
hợp của 20 dòng KTTC ở thế hệ BC4S4. Kết<br />
quả cho thấy, các dòng KTTC Glyphosate ổn<br />
định; một số đặc tính nông học cơ bản đã hoàn<br />
toàn giống với các dòng bình thường cùng<br />
loại; các dòng KTTC có biểu hiện sinh trưởng<br />
và phát triển khỏe hơn, cây chắc, lá xanh bền,<br />
bông cờ to, ít nhiễm sâu bệnh.<br />
<br />
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br />
<br />
Bảng 3. Một số đặc điểm chính của các dòng triển vọng<br />
Bệnh khô vằn<br />
<br />
Bệnh đốm lá<br />
<br />
Dài bắp<br />
<br />
TL hạt/bắp<br />
<br />
Năng suất<br />
<br />
(điểm)<br />
<br />
(điểm)<br />
<br />
(cm)<br />
<br />
(%)<br />
<br />
(tạ/ha)<br />
<br />
Dòng<br />
CG<br />
<br />
BT<br />
<br />
CG<br />
<br />
BT<br />
<br />
CG<br />
<br />
BT<br />
<br />
CG<br />
<br />
BT<br />
<br />
CG<br />
<br />
BT<br />
<br />
DF5<br />
<br />
113<br />
<br />
114<br />
<br />
145,4<br />
<br />
140,5<br />
<br />
14,6<br />
<br />
14,0<br />
<br />
76,7<br />
<br />
75,4<br />
<br />
28,5<br />
<br />
26,4<br />
<br />
DF7<br />
<br />
107<br />
<br />
108<br />
<br />
124,7<br />
<br />
123,6<br />
<br />
12,2<br />
<br />
11,3<br />
<br />
72,4<br />
<br />
70,3<br />
<br />
21,2<br />
<br />
20,5<br />
<br />
DF4<br />
<br />
113<br />
<br />
115<br />
<br />
156,5<br />
<br />
155,3<br />
<br />
11,5<br />
<br />
10,4<br />
<br />
75,5<br />
<br />
75,0<br />
<br />
27,7<br />
<br />
26,2<br />
<br />
CML161<br />
<br />
116<br />
<br />
116<br />
<br />
150,3<br />
<br />
148,7<br />
<br />
14,5<br />
<br />
14,2<br />
<br />
73,2<br />
<br />
72,6<br />
<br />
26,5<br />
<br />
25,3<br />
<br />
02A<br />
<br />
112<br />
<br />
113<br />
<br />
137,8<br />
<br />
133,6<br />
<br />
12,0<br />
<br />
11,6<br />
<br />
71,6<br />
<br />
71,2<br />
<br />
24,6<br />
<br />
23,5<br />
<br />
02B<br />
<br />
116<br />
<br />
117<br />
<br />
156,5<br />
<br />
152,8<br />
<br />
13,7<br />
<br />
13,2<br />
<br />
71,4<br />
<br />
70,7<br />
<br />
23,5<br />
<br />
21,4<br />
<br />
DF2<br />
<br />
117<br />
<br />
118<br />
<br />
152,8<br />
<br />
152,0<br />
<br />
14,7<br />
<br />
14,0<br />
<br />
76,8<br />
<br />
75,3<br />
<br />
27,6<br />
<br />
25,7<br />
<br />
DF1<br />
<br />
120<br />
<br />
121<br />
<br />
151,4<br />
<br />
148,7<br />
<br />
11,4<br />
<br />
11,0<br />
<br />
72,3<br />
<br />
71,5<br />
<br />
20,3<br />
<br />
19,2<br />
<br />
24,9<br />
<br />
23,5<br />
<br />
TB<br />
CV (%)<br />
<br />
12,2<br />
<br />
LSD.05<br />
<br />
2,34<br />
<br />
Ghi chú: CG: KTTC; BT: Bình thường, KV: Khô vằn.<br />
<br />
Hình 1. Hình thái bắp của một số dòng<br />
Các dòng KTTC có hình dạng bắp gần đồng<br />
nhất so với các dòng bình thường. Tuy nhiên, do<br />
có đời tự phối ít (BC4S2 - S4) nên vẫn có xu thế<br />
bắp dài và to hơn.<br />
3.2. Đánh giá đa dạng di truyền các vật liệu<br />
mới tạo ra bằng chỉ thị phân tử SSR<br />
Kết quả ở sơ đồ phả hệ cho thấy hệ số<br />
<br />
tương đồng di truyền của các dòng biến thiên<br />
trong khoảng từ 0.23 - 1.00. Nhìn chung,<br />
khoảng cách di truyền của các dòng tương đối<br />
lớn, cho thấy các dòng tương đối khác biệt nhau<br />
về vật chất di truyền. Hình 2 cho thấy ở hệ số<br />
tương đồng di truyền 0.24, các dòng ngô chia<br />
làm 3 nhóm chính.<br />
<br />
339<br />
<br />
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br />
<br />
H1<br />
H1.1<br />
H97<br />
Q59<br />
H9<br />
H14<br />
H264<br />
H240<br />
H250<br />
H226<br />
H228<br />
H6.1<br />
H6.2<br />
H63<br />
H095<br />
H14.1<br />
H276<br />
H67<br />
H54<br />
H1.2<br />
H2<br />
H2.1<br />
H13.2<br />
H26<br />
H59<br />
H82<br />
H230<br />
HP7<br />
H7.1<br />
H7.2<br />
H21<br />
H3.2<br />
H901<br />
H3A<br />
H84<br />
H70<br />
H093<br />
H333<br />
H64<br />
D55<br />
NS25<br />
H65<br />
H53<br />
H95.2<br />
NX18<br />
H171<br />
H29<br />
H414<br />
H17<br />
H60<br />
H46<br />
H8.1<br />
H8.2<br />
H171.<br />
H5.1<br />
H5.2<br />
H4<br />
H4.1<br />
H80<br />
H65.1<br />
H603<br />
DF9<br />
51<br />
H20<br />
H3.1<br />
H3.3<br />
H672<br />
H19<br />
H866<br />
H18<br />
<br />
H 171. 1<br />
<br />
0.24<br />
<br />
0.43<br />
<br />
0.62<br />
<br />
0.81<br />
<br />
1.00<br />
<br />
Coefficient<br />
Hình 2. Sơ đồ phả hệ của 70 dòng ngô phân tích dựa trên 35 chỉ thị SSR<br />
3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen mới<br />
3.3.1. Thí nghiệm PCR<br />
<br />
Năm 2011<br />
<br />
- Kết quả tách chiết DNA thu được các mẫu<br />
có hàm lượng DNA cao, nồng độ từ 100 ug/ml<br />
đến 300 ug/ml (hình 3).<br />
<br />
Năm 2012<br />
<br />
Hình 3. Ảnh điện di DNA genome của các mẫu ngô<br />
340<br />
<br />
Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br />
<br />
- Kết quả phân tích sự kiện chuyển gene<br />
KTTC Glyphosate bằng 3 trình tự mồi D, E, F<br />
(hình 4 và 5) năm 2011 cho thấy: Ở nguồn vật<br />
liệu cho gene sản phẩm PCR được nhân bởi cặp<br />
mồi D và F có độ dài khoảng trên 600bp và 8<br />
dòng ngô thường có sản phẩm PCR được nhân<br />
<br />
bởi cặp mồi E và F khoảng trên 200bp; 8 dòng<br />
ngô KTTC (BC4F4) thể hiện sản phẩm PCR ở cả<br />
2 đoạn trên 600bp và trên 200bp. Đối với các<br />
giống ngô thường và các giống ngô KTTC kết<br />
quả PCR cũng thể hiện tương tự như đối với các<br />
dòng (hình 5).<br />
<br />
Hình 4. Kết quả PCR 16 dòng ngô bằng 3 trình tự mồi D, E và F. (giếng 1: Thang chuẩn 100bp;<br />
giếng 2: Đối chứng âm; giếng 3: Nguồn cho gene; giếng 4 - 11: 8 dòng ngô thường;<br />
giếng 12 - 18: 8 dòng ngô BC4F4)<br />
<br />
Hình 5. Kết quả phân tích PCR 7 giống ngô bằng 3 trình tự mồi D, E và F. (giếng 1: Thang<br />
<br />
chuẩn 100bp; giếng 2: đối chứng âm; giếng 3: Nguồn cho gene; giếng 4 - 6: 3 giống ngô<br />
thường; giếng 7 - 10: 4 giống ngô lai giữa các dòng BC4F4)<br />
Năm 2012, kết quả điện di phân tích sự có<br />
mặt của gen CP4 EPSPS bằng 3 trình tự mồi D,<br />
E, F cho kết quả tương tự như năm 2011. Điều<br />
này khẳng định chắc chắn sự có mặt của gen<br />
<br />
Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm PCR<br />
của 20 dòng ngô bằng 3 trình tự mồi D, E, F.<br />
(giếng M: Thang chuẩn 100bp; giếng 1: Đối<br />
chứng âm; giếng 2: Đối chứng dương; giếng<br />
3 - 12: 10 dòng ngô thường; giếng 13 - 22: 10<br />
dòng ngô BC4S4)<br />
<br />
KTTC Glyphosate CP4 EPSPS trong các dòng<br />
mới và các tổ hợp lai có các dòng đó tham gia<br />
(bảng 6 và 7).<br />
<br />
Hình 7. Kết quả phân tích PCR 12 giống ngô bằng<br />
3 trình tự mồi D, E, F. (giếng M : Thang chuẩn<br />
100bp; giếng 1: Đối chứng âm; giếng 2: Nguồn vật<br />
liệu cho gen; giếng 3 - 5: LVN4;<br />
giếng 6 - 8: LVN14; giếng 9 - 11: LVN10;<br />
giếng 12 - 14: 2AB)<br />
<br />
341<br />
<br />