Nghiên cứu chọn tạo giống ngô cho kháng thuốc trừ cỏ bằng phương pháp lai trở lại

Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br /> <br /> NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ CHO KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ<br /> BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TRỞ LẠI<br /> TS. Phan Xuân Hào<br /> Viện Nghiên cứu Ngô<br /> SUMMARY<br /> Breeding for herbicide tolerance in Maize by backcrossing<br /> The tolerance to Glyphosate has transferred into some promising inbreed lines by backcross method.<br /> The new inbred lines and hybrids are the similar to initial ones regarding to the phenotypes and yield.<br /> The presence of CP4 EPSPS gene and OPT/mepsps fragments in the donor, eight herbicide - tolerant<br /> maize lines and four hybrids derived from these have asserted by PCR and southern blot technique. In<br /> general, there are no significant difference in the degrees of damage of major diseases and the above ground insects among initial and new developed maize lines and hybrids.<br /> Keywords: Glyphosate, backcross, inbred lines.<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ *<br /> Mặc dù hiện nay vẫn còn một số quan điểm<br /> khác nhau về vấn đề cây trồng biến đổi gen<br /> (GMO), nhưng với việc mở rộng nhanh diện tích<br /> chỉ sau một thời gian ngắn đã khẳng định ý nghĩa<br /> của thành tựu này đối với nhân loại.<br /> Việc chuyển các gen kháng sâu và kháng<br /> thuốc trừ cỏ vào ngô ở Mỹ chỉ thực hiện theo công<br /> nghệ sinh học cho một số dòng, sau đó chuyển vào<br /> các dòng khác bằng phương pháp lai trở lại, kể cả<br /> nhiều tính trạng như giống ngô Smart stax [8]. Các<br /> công ty hạt giống vừa và nhỏ ở Mỹ cũng chuyển<br /> các gen được mua bản quyền vào các dòng hiện có<br /> của họ bằng phương pháp lai trở lại [7]. Có thể<br /> chuyển các gen mới vào các dòng bố hoặc mẹ, con<br /> lai sẽ có tính trạng kết hợp [8]. Đề tài “Chọn tạo<br /> giống ngô kháng thuốc trừ cỏ (KTTC) bằng<br /> phương pháp lai trở lại” được thực hiện theo định<br /> hướng trên với mục tiêu: Tạo được 2 - 3 dòng ngô<br /> biến đổi gen kháng thuốc trừ cỏ bằng kỹ thuật lai<br /> trở lại; 1 - 2 giống ngô lai triển vọng mang gen<br /> kháng thuốc trừ cỏ.<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Vật liệu<br /> Các dòng thuần ngô bình thường: DF1, DF2,<br /> DF4, DF5, DF7, CML161, 2A, 2B, H14, H65,<br /> Người phản biện: TS. Mai Xuân Triệu.<br /> <br /> H171, H020 và các dòng kháng thuốc trừ cỏ<br /> glyphosate cùng loại<br /> *Thí nghiệm PCR và Southern:<br /> Sử dụng 24 nguồn vật liệu ngô bao gồm: 1<br /> nguồn cho gene (donor) và 8 dòng ngô thường, 3<br /> giống ngô lai thường của các dòng, 08 dòng<br /> backcross, 4 giống lai giữa các dòng backcross.<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> - Tạo các dòng mới bằng phương pháp lai lại<br /> và tự phối.<br /> - Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị<br /> phân tử SSR và phần mềm NTSYSpc.<br /> - Phân tích PCR tiến hành với cặp mồi đặc<br /> hiệu cho gen KTTC.<br /> - Tách chiết ADN theo phương pháp của<br /> Saghai - Maroof (1984) [10].<br /> - Phương pháp PCR theo phương pháp của<br /> Grohmann và cộng sự (2009) [4].<br /> - Phân tích sự kiện chuyển gene và vật liệu<br /> thường sử dụng 03 trình tự mồi theo phương<br /> pháp nghiên cứu của Heck và cộng sự (2005) [5].<br /> - Phân tích đoạn OPT/m - epsps sử dụng 02<br /> trình tự mồi theo phương pháp PCR của<br /> Matsuoka và cộng sự (2000) [6].<br /> - Thí nghiệm Southern blot thực hiện theo<br /> phương pháp của Breitler và cộng sự (2004).<br /> 337<br /> <br /> VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br /> <br /> Bảng 1. Danh sách và trình tự các mồi cho thí nghiệm PCR<br /> TT<br /> <br /> Tên mồi<br /> <br /> Trình tự<br /> <br /> 1<br /> <br /> Primer D<br /> <br /> 5’ - GCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG - 3’<br /> <br /> 2<br /> <br /> Primer E<br /> <br /> 5’ - CAGCATCAGCGCTCGAAAGTTTCGTCAA - 3’<br /> <br /> 3<br /> <br /> Primer F<br /> <br /> 5’ - GGCAGGGTGTTGTTGTCCATTTTATGG - 3’<br /> <br /> 4<br /> <br /> Primer OTP5<br /> <br /> 5’ - ACGGTGGAAGAGTTCAATGTATG - 3’<br /> <br /> 5<br /> <br /> PrimerEPS3<br /> <br /> 5’ - TCTCCTTGATGGGCTGCA - 3’<br /> <br /> Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR và chu trình nhiệt<br /> Thành phần<br /> DNA<br /> <br /> Nồng độ cuối<br /> <br /> Bước<br /> <br /> 50ng DNA<br /> <br /> 1<br /> <br /> Nhiệt độ - Thời gian<br /> 0<br /> <br /> 95 C - 2 phút<br /> <br /> 0,1uM Primer<br /> <br /> 2<br /> <br /> 94 C - 30 giây<br /> <br /> MgCl2<br /> <br /> 1,5mM Mg+<br /> <br /> 3<br /> <br /> 60 C - 30 giây<br /> <br /> dNTP<br /> <br /> 0,2uM dNTPs<br /> <br /> 4<br /> <br /> 72 C - 1 phút<br /> <br /> Taq buffer<br /> <br /> 1 X Taq buffer<br /> <br /> 5<br /> <br /> 72 C - 10 phút<br /> <br /> Nước<br /> <br /> -<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4 C - bảo quản<br /> <br /> Taq<br /> <br /> 1,5 U Taq<br /> <br /> 7<br /> <br /> Kết thúc<br /> <br /> - Đánh giá an toàn sinh học - khảo nghiệm<br /> hạn chế:<br /> Đối với giống ngô KTTC, những sinh vật<br /> không chủ đích được chọn để đánh giá là tập hợp<br /> các loài chân khớp trong sinh quần cây ngô và<br /> các vật gây bệnh hại cây ngô.<br /> Tiến hành điều tra 5 lần vào các thời điểm:<br /> Lần 1: Vào giai đoạn khoảng V10 - V15,<br /> Lần 2: Vào giai đoạn khoảng V18 - VT,<br /> Lần 3: Vào giai đoạn khoảng R1,<br /> Lần 4: Vào giai đoạn khoảng R2,<br /> Lần 5: Vào giai đoạn khoảng R3 - R4.<br /> Một số chỉ tiêu liên quan đến đa dạng loài<br /> được tính theo Odum (1971) [9]<br /> <br /> 338<br /> <br /> 1 chu kỳ<br /> <br /> 0<br /> <br /> Primer<br /> <br /> - Thí nghiệm khảo sát, đánh giá các THL:<br /> Đánh giá sinh trưởng, phát triển và khả năng<br /> kháng thuốc trừ cỏ trong điều kiện hạn chế,<br /> cách ly.<br /> <br /> Chu kỳ<br /> <br /> 0<br /> <br /> 36 chu kỳ<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1 chu kỳ<br /> <br /> 0<br /> <br /> Các bệnh đốm lá lớn (Helminthoporium<br /> turcicum), đốm lá nhỏ (Helminthoporium<br /> maydis), gỉ sắt (Puccinia maydis), đốm nâu<br /> (Physoderma maydis), khô vằn (Rhizoctonia<br /> solani) được đánh giá vào thời điểm 80 - 85 ngày<br /> sau gieo. Tỷ lệ bệnh, mức độ nhiễm bệnh đánh<br /> giá theo thang điểm từ 1 - 9.<br /> III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1. Kết quả chọn tạo dòng ngô kháng thuốc<br /> trừ cỏ (KTTC)<br /> Duy trì, đánh giá các đặc tính nông học,<br /> khả năng KTTC glyphosate và khả năng kết<br /> hợp của 20 dòng KTTC ở thế hệ BC4S4. Kết<br /> quả cho thấy, các dòng KTTC Glyphosate ổn<br /> định; một số đặc tính nông học cơ bản đã hoàn<br /> toàn giống với các dòng bình thường cùng<br /> loại; các dòng KTTC có biểu hiện sinh trưởng<br /> và phát triển khỏe hơn, cây chắc, lá xanh bền,<br /> bông cờ to, ít nhiễm sâu bệnh.<br /> <br /> Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br /> <br /> Bảng 3. Một số đặc điểm chính của các dòng triển vọng<br /> Bệnh khô vằn<br /> <br /> Bệnh đốm lá<br /> <br /> Dài bắp<br /> <br /> TL hạt/bắp<br /> <br /> Năng suất<br /> <br /> (điểm)<br /> <br /> (điểm)<br /> <br /> (cm)<br /> <br /> (%)<br /> <br /> (tạ/ha)<br /> <br /> Dòng<br /> CG<br /> <br /> BT<br /> <br /> CG<br /> <br /> BT<br /> <br /> CG<br /> <br /> BT<br /> <br /> CG<br /> <br /> BT<br /> <br /> CG<br /> <br /> BT<br /> <br /> DF5<br /> <br /> 113<br /> <br /> 114<br /> <br /> 145,4<br /> <br /> 140,5<br /> <br /> 14,6<br /> <br /> 14,0<br /> <br /> 76,7<br /> <br /> 75,4<br /> <br /> 28,5<br /> <br /> 26,4<br /> <br /> DF7<br /> <br /> 107<br /> <br /> 108<br /> <br /> 124,7<br /> <br /> 123,6<br /> <br /> 12,2<br /> <br /> 11,3<br /> <br /> 72,4<br /> <br /> 70,3<br /> <br /> 21,2<br /> <br /> 20,5<br /> <br /> DF4<br /> <br /> 113<br /> <br /> 115<br /> <br /> 156,5<br /> <br /> 155,3<br /> <br /> 11,5<br /> <br /> 10,4<br /> <br /> 75,5<br /> <br /> 75,0<br /> <br /> 27,7<br /> <br /> 26,2<br /> <br /> CML161<br /> <br /> 116<br /> <br /> 116<br /> <br /> 150,3<br /> <br /> 148,7<br /> <br /> 14,5<br /> <br /> 14,2<br /> <br /> 73,2<br /> <br /> 72,6<br /> <br /> 26,5<br /> <br /> 25,3<br /> <br /> 02A<br /> <br /> 112<br /> <br /> 113<br /> <br /> 137,8<br /> <br /> 133,6<br /> <br /> 12,0<br /> <br /> 11,6<br /> <br /> 71,6<br /> <br /> 71,2<br /> <br /> 24,6<br /> <br /> 23,5<br /> <br /> 02B<br /> <br /> 116<br /> <br /> 117<br /> <br /> 156,5<br /> <br /> 152,8<br /> <br /> 13,7<br /> <br /> 13,2<br /> <br /> 71,4<br /> <br /> 70,7<br /> <br /> 23,5<br /> <br /> 21,4<br /> <br /> DF2<br /> <br /> 117<br /> <br /> 118<br /> <br /> 152,8<br /> <br /> 152,0<br /> <br /> 14,7<br /> <br /> 14,0<br /> <br /> 76,8<br /> <br /> 75,3<br /> <br /> 27,6<br /> <br /> 25,7<br /> <br /> DF1<br /> <br /> 120<br /> <br /> 121<br /> <br /> 151,4<br /> <br /> 148,7<br /> <br /> 11,4<br /> <br /> 11,0<br /> <br /> 72,3<br /> <br /> 71,5<br /> <br /> 20,3<br /> <br /> 19,2<br /> <br /> 24,9<br /> <br /> 23,5<br /> <br /> TB<br /> CV (%)<br /> <br /> 12,2<br /> <br /> LSD.05<br /> <br /> 2,34<br /> <br /> Ghi chú: CG: KTTC; BT: Bình thường, KV: Khô vằn.<br /> <br /> Hình 1. Hình thái bắp của một số dòng<br /> Các dòng KTTC có hình dạng bắp gần đồng<br /> nhất so với các dòng bình thường. Tuy nhiên, do<br /> có đời tự phối ít (BC4S2 - S4) nên vẫn có xu thế<br /> bắp dài và to hơn.<br /> 3.2. Đánh giá đa dạng di truyền các vật liệu<br /> mới tạo ra bằng chỉ thị phân tử SSR<br /> Kết quả ở sơ đồ phả hệ cho thấy hệ số<br /> <br /> tương đồng di truyền của các dòng biến thiên<br /> trong khoảng từ 0.23 - 1.00. Nhìn chung,<br /> khoảng cách di truyền của các dòng tương đối<br /> lớn, cho thấy các dòng tương đối khác biệt nhau<br /> về vật chất di truyền. Hình 2 cho thấy ở hệ số<br /> tương đồng di truyền 0.24, các dòng ngô chia<br /> làm 3 nhóm chính.<br /> <br /> 339<br /> <br /> VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM<br /> <br /> H1<br /> H1.1<br /> H97<br /> Q59<br /> H9<br /> H14<br /> H264<br /> H240<br /> H250<br /> H226<br /> H228<br /> H6.1<br /> H6.2<br /> H63<br /> H095<br /> H14.1<br /> H276<br /> H67<br /> H54<br /> H1.2<br /> H2<br /> H2.1<br /> H13.2<br /> H26<br /> H59<br /> H82<br /> H230<br /> HP7<br /> H7.1<br /> H7.2<br /> H21<br /> H3.2<br /> H901<br /> H3A<br /> H84<br /> H70<br /> H093<br /> H333<br /> H64<br /> D55<br /> NS25<br /> H65<br /> H53<br /> H95.2<br /> NX18<br /> H171<br /> H29<br /> H414<br /> H17<br /> H60<br /> H46<br /> H8.1<br /> H8.2<br /> H171.<br /> H5.1<br /> H5.2<br /> H4<br /> H4.1<br /> H80<br /> H65.1<br /> H603<br /> DF9<br /> 51<br /> H20<br /> H3.1<br /> H3.3<br /> H672<br /> H19<br /> H866<br /> H18<br /> <br /> H 171. 1<br /> <br /> 0.24<br /> <br /> 0.43<br /> <br /> 0.62<br /> <br /> 0.81<br /> <br /> 1.00<br /> <br /> Coefficient<br /> Hình 2. Sơ đồ phả hệ của 70 dòng ngô phân tích dựa trên 35 chỉ thị SSR<br /> 3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen mới<br /> 3.3.1. Thí nghiệm PCR<br /> <br /> Năm 2011<br /> <br /> - Kết quả tách chiết DNA thu được các mẫu<br /> có hàm lượng DNA cao, nồng độ từ 100 ug/ml<br /> đến 300 ug/ml (hình 3).<br /> <br /> Năm 2012<br /> <br /> Hình 3. Ảnh điện di DNA genome của các mẫu ngô<br /> 340<br /> <br /> Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất<br /> <br /> - Kết quả phân tích sự kiện chuyển gene<br /> KTTC Glyphosate bằng 3 trình tự mồi D, E, F<br /> (hình 4 và 5) năm 2011 cho thấy: Ở nguồn vật<br /> liệu cho gene sản phẩm PCR được nhân bởi cặp<br /> mồi D và F có độ dài khoảng trên 600bp và 8<br /> dòng ngô thường có sản phẩm PCR được nhân<br /> <br /> bởi cặp mồi E và F khoảng trên 200bp; 8 dòng<br /> ngô KTTC (BC4F4) thể hiện sản phẩm PCR ở cả<br /> 2 đoạn trên 600bp và trên 200bp. Đối với các<br /> giống ngô thường và các giống ngô KTTC kết<br /> quả PCR cũng thể hiện tương tự như đối với các<br /> dòng (hình 5).<br /> <br /> Hình 4. Kết quả PCR 16 dòng ngô bằng 3 trình tự mồi D, E và F. (giếng 1: Thang chuẩn 100bp;<br /> giếng 2: Đối chứng âm; giếng 3: Nguồn cho gene; giếng 4 - 11: 8 dòng ngô thường;<br /> giếng 12 - 18: 8 dòng ngô BC4F4)<br /> <br /> Hình 5. Kết quả phân tích PCR 7 giống ngô bằng 3 trình tự mồi D, E và F. (giếng 1: Thang<br /> <br /> chuẩn 100bp; giếng 2: đối chứng âm; giếng 3: Nguồn cho gene; giếng 4 - 6: 3 giống ngô<br /> thường; giếng 7 - 10: 4 giống ngô lai giữa các dòng BC4F4)<br /> Năm 2012, kết quả điện di phân tích sự có<br /> mặt của gen CP4 EPSPS bằng 3 trình tự mồi D,<br /> E, F cho kết quả tương tự như năm 2011. Điều<br /> này khẳng định chắc chắn sự có mặt của gen<br /> <br /> Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm PCR<br /> của 20 dòng ngô bằng 3 trình tự mồi D, E, F.<br /> (giếng M: Thang chuẩn 100bp; giếng 1: Đối<br /> chứng âm; giếng 2: Đối chứng dương; giếng<br /> 3 - 12: 10 dòng ngô thường; giếng 13 - 22: 10<br /> dòng ngô BC4S4)<br /> <br /> KTTC Glyphosate CP4 EPSPS trong các dòng<br /> mới và các tổ hợp lai có các dòng đó tham gia<br /> (bảng 6 và 7).<br /> <br /> Hình 7. Kết quả phân tích PCR 12 giống ngô bằng<br /> 3 trình tự mồi D, E, F. (giếng M : Thang chuẩn<br /> 100bp; giếng 1: Đối chứng âm; giếng 2: Nguồn vật<br /> liệu cho gen; giếng 3 - 5: LVN4;<br /> giếng 6 - 8: LVN14; giếng 9 - 11: LVN10;<br /> giếng 12 - 14: 2AB)<br /> <br /> 341<br /> <br />