Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu đa hình di truyền gen thyroglobulin (TG5) ở một số nhóm bò vàng Việt Nam

MỞ ĐẦU

Việc bảo tồn và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên đa dạng sinh học nói

chung và nguồn gen động vật nuôi nói riêng ở nước ta hiện nay đang là vấn đề

cấp thiết. Do áp lực của kinh tế thị trường đòi hỏi các giống có năng suất cao,

do biến đổi khí hậu và đô thị hóa nên nhiều giống vật nuôi bản địa đang có nguy

cơ bị mất đi.

Từ những năm 1990 tổ chức Nông lương thực thế giới (FAO) đã xây dựng

một chương trình phát triển bền vững nguồn gen động vật nuôi trên toàn cầu,

mục tiêu của chương trình này nhằm trợ giúp việc duy trì sự đa dạng sinh học

và phát triển nông nghiệp bền vững. Đây là một chương trình tổng thể sử dụng

các kỹ thuật di truyền phân tử như các chỉ thị vi vệ tinh (microsatellite), phân

tích trình tự ADN, PCR-RFLP, SNP… để đánh giá sự đa dạng di truyền giữa

các giống và trong bản thân mỗi giống vật nuôi ở mức độ phân tử nhằm định

hướng cho việc quản lý, bảo tồn và sử dụng nguồn gen động vật nuôi trên quy

mô toàn cầu [20].

Theo thống kê của FAO thì hiện nay trên thế giới có khoảng trên 3500

giống vật nuôi, trong đó có khoảng 815 giống bò khác nhau. Tuy nhiên đây là

con số thống kê chưa đầy đủ vì nhiều giống bò bản địa khác vẫn chưa được

phát hiện, đồng thời nhiều giống cũng đang có nguy cơ bị mất đi do không

được bảo tồn [19].

Tình hình chăn nuôi bò thịt ở Việt Nam hiện nay mặc dù chính phủ đã

đẩy mạnh công tác khuyến nông nhằm “u hóa” đàn bò nhưng tỷ lệ bò vàng

gốc chưa bị lai tạp vẫn còn nhiều [11]. Các chương trình lai tạo đều tập trung

vào cải thiện tầm vóc và năng suất, còn vấn đề liên quan đến chất lượng thịt

để phục vụ thị trường thì còn bỏ ngỏ. Theo các chuyên gia trong ngành chăn

nuôi đánh giá thì hiện nay Việt Nam có khoảng 7 nhóm bò vàng địa phương,

mỗi nhóm mang những nét đặc trưng được chọn lọc theo sở thích của người

1

dân và đáp ứng với điều kiện khí hậu ở từng vùng. Các nhóm bò này thường

có kích thước nhỏ năng suất thịt, sản lượng sữa thấp nhưng chúng lại có khả

năng chịu được điều kiện khó khăn, khả năng kháng bệnh và sinh sản tốt [5].

Nhưng liệu bò vàng Việt Nam có những gen tiềm ẩn liên quan đến chất lượng

thịt như: độ mềm thịt, độ ngọt, mỡ giắt trong thịt… có thể được kiểm tra

thông qua các marker phân tử để thiết kế các chương trình lai tạo hợp lý hay

không?

Trên thế giới đã ứng dụng nhiều kỹ thuật trong lĩnh vực di truyền phân tử

để xác định sự đa hình các gen liên quan đến đến các tính trạng kinh tế như:

chất lượng thịt, tốc độ sinh trưởng…nhằm phát triển chúng như các chỉ thị

phân tử hỗ trợ chọn lọc những giống bò thịt có năng suất và chất lượng cao.

Thịt có mỡ giắt và độ dày mỡ lưng là 2 đặc điểm chất lượng quan trọng có

ảnh hưởng đến chất lượng thịt xẻ và tác động đến nền sản xuất bò thịt.

Chọn lọc nhằm làm tăng thịt có giắt mỡ nhưng lại có độ dày mỡ lưng thấp

từ lâu đã được công nhận là một mục tiêu quan trọng cho sản xuất thịt bò

chất lượng cao. Trong chăn nuôi bò thịt, truyền thống lựa chọn để tăng thịt có

mỡ giắt và giảm mỡ lưng không hề đơn giản do hai tính trạng này có quan

hệ đồng biến (thịt có mỡ giắt nhiều thì độ dày mỡ lưng cũng cao). Ngày nay

với sự phát triển mạnh của lĩnh vực di truyền phân tử, việc kiểm tra ở mức độ

phân tử ADN nhằm xác định gen quy định phẩm chất tốt đối với tính trạng

mỡ giắt trong thịt sẽ cung cấp một công cụ hữu hiệu để cải tiến di truyền tính

trạng này một cách thuận lợi hơn. Một số gen đã được liên quan đến chất

lượng thịt bò đã được xác định như: TG5, CAST-T1, Calpain 316-T2, Calpain

4751-T3. Sự thay đổi trình tự nucelotide của những gen này dẫn đến làm tăng

hay giảm độ dày mỡ lưng và tỷ lệ mỡ giắt trong thịt làm biến đổi độ mềm và

mùi vị thịt, có thể phát hiện được bằng các kỹ thuật di truyền như PCR-RFLP

hay giải trình tự gen. Do đó, việc kiểm tra di truyền đối với các chỉ thị

(marker) liên quan đến độ mềm của thịt đã trở thành sản phẩm thương mại

2

[31], [32] và đang được ứng dụng trong việc xác đinh kiểu gen mong muốn

phục vụ công tác lai tạo giống bò thịt. Tác giả De và cộng sự (2004) chỉ ra

rằng gen Thyroglobulin -TG5- có liên quan đến độ dày mỡ lưng và mỡ giắt

trong bắp thịt (marbling) ở quần thể bò lai F2 Wagyu X Limousin [18]. Giống

bò Wagyu nổi tiếng của Nhật về thịt mềm mọng, thơm, tỷ lệ thịt có mỡ giắt

rất cao nên được ưa chuộng trên thị trường. Do vậy, gen TG5 được đề cử là

một trong các chỉ thị phân tử dựa trên ADN được ứng dụng trong chọn lọc

giống bò thịt.

Cho đến nay chưa có công trình nào nghiên cứu về đa hình di truyền gen

TG5 trong các giống bò Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

tài “Nghiên cứu đa hình di truyền gen thyroglobulin (TG5) ở một số

nhóm bò vàng Việt Nam” với mục đích: Xác định sự sai khác di truyền gen

TG5 giữa các nhóm bò vàng địa phương của Việt Nam ở mức độ phân tử giúp

3

định hướng cho việc bảo tồn và phát huy giá trị các giống bản địa Việt Nam.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền có thể được biểu hiện ở một vài mức độ, từ quan sát kiểu

hình đến các chỉ thị phân tử. Phương pháp đầu tiên là phương pháp đánh giá

đa dạng giống qua đặc điểm kiểu hình [28]. Các chỉ thị kiểu hình được chia

thành các tính trạng riêng biệt (ví dụ như các tính trạng về hình thái và sinh

thái di truyền) và các tính trạng số lượng (ví dụ như trọng lượng cơ thể) được

sử dụng để đánh giá biến dị di truyền và mối quan hệ phát sinh loài giữa các

giống và quần thể.

Các chỉ thị khác như đa hình protein, hoạt tính enzym và các nhóm máu

được sử dụng để đánh giá biến dị di truyền trong các quần thể [21], [25], [26].

Tuy nhiên, các chỉ thị này cho kết quả đa hình thấp và hạn chế trong nghiên

cứu đa dạng di truyền.

Hiện nay với sự phát triển của Công nghệ sinh học đặc biệt là công

nghệ phân tích gen đã cung cấp nhiều dấu hiệu cùng với các kỹ thuật di

truyền phân tử như: PCR-RFLP, kỹ thuật microsatellile, giải trình tự

ADN...được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu với các đối tượng khác nhau.

Đặc biệt là các kỹ thuật, công nghệ phân tích di truyền đã và đang được áp

dụng nhiều trong chăn nuôi nhằm hỗ trợ chọn tạo giống vật nuôi (marker

assisted selection) cũng như các nghiên cứu về đa dạng di truyền, các dự án

bảo tồn và khai thác nguồn gen. Kỹ thuật di truyền phân tử được coi là hữu

hiệu nhất được dùng đề đánh giá mức độ sai khác di truyền giữa các giống và

trong bản thân các giống gia súc, gia cầm.

1.1. Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) hay còn gọi là phản ứng

chuỗi trùng hợp, được Karry Mullis hoàn thiện vào giữa những năm 80 và đã

đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử.

4

Kỹ thuật PCR cho phép nhân các đoạn ADN định trước. Kỹ thuật PCR

sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép ADN. ADN polymerase dùng

các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới tương hợp với

nó. Cả hai sợi ADN đều được dùng để làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu

các đoạn mồi oligonucleotide được cung cấp cho cả hai sợi. Hỗn hợp phản

ứng lại được đun nóng lên để tách sợi ban đầu khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi

này sau đó lại được dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm các bước: gắn

đoạn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn. Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết, ta sẽ có 2n bản sao các

phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi. Đó là đặc điểm quan trọng

thứ hai của kỹ thuật PCR, nó dẫn đến kết quả là một đoạn ADN định trước

được nhân lên [4].

1.2. Các phương pháp nghiên cứu đa hình di truyền dựa trên PCR

1.2.1. Phương pháp PCR-RFLP( Polymerase chain reaction-Restriction

fragment length polymorphism )

Sau khi nhân đoạn ADN nhờ một cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR

được cắt bằng một hoặc một số enzym giới hạn. Sau khi phân tích các sản

phẩm cắt bằng enzym giới hạn, điện di trên gel có thể phát hiện được sự thay

thế các base nitơ hay sự thay đổi trật tự các base nitơ tại vị trí cắt trên ADN

được nhân lên.

Phương pháp này được áp dụng khá phổ biến trên nhiều phòng thí

nghiệm trên thế giới do sự biểu hiện đa hình tương đối cao, dễ tiến hành và

chi phí thấp.

1.2.2. Phương pháp AFLP (Amplified fragment length polymorphism)

AFLP là phương pháp nghiên cứu đa hình chiều dài các đoạn được

nhân bản chọn lọc. Cơ sở của phương pháp này là dùng enzym giới hạn để cắt

nhỏ ADN genome thành các phân đoạn có kích thước khác nhau, trong đó có

những đoạn mang đầu mút giống nhau. Nếu ta sử dụng một đoạn nối

5

(adaptor) như nhau có gắn thêm một hoặc một số oligonucleotide được chọn

trước để định hướng cho việc gắn mồi thì tất cả những đoạn ADN có đầu gắn

giống nhau sẽ được nhân lên. Khi ta thay đổi số lượng và trật tự các

oligonucleotide ở các đầu nối ta có thể nhận được những đoạn ADN nhân bản

có kich thước khác nhau giúp ta có thể phân biệt được sự đa hình giữa chúng.

1.2.3. Phương pháp RAPD (Random amplified polymorphism DNA)

RAPD là phương pháp phân tích đa hình các đoạn ADN được nhân

bản ngẫu nhiên. Dựa trên cơ sở của phản ứng PCR với các cặp mồi có trình tự

ngẫu nhiên thường dài khoảng 10 base. Phương pháp này có thể áp dụng đối

với các đối tượng chưa biết trình tự về ADN genom. Phương pháp này cho

phép phát hiện đa hình cao và ngày càng được áp dụng rộng rãi trong chọn

giống và phân loại thực vật.

Nhìn chung các phương pháp phân tích đa hình di truyền nhờ chỉ thị

ADN dựa trên PCR ngày càng phát triển nhanh chóng và áp dụng rộng rãi

trong chọn giống. Tuy nhiên có một số hạn chế cho việc áp dụng các phương

pháp chọn lọc này:

- Tốc độ lập bản đồ gen cho việc áp dụng các phương pháp này còn rất chậm,

nhiều gen đã được đưa vào bản đồ còn quá xa các chỉ thị đã biết.

- Việc sử dụng các chỉ thị phân tử dựa vào PCR khá tốn kém nên hiện nay

mới chỉ có một số lượng hạn chế các chỉ thị dựa vào PCR được sử dụng trong

chọn lọc.

1.2.4. Microsatellite

Thuật ngữ Microsatellite được Litt và Luty giới thiệu vào năm 1989

nhằm chỉ các trình tự ADN lặp lại một cách có trật tự (Tandemly repeated

DNA sequence). Các đoạn này có độ dài chỉ vài cặp bazơ nitơ (2-6 bp), có

tính đa hình cao và có thể được nhân lên bằng phản ứng PCR.

6

Microsatellite được phân bố ngẫu nhiên trên toàn bộ hệ gen, tập trung

thành những cụm nhỏ (clusters) khoảng 200bp và được tìm thấy trong tất cả

cơ thể sống đặc biệt là ở những cơ thể sống có hệ gen lớn. Người ta thấy rằng

trung bình cứ 10.000 nucleotide thì gặp một trình tự microsatellite.

Những đoạn lặp lại của polyA /polyT là kiểu phổ biến nhất trong tất cả

các hệ gen nhưng tần số phân bố giữa các loài rất khác nhau. Ngoài ra còn có

một số kiểu lặp lại phổ biến khác như kiểu lặp lại 2 nucleotide như (CA)/(GT)

[10].

Microsatellite có các tính chất cần thiết cho một chỉ thị phân tử

(Molecular marker) do sự đa dạng và khả năng biến đổi lớn về chiều dài của

chúng và có thể dễ dàng phát hiện bằng phản ứng PCR từ một lượng ADN rất

nhỏ.

1.3. Giải trình tự ADN

Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp giải trình tự ADN hiện nay

đều dựa trên phương pháp được Sanger và cộng sự công bố năm 1977, được

gọi là phương pháp dideoxyribonucleotide (gọi tắt là phương pháp dideroxy).

Nguyên tắc của phương pháp dideroxy dựa trên việc bổ sung các dẫn xuất

tương ứng của các dNTP là 2’,3’-dideoxynucleotide (viết tắt là ddNTP) vào

thành phần phản ứng tổng hợp ADN trong ống nghiệm. Do ddNTP thiếu

nhóm C3’-OH, nên một khi nó được gắn vào mạch ADN đang tổng hợp, thì

quá trình tổng hợp ADN sẽ dừng lại. Trong phương pháp Sanger, sự sao chép

ADN được bắt đầu bằng việc gắn một đoạn oligonucleotide có trình tự bổ

sung với trình tự ADN cần giải rồi ủ chúng cùng enzym ADN polymerase.

Phân tử ADN tổng hợp mới sẽ có trình tự bổ sung với mạch ADN làm khuôn.

Các phản ứng tổng hợp trình tự được chia thành 4 ống nghiệm tách biệt. Mỗi

ống được bổ sung một hỗn hợp gồm 4 loại dNTP thông thường, một trong

những loại dNTP này được đánh dấu phóng xạ để phát hiện mạch mới đang

được tổng hợp. Ngoài ra từng loại trong 4 loại ddNTP (ddATP. ddGTP,

7

ddCTP, ddTTP) sẽ được bổ sung lần lượt tương ứng vào mỗi ống nghiệm nêu

trên với nồng độ bằng 1/10 so với nộng độ loại dNTP tương ứng. Với thành

phần phản ứng như vậy, trong phần lớn trường hợp, dNTP sẽ liên kết vào

mạch ADN đang tổng hợp, nhưng ddNTP (ở nồng độ thấp) cũng sẽ liên kết

vào một số mạch ADN đang được tổng hợp và làm kết thúc quá trình sao

chép. Do có nhiều phân tử ADN được tổng hợp đồng thời nên quá trình này

dẫn đến sự hình thành của một hỗn hợp nhiều phân tử ADN được sao chép

không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’ được đánh dấu và khác nhau ở đầu 3’

về chiều dài và loại nucleotide kết thúc chuỗi. Các sản phẩm này sau đó được

phân tách trên gel polyacrylamide và đọc trình tự theo thứ tự các băng xuất

hiện trên bản điện di theo chiều từ cực dương sang cực âm [3].

Giải trình tự ADN tự động

Kỹ thuật giải trình tự được Sanger mô tả có thể xác định chính xác trình

tự nucleotide của một đoạn ADN dài tới 300bp. Tuy nhiên, phương pháp này

cần nhiều thao tác kỹ thuật. Ngoài ra việc đọc kết quả điện di bằng mắt đôi

khi vẫn còn sai sót. Hiện nay, có thể giải trình tự ADN các hệ gen lớn đều dựa

vào phương pháp giải trình tự tự động.

Phương pháp giải trình tự tự động kết hợp đồng thời 4 phản ứng độc

lập vào một phản ứng chung. Trong điều kiện như vậy, việc dùng các

nucleotide được đánh dấu phóng xạ (gắn vào đầu 5’ của mạch ADN tổng hợp

mới) là không phù hợp vì các đoạn ADN mới tổng hợp chỉ khác nhau một

nucleotide nên khó phân tách bằng điện di thông thường. Để khắc phục điều

đó, người ta dùng một bộ các ddNTP được gắn chất phát quang. Các ddNTP

lúc này vẫn có thể liên kết vào mạch ADN đang kéo dài và làm ngừng phản

ứng sao chép. Cấu trúc phần phát quang của ddNTP gồm một “gốc phát

quang” liên kết với một trong 4 gốc dicholororhodamine (viết tắt là

dRhodamine, là chất nhận năng lượng quang) khác nhau qua một đoạn nối.

Bốn gốc dRhodamine khi bị “gốc phát quang” kích thích (bởi nguồn sáng

8

lazer thường từ Argon) nhận năng lượng rồi phát quang ở các bước sóng khác

nhau. Nhờ vậy, mỗi loại ddNTP khi được kích thích bởi nguồn sáng Argon

của máy giải trình tự sẽ phát đi “tín hiệu” khác nhau. Thông tin này được cảm

biến tín hiệu kết hợp với máy tính xử lý và tự động chuyển thành trình tự

ADN. Các ddNTP được gắn chất phát quang theo nguyên lý nêu trên được gọi là các yếu tố kết thúc chuỗi BigDyeTM [3].

2. Một số nghiên cứu về vai trò và cấu trúc của gen Thyroglobulin

Thyroglobulin là một hóc môn glycoprotein có trọng lượng phân tử

khoảng 660 kDa, được tổng hợp từ tế bào nang tuyến giáp và được giải phóng

vào máu dưới dạng tiền hóc môn. Mỗi phân tử thyroglobulin chứa 140 amino

acid tyrosine (amino acid này nằm trong cấu trúc phân tử của thyroglobulin)

Thyroglobulin chứa triodothyronine (T3) và thyroxin (T4). Trong cơ thể

người Thyroglobulin được giải phóng với một lượng không đáng kể. Thay

vào đó, T4 và T3 được tách khỏi phân tử thyroglobulin để đi vào máu. Hầu

hết các hóc môn tuyến giáp sản xuất là T4. Nội tiết tố này tương đối không

hoạt động, nhưng nó được chuyển thành dạng T3 hoạt động hơn trong gan và

các mô khác nhờ phản ứng deioddinated. Khoảng 99,7% T3 trong máu được

gắn vào globulin và số còn lại là hormon tự do. Hóc môn T3 có ảnh hưởng

đến sự trưởng thành của các cơ quan trong cơ thể. Ailhaud và cộng sự (1992)

cho thấy vai trò của hóc môn T3 và T4 có tác động tới sự sinh trưởng và biệt

hóa của tế bào tạo mỡ trong in vitro và in vivo đã [12]. Tương tự, T3 và T4

cũng được cho là có liên quan đến sự tích tụ mỡ giắt trong cơ ở bò Wagyu

[24]. Thịt bò có tỷ lệ mỡ giắt cao thì mềm hơn và ngọt hơn so với thịt

không có mỡ giắt. Mỡ giắt trong cơ của bò Wagyu có thành phần a xít béo

no nên rất tốt cho sức khỏe người ăn kiêng như người béo và người bị tim

mạch [35]

9

Hình 1. Lát cắt bắp thịt chứa mỡ giắt của bò Wagyu- Nhật Bản

Mỡ giắt trong thịt tạo thành các vân thịt (hình 1). Vân thịt là một yếu

tố được quan tâm khá nhiều trong đánh giá chất lượng thịt. Vân thịt có ảnh

hưởng nhiều tới các tính trạng về độ ngon miệng như mùi và vị. Vân thịt

được đánh giá theo các cấp từ không đến rất nhiều theo màu mỡ hoặc theo

màu thịt minh họa trên hình 2.

A B

Hình 2. Thịt giắt mỡ với các mức độ khác nhau phân theo màu mỡ (A) và

màu thịt (B)

10

Gen tổng hợp Thyroglobulin nằm trong trung đoạn nhiễm sắc thể 14

của bò. Gen Thyroglobulin bò dài khoảng 200.000 bp với hơn 42 exon trong

đó 34 exon đã được xác định và được cho là gen lớn nhất trong các loài sinh

vật nhân chuẩn đã được nghiên cứu [34]. De Martynoff. (1987) đã giải trình

tự vùng 5’ và exon 1 của gen TG5 và so sánh với vùng tương ứng của gen

TG5 của người cho thấy phần lớn là tương đồng. Tuy nhiên vùng promoter

của bò có một đoạn trình tự xen khoảng 220 bp khác với của người, và trình

11

tự vùng “Pu box” của người dài hơn của bò [17] (hình 3)

Hình 3. So sánh trình tự (A) và cấu trúc (B) vùng 5’ và exon 1 của gen

TG5 của người và bò [17]

Các đa hình của gen Thyroglobulin thường xuất hiện ở trình tự đầu 5’ và

có mối liên quan chặt chẽ với sự tích tụ các mô mỡ trong cơ ở những con bò

trưởng thành [13]. Cũng theo tác giả này, những cá thể mang alen đồng hợp

TT hay dị hợp TC có vân mỡ giắt cao hơn những cá thể mang alen đồng hợp

CC (đột biến biến đổi T thành C ở vùng trước exon 1 của gen). Nói cách

khác, sự hiện diện của alen T cũng làm tăng sự tăng trưởng và tích tụ vân mỡ

giắt trong cơ. Điều thú vị là không thấy tương quan giữa alen T tới độ dày mỡ

mông hay trọng lượng thịt xẻ. Kết quả nghiên cứu của Barendse cho thấy có

thể lựa chọn TG5 như một chỉ thị phân tử trong chọn lọc giống bò thịt. Tần

số alen C và T của một số giống bò trên thế giới của một số tác giả được thể

hiện ở bảng 1

Bảng 1. Tần số alen C và T của một số giống bò

Tác giả

Giống bò

Tần số alen C Tần số alen T

De (2004) [18]

Bò F2 Wagyu x Limousin

0,61

0,39

Casas (2005) [15]

Bò Brahman

0.96

0,04

Casas (2008) [16]

Bò Wagyu

0.69

0,31

Kaplanova (2009) [23] Bò lai Czech Spotted

0,77

0,23

12

3. Tình hình chăn nuôi bò thịt giai đoạn 2001-2005 và định hướng phát

triển giai đoạn 2006-2015

3.1. Kết quả chăn nuôi bò giai đoạn 2001-2005

3.1.1. Tăng trưởng đầu con

Trong vòng 5 năm, chăn nuôi của nước ta đã phát triển nhanh về số

lượng và chất lượng sản phẩm, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của xã hội về

thịt, trứng, sữa. Chăn nuôi bò đã có nhiều cơ hội tốt để phát triển và tăng

trưởng về số lượng đàn bò và cải tiến về chất lượng giống. Số lượng đàn bò

của nước giai đoạn 2001-2005 được trình bày ở bảng 2 [11].

Trung

2000

2001 2002 2003 2004 2005

Bảng 2. Số lượng đàn bò và tốc độ tăng đàn hàng năm 2001-2005

Số lượng

Đơn vị

bình

Triệu

Đàn bò

4,13

3,89

4,06 4,39

4,91

5,54 4,49

con

Tốc độ tăng đàn

%

0

- 5,74 4,37 8,12 11,84 12,83 6,29

Từ năm 2001 đến 2005, đàn bò đã tăng từ 3,89 triệu con lên 5,54 triệu

con đạt tốc độ tăng trưởng 6,29 % năm. Hiện nay, đã có 15 tỉnh tham gia dự

án phát triển giống bò thịt chất lượng cao. Hàng nghìn bò thịt giống cao sản

đã được nhập về nước trong giai đoạn vừa qua nhằm đáp ứng nhu cầu giống

phát triển chăn nuôi bò của nhân dân. Tỷ lệ đàn bò lai chiếm trên 30% tổng

đàn bò và là đàn bò nền để tiếp tục lai tạo bò thịt chất lượng cao.

3.1.2. Phân bố đàn bò theo vùng

Năm 2005 tổng đàn bò của cả nước trên 5,5 triệu con, phân bố của đàn bò cho

2 vùng sinh thái như sau: miền Bắc chiếm trên 48,67% và miền Nam chiếm

trên 51,33% tổng đàn bò. Trong đó riêng khu vực Bắc Trung bộ và Nam

Trung Bộ thuộc 2 vùng sinh thái trên là nơi có điều kiện tự nhiên phù hợp với

13

phát triển của bò nên đàn bò được tập trung cao nhất ở đây (trên 38% tổng

đàn bò của cả nước được nuôi ở 2 khu vực này). Khu vực Tây Bắc là vùng núi

cao của miền Bắc có điều kiện phù hợp với sinh thái của trâu hơn là bò. Do đó

đàn bò của vùng Tây Bắc thấp nhất, chỉ chiếm trên 4% tổng đàn (bảng 3) [11].

Bảng 3. Số lượng đàn bò năm 2005 và phân bố đàn bò theo vùng sinh thái

STT

Năm 2005

Tỷ lệ so với cả nước (%)

(đơn vị tính là 1000 con)

Vùng sinh thái

5.540,7

100

Cả nước

2.696,4

48,67

Miền Bắc

Đồng Bằng sông Hồng

1

685,8

12,38

Vùng Đông Bắc

2

675,4

12,19

Vùng Tây Bắc

3

224,2

4,05

Vùng Bắc Trung Bộ

4

1.110,8

20,05

2,844.2

51,33

Miền Nam

Vùng Nam Trung Bộ

5

1.007,3

18,18

Vùng Tây Nguyên

6

616,9

11,13

Vùng Đông Nam Bộ

7

682,1

12,31

8

Đồng Bằng Sông Cửu Long

537,8

9.71

3.1.3. Sản phẩm của chăn nuôi bò

Tổng sản lượng thịt hơi các loại của nước ta năm 2001 đạt 1.939,3 ngàn

tấn, năm 2005 đã tăng lên 2.812,1 ngàn tấn; tốc độ tăng trưởng bình quân/năm

của sản lượng thịt hơi là 9,81 %/năm. Trong đó tổng sản lượng thịt bò tăng

97,7 ngàn tấn năm 2001 lên 142,1 ngàn tấn năm 2005 với tốc độ tăng trưởng

8,83 % năm.

Các sản phẩm da và sừng, móng: Năm 2005 có khoảng 550-600 nghìn

bò được mổ thịt cung cấp hàng nghìn tấn da tươi, sừng, móng bò cho công

nghiệp thuộc da và nguyên liệu cho các nghề thủ công, mỹ nghệ [11].

14

Ngoài ra phân bón và sức kéo của bò có vai trò quan trọng dối với nông

nghiệp. Hàng năm chăn nuôi bò cung cấp cho nông dân nguồn sức kéo lớn

trong làm đất và cung cấp 15-20 triệu tấn phân bón hữu cơ cho trồng lúa, các

cây màu, rau, đậu, các loại hoa quả và các cây công nghiệp như hạt tiêu, cao

su, cà phê và cây điều [11].

3.2. Định hướng phát triển

Với mục tiêu phát triển chăn nuôi bò thịt nhằm tạo ra khối lượng lớn

sản phẩm thịt bò có giá trị và chất lượng cao, tạo việc làm, tăng thu nhập và

cải thiện đời sống cho nông dân, phát triển chăn nuôi bò thịt bền vững và bảo

vệ môi trường cụ thể là [11]:

1) Đưa số lượng bò từ 5,54 triệu con năm 2005 lên trên 7,1 triệu con

vào năm 2010 và 9,0 triệu con vào năm 2015, đồng thời đưa cơ cấu giống bò

lai, bò thịt chất lượng cao từ 30% năm 2005 lên 36% năm 2010 và 40% năm

2015.

2) Đưa sản lượng thịt bò từ 142 nghìn tấn năm 2005 lên trên 210 nghìn

tấn vào năm 2010 và đạt 310 nghìn tấn năm 2015 và bình quân thịt bò/người

từ 1,7 kg năm 2005 lên 2,35 kg năm 2010 và 2,84 kg năm 2015.

Để thực hiện tốt các mục tiêu trên, định hướng phát triển chăn nuôi bò

thịt giai đoạn 2006-2015 của nước ta là [11]:

1). Chuyển đổi cơ cấu kinh tế nông nghiệp nông thôn theo Nghị quyết

06 của Bộ Chính Trị 12/2000. Chuyển một phần đất canh tác sang trồng cây

thức ăn chăn nuôi, trồng cỏ thâm canh sản xuất thức ăn cho chăn nuôi bò.

2). Khuyến khích và ưu tiên phát triển chăn nuôi bò trang trại thâm

canh quy mô vừa và nhỏ sản xuất hàng hóa chất lượng cao.

3). Phát triển chăn nuôi bò thịt phù hợp với điều kiện tự nhiên kinh tế -

xã hội của từng địa phương, phát huy tập quán chăn nuôi, sử dụng nguồn lao

động và các nguồn lợi tự nhiên về thức ăn.

15

4). Áp dụng các tiến bộ khoa học và công nghệ sinh học vào phát triển

chăn nuôi bò thịt đặc biệt các công nghệ ứng dụng cho công tác giống và sinh

sản để tăng nhanh tiến bộ di truyền, năng suất và chất lượng sản phẩm chăn

nuôi bò thịt.

5). Tăng cường hệ thống quản lý và nhân giống bò thịt chất lượng cao.

4. Đặc điểm của các nhóm bò vàng Việt Nam

Theo một số tác giả như Lê Viết Ly (1999) [5]thì ở nước ta hiện nay có

khoảng 7 nhóm bò vàng địa phương đặc trưng cho các vùng sinh thái đó là:

nhóm bò vàng Lạng Sơn, bò H’Mông, bò vàng Thanh Hoá, bò vàng Nghệ An,

bò U đầu rìu Nghệ An, bò vàng Phú Yên và bò vàng Bà Rịa Vũng Tàu.

Sở dĩ có tên gọi bò vàng vì phần lớn (>90%) chúng có sắc lông màu vàng,

chúng được cho là có nguồn gốc từ bò Ấn Độ có u và bò vàng Trung Quốc

không u. Trong quá trình thuần hóa, giao lưu buôn bán bò được đưa vào Việt

Nam từ lâu đời. Từ đó, bò vàng đã trở thành con vật quý giá đối với người

nông dân, nó gắn liền với đời sống kinh tế văn hóa, xã hội ở từng địa phương

vì vậy đã hình thành nên các tên mang tính chất địa danh nơi nó sinh sống.

4.1. Nhóm bò vàng Hà Giang (bò H’Mông)

Từ lâu đời, người H’Mông và các dân tộc ít nguời vùng núi cao, đã thuần

hóa, chọn lọc, nuôi dưỡng tạo nên nhóm bò vàng thích ứng tốt với điều kiện

lạnh khô vùng núi cao. Do vậy thường gọi nhóm bò này là bò H’Mông (hình

4) [8]. Bò phân bố nhiều vùng núi cao phía Bắc như Sơn La, Điện Biên, Lai

Châu, Hà Giang,...Trong đó Hà Giang được xem là sứ sở của bò H’Mông [6].

Bò có ngoại hình cân đối, cao to, cấu tạo chắc chắn, linh hoạt. Phần lớn

bò màu vàng tơ, một số ít màu cánh gián xẫm (tối), da mỏng, lông mịn. Con

đực có u vai to, cao, có yếm rộng, đuôi dài. Đầu bò cái thanh, đầu bò đực thô

hơn. Đỉnh trán có u gồ (91%), một số ít có trán lõm (9%) hoặc rộng phẳng,

đôi khi hơi lõm hoặc gồ lên. Hai tai nhỏ, sừng mọc chỉ về phía trước ra hai

bên, ngắn hoặc mọc nhú lên xù xì. Đực trông hung dữ, con cái dáng thanh,

16

đầu nhẹ, sống mũi thẳng, đằng truớc hẹp, phía mông rộng hơn. Trọng lượng

sơ sinh của bê 15-16 kg, khối lượng 5 năm tuổi con cái đạt 250-270 kg, con

đực đạt 382-388 kg. Có thể nói bò H’Mông là một giống có tầm vóc lớn so

với các giống bò nội.

Bò đực H’Mông Bò cái H’Mông

Hình 4. Bò đực và bò cái H’Mông

4.2. Nhóm bò vàng Lạng Sơn

Ngoại hình của bò vàng Lạng Sơn mang các đặc điểm chung của bò vàng

Việt Nam là sắc lông màu vàng. Da mỏng, lông mịn, tầm vóc nhỏ bé (hình 5).

Bò có tầm vóc trung bình, kết cấu vững chắc, cao vây đạt 101-106 cm; dài

thân chéo 113-117 cm; vòng ngực 132-141 cm. Lúc trưởng thành, con cái có

khối lượng con cái 180- 230 kg, con đực 300-350 kg [5].

Bò đực Lạng Sơn

Bò cái Lạng Sơn

Hình 5. Bò đực và bò cái Lạng Sơn

4.3. Nhóm bò vàng Thanh Hóa

17

Bò vàng Thanh Hóa có tầm vóc trung bình. Toàn thân hình chữ nhật dài,

đầu con cái thanh, đầu con đực thô, sừng ngắn, trán phẳng hoặc hơi lõm, bò

đực mõm ngắn, bò cái mõm dài thanh hơn, mạch máu nổi rõ trên mặt, mắt to

nhanh nhẹn. Cổ bò cái thanh, cổ bò đực to, dày, lông đen. Yếm của bò kéo dài

từ hầu đến ức, da cổ, yếm có nhiều nếp nhăn nhỏ. Bò đực có u, bò cái không

có u; lưng hông thẳng, hơi rộng, bắp thịt nở nang; mông hơi xuôi, ngắn và

lép. Ngực tương đối sâu nhưng lép, bụng to tròn, không sệ; bốn chân cứng

cáp, thanh tú, hai chân trước thẳng, hai chân sau ở một số con có chạm kheo.

Bầu vú đều, phát triển kém. Màu sắc lông da vàng tươi, ở bụng, yếm và bên

trong đùi màu vàng nhạt, da mỏng, lông mịn dài (hình 6).

Khối lượng sơ sinh 13-22 kg trung bình dưới 14-15kg, con cái trưởng

thành có khối lượng 180-200 kg; con đực 250-320kg. Bò có chiều cao 100-

105cm; vòng ngực 132-133cm; dài thân chéo 112-113 cm.

Bò được phối giống lần đầu vào lúc 20-24 tháng tuổi. Ưu điểm nổi bật

của bò là chịu đựng tốt trong điều kiện dinh dưỡng thấp, chịu nóng tốt, sức

chống bệnh cao [5].

Bò đực Thanh Hóa Bò cái Thanh Hóa

Hình 6. Bò đực và bò cái Thanh Hóa

4.4. Nhóm bò vàng Nghệ An

Bò Nghệ An có tầm vóc trung bình. Con cái đa số tiền thấp hậu cao, con

đực tiền cao hậu thấp, màu lông vàng sẫm chiếm 70-80%. Bò thường có một

18

sọc đen kéo dài từ u vai đến mông. Số còn lại có màu vàng nhạt hoặc màu

đen. Da mỏng lông mịn (hình 7). Đầu bò đực thô, nặng, đầu bò cái thanh.

Trán rộng phẳng, thỉnh thoảng có con hơi lõm đỉnh trán hơi dô lên, mắt lồi,

mõm rộng; tai to đưa ngang. Sừng bò đực hình búp măng mập, chỏm sừng

màu đen, chân sừng màu tro; sừng bò cái nhỏ, dài và cong về phía trước. Cổ

bò đực dày, tròn; cổ bò cái thanh và dài. Yếm to kéo dài từ hầu đến xương mỏ

ác. Con đực có u vai cao, con cái u vai thấp [5].

Khối lượng bò Nghệ An tương tự hoặc cao hơn bò Thanh Hóa chút ít.

Cao vây của bò 104-110; dài thân chéo 115-124 cm; vòng ngực 139-156 cm.

Bò cái trưởng thành có khối lượng 190-210 kg; bò đực trưởng thành 300-350

kg. Khối lượng sơ sinh của bê: 13-16 kg

Bò đực Nghệ An Bò cái Nghệ An

Hình 7. Bò đực và bò cái Nghệ An

4.5. Nhóm bò vàng Phú Yên

Là giống bò địa phương có thể coi là đại diện cho bò duyên hải miền

Trung, thuộc bò vàng Việt Nam (hình 8) [5].

Bò được phân bố tại các tỉnh duyên hải miền Trung từ Đà Nẵng, Quảng Nam

đến Ninh Thuận, Bình Thuận. Bò thích nghi tốt trong điều kiện nóng, khô,

thức ăn nghèo nàn của địa phương.

Bò Phú Yên có màu vàng. Cơ thể phát triển cân đối, chắc chắn, bò có

dạng đầu ngắn và nhỏ, có chiều dài thân và lưng rộng, ngực rộng và sâu. Bò

có tầm vóc trung bình , khối lượng có cao hơn chút ít so với các bò địa

19

phương khác. Khối lượng sơ sinh 15-15 kg, 3 năm tuổi là 180-200 kg; 4 năm

tuổi đạt là 200-230 kg và 5 năm tuổi 220-250 kg.

Bò đực Phú Yên Bò cái Phú Yên

Hình 8. Bò đực và bò cái Phú Yên

4.6. Nhóm bò vàng Bà Rịa

Là giống bò địa phương có thể coi là đại diện cho bò miền Đông Nam Bộ,

thuộc bò vàng Việt Nam (hình 9) [5]. Bò được phân bố tại các tỉnh miền

Đông Nam Bộ như Đồng Nai, Bình Phước, Bình Dương, Tây Ninh.

Bò có màu lông vàng, số ít có màu vàng sáng hoặc cánh gián đậm (ở con

đực). Tầm vóc to hơn các bò địa phương khác, khối lượng trung bình đạt 250-

280 kg. Bò có yếm cổ ngắn, một số không có yếm.

Bò đực Bà Rịa-Vũng Tàu

Bò cái Bà Rịa-Vũng Tàu

Hình 9. Bò đực và bò cái Bà Rịa - Vũng Tàu

4.7. Nhóm bò U đầu rìu

20

Từ lâu đời, bò U đầu rìu được nhân dân địa phương chọn lọc nuôi dưỡng

theo phương thức riêng biệt phù hợp với điều kiện sinh thái của địa phương

(hình 10).Bò phân bố rải rác ở Nghệ An, Hà Tĩnh nhưng tập trung nhièu nhất

ở hai huyện Nam Đàn- Nghệ An và Kỳ Anh- Hà Tĩnh.

Bò U đầu rìu có màu sắc lông nâu nhạt đến màu vàng. Một số bò đực u

vai có màu đen. Mặt thanh, sừng ngắn to ở bò đực, nhỏ ở bò cái; tai nhỏ,

thẳng, yếm thẳng và gọn; lông thưa, ngắn và mịn, màu sắc lông biến đổi từ

nâu đậm cánh gián đến màu vàng. Đuôi dài, chỏm đuôi có màu đen. Bò đực

có u vai hình đầu rìu. Bò có kích thước trung bình so với bò vàng ở nước ta.

Khối lượng sơ sinh của bò 13-16 kg. Khối lượng trưởng thành ở bò cái: 190-

210 kg, bò đực 270-320 kg [5], [7].

Bò đực U đầu rìu Bò cái U đầu rìu

Hình 10. Bò đực và bò cái U đầu rìu

5. Đặc điểm của giống bò lai Sind

Nguồn gốc: Bò lai Sind là con lai cấp tiến giữa bò đực giống RedSindhi

và bò cái vàng Việt Nam (hình 11) [8].

Hình thái: Bò có màu nâu đỏ, đỏ vàng hoặc màu đỏ. Tai to rủ xuống, u

to, yếm rộng và nhiều nếp nhăn, âm hộ có nhiều nếp nhăn. Da chùng và rộng,

nhiều vùng da có thể rung cục bộ để xua đuổi ruồi, muỗi khi bị cắn. Lúc

trưởng thành bò đực nặng khoảng 320-440 kg, bò cái nặng 275-300 kg.

Đây là giống bò kiêm dụng để cày kéo, lấy thịt, lấy sữa. Bò lai Sind

nuôi nhanh lớn và cho nhiều thịt hơn so với bò vàng bản địa. Bò bắt đầu phối

21

giống lúc 20 tháng tuổi. Sản lượng sữa có thể đạt 1200 – 1400kg/240 – 270

ngày, tỷ lệ mỡ sữa cao hơn so với bò sữa gốc Hà lan (4,5% - 4,8%).

Bò cái lai Sind Bò đực lai Sind

Hình 11. Bò đực và bò cái lai Sind

6. Đặc điểm của bò Brahman đỏ

Nguồn gốc của giống bò Brahman đỏ xuất phát từ bò Bos indicus của

Ấn Độ và Pakistan, sau đó được nhập vào Mỹ, Australia và trở thành giống bò

thịt nổi tiếng. Giống bò Brahman đỏ tương đối giống bò Vàng Việt Nam, song

tầm vóc và khả năng sản xuất cao hơn giống bò Vàng Việt Nam. Giống bò

này có khả năng thích nghi tốt với điều kiện nhiệt đới, nóng và ẩm cũng như

khô hạn vì là giống bò nhiệt đới. Bò đực trưởng thành có màu lông sẩm hơn

so với bò cái và lông ở vùng cổ, vai, đùi, hông sẩm màu hơn các vùng khác

(hình 12).

Bò Brahman đực

Bò Brahman cái

Hình 12. Bò đực và bò cái Brahman đỏ

22

Brahman đỏ là giống bò có tầm vóc lớn, ngoại hình đẹp, thân dài, lưng

thẳng, tai to, u, yếm phát triển. Trọng lượng trưởng thành của bò đực khoảng

800-1000 kg, bò cái khoảng 450 kg [8]. Giống bò Brahman đỏ động dục lần

đầu trong phạm vi 15-18 tháng tuổi, mắn đẻ, dễ đẻ, lành tính, nuôi con giỏi.

Đây là giống kháng ve tốt, ít mắc bệnh ký sinh trùng đường máu, cũng như

23

các bệnh về mắt, móng.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ tháng 6/2009 đến tháng 6/2010 tại phòng thí

nghiệm trọng điểm Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Chăn Nuôi.

2.2. Đối tượng nghiên cứu

Chúng tôi nghiên cứu 7 nhóm bò vàng địa phương: bò vàng Lạng Sơn,

bò vàng Hà Giang, bò vàng Thanh Hóa, bò vàng Nghệ An, bò U đầu rìu, bò

vàng Phú Yên, bò vàng Bà Rịa Vũng Tàu. Đồng thời chúng tôi cũng nghiên

cứu hai giống bò đối chứng: bò lai Sind và giống bò ngoại nhập Brahman đỏ.

Chúng tôi sử dụng kìm bấm tai chuyên dụng để thu thập tế bào mô tai để tách

chiết ADN. Mỗi nhóm bò sẽ tiến hành lấy mẫu mô tai ít nhất là 50 cá thể có

tuổi từ 2 năm trở lên, không có quan hệ huyết thống và kiểu hình tương đồng. Mẫu mô được bảo quản trong cồn tuyệt đối và giữ trong tủ lạnh sâu -200C.

Số liệu thu thập mẫu của các nhóm, giống bò; địa điểm thu mẫu, và số

lượng các cá thể của từng nhóm, giống được sử dụng trong nghiên cứu thể

hiện ở bảng 4.

Bảng 4. Bảng số liệu thu thập các nhóm, giống bò nghiên cứu

Nhóm

Địa điểm thu mẫu

Số mẫu

Bò vàng Hà Giang

Đồng Văn- Hà Giang

66

Bò vàng Lạng Sơn

Bình Gia- Lạng Sơn

66

Bò vàng Thanh Hóa

Như Xuân- Thanh Hóa

66

Bò vàng Nghệ An

Yên Thành- Nghệ An

66

Bò vàng U đầu rìu

Nam Đàn- Nghệ An

66

Bò vàng Phú Yên

Sông Hinh- Phú Yên

66

Châu Đức- Vũng Tàu

Bò vàng Bà Rịa

66

Củ Chi- TP HCM

Bò Brahman đỏ

100

Ba Vì- Hà Nội

Bò lai Sind

59

Tổng

621

24

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN từ mô tai

Để tách chiết ADN từ mô tai hay máu động vật có rất nhiều phương

pháp khác nhau như: Phương pháp dùng phenol- chlorophoc, dùng kít...Tại

phòng thí nghiệm Trọng Điểm Công Nghệ Tế Bào Động Vật, chúng tôi đã sử

dụng kít tách mô của hãng Qiagen. Quy trình tách chiết như sau:

- Lấy khoảng 25 mg mô tai (bằng hạt đỗ nhỏ) rồi cắt nhỏ, cho vào ống

eppendorf 1,5ml. Thêm 180 l đệm ATL.

- Thêm 20 l Proteinase K, mix đều bằng vortex.Ủ ở 550 C trong 3 giờ hoặc

qua đêm.

- Lấy ra vortex rồi cho thêm 200 l đệm AL, ủ tiếp ở 700 C trong 10 phút.

- Thêm 200 l cồn 96%, trộn đều bằng vortex.

- Hút toàn bộ phần dịch cho sang ống 2ml chứa cột lọc. Ly tâm 8000 vòng

trong 1 phút.

- Chuyển cột lọc sang ống 2 ml khác rồi cho thêm 500 l đệm rửa AW1, ly

tâm 8000 vòng trong 1 phút.

- Tiếp tục chuyển cột lọc sang ống 2 ml khác rồi cho thêm 500 l đệm rửa

AW2, ly tâm 12000 vòng trong 3 phút.

- Lấy cột lọc cho sang ống 1,5 ml rối cho thêm 200-300 l đệm AE hòa tan

ADN. Để ở nhiệt độ phòng khoảng 5-10 phút rồi ly tâm 8000 vòng trong 1

phút để thu lấy ADN hòa tan. Loại bỏ cột lọc và bảo quản ADN lâu dài trong tủ lạnh sâu -200 C

2.3.2 Phương pháp PCR - RFLP

Phương pháp PCR

Phương pháp PCR nhân đoạn gen TG5

* Trình tự mồi để nhân đoạn gen TG5. Chúng tôi sử dụng cặp mồi theo tác

giả De (2004) [18] công bố để nhân đoạn gen TG5 trên các mẫu bò thí nghiệm

đã thu thập được. Trình tự mồi như sau:

25

Mồi xuôi 5’ GGGGATGACTACGAGTATGACTG 3’

Mồi ngược 5’GTGAAAATCTTGTGGAGGCTGTA 3’

*Thành phần PCR:

Bảng 5. Thành phần phản ứng PCR đoạn gen TG5

Thành phần PCR Đệm (10X)

Thể tích (l) 2,5

MgCl2 (25mM)

1,2

dNTP (2nM)

2,5

Mồi xuôi (10pmol/µl)

1,0

Mồi ngược (10pmol/µl)

1,0

Hot start Taq DNA Polymerase (5U/µl)

0,4

H2O

15,4

ADN

1

Tổng

25

*Chu trình nhiệt: 940 C trong 5 phút; 940 C trong 35 giây, 630 C trong 45 giây, 720 C trong 35 giây lặp lại 30 chu kỳ; 720 C trong 10 phút; 40 C trong 10 phút

hoặc qua đêm.

Phương pháp RFLP

Trong nghiên cứu đa hình gen TG5, sau khi phản ứng PCR, chúng tôi

sử dụng enzym giới hạn BstYI để cắt đoạn gen TG5 nhằm xác định đa hình

giữa các cá thể bò trong từng nhóm giống. Enzym BstYI có vị trí nhận biết là:

5’ R GATCY 3’ 3’ YCTAG R 5’

trong đó R là G hoặc A còn Y là C hoặc T.

- Thành phần phản ứng RFLP thể hiện trong bảng 6

26

Bảng 6. Thành phần và thể tích phản ứng cắt enzym đoạn gen TG5

Thể tích (l)

Thành phần

Đệm (10X)

2,5

Enzym BstYI (5U/µl)

0,2

7,3

H2O

Sản phẩm PCR

15

Tổng

25

Hỗn hợp phản ứng được ủ trong tủ ấm ở 370 C trong 7-10 giờ. Kiểm tra

kết quả phản ứng cắt enzym trên gel agarose 2,5%.

Điện di trên gel agarose

Để xác định đa hình ADN thì sản phẩm PCR từ cặp mồi TG5 được cắt

bằng các enzym giới hạn BstYI. Độ lớn của các đoạn ADN được xác định

bằng phương pháp điện di trên agarose 2,5% với điện thế là 100 vôn trong 40-

50 phút trên hệ đệm TBE 1X. Các phân đoạn ADN cắt giới hạn được nhuộm

với Ethidium bromide và quan sát, chụp hình dưới ánh sáng UV. Các băng

điện di được đối chứng với các thang ADN chuẩn. Kiểu gen của từng cá thể

được xác định dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của các phân đoạn ADN.

2.3.3. Phương pháp giải trình tự gen TG5

Chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR đoạn gen TG5 bằng kit

tinh sạch của hãng Qiagen. Sản phẩm PCR làm sạch được sử dụng là nguyên

liệu cho phản ứng sequencing (theo chu trình BigDye Terminator V 3.1 Cycle

Sequencing Kit của hãng ABI) trên hai chiều riêng biệt mồi xuôi và ngược

của cặp mồi đã dùng để PCR. Sau đó, tinh sạch sản phẩm sau phản ứng sequencing được thực hiện theo kít BigDye® XTerminator™- Purification của

hãng ABI, cuối cùng giải trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI- 3130.

2.4. Phương pháp xử lý số liệu

-Tính tần số alen: Tần số của các alen được tính dựa vào tần số các

kiểu gen theo công thức sau:

27

f(A) = f(AA) + 1/2f(AB)

Trong đó f(A) là tần số alen A, f(AA) là dạng đồng hợp, f(AB) là dạng dị hợp - Phân tích thống kê: Sử dụng phương pháp phân tích thống kê χ2 (đọc

là khi bình phương) để so sánh sự khác biệt về tần số alen giữa các nhóm,

giống.

- Phân tích số liệu giải trình tự: Các file kết quả thu được sau khi giải

trình tự trên máy ABI-3130 được đọc bởi phần mềm phân tích trình tự

Sequencing Analysis version 5.2.0. So sánh trình tự đột biến điểm trong đoạn

gen TG5 của các mẫu bò nghiên cứu với đoạn gen TG5 trên ngân hàng gen

quốc tế NCBI (mã số X05380) được thực hiện nhờ phần mềm Bioedit version

28

7.0.5.3

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả tách chiết ADN từ mẫu mô tai

Chúng tôi sử dụng kít tách ADN từ mô của hãng Qiagen, và đã tách

chiết thành công 621 mẫu ADN. Kiểm tra kết quả tách chiết ADN bằng điện

di trên gel agarose 1% thể hiện trên hình 13.

Hình 13. Ảnh điện di ADN tổng số trên gel agarose 1%.

Ảnh điện di cho thấy ADN tập trung thành băng đậm nét sáng rõ trên

bản gel agarose. Chúng tôi tiến hành đo độ tinh sạch ADN của các mẫu tách

chiết bằng máy quang phổ thu được tỷ lệ giá trị OD 260/280 dao động trong

khoảng 1,8-2,0. Qua đó cho thấy kết quả tách chiết ADN rất tốt, phù hợp cho

các phản ứng PCR tiếp theo.

3.2. Kết quả PCR đoạn gen TG5

Sau khi tiến hành phản úng PCR bằng cặp mồi theo De. S (2004) công

bố [18], chúng tôi đã nhân được đoạn gen TG5 có kích thước khoảng 548 bp.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% được minh họa ở hình 14.

548 bp

Hình 14. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen TG5

M: Thang ADN chuẩn 100 bp;1-11: Sản phẩm PCR gen TG5 của 11 cá thể bò

29

Trên tổng số 621 mẫu ADN của 9 nhóm, giống bò đều thu được một

sản phẩm duy nhất là băng vạch 548 bp chứng tỏ mồi rất đặc hiệu. Kết quả

của chúng tôi cũng tương đương với công bố của Barendse (1997) [13],

Thaller (2003) [29], Jiang (2005) [22], Kaplanova (2009) [23].

3.3. Kết quả cắt đoạn gen TG5 bằng enzym BstYI

Sau khi chạy PCR gen TG5 thành công, chúng tôi sử dụng enzym

BstYI để phân cắt đoạn gen TG5 nhằm xác định sự đa hình giữa các cá thể bò

nghiên cứu theo từng nhóm, giống. Theo kết quả của De (2004) [18] thì sau

khi cắt đoạn gen TG5 của bò bằng enzym BstYI sẽ thu được 3 kiểu đa hình

tương ứng với 3 kiểu gen thể hiện ở bảng 7:

Bảng 7. Các kiểu gen TG5 khác nhau và độ dài các đoạn cắt tương ứng

Kiểu gen

Độ dài đoạn cắt bởi enzym BstYI (bp)

CC

295, 178, 75

TT

473, 75

CT

473, 295, 178, 75

Như vậy sản phẩm PCR đoạn gen TG5 chứa một điểm cắt thông

thường và một điểm cắt đa hình của enzym giới hạn BstYI. Điều đó có nghĩa

là trên sản phẩm PCR luôn luôn tồn tại một điểm cắt của enzym giới hạn

BstYI (tạo băng 75 bp). Ngoài ra có một điểm cắt khác (ở vị trí 1696 theo

trình tự M358823 trên ngân hàng gen) thường xẩy ra sự đột biến thay thế giữa

2 nucleotide T và C và được gọi là điểm đa hình. Khi nucleotide T được thay

thế bởi nucleotide C sẽ dẫn đến sự nhận biết và bị cắt bởi enzym BstYI. Vì

vậy, khi cắt sản phẩm PCR bằng enzym BstYI sẽ thu được 2 kiểu alen ký hiệu

T và C, trong đó alen T sẽ cho các băng có kích thước khoảng 75 bp và 473

bp; alen C sẽ cho các băng có kích thước khoảng 75 bp, 178 bp và 295 bp.

Do đó, tổ hợp của 2 kiểu alen này sẽ có 3 kiểu gen khác nhau là CC, CT, TT.

Kết quả nghiên cứu trên 9 nhóm, giống bò của chúng tôi chỉ thu được 2

kiểu gen CC và CT mà không thu được kiểu TT. Kết quả cắt đoạn gen TG5

30

bằng enzym BstYI ở các mẫu bò nghiên cứu của chúng tôi, được minh họa

qua hình 15.

M CT CC CC CT CC CC CC CC CC CC CC

473 bp 295 bp 178 bp

75 bp

M CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC

295 bp 178 bp

75 bp

Hình 15. Ảnh điện di kết quả cắt đoạn gen TG5 bằng enzym BstYI

M: Thang ADN chuẩn 100 bp

3.4. Kiểu gen và tần số alen của các nhóm, giống bò

A. Kiểu gen

Kết quả điện di đoạn gen TG5 sau khi cắt bằng enzym BstYI của toàn

bộ 621 mẫu bò thuộc 9 nhóm, giống, các kiểu gen thu được thể hiện ở bảng 8.

31

Bảng 8. Số cá thể theo các kiểu gen của các nhóm, giống bò nghiên cứu

Nhóm/Giống Kiểu gen CC Kiểu gen CT Kiểu gen TT

Tổng số

Bò Hà Giang

64

2

0

66

Bò Lạng Sơn

66

0

0

66

Bò Thanh Hóa

65

1

0

66

Bò Nghệ An

66

0

0

66

Bò U đầu rìu

65

1

0

66

Bò Phú Yên

66

0

0

66

Bò Bà Rịa

65

1

0

66

Bò Brahman

94

6

0

100

Bò lai Sind

58

1

0

59

0

621

Tổng

609

12

Trong 621 mẫu cá thể nghiên cứu, chỉ có 12 cá thể mang kiểu gen dị

hợp TC còn lại 609 mẫu là CC, không có cá thể nào có kiểu gen đồng hợp TT.

Trong đó giống bò Brahman là giống có số cá thể mang gen dị hợp TC cao

nhất (6 cá thể), tiếp đến là bò Hà Giang 2 cá thể, 4 nhóm bò vàng Thanh Hóa,

U đầu rìu, Bà Rịa và lai Sind mỗi nhóm chỉ có 1 cá thể , 3 nhóm còn lại đều

không phát hiện cá thể dị hợp TC ( 100% là CC).

B. Tần số a len

Sau khi thu được kiểu gen TG5 của từng cá thể trong 9 nhóm, giống bò

nghiên cứu, chúng tôi tính được tần số alen của các nhóm, giống bò. Kết quả

được thể hiện chi tiết ở bảng 9.

32

Bảng 9. Tần số alen của 9 nhóm, giống bò nghiên cứu

Nhóm/Giống

Tần số alen C

Tần số alen T

Bò Hà Giang

0,985

0,015

Bò Lạng Sơn

1,000

0,000

Bò Thanh Hóa

0,992

0,008

Bò Nghệ An

1,000

0,000

Bò U đầu rìu

0,992

0,008

Bò Phú Yên

1,000

0,000

Bò Bà Rịa

0,992

0,008

Bò Brahman

0,970

0,030

Bò lai Sind

0,992

0,008

Tổng đàn

0,990

0,010

Trong 9 nhóm giống bò nghiên cứu thì giống bò Brahman có tần số

alen T cao nhất là 0,03 tiếp đến là bò Hà Giang là 0,015; 4 nhóm bò Thanh

Hóa, U đầu rìu, Bà Rịa và lai Sind có tần số alen thấp bằng nhau (0,008); 3

nhóm bò còn lại là Lạng Sơn, Nghệ An và Phú Yên có tần số alen T bằng 0

(100% alen C không có alen T). Sự khác nhau về tần số alen T trong 7 nhóm

bò vàng bản địa không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) nhưng khi gộp 7 nhóm

bò vàng này để so sánh với bò lai Sind và bò Brahman thì khác nhau có ý

nghĩa (sẽ được trình bày kỹ hơn ở mục 3.5). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi

trên giống bò Brahman nhập về Việt Nam tương đương với kết quả của Casas

(2005) [15] nghiên cứu trên bò Brahman thương phẩm của Mỹ ( alen T chiếm

0,035). Tuy nhiên công trình của Kaplanova (2009) [23] nghiên cứu trên bò

sữa của Cộng Hòa Séc (Czech Spotted Cattle Holstein Red Holstein

Ayshire) cho thấy tần số alen T tương đối cao (0,23). Rincker (2006) [27]

nghiên cứu trên 175 cá thể bò Simmental cho thấy có 26,8% kiểu gen CC,

54,3% kiểu gen CT và 18,9% kiểu gen TT ( tần số a len T là 0,46). Tác giả

Van Eenennaam (2007) [30] nghiên cứu đa hình SNP gen TG5 chỉ ra rằng tần

33

số alen T cao nhất ở bò Wagyu trung bình ở một số giống bò Bos taurus khác

và thấp nhất ở bò Bos indicus.

So sánh với kết quả nghiên cứu trên các giống bò khác nhau của một số

tác giả trên thế giới thì sự phân bố về tần số các kiểu gen TG5 ở bò vàng Việt

Nam có sự khác biệt đáng kể. Thể hiện là có 98% kiểu gen CC và chỉ có 2%

CT không có kiểu gen TT. Như đã nêu, mối liên quan giữa alen T với tính

trạng mỡ ở thịt bò đã được nhiều tác giả nghiên cứu và cho thấy rằng các cá

thể mang kiểu gen TT có độ mỡ giắt cao nhất sau đó đến kiểu gen CT và thấp

nhất là kiểu gen CC. Như vậy có thể do mối liên quan giữa kiểu gen với điều

kiện môi trường nên ở những quần thể bò Vàng Việt Nam do thích nghi với

khí hậu nhiệt đới nóng ẩm và chịu kham khổ, lại được thuần hóa để cày kéo

nên alen T được coi là không có lợi. Tần số alen T xuất hiện rất nhỏ như là

kết quả của sự chọn lọc tự nhiên giúp cho chúng thích nghi với điều kiện môi

trường.

3.5 So sánh tần số kiểu gen và tần số alen của 3 nhóm, giống bò: Bò vàng

bản địa, bò lai Sind và bò Brahman đỏ

Sau khi phân tích đa hình trong 9 nhóm, giống bò chúng tôi nhận thấy

tần số alen T không có sự khác nhau có ý nghĩa trong 7 nhóm bò vàng bản

địa. Vì vậy chúng tôi gộp 7 nhóm bò này thành nhóm chung gọi là bò vàng để

so sánh với giống bò lai Sind và bò Brahman. Số liệu thể hiện trong bảng 10

Bảng 10. Tần số kiểu gen và tần số alen của 3 nhóm, giống bò

Giống

Kiểu CC Kiểu CT Kiểu TT Tần số alen C Tần số alen T

Bò Brahman

94

6

0

0.970

0.030

Bò lai Sind

58

1

0

0.992

0.008

Bò vàng

457

5

0

0.995

0.005

Sử dụng phương pháp phân tích thống kê khi bình phương để so sánh

sự khác nhau về tần số alen T theo cách gộp thành 3 nhóm, giống như trên

(tương đương với so sánh alen C) chúng thấy có sự khác nhau có ý nghĩa độ

34

tin cậy 99% (p < 0.01). Tần số alen T cao nhất ở giống bò Brahman trung

bình ở bò lai Sind và thấp nhất là bò vàng bản địa. Như vậy mức độ chọn lọc

khác nhau có ảnh hưởng nhất định đến sự xuất hiện của alen T. Giống bò

Brahman là giống bò nổi tiếng được nhập khẩu từ Mỹ đã được chọn lọc cao

theo hướng năng suất thịt và tỷ lệ thịt xẻ. Bò lai Sind cũng được chọn lọc

nhưng ở mức trung bình và thường không được chọn theo dòng nhất định mà

chỉ dựa trên chọn lọc chủ quan của người chăn nuôi, còn bò vàng hay còn gọi

là bò cóc, bò cỏ được chăn nuôi theo hướng quảng canh chưa có sự chọn lọc

theo dòng.

3.6. Kết quả giải trình tự gen TG5

Để xem xét trong trình tự đoạn gen TG5 giữa các nhóm, giống bò có sự

khác nhau nào đó ngoài điểm đa hình mà đã phát hiện bằng PCR-RFLP hay

không. Chúng tôi lựa chọn 8 mẫu ngẫu nhiên trong một số nhóm giống : Hà

Giang, Bà Rịa, Brahman, Nghệ An, Thanh Hóa, U đầu rìu để giải trình tự

đoạn gen TG5. Trong đó 4 mẫu đại diện cho kiểu gen CT là: Hà Giang 76, Bà

Rịa 28, Brahman 04, Brahman 98; còn 4 mẫu đại diện cho kiểu gen CC là

Nghệ An 63, Hà Giang 45, Thanh Hóa 28, U đầu rìu 75.

Sử dụng phương pháp giải trình tự tự động trực tiếp trên máy ABI

3130, chúng tôi thu được trình tự các nucleotide của 8 mẫu thí nghiệm và so

sánh với đoạn trình tự X05380 [33] trên ngân hàng gen quốc tế. Kết quả được

35

thể hiện trên hình 16

36

37

Vị trí đột biến C-T

Hình 16. Trình tự 548 nucleotide đoạn gen TG5 theo chiều xuôi Kết quả tổng hợp từ giải trình tự theo 2 chiều xuôi và ngược, chúng tôi

đã thành công trong giải trình tự đọan gen TG5 có kích thước 548 bp. Trong

trình tự của 8 mẫu thí nghiệm chúng tôi thấy một điểm đa hình duy nhất tại vị

trí 373 tính theo chiều xuôi. Đột biến C thành T xuất hiện ở 4 mẫu bò: Hà

Giang 76, Bà Rịa 28, Brahman 98 và Brahman 04. Đột biến này có thể phát

hiện bằng enzym cắt giới hạn BstYI. Như vậy kết quả giải trình tự 8 mẫu hoàn

toàn chính xác so với kết quả cắt bằng enzym BstYI đó là: 4 mẫu dị hợp TC

và 4 mẫu đồng hợp CC. Hình ảnh minh họa vị trí đột biến của kiểu gen dị hợp

CT và vị trí tương đương không đột biến của kiểu gen đồng hợp CC được thể

hiện ở hình 17 và 18.

Vị trí đột biến

Hình 17. Trình tự chiều xuôi đoạn gen TG5 của kiểu gen di hợp TC (đột biến C→T)

38

Hình 18. Trình tự chiều xuôi đoạn gen TG5 của kiểu gen đồng hợp CC

So sánh kết quả giải trình tự của chúng tôi với trình tự X05380 ( trình tự vùng 5’ và exon 1của gen TG5) được công bố trên ngân hàng gen quốc tế

NCBI của tác giả De Martynoff (1987) (hình 19) [17].

Hình 19. Trình tự và cấu trúc vùng 5’ và exon1 của gen TG5 theo

De Martynoff (1987)

39

Chúng tôi thấy đoạn trình tự mà chúng tôi nhân lên nằm hoàn toàn

trong vùng 5’ trước exon 1 của gen (từ -849 đến – 301) và không có sự khác

biệt nào ngoài vị trí đột biến C thành T xuất hiện trên 4 mẫu kiểu gen dị hợp

TC.

Như vậy chứng tỏ trình tự đoạn gen TG5 này rất bảo thủ vì nó nằm

trong vùng điều khiển của gen. Cho nên hoàn toàn có thể dùng phương pháp

PCR- RFLP với enzym cắt là BstYI để phân tích đa hình gen TG5 trên các

giống bò.

Trên cơ sở trình tự các nucleotide của đoạn gen TG5 thu được, chúng

tôi có thể minh họa vị trí cắt đoạn gen TG5 bằng enzym BstYI của các alen C

và T như sau:

75 bp 473 bp

Alen T

75bp 295bp 178bp

Alen C

Hình 20. Vị trí cắt của enzym BstYI trên đoạn gen TG5 theo chiều 5’-3’

Hai vị trí cắt của enzym BstYI trên đoạn gen TG5 có trình tự nhận biết

là: GGATCT -điểm cắt không đa hình ở vị trí 75; AGATCC- điểm đa hình ở

vị trí 373.

40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận

Trên cơ sở nghiên cứu sử dụng kỹ thuật RFLP – PCR để phân tích đa

hình gen TG5 trên một số nhóm giống bò Việt Nam chúng tôi rút ra một số

kết luận như sau:

1. Trong số 621 mẫu bò của 9 nhóm, giống được tiến hành phân tích đa hình

gen TG5 đã xác định được 2 kiểu gen CC và CT với tần số tương ứng là

98,1% và 1,9% chưa phát hiện được cá thể nào mang kiểu gen TT. Qua đó

cho thấy tần số alen T – alen được cho là có liên quan đến tính trạng mỡ giắt - trong quần thể bò vàng Việt Nam là rất thấp (xấp xỉ 1%). 2. Sự khác nhau về đa hình gen TG5 trong 7 nhóm bò vàng Việt Nam không

có ý nghĩa thống kê (p > 0.05) nhưng so sánh giữa 7 nhóm bò vàng với bò lai

Sind và bò Brahman thì khác nhau có ý nghĩa với độ tin cậy 99% (p < 0.01)

3. Trong trình tự đoạn gen TG5, mới chỉ phát hiện một điểm đa hình do sự

biến đổi C thành T ở vị trí 373 trong các mẫu có kiểu gen dị hợp CT. Kết quả

này hoàn toàn tương đồng với kết quả cắt đoạn gen TG5 bằng enzym BstYI

trong phương pháp PCR-RFLP để phân tích đa hình.

Kiến nghị

Để có được sự đánh giá đầy đủ hơn về tính đa hình di truyền của gen

TG5 chúng tôi có một số kiến nghị sau

1. Tiến hành ghép đôi giữa các đực giống có kiểu gen TC với các bò cái cũng

có kiểu gen TC nhằm theo dõi sự đa hình di truyền qua các đời con.

2. Cần tiến hành mổ khảo sát để xác định mối tương quan đa hình gen TG5

với đặc điểm mỡ giắt ở bò vàng Việt Nam.

41

Tài liệu tham khảo

Tài liệu tiếng Việt

1. Nguyễn Kim Đường (2008), “Một số vấn đề hiện trạng chăn nuôi bò ở

Nghệ An”, Tạp chí Khoa học, Công nghệ Chăn nuôi, Số 13, tr. 12-19.

2. Võ Thị Thương Lan (2005), Sinh học phân tử, NXB ĐHQG, Hà Nội.

3. Đinh Đoàn Long (2009), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, Nhà xuất

bản đại học Quốcgia Hà Nội.

4. Lê Đình Lương (1998), Nguyên lý kỹ thuật di truyền, Nhà xuất bản giáo

dục, Hà Nội.

5. Lê Viết Ly, Hoàng Kim Giao, Mai Văn Sánh, Võ Văn Sự và Lê Minh Sắt,

(1999), Bảo tồn nguồn gen vật nuôi ở Việt Nam, Tập I, Phần gia súc,

NXB Nông nghiệp.

6. Nguyễn Văn Niêm, Đỗ Hữu Hoan, Lưu Công Khánh và Đỗ Xuân Cốn

(2000),“Đặc điểm sinh học, khả năng sản xuất và phát triển chăn nuôi bò

vàng Hà Giang tại các tỉnh miền núi phía Bắc”, Báo cáo khoa học chăn

nuôi thú y 1999-2000.

7. Nguyễn Văn Niêm và Lê Viết Ly (2006), “Nghiên cứu một số đặc điểm

sinh học của bò U đầu rìu”, Báo cáo khoa học, tr. 311-324.

8. Võ Văn Sự, Nguyễn Văn Thiện, Đặng Tất Nhiễm, Lê Viết Ly, Nguyễn

Viết Hải, Hoàng Văn Tiệu (2004), Át lát các giống vật nuôi Việt Nam,

NXB Nông nghiệp, Hà Nội.

9. Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen Nguyên lý và ứng dụng, NXB Khoa

học Kỹ thuật, Hà Nội.

10. Nhữ Văn Thụ (2001), “Microsatellites”, Thông tin KHKT Chăn nuôi, Số

1, tr.46- 51.

11. http://www.cucchannuoi.gov.vn/?index=s&id=409

42

Tài liệu tiếng Anh

12. Ailhaud G., Grimaldi P and Negrel R (1992), “Cellular and molecular

aspects of adipose tissue development”, Annu Rev Nutr 12, pp. 207-233.

13. Barendse W (1997), Assessing lipid metabolism. Patent Aplication

WO9923248 PCT/AU98/00882.

14. Barendse W., Bunch R., Thomas M., Armitage S., Baud S and Donaldson

N (2001), “The TG5 DNA marker test for marbling capacity in Australian feedlot cattle”, Proceedings of the Beef Quality CRC Marbling Symposium, October 9-10, Coffs Harbour, pp: 30-35. 15. Casas E., White S.N., Riley D.G., Smith T.P.L., Brenneman R.A., Olson

T.A, Johnson D.D., Coleman S.W., Bennett G.L and Chase C.C (2005),

“Assessing of single nucleotide polymorphisms in genes residing on

chromosomes 14 and 29 for association with carcass composition traits

in Bos indicus cattle”, J. Anim. Sci. 83, pp.13-19.

16. Casas E., White S.N., Shackelford., Wheeler T.L., Koohmaraie M.,

Bennett G.L and Smith T.P.L (2007), “Assessing the association of

single nucleotide polymorphisms at the thyroglobulin gene with carcass

traits in beef cattle”, J. Anim. Sci. 85, pp. 2807-2814.

17. De Martynoff . G, Pohl. V. Merken. L et al (1987), “Structural

organization of the bovine thyroglobulin gene and of its 5’-flanking

region”, European Journal of Biochemistry, 164(3), pp. 591-599.

18. De, S., Macneil, M.D., Wu, X.L., Michal, L.L., Xiao, Q., Garcia, M.D.,

Griffin, K.B., Gaskins, C.T., Reeves, J.J., Busboom, J.R. (2004),

“Detection of quantitative trait loci for marbling and backfat in wagyu x

limousin f2 crosses using a candidate gene approach”, Western Section of

Animal Science Proceedings 55, pp. 95-98.

19. FAO (1995), Global project for the maintenance of domestic animal

genetic diversity (MoDAD). Draft project formulation report, Food and

Agriculture Organization of United Nations Rome

43

20. FAO (2002), Secondary Guidelines for Development of National Farm

Animal Genetic Recourse Management Plans, Measurement of Domestic

Animal Diversity (MoDAD): Recommended Microsatellite Markers,

Food and Agriculture Organization of the United Nation.

21. Gintovt, V. E., Podstreshny, A. P., Mashurov, A. P. and Berendyaeva, Z.

I. (1983), “Study of gene pool od the domestic fowl by the methods of

immunogenetic analysis”, Genetika, 17, pp. 873-882.

22. Jiang, Z. et al (2005), “Significant associations of the mitochondrial

transcription factor A promoter polymorphisms with marbling and

subcutaneous fat depth in Wagyu x Limousine F2 crosses”,

Biochemical and Physiological Research Communications, 334, pp .516-

523.

23. Kaplanová K., Dvořák J., Urban T. (2009), “Association of single

nucleotide polymorphisms in TG, LEP and TFAM genes with carcass

traits in cross-breed cattle”, Proceedings of International Ph. D. Students

Conference November 25, 2009 Brno, Czech Republic, pp. 139.

24. Mears, G.J., P.S. Mir, D.R.C. Bailey, and S.D.M. Jones (2001), “Effect of

Wagyu genetics on marbling, backfat, and circulating hormones in

cattle”, Can. J. Anim.Sci, 81, pp. 6573.

25. Mina, N. S., Sheldon, B. L., Yoo, B. H. and Frankham, R. (1990),

“Heterozygosity at protein loci in inbred and outbred lines of chickens”,

Poultry Science, 70, pp. 1864-1872.

26. Nikiforov, A. A., Moiseyeva, I. G. and Zakharpv, I. A. (1998), “Position

of Russian chicken breed in the diversity of Erasian breeds”, Genetics,

34, pp. 850-851.

27. Rincker C.B., Pyat N.A., Berger L.L., and Faulkner D.B (2006),

“Relationship among GeneSTAR marbling marker, intramuscular fat

44

deposition and expected progeny differences in early weaned Simmental

steer”, J. Anim. Sci, 85, pp. 686-693.

28. Romanov, M. N. (1999), “Goose production efficiency as influenced by

genotype, nutrition and production systems”, World’s Poultry Science

Journal, 55, pp. 281-294.

29. Thaller, G. et al (2003), “DGAT1, a new positional and functional

candidate gene for intramuscular fat deposition in cattle”. Animal

Genetics, 34, pp. 354-357.

30. Van Eenennaam A.L., Li J., Thallaman R.M., Quaas R.L., Dikeman M.E.,

Gill C.A., Franke D.E and Thomas M.G (2007), “Validation of

commercial DNA test for quantitative beef quality traits”, J. Anim. Sci,

85, pp. 891-900.

31. http://www.bovingen.com

32. http://www.igenity.com

33. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X05380.1

34. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3032624

45

35. http://www.publish.csiro.au/issue/795.htm