Ạ Ọ
Ộ Ố Đ I H C QU C GIA HÀ N I
ƯỜ
Ọ Ự
Ạ Ọ
TR
NG Đ I H C KHOA H C T NHIÊN
Ễ
Ệ
NGUY N XUÂN VI T
Ề
Ứ
Ấ
Ể
Ọ
SINH H C VÀ THU NH N
Ệ NGHIÊN C U ĐI U KI N NUÔI C Y, CHUY N HÓA Ậ (cid:0) DECALACTONE T Ừ
Ằ
Ấ
Ầ
Ầ
Ầ
D U TH U D U B NG N M MEN
Yarrowia lipolytica
Ọ
Ậ
Ạ LU N VĂN TH C SĨ KHOA H C
ộ
Hà N i 2014
Ạ Ọ
Ộ Ố Đ I H C QU C GIA HÀ N I
ƯỜ
Ọ Ự
Ạ Ọ
TR
NG Đ I H C KHOA H C T NHIÊN
Ễ
Ệ
NGUY N XUÂN VI T
Ề
Ứ
Ấ
Ể
Ọ
SINH H C VÀ THU NH N
Ệ NGHIÊN C U ĐI U KI N NUÔI C Y, CHUY N HÓA Ậ (cid:0) DECALACTONE T Ừ Ấ
Ằ
Ầ
Ầ
Ầ
D U TH U D U B NG N M MEN
Yarrowia lipolytica
ậ ọ Chuyên ngành: Vi sinh v t h c
ố
Mã s : 60 42 01 07
Ọ
Ậ
Ạ LU N VĂN TH C SĨ KHOA H C
Ọ
Ẫ
NG
ƯỜ ƯỚ I H
NG D N KHOA H C:
Ễ
Ị
PGS.TS. NGUY N TH HOÀI TRÂM
Ự
PGS.TS. NGÔ T THÀNH
ộ
Hà N i 2014
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
Ờ Ả Ơ L I C M N
ả ơ ễ ị Tôi xin chân thành c m n PGS. TS. Nguy n Th Hoài Trâm và PGS.TS
ự ữ ườ ự ế ướ ẫ ề ậ Ngô T Thành nh ng ng i đã tr c ti p h ọ ng d n v khoa h c và t n tình giúp
ứ ề ố ỡ đ tôi trong su t quá trình tôi nghiên c u, hoàn thành đ tài.
ả ơ ộ ộ ệ ị Tôi xin chân thành c m n các anh ch cán b B môn Công ngh Enzim
ự ệ ẩ ộ ươ ệ ệ và Protein, Vi n Công nghi p Th c ph mB Công th ng đã nhi ỡ t tình giúp đ ,
ự ậ ẻ ớ ỉ ả ờ ch b o và chia s v i tôi trong th i gian th c t p.
ị ượ ỏ Nhân d p này, tôi cũng xin đ c bày t lòng bi t n t i ế ơ ớ Ban Giám hi uệ
ườ ọ ự ạ ọ ủ ệ Tr ọ ng Đ i h c Khoa h c T nhiên ĐHQGHN, Ban Ch nhi m khoa Sinh h c,
ậ ọ ỉ ẫ ầ ộ ộ và các th y giáo, cô giáo B môn Vi sinh v t h c đã đ ng viên, ch d n, đóng góp
ậ ợ ể ữ ế ề ệ ậ ạ ý ki n và t o nh ng đi u ki n thu n l i đ tôi hoàn thành lu n văn.
ả ơ ố ườ ạ ộ Cu i cùng, tôi xin c m n gia đình, ng i thân và b n bè đã đ ng viên,
ự ệ ề ỡ ố giúp đ tôi trong su t quá trình tôi th c hi n đ tài.
ộ Hà N i tháng 62014.
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013
ọ ễ ệ H c viên: Nguy n Xuân Vi t
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
Ụ Ụ M C L C
1.4. Ứng dụng của nấm men chuyển hóa chất béo....................................................................16
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ và môi trường nghiên cứu.................................23 2.1.2. Hóa ch tấ ..............................................................................................23
2.1.3. Thi t bế ị..................................................................................................24
ẻ ồ 2.2.2. Lên men theo m trên n i 5L ..............................................................27
ế ầ ơ ấ ồ ẻ 2.2.3. Lên men theo m có ti p d n c ch t, trên n i 5L .......................28
ẻ ồ 2.2.4. Lên men theo m trên n i 50L ...........................................................28
ế ầ ơ ấ ồ ẻ 2.2.5. Lên men theo m có ti p d n c ch t, trên n i 50L .....................28
ấ ị ư ượ 2.2.8. Ch ng c t d ch lên men đã đ c lactone hóa ..................................29
ế ạ ị 2.2.11 Làm s ch d ch chi t cô đ c ặ ...............................................................30
ặ ằ ử ạ ị ế 2.2.11.1 Làm s ch d ch chi t cô đ c b ng cách r a ki m ề .........................30
CH
ặ ằ ế ạ ị 2.2.11.2 Làm s ch d ch chi t cô đ c b ng Na2SO4 khan ........................30
Ả NG 3: K T QU VÀ BÀN LU N ứ ắ
ươ ở
ƯƠ Ế 3.2.3. So sánh tóm t t các ph
Ậ ......................................................................34 ............47
quy mô 5L và 50L ng th c lên men
γ ạ ự ọ ề ệ ậ ừ ị 3.3.2. L a ch n đi u ki n thu nh n và làm s ch decalactone t d ch lên
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013
men...................................................................................................................... 53
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
Ẽ Ụ DANH M C HÌNH V
1.4. Ứng dụng của nấm men chuyển hóa chất béo....................................................................16
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ và môi trường nghiên cứu.................................23 2.1.2. Hóa ch tấ ..............................................................................................23
2.1.3. Thi t bế ị..................................................................................................24
ẻ ồ 2.2.2. Lên men theo m trên n i 5L ..............................................................27
ế ầ ơ ấ ồ ẻ 2.2.3. Lên men theo m có ti p d n c ch t, trên n i 5L .......................28
ẻ ồ 2.2.4. Lên men theo m trên n i 50L ...........................................................28
ế ầ ơ ấ ồ ẻ 2.2.5. Lên men theo m có ti p d n c ch t, trên n i 50L .....................28
2.2.7.1. Lactone hóa có gia nhi tệ .............................................................29
2.2.7.2. Lactone hóa không gia nhi tệ ....................................................29
ấ ị ư ượ 2.2.8. Ch ng c t d ch lên men đã đ c lactone hóa ..................................29
ế ạ ị 2.2.11 Làm s ch d ch chi t cô đ c ặ ...............................................................30
ặ ằ ử ạ ị ế 2.2.11.1 Làm s ch d ch chi t cô đ c b ng cách r a ki m ề .........................30
ặ ằ ế ạ ị 2.2.11.2 Làm s ch d ch chi t cô đ c b ng Na2SO4 khan ........................30
Ế
CH
ứ ố
ƯƠ 3.2.1.3. Lên men theo ph
Ậ ......................................................................34 Ả NG 3: K T QU VÀ BÀN LU N ế ươ ng th c Batch culture “có kh ng ch
pH và DO”......................................................................................................41
ắ ươ ứ ở 3.2.3. So sánh tóm t t các ph ng th c lên men quy mô 5L và 50L ............47
ọ ỷ ệ ự ế 3.3.1.4. L a ch n t l dung môi chi t rút ..................................52
.......................................................................................................52
ọ ố ầ ự ế 3.3.1.5 L a ch n s l n chi t rút .............................................................52
γ ạ ự ọ ề ệ ậ ừ ị 3.3.2. L a ch n đi u ki n thu nh n và làm s ch decalactone t d ch lên
(A).........................................................................................................................................................57
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013
men...................................................................................................................... 53
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
..............................................................................................................................................................58
(B).........................................................................................................................................................58
..............................................................................................................................................................58
(C).........................................................................................................................................................58
(D)........................................................................................................................................................59
Hình 3.5. Sắc ký đồ γ-decalactone thu nhận từ dịch lên men bằng chủng Y. lipolytica VTP 5 (A),
sau khi làm sạch bằng phương pháp “Chiết rút-làm sạch” (B), bằng phương pháp “Chưng cất-chiết
rút-làm sạch” (C), γ-decalactone cô đặc (D).......................................................................................59
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
Ả Ụ DANH M C B NG
1.4. Ứng dụng của nấm men chuyển hóa chất béo....................................................................16
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ và môi trường nghiên cứu.................................23 2.1.2. Hóa ch tấ ..............................................................................................23
Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng.........................................................................................................23
2.1.3. Thi t bế ị..................................................................................................24
ẻ ồ 2.2.2. Lên men theo m trên n i 5L ..............................................................27
ế ầ ơ ấ ồ ẻ 2.2.3. Lên men theo m có ti p d n c ch t, trên n i 5L .......................28
ẻ ồ 2.2.4. Lên men theo m trên n i 50L ...........................................................28
ế ầ ơ ấ ồ ẻ 2.2.5. Lên men theo m có ti p d n c ch t, trên n i 50L .....................28
2.2.7.1. Lactone hóa có gia nhi tệ .............................................................29
2.2.7.2. Lactone hóa không gia nhi tệ ....................................................29
ấ ị ư ượ 2.2.8. Ch ng c t d ch lên men đã đ c lactone hóa ..................................29
ế ạ ị 2.2.11 Làm s ch d ch chi t cô đ c ặ ...............................................................30
ặ ằ ử ạ ị ế 2.2.11.1 Làm s ch d ch chi t cô đ c b ng cách r a ki m ề .........................30
ặ ằ ế ạ ị 2.2.11.2 Làm s ch d ch chi t cô đ c b ng Na2SO4 khan ........................30
Ế
CH
ứ ố
ƯƠ 3.2.1.3. Lên men theo ph
Ậ ......................................................................34 Ả NG 3: K T QU VÀ BÀN LU N ế ươ ng th c Batch culture “có kh ng ch
pH và DO”......................................................................................................41
Bảng 3.11. Lựa chọn điều kiện lactone hóa để thu nhận γ-decalactone từ dịch .............................50
ắ ươ ứ ở 3.2.3. So sánh tóm t t các ph ng th c lên men quy mô 5L và 50L ............47
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi sử dụng đến hiệu suất chiết rút γ-decalactone từ dịch
lên men.................................................................................................................................................52
ọ ỷ ệ ự ế 3.3.1.4. L a ch n t l dung môi chi t rút ..................................52
.......................................................................................................52
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của số lần chiết rút đến hiệu suất chiết rút γ-decalactone từ dịch lên men 53
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013
ọ ố ầ ự ế 3.3.1.5 L a ch n s l n chi t rút .............................................................52
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
γ ạ ự ọ ề ệ ậ ừ ị 3.3.2. L a ch n đi u ki n thu nh n và làm s ch decalactone t d ch lên
(A).........................................................................................................................................................57
..............................................................................................................................................................58
(B).........................................................................................................................................................58
..............................................................................................................................................................58
(C).........................................................................................................................................................58
(D)........................................................................................................................................................59
Hình 3.5. Sắc ký đồ γ-decalactone thu nhận từ dịch lên men bằng chủng Y. lipolytica VTP 5 (A),
sau khi làm sạch bằng phương pháp “Chiết rút-làm sạch” (B), bằng phương pháp “Chưng cất-chiết
rút-làm sạch” (C), γ-decalactone cô đặc (D).......................................................................................59
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013
men...................................................................................................................... 53
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
Ữ Ế Ụ Ắ DANH M C CH VI T T T
AcylcoA oxydase Aox
Adenosin triphosphat ATP
Coenzyme A CoA
ự ộ C ng s Cs
Food and drug administration FDA
ắ Gas chromatography (S c ký khí) GC
Megabase Mb
Peroxisomal acylCoA oxidase POX
Vòng/phút v/p
Yeast Maltose
YM
Yarrowia lipolyticaVTP5 Y VTP5
Y MTLY362P Yarrowia lipolytica MTLY362P
ượ Dessolved Oxygen (Hàm l ng ôxy hòa tan) DO
Yeast Maltose Agar YMA
DE
Diethyl ether
U
Unit
L
Lít
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013
S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
M Đ UỞ Ầ
ườ ế ế ử ụ ấ ơ ừ Con ng i bi t đ n ch t th m và s d ng chúng t hàng nghìn năm nay. Nó
ấ ượ ề ả ủ ặ ẩ ệ ự ẩ làm tăng ch t l ng c a nhi u s n ph m, đ c bi ờ ố t là th c ph m. Khi đ i s ng
ể ấ ộ ơ ượ ả ấ ngày càng phát tri n, xã h i càng văn minh thì các ch t th m đ c s n xu t và s ử
ề ả ố ượ ạ ấ ượ ẫ ụ d ng ngày càng đa d ng và phong phú v c s l ng l n ch t l ng.
Hi n nay, ngành công nghi p ch bi n th c ph m có nhu c u r t l n v các
ầ ấ ớ ế ế ự ề ệ ệ ẩ
ấ ạ ươ ị ả ươ ạ ươ ụ ch t ph gia t o h ng. H ng t o nên giá tr c m quan và h ư ặ ng vi đ c tr ng
ế ế ấ ử ươ ự ự ẩ ẩ cho th c ph m. Trong quá trình ch bi n th c ph m, c u t h ng trong nguyên
ầ ẽ ầ ệ ề ệ ả ấ ộ ắ li u ban đ u s d n m t đi, đi u đó b t bu c các nhà công ngh ph i nghĩ t ớ i
ươ ụ ạ ươ ặ ả ẩ ph ấ ng án thêm ch t ph gia t o h ự ng. M t khác, trong các s n ph m th c
ế ướ ẩ ọ ượ ầ ự ặ ủ ữ ph m pha ch (n c ng t, r u mùi, s a chua ...) luôn c n s có m t c a các
ấ ạ ươ ự ữ ệ ẩ ch t t o h ng. Ngoài công nghi p th c ph m ra, nh ng ngành khác cũng có nhu
ạ ươ ụ ấ ệ ẩ ấ ầ ử ụ c u s d ng các ch t ph gia t o h ng, đó là: ỹ công nghi p m ph m, ch t ph ụ
ể ả ấ ướ ệ ấ ượ ầ gia đ s n xu t n c hoa, ph n son, kem xoa; công nghi p d c c n thêm các
ươ ặ ệ ạ ố ẻ ể ấ ạ ch t t o h ố ng vào thu c, đ c bi t là các lo i thu c cho tr em đ làm át đi
ệ ả ễ ố ủ ấ ố ố ơ ị ị ươ h ng v khó ch u c a thu c và làm cho thu c d u ng h n; vi c s n xu t các
ư ơ ướ hàng tiêu dùng nh kem đánh răng, xà phòng th m, n ộ ầ c g i đ u, vv ... cũng c nầ
ạ ươ ụ ấ ổ b xung ch t ph gia t o h ng.
ấ ử ạ ố ươ ư Trong s các c u t t o h ng nh este, andehyde, lactone, alcohol..... thì
ổ ế ấ ử ươ ấ ợ ơ lactone là h p ch t khá ph bi n và là c u t h ng th m chính trong m t sộ ố
ừ ậ ạ ả ả ộ ư lo i hoa qu , th o m c nh đào, m n, d a, dâu tây... Trong các lactone thì γ
ấ ị ượ ứ ấ ấ decalactone (C10H18O2) là có giá tr nh t, đ ề c nghiên c u nhi u nh t. Ch t này
ự ở ứ ộ ượ ủ ạ ạ ồ ạ t n t i trong t nhiên m c đ vi l ầ ng, song là thành ph n ch đ o t o nên
ề ạ ơ ể ượ ổ ằ ợ ươ h ng th m cho nhi u lo i qu . ả γ decalacton có th đ c t ng h p b ng con
ợ ừ ầ ự ậ ủ ể ậ ờ ườ đ ổ ng sinh t ng h p t d u th c v t nh quá trình chuy n hoá c a vi sinh v t.
ạ ầ ự ậ ầ ầ ầ ạ ộ Trong các lo i d u th c v t, d u th u d u (castor oil), là m t lo i nguyên
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 1
ầ ỷ ệ ợ ổ li u phù h p cho quá trình t ng h p ợ γdecalactone. Quá trình thu phân d u th u ầ
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
axit ricinoleic, đây là “c ch t” đ m t s n m men chuy n hóa
ể ộ ố ấ ể ấ ơ d u sầ ẽ t o raạ
ấ ơ ờ thành ch t th m, nh quá trình βoxi hóa.
ộ ố ấ ấ ể M t s n m men chuy n hóa ch t béo (oleaginous yeasts) nh ư Yarrowia
lipolytica, Rhodotorula sp., Candida sp., Lipomyces sp., Trichosporon sp.,…. có
ấ ị ướ ử ụ ể ả ợ ố kh năng s d ng, chuy n hóa axít béo và các h p ch t k n c. Trong s đó
ượ ứ ề ề ấ ấ ấ n m men Yarrowia lipolytica là loài đ c nghiên c u nhi u nh t. V n đ nâng
ự ự ể ầ ấ ầ ầ ơ ủ cao s chuy n hóa d u th u d u thành ch t th m đang thu hút s quan tâm c a
ư ề ệ ấ ầ ầ ọ ồ ầ ả nhi u nhà khoa h c cũng nh các nhà s n xu t. Ngu n nguyên li u d u th u d u
ệ ử ụ ẻ ề ư ứ ệ ẵ ở ướ n ổ c ta s n có, r ti n nh ng vi c s d ng nó cho vi c nghiên c u sinh t ng
ư ượ ậ ấ ơ ề ờ ợ h p ch t th m nh vi sinh v t ch a đ ữ ứ c quan tâm nghiên c u nhi u. Vì nh ng
ế ề
ứ
ệ
ẽ l trên đây, chúng tôi ti n hành đ tài
ấ ề “Nghiên c u đi u ki n nuôi c y,
ừ ầ
ầ
ầ
ọ
ể
chuy n hóa sinh h c và thu nh n
ậ γdecalactone t
ằ d u th u d u b ng
ấ
Yarrowia lipolytica”.
n m men
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 2
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ủ ề
ụ
M c tiêu c a đ tài
ứ ầ ầ ệ ư ộ ệ ề ầ Ch ng minh d u th u d u Vi t Nam nh m t nguyên li u ti m năng trong
ệ ả ấ ơ ư ấ ờ ấ ấ vi c s n xu t ch t th m (cid:0) –decalactone nh n m men, cũng nh n m men
ệ ả ư ộ ề ấ ủ Yarrowia lipolytica VTP5 nh m t ch ng ti m năng cho vi c s n xu t này.
ứ
ộ
N i dung nghiên c u
ự ể ề ệ ể ầ ọ ọ ợ ầ 1. L a ch n đi u ki n thích h p đ lên men chuy n hóa sinh h c d u th u
ấ ằ ấ ầ d u thành ch t th m ơ (cid:0) –decalactone b ng n m men Yarrowia lipolytica VTP5,
quy mô trên máy l c.ắ
ự ề ệ ọ ợ ồ 2. L a ch n đi u ki n thích h p cho quá trình lên men đó trong các n i lên
men dung tích 5L và 50L.
ệ ế ấ ừ ị ề 3. Tìm các đi u ki n tách chi ậ t và thu nh n ch t th m ơ (cid:0) –decalactone t d ch
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 3
lên men.
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
Yarrowia lipolytica
ƯƠ Ổ Ệ CH NG I. T NG QUAN TÀI LI U
ấ 1.1. N m men
ộ ề ấ ả ấ N m men Yarrowia lipolytica thu c v nhóm các loài n m men có kh năng
ư ể ấ ấ ọ chuy n hóa ch t béo, hay còn g i là n m men a béo (oleaginous yeasts). Trong
đó còn có các loài khác nh ư Rhodotorula sp., Candida sp., Lipomyces sp.,
ể ấ ầ ả ợ ấ Trichosporon sp. Chúng có kh năng chuy n hóa ch t béo, d u và các h p ch t
ị ướ hydrocacbon k n c [11].
ấ ấ ấ ộ Yarrowia là chi n m men duy nh t thu c ngành n m túi (Ascomycota), chi
ộ ỉ này cũng ch có m t loài.
ấ ượ ậ ầ ầ ừ ơ ự ậ ở N m men này đ c phân l p l n đ u tiên t b th c v t Hà Lan năm
ầ ọ ượ ổ Candida 1928, lúc đ u có tên g i là Torula lipolytica, sau đó đ c đ i thành
ế ế ậ lipolytica và đ n nay là ộ Yarrowia lipolytica. Nó thu c nhóm vi sinh v t hi u khí
ả ạ ấ ề ả ẩ ộ ắ b t bu c, có kh t o r t nhi u s n ph m khác nhau, và đã ượ đ c đánh giá là nhóm
ấ ơ ả ề ệ ả ả ấ n m men không có kh năng gây b nh. Nhi u quy trình s n xu t c b n nh ờ
ượ ự ứ ụ ẩ ả ấ ở ấ n m men này đ ơ c c p phép ng d ng b i C quan Qu n lý Th c ph m và
ượ ẩ ơ ỳ D c ph m Hoa K (FDA). H n n a, ữ Yarrowia lipolytica cũng đ ượ ử ụ c s d ng
ề ự ụ ứ ế ự làm công c trong các nghiên c u v s bài ti ủ t protein, s hình thành c a
ề ưỡ ủ ủ ấ ợ peroxisome, v tính l ề ự ng hình c a n m men, v s phân h y các h p ch t k ấ ỵ
ể
ặ
ề Đ c đi m hình thái, di truy n
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 4
ư ự ề ướ n c, cũng nh trong nhi u các lĩnh v c khác [16][18].
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ấ ưỡ ể ấ Yarrowia lipolytica là lo iạ n m men l ng hình chuy n hóa ch t béo ,
ườ ự ạ ườ th đ ng cượ phân l pậ từ nhi uề lo i th c ph m ẩ khác nhau, từ môi tr ng t ự
ướ ủ ầ ưở ả ấ ẩ nhiên như n c th i ả c a nhà máy ép d u, x ầ ự ng s n xu t th c ph m có d u,
ế ậ hay từ môi tr ngườ ô nhi mễ d uầ . H uầ h tế các t bào phân l p đ ạ ượ ở tr ng thái c
ộ ố ở ạ ưỡ ể ử ơ đ n b i ộ , nh ngư m t s ít tr ng thái l ng b i ộ đ hình thành bào t ứ túi ch a
ệ ạ ơ b nố bào tử. Các t bàoế có th ể bi t hóa thành d ng ạ đ n bào, d ng ệ ợ h s i gi ả hay ,
ợ ộ ề d ngạ s i, tùy thu c vào ệ đi u ki n sinh tr ộ ưở . B gen trong ng nhân c aủ Y.
ớ ướ ề lipolytica có sáu nhi mễ s cắ thể, v i kích th ả c kho ng 20Mb. Nhi u trong s ố
ấ ươ ự ấ các gen xu t hi n ệ t ng t nh ư gen c aủ n m s i ề ợ h nơ là c aủ n m men truy n ấ
ệ ả th ngố Saccharomyces cerevisiae. Vi c gi i mã trình t ộ ự b gen c a ủ Y. lipolytica
ế ả g nầ đây đã cho bi t nhi u ề thông tin quan tr ngọ v ề tích lũy và phân gi i lipi t, về
ơ ớ ế ự ấ ự ươ s t ng tác c a ủ c ch t k n ấ ỵ ướ v i các t c bào n mấ men, s h p ph ụ và v nậ
ơ ấ ủ chuy nể c a chúng , các quá trình oxy hóa các c ch t này và các enzyme khác nhau
ơ ấ tham gia vào nh ngữ quá trình đó. M tộ số enzyme liên quan đ nế sử d ngụ c ch t
ỵ ướ thu c ộ các lo iạ multigene (đa gen). Ví d :ụ lipases/esterase (LIP genes), k n c
cytochromes P450 (ALK genes) và peroxisomal acylCoA oxidases (POX genes)
ượ đ c mã hóa b i ở m t h ộ ọ 5 gen có tên POX1, POX2, POX3, POX4, POX5, nh ngữ
ổ ợ gen này mã hóa t ng h p năm enzyme acylcoenzyme A oxidases (Aox) là Aox1,
ở ể ọ Aox2, Aox3, Aox4, Aox5. Các enzyme th peroxi có vai trò quan tr ng trong
ắ ộ ỗ ả s n xu t ấ (cid:0) decalactone t ừ met
ữ ế (Aox3) có liên quan đ n quá trình tái tiêu th ầ hyl ricinoleate, m t ph n chu i ng n riêng Aox ụ (cid:0) decalactone. Khi nh ng gen này
ế ư ự ế ả ử ụ ế t ị ộ b đ t bi n, bào không ch t nh ng s phân gi i, s d ng các c ch t k n ơ ấ ỵ ướ c
ể
ặ
ọ Đ c đi m sinh lý h c
ề
ồ V ngu n cacbon
ị ứ c a ủ Yarrowia lipolytica b c ch ế [21][25][27].
ử ụ ệ ấ ơ ườ ườ Ngoài vi c s d ng các c ch t thông th ư ng nh các đ ng hexose,
ể ử ụ ệ ả ơ ấ ỵ pentose, thì Yarrowia lipolytica còn có th s d ng hi u qu các c ch t k
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 5
ệ ử ụ ư ấ ơ ơ ướ n ấ ặ c nh ankan, hydrocacbon th m, ch t béo… Vi c s d ng các c ch t đ c
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ệ ế ơ ế bi t này có liên quan đ n c ch bám dính c a c ch t k n ủ ơ ấ ỵ ướ vào màng t c bàoế
ế ậ ấ ơ ế ằ ể và c ch v n chuy n các ch t qua màng t ấ bào b ng các ch t mang. Khi đó,
ữ ọ ỏ ơ ấ ỵ ướ ề ặ ế ế nh ng gi t nh c ch t k n c bám dính lên b m t t bào (hình 1.1), t bào t ự
ề ặ ồ ề ồ ổ ề ặ ả ộ ế ư ạ thay đ i b m t nh t o b m t g g l i lõm, và gi m đ dày thành t bào . Sau
ượ ậ ủ ộ ể ệ ử đó chúng đ c v n chuy n ch đ ng thông qua các kênh ậ v n chuy n ể đi n t dày
ế ặ đ c trên màng t bào [16].
ướ ủ ế ả D i đây (hình 1.1) ể là nh hi n vi c a t bào Yarrowia lipolytica trong môi
ườ ệ ượ ọ ừ tr ng methy ricinoleat e, minh h a cho hi n t ng v a trình bày.
ưở Yarrowia lipolytica sinh tr ng trong môi tr ườ ch aứ methy ng Hình 1.1 T bàoế
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 6
ricinoleate [16].
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
Sau khi đ
ượ ậ ế ế ấ ướ ế ể c v n chuy n vào trong t bào, n u là ch t béo, tr c h t chúng
ủ ủ ộ ẽ ị s ch u tác đ ng c a enzym e lipotic (lipase) đ b ể ị th y phân thành glycerol và ax ít
ấ ỵ ướ ế ơ ẽ ượ ờ ệ béo; ti p đó các c ch t k n c này s đ c hydroxy hóa nh h ezyme có tên
ướ ộ là cytochrome P450 monoxidase khu trú trong l i n i ch t ấ , r iồ ti p t c ế ụ ch uị tác
ế ủ ệ ộ đ ng c a h enzym ể e oxidase chuy n thành andeh yde béo; ti p đó là quá trình oxi
ượ ở hóa andehyde béo đ c xúc tác b i aldeh yde dehydrogenase [10].
ể ồ ể ử ụ Ngoài ngu n cacbon k trên, Yarrowia lipolytica cũng có th s d ng ancol
ữ ơ (ankan, glycerin…), axit h u c (axit axetic, axit xitric, axit succinic…) hay các
ữ ơ ấ ể ố ủ ư ồ ưở ữ mu i c a các axit h u c đó nh nh ng ngu n cacbon duy nh t đ sinh tr ng,
ầ Nhu c u oxy
ữ ướ ể và chuy n hóa các ch tấ theo nh ng h ng khác nhau [16].
ấ ự ế ắ ố ộ ưở N m men Yarrowia lipolytica s ng hi u khí b t bu c, s sinh tr ng và trao
ấ ủ ế ố ặ ụ ề ấ ộ ệ ượ ổ đ i ch t c a nó ph thu c vào r t nhi u y u t , đ c bi t là l ng oxy trong môi
ườ ự ấ ầ ấ ưở tr ng nuôi c y. Trong quá trình nuôi c y, nhu c u oxy cho s sinh tr ng và
ấ ủ ụ ắ ấ ổ ộ ộ ồ trao đ i ch t c a n m men này ph thu c vào n ng đ ion s t có trong môi
ấ ắ ề ệ ươ ượ ụ tr ngườ [12]. Ngoài vi c khu y l c, có nhi u ph ng pháp đ ằ c áp d ng nh m
ượ ườ ặ ấ ệ tăng hàm l ng oxy trong môi tr ư ụ ng nuôi c y nh s c khí nén, đ c bi t là b ổ
ấ sung ch t mang perfluorocarbons (PFC) đã hòa tan oxy vào bình lên men trong giai
ủ ạ ấ ượ ầ ượ ử ụ đo n sau c a quá trình nuôi c y khi mà l ng oxy ban đ u đã đ c s d ng đáng
ứ ồ ộ ườ ừ ể k . Theo các nghiên c u, khi tăng n ng đ oxy trong môi tr ng lên men t 10
ả ượ ệ ừ ể ấ ệ ế đ n 20% thì s n l ng ch t đã chuy n hóa tăng rõ r t (t 1080%) ; vi c tăng
ộ ượ ả ồ n ng đ oxy lên trên 20% không làm tăng thêm l ng s n ph m ẩ [12].
ơ ừ
ấ 1.2. Ch t th m t
lipit
ự
ệ
ấ
ẩ
1.2.1. Vài nét v cácề
ch t th m
ơ dùng trong công nghi p th c ph m
ữ ấ ả ầ ầ ấ ơ ộ ơ Ch t th m là nh ng ch t có kh năng bay h i m t ph n hay toàn ph n trong
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 7
ứ ề ả ơ không khí, đ ậ c ượ c quan kh u giác c m nh n mùi khi chúng lan truy n hay
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ơ ừ ủ ớ ộ ế ở ộ ả khuy ch tán trong không khí v i đ bay h i v a đ và ấ m t kho ng cách nh t
ộ ợ ể ề ấ ấ ấ ơ ỗ ợ ị đ nh [ ể 2]. Các ch t th m có th là m t h p ch t hay h n h p nhi u ch t, có th là
ấ ắ ấ ỏ ấ ặ ch t r n hay ch t l ng ho c ch t khí.
ế ườ ị ượ ả ơ Đ n nay, ng i ta đã xác đ nh đ ự ấ c kho ng 7.000 ch t bay h i trong th c
ơ ượ ấ ẩ ả ấ ẩ ỹ ơ ph m và có kho ng h n 8.000 ch t bay h i đ c tìm th y trong m ph m và
ủ ế ấ ẩ ấ ợ ơ ộ ượ d c ph m. Các h p ch t th m này ch y u thu c các nhóm ch t aldeh it, xeton,
ữ ơ ancol, các axit h u c , este, lacton e…
ồ ố ườ ấ ơ D aự vào ngu n g c ng ơ i ta chia ch t th m thành 3 lo i: ấ ạ ch t th m t ự
ấ ơ ổ ợ ự ấ nhiên; ch t th m t ng h p hoàn toàn (không có trong t ơ nhiên); và ch t th m
ấ ự ợ ợ ố ổ t ng h p gi ng h p ch t t nhiên [2].
ấ ơ ự ượ ế ừ ệ ồ Ch t th m t nhiên đ c chi t tách t ố nguyên li u thiên nhiên có ngu n g c
ạ ươ ự ự ặ ậ ậ ầ ầ ơ ộ th c v t (tinh d u, nh a d u th m) ho c đ ng v t (x h ng). Trong khi đó
ợ ượ ạ ấ ơ ổ ườ ch t th m t ng h p đ ằ c t o ra b ng con đ ng hoá h c ấ ọ , có mùi gi ng các ch t ố
ự ư ấ ặ ớ ự th mơ c aủ t ơ nhiên ho c các ch t th m m i ch a có trong t nhiên. Trong công
ự ệ ẩ ượ ườ ỉ ượ ử ụ ấ nghi p th c ph m và d ẩ c ph m, ng i ta ch đ ơ c phép s d ng các ch t th m
ố ự ấ ự ấ ơ ợ ố ợ ồ có ngu n g c t ổ nhiên và các ch t th m t ng h p gi ng h p ch t t nhiên. Các
ế ấ ơ ổ ượ ử ụ ả ượ ể ặ ợ ch t th m t ng h p hoàn toàn n u đ c s d ng ph i đ c ki m tra ch t ch ẽ
ế ề ượ ử ụ ẩ ố ề ộ v đ tinh khi t và li u l ả ng s d ng trong s n ph m cu i cùng.
ả ấ ấ ơ ừ ơ ấ ự ườ ử ụ Đ sể n xu t các ch t th m t c ch t t nhiên ng i ta s d ng enzym e
ặ ậ ấ ơ ượ ạ ượ ọ ho c vi sinh v t. Các ch t th m đ c t o thành theo cách này đ ợ c g i là “h p
ấ ự ở ượ ạ ừ ệ ả ẩ ch t t nhiên” b i chúng đ c t o ra t các s n ph m nông nghi p thông qua
ọ ự ạ ờ ho t tính sinh h c t nhiên (enzym ậ e và vi sinh v t) và nh đó, t ỷ ệ l ồ các đ ng
ể ấ ồ ơ ị ủ phân (isomers) và đ ng v (isotops) c a các ch t th m này có th so sánh đ ượ c
ẩ ế ấ ừ ự ấ ượ ổ ư ớ ả v i s n ph m chi t xu t t t nhiên, không nh các ch t đ ằ ợ c t ng h p b ng
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 8
quá trình hóa h c. ọ
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ự ẩ ượ ử ế ặ ờ ổ Trong th c ph m, lipit đ c kh ho c bi n đ i nh các enzym e có s nẵ
ệ ặ ượ ạ trong nguyên li u thô ho c enzym e đ c t o ra do quá trình sinh tr ngưở trong
ườ ự ậ ẩ môi tr ủ ng th c ph m c a vi sinh v t .
ư ự ứ ề ề ẩ ặ ơ ỉ ấ M c dù có nhi u nghiên c u v ch t th m trong th c ph m nh ng ch có
ộ ố ấ ượ ể ả ứ ằ ườ m t s ít ch t th m ơ đ c nghiên c u đ s n xu t ấ b ng con đ ọ . ng sinh h c
ượ ề ấ ấ ơ ọ Trong s ố đó đ c quan tâm nhi u nh t là các ch t th m h lacton e nh ư (cid:0)
ấ ơ ừ decalactone và các ch t th m t carotenoit.
ẫ ấ ặ ấ ơ ệ ở ế ươ ứ Các ch t th m có s c h p d n đ c bi t b i nó liên quan đ n h ị ng v và
ị ả ố ườ ự ẩ ơ ợ ạ t o nên giá tr c m quan cho th c ph m. Trong đa s tr ấ ng h p, ch t th m đem
ườ ử ụ ự ệ ấ ẩ ả ơ ạ l i cho ng ự i s d ng th c ph m c m giác ngon mi ng. Ch t th m trong th c
ẵ ừ ể ẩ ể ượ ệ ầ ph m có th có s n t nguyên li u ban đ u, hay có th đ c hình thành trong quá
ặ ượ ụ ự ụ ấ ẩ ớ ế ế trình ch bi n, ho c đ ư c thêm vào th c ph m nh ch t ph gia v i m c đích
ị ả ự ệ ệ ẩ ế ế tăng giá tr c m quan trong th c ph m. Hi n nay ngành công nghi p ch bi n
ầ ấ ớ ự ụ ề ấ ạ ẩ ươ th c ph m có nhu c u r t l n v các ch t ph gia t o h ng. Trong quá trình
ế ế ự ệ ấ ch bi n th c ph m ẩ và đ u ng ồ ố , các ch t th m ầ ơ có trong nguyên li u ban đ u
ườ ị ấ ệ ả ớ ươ th ng xuyên b m t đi , khi nế các nhà công ngh ph i nghĩ t i ph ng án thêm
ư ướ ụ ẩ ả ấ ặ ọ ượ ch t ph gia. M t khác các s n ph m nh n c ng t, r ữ u mùi, s a chua,…
ầ ự ặ ủ ệ ấ ơ luôn c n s có m t c a các ch t th m. Ngoài công nghi p ch bi n ẩ ế ế th c ph m ự
ấ ẩ ử ệ ệ ẩ ỹ ượ ồ ố và đ u ng thì công nghi p m ph m, ch t t y r a và công nghi p d c là các
ầ ớ ử ụ ụ ngành có nhu c u l n s d ng các ch t ph gia t o h ạ ươ [2]. ng
ấ 1.2.2. Ch t th m
ấ ơ (cid:0) decalactone
ấ ử ơ ố Trong s các c u t th m nh a ư ndehit, este, lactone,…thì lactone là h pợ
ấ ấ ử ạ ươ ủ ủ ơ ổ ế ch t khá ph bi n. Các lacton e là c u t t o h ề ng th m chính c a c a nhi u
ế ế ừ ị ủ ấ ừ ư ự ề ẩ ạ ả lo i qu nh đào, d a, dâu tây và c a r t nhi u th c ph m ch bi n t th t, các
ữ ẩ ạ ả s n ph m s a, các lo i caramel [6].
ượ ề ấ ự ố Các lactone đ c tìm th y nhi u trong t nhiên, trong s đó (cid:0) decalactone
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 9
ấ ị ượ ứ ề ấ ấ (C10H18O2) có giá tr nh t và cũng đ c quan tâm nghiên c u nhi u nh t. Ch t này
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ự ở ứ ộ ượ ủ ế ạ ầ ồ ạ t n t i trong t nhiên m c đ vi l ng, là thành ph n ch y u t o nên h ươ ng
ề ạ ơ ủ ả ơ th m cho nhi u lo i hoa qu . ả (cid:0) decalactone có mùi th m c a qu đào, mùi
ườ ủ ấ ấ ạ ầ ộ ươ h ủ ơ ữ ng c a b s a, có c ng đ mùi r t m nh, và là ph n chính c a r t nhi u t ề ổ
ượ ử ụ ự ệ ẩ ẩ ỹ ợ ươ h p h ơ ng th m đ c s d ng trong công nghi p th c ph m, m ph m và d ượ c
ẩ ấ ợ ộ ộ ử ủ ph m. H p ch t này là m t este n i phân t c a axit 4 hydroxydecanoic, axit này
ề ệ ừ ế ẽ trong đi u ki n pH t 1 đ n 2 s đóng vòng đ t o ể ạ (cid:0) decalactone.
ấ ở ề ệ ườ ộ Ch t th m ơ (cid:0) decalactone đi u ki n th ố ấ ỏ ng là m t ch t l ng trong su t
ấ ễ ơ ạ ạ ặ ơ ơ ấ không màu, ho c có màu vàng r m r t nh t, r t d bay h i t o mùi th m d ễ
ư ầ ị ướ ấ ố ư ch u; h u nh không tan trong n c nh ng tan r t t t trong các dung môi h u c ữ ơ
ư ượ ầ nh r u, d u, ete, diethyl ether, etyl axetat…
γ ủ ấ Tính ch t lý hóa c a decalactone
Công th c phân t
ứ ử C10H18O2 (M =170).
ứ ấ ạ Công th c c u t o
Nhi
oC
ệ ộ t đ sôi: 218
ỷ ọ T tr ng : 0,952
ơ ữ ả Mùi : Hoa qu và b s a.
ể ử ụ ự ế ộ
Ủ ẩ ợ (cid:0) decalactone không có đ c tính và có th s d ng tr c ti p trong th c ự ư (cid:0) decalactone vào danh sách ph m. Năm 1974, y ban h p tác Châu Âu đã đ a
ữ ấ ợ ơ ổ ợ ượ ử ụ ẩ ở ứ ự ộ nh ng h p ch t th m t ng h p đ c s d ng trong th c ph m m c đ cao
ấ ừ ự ế ồ ộ nh t (t 520 ppm). Tuy nhiên trong th c t , n ng đ lactone này đ ượ ử ụ c s d ng
ự ẩ ướ ừ trong th c ph m cũng không quá 3 ppm và trong n c hoa t 20400 ppm [23].
ượ ử ụ ề ệ Trên th gi ế ớ (cid:0) decalactone đ i, c s d ng trong nhi u ngành công nghi p khác
ấ ạ ươ ồ ố ự ẹ ẩ nhau, làm ch t t o h ng cho th c ph m, k o cao su, kem đánh răng, đ u ng,
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 10
ề ế ả ẩ ả ẩ ướ n c hoa, s n ph m làm m m v i, các ch ph m dùng cho tóc…
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ườ
ạ
ấ
1.2.3. Các con đ
ng t o thành
ch t th m
ơ γdecalactone ở vi sinh
v tậ
ộ ố ạ ả ư ặ ớ ượ γdecalactone có m t trong m t s lo i qu nh ng v i hàm l ng r t ít ấ . B iở
ườ ộ ượ ấ ơ ớ v yậ ng i ta đã tìm ả cách s n xu t ấ ch t th m này v i m t l ồ ng d i dào nhờ vi
ậ ạ sinh v t. ậ Tùy lo i vi sinh v t mà c ấ h t này đ ạ ượ t o thành c ộ theo m t trong hai con
ể ổ ợ ọ ọ ngườ , đó là t ng h p sinh h c (biosynthetic) và chuy n hoá sinh h c đ
ườ ể ọ ườ (biotranformation). Con đ ng chuy n hóa sinh h c là con đ ng chính đ ượ ứ c ng
ấ ả ơ ấ d ngụ trong công nghi p ệ s n xu t ấ ch t th m vì ả có kh năng ơ cho năng xu t cao h n
ợ ổ t ng h p sinh h c ọ [12].
ợ ổ ườ ổ ợ T ng h p sinh h c ọ (biosynthetic) (cid:0) decalactone là con đ ng t ng h p nh ờ
ộ ố ử ụ ấ ầ ậ ậ ỡ vi sinh v t mà không s d ng ch t béo hay d u m . M t s vi sinh v t có kh ả
ừ ữ ấ ơ ợ ổ năng t ng h p ợ (cid:0) decalactone t ả nh ng h p ch t đ n gi n. Berger (1986) là ng ườ i
ự ườ ướ ệ ầ đ u tiên đã phát hi n ra s có m t c a ặ ủ (cid:0) decalactone trong môi tr ng n ị c th t
ủ ả ấ ở lên men b i các ch ng n m đ m ( Basidomycetes) [12].
ể ọ ườ ổ Chuy n hoá sinh h c ( biotranformation) là con đ ng t ng h p ợ γ
ử ụ ủ ả ậ ấ ờ ồ ơ decalactone nh các ch ng vi sinh v t có kh năng s d ng ngu n c ch t nh ư
ủ ế ủ ầ ầ ầ ầ ấ ầ ầ ầ d u, các ch t béo, trong d u th u d u. ầ H pợ ph n ch y u c a d u th u d u là
ơ ấ ả ứ ừ ừ ồ ổ axit ricinoleic, đóng vai trò v a là ngu n cacbon v a là c ch t c m ng cho t ng
ị ắ ắ h p ợ γdecalactone. Trong quá trình βoxy hóa, axit ricinoleic b c t ng n d n ầ đ nế
ử ẽ ế ạ ấ ổ còn hai nguyên t cacbon và t o ra acetylCoA, ch t này sau đó s bi n đ i qua
ấ ượ ể chu trình Krebs đ cung c p năng l ậ ng cho sinh v t. Quá trình βoxy hóa t o raạ
ề ệ ẩ ả s n ph m trung gian là axit 4 hydroxy decanoic, axit này trong đi u ki n pH 1,5
ẽ ượ ế đ n 2 s đóng vòng đ t o ể ạ γdecalactone [39][40]. Quá trình này đã đ c tìm
ấ ở ộ ố ấ ư Yarrowia lipolytica, Candida maltosa, Candida th y m t s n m men nh
tropicalis….
ể ấ Quá trình chuy n hóa a xit ricinloneic thành ch t th m ơ γdecalactone nh viờ
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 11
ự ấ ậ ạ ộ ủ ờ sinh v t th c ch t là quá trình βoxy hóa, nh ho t đ ng c a các acyl coenzym e
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ễ ể A oxidase, di n ra trong ty th và các peroxisome . Quá trình βoxy hóa nói trên
ạ bao g m ồ 4 giai đo n [24] :
1. Ph n ng kh hydro t o liên k t đôi gi a 2 nguyên t
(cid:0) ả ứ ử ữ ế ạ ử ở ị carbon v trí và
(cid:0) ứ ả ạ (C2 và C3), t o enoylCoA. Ph n ng do enzyme acylCoA
ớ ự ủ dehydrogenase xúc tác v i s tham gia c a FAD.
2. Ph n ng hydrate hóa g n H
ứ ắ ả ạ ế 2O vào liên k t đôi t o ra (cid:0)
ượ ở hydroxyacylCoA, đ
ả ứ ử 3. Ph n ng kh hydro đ i v i c xúc tác b i enzyme enoylCoA hydratase. ố ớ (cid:0) hydroxy acylCoA, do enzyme (cid:0) hydroxy
ạ ế acylCoA dehydrogenase xúc tác, t o ra (cid:0) keto acylCoA và bi n đ i ổ
NAD+ thành NADH.
4. Ph n ng tách acetylCoA và t o acylCoA m i ng n h n 2 nguyên t
ả ứ ắ ạ ơ ớ ử C
ở ọ ượ đ c xúc tác b i enzyme acylCoA acetyl transferase (còn g i là thiolase).
ị ắ ầ ắ Quá trình trên đ ượ ặ ạ c l p l i, a xít béo b c t ng n d n thành các acetyl CoA.
+: 1 c p cho FAD và 1 c p cho NAD
+ và
ế ượ ặ ặ Sau m t ộ chu kỳ, t bào thu đ ặ c 2 c p H
ử ư ậ ử ạ 1 phân t acetylCoA. Nh v y qua 4 giai đo n ạ thì phân t axit béo l ắ i ng n đi 2
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 12
ử ể ạ nguyên t cacbon đ t o thành acetyl CoA (hình 1.2).
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ơ ồ ơ ế
ể
ấ ơ (cid:0) decalactone
Hình 1.2. S đ c ch chuy n hóa axit ricinoleic thành ch t th m
[24]
ị ắ ầ ơ ồ ừ ạ ạ Trên s đ , axít ricinoleic b c t d n thành t ng m ch 2 cacbon, t o ra acetyl
ẽ ế ấ ế ấ ỗ ổ CoA, ch t này sau đó s bi n đ i qua chu trình axit citric và chu i hô h p t bào,
ượ ạ ộ ủ ậ ấ ạ t o năng l ố ng ATP cung c p cho ho t đ ng s ng c a vi sinh v t. Quá trình này
ẽ ẩ ả ạ t o ra s n ph m trung gian là axit 4 hydroxy decanoic, axít này s đóng vòng đ ể
ườ ệ ạ t o ra (cid:0) decalactone, β oxy hóa là con đ ể ổ ng chính trong công nghi p đ t ng
ấ h p ợ (cid:0) decalactone và các lactone khác vì cho năng su t cao [24][36][39].
ơ
ọ
ể
ấ
1.3. Chuy n hóa sinh h c axit ricinoleic thành ch t th m
γ
ủ
ể
ằ
ấ
ấ decalactone b ng các ch ng n m men chuy n hóa ch t béo
ồ ơ ấ 1.3.1. Ngu n c ch t
ể ậ ồ ử ụ Ngu n axit ricinoleic đ vi sinh v t s ể d ng chuy n hóa thành (cid:0)
ả ầ ầ ầ ầ ầ ầ ươ ượ decalactone là d u th u d u. Cây, qu và d u th u d u th ẩ ng ph m đ c minh
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 13
ầ ầ ươ ế ẩ ọ ở h a ầ hình 1.3 a và b. D u th u d u có tên th ng ph m ti ng Anh là castor oil
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ượ ừ ạ ầ ộ ọ (hình 1.3 c), đ c tách ra t h t cây th u d u ầ ầ (Ricinus communis) thu c h Th u
ằ ộ ỏ ươ ạ ả ầ d u (Euphorbiaceae), b Ba m nh v (Ephorbiales), b ng ph ng pháp ép l nh,
ặ ép nóng ho c trích ly.
ầ ầ ầ ầ a.Cây th u d u ầ c.D u th u d u
ộ ố ầ ả ầ ầ b.Qu th u d u ề ầ ả Hình 1.3. M t s hình nh v th u d u [5]
ứ ầ ả ầ ầ ầ ạ ầ ầ ộ ấ ỏ H t th u d u ch a kho ng 5060% d u. D u th u d u là m t ch t l ng
ứ ệ ầ ầ ạ ầ ặ ơ ị ề ề s n s t, không màu ho c h i vàng, mùi v nh t. D u th u d u ch a nhi u
ủ ế ư ư ộ glyxerit nh stearin, cholesterin, palmitin nh ng ch y u là ricinolein và m t ít
ị ủ ư ạ axít béo nh linoleic, stearic. Ricinolein b th y phân t o thành ricinoleic acid
ộ ượ ứ {m t axit r u béo có công th c phân t ử 18H34O3 và danh pháp IUPAC [R,Z]12 C
OH
O
OH
hydroxy9octadecenoic acid (hình 1.4 )}.
ứ ấ ạ ủ Hình 1.4 Công th c c u t o c a axit ricinoleic (12 hydroxy9octadecenoic
acid) [18].
ấ ạ ừ ộ ử ế ớ Axit này c u t o t b khung 18 nguyên t ộ cacbon v i m t liên k t đôi ở
ữ ử ắ ố ộ ố ớ gi a nguyên t cacbon s 9 và s 10, m t nhóm hydroxyl g n v i nguyên t ử
ấ ố ọ ươ ớ ồ cacbon s 12. C u trúc hóa h c này khá t ng đ ng v i 4 hydroxy decanoic mà
ủ ặ ưở ạ d ng lactone c a nó là (cid:0) decalactone. Đ c đi m này cho phép ta có ý t ể ng v ề
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 14
ệ ể ầ ấ ầ ơ ầ vi c sinh chuy n hóa d u th u d u thành ch t th m [4].
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ọ ủ ầ ầ ở ầ ầ ướ ệ Thành ph n hóa h c c a d u th u d u các n ư c nh Vi ộ Ấ t Nam, n Đ ,
ự ả ệ ẫ Braxin (b ng 1.1),…có s khác bi ầ t, tuy nhiên thành ph n chính v n là axit
ế ớ ữ ệ ầ ầ ộ ricinoleic chi m t ầ ầ i 8390,4%. Hi n nay d u th u d u là m t trong nh ng d u
ấ ượ ử ụ ế ở ạ ự ệ ế ọ công nghi p quan tr ng nh t đ c s d ng tr c ti p ( d ng liên k t glyxerit)
ự ế ế ề ấ ặ ổ ệ ọ ho c gián ti p (qua các bi n đ i hóa h c) trong r t nhi u lĩnh v c công nghi p
ờ ố ặ ệ ệ ổ ệ ầ ầ ầ ợ ồ và đ i s ng. Đ c bi t, d u th u d u là ngu n nguyên li u cho vi c t ng h p các
ạ ấ ơ ợ h p ch t th m d ng lactone .
ả
ữ ơ
ầ
ầ
ầ
ầ
Thành ph n axít h u c trong d u th u d u [17].
B ng 1.1.
ầ ệ ầ D u Vi t Nam D u Braxin ầ Ấ ộ (%) Axit D u n Đ
(%) 86,36 (%) 83 90 87,4 90,4
3,19 5,98 2,96 5,64 0,68 1,84 0,87 2,35
Ricinoleic Linoleic Oleic Stearic Palmitic Dihydrostearic 2,9 4,0 2,5 4,0 0,9 1,3 0,8 1,3 0,5 0,8
ủ
ể
ấ
ả 1.3.2. Các ch ng n m men có kh năng chuy n hóa axit ricinoleic
γ
ơ
ấ
thành ch t th m decalactone
ữ ể ầ ầ ầ ả ậ ấ Nh ng loài vi sinh v t có kh năng chuy n hóa d u th u d u thành ch t
ấ ấ ẩ ồ ố
ố ấ ấ ổ ủ ệ ẩ ấ ng và hi u su t t ng h p ượ l th m ơ (cid:0) decalactone bao g m vi khu n, n m m c và n m men. Tuy nhiên s n ả ợ (cid:0) decalactone c a vi khu n và n m m c r t th p, ấ
ứ ứ ụ ấ ể ủ ế ậ do đó các nghiên c u ng d ng ch y u t p trung vào nhóm n m men chuy n
ộ ố ể ậ ả ấ ấ ượ hóa ch t béo. M t s vi sinh v t có kh năng chuy n hóa ch t béo đ c nêu
ả trong b ng 1.2.
ả
ộ ố
ậ
ể
ầ
ầ
ầ
ả
M t s vi sinh v t có
kh năng chuy n hóa d u th u d u thành
B ng 1.2.
ấ
ch t th m
ơ (cid:0) decalactone
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 15
ả ượ ợ ệ Vi sinh v tậ S n l ng ấ ổ Hi u su t t ng h p ệ Tài li u tham
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
γ γ decalactone decalactone/ kh oả
castor oil (g/g) 0,0061 (g/L) 0,61 [17].
Yarrowia lipolytica Sporidiobolus 1 [15]. 0,10
odorus Saccharomyces 3,7 [13]. 0,13
cerevisiae Yarrowia lipolitica
HR 145 12,3 0,246 [33].
(DSM 12397) Yarrowia lipolytica 0,621 [1]. 0,062
W29 Rhodotorula 5,8 [8]. 0,33 aurantiaca
ủ ấ
Ứ
ụ
ể
ấ
1.4. ng d ng c a n m men chuy n hóa ch t béo
ấ
ấ
ả S n xu t ch t béo
ủ ữ ư ể ả ấ ấ ấ Nh ng ch ng n m men a béo có kh năng chuy n hóa ch t béo cao nh t
ượ đã đ c báo cáo bao g m ồ Candida 107, Rhorosporidium toruloides, Yarrowia
ấ ượ lipolytica. H p th ụ lipit và axit béo ấ ở nhóm n m men này đã đ ứ c nghiên c u
ộ ệ ố ạ ấ ồ ở trên m t h th ng lên men g m hai giai đo n trong nuôi c y, theo đó ạ giai đo n
ậ ượ ề ệ ế ạ ồ ở ầ đ u vi sinh v t đ c nuôi trong đi u ki n h n ch ngu n cacbon; ạ giai đo n
ế ườ ổ ồ ườ ti p theo, ng i ta b sung ngu n cacbon là glucose vào môi tr ấ ng nuôi c y,
ẽ ấ ế ụ ấ ượ ượ chính ch t này s kích thích t tào h p th lipit. L ng lipit đ c tích lũy có t ỷ
ớ ọ ượ ủ ế ở Rhodosporidium ệ ấ l r t cao: so v i tr ng l ng khô c a t bào
ơ ở ừ toruloides ho cặ Rhodotorula glutinis là h n 70%, Y. lipolytica là t 38% 50%
ả
ấ
S n xu t carotenoids
ấ ộ ế ộ tùy thu c ch đ nuôi c y, v i ớ Candida 107 t ỷ ệ l này là 28% [11][21][27].
ố ủ ể ấ ả ấ ộ M t s ch ng n m men chuy n hóa ch t béo có kh năng tích lũy
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 16
ế ơ ấ ổ ề ấ ợ ơ carotenoids trong t ề ặ bào (ti n vitamin A, c ch t t ng h p ch t th m…). V m t
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ệ ậ ế ậ sinh lý và sinh thái vi sinh v t, vi c tích lũy carotenoid giúp t bào vi sinh v t tăng
ứ ề ướ ấ ợ ừ ườ ử ườ c ng s c đ kháng tr c tác nhân b t l i t môi tr ư ng nh tia t ộ ạ ngo i. M t
ủ ố ượ ứ ứ ụ ể vài ch ng trong s đó đã đ ệ ả c nghiên c u và tri n khai ng d ng trong vi c s n
ấ xu t carotennoid, nh ư Rhodotorula glutinis TISTR 5159, Rhodotorula glutinis
ủ ả CCY 20226, Rhodototula gracillis… Kh năng tích lũy carotenoid c a chúng
ấ ợ ề ệ ấ ư ườ tăng lên khi nuôi c y trong đi u ki n b t l i nh môi tr ng có H ờ ồ 2O2 đ ng th i
ồ ơ ả ượ ế ị ạ b h n ch ngu n nit , oxy. Khi đó s n l ng carotenoid có th đ t ể ạ 26,30mg/L
ấ ủ ấ ượ ứ ụ ể ị d ch nuôi c y. C ác ch ng n m men này đã đ c ng d ng đ lên men trong đó
ủ ướ ả ừ ấ ầ ọ ầ ả ồ ử ụ s d ng ngu n cacbon c a n c th i t ậ các nhà máy s n xu t d u c , d u đ u
ỉ ầ ồ ơ ạ ộ ổ nành, mà ch c n b sung thêm ngu n nit là (NH ấ 4)2SO4 và ch t ho t đ ng b ề
ả
ấ S n xu t enzyme
ư ặ m t nh Tween 20 [14][26].
ấ ủ ữ ạ ậ ộ ọ M t trong nh ng enzyme ngo i bào quan tr ng nh t c a vi sinh v t là lipase;
ượ ứ ấ ẩ ử ệ ả ụ ấ ộ enzyme này đ ự c ng d ng r ng rãi trong công nghi p s n xu t ch t t y r a, th c
ượ ử ề ể ấ ả ấ ấ ẩ ẩ ph m, d c ph m, x lý ch t th i. Nhi u nhóm n m men chuy n hóa ch t béo có
ớ ả ượ ả ổ ấ ố ơ ấ ợ kh năng t ng h p lipase v i s n l ữ ng cao. Nh ng c ch t t ữ t nh t cho nh ng
ầ ọ ầ ử ụ ể ổ ủ ầ ấ ạ ả ợ ch ng n m men này s d ng đ t ng h p lipase là d u c , d u oliu, d u h t c i,
ớ ồ ộ ừ ậ ữ ể ầ ầ d u đ u nành… V i n ng đ t 0,4 2% nh ng d u này có th cho s n l ả ượ ng
ườ ữ ể ấ ấ lipase 30,4 U/ml môi tr ng. Nh ng loài n m men chuy n hóa ch t béo có kh ả
ổ ượ ứ Rhodotorula glutinis, Yarrowia ợ năng t ng h p lipase đ c quan tâm nghiên c u là
ấ
ổ
ợ
ơ
T ng h p ch t th m
lipolytica [30][32][35].
ư ể ả ấ ầ ấ ợ ấ Các n m men a béo có kh năng chuy n hóa ch t béo, d u và các h p ch t
ị ướ hydrocacbon k n c là Yarrowia lipolytica, Rhodotorula sp., Candida sp.,
ặ ệ Lipomyces sp., Trichosporon sp.,… Đ c bi t loài ạ ấ Yarrowia lipolytica là lo i n m
ề ố ượ ứ ề men “không truy n th ng” đ c nghiên c u nhi u nh t. ấ Yarrowia lipolytica có khả
ấ ỵ ướ ử ụ ơ ư ầ ộ năng s d ng các c ch t k n c nh các ankan, axít béo và d u, m t cách có
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 17
ệ ả ồ ưỡ ố ế ể ợ ư ộ hi u qu , nh m t ngu n dinh d ổ ng chính đ sinh t ng h p sinh kh i t bào
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ể ạ ể ấ ặ ơ ho c chuy n hóa đ t o thành axít citric, axít 2keto glutaric, các ch t th m h ọ
lactone [23].
ự ả ấ ườ ẫ ớ ự ạ S phân gi ở ấ i ch t béo C18 b i n m men thông th ng d n t i s t o thành
ộ ố ủ ấ ơ ạ các ch t bay h i axetyl (C2) và propionyl (C3). Tuy nhiên, m t s ch ng l i có
ị ươ ấ ấ ả ạ ợ ạ kh năng t o thành các h p ch t C8 – C15 r t có giá tr th ợ ng m i. Các h p
ạ ươ ấ ớ ươ ả ch t vòng l n C15 có mùi x h ng, các lactone C8 C12 có h ng hoa qu và
ừ ậ ơ ứ ề ượ ươ h ng béo ng y (d a, đào, dâu tây, m ,…) [19]. Nhi u nghiên c u đã đ ự c th c
ủ ủ ư ệ ể ế ặ ộ ề hi n đ tác đ ng đ n đ c tính di truy n c a các ch ng, nh ng nguyên nhân t ạ i
ộ ố ủ ư ạ ấ ẫ ả ợ sao m t s ch ng có kh năng t o thành các h p ch t này thì v n ch a đ ượ c
ủ ể ệ ậ ặ ậ ậ ớ ệ ấ hi u rõ. Vì v y, vi c phân l p các ch ng vi sinh v t m i, đ c bi t là n m men có
ể ể ể ấ ấ ả ọ ơ kh năng chuy n hóa sinh h c ch t béo thành các ch t th m đ tìm hi u con
ộ ị ứ ấ ạ ạ ấ ổ ườ đ ng trao đ i ch t, m c đ d hóa, các ch t trung gian t o thành, ho t tính β
ượ ặ ọ ệ oxy hóa,…Luôn luôn đ ọ c các nhà khoa h c chú tr ng đ c bi ọ ệ ự t. Vi c l a ch n
ứ ố ư ủ ể ấ ề các ch ng n m men có ti m năng đ nghiên c u t ể i u hóa quá trình sinh chuy n
ằ ứ ụ ệ ả ấ ấ ạ ả ơ ọ hóa đ t hi u qu cao nh m ng d ng trong ngành s n xu t ch t th m h lactone
ớ ủ ự ọ nh ư (cid:0) decalactone là s quan tâm l n c a các nhà khoa h c.
ữ ứ ủ ế ụ ể ấ ấ Ngoài nh ng ng d ng ch y u trên đây, n m men chuy n hóa ch t béo còn
ể ượ ử ụ ư ả ụ ề ấ ả có th đ ấ c s d ng cho nhi u m c đích khác nh s n xu t biodiesel, s n xu t
ử ễ ọ ườ ườ axit citric, làm vi nang sinh h c, x lý ô nhi m môi tr ng (nh t là ấ môi tr ị ng b ô
ư ấ ứ ầ ả ừ ễ ấ ả ở ế ế ầ nhi m b i ch t th i ch a d u nh ch t th i t nhà máy ch bi n d u th c v t, t ự ậ ừ
ữ ườ ở ạ ễ ấ các nhà máy s a, môi tr ở ầ ng đ t ô nhi m b i d u, b i h t có d u ẩ ầ và th c ph m ự
ủ phân h y) [16].
ế ố ả
ưở
ọ
ế
ể
1.5. Các y u t
nh h
ng đ n chuy n hóa sinh h c axit ricinoleic thành
γ
ơ
ấ
ằ
ấ
ch t th m decalactone b ng n m men
ộ ầ
ầ
ồ
ầ N ng đ d u th u d u
ổ ầ ầ ầ ượ ử ụ Trong sinh t ng h p ợ (cid:0) decalactone, d u th u d u đ ồ c s d ng làm ngu n
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 18
ủ ế ủ ầ ầ ầ ầ ấ cacbon duy nh t. Axit ricinoleic, thành ph n ch y u c a d u th u d u đóng vai
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ồ ổ ặ ủ ự trò là ngu n cacbon chính cho sinh t ng h p ợ (cid:0) decalactone. S có m t c a các
ấ ồ ụ ầ ầ ầ ả axit béo trong d u th u d u đóng vai trò là ch t đ ng oxy hóa và có tác d ng c m
ứ ệ ầ ầ ng h enzyme. V i ớ Yarrowia lipolytica W29, khi l ầ ử ụ ng d u th u d u s d ng
ả ượ ạ ượ tăng trong ph m vi nào đó thì s n l ng ầ c tăng d n, tuy
ừ ẽ ượ (cid:0) decalactone thu đ ế ậ ứ ộ ầ ử ụ nhiên n ng đ d u s d ng quá cao s làm c ch th m chí ng ng quá trình sinh
ộ
ồ
ườ
N ng đ oxi trong môi tr
ng
ồ ợ (cid:0) decalactone [1]. ổ t ng h p
ế ố ấ ọ ể ọ Oxy là y u t r t quan tr ng trong quá trình chuy n hoá sinh h c axit
γ ấ ầ ầ ầ ơ ricinoliec trong d u th u d u thành ch t th m decalactone. Oxy hòa tan vào môi
ườ ở ạ ả ủ ấ ạ ọ ỏ tr ỏ ng l ng ề d ng b t khí nh làm kích thích sinh s n c a n m men và t o đi u
ệ ế ấ ườ ấ ỉ ki n cho t ấ bào n m men hô h p. Oxy trong môi tr ng nuôi c y không ch có
ưở ẩ ự ả ạ vai trò kích thích sinh tr ng mà còn thúc đ y s sinh s n các enzyme ngo i bào,
ẩ ả thúc đ y s n sinh lipaza [16].
ữ ế ể ế ả ấ Đ tăng kh năng ti p xúc gi a t bào n m men và oxy chúng tôi đã s ử
ư ắ ệ ấ ổ ọ ộ ụ d ng các bi n pháp nh : l c, khu y tr n hay th i khí làm cho b t khí càng phân
ỏ ơ ế ấ ượ ế ấ ề tán nh và đ u h n, do đó t bào n m men càng đ ớ c ti p xúc v i ch t dinh
ố ơ ươ ổ ưỡ d ng và oxy t t h n. Ngoài ra còn có ph ng pháp b sung Perfluorodecalin
pH môi tr
ngườ
ư ộ ồ ườ ấ nh m t ngu n mang oxy vào môi tr ng nuôi c y.
ườ ưở ự ế ướ ỵ ướ pH môi tr ả ng nh h ế ng tr c ti p đ n tính háo n c và k n ủ c c a
ế ấ ừ ưở ế ự ấ ủ ế ụ thành t bào n m men, t ả đó nh h ng đ n s h p th lipit c a t bào
ủ ế ằ ớ ồ Khi ti n hành lên men b ng ch ng Yarrowia lipolytica W29 v i n ng đ ộ
ầ ầ ộ ừ ế ả ổ các pH khác nhau dao đ ng t ợ 3 đ n 7, kh năng t ng h p
ấ ở ủ ủ ấ ể ở ằ ầ ở d u th u d u 10g/L (cid:0) decalactone c a ch ng n m men này t ố t nh t pH b ng 7. Có th pH này
ườ ậ ợ ệ ạ ấ ạ ự ạ s t o thành các h t lipit trong môi tr ề ng đã t o đi u ki n thu n l i nh t cho s ự
ớ ế ủ ế ể ạ ấ ặ ế ti p xúc c a chúng v i t bào n m men, ho c có th t i pH này, t ấ bào n m men
ố ộ ắ T c đ l c
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 19
ấ ươ ố ườ ả s n sinh ra ch t nhũ t ng hóa giúp lipit hòa tan t t trong canh tr ng [1].
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ủ ằ ườ Khi lên men b ng ch ng Yarrowia lipolytica W29 trong môi tr ứ ng ch a
ầ ở ồ ố ộ ắ ế ộ ớ ầ ầ d u th u d u ả ủ n ng đ 10g/L, pH 7, v i các t c đ l c khác nhau. K t qu c a
ấ ạ ấ ọ ợ ố ổ ị ộ ắ L i Th Ng c Hà cho th y: t c đ l c phù h p nh t cho sinh t ng h p ợ (cid:0)
ắ
ờ
Th i gian l c
decalactone là 200 vòng/phút [1].
ả ạ ế ọ ị Theo tác gi L i Th Ng c Hà, khi ti n hành nuôi Yarrowia lipolytica W29 ở
ộ ắ ố ướ ạ ả ượ pH=7, t c đ l c 200 v/p và đo kính th ế c h t lipit, k t qu thu đ c nh ư
ệ ộ ớ ở ứ ố sau:Trong m t thí nghi m, v i Y. lipolytica W29, mà ứ công th c đ i ch ng
ế ế ả ấ ượ ở ứ không có t bào n m men này, k t qu thu đ ư c nh sau: ứ ố công t c đ i ch ng,
ủ ạ ệ ế ắ ờ ớ th i gian l c càng lâu thì di n tích ti p xúc riêng c a h t lipit càng l n; trong khi
ở ủ ứ ệ ế ạ ấ ươ đó công th c có n m men, di n tích ti p xúc riêng c a các h t lipit t ố ng đ i
ổ ủ ề ắ ờ ộ ị ả ế ằ ấ n đ nh theo th i gian l c. Đi u này ng h cho gi thi t r ng n m men này có
ế ạ ấ ổ ộ ị ươ ủ ườ ti t ra m t ch t nhũ hóa làm n đ nh tr ng thái nhũ t ng c a môi tr ng [1]. Có
ế ắ ả ưở ế ả ổ ẽ l ờ chính vì th mà th i gian l c có nh h ng đ n kh năng sinh t ng h p ợ (cid:0)
ủ ấ decalactone c a n m men này.
ả
1.6. Tình hình nghiên c uứ và s n xu t
ấ (cid:0) decalactone trong và ngoài
n
cướ
cướ
a. Trong n
ứ ứ ể ả ụ ệ ệ ọ Ở ệ Vi ấ t Nam, vi c nghiên c u ng d ng công ngh sinh h c đ s n xu t
ấ ằ ơ ườ ư ể ặ ọ ổ ch t th m b ng con đ ợ ng sinh h c nh sinh t ng h p ho c sinh chuy n hóa còn
r t ít.ấ
ả ứ ự ừ ầ ầ Năm 19952000, d a vào ph n ng ozon hóa t ầ d u th u d u. Bùi Quang
ậ ợ ượ ư ấ ị ổ Thu t đã t ng h p đ c các ch t có giá tr cao nh [R] (cid:0) decalactone, [R] (cid:0)
ả ấ ợ ơ undecalactone, diacetate [R]1,4decanodiol và kho ng 20 h p ch t th m khác có
ể ử ụ ạ ọ ọ ố ệ ho t tính quang h c và sinh h c, có th s d ng t ự t trong công nghi p th c
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 20
ẩ ẩ ượ ỹ ph m, m ph m và d ẩ c ph m [4].
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ả ồ ụ ư ệ ổ ữ ồ Năm 2003, trong khuôn kh nhi m v “B o t n và l u gi ngu n gen vi
ự ự ệ ệ ệ ẩ ẩ ầ ầ ậ sinh v t công nghi p th c ph m”, Vi n Công nghi p Th c ph m l n đ u tiên đã
ộ ố ơ ộ ủ ế ấ ả ậ ả ti n hành phân l p và kh o sát s b m t s ch ng n m men có kh năng
ừ ế ể ấ ả ậ ầ ầ ầ ớ ả ơ chuy n hóa d u th u d u thành ch t th m. T các k t qu phân l p m i và kh o
ư ậ ủ ề ể ẵ ọ ố ượ sát các ch ng có s n trong s u t p gi ng, nhóm đ tài đã tuy n ch n đ c 3
ủ ể ả ấ ừ ầ ầ ầ ch ng n m men có kh năng chuy n hóa axit ricinoleic t ể ạ d u th u d u đ t o
ấ ấ ấ ơ ơ ượ ơ ộ ị ch t th m trong quá trình nuôi c y. Ch t th m đã đ c s b xác đ nh thành
ầ ươ ắ ạ ằ ph n b ng ph ng pháp s c ký khí (GC), (cid:0) decalactone t o ra đã đ ượ ơ ộ c s b
ượ ế ệ ủ ị đ nh l ng và tách chi ấ ổ t. Hi u su t t ng h p ợ (cid:0) decalactone b ng các ch ng n m ấ ằ
ủ ự ệ ệ ẩ ạ ấ men c a Vi n Công nghi p Th c ph m đ t cao nh t là 0,24% (240 mg/L môi
ườ ố ớ ủ ấ tr ng nuôi c y) đ i v i ch ng KFP 346 [3].
ố ế ả ạ ọ ị Năm 2003, L i Th Ng c Hà, đã công b k t qu nghiên c u v m t s y u t ứ ề ộ ố ế ố
ưở ế ả ổ ủ ấ ả có nh h ng đ n kh năng sinh t ng h p ợ (cid:0) decalactone c a ch ng n m men ủ
Ở ề ệ ệ ấ Yarrowia lipolytica W29. ớ ơ ấ đi u ki n nuôi c y trong phòng thí nghi m v i c ch t
ố ộ ắ ủ ấ ầ ầ ổ ầ d u th u d u 20 g/L, pH=7,0, t c đ l c 200 vòng/phút, ch ng n m men này t ng
b. Ngoài n
cướ
ườ ợ ượ h p đ c 621mg (cid:0) decalactone/lít môi tr ng [1].
ế ế ử ụ ự ự ề ẩ ầ ấ ơ Nhu c u v ch t th m s d ng trong các lĩnh v c ch bi n th c ph m, đ ồ
ẩ ượ ấ ẩ ử ạ ả ẩ ỷ ỹ ỹ ố u ng, m ph m, d c ph m và ch t t y r a đ t kho ng 1620 t đô la M hàng
ư ấ ẫ ơ ượ ổ ỉ ấ ợ ọ ủ ế năm nh ng v n ch y u là các ch t th m đ c t ng h p hóa h c và ch r t ít
ượ ả ườ ế ừ ự ậ ặ trong chúng đ ấ ằ c s n xu t b ng con đ ng tách chi th c v t ho c qua s t t ự
ấ ủ ậ ổ trao đ i ch t c a vi sinh v t.
ủ ế ạ ầ ươ ủ ơ (cid:0) lactone và (cid:0) lactone là thành ph n ch y u t o nên h ng th m c a các
ươ ự ộ ố ả ư ạ ả ẩ ồ ngu n h ng t ươ nhiên nh các lo i qu và m t s s n ph m lên men. H ng
ế ị ủ ủ ấ ơ ộ ạ th m c a các lactone là do c u trúc vòng lactone quy t đ nh, đ dài c a m ch
ấ ấ ươ ồ cacbon và c u trúc đ ng phân quang h c. ọ (cid:0) decalactone, ch t h ng có giá tr ị
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 21
ề ệ ế ấ ơ ớ l n trong nhi u ngành công nghi p và cho đ n nay là ch t th m chính đ ượ ổ c t ng
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ằ ườ ả ượ ợ h p b ng con đ ọ ng sinh h c. S n l ng (cid:0) decalactone càng ngày càng tăng, d nẫ
ả ượ ả ấ ầ ế đ n giá thành gi m d n. Năm 1997, s n l ng (cid:0) decalactone đ t 10 t n làm ạ
ể ừ ả ố ỹ gi m giá thành đáng k t trên 12.000 đô la M /kg (năm 1986) xu ng còn 500 đô
ấ ả ấ ỹ ỹ ơ la M /kg năm 1998 và 300 đô la M /kg năm 2003. Các nhà s n xu t ch t th m
ẫ ớ ự ế ệ ề ả ấ ạ ấ r t quan tâm đ n vi c h giá thành s n xu t và đi u này đã d n t ổ i s thay đ i
ị ướ ứ ở ự trong đ nh h ng nghiên c u lĩnh v c này [20].
ơ ấ ạ ộ ố ế ứ ể ả ấ ọ ề M t s k t qu nghiên c u khoa h c v chuy n hóa c ch t t o thành ch t
ờ ử ụ ậ ạ ơ ượ ư ố th m d ng lactone nh s d ng vi sinh v t đã đ c th ng kê nh sau:
ủ ấ Yarrowia lipolytica, ử ụ Farbood và Willis (1985) s d ng các ch ng n m men
ể ổ Aspergillus oryzae, Geotrichum klebahnii và Candida sp. Đ t ng h p ợ (cid:0)
ừ ơ ấ ầ ầ ầ ầ ầ ớ decalactone t ầ các c ch t chính là d u th u d u, d u th u d u cùng v i enzyme
ủ ầ ầ ầ ở lipase, d u th u d u th y phân ệ quy mô phòng thí nghi m trong các bình tam
ệ ấ ấ ượ ấ giác có khu y. Tuy nhiên, hi u su t thu đ ỉ ạ c còn th p, ch đ t 0,69g/L môi
ườ ấ ầ tr ng sau 1 tu n nuôi c y [17].
ứ ự ầ ộ ộ ử ụ Trong m t nghiên c u g n đây, Alchihab M và c ng s (2010) đã s d ng
ủ ấ ậ ừ ự ể các ch ng n m men Rhodotorula aurantiaca phân l p t Nam C c đ lên men
ầ ồ ấ ạ ầ d u th u d u t o ầ ạ (cid:0) decalactone. N ng đ ộ γdecalactone cao nh t đ t 5,8g/L trên
ườ ứ ầ ầ môi tr ầ ng ch a 20g/L d u th u d u [8].
ồ ụ ườ ệ ấ N ng đ ộ γdecalactone tích t trong canh tr ng cao nh t hi n nay (12,3
ượ ậ ả ứ ự ệ g/L) đ ở c ghi nh n b i nhóm tác gi Đ c th c hi n trên Yarrowia lipolytica HR
ườ ứ ấ 145 (DSM 12397), môi tr ng ch a 0,5% ure, khoáng ch t, vitamin, 0,07% Tween
ầ ầ ố ư ệ ề ậ ỹ ầ 80, và 5% d u th u d u, sau khi đã t i u hóa đi u ki n lên men. K thu t này
ượ ệ ở ề ả đã đ c đăng ký b n quy n công ngh b i công ty Haarmann & Reimer GmbH
[33].
ộ ị ượ ặ ự Groguenin và c ng s năm 2004, sau khi xác đ nh đ ủ c các đ c tính c a
β ộ ố ủ ườ ấ m t s enzyme c a con đ ng oxy hóa trong n m men Yarrowia lipolytica, đã
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 22
ạ ỏ ộ ố ứ ể ỗ ạ ộ nghiên c u lo i b m t s enzime ho t đ ng trong quá trình chuy n hóa chu i
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ạ ỏ ượ ắ ượ ệ ể ấ ng n. Khi lo i b đ c các enzyme này, đã nâng cao đ c hi u su t chuy n hóa
ấ ươ ợ ầ ớ ơ và tích lũy các h p ch t h ơ ng th m l n h n 4 l n [24].
ƯƠ Ệ ƯƠ CH NG 2: NGUYÊN LI U VÀ PH NG PHÁP
ấ
ế ị ụ
ườ
ứ
ệ 2.1. Nguyên li u, hóa ch t, thi
ụ t b , d ng c và môi tr
ng nghiên c u
2.1.1. Vi sinh v tậ
ủ ứ ấ Trong nghiên c u này, ch ng n m men Yarrowia lipolytica VTP5 đ cượ
ể ể ầ ầ ầ ủ ấ dùng đ chuy n hóa d u th u d u thành (cid:0) decalactone. Đây là ch ng n m men
ể ấ ướ ượ ậ ừ chuy n hóa ch t béo ( oleaginous yeast), tr đ c đây c phân l p t nem chua,
ệ ượ ư ộ ệ hi n đang đ c l u gi ữ ạ t ệ i B môn Công ngh Enzyme và Protein Vi n Công
2.1.2. Hóa ch tấ
ệ ẩ ự nghi p Th c ph m.
ả
ấ ử ụ
Các hoá ch t s d ng.
B ng 2.1
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 23
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
Hóa ch t ấ ố ồ Ngu n g c Hóa ch t ấ ố ồ Ngu n g c
HCl bão hòa 20% MeckĐ cứ Albumin SigmaMỹ
Yeast extract WakoNh t ậ NAOH 6M MeckĐ cứ
ầ Tryptone WakoNh t ậ ọ D u phá b t SigmaMỹ
Agar WakoNh t ậ MeckĐ cứ
D Glucose WakoNh t ậ MeckĐ cứ Etanol (cid:0) decalacton chu nẩ
Etyl axetat WakoNh t ậ Dietyl Ether MeckĐ cứ
Butanol MeckĐ cứ Tween 80 SigmaMỹ
ệ Malt extract WakoNh t ậ Castor oil Vi t Nam
2.1.3. Thi
t bế ị
KCL MeckĐ cứ Peptone WakoNh tậ
ế ị ụ ụ ứ ự ệ ệ Các thi t b ph v cho quá trình nghiên c u và th c hi n thí nghi m bao
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 24
ạ ế ị ư ồ ố ồ g m các lo i thi t b và ngu n g c nh sau:
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ả
ế ị
Thi
ứ t b trong nghiên c u
B ng 2.2
Ngu n ồ Ngu n ồ STT Thi t bế ị STT Thi t bế ị g cố g cố
ụ 1 Máy đo pH Ohaus ể Th y Đi n 15 Máy ly tâm Đ cứ
0C
Cân phân tích ụ ủ ạ 2 ể Th y Đi n 16 T l nh sâu 20 Nh tậ Ohaus
ộ ấ Máy khu y tr n 3 Máy khu y tấ ừ Nh tậ 17 OSI Vontex RotoLab
ủ ấ ủ ấ 4 T nuôi c y ậ ả Nh t B n 18 T c y vô trùng Nh tậ
Lò vi song Sanyo 5 Nh tậ 19 ủ ố T H t Mỹ EM
ế ị Thi t b cô quay chân 6 ắ ổ Máy l c n nhi ệ t Đ cứ 20 Th y sụ ỹ không Buchi RE 111
ệ ố H th ng GC ệ 7 T s yủ ấ Vi t Nam 21 Mỹ Thermo Finigan
ế ị ả Thi t b đông khô Máy nh Canon 8 22 Nh tậ Đ cứ Christ Isus 1200
ủ ấ 9 T c y Box 23 Máy đo OD Mỹ Đ cứ
ủ ấ T nuôi c y Sanio 24 ắ 10 Máy l c Gyrmax Mỹ Nh tậ
ể Kính hi n vi Trung ủ ấ 25 11 T s y Memmert Nh tậ Olympus Qu cố
ế ị ồ Thi t b lên men 5L ử N i kh trùng 26 12 Nga Mỹ New Brunswick Study
ế ị Máy ly tâm CeFa – Thi t b lên men 27 13 Nh tậ Đ cứ Z41, 60 lít/giờ 50L Marubishi
ế ị ư Thi ấ t b ch ng c t 14 Đ cứ Clevenger
ườ
2.1.4. Môi tr
ng (g/L)
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 25
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ườ
ữ ố
ng gi
gi ng (YMA)
* Môi tr
Yeast extract 3
Malt extract 3
Peptone 5
Glucose 10
Agar 20
ườ ạ ườ ng ho t hóa gi ng ố : Môi tr ể ị ng YM d ch th * Môi tr
Yeast extract 3
Malt extract 3
Peptone 5
Glucose 10
ườ * Môi tr ố ng nhân gi ng
Peptone 20
Yeast extrac 10
Glucose 20
ườ ng lên men * Môi tr
ầ ầ ầ D u th u d u (castor oil) 100
Pepton 20
Tween 80 1
ươ
2.2. Ph
ng pháp
ố
ắ 2.2.1. Nhân gi ng và lên men trên máy l c
* Nhân gi ngố
ấ ấ ố ừ ố ạ C y 10 vòng que c y gi ng t ứ ng th ch nghiêng vào bình tam giác ch a
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 26
ườ ố ở ể ạ 50mL môi tr ắ ng nhân gi ng, nuôi l c 200 v/p, trong 9h 27ºC đ đ t m t đ t ậ ộ ế
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
6/mL). Huy n d ch thu đ ề
ấ ị ượ ượ ấ bào cao nh t (6,5.10 c này đ ố c coi là gi ng c p 1 đ ể
* Lên men trên máy l cắ
ế ấ ố ườ ti p gi ng c y vào các môi tr ng lên men.
ệ ắ ượ ễ ế ố Vi c lên men trên máy l c, đ c di n ra sau ấ ti p gi ng c p 1 vào các bình
ứ ườ ờ ở ệ ộ ố ch a 100 mL môi tr ng lên men trong th i gian 4 ngày, nhi t đ 27ºC, t c đ ộ
ả
ố ộ ắ a) Kh o sát t c đ l c
ượ ế ả ắ l c 200 v/p. Các kh o sát sau đây đã đ ắ ố ớ c ti n hành đ i v i lên men l c:
ộ ắ ố ượ ả Các t c đ l c 140, 200, 250, 300 v/p đã đ ố ớ c kh o sát đ i v i 4 bình tam
ả
ườ
ầ
ng ban đ u: pH= 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7
b) Kh o sát pH môi tr
ứ ườ ỗ giác m i bình ch a 100 m L môi tr ng lên men .
4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7), đã đ
ượ ả ầ Các pH ban đ u khác nhau ( ố ớ c kh o sát đ i v i 7
ứ ườ ấ ố ỗ bình tam giác 500 mL, m i bình ch a 100 mL môi tr ế ng lên men. Ti p gi ng c p 1
ườ ế ở ố vào môi tr ng lên men, ti n hành lên men trong 4 ngày nhi ộ ắ ệ ộ 27ºC, t c đ l c t đ
ỉ ệ ế
ỉ ệ ấ
ố ti p gi ng (t l
c y)
ả c) Kh o sát t l
200 v/p.
ỉ ệ ế ả ể ố ườ Kh o sát các t l ti p gi ng 5%, 10%, 15%, 20%, th tích môi tr ng lên
ố ố ượ ế men. Nuôi gi ng trong 9h, Sau đó ti p gi ng vào các bình lên men đã đ ẩ c chu n
ỉ ệ ố ư ớ ờ ở ị ướ b tr c v i các t l gi ng nh trên. Lên men trong th i gian 4 ngày, nhi ệ ộ t đ
ả
ờ
d) Kh o sát th i gian lên men
ố ộ ắ 27ºC, t c đ l c 200 v/p.
ờ ượ ả ế Th i gian lên men đ c kh o sát là 3, 4, 5, 6 ngày, t ấ ả ượ t c đ ố c ti p gi ng
6 t
oC, l c ắ 200 v/p.
ớ ỉ ệ ế ầ ấ c p 1 v i t l 10% (6,5.10 bào/mL), có pH ban đ u là 5,4 27ở
ẻ n iồ 5L
2.2.2. Lên men theo m trên ố Các thông s lên men:
ỉ ệ ế ố ệ ể ồ N i lên men có th tích làm vi c 3 L; t l ti p gi ng 10% (v/v), nhi ệ ộ t đ
ấ ấ ườ ấ ấ ẫ ầ 270C, khu y 200 v/p, c p khí 0,7 L/L môi tr ng/phút; t n su t l y m u phân
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 27
ờ ộ ầ ể ờ tích: 8 gi ế m t l n; th i đi m k t thúc lên men: 64h.
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ơ ấ ẻ n iồ 5L
ượ ẻ ớ ộ ơ 2.2.3. Lên men theo m có ti p Khác v i lên men theo m đã đ ế d nầ c ch t, trên ở ụ c trình bày ấ ồ m c 2.2.2, n ng đ c ch t
ầ ầ ầ ầ ườ ộ ổ ồ ỉ (d u th u d u) ban đ u trong môi tr ứ ng lên men ch là 40% n ng đ t ng, t c
ầ ạ ứ ượ ế ầ ồ 120g/3L. Ph n còn l i, 60% t c 180g/3L đ c ti p d n vào n i lên men ở ờ th i
ấ ấ ớ ố ư ở ể ầ ẫ ộ đi m 16h lên men, v i t c đ 2mL/phút. T n su t l y m u nh lên men theo
m .ẻ
ẻ
n iồ 50L
2.2.4. Lên men theo m trên ố
ư Các thông s lên men nh sau:
Th tích làm vi c c a n i 30L
ệ ủ ồ ể
0C, c p khí 0,7L/L
ở ề ệ ấ ấ Lên men đi u ki n khu y 200 vòng/phút, nuôi 27
ấ ấ ộ ầ ế ầ ẫ ạ ờ T n su t l y m u 4h m t l n, k t thúc lên men t ể i th i đi m 64h
ơ ấ ẻ 2.2.5. Lên men theo m có ti p ế d nầ c ch t, trên n iồ 50L
ớ ở ụ ở ầ ử ụ ộ ầ ầ ầ ồ Khác v i m c 2.2.4 đây n ng đ d u th u d u s d ng ban đ u là
ộ ổ ứ ầ ồ ạ ượ 40% n ng đ t ng, t c 1200g/30L, ph n còn l i, 60% t c ứ 1800g/30L đ ế c ti p
ở ờ ớ ố ộ ể ầ ẫ ồ ầ d n vào n i lên men th i đi m 16h v i t c đ 20mL/phút ấ ấ , t n su t l y m u 4h
ộ ầ ế ạ ờ m t l n, k t thúc lên men t ể i th i đi m 64h.
ố ượ
ế
ế
ồ
ồ
ế
ằ
ầ
2.2.6. Đ m s l
ng t
bào b ng bu ng đ m h ng c u
ụ ế ế ầ ồ ồ ồ D ng c : ố ậ ụ bu ng đ m h ng c u Thomas. Bu ng đ m này có 16 kh i l p
ươ ố ớ ượ ỗ ố ỏ ướ ư ố ph ng, m i kh i l n đ c chia thành 16 kh i nh . Kích th c kh i nh sau:
ề ố Chi u sâu các kh i: 1/10mm
ề ạ ố ỏ Chi u dài c nh kh i nh : 1/20mm
2 = 1/400mm2
ệ ố ỏ Di n tích đáy kh i nh : (1/20)
3 = 1/4000mm3
ể ỏ ộ ố Th tích m t kh i nh : (1/20)
3 = 1/250mm3
ể ộ ố ớ Th tích m t kh i l n: 16x 1/4000mm
3= 0,064 mm3
ể ồ ế Th tích bu ng đ m: 16x 1/250mm
ế ẫ ả ả ỗ ớ ừ ế Ti n hành: Pha loãng m u (đ m b o m i ô l n có t ế 5 đ n 10 t bào). Dùng
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 28
ọ ủ ế ế ẫ ỏ ồ pipet hút nhanh 1 gi t m u nh lên bu ng đ m, ph lá kính. Soi đ m trên kính
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ố ượ ể ế ế ố ớ hi n vi. Đ m s l ng t bào trong 5 kh i l n.
ứ ế ả Tính k t qu theo công th c:
N= n/v.f
Trong đó:
ố ế ẫ ị N: s t bào/1mL d ch m u
3
ố ế n: s t ố ớ bào trung bình trong 1 kh i l n
ể ố ớ v: th tích kh i l n = 1/250mm
ệ ố ẫ f: h s pha loãng m u
ố ế ể ố ế ố ổ ẫ ộ ị Đ xác đ nh s t bào s ng/t ng s t ẫ ế bào trong m u: Ti n hành nhu m m u
ọ ẫ ọ ế ằ b ng xanh Metylen (1 gi t m u: 1 gi t xanh metylen), các t ế ẽ ắ bào ch t s b t màu
xanh.
ị
2.2.7. Lactone hóa d ch sau lên men
2.2.7.1. Lactone hóa có gia nhi
tệ
ạ ỏ ố ượ ạ ằ D chị sau lên men đã lo i b sinh kh i đ c h pH v 2 ề b ng HCl 6 N (để
γ ủ ụ ượ cho axit 4hydro decanoic đóng vòng thành decalctone), th t c này đ ự c th c
ắ ề ồ ệ ờ hi n b ng ằ l c đ u r i đun nóng đ nế 85 C 90 C trong th i gian 1030 phút.
ủ ụ ẽ ị ệ ứ ượ d ch lactone hóa 1 Sau th t c này s thu đ c (có gia nhi t) ch a γ
tệ
2.2.7.2. Lactone hóa không gia nhi
γ ị ượ ằ decalctone, d ch này đ ể c dùng đ tách chi ế decalctone t b ng dung môi.
ạ ỏ ượ ẫ ẫ ị D ch sau lên men đã lo i b sinh kh i ố đ c chia làm 3 m u: m u 1 gi ữ
ỉ ề ẫ ỉ nguyên không ch nh pH ỉ ; m u 2 ch nh pH v 1,5 ; m u 3ẫ ch nh pH ề v 2, sau thủ
ẽ ị ệ ượ d ch lactone hóa 2 ụ t c này s thu đ c (không gia nhi t) ch a ứ (cid:0) decalactone, d chị
ể ư ụ ấ ặ d chị này đ dùng tách chi ế (cid:0) decalactone (m c 2.2.9), ho c ch ng c t thành t
ụ ể ế ư ng ng t ụ ch a ứ (cid:0) decalactone (m c 2.2.8) cũng dùng đ tách chi t.
ấ ị
ư
ượ
c lacton
e hóa
2.2.8. Ch ng c t d ch lên men đã đ
ư ị D ch lactone hóa ở pH 2 nh trên, đ ư ượ ch ng c t ằ ấ b ng thi c ế ị Clevenger ở t b
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 29
ư ể ị ấ ử ươ ậ d ch ng ng t nhi ệ ộ 100ºC đ thu nh n t đ ụ ch a ứ các c u t h ơ . ng th m
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ằ
2.2.9. Tách chi
t ế (cid:0) decalactone b ng dung môi
D ch lactone hóa 1 và 2 cũng nh d ch ng ng t
ư ị ư ị ụ ụ ở , các m c 2.2.72.2.8, đ ượ c
γ ể ằ ậ ồ ế ằ dùng làm ngu n đ thu nh n decalactone b ng cách chi t rút b ng dung môi:
ỗ ị ượ ổ ẹ ắ 1,5 ml m i dung d ch đó đ c b xung 1,5 ml dung môi diethyl ether, l c nh 1,5
ể ầ ị ị d ch chi ấ phút, đ yên và dùng pipet hút l y ph n d ch phía trên chính là ế ch a ứ (cid:0) t
decalactone.
ạ ỏ
ỏ ị
2.2.10. Lo i b dung môi kh i d ch chi
ế t
ị ế ượ ở ụ ượ ạ ỏ ằ ộ D ch chi t thu đ m c 2.2.9 đ c c lo i b dung môi b ng c t crudemar
ặ ế ị ạ ộ ủ ằ ho c b ng thi t b cô quay chân không buchi RE, nguyên lý ho t đ ng c a hai
ế ị ư ị ầ ặ ầ thi t b này nh sau: d ch chi ế ượ t đ c hút vào bình c u crudema ho c bình c u cô
ệ ộ ớ ế ủ quay c a thi ế ị ở t b nhi t đ 45ºC, t i khi diethyl ether bay h t. Dùng pipet hút
γ ạ ượ ằ ượ l ng ị d ch cô còn l i (ch a ứ decalactone) đ c phân tích b ng GC.
ạ
ị
ế
ặ
2.2.11 Làm s ch d ch chi
t cô đ c ế
ạ
ị
ặ ằ
ử
ề t cô đ c b ng cách r a ki m
2.2.11.1 Làm s ch d ch chi
γ ượ ằ ị D ch chi tế cô đ cặ ch a (ứ decalactone ) đ ạ c làm s ch b ng cách r a ử b ngằ
ế ạ ằ ạ ỏ ồ ki mề (NaOH pH 1112), sau đó chi i b ng t l diethyl ether, r i lo i b dung môi
ơ ế ế ị ằ b ng thi ế ị cô quay chân không, đ n khi dung môi bay h i h t. D ch thu đ t b ượ c
ượ ế ạ ẽ ượ ử ề ằ ị d ch chi t s ch 1 ủ ụ sau th t c này đ ọ c g i là (r a b ng ki m) s đ ị c đ nh
γ ặ ố ượ l ng decalactone ả ủ ụ ằ b ng GC ho c dùng cho th t c cu i cùng: đánh giá c m
quan.
ạ
ị
ế
ặ ằ Na2SO4 khan
t cô đ c b ng
2.2.11.2 Làm s ch d ch chi
ặ ị ượ ệ ố ỷ ệ ồ ị D ch sau cô đ c đ ồ c pha vào c n tuy t đ i (t l 20 ml d ch c n/50 ml
ặ ồ ờ ế ị ớ ạ ỏ ị d ch cô đ c) r i lo i b dung môi nh thi t b cô quay chân không t ồ i khi c n và
ạ ơ ế ị ượ ế ụ ượ diethyl ether còn sót l i bay h i h t, d ch thu đ c ti p t c đ ằ ạ c làm s ch b ng
Na2SO4) .
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 30
ị ượ ượ ế ạ ị d ch chi t s ch 2 Na2SO4 khan. D ch thu đ ủ ụ c sau th t c này đ ọ c g i là (b ngằ
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ả
2.2.12. Đánh giá c m quan
ự ưở ố ượ ấ ố Đánh giá s sinh tr ng n m men thông qua kh i l ng sinh kh i.
ề ủ ự ồ ắ ị ắ Đánh giá màu s c d ch sau lên men thông qua s đ ng đ u c a màu s c
trong các bình sau lên men.
ị
ằ
ắ
2.2.13. Phân tích đ nh l
ượ (cid:0) decalactone b ng s c ký khí
ng
ử ụ ươ ắ ượ S d ng ph ng pháp s c ký khí (Gas ChromatographyGC) đ ự c th c
ệ ạ ự ộ ệ ọ hi n t i Trung tâm phân tích, Vi n Khoa h c hình s , B Công An
ẫ ượ ơ ộ Nguyên lý: M u đ c phân tích GC b m vào trong c t và theo dòng khí
ườ ơ ư ộ ắ ế ẫ ộ mang (th ng là nit ) đ a đ n c t s c ký (pha tĩnh). M u khi qua c t này s ẽ
ượ ấ ầ ượ ụ ấ ỏ ộ đ c h p ph lên trên pha tĩnh đó. Sau đó, các ch t l n l t tách kh i c t theo
ượ ở ầ ừ ệ ậ ậ ượ dòng khí ra và đ c ghi nh n b i đ u dò. T các tín hi u nh n đ c, máy tính
ả ằ ế ể ệ ắ ồ ượ ấ ượ ỗ ẽ ử s x lý và bi u hi n k t qu b ng s c ký đ . Hàm l ng m i ch t đ c xác
ờ ờ ượ ị ư ắ đ nh nh th i l ồ ng l u trên s c ký đ .
ệ : ự Th c hi n
ẫ ổ ạ Dùng pipet s ch hút chính xác 100 μl m u phân tích GC sau đó b xung
ạ ố ị dung d ch chu n: ẩ γdecalactone (mg/mL), cho vào ng Eppendort s ch đã thanh
ẫ ố ệ trùng có đánh s kí hi u m u phân tích GC.
ố ế ị ắ Thông s thi t b s c kí:
ế ị + Thi t b GC Aligent 6890 A/ USA
ể ẫ + Th tích m u tiêm: 2 μl
+ Khí mang: N2
2 + O2
ọ ử ố ủ + Detector ion hóa ng n l a (FID), khí đ t c a FID: H
1: 30μm, nhi
ộ ướ ộ + C t HP ệ ộ ừ OC 250OC trong 10 phút, kích th t đ t 80 c c t 30 μm
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 31
x 250μm x 0.25 μm.
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ơ ồ
S đ quá trình
lên men thu nh n ậ (cid:0) decalactone:
ấ ủ Ch ng n m men nghiên c uứ ế K t qu : l ng γ
ả ượ decalactone
ạ Ho t hóa
ạ Tinh s ch, sau đó phân tích GC
ị ườ ng YM
D ch môi tr ứ ấ ch a n m men
ị ế D ch chi ứ ặ t cô đ c (ch a γ decalactone)
Nhân gi ngố
ng nhân
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 32
ị ố ườ D ch môi tr ứ ấ gi ng ch a n m men
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ạ ỏ Lo i b dung môi Lên men
ị D ch chi
t (ch a γ ế ứ decalactone) ề
ị Huy n d ch sau lên men
t b ng
ế ằ Chi dung môi
ạ Ly tâm (10000 v/p) ố lo i sinh kh i ị ấ ư D ch ch ng c t
t b ng ị ế ằ Chi dung môi ạ ố D ch sau lên men (đã lo i sinh kh i)
ư ấ Ch ng c t
Lactone hóa b ng ằ HCl pH 1,52
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 33
ị D ch lactone hóa
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ƯƠ
Ậ
Ế
CH
Ả NG 3: K T QU VÀ BÀN LU N
ự
ọ
ề
ắ ệ 3.1. L a ch n đi u ki n lên men trên máy l c
ọ ố ộ ắ ự 3.1.1. L a ch n t c đ l c
ế ộ ế ậ ấ ắ ộ Yarrowia lipolytica là n m men hi u khí b t bu c, vì v y ch đ thông khí
ưở ế ớ ưở ẽ ả s nh h ả ng l n đ n kh năng sinh tr ng và tích t ụ γdecalactone trong môi
ườ ả ượ ế ấ ố ả tr ng lên men. K t qu đ ộ ắ c trình bày trong B ng 3.1. Cho th y t c đ l c
ợ ượ thích h p cho ch ng ủ Y. lipolytica VTP5 là 200 vòng/phút, l ng γdecalactone tích
ổ ố ả ủ ộ ắ ự ự ế ấ ụ ạ t đ t 2,164 g/L. K t qu c ng cho th y theo s thay đ i t c đ l c, thì s tăng
ả ượ ố ượ ễ ề ề hay gi m l ng sinh kh i và l ng γdecalactone di n ra cùng chi u. Đi u đó
ỉ ớ ợ ằ ượ ẩ ả ố ạ ượ ở ố ư ở ộ ch m i g i ý r ng l ng s n ph m t i đa đ t đ t c đ 200 v/p nh c đây
ố ộ ắ ấ ự ể ưở ủ ấ ố ả ấ có th là do t c đ l c y s sinh tr ng c a n m men là t t nh t. Còn kh năng
ỗ ế ủ ấ ở ố ộ ắ ấ ẫ ẩ ạ ả t o s n ph m c a m i t bào có là cao nh t t c đ l c y không thì v n là câu
ỏ ầ ứ ơ ướ ế ượ ỏ ể h i đ ng , c n có các nghiên c u chính xác h n, tr c h t là tính l ả ng s n
ẩ ơ ố ị ph m trên đ n v sinh kh i khô.
ả Ả ưở ủ ố ộ ắ ế ệ ấ nh h ng c a t c đ l c đ n hi u su t lên men B ng 3.1.
ượ
ố ướ
ố ộ ắ T c đ l c
L
ng sinh kh i
t (g/L)
ượ (cid:0) decalactone (g/L) L
ng
(vòng/phút)
140 38,0 1,892 ± 0,016
200 41,0 2,164 ± 0.025
250 37,5 1,791 ± 0.033
300 35,0 1,477 ± 0,027
ự ườ ọ 3.1.2. L a ch n pH môi tr ng lên men
ượ ả ấ ợ ố ệ S li u đ ấ c trình bày trong b ng 3.2 cho th y: pH 6,0 là thích h p nh t
ưở ể ầ ầ ấ cho Y lipolytica VTP5 sinh tr ơ ầ ng và chuy n hóa d u th u d u thành ch t th m
γ γ ớ ượ ố ướ ị decalactone, v i l ng sinh kh i ấ ạ t và decalactone đ t giá tr cao nh t,
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 34
ấ ươ ứ t ng ng là 48,5 g/L và 2,286 g/L sau 4 ngày nuôi c y.
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ả Ả ưở ủ ườ ế ệ ấ nh h ng c a pH môi tr ng đ n hi u su t lên men B ng 3.2.
ế
pH khi k t thúc lên men
Sinh kh i
ố ướ t
ng
pH môi ngườ
tr
(g/L)
4,0 4,5 5,0 5,5 31,0 35,0 41,0 45,0
ượ (cid:0) decalactone L (g/L) 1,158 ± 0,018 1,732 ± 0,027 2,184 ± 0,038 2,212 ± 0,035
3,80 4,12 4,32 4,50 4,65
6,0 6,5 7,0 4,70 4,85 48,5 43,0 35,5 2,286 ± 0,032 1,836 ± 0,026 1,432 ± 0,014
ủ ề ấ ỗ ườ ợ M i ch ng n m men đ u có pH môi tr ự ổ ng thích h p riêng cho s t ng
ể ở ề ệ ế ấ ả γợ h p decalactone. Có th đi u ki n pH này, t ộ bào n m men s n sinh ra m t
ấ ươ ố ườ ề ch t nhũ t ng hóa giúp lipit hòa tan t t trong canh tr ng. Đi u này đã đ ượ c
ề ậ ự ạ ạ ộ ọ ướ Pagot cùng c ng s đã đ c p. Theo h , khi h t lipit đ t kích th ấ ỏ c nh nh t,
ấ ạ ậ ợ ủ ệ ế ề ệ ớ di n tích ti p xúc riêng c a chúng là l n nh t, t o đi u ki n thu n l i cho s ự
ớ ế ế ấ ạ ự ả ẩ ấ ổ ti p xúc v i t ứ ấ bào n m men, giúp cho s trao đ i ch t t o s n ph m th c p
ế ễ ạ ơ trong t ơ bào di n ra nhanh h n, m nh h n [31].
ự ọ ố ờ 3.1.3. L a ch n th i gian nhân gi ng
ấ ố ở ề ệ Trong quá trình nhân gi ng c p 1, ắ đi u ki n l c 200 v/p, nhi ệ ộ t đ
ậ ộ ấ ạ ế 27oC thì đ t m t đ cao nh t sau 9 gi ờ ổ ở ứ 6,5 x 106 t m c tu i, bào/mL (b ngả
ừ ờ ờ ở ế ế ở ạ ế ẩ 3.3) t ể th i đi m 12 gi ầ tr đi, h u h t t bào d ng khu n ty, vì th chúng tôi
ị ượ ậ ộ ế ươ ế ồ ể không th xác đ nh đ c m t đ t bào theo ph ế ng pháp đ m trong bu ng đ m
ệ ấ ầ ậ ố ớ ờ ồ h ng c u trong lu n văn này. Tuy nhiên, vi c nhân gi ng c p 1, v i th i gian lâu
ờ ể ể ượ ậ ộ ế ế ơ h n 9 gi đ có th có đ c m t đ t bào cao h n ơ 6,5 x 106 t bào/mL là không
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 35
ế ố ờ ượ kinh t vì tiêu t n thêm th i gian và năng l ng.
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ả ự ế ổ ậ ộ ế ố ờ S bi n đ i m t đ t bào theo th i gian nhân gi ng B ng 3.3.
ổ ố
ờ Tu i gi ng (gi )
ậ ộ ế M t đ t bào
Hình thái t bàoế
(106/mL) 1,0 3,0
0 6
ộ ố ạ ứ ứ ứ ứ ứ ứ ẩ Hình tr ng, tr ng dài Hình tr ng, tr ng dài Hình tr ng, tr ng dài, m t s t o khu n ty
ế
ượ
ế
ầ ế ạ
ẩ
Ghi chú: Không đ m đ
c vì t
bào h u h t t o thành khu n ty
ầ ế ạ ầ ế ạ ẩ ẩ 6,5 H u h t t o khu n ty H u h t t o khu n ty 9 12 18
ọ ỷ ệ ấ ự ố 3.1.4. L a ch n t l c y gi ng
ả Ả ưở ế ệ ố nh h ng c a t ủ ỷ ệ ấ l ắ ấ c y gi ng đ n hi u su t lên men trên máy l c B ng 3.4.
ỷ ệ ố
ố ướ
T l
gi ng (%, v/v)
Sinh kh i
t (g/L)
ng
ượ (cid:0) decalactone L (g/L) 1,918 ± 0,018
5
38,5 49,5
2,679 ± 0,042 1,734 ± 0,019 1,527 ± 0,032 51,5 45,0 10 15 20
ạ ấ ố ớ ế ệ ắ ề V i gi ng c p 1 đã đ t m t đ ậ ộ 6,5 x 106 t bào/mL trong các đi u ki n l c nh ư ở
ụ ỷ ệ ấ ổ ừ ố ế ượ các m c 3.1.3, khi t c y gi ng thay đ i t l 5 đ n 20% (v/v) thì l ng sinh
ố ượ ả ả ẩ ổ ượ ả kh i và l ư ng s n ph m thay đ i nh trong b ng 3.4. Theo đó l ẩ ng s n ph m
ứ ứ ấ ố ạ đ t m c cao nh t 2,679 g/L ng v i t ớ ỷ ệ ấ l c y gi ng 10% (v/v) .
ả ượ ả ẩ ả ố Cũng theo trong b ng 3.4, ở ỷ ệ ố l gi ng 15% thì l t ng s n ph m gi m xu ng,
ượ ố ượ ả còn l ng sinh kh i thì tăng lên so v i t ớ ỷ ệ ố l gi ng 10%, l ế ụ ẩ ng s n ph m ti p t c
ả ỷ ệ ố ệ ượ ữ ả ố gi m khi t gi ng tăng lên 20%, còn sinh kh i cũng gi m. Nh ng hi n t l ng này
ể ượ ả ớ ỉ ệ ố ằ ỷ ệ ố có th đ c gi i thích r ng, so v i t l gi ng 10% thì t ư ủ ạ gi ng 5% ch a đ t o l
ượ ố ầ ế ể ạ ẩ ỷ ệ ố ạ ra l ng sinh kh i c n thi ề ả t đ t o nhi u s n ph m; t gi ng 15% t o ra quá l
ầ ả ủ ế ề ẩ ạ ố ộ nhi u sinh kh i khi n chúng phân h y (tiêu dùng) m t ph n s n ph m đã t o ra; và
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 36
ượ ơ ấ ả ố ố ớ ỷ ệ ố v i t l gi ng 20% thì l ả ng sinh kh i sinh ra ph i gi m xu ng vì c ch t không
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ầ ả ụ ộ ẩ ặ ủ đ cho chúng, m c dù chúng đã tiêu th m t ph n s n ph m.
ự ờ ọ 3.1.5. L a ch n th i gian lên men
ả ế ề ệ ả ấ ớ K t qu trình bày trong b ng 3.5 cho th y, v i các đi u ki n lên men đã
ụ ủ ọ ả ổ ự l a ch n trong m c 3.1.1 3.1.4, ch ng ợ Y. lipolytica VTP5 có kh năng t ng h p
ở ứ ấ ớ ượ l ng γ m c cao nh t là 2,835 g/L sau 4 ngày lên men. T i ngày decalactone
ượ ể ầ ả ẩ ả ố ộ ở ị ứ th 5, l ng s n ph m gi m xu ng, có th là do b tiêu dùng m t ph n b i các
ế t bào.
ả Ả ưở ấ ổ ủ ế ệ ờ ợ nh h ng c a th i gian lên men đ n hi u su t t ng h p γ B ng 3.5.
ủ decalactone c a ch ng ủ Y. lipolytica VTP5
ờ
ng
Th i gian lên men (ngày) 3 4 5
ượ (cid:0) decalactone (g/L) L 1,753 ± 0,028 2,835 ± 0,043 2,451 ± 0,037
Ứ ụ ươ ầ ơ ấ ế 3.1.6. ng d ng ph ng pháp lên men ti p d n c ch t (fedculture)
ộ ố ứ ượ ố ể ả ớ ả ưở Theo m t s nghiên c u đã đ c công b , đ gi m b t nh h ng kìm
ế ự ủ ầ ầ ầ hãm c a ricinoleic acid/methyl ricinoleate trong d u th u d u đ n s sinh tr ưở ng
ể ầ ấ ả c a n m men chuy n hóa d u này thành γ ủ decalactone, các tác gi ử ụ đã s d ng
ươ ặ ươ ế ph ng pháp lên men 2 pha [39][41], ho c ph ầ ơ ấ ng pháp lên men ti p d n c ch t
ứ ử ụ ươ ứ ế (fed – batch) [34]. Chúng tôi ti n hành nghiên c u s d ng ph ng pháp th hai
ứ ệ ườ ầ này, theo đó có 3 công th c thí nghi m: môi tr ứ ng ban đ u ch a 20, 40, 60 g
ầ ầ ờ ượ ế ượ ầ ầ ầ d u th u d u/L, sau 24 gi lên men, đ c ti p thêm l ầ ng d u th u d u còn l ạ i.
Ở ứ ố ứ ườ ứ ầ ầ ầ ừ công th c đ i ch ng, môi tr ng ch a 100 g d u th u d u/ L ngay t ầ ban đ u.
ế ấ ả ươ ầ ơ ấ ứ ả K t qu trong b ng 3.6 cho th y ph ế ng th c lên men ti p d n c ch t đã
ệ ấ ở ả nâng cao hi u su t lên men c a ủ Y. lipolytica VTP5; ệ ứ c 3 công th c thí nghi m
ố ượ ớ ở ẩ ả ứ ố ứ ượ l ng sinh kh i và l ề ng s n ph m đ u tăng so v i công th c đ i ch ng riêng
ở ả ượ ứ ố ượ ả ẩ ạ công th c “40+60” c l ng sinh kh i và l ứ ự ề ng s n ph m đ u đ t m c c c
ứ ớ ạ đ i so v i các công th c khác.
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 37
ứ ứ ế ả ỏ ầ ầ ả ưở ứ K t qu nghiên c u ch ng t ầ d u th u d u có nh h ng c ch đ n s ế ế ự
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ưở ủ ấ ả ượ sinh tr ng c a n m men, thông qua đó làm gi m l ng γ cượ decalactone thu đ
ờ ươ ả ố ở ệ ắ nh lên men. Ph ng pháp fedbatch có hi u qu t t ư ừ quy mô máy l c nh v a
ẽ ượ ứ ụ ở ầ ồ trình bày, s đ c ng d ng ế quy mô n i lên men 5L và 50L trong các ph n ti p
theo.
ả Ả ưở ủ ượ ầ ử ụ ế ầ ầ ầ nh h ng c a hàm l ệ ng d u th u d u s d ng ban đ u đ n hi u B ng 3.6.
Sinh kh i
t (g/L)
Công th cứ ầ
ấ ổ ợ ủ su t t ng h p γ decalactone c a ch ng ủ Y. lipolytica VTP5
ầ
ầ ầ ầ ầ ầ ĐC: 100 g/L d u th u d u MT ban đ u: 20 g/L d u th u d u;
ố ướ 48,5 50,5
(cid:0) decalactone (g/L) 2,835 ± 0,039 3,386 ± 0,047
ầ ầ ờ ế ti p thêm 80 g/L (20+80) sau 24 gi ầ ầ MT ban đ u: 40 g/L d u th u d u; 53,5 3,643 ± 0,042
ầ ầ ờ ế ti p thêm 60 g/L (40+60) sau 24 gi ầ ầ MT ban đ u: 60 g/L d u th u d u; 51,0 3,094 ± 0,034
ờ ế sau 24 gi ti p thêm 40 g/L (60+40)
ắ ế ả ự ọ ề ệ 3.1.7. Tóm t ắ t k t qu l a ch n đi u ki n lên men trên máy l c
ả ố ượ ự ọ Trong B ng 3.7 có nêu lên các thông s đã đ ộ c l a ch n m t cách riêng l ẻ
ể ạ ượ ượ ố ị ố ấ ả ẩ (trong khi c đ nh các thông s khác) đ đ t đ c l ng s n ph m cao nh t. Các
ượ ự ẽ ượ ế ụ ụ ở ố thông s đã đ ọ c l a ch n này s đ c áp d ng ti p t c cho lên men quy mô
5L và 50L.
ả ả ự ế ề ệ ổ ợ T ng h p k t qu l a ch n đi u ki n lên men sinh γ ọ decalactone nhờ B ng 3.7.
ở ắ Y. lipolytica VTP5 quy mô máy l c
ề
ợ
ố
ẻ
ệ Đi u ki n lên men
Thông s thích h p (riêng l
)
ượ (cid:0) decalactone L
ng
ố ộ ắ T c đ l c
ngườ ấ
(g/L) 2,164 ± 0,025 2,286 ± 0,032 2,679 ± 0,042 2,835 ± 0,043 3,643 ± 0,042
ầ ầ pH môi tr ỷ ệ ố gi ng c p 1 T l ờ Th i gian lên men Lên men có ti pế 200 vòng/phút 6 10% ( nuôi 27oC, 200 v/p, 9h) 4 ngày ầ ầ 40 g/L d u th u d u ban đ u, sau
ờ ổ 24 gi
ầ ơ ấ d n c ch t ể ấ ố ờ Năng su t chuy n hóa (mg γ 37,95 b sung 60 g/L decalactone /gi ) = (s mg
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 38
ạ ể ờ ờ γdecalactone t i th i đi m c c đ i) nhân ự ạ / (9 gi
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ự ạ ẩ ố ờ ể ạ ả gi ng + th i gian đ đ t s n ph m c c đ i)
3643=37,95x(9+88)
ứ ươ ứ ở 3.2. Nghiên c u các ph ng th c lên men quy mô 5L và 50L
ở 3.2.1. Lên men quy mô 5L
ươ ứ ố ế ng th c (batch culture) không kh ng ch pH và 3.2.1.1. Lên men theo ph
DO
ơ ả ệ ề ồ ồ Các đi u ki n lên men c b n g m: n i lên men có dung tích 5L (dung tích
ườ ứ ầ ầ ỷ ệ ố ấ làm vi c ệ 3L), môi tr ng ch a 100 g/L (10%) d u th u d u ầ , t gi ng c p 1 là l
ấ ấ ộ ố ườ 10%, t c đ khu y 200 vòng/phút, c p khí 0,7 L/L môi tr ng/phút, nhi ệ ộ t đ
ớ ươ ứ ế ế 27oC. V i ph ố ng th c lên men “không kh ng ch pH và DO”, k t qu ả (Hình
3.1) cho th y:ấ
ườ ờ ầ Môi tr ng lên men sau khi thanh trùng có pH 5,42. Trong 8 gi đ u pH
ẹ ả ố ấ ị ở ờ gi m nh xu ng 5,02 ạ ; sau đó tăng nhanh, đ t giá tr cao nh t là 7,0 24 gi lên
ế ế ả ầ ở men, r iồ gi m d n đ n 4,53 khi k t thúc lên men 96 gi ờ .
ượ ườ ắ ầ ạ Hàm l ng ôxy hòa tan trong môi tr ng đ t 75,3% khi b t đ u lên men ,
ả ẹ ầ ả ừ ố gi m nhanh xu ng 5% sau 16 gi ờ, sau đó gi m nh d n và gi ữ ở 0,2% t 64 gi ờ
ế ở ờ ề ấ ấ Y. lipolytica ế cho đ n khi k t thúc lên men 96 gi . Đi u này cho th y n m men
ưở ứ ộ ụ ớ VTP5 sinh tr ng và tiêu th ôxy v i m c đ cao.
ấ ạ ị ố ấ Sinh kh i n m men ố tăng nhanh, đ t giá tr cao nh t là 5,31 gam sinh kh i
ướ ở ờ ế ẹ ả t/100 mL (53,1 g/L) 48 gi , sau đó gi m nh còn 4,85 g/100 mL khi k t thúc
lên men.
γ ắ ầ ượ ụ ườ decalactone b t đ u đ c tích t trong môi tr ng lên men sau 24 gi ,ờ
ấ ạ ầ ả ị tăng d n và đ t giá tr cao nh t là 4,264 g/L sau 88 gi ờ lên men, sau đó gi m còn
ở ờ ệ ượ ế ấ ế 3,920 g/L khi k t thúc lên men 96 gi . Không có hi n t ng t bào n m men b ị
γ ế ộ ồ ườ ầ ch t khi n ng đ decalactone trong môi tr ấ ng nuôi c y tăng d n.
Nh v y ư ậ , khi lên men theo m ẻ ở n iồ lên men dung tích 5L, theo ph ngươ
ứ ế ố ọ ầ ệ ể ấ ầ th c “không kh ng ch pH và DO”, ầ hi u su t chuy n hóa sinh h c d u th u d u
γ ắ ạ thành decalactone tăng 50% (đ t 4,264 g/L) so v i ớ lên men trên máy l c (2,835
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 39
ố ế ấ ấ ớ g/L). Sinh kh i t ề bào n m men tăng không nhi u so v i khi nuôi c y trên máy
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ẫ ờ ắ l c. Tuy nhiên, th i gian lên men v n kéo dài.
ượ ư ả ẩ ớ L ng s n ph m tăng lên nh trên, so v i lên men trên máy l c ắ có th ể liên
ụ ế ụ ấ ự ươ ấ quan đ n tác d ng t ố ủ ự khu y, s c khí t c a s : tính ch t nhũ hóa và s t ng tác
ườ ủ ầ ỏ ượ ả ế ệ ầ trong các pha môi tr ng l ng c a d u và n ướ đ c ế c c i thi n, khi n d u ti p
ố ơ ớ ế ể ượ ể ế ả xúc t t h n v i t bào đ đ c chuy n hóa thành s n ph m ứ ẩ . K t qu nghiên c u ả
ủ ề ớ ả ủ c a chúng tôi phù h pợ v i nhi u công trình c a các tác gi khác [ 7].
ộ ọ ươ ứ lên men theo ph ng th c batch culture “không Hình 3.1. Đ ng h c quá trình
ố ế kh ng ch pH và DO” trên n iồ lên men dung tích 5L.
ể ệ ể ấ ầ ầ ầ ơ Đ nâng cao h n n a ữ hi u su t chuy n hóa d u th u d u thành γ
ứ ươ ứ ế ụ decalactone, chúng tôi ti p t c các nghiên c u các ph ng th c lên men khác
ầ ướ nhau nh ư trong các ph n d i đây.
ươ ứ ố ế 3.2.1.2. Lên men theo ph ng th c Batch culture “k hông kh ng ch pH
ố ế có kh ng ch DO ”
ươ ứ ế ấ ả Theo ph ng th c này, k t qu nêu trong hình 3.2 A cho th y :
ườ ạ ầ ố + DO trong môi tr ả ng lúc đ u đ t 97,5%, gi m xu ng 48,2% sau 8 gi ờ
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 40
ể ữ ượ ườ ị lên men. Sau đó đ gi cho hàm l ng DO trong môi tr ả ng có giá tr kho ng
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ấ ố ộ ượ ả ộ 40%, t c đ cánh khu y đ c tăng lên và dao đ ng trong kho ng 300 500
vòng/phút.
ố ấ ố ướ ạ + Sinh kh i n m men tăng nhanh, đ t 5,58 gam sinh kh i t/100 mL sau
ờ ế ụ ẹ ế ữ ở ứ 40 gi lên men và ti p t c tăng nh đ n 6,30 g/100 mL và gi ế m c này cho đ n
ế ở khi k t thúc lên men 96 gi ờ .
γ ờ ấ + L ạ ngượ decalactone đ t 5,22 g/Lít sau 72 gi nuôi c y, tăng 22,4% so
ươ ề ỉ ườ ầ ớ v i ph ng th c ứ khi lên men không đi u ch nh pH môi tr ng ban đ u và không
ố kh ng ch ế DO (4,264 g/L).
ươ ứ ố ế 3.2.1.3. Lên men theo ph ng th c Batch culture “có kh ng ch pH và
DO”
ả ủ ế ấ ươ ứ ư Hình 3.2 B cho th y k t qu c a ph ng th c lên men này nh sau:
ố ạ ứ ế ấ ả + Sinh kh i đ t m c cao nh t 7,887,85 g/100mL trong kho ng 56 đ n 64 gi ờ
ớ ươ ứ ế ố ố lên men, tăng 24,3% so v i ph ế ng th c “không kh ng ch pH có kh ng ch DO”
ẹ ế ở ờ ờ ế ả (6,30g/100mL), sau đó gi m nh đ n 7,55g/100mL ể th i đi m 96 gi (k t thúc lên
men).
γ ượ ạ ờ + L ng decalactone đ t 6,234 g/L sau 64 gi ớ lên men, tăng 46% so v i
ứ ế ế ố ố ở ươ ph ng th c không kh ng ch pH và có kh ng ch DO (5,22 g/L).
ươ ứ ượ Nh v y, ư ậ trong ph ng th c này, nh s ờ ự tăng l ng không khí vào môi
ườ ố ượ tr ng ố ị để c đ nh và kh ng ch ế hàm l ng ôxy hòa tan, mà s ự sinh tr ngưở c aủ
γ ạ ơ ượ ữ ấ n m men m nh h n và hàm l ng decalactone cũng tăng ơ theo. H n n a, k hi
ố ượ ả ườ ợ ố kh ng ch ế hàm l ng ôxy hòa tan, trong c hai tr ng h p không kh ng ch ế và
γ ườ ở ị ượ ả ố có kh ng ch ế pH môi tr ng ợ l giá tr thích h p, ng s n ph m ẩ decalactone
ượ ươ ờ ề đ u tăng, và th i gian lên men đ ắ c rút ng n đáng k ớ ể so v i ph ứ ng th c Batch
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 41
ụ ố ế culture (không kh ng ch pH và DO m c 3.2.1.1) .
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
(A)
(B)
ộ ươ ứ theo ph ng th c batch culture “ không ọ Hình 3.2. Đ ng h c quá trình lên men
ố ế ố kh ng ch ố ế pH có kh ng ch DO” (A), và “có kh ng ch ế pH và DO” (B) quy mô 5L
ươ ơ ng th c ứ ti p ế d nầ c ch t ấ (fed – batch 3.2.1.4. Lên men theo ph
culture), quy mô 5L
ươ ộ ố ề ứ ệ ượ Trong ph ng th c lên men này, m t s đi u ki n lên men đ ụ c áp d ng
ư ồ ả ự ụ ế ệ ề ắ ọ ừ t các k t qu l a ch n đi u ki n lên men trên máy l c (m c 3.1) nh : n ng đ ộ
ủ ầ ầ ầ ườ ờ ầ ban đ u c a d u th u d u trong môi tr ng là 40g/L, sau 16 gi lên men đ ượ c
ớ ố ộ ế ế ố ở ở ti p thêm 60g/L v i t c đ 2ml/phút; không kh ng ch pH 6 và DO 40%.
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 42
ế ấ ả K t qu trình bày trong hình 3.3 cho th y:
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ưở ủ ễ ấ ơ ờ Sinh tr ng c a n m men di n ra nhanh h n trong 16 gi ầ lên men đ u
ẻ ử ụ ớ ườ ộ ầ ứ ầ tiên so v i lên men theo m s d ng môi tr ầ ng ch a toàn b d u th u d u
ư ậ ươ ứ 100g/L ngay t ừ ầ (hình 3.2). Nh v y ph đ u ng th c fedbatch culture có l ẽ đã
ủ ơ ả ưở ủ ấ gi m b t ớ sự kìm hãm c a c ch t ấ đ i v i ố ớ sinh tr ố ng c a n m men. Sinh kh i
ạ ự ạ ố ươ ườ ờ ế t bào đ t c c đ i 8,0 gam sinh kh i t i/100 mL môi tr ng sau 56 gi lên men
ữ ế ế ị ở và gi nguyên giá tr này đ n khi k t thúc lên men 112 gi ờ .
γ ắ ầ decalactone b t đ u đ ượ ượ c đ c tích t ụ m c ở ứ 0,254 g/L t ể iạ th i đi m ờ
ẻ ấ ớ ơ 12 gi ớ ờ lên men, s m h n so v i nuôi c y theo m (24 gi ờ ở ầ hình 3.2) và tăng d n,
9
8
7
6
5
) L m 0 0 1 / g ( t
ớ ư
i
4
3
) L / g ( e n o t c a l a c e d γ
ố h k h n i S
2
ố ướ Sinh kh i t γ decalactone
1
0
0
8
16
24
32
40
48
56
64
72
80
88
96
104 112
ờ
ờ Th i gian lên men (gi )
ờ ữ ổ ế ờ ạ đ t 7,343 gam/Lít sau 96 gi lên men r iồ gi nguyên không thay đ i đ n 112 gi .
ộ ọ ươ ứ ng th c Fedbatch culture, có Hình 3.3. Đ ng h c quá trình lên men theo ph
ế ố ở kh ng ch pH và DO, quy mô 5L
ư ậ ớ ươ ơ ấ ầ ứ ẻ Nh v y, v i ph ng th c lên men theo m có ti p ầ ế d nầ c ch t d u th u
ể ầ ầ ầ ầ d u, c s ả ự sinh tr ấ ngưở c a ủ n m men và s ự chuy n hóa d u th u d u thành γ
ề ẻ ấ ả ớ decalactone đ u tăng so v i nuôi c y theo m (B ng 3. 8). Ngoài ra, sau khi đ tạ
γ ị ự ạ ụ ở ấ ặ ị giá tr c c đ i, decalactone không b phân h y/ ủ (tiêu th ) b i n m men, m c dù
ố ớ ượ l ng sinh kh i không suy gi m ả (xem hình 3.3 so v i hình 3.1 và 3.2) . Theo
ươ ứ ặ ơ ph ờ ng th c fedbatch culture, m c dù th i gian lên men có dài h n (đ đ t t ể ạ ớ i
ự ạ ư ề ả ẩ ọ ượ ề ượ l ng s n ph m c c đ i), nh ng đi u quan tr ng là l ơ ng này cao h n nhi u so
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 43
ươ ư ừ ề ậ ứ ữ ả ơ ớ ủ v i c a 3 ph ng th c batch culture (b ng 3.8). H n n a, nh v a đ c p trên
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ứ ự ứ ạ ạ ượ ữ γ đây, sau khi decalactone đ t m c c c đ i, m c này đ c gi ờ ế cho đ n th i
ườ ư ể ế ờ ươ ứ đi m k t thúc lên men (112 gi ). D ng nh ph ng th c lên men này có tác
ủ ệ ậ ả ả ẩ ị ị ợ ụ d ng b o v cho s n ph m lên men không b phân h y. Nh n đ nh này phù h p
ớ v i các tài li u ệ [22] và [27].
ả ế ả ươ ế ị So sánh k t qu lên men theo 4 ph ng th c, ứ trên thi t b dung tích 5 B ng 3.8.
lít.
ươ
ứ
ượ
Ph
ng th c lên men
L
ng γ
decalactone (g/L)
ươ ứ ẻ 3 Ph ng th c lên men theo m batch culture
ươ ứ ế Ph ố ng th c không kh ng ch pH và DO 4,264
Sau 88 giờ
ươ ứ ế ế ố ố Ph ng th c không kh ng ch pH có kh ng ch DO 40% 5,220
Sau 72 giờ
ươ ứ ố Ph ế ng th c có kh ng ch pH = 6 và DO = 40% 6,234
Sau 64 giờ
ươ ầ ơ ấ ứ ẻ ế Ph ng th c lên men theo m có ti p d n c ch t (fedbatch
culture)
ộ ầ ấ ầ ầ ồ ờ N ng đ d u th u d u ban đ u 40 g/L, sau 16 gi môi 7,343
ườ ượ ế ế ố tr ng đ c ti p thêm 60 g/L. Kh ng ch pH = 6, DO = 40% Sau 96 giờ
ở ồ 3.2.2. Lên men quy mô pilot trên n i dung tích 50 lít
ứ ượ ự ệ ồ Các nghiên c u đ c th c hi n trên n i lên men dung tích 50L (B.E.
ấ ấ ậ ả ố ộ ố Marubishi, Nh t B n). Có t c đ khu y cao nh t là 250 vòng/phút, không kh ng
ế ượ ế ị ượ ứ ướ ch đ c pH và DO. Trên thi ự t b này, s lên men đ c nghiên c u d i 2
ươ ứ ẻ ẻ ế ph ầ ơ ấ ng th c lên men là lên men theo m và lên men theo m có ti p d n c ch t.
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 44
ẻ ở 3.2.2.1. Lên men theo m (batch culture) quy mô 50L
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ễ ế ề ườ ố ượ Các di n bi n v pH môi tr ng lên men, sinh kh i, và l ng γ
ạ ượ ể ệ ở ượ ả ư decalactone t o thành đ c th hi n (hình 3.4 A) và đ c mô t nh sau:
ẹ ả ố ờ pH sau thanh trùng là 5,97, gi m nh xu ng 5,8 sau 8 gi ồ lên men, r i
ế ạ ạ ờ ờ ề ầ ả tăng m nh đ n 6,8 t ể i th i đi m 12 gi ế lên men. Sau đó, pH gi m d n đ u đ n
ế ở 4,09 khi k t thúc lên men 64 gi ờ .
ố ế ờ ầ ấ Sinh kh i t bào tăng nhanh trong 16 gi ạ đ u nuôi c y, đ t 3,72 gam sinh
ố ướ ế ờ ờ kh i t/100 mL, sau đó tăng đ n 7,5 g/100 mL trong th i gian 4452 gi ả và gi m
ẹ ế ở nh còn 7,35 g/100 mL khi k t thúc lên men 64 gi ờ .
ượ ụ ờ ạ ấ ị γdecalactone đ c tích t sau 12 gi ầ nuôi c y, tăng d n và đ t giá tr cao
ấ ở ờ ế ả ố ở nh t 7,204 g/L 56 gi , sau đó gi m xu ng 6,54 g/L khi k t thúc lên men 64 gi ờ .
ư ậ ệ ẻ ấ ồ Nh v y, khi lên men theo m trên n i 50 lít, hi u su t lên men tăng 16%,
ơ ờ ờ ẻ ở ế ố ắ th i gian ng n h n 8 gi so v i ớ lên men theo m quy mô 5L có kh ng ch pH
ờ ớ ờ và DO (7,204 g/L sau 56 gi so v i 6,234 g/L sau 64 gi xem thêm hình 3.2 B và
ươ ứ ặ ở ượ ả b ng 3.8). Tuy nhiên, theo ph ng th c này m c dù quy mô 50L, l ả ng s n
ẩ ẫ ấ ơ ớ ươ ứ ph m v n th p h n so v i ph ng th c Fedbatch culture (quy mô 5L), (7,240 so
ở ậ ươ ứ ượ ụ ớ v i 7,343 g/L), b i v y, ph ng th c Fedbatch culture đ c áp d ng cho quy mô
ư ướ 50L nh d i đây.
ế ầ ơ ấ ở 3.2.2.2. Lên men theo m ẻ có ti p d n c ch t (Fedbatch culture) quy mô
50L
ươ ứ ượ ự ệ ồ Ph ng th c lên men này đ c th c hi n trong n i lên men 50L (dung tích
ệ ớ ượ ầ ầ ượ ư làm vi c 30 L) v i 40% l ầ ng d u th u d u (1200 gam) đ c đ a vào môi
ườ ấ ừ ầ ượ ầ ầ ầ ổ tr ng nuôi c y t đ u, và đ c b sung 60% (1800 gam) d u th u d u sau 16
ờ ớ ố ấ ấ ộ ộ ố gi lên men, v i t c đ 20 mL/phút, t c đ khu y 200 vòng/phút, c p khí 1,0 L
ườ ượ ự ệ ủ ữ ố không khí/L môi tr ng/phút, l ng gi ng 10%. Nh ng s ki n chính c a quá
ư trình lên men này nh sau (hình 3.4 B):
ế ế ả ầ ầ ở ờ pH ban đ u là 5,96, gi m d n đ n 4,04 khi k t thúc lên men 64 gi .
ượ ấ ạ ố ị L ng sinh kh i tăng r t nhanh, đ t 5,97 g/100 mL d ch lên men sau 20
ờ ầ ớ ứ ấ ạ ờ ể ớ ả gi và tăng d n t i m c cao nh t 8,1 g/L t i 56 gi , gi m không đáng k t i 8,0
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 45
ế ở ế g/L đ n khi k t thúc lên men 64 gi ờ .
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ượ ụ ườ ờ L ng γ decalactone tích t trong môi tr ng là 0,33 g/L sau 12 gi lên
ế ầ ờ ữ ị men, tăng d n đ n 8,10 g/L sau 60 gi và gi ờ nguyên giá tr này khi kéo dài th i
gian lên men thêm 4 gi .ờ
ư ậ ươ ứ ở Nh v y, khi lên men theo ph ng th c fedbatch culture quy mô pilot
ế ượ ề ệ ặ ố ượ 50L, m c dù trong đi u ki n không kh ng ch đ c pH và DO, l ng γ
ớ ở ề ạ ẫ decalactone t o thành v n tăng, tuy không nhi u, so v i quy mô 5L {8,1 g/L so
ặ ả ệ ớ ề ờ ơ ớ v i 7,34 g/L (xem thêm b ng 3.9)} và đ c bi ắ t v i th i gian ng n h n nhi u (60
ờ ờ ứ ề ỏ ệ ấ ộ gi ớ so v i 96 gi , xem thêm hình 3.3). Đi u đó ch ng t vi c khu y tr n và cung
ế ị ế ố ớ ơ ấ c p không khí trong các thi t b lên men dung tích l n h n là y u t ả có nh
ớ ự ự ể ầ ầ ầ ấ ố ọ ưở h ng r t tích c c đ i v i s chuy n hóa sinh h c d u th u d u thành γ
8
9
8
7
7
6
,
,
6
5
H p ; ) l
H p ; ) l
5
4
4
3
3
pH
) L / g ( e n o t c a l a c e d γ L H
m 0 0 1 / g ( U K S L H
) L / g ( e n o t c a l a c e d γ L H
m 0 0 1 / g ( U K S L H
HL sinh kh i
ố ướ t
2
γ
pH ố ướ HL sinh kh i t HL decalactone
2
γ
HL decalactone
1
1
0
0
0
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64
0
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64
ờ
ờ
ờ Th i gian lên men (gi )
ờ Th i gian lên men (gi )
(A)
ủ ủ ấ decalactone c a ch ng n m men Y. lipolytica VTP5.
(B) ứ
ộ ở ươ quy mô 50L, theo ph ng th c Batch culture ọ Hình 3.4. Đ ng h c quá trình lên men
ấ ớ ế ơ (A) và Fedbatch culture (B) ế ẻ Ngoài ra, n u so sánh lên men theo m có ti p thêm c ch t v i lên men
ở ấ ượ ẻ theo m , cùng quy mô 50L thì cũng th y l ng γ ạ decalactone t o thành tăng lên
ụ ế ả ả ớ (8,1 g/L so v i 7,204 g/L xem thêm m c 3.2.2.1 và b ng 3.9). K t qu này có th ể
ớ ủ ồ ể ệ ằ ả ố ộ ầ ủ ầ ủ c ng c thêm quan đi m cho r ng vi c gi m b t c a n ng đ ban đ u c a d u
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 46
ể ề ủ ế ể ầ ầ ả th u d u đ v sau ti p thêm cho đ trong quá trình lên men, có th đã làm gi m
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ộ ố ủ ưở ấ ớ ự b t s kìm hãm c a m t s ch t trong đó, do đó làm tăng sinh tr ấ ủ ng c a n m
ượ ẩ ả men, qua đó tăng l ng s n ph m [34].
ự ớ ở Cũng trong s so sánh Fedbatch culture v i Batch culture cùng quy mô
ể ạ ượ ự ạ ề ẩ ả ơ ờ 50 Lít, thì th i gian đ đ t l ng s n ph m c c đ i là không dài h n nhi u (60
ờ ờ ớ gi so v i 56 gi ).
ủ ế ấ ả ươ ứ K t qu trên đây c a chúng tôi cũng cho th y đây là ph ng th c lên men
ệ ả ả ở ớ ế ớ ợ có hi u qu khi s n xu t γ ấ decalactone ả ủ quy mô l n và phù h p v i k t qu c a
̀ ả ủ ằ Y. Rabenhorst va Gatfield (2012). Theo các tác gi này, lên men b ng ch ng
ườ ứ ầ lipolytica HR 145 trên môi tr ng ban đ u ch a 10 g/L ricinoleic acid, sau 16 gi ờ
ượ ạ ạ ờ ổ b sung 50 g/L, thì l ng γ decalactone đ t 11,0 và 12,3 g/L t ể i th i đi m 69 và
ờ ế ị 70 gi trên thi t b lên men 10L và 300L [34].
ắ ươ ở 3.2.3. So sánh tóm t ng th c lên men quy mô 5L và 50L
ự t các ph ượ ứ ả S so sánh này đ c nêu trong b ng 3.9.
ấ ằ ể ễ ả ượ ế ậ ả ế Qua b ng này có th d dàng nh n th y r ng các k t qu đ c x p theo
ứ ự ư th t nh sau:
ở ẻ Cùng quy mô 5L, khi lên men theo m thì:
ế ế ế ố ố ố Kh ng ch pH và DO > không kh ng ch pHcó kh ng ch DO > không
ố ế kh ng ch pH và DO
ở Cùng quy mô 5L thì:
ơ ấ ế ẻ ẻ Lên men theo m có t p thêm c ch t > lên men theo m
ở Cùng quy mô 50L thì:
ơ ấ ẻ ế ẻ Lên men theo m có ti p thêm c ch t > lên men theo m
ể ễ ấ ằ ẻ ể ổ ố ế Cu i cùng, nhìn t ng th cũng có th d th y r ng lên men theo m có ti p
ơ ấ ở ố ấ ươ ự ứ thêm c ch t, quy mô 50L là t t nh t trong các ph ệ ng th c lên men đã th c hi n
ề ặ ở ự ố ể ế ặ trong đ tài này, m c dù ủ đó không có s kh ng ch pH và DO, do đ c đi m c a
thi ế ị t b .
ể ề ậ ở ế ơ Đi u có th bàn lu n thêm là, ặ ớ quy mô 50L ho c l n h n, n u thi ế ị t b
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 47
ế ế ẻ ể ấ ố ơ cho phép kh ng ch pH và DO thì ki u lên men theo m có ti p thêm c ch t có
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ể ẽ ứ ẹ ả ố ơ ả ề ượ ề ế ự ạ ả ẩ th s h a h n nhi u k t qu t t h n, c v l ng s n ph m c c đ i cũng nh ư
ạ ế ờ th i gian đ t đ n đó.
ả ượ ự ạ ạ ượ ở ờ So sánh l ng γ decalactone c c đ i cùng th i gian đ t đ c, quy B ng 3.9
mô 5L và 50L
ở ở Lên men quy mô 5L Lên men quy mô 50L
ượ ờ ượ ờ Ph ngươ L ng γ Th i gian Ph ngươ L ng γ Th i gian
ứ ứ th c lên decalactone ( lên men th c lên decalactone lên men
men ự ạ c c đ i g/L gi )ờ men ự ạ c c đ i g/L ( gi )ờ
Batch Batch
culture, culture, 4,264 88 7,204 56
“không “Không
ố ố kh ng ch ế kh ng ch ế
pH và DO” pH và DO”
Batch
culture, 5,22 72
“Không
ố kh ng ch ế
pH có
ố kh ng ch ế
DO”
Batch 6,234 64
culture, “Có
ố kh ng ch ế
pH và DO”
Fedbatch 7,343 96 Fedbatch 60 8,10
culture, “ Có culture,
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 48
ố kh ng ch ế “Không
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ố pH và DO” kh ng ch ế
pH và DO”
ự ọ ề ệ ế ậ ừ ị 3.3. L a ch n đi u ki n chi t rút và thu nh n γ decalactone t d ch lên men
ự ọ ệ ề ế 3.3.1. L a ch n đi u ki n chi t rút γ decalactone
ự ế ọ 3.3.1.1. L a ch n dung môi chi t rút
ữ ơ ự Các dung môi h u c không phân c c (diethyl ether, nhexane) và dung môi
γ ơ ượ ử ụ ể ế ự ữ h u c phân c c (ethyl acetate) đã đ c s d ng đ chi ạ t rút decalactone t o
ườ ủ ằ ế ả thành trong môi tr ng lên men b ng ch ng Y. lipolytica VTP5. K t qu trình bày
ả ố ế ệ trong b ng 3.10 cho th y: ấ Diethyl ether là dung môi t t nh t. ấ ấ N u coi hi u su t
γ ế ủ ệ ấ ế tách chi t decalactone c a diethyl ether là 100% thì hi u su t tách chi γ t
ủ ươ ứ decalactone c a nhexane và ethyl actetate t ng ng là 50,9 và 53,2%.
ả ự ọ ừ ị a ch n dung môi tách chi ế (cid:0) decalactone t t d ch lên men B ng 3.10. L
ượ
ệ
Dung môi tách chi
t ế
L
ng γ
ấ Hi u su t tách chi
ế t
decalactone (g/L)
(%)
Diethyl ether 1,917 ± 0,034 100
Ethyl acetate 1,020 ± 0,026 53,2
nhexane 0,975 ± 0,012 50,9
ể ệ ấ ế ẳ ớ ơ Có th vì hi u su t tách chi t cao h n h n c a ủ diethyl ether so v i hai
ố ả ề ử ụ ể ế dung môi kia mà đa s các tác gi đ u s d ng diethyl ether đ tách chi t các
ụ ườ ể ọ lactone tích t trong môi tr ng chuy n hóa sinh h c [6][22][24]. Tuy nhiên cũng
ả ử ụ ể ộ ố có m t s tác gi s d ng nhexane [3][15][17], ho c ặ ethyl acetate đ tách chi ế t
γ ừ ị ủ ấ decalactone t d ch lên men các ch ng n m men khác nhau [13].
ệ ử ụ ượ ở ấ ả Tuy nhiên, vi c s d ng diethyl ether cũng có nh ể c đi m: t c các t
γ ổ ắ ấ ậ ề ạ ấ ề ph s c ký khí đ u nh n th y ngoài decalactone còn có t p ch t. Đi u này có
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 49
ữ ể ế ả th là do diethyl ether không nh ng chi t rút đ ượ (cid:0) decalactone mà c các h p ợ c
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ố ấ ủ ủ ầ ầ ầ ầ ị ph n khác c a d u th u d u và c a sinh kh i n m men trong d ch lên men. Vì
ể ế ầ ươ ậ v y, đ thu nh n ậ (cid:0) decalactone tinh khi ả t, c n ph i có ph ạ ng pháp làm s ch
ử ụ ặ ợ ươ ư ấ ậ thích h p, ho c s d ng các ph ng pháp thu nh n khác nh h p ph ụ (cid:0)
ậ ệ ỵ ướ ư ư ặ ị decalactone trên các v t li u k n ấ c, ho c ch ng ch t, thu d ch ng ng t ụ ứ ch a
ấ ơ ớ ế ể ạ ỏ ạ ế ạ ằ ch t th m và sau đó m i chi ấ t rút b ng dung môi đ lo i b /h n ch t p ch t
ẩ ả trong s n ph m [8][34].
ự ọ ệ ề 3.3.1.2. L a ch n đi u ki n lactone hóa
ề ả ự ệ ể ị Nhi u tác gi đã th c hi n lactone hóa d ch lên men đ thu nh n ậ (cid:0)
ở ư ệ ề ị decalactone các đi u ki n nh : axít hóa d ch lên men ế đ n pH 1,5 – 2 có gia
oC trong 1030 phút) [15][17][34], ho c axít hóa
ệ ặ ở ệ ộ nhi t (80120 nhi t đ phòng
ứ ủ ệ ấ ế [13][41]. Trong nghiên c u c a mình, chúng tôi so sánh hi u su t chi t rút (cid:0)
ử ụ ươ decalactone b ng ằ diethyl ether khi s d ng hai ph ng pháp lactone hóa có gia
ệ ệ ả ượ ế ả nhi t và lactone hóa không gia nhi t. K t qu đ c trình bày trong b ng 3.11.
γ ự ể ề ệ ậ ọ ừ ị ả L a ch n đi u ki n lactone hóa đ thu nh n decalactone t d ch
B ng 3.11. lên men ươ
ề
ệ
ượ
Ph
ng pháp
Đi u ki n lactone hóa
L
ng γ
lactone hóa
decalactone (g/l) 1,252 ± 0,018
ế ị D ch lên men không axit hóa (pH khi k t thúc
Lactone hóa
không gia nhi tệ
ế ế ế ế 2,037 ± 0,034 1,827 ± 0,031 1,651 ± 0,037 1,611 ± 0,023 1,836 ± 0,039 Lactone hóa có lên men = 4,12) Axit hóa pH đ n 2ế Axit hóa pH đ n 1,5 Axít hóa pH đ n 2; đun nóng 85 Axít hóa pH đ n 2; đun nóng 85 Axít hóa pH đ n 2; đun nóng 85 ế Axít hóa pH đ n 2; đun nóng 90 1,899 ± 0,023
oC/10 phút oC/20 phút oC/30 phút oC/10 phút oC/20
gia nhi tệ ế Axít hóa pH đ n 2; đun nóng 90 1,906 ± 0,021
oC/30 phút
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 50
ế phút Axít hóa pH đ n 2; đun nóng 90 1,921 ± 0,033
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ể ấ ả Qua b ng 3.11 có th th y:
ườ ề ế ị pH môi tr ệ ng khi k t thúc lên men có giá tr = 4,12. Trong đi u ki n
ệ ượ ượ ế không gia nhi t và không axít hóa, thì l ng (cid:0) decalactone đ c chi ấ t rút là th p
(1,252 g/L).
ệ ề ệ ế ệ Cũng trong đi u ki n không gia nhi ị t, vi c axít hóa d ch lên men đ n pH
ệ ấ ặ ế ớ ườ ợ = 1,5 ho c 2 đã làm tăng hi u su t chi t rút so v i tr ng h p không axít hóa,
ứ ự ớ (1,827 và 2,037 g/L, theo th t , so v i 1,252 g/L).
oC trong th i gian 2030 phút sau khi axít
ệ ệ ị ở ờ Vi c gia nhi t d ch lên men 90
ệ ế ả ế ỉ ớ ấ ươ hóa đ n pH 2 có hi u qu chi t rút x p x v i ph ng pháp không gia nhi ệ t
ớ (1,906 và 1,921 g/L so v i 2,037 g/L).
ở ẫ ệ ổ ắ ỉ Tuy nhiên, các m u lactone hóa có gia nhi ồ t, ph s c ký đ có ít các đ nh
ẫ ơ ớ ệ ề ể ạ t p h n so v i các m u lactone hóa không gia nhi t. Đi u đó có th là do trong
ệ ạ ừ ượ ộ ố ấ ơ quá trình gia nhi t đã lo i tr đ c m t s ch t bay h i.
ọ ố ộ ự ờ ấ ế 3.3.1.3. L a ch n t c đ khu y và th i gian chi t rút γdecalactone
ư ế ả ấ ả ủ B ng 3.12 cho th y k t qu c a thí nghi m này nh sau:
ể ấ ộ ố ợ ế ừ ị ệ (cid:0) decalactone t T c đ khu y thích h p đ chi t rút ằ d ch lên men b ng
ế ế ấ ố ộ dung môi diethyl ether là 100 vòng/phút. N u tăng t c đ khu y đ n 150 – 200
ượ ượ ế ả ầ ậ vòng/phút thì l ng (cid:0) decalactone đ c tách chi t gi m d n. Do v y chúng tôi
ứ ự ấ ố ộ ọ ờ ế ể dùng t c đ khu y 100 vòng/phút đ nghiên c u l a ch n th i gian chi t rút
thích h p. ợ
ờ ế ừ ế ả ưở ế ề Th i gian chi 10 đ n 25 phút không nh h ệ ng nhi u đ n hi u
ấ ế ư ườ ủ ố ấ ợ ộ t rút t (cid:0) decalactone nh tr su t chi t rút ng h p c a t c đ khu y. Tuy nhiên, do
oC) nên n u kéo dài th i gian chi
ệ ộ ấ ế ờ ế diethyl ether có nhi ơ t đ bay h i th p (35
ụ ả ưở ế ệ ấ ẽ ị thì dung môi s b hao h t, nh h ng đ n hi u su t thu nh n t rút ậ (cid:0) decalactone và
ế ờ ế ố ừ ế dung môi. Vì th theo chúng tôi, th i gian chi t rút t ấ t nh t là t 10 đ n 15 phút.
ả Ả ưở ủ ố ộ ờ ế ế ấ nh h ấ ng c a t c đ khu y và th i gian chi ệ t rút đ n hi u su t thu B ng 3.12.
ừ ị nh n ậ γdecalactone t d ch lên men
ỉ Ch tiêu
Thông số
L
ượ γdecalactone (g/L)
ng
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 51
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ố ộ ấ T c đ khu y
ờ ế (Th i gian chi t rút 5 phút)
ờ ế Th i gian chi t rút
ấ (Khu y 100 vòng/phút)
50 vòng/phút 100 vòng/phút 150 vòng/phút 200 vòng/phút 5 phút 10 phút 15 phút 20 phút 25 phút 1,545 ± 0,36 1,774 ± 0,022 1,530 ± 0,014 1,305 ± 0,018 1,774± 0,037 2,243 ± 0,034 2,258 ± 0,027 2,099 ± 0,039 2,022 ± 0,045
ọ ỷ ệ ự ế 3.3.1.4. L a ch n t l dung môi chi t rút
ả ượ ế ấ ỷ ệ ị K t qu đ ả c trình bày trong b ng 3.13 cho th y t l dung môi/d ch lên
ể ợ ế men (v/v) thích h p đ chi t rút γdecalactone là 0,5/1. Khi tăng t ỷ ệ l dung môi,
ượ ượ ế ừ ị ổ t ng l ng γdecalactone đ c chi t rút t ư d ch lên men có tăng lên, nh ng
ệ ế ấ ố ế ượ l ng dung môi tiêu t n cũng tăng theo. N u coi hi u su t chi t rút theo t ỷ ệ l
ươ ươ ể ớ ị dung môi t ng đ ng v i th tích d ch lên men (t ỷ ệ l 1/1) là 100% thì khi chi ế t
ộ ử ệ ấ ể rút m t n a th tích dung môi (t ỷ ệ l 0,5/1), hi u su t thu nh n ậ γdecalactone là
97,2%.
ả Ả ưở ủ ỷ ệ ử ụ ế ệ ấ ế nh h ng c a t l dung môi s d ng đ n hi u su t chi t rút γ B ng 3.13.
ừ ị decalactone t d ch lên men
ỷ ệ
ượ
T l
dung
L
ng dung môi
L
ượ γ ng
ổ T ng l
ượ γ ng
Hi uệ
ị
ế
ấ
môi/d ch lên men
chi
t rút thu đ
ượ c
decalactone
decalactone
su t thu
(v/v)
(mL)
(mg/mL)
(mg)
nh n(%ậ
) 92,0 97,2 98,0 100
27 45 65 94 5,392 3,417 2,386 1,684 145,6 ± 0,022 153,8 ± 0,027 155,1 ± 0,034 158,3 ± 0,021
0,3/1 0,5/1 0,7/1 1/1
ọ ố ầ ự ế 3.3.1.5 L a ch n s l n chi t rút
ị ượ ế ầ ằ γdecalactone trong d ch lên men đ c chi t rút 3 l n b ng diethyl ether v i t ớ ỷ ệ l
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 52
ươ ứ ầ ị dung môi/d ch lên men t ỗ ng ng là 0,5/1, 0,3/1 và 0,3/1, ph n dung môi sau m i
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ế ượ ể ị ượ ầ l n chi t rút đ c phân tích GC đ xác đ nh l ng γdecalactone trong đó. K tế
ả ượ ỉ ầ ấ ả ế ầ qu đ c trình bày trong b ng 3.14 cho th y ch c n chi ậ t rút 1 l n đã thu nh n
ị ạ ượ ế ượ đ c 96,5% γdecalactone trong d ch lên men, còn l i 3,5% đ c chi ố t rút n t
ứ ầ trong l n th 2.
ớ ố ử ụ ư ậ ấ ộ Nh v y, khi s d ng dung môi diethyl ether, v i t c đ khu y 100 v/p,
ờ ế ỉ ầ ế ầ th i gian chi t rút 10 phút, ch c n chi ể t rút 1 l n đ thu nh n ậ γdecalactone từ
ị d ch lên men.
ả Ả ưở ế ế ấ ế nh h ủ ố ầ ng c a s l n chi ệ t rút đ n hi u su t chi t rút γdecalactone B ng 3.14.
ừ ị t d ch lên men
ố ầ
ế
ệ
S l n chi
t rút
L
ượ γdecalactone
ng
ấ Hi u su t
(g/L)
thu nh nậ
(%) 96,5
ầ ị L n 1: t ỷ ệ l diethyl ether/d ch lên men 3,417 ± 0,019
ầ ầ 3,5 0 = 0,5/1 (v/v) ỷ ệ l L n 2 (t ỷ ệ l L n 3 (t 0,3/1) 0,3/1)
0,124 ± 0,011 0 3,541 ± 0,019 T ng ổ
γ ự ọ ệ ề ậ ạ ừ ị 3.3.2. L a ch n đi u ki n thu nh n và làm s ch decalactone t d ch lên
men
ậ ả ộ ướ ẩ ấ ọ Thu nh n s n ph m là m t b ề c quan tr ng và khó khăn nh t trong nhi u
ệ ặ ấ ả ả ọ ệ ố ớ ẩ quá trình s n xu t các s n ph m công ngh sinh h c, đ c bi ấ t đ i v i các ch t
ươ ấ ễ ủ ơ ơ ạ t o h ng th m, vì tính ch t d bay h i và kém hòa tan c a chúng. Các ph ươ ng
ượ ử ụ ệ ể ế ậ ấ ơ pháp đã đ c s d ng trong công ngh đ chi t rút và thu nh n các ch t th m t ừ
ườ ữ ơ ư ấ ỏ ồ môi tr ng l ng bao g m: dùng dung môi h u c , ch ng c t, phân tách trên các
ụ ụ ạ ạ ấ ặ ử ụ lo i màng chuyên d ng, h p ph trên cacbon ho t tính [28][37][38] ho c s d ng
ơ ỗ ố ữ ể ạ ế ấ ươ ơ ự các lo i nh a h u c l x p đ chi t rút các ch t h ng th m, do tính ch t k ấ ị
ề ặ ớ ủ ệ ướ ự n c t nhiên và di n tích b m t l n c a chúng [8].
ứ ự ề ệ ọ Do đi u ki n th c t ự ế ạ ơ t i n i th c t p, ề ự ậ sau khi nghiên c u l a ch n đi u
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 53
γ ệ ế ừ ị ế ki n lactone hóa và chi t rút decalactone t d ch lên men, chúng tôi đã ti n hành
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
γ ệ ề ạ ả ậ ươ kh o sát đi u ki n thu nh n và làm s ch decalactone theo hai ph ng pháp: ( i)
ế ư ấ ế ự ạ “chi ạ t rút làm s ch”, và ( ii) “ ch ng c t chi t rút làm s ch”. S khác nhau c ơ
ươ ở ỗ ươ ư ứ ệ ữ ả b n gi a 2 ph ng pháp này là ch : theo ph ấ ng pháp th hai, vi c ch ng c t
ạ ỏ ượ ộ ố ợ ầ ơ ị đã lo i b đ c m t s h p ph n khó/ không bay h i trong d ch sau lên men, mà
ươ ứ ự ể ệ ạ ấ ph ẫ ng pháp th nh t không th . Trong các lo i th c nghi m này, các m u
ứ ượ ớ ượ ự ầ ẫ ị nghiên c u đ ệ c th c hi n v i l ng m u 1000 mL d ch lên men/l n.
γ ạ ươ ậ 3.3.2.1. Thu nh n và làm s ch decalactone theo ph ng pháp “chi ế t
rút – làm s ch”ạ
γ ệ ậ ả ừ ị ấ B ng 3.15 trình bày hi u su t thu nh n decalactone t d ch lên men sau
ạ ỗ ế ế ậ ạ ả ượ ấ m i công đo n chi t rút, làm s ch và thu nh n. K t qu thu đ c cho th y:
ệ ấ ậ ươ γ Hi u su t thu nh n decalactone theo ph ng pháp này, sau khi qua t ấ t
γ ạ ạ ượ ư ậ ả c các công đo n, đ t 50,1%. decalactone thu đ c theo cách nh v y có đ ộ
ắ ạ s ch s c ký là 99,43% (hình 3.5 B).
γ ệ ầ ậ ấ ướ ề Hi u su t thu nh n decalactone trong ph n n ầ ử c sau khi r a ki m l n
ứ ự ự ệ ậ ầ ấ ấ ế 1 và l n 2 là r t th p, (2,4 và 2,9% theo th t ). Vì v y, khi th c hi n chi t rút và
γậ ừ ị ở ầ ớ ướ thu nh n decalactone t d ch lên men quy mô l n, không c n b ậ c thu nh n
γ ở ướ ử ề decalactone pha n c sau khi r a ki m.
γ ả ệ ấ ừ ị ươ ậ Hi u su t thu nh n decalactone t d ch lên men theo ph ng pháp B ng 3.15.
ế ạ “chi t rút làm s ch”
ổ
L
ngượ
L
ượ γ ng
T ng L
ượ ng
Hi uệ
Tên m uẫ
dung môi
decalactone
γdecalactone
su tấ
ế
chi
t thu
(mg/mL)
(mg)
thu
ượ
đ
c (mL)
nh nậ
(%)
ị 1000 mL d ch lên men, axit hóa
ế ằ ế đ n pH = 2, chi t rút b ng 445 4,526 2014,1 ± 0,41 100
diethyl ether (t ỷ ệ l dung
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 54
ị môi/d ch lên men =0,5/1), thu
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ử pha dung môi ầ ề R a ki m l n 1 (NaOH 0,1N,
1: 1).
ỷ ệ l ầ 410 3,645 1494,5 ± 0.35 74,2
ầ ướ ứ ặ ỉ pH=12, t Thu ph n dung môi (a) Ph n n c ch a c n,ch nh
ế 210 0,230 48,3 ± 0.16 2,4 ế pH đ n 2, chi ằ t rút b ng DE
ố ớ ử ề ầ ầ (0,5/1), thu ph n dung môi ầ R a ki m l n 2 đ i v i ph n
dung môi (a) (NaOH 0,1N,
1:1).
370 3,691 1365,7 ± 0,47 67,8
ỷ ệ l ầ ướ ứ ặ ỉ pH=12, t Thu ph n dung môi (b) Pha n c ch a c n, ch nh
ế 195 0,299 58,3 ± 0,22 2,9 ế pH đ n 2, chi ằ t rút b ng DE
ượ ầ ầ (0,5/1), thu ph n dung môi Ph n dung môi (b) đ c cô chân
oC. B ổ
ổ ở ể không đ đu i DE 35 6,0 206,080 1236,5 ± 0,38 50,1
sung ethanol (99,5%) và cô chân
ổ ế ể ở ệ không, đ đu i h t DE nhi t
oC. Thu d ch
ị đ 55ộ γdecalactone
cô đ cặ
ươ ấ 3.3.2.2. Thu nh n ậ γdecalactone theo ph ư ng pháp “Ch ng c t chi ế t
ạ rút làm s ch”
ươ ứ ị ượ Theo ph ng th c này, d ch lên men, sau khi đ ế c axit hóa đ n pH = 2,
ư ế ị ư ấ ồ ệ ượ đ ấ c ch ng c t trong thi t b ch ng c t c n, quy mô phòng thí nghi m, và thi ế t
ơ ướ ố ả ượ ế ả ấ ị ư b ch ng c t cu n h i n c Clevenger. K t qu đ c trình bày trong b ng 3.16
ệ ấ ấ ươ ấ cho th y hi u su t thu nh n ậ γdecalactone theo ph ư ng pháp “Ch ng c t – chi ế t
ỉ ạ ắ ấ ấ ớ ộ ạ rút” là r t th p, ch đ t 35,4 %, v i đ s ch s c ký là 99,43%. (Hình 3.5 C).
ả ệ ấ ừ ị ươ Hi u su t thu nh n ậ γdecalactone t d ch lên men theo ph ng pháp B ng 3.16.
L
ngượ
L
ư ấ ế “ch ng c t chi t rút”
ượ γ ng
ổ T ng l
ượ ng
Hi uệ
dung
decalactone
γdecalactone
su tấ
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 55
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
Tên m uẫ
(mg/mL)
(mg)
thu
môi
nh nậ
chi
tế
(%)
thu
đ
cượ
(mL)
ị ượ ế ằ D ch lên men đ c chi t rút b ng
4,166 4166,0 ± 0,39 100 diethyl ether sau khi axit hóa đ n ế
ấ ồ t b ch ng c t c n
pH=2 ế ị ư ử ụ S d ng thi ư ị 1000 mL d ch lên men pH=2, ch ng
oC; Thu 800 ml d ch
ị ấ ở c t 100 400 7,894 3157,6 ± 0,31 75,8
ụ ế ư ng ng t , chi ằ t rút b ng DE
tế
ổ (0,5/1). Thu pha dung môi chi Cô chân không đu i dung môi DE ở
oC (760 mmHg); b ổ
ệ ộ nhi t đ 35 6,0 204,322 1225,9 ± 0,45 29,4
sung ethanol (99,5%) và cô chân
ổ ế không đu i h t dung môi DE ở
t đ 55
ệ ộ ư ấ ằ nhi Ch ng c t b ng thi
oC (350 mmHg) ế ị t b
ị
ấ ở ư Clevenger 1000 mL d ch lên men, pH=2, oC, thu nh n:ậ 100
ch ng c t γdecalactone không tan trong 4,0 203,16 812,6 ± 0,34
ư ụ ế c ướ n ị 800 ml d ch ng ng t , chi t rút
ằ b ng DE (0,5/1). Thu pha dung môi
ế ổ chi 4,0 165,633 662,5 ± 0,29
t. Cô chân không đu i dung oC (760 mmHg); b ổ 35ở môi DE
sung ethanol (99,5%) và cô chân
ổ ế ở
không đu i h t dung môi DE 55oC (350 mmHg)
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 56
T ng ổ 1475,1 35,4
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ệ ấ ừ ị Hi u su t thu nh n ậ γdecalactone t ứ ủ d ch lên men trong các nghiên c u c a
ở ả ươ ớ ủ ự ấ ộ ơ chúng tôi, c 2 ph ng pháp th p h n so v i c a Alchihab và c ng s (2010):
ử ụ ể ấ ự ừ ị Khi s d ng nh a MN202 đ h p ph ụ γdecalactone t d ch lên men trên thi ế ị t b
ư ạ ủ ấ ằ dung tích 100 lít b ng ch ng n m men a l nh Rh. aurantiaca A19 và sau đó
ụ ằ ệ ấ ả ấ ph n h p ph b ng ethanol, hi u su t thu nh n ậ γdecalactone sau khi cô ki tệ
ạ ổ đu i dung môi đ t 56% [8].
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 57
(A)
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
(B)
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 58
(C)
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
(D)
ắ ằ Hình 3.5. S c ký đ
t rút
ủ Y. d ch lên men b ng ch ng ế ng pháp “Chi ạ ế ạ ằ ằ ươ ư ng pháp “Ch ng c tchi t rútlàm s ch”
ồ γdecalactone thu nh n t ậ ừ ị ạ lipolytica VTP 5 (A), sau khi làm s ch b ng ph ấ ươ làm s ch” (B), b ng ph (C), γdecalactone cô đ c (D). ặ
Ậ Ế K T LU N
ề ể ể ệ ầ ầ ầ ợ 1. Các đi u ki n lên men thích h p đ chuy n hóa d u th u d u thành γ
ấ ư ờ ủ decalactone nh ch ng n m men Y. lipolytica VTP5 là nh sau:
a) Trên máy l c, ắ giá tr pH là 6,0
ị ố ộ ắ ổ ờ ; t c đ l c 200 v/p ố ; tu i gi ng 9 gi và t ỉ
ế ờ ệ ố l gi ng 10% ậ ộ ố (v/v, m t đ gi ng = 6.5x106 t bào/m L); và th i gian
ợ thích h p là 4 ngày .
b) Trên n iồ lên men 5L, so sánh lên men theo m và theo m có ti p
ẻ ẻ ế d nầ cơ
ươ ứ ượ ố ch tấ , (kh ng ch ế pH, DO) thì ph ứ ng th c th hai cho l ng γ
ạ decalactone cao nh t,ấ đ t 7,343 g/ L.
c) Trên n iồ lên men 50L, lên men theo m có ti p
ẻ ơ ế d nầ c ch t ấ , không
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 59
γ ố ượ ạ kh ng ch ế pH và DO, l ng decalactone đ t 8,10 g/ L.
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
d) So sánh ba quy mô lên men cho th y năng xu t thu nh n
γ ấ ấ ậ decalactone là
ư nh sau:
50L > 5L, và 5L > trên máy l c.ắ
ể ề ệ ả ậ ẩ ừ ị ợ 2. Các đi u ki n thích h p đ thu nh n s n ph m t ằ d ch lên men b ng
ư ch ng ủ Y. lipolytica VTP5 là nh sau:
ạ Dung môi diethyl ether, lactone hóa t i pH 2 có gia nhi ệ 90oC/10 phút. t
ố ộ ế T c đ chi t rút 100 v/p.
ỉ ệ ố ầ ị ế T l dung môi/ d ch lên men là 0,5/1, s l n chi t rút là 1.
γ ươ ậ ế ạ 3. So sánh hai ph ng pháp thu nh n decalactone (“chi t rút – làm s ch”
ư ấ ế và “ch ng c t chi t rút” ) cho th y: ấ
ậ ở ả ệ ươ ấ Hi u su t thu nh n c hai ph ng pháp ề đ u th p ấ (29,4% và 35,4%)
ư ấ ơ ượ ề ạ ộ nh ng ch t th m thu đ c đ u có đ tinh s ch cao (99,43%).
Ế Ị KI N NGH
1. V qề uá trình lên men
ể ầ ầ ầ Ti p t c ế ụ lên men chuy n hóa d u th u d u thành γdecalactone b ng ằ ch ngủ
ặ ớ ả ố Y. lipolytica VTP 5 trên n iồ lên men 50L ho c l n h n ơ mà có kh năng kh ng ch ế
ượ đ c pH và DO.
2. V dề ung môi
ứ ầ ả ế ề ượ C n nghiên c u thêm d ung môi có kh năng chi t rút ượ đ c nhi u l ng g
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 60
ơ decalactone h n dung môi đã dùng .
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ươ ậ ả ẩ ằ C n nầ ghiên c u ứ thêm ph ng pháp thu nh n s n ph m b ng cách chi t ế nhờ
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 61
ề hai hay nhi u nhóm dung môi khác nhau.
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
Ả Ệ TÀI LI U THAM KH O
Ti ng ế Vi tệ
ộ ố ế ố ả ạ ọ ị ưở ế ả 1. L i Th Ng c Hà (2003), “ M t s y u t nh h ổ ng đ n kh năng sinh t ng
ủ ấ ạ h p ợ γdecalactone c a ch ng n m men ủ Yarrowica lipolytica W29”, T p chí khoa
ậ ọ ỹ h c k thu t Nông nghi p ệ , tr. 222 – 226.
ặ ị ọ ậ ơ ở ệ ệ C s công ngh sinh h c t p 2 2. Đ ng Th Thu, ấ , Công ngh hóa sinh, Nhà xu t
ụ ệ ả b n Giáo d c Vi t Nam.
ụ ườ ệ ế ổ ng xuyên 3. Vũ Nguyên Thành (2003), Báo cáo t ng k t nhi m v th “ B oả
ữ ự ệ ẩ ậ ồ ư ồ t n, l u gi ệ ngu n gen vi sinh v t công nghi p th c ph m 2003”, Vi n Công
ệ ẩ ự nghi p Th c ph m.
ấ ậ ổ ợ ợ ơ ấ 4. Bùi Quang Thu t và Kula J ( 2006), “ T ng h p các h p ch t th m và ch t
ạ ộ ọ ừ ầ ầ ể ậ ứ ứ Tuy n t p các công trình nghiên c u ng ho t đ ng sinh h c t ầ d u th u d u”,
ự ệ ẩ ạ ọ ệ ụ d ng công ngh sinh h c – công nghi p th c ph m giai đo n 2001 – 2005 , Nhà
ấ ả ộ xu t b n Lao đ ng xã h i, ộ tr. 377 – 383.
Internet
5. https://www.google.com.vn/search?q=Ricinus+communis&newwindow
ế Ti ng Anh
6. Aguedo M, Gomes N, Escamilla García E, Waché Y, Mota M, Teixeira J.A. &
Belo I (2005), “Decalactone production by Yarrowia lipolytica under increased O2
transfer rates”, Biotechnology Lett, 27(20), pp. 16171621.
7. Aguedo M, Ly MH, Belo I, Teixeira JA, Belin JM, Waché Y (2004), “The use of
enzymes and microorganisms for the production of aroma compounds from lipits”,
Food Technology and Biotechnology, 42(4), pp. 327336.
8. Alchihab M, Destain J, Aguedo M, Wathelet JP, Thonart P (2010), “The
utilization of gum Tragacanth to improve the growth of Rhodotorula aurantiaca
γ and the production of decalactone in large scale ”, Appl Biochem, 62(1), pp. 233
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 62
241.
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
9. Barnett JA (2003), “Beginnings of microbiology and biochemistry: the
contribution of yeast research”, Microbiology (Reading, Engl.), pp. 557567.
10. Barth G, Gaillardin C (1997), “Physiology and genetics of the dimorphic fungus
Yarrowia lipolytica”, FEMS Microbiology Reviews, 19, pp. 219237.
11. Beoloupos A, Mrozova Z, Thevennieau F, Le Dall MT, Hapala I, Papanikolaou
S, Chardot T, Nicaud JM (2008), “Control of lipid accumulation in the yeast
Yarrowia lipolytica”, Applied and Environmental Microbiology, 74(24), pp. 7779
7789.
12. Berger R.G (1986), “Biosynthesis of Flavor Compounds by Microorganisms
Odorous Constituents of Polyporus durus”, (Basidiomycetes), Volume 41, Section
C, A European journal of biosciences, pp. 559563.
13. Boog ALGM, Peters ALJ, Ross R (1998), “Process for producing γ
decalactone”, Unite States patent 5.789.212.
14. Chanika S, Benjamas C, thanwadde T.S and Thanwien B (2011), “Efficicient
concomitant production of lipids and carotenoids by oleaginous red yeast
Rhodotorula glutinis culture in palm oil mill effuluent and application of lipids for
biodiesel production”, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 16(1), pp. 23
33.
15. Cheetham P.S.J., Maume K.A, De Rooij J.F.M (1993), “Method of producing
gamma hydroxydecanoic acid or its lactone by feeding a ricinoleic acid source to
Sporobolomyces odrus or Rhodotorula glutinis”, United States Patent 5.219.742.
16. Coelho M.A.Z, Amaral P.F.F and Belo I (2010), “Yarrowia lipolytica : an
industrial work horse”, Current Research, Technology and Education Topic in
Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, Vol. 2, pp. 930944.
17. Farbood MI, Willis BJ (1985), “Production of γdecalactone”, Unite States
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 63
Patent 4.560.656.
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
18. Fickers, P., Benetti, P.H., Wache, Y., Marty, A., Mauersberger, S., Smit, M.S.
and Gerold Barth, Claude Gaillardin, (1996), “Physiology and genetics of the
dimorphic fungus Yarrowia lipolytica”.
19. Gatfield, I.L (1999), “Biotechnological production of natural flavor materials”,
In Flavor Chemistry: 30 Years of Progress ed, Teranishi, R., Wick, E.L. and
Hornstein, I., pp. 211–227. New York: Kluwer Academic, Plenum Publishers.
20. Gatfield, I.L., Gu¨ntert, M., Sommer, H., and Werkhoff, P.(1993), “Some
aspects of the microbiological production offlavoractive lactones with particular
γ reference to decalactone ”, Chem Microbiol Technol Lebensm, 15, pp. 165–170.
21. Gill C.O, Haill M.G, and Ratledge C (1977), “Lipid accumulation in an
oleaginous yeast (Candida 107) growing on glucose in single – stage continous
culture”, Appl Environ Microbiol 1977 February, 33(2), pp. 231239.
22. Gomes N, Teixeira JA, Belo I (2012), “Fedbatch culture of Yarrowia
γ lipolytica for decalactone production from methyl ricinolate” , Biotechnol Lett, 34,
pp. 649654.
23. Gopinath M, Vijayakumar L, Dhannasekar R, Viruthagiri T (2008), “Microbial
γ Global Journal of biosynthetic of decalactone and its applications”,
Biotechnology, Biochemistry, 3(2), pp. 6068.
24. Groguenin, A., Wache ´, Y., Escamilla Garcı´a, E., Aguedo, M., Husson, F.,
Ledall, M.T., Nicaud, J.M., and Belin, J.M (2004), “Genetic engineering of β
oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of
aroma compounds”, J Molec Catal B, 28, pp. 75–79.
25. Le Clainche A (1997), “Maîtrise de la production de γlactone par la levure
Yarrowia lipolytica : mise en évidence de l’existence d’une famille multigénitique
d’acylCoA oxydases”.
26. Li Y, Zongbao Z, and Fengwu B (2007), “High density cultivation of
oaleagious yeast Rhodosparidrum toruloides Y4 in fedbatch culture”, Enzyme and
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 64
and Microbial Technology, 41(3), pp. 312317.
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
27. Martina Carnecka, Andrea Halienova, Radka Koci, “Production of carotenoid
ergosterolsupplemented biomass by red yeast Rhodotorula glutinis grown under
external stress”, Food Technology and Biotechology, Vol 48 (1).
28. Mediaros ABP, Pandey A, Vandenberghe LPS, Pastore GM, Soccd CR (2006),
“Prodution and recovery of aroma compounds produced by solidstate fermentation
using different adsorbents”, Food technol Biotechnol, 44, pp. 4751.
29. Moradi H, Asadllahi MA, Nahvi I (2013), “Improved γdecalactone production
from castor oil by fedbatch culture cultivation of Yarrowia lipolytica”, Biocatalysis
and Agriculture Biotechnology, 2, pp. 6468.
30. Nadal M, GarcíaPedrajas MD, Gold SE (2008), “Dimorphism in fungal plant
pathogens”, FEMS Microbiol Lett, 284, pp. 127–134.
31. Pagot Y, Le Clainche A, Nicaud JM, Waché Y, Belin JM (1998), “Peroxisomal
β γ Yarrowia oxidation activities and decalactone production by the yeast
lipolytica”, Appl Microbiol Biotechnol , 49, pp. 295300.
32. Papaparaskevas D, Christakopoulos P, Kelos D, Macris BJ (1992), “Optimizing
production of extracellular lipase from Rhodotorula glutinis”, Biotechnology Lett,
14, pp. 397402.
γ 33. Rabenhorst J, Gatfield I (2002), “Method of producing decalactone using
Yarrowia lipolytica strain HR 145 (DSM 12397)”, Unite States Patent 6.415.565.
γ 34. Rabenhorst J, Gatfield I (2012), “Method of producing decalactone using
Yarrowia lipolytica strain HR 124 (DSM 12397)”, Unite States patent N0 6451565
B1.
35. Rodrigues G, Pais C (2007), “The influence of acetic and other weak carboxylic
acids on growth and cellular death of the yeast Yarrowia lipolytica”, Food
Technology and Biotechnology, 38, pp. 2732.
36. RuizHerrera J, Sentandreu R (2002), “Different effectors of dimorphism in
Yarrowia lipolytica”, Arch Microbiol, 178, pp. 477–483.
37. Souchon I, Spinnler HE, Dufoss L,Voilleg A (1998), “Trapping of γ
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 65
decalactone by adsorption on hydrophobic sorbents: application to the
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
bioconversion of methyl ricinoleate by the yeast”, Sporidiobolus salmonicolor
Biotechnol tech, 12, pp. 109113.
38. Suryadi I, Suresh B (2000), “Adsorption of flavor ester on granular activated
carbon”, CanjChem Eng, 78, pp. 892901.
β γ 39. Waché Y. et al., (2001), “Role of oxidation enzymes in decalactone
production by the yeast Yarrowia lipolytica”, Appl. Environ. Microbiol., 67(12),
pp. 57005704.
β 40. Waché Y. et al., (2002),“Optimization of Yarrowia lipolytica 's oxidation
γ pathway for decalactone production ”, J. Mol. Catal. B: Enzym ., pp. 347351.
41. Waché Y, Aguedo M, Nicaud JM, Belin JM (2003), “Catabolism of
hydroxyacids and biotechnological production of lactones by Yarrowia lipolytica”,
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 66
Applied Microbiology and Biotechnology, 61, pp. 393600.
ậ
ạ
ọ
Lu n văn th c sĩ khoa h c Nguy n
ễ Xuân Vi
tệ
ậ ọ
Chuyên ngành Vi sinh v t h c Khóa 20112013 67
![Luận văn Thạc sĩ: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính chống ung thư của hợp chất lai chứa khung tetrahydro-β-carboline và imidazo[1,5-a]pyridine](https://cdn.tailieu.vn/images/document/thumbnail/2025/20250807/kimphuong1001/135x160/50321754536913.jpg)
