Nghiên cứu định lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015<br /> <br /> Nghiên cứu định lượng BERBERIN CHLORID trong<br /> “viên nén đại tràng 105” bằng phương pháp<br /> sắc ký lỏng hiệu năng cao<br /> Hồ Cảnh Hậu*; Hoàng Văn Thêm*; Nguyễn Thị Lan Hương*<br /> Nguyễn Văn Thuận**; Nguyễn Cẩm Vân***; Nguyễn Tuấn Quang***<br /> Tóm tắt<br /> Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng berbein chlorid trong “Viên nén đại tràng 105”<br /> bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đối tượng và phương pháp: “Viên nén đại tràng 105”<br /> do Bệnh viện Quân y 105 sản xuất được tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC với cột: RP18<br /> (150 x 4,6 mm, 5 µm), bước sóng 345 nm, tốc độ dòng 1,2 ml/phút, thể tích tiêm 20 µl, pha<br /> động là hỗn hợp methanol-acetonitril-dung dịch axít phosphoric 0,1% (5:3:3). Kết quả: phương<br /> pháp xây dựng đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, tính tuyến tính, độ đúng và độ lặp lại.<br /> Giới hạn phát hiện của berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” là 0,02 µg/ml. Áp dụng<br /> xác định hàm lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” là 37,65 ± 1,02 (mg/viên).<br /> Kết luận: phương pháp xây dựng đảm bảo yêu cầu và có thể được dùng để định lượng<br /> berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105”.<br /> * Từ khóa: Berberin chlorid; “Viên nén đại tràng 105”; Sắc ký lỏng hiệu năng cao.<br /> <br /> Quantitative Study on Berberin Chloride in “Vien nen dai trang 105”<br /> by High Performace Liquid Chromatography<br /> Summary<br /> Objective: To establish the quantitative methodology measuring the amount of berberin<br /> chloride in “Vien nen dai trang 105” by high performance liquid chromatography (HPLC). Subjects<br /> and methodology: “Vien nen dai trang 105” produced by 105 Hospital is analysed using the<br /> HPLC system with a column of RP18 (150 x 4.6 mm, 5 µm), the wave length of 345 nm, the flow<br /> rate water of 1.2 ml/min, injection volume: 20 µl, a mixture of methanol- acetonitrile-acide<br /> phosphoric 0.1% with ratio (5:3:3) as mobile phase. Results: This methodology ensures the<br /> specificity, compatibility, linearity, preciseness and repeatability. The limitation of berberin<br /> chlorid in “Vien nen dai trang 105” found is 0.02 µg/ml. As a result, the amount of berberin<br /> chlorid measured in “Vien nen dai trang 105” is 37.65 ± 1.02 (mg/pill). Conclusion: The methodology<br /> meets all the requirements and can be used to measure the amount of berberin chlorid in “Vien<br /> nen dai trang 105”<br /> * Key words: Berberin chlorid; “Vien nen dai trang 105”; High performance liquid chromatography.<br /> * Bệnh viện Quân y 105<br /> ** Bệnh viện Quân y 7<br /> *** Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (drquang2000@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 24/12/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 12/01/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 26/01/2015<br /> <br /> 75<br /> <br /> Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015<br /> Đặt vấn đề<br /> “Viên nén đại tràng 105” là đề tài đang<br /> được Bệnh viện Quân y 105, Tổng cục<br /> Hậu cần nghiên cứu phát triển từ bài<br /> thuốc y học cổ truyền để điều trị viêm đại<br /> tràng cấp và mạn tính rất có hiệu quả.<br /> Thành phần của “Viên nén đại tràng 105”<br /> có sự kết hợp của các dược liệu và hoạt<br /> chất từ dược liệu như Hoàng đằng, cao Bồ<br /> giác, berberin chlorid…, trong đó, berberin<br /> chlorid chiếm tỷ lệ khá cao và được coi là<br /> thành phần chính của dược phẩm. Berberin<br /> chlorid được chiết xuất từ các dược liệu<br /> như Vàng đắng, Hoàng liên,… [1, 2, 5],<br /> có tác dụng ức chế đối với vi khuẩn<br /> Shigella, Bacillus cholerae, Staphylococus<br /> aureus…, tác dụng chống vi khuẩn tả Vibrio<br /> cholerae, tác dụng với lỵ amip. Đặc biệt,<br /> dùng berberin điều trị nhiễm khuẩn đường<br /> ruột không ảnh hưởng đến sự phát triển<br /> của hệ vi khuẩn có ích ở ruột [3, 9].<br /> Việc nghiên cứu định lượng berberin<br /> chlorid trong “Viên nén đại tràng 105” góp<br /> phần tiêu chuẩn hóa chất lượng sản<br /> phẩm, cũng như xây dựng công thức bào<br /> chế. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên<br /> cứu định lượng berberin trong “Viên nén<br /> đại tràng 105” bằng phương pháp sắc ký<br /> lỏng hiệu năng cao.<br /> Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp<br /> nghiên cứu<br /> 1. Nguyên liệu và thiết bị.<br /> - “Viên nén đại tràng 105” được sản<br /> xuất tại Bệnh viện Quân y 105, Tổng cục<br /> Hậu cần.<br /> - Hóa chất: acetonitril, methanol, axít<br /> phosphoric 0,1%, nước cất đạt tiêu chuẩn<br /> cho HPLC; chất chuẩn berberin chlorid<br /> <br /> 77<br /> <br /> (Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương,<br /> 99%); các hóa chất dung môi khác đạt<br /> tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.<br /> - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao<br /> Shimadzu 10 Avp (Nhật Bản) gồm hệ bơm<br /> 4 kênh dung môi, autosampler, detector UV,<br /> cột RP18 (150 x 4,6 mm, 5 µm) và bảo vệ<br /> cột cùng loại.<br /> - Dụng cụ: cân phân tích Sartorius (độ<br /> chính xác 0,1 mg) và các dụng cụ thí<br /> nghiệm khác.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> - Điều kiện sắc ký:<br /> + Cột: RP18 (150 x 4,6 mm, 5 µm).<br /> + Bước sóng phát hiện: 345 nm.<br /> + Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.<br /> + Thể tích tiêm: 20 µl.<br /> + Pha động: hỗn hợp methanol-acetonitrildung dịch axít phosphoric 0,1% (5:3:3),<br /> thêm vào mỗi 100 ml hỗn hợp 0,1 g natri<br /> lauryl sulfat (TT) [4, 8, 9].<br /> - Phương pháp xử lý mẫu:<br /> + Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn được<br /> pha bằng cách hòa tan berberin chlorid<br /> chuẩn trong pha động để có nồng độ 30<br /> µg/ml, lọc qua màng 0,45 µm thu được<br /> dung dịch thử.<br /> + Mẫu thử: cân chính lượng bột viên<br /> tương đương khoảng 15 mg berberin<br /> chlorid vào bình định mức 50 ml, hòa tan<br /> và pha loãng vừa đủ bằng pha động<br /> (dung dịch A). Hút chính xác 3 ml dung<br /> dịch A, pha loãng vừa đủ thành 25 ml với<br /> pha động, lọc qua màng 0,45 µm. Dịch<br /> lọc dùng để tiêm mẫu.<br /> + Mẫu trắng: pha động, lọc qua màng<br /> lọc 0,45 µm.<br /> <br /> Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015<br /> - Thẩm định phương pháp: với các tiêu<br /> chí về tính đặc hiệu, tính tương thích, tính<br /> tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn<br /> phát hiện [4, 7].<br /> <br /> 0.4<br /> <br /> 0.3<br /> <br /> 5.170<br /> <br /> 1. Tính đặc hiệu.<br /> <br /> Volts<br /> <br /> 0.2<br /> <br /> KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ bµn luËn<br /> <br /> 0.0<br /> <br /> 1<br /> <br /> Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn,<br /> mẫu thử và mẫu trắng. Kết quả trên sắc<br /> ký đồ (SKĐ) cho thấy: mẫu thử cho pic có<br /> thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu<br /> của mẫu chuẩn berberin chlorid; pic của<br /> berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng<br /> 105” ở mẫu thử rõ ràng, cân đối, tách<br /> hoàn toàn khỏi pic tạp. Đồng thời, mẫu<br /> trắng không thấy xuất hiện pic có thời<br /> gian lưu tương ứng với mẫu chuẩn và<br /> mẫu thử (hình 2, hình 3 và hình 4).<br /> <br /> Berberin<br /> <br /> 0.1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> Minutes<br /> <br /> Hình 3: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu của<br /> mẫu thử.<br /> 2. Tính tương thích.<br /> Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch<br /> mẫu chuẩn berberin chlorid có nồng độ<br /> khoảng 30 µg/ml vào hệ thống sắc ký.<br /> Bảng 1: Tính tương thích của hệ thống<br /> sắc ký.<br /> <br /> 0.0100<br /> <br /> 0.0075<br /> <br /> stt<br /> <br /> Thêi gian l-u<br /> (phót)<br /> <br /> DiÖn tÝch pic<br /> <br /> 1<br /> <br /> 5,175<br /> <br /> 2498965<br /> <br /> 2<br /> <br /> 5,172<br /> <br /> 2515328<br /> <br /> 3<br /> <br /> 5,173<br /> <br /> 2516250<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5,172<br /> <br /> 2515583<br /> <br /> 5<br /> <br /> 5,170<br /> <br /> 2516382<br /> <br /> 6<br /> <br /> 5,167<br /> <br /> 2516104<br /> <br /> TB<br /> <br /> 5,172<br /> <br /> 2513102<br /> <br /> SD<br /> <br /> 0,003<br /> <br /> 6937,51<br /> <br /> RSD%<br /> <br /> 0,05<br /> <br /> 0,28<br /> <br /> Volts<br /> <br /> 0.0050<br /> <br /> (Berberin)<br /> <br /> 0.0025<br /> <br /> (µAU*s)<br /> <br /> 0.0000<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> Minutes<br /> <br /> Hình 1: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu của<br /> mẫu trắng.<br /> 0.3<br /> <br /> Volts<br /> <br /> 0.2<br /> <br /> Berberin<br /> <br /> 5.172<br /> <br /> 0.1<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0.0<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> Minutes<br /> <br /> Hình 2: SKĐ đánh giá tính đặc hiệu của<br /> mẫu chuẩn berberin chlorid.<br /> <br /> 78<br /> <br /> Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian<br /> lưu và diện tích pic berberin chlorid lần<br /> lượt là 0,05% và 0,28%. Như vậy, phương<br /> pháp phân tích hoàn toàn phù hợp với hệ<br /> thống sắc ký.<br /> <br /> Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015<br /> 3. Tính tuyến tính.<br /> Pha một dãy các dung dịch chuẩn trong<br /> pha động có nồng độ berberin chlorid từ<br /> 5 - 60 µg/ml. Tiến hành sắc ký các dung<br /> dịch theo điều kiện sắc ký đã nêu, lặp lại<br /> thí nghiệm 3 lần.<br /> Bảng 2: Kết quả khảo sát tính tuyến<br /> tính.<br /> Nồng độ (àg/ml)<br /> <br /> Diện tích pic (mAU.s)<br /> <br /> 5<br /> <br /> 472499<br /> <br /> 10<br /> <br /> 939110<br /> <br /> 20<br /> <br /> 1828049<br /> <br /> 30<br /> <br /> 2730267<br /> <br /> 40<br /> <br /> 3677890<br /> <br /> 50<br /> <br /> 4789210<br /> <br /> 60<br /> <br /> nồng độ berberin chlorid và diện tích pic<br /> với hệ số tương quan r ≈ 1.<br /> 4. Khảo sát độ đúng của phương pháp.<br /> Tiến hành bằng phương pháp thêm<br /> chuẩn vào mẫu trắng để thu được các<br /> dung dịch mẫu tự tạo có nồng độ 20, 30,<br /> 40 µg/ml, mỗi nồng độ tiến hành trên 3 thí<br /> nghiệm riêng biệt. Tiến hành định lượng<br /> lại lượng chuẩn trong các mẫu trên, từ đó<br /> tính toán được % thu hồi.<br /> Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của<br /> phương pháp.<br /> Nồng độ<br /> ban đầu<br /> (àg/ml)<br /> <br /> 20,12<br /> 20,34<br /> <br /> 5586820<br /> <br /> 20,68<br /> <br /> Phương trình hồi quy: y = 93990x - 26295.<br /> Hệ số tương quan: r = 0,9995<br /> <br /> 29,82<br /> <br /> Diện tích PIC<br /> <br /> 187606<br /> 2<br /> 187418<br /> 3<br /> 189298<br /> 1<br /> 275298<br /> 9<br /> <br /> Diện tích pic (µAU.s)<br /> <br /> Đường hồi quy tuyến tinh giữa diện tích pic của<br /> <br /> Đường hồi quy<br /> tuyếnchlorid<br /> tính giữa<br /> berberin<br /> và diện<br /> nồngtích<br /> độ pic của<br /> Berberin clorid và nồng độ<br /> 6000000<br /> y = 93990x - 26295<br /> 5000000<br /> R2 = 0.999<br /> 4000000<br /> <br /> 30,12<br /> <br /> 3000000<br /> <br /> 40,56<br /> <br /> 30,36<br /> <br /> 281596<br /> 3<br /> 284979<br /> 9<br /> 377560<br /> 1<br /> <br /> 2000000<br /> <br /> 40,90<br /> <br /> 1000000<br /> <br /> 373518<br /> 5<br /> <br /> Nồng độ thu<br /> hồi (àg/ml)<br /> <br /> 20,24<br /> <br /> %<br /> thu hồi<br /> <br /> 100,<br /> 2<br /> <br /> 20,22<br /> <br /> 99,3<br /> <br /> 20,42<br /> <br /> 98,4<br /> <br /> 29,57<br /> <br /> 98,7<br /> <br /> 30,24<br /> 30,60<br /> <br /> 100,<br /> 6<br /> 101,<br /> 2<br /> <br /> 40,45<br /> 40,02<br /> <br /> 99,6<br /> 100,<br /> 5<br /> <br /> 0<br /> 0<br /> <br /> 20<br /> <br /> 40<br /> <br /> 60<br /> <br /> 80<br /> <br /> Nồng độ (µg/m l)<br /> <br /> Hình 4: Đồ thị khảo sát sự tương quan<br /> tuyến tính giữa nồng độ và diện tích<br /> pic berberin chlorid.<br /> Trong khoảng nồng độ khảo sát có sự<br /> tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa<br /> <br /> 79<br /> <br /> 40,23<br /> <br /> 371168<br /> 7<br /> <br /> 39,77<br /> <br /> 98,2<br /> <br /> Trung bình<br /> <br /> 99,6<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 1,07<br /> <br /> Phương pháp có độ thu hồi berberin<br /> chlorid từ 98,2 - 101,2% (nằm trong giới<br /> hạn 98 -102%) với RSD là 1,07% (nằm<br /> <br /> Tạp chí y - dược học quân sự số 2-2015<br /> trong giới hạn < 2%). Do đó, phương<br /> pháp đạt yêu cầu về độ đúng.<br /> <br /> Độ lặp lại của phương pháp được xác<br /> định trên 6 mẫu thử khác nhau theo các<br /> điều kiện sắc ký đã nêu.<br /> <br /> 5. Độ lặp lại.<br /> Bảng 4: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp (n = 6).<br /> Mẫu<br /> <br /> Diện tích pic<br /> Hàm lượng berberin<br /> chlorid (mg)<br /> <br /> Thử 1<br /> <br /> Thử 2<br /> <br /> Thử 3<br /> <br /> Thử 4<br /> <br /> Thử 5<br /> <br /> Thử 6<br /> <br /> 3384720<br /> <br /> 3332455<br /> <br /> 3341579<br /> <br /> 3388796<br /> <br /> 3328205<br /> <br /> 3385202<br /> <br /> 15,12<br /> <br /> 14,89<br /> <br /> 14,93<br /> <br /> 15,14<br /> <br /> 14,87<br /> <br /> 15,12<br /> <br /> Hàm lượng berberin chlorid trung bình = 15,01 (mg); RSD = 0,87<br /> <br /> Hàm lượng berberin chlorid trong mẫu thử trung bình = 15,01 (mg), định lượng lặp<br /> lại với n = 6 cho RSD% = 0,87% chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt.<br /> 6. Giới hạn phát hiện (LOD).<br /> Pha loãng dần dung dịch chuẩn, tiêm vào hệ thống sắc ký. Tại nồng độ berberin<br /> chlorid khoảng 0,02 µg/ml thì trên sắc ký đồ, pic của berberin chlorid thu được vẫn cân<br /> đối, riêng biệt. Tỷ số S/N là 6. Như vậy, giá trị 0,02 µg/ml đáp ứng được yêu cầu là giới<br /> <br /> 186<br /> <br /> 35<br /> <br /> hạn phát hiện của phương pháp.<br /> <br /> 3 .7 4 2<br /> <br /> 0 .0 0 0 2<br /> <br /> 213<br /> <br /> V o lt s<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0 .0 0 0 1<br /> <br /> 5 .1 1 0<br /> <br /> 1796<br /> <br /> 0 .0 0 0 0<br /> <br /> B e r b e r in<br /> <br /> - 0 .0 0 0 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> - 0 .0 0 0 2<br /> <br /> 0<br /> <br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> 6<br /> <br /> M in u te s<br /> <br /> Hình 6: Sắc ký đồ của berberin chlorid tại LOD.<br /> 7. Kết quả định lượng berberin chlorid trong “Viên nén đại tràng 105”.<br /> <br /> 80<br /> <br /> 7<br /> <br />