Nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn trên thực nghiệm của altretamin tổng hợp tại Việt Nam

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƢỜNG DIỄN TRÊN<br /> THỰC NGHIỆM CỦA ALTRETAMIN TỔNG HỢP TẠI VIỆT NAM<br /> Lê Thị Hồng Hạnh*; Vũ Bình Dương*; Hồ Anh Sơn*; Phan Đình Châu**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đã đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của altretamin được tổng<br /> hợp tại Việt Nam. Đối tượng và phương pháp: sử dụng altretamin để đánh giá độc tính cấp trên<br /> 36 chuột nhắt trắng và độc tính bán trường diễn trên 06 thỏ theo quy định. Kết quả: nghiên cứu<br /> độc tính cấp của altretamin trên chuột nhắt trắng theo đường uống với LD50 730 ± 60 (mg/kg).<br /> Với độc tính bán trường diễn, thỏ uống altretamin 28 ngày ở mức liều 21 mg/kg, không thay đổi<br /> có ý nghĩa thống kê về trọng lượng cơ thể, số lượng tiểu cầu, SGOT, SGPT, ure, creatinin.<br /> Hình ảnh mô bệnh học của gan, thận bình thường. Tuy nhiên, altretamin gây giảm số lượng<br /> hồng cầu và số lượng bạch cầu so với trước khi thử nghiệm. Kết luận: LD50 của altretamin<br /> được tổng hợp là 730 ± 60 (mg/kg) trên chuột nhắt. Độc tính bán trường diễn cho thấy<br /> altretamin không gây tổn thương gan thận, số lượng tiểu cầu; nhưng gây giảm số lượng hồng<br /> cầu và bạch cầu trong máu ngoại vi của thỏ.<br /> * Từ khóa: Altretamin tổng hợp; Độc tính cấp; Độc tính bán trường diễn.<br /> <br /> Experimental Evaluation of Acute and Semi-Chronic Toxicity of<br /> Synthesised Altretamine from Vietnam<br /> Summary<br /> Objective: To evaluate on acute and semi-chronical toxicity synthesized altretamine from Vietnam.<br /> Subject and method: Synthesized altretamine was used to evaluate the acute toxicity on 36 mice<br /> and semi-chronic toxicity on 06 rabbits according to standard operating procedure. Results: The<br /> results of acute toxicity of altretamine with LD50 is 730 ± 60 (mg/kg). With dose of 21 mg<br /> altretamine/kg/daily in 26 days, the treated rabbits showed that there were no significant change for<br /> body weight, platelet counts, serum SGOT, SGPT, ure and creatinine. Histology of liver and kidney<br /> tissue showed no changes. However, red blood cells and leukocyte count were significantly<br /> decreased in comparision with experimental beginning. Conclusion: Altretamine LD50 is 730 ±<br /> 60 (mg/kg) on mice. Semi-chronic study revealed that altretamine was not toxic for liver, kidney<br /> and platelet counts, but it could reduced the red blood and the leukocytes by 28 days follow-up.<br /> * Key words: Synthesized altretamine; Acute toxicity; Semi-chronical toxicity.<br /> * Học viện Quân y<br /> * Đại học Bách khoa Hà Nội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 28/02/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/03/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 02/04/2015<br /> <br /> 10<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> <br /> - Máy đếm hồng, bạch cầu tự động.<br /> <br /> ®Æt vÊn ®Ò<br /> <br /> - Bộ dụng cụ mổ động vật cỡ nhỏ.<br /> <br /> Altretamin được sử dụng phổ biến trong<br /> điều trị ung thư buồng trứng, ung thư phổi và<br /> <br /> - Cân chính xác 10-2 mg, bơm kim tiêm...<br /> <br /> ung thư vú. Dược chất này đang được sử<br /> <br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> <br /> dụng điều trị ung thư với các tên như:<br /> <br /> * Đánh giá độc tính cấp của altretamin:<br /> <br /> hexastat (Pháp), hexinawas (Tây Ban Nha),<br /> altretamin (Mỹ) [3]… Hiện nay, Bộ Y tế vẫn<br /> chưa cấp số nhập khẩu các biệt dược chứa<br /> hoạt chất này, trong khi nhu cầu sử dụng<br /> thuốc điều trị ung thư rất lớn và hầu hết phải<br /> nhập ngoại nên chi phí điều trị cao. Học viện<br /> Quân y đã xây dựng được quy trình tổng hợp<br /> altretamin. Kết quả cho thấy, altretamin tổng<br /> hợp được là tinh khiết, các thông số lý hóa<br /> của hợp chất tổng hợp được phù hợp với số<br /> liệu đã công bố và đạt tiêu chuẩn Dược điển<br /> <br /> - Dựa theo phương pháp xác định độc tính<br /> cấp của Abrham W.B, Turner A, theo quy định<br /> của Bộ Y tế Việt Nam và Tổ chức Y tế Thế<br /> giới về nghiên cứu độc tính của thuốc [1,<br /> 7].<br /> - Thí nghiệm được tiến hành trên chuột<br /> nhắt trắng. Chia chuột thành các lô, mỗi lô 06<br /> con. Cho từng lô chuột uống liều duy nhất<br /> altretamin với các mức liều tăng dần theo<br /> từng nhóm, đến liều gây chết 100% số chuột.<br /> <br /> Mỹ 34 [2]. Để sử dụng được altretamin trong<br /> <br /> - Sau khi dùng thuốc, nuôi dưỡng và theo<br /> <br /> điều trị cần nghiên cứu đánh giá tính an toàn<br /> <br /> dõi liên tục chuột trong 72 giờ. Xác định số chuột<br /> <br /> của sản phẩm.<br /> <br /> chết theo từng nhóm thí nghiệm.<br /> - Tính toán: theo phương pháp cải tiến của<br /> <br /> ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu.<br /> * Chế phẩm nghiên cứu:<br /> Altretamin do Trung tâm Nghiên cứu Ứng<br /> dụng sản xuất thuốc, Học viện Quân y tổng hợp<br /> đạt tiêu chuẩn Dược điển Mỹ 34.<br /> * Động vật thí nghiệm:<br /> - Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh đạt tiêu<br /> chuẩn thí nghiệm, trọng lượng 20 - 22 g.<br /> - Thỏ nhà khỏe mạnh, đạt tiêu chuẩn thí<br /> nghiệm, trọng lượng 1,8 - 2,2 kg.<br /> Động vật được nuôi dưỡng trong điều kiện<br /> phòng thí nghiệm 5 ngày trước khi tiến hành<br /> nghiên cứu.<br /> <br /> Livschitz P.Z [1].<br /> * Đánh giá độc tính bán trường diễn của<br /> altretamin:<br /> Theo phương pháp Abraham, quy định của<br /> Tổ chức Y tế Thế giới và Bộ Y tế về hiệu lực<br /> và an toàn thuốc [1].<br /> - 6 thỏ uống altretamin liên tục trong 28<br /> ngày, liều 21 mg/kg/24 giờ.<br /> - Các chỉ tiêu đánh giá:<br /> + Tình trạng toàn thân, vận động, ăn<br /> uống, trọng lượng cơ thể.<br /> + Huyết học: hồng cầu, hemoglobin, bạch<br /> cầu, tiểu cầu.<br /> + Sinh hóa: SGOT, SGPT, ure, creatinin.<br /> + Mô bệnh học: vào ngày thứ 28, mô gan,<br /> <br /> * Thiết bị và dụng cụ:<br /> <br /> thận được phẫu tích để đánh giá hình ảnh giải<br /> <br /> - Máy xét nghiệm sinh hoá tự động.<br /> <br /> phẫu bệnh.<br /> 11<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> <br /> - Thời điểm xét nghiệm: lấy máu xét<br /> <br /> [5]. Với các đường sử dụng khác nhau, LD50<br /> <br /> nghiệm các chỉ số sinh hóa, huyết học, tại 3<br /> <br /> trên chuột nhắt giảm đáng kể khi tiêm phúc<br /> <br /> thời điểm: trước khi uống altretamin, sau 2<br /> <br /> mạc, còn 200 mg/kg [6] đường tiêm tĩnh mạch<br /> <br /> và 4 tuần nghiên cứu.<br /> <br /> thì LD50 là 171 mg/kg [8].<br /> <br /> - Dữ liệu được phân tích bằng chương<br /> trình Startview 5.0.<br /> <br /> altretamin.<br /> * Ảnh hưởng của altretamin đến phát triển<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> <br /> trọng lượng thỏ:<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> Bảng 2: Trọng lượng thỏ trong quá trình thử<br /> <br /> 1. Độc tính cấp của altretamin.<br /> Bảng 1: Kết quả đánh giá độc tính cấp của<br /> altretamin theo đường uống.<br /> SỐ LƯỢNG SỐ LƯỢNG<br /> <br /> LIỀU SỬ<br /> STT<br /> <br /> DỤNG<br /> <br /> 2. Độc tính bán trƣờng diễn của<br /> <br /> n<br /> <br /> (mg/kg TLCT)<br /> <br /> ĐỘNG VẬT<br /> <br /> ĐỘNG VẬT<br /> <br /> CHẾT<br /> <br /> SỐNG<br /> <br /> (sau 72 giờ)<br /> <br /> (sau 72 giờ)<br /> <br /> nghiệm (n = 6).<br /> THỜI ĐIỂM XÉT<br /> <br /> TLCT<br /> <br /> NGHIỆM<br /> <br /> (kg, X ± SD)<br /> <br /> Trước thí nghiệm (a)<br /> <br /> 2,07 ± 0,14<br /> <br /> Sau 2 tuần (b)<br /> <br /> 1,98 ± 0,17<br /> <br /> Sau 4 tuần (c)<br /> <br /> 2,02 ± 0,13<br /> <br /> p<br /> <br /> p a-b-c > 0,05<br /> <br /> Lô 1<br /> <br /> 300<br /> <br /> 06<br /> <br /> 0<br /> <br /> 06<br /> <br /> Lô 2<br /> <br /> 450<br /> <br /> 06<br /> <br /> 01<br /> <br /> 05<br /> <br /> Kết quả trên cho thấy TLCT thỏ tại các thời<br /> <br /> Lô 3<br /> <br /> 600<br /> <br /> 06<br /> <br /> 02<br /> <br /> 04<br /> <br /> điểm thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p ><br /> <br /> Lô 4<br /> <br /> 750<br /> <br /> 06<br /> <br /> 03<br /> <br /> 03<br /> <br /> 0,05). Không có hiện tượng thỏ giảm cân sau<br /> <br /> Lô 5<br /> <br /> 900<br /> <br /> 06<br /> <br /> 05<br /> <br /> 01<br /> <br /> khi uống altretamin 4 tuần.<br /> <br /> Lô 6<br /> <br /> 1050<br /> <br /> 06<br /> <br /> 05<br /> <br /> 01<br /> <br /> Lô 7<br /> <br /> 1200<br /> <br /> 06<br /> <br /> 06<br /> <br /> 0<br /> <br /> Theo dõi chuột uống altretamin với các<br /> liều khác nhau thấy: ở liều 300 mg/kg trọng<br /> lượng cơ thể (TLCT), tất cả chuột đều khỏe<br /> mạnh, hoạt động ăn uống bình thường. Với<br /> <br /> * Ảnh hưởng của altretamin đối với một số<br /> chỉ tiêu huyết học của thỏ:<br /> Bảng 3: Chỉ số huyết học của thỏ trong quá<br /> trình thí nghiệm (n = 6,<br /> CHỈ TIÊU<br /> <br /> mức liều 450 mg/kg, chuột bắt ®ầu xuất hiÖn<br /> các biểu hiện kém hoạt động, xù lông và chết<br /> <br /> Số lượng HC<br /> <br /> trong 24 giờ. 100% chuột chết khi tăng dần<br /> <br /> (x1012/l)<br /> <br /> đến liều 1.200 mg/kg/24 giờ. Số chuột còn<br /> <br /> HST (g/dl)<br /> <br /> sống ở các lô dần hồi phục ăn uống, hoạt<br /> động bình thường. Altretamin được tổng hợp có<br /> LD50 730 ± 60 (mg/kg) TLCT chuột nhắt trắng.<br /> Với altretamin được tổng hợp tại các cơ sở<br /> <br /> Số lượng BC<br /> 9<br /> <br /> (x 10 /l)<br /> Số lượng TC<br /> 9<br /> <br /> x ± SD).<br /> <br /> TRƯỚC THÍ<br /> <br /> SAU 2<br /> <br /> SAU 4<br /> <br /> NGHIỆM (a)<br /> <br /> TUẦN (b)<br /> <br /> TUẦN (c)<br /> <br /> 4,72 ±<br /> <br /> 4,34 ±<br /> <br /> 0,25<br /> <br /> 0,39*<br /> <br /> 11,75 ±<br /> <br /> 11,08 ±<br /> <br /> 10,48 ±<br /> <br /> 0,61<br /> <br /> 0,65<br /> <br /> 0,56*<br /> <br /> 8,58 ±<br /> <br /> 10,12 ±<br /> <br /> 11,78 ±<br /> <br /> 1,49<br /> <br /> 1,90<br /> <br /> 2,70*<br /> <br /> 333,00 ±<br /> <br /> 307,50 ±<br /> <br /> 302,83 ±<br /> <br /> 78,73<br /> <br /> 17,02<br /> <br /> 42,43<br /> <br /> 4,94 ± 0,21<br /> <br /> khác nhau, LD50 có sự khác biệt nhất định.<br /> <br /> (x 10 /l)<br /> <br /> Với cùng đường uống và cùng trên chuột<br /> <br /> (*: thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với thời<br /> <br /> nhắt, một công bố cho thấy LD50 là 437 mg/kg<br /> 12<br /> <br /> điểm trước thí nghiệm với p < 0,05).<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> <br /> Kết quả trên cho thấy, sau 2 tuần uống liên<br /> tục altretamin, số lượng tế bào máu thỏ biến<br /> động không có ý nghĩa thống kê so với trước<br /> khi uống thuốc. Tuy nhiên, sau 4 tuần uống<br /> <br /> máu thỏ không có sự khác biệt đáng kể giữa<br /> các giai đoạn thử nghiệm.<br /> Rất ít bài báo công bố về altretamin liên<br /> <br /> liên tục, số lượng dòng tế bào hồng cầu, bạch<br /> <br /> quan tới tổn thương thận. Có thể gặp tổn<br /> <br /> cầu máu ngoại vi thỏ đã giảm có ý nghĩa thống<br /> <br /> thương gan dạng hoại tử độc tế bào<br /> <br /> kê (p < 0,05). Chưa phát hiện thấy dòng tiểu<br /> <br /> (necrosis) trên động vật thực nghiệm [8].<br /> <br /> cầu giảm tương ứng.<br /> <br /> * Kết quả mô bệnh học tạng của thỏ thí<br /> <br /> Theo một số công bố, altretamin có thể gây<br /> tình trạng giảm bạch cầu máu ngoại vi trên<br /> <br /> nghiệm:<br /> <br /> chuột nhắt khi sử dụng, một số trường hợp<br /> <br /> Quan sát đại thể bằng mắt thường và dưới<br /> <br /> gây giảm hoạt động sản xuất ở tủy xương [5].<br /> <br /> kính lúp có độ phóng đại 25 lần thấy: màu<br /> <br /> Các nghiên cứu cũng cho thấy, altretamin có<br /> <br /> sắc, hình thái của gan, lách và thận ở hai lô<br /> <br /> thể gây giảm số lượng hồng cầu, tăng hồng<br /> <br /> dùng altretamin không khác so với chứng.<br /> <br /> cầu lưới hoặc dạng hồng cầu non ra máu<br /> ngoại vi [8], một số trường hợp gây xuất huyết<br /> [5]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng<br /> tôi, chưa phát hiện thấy giảm tiểu cầu có ý<br /> nghĩa thống kê so với thời điểm trước thí<br /> nghiệm.<br /> * Ảnh hưởng của altretamin đối với chức<br /> năng gan, thận:<br /> Bảng 4: Ảnh hưởng của altretamin đối với<br /> chức năng gan, thận của thỏ (n = 6,<br /> <br /> X±<br /> <br /> SD).<br /> CHỈ TIÊU TRƯỚC THÍ<br /> <br /> SGOT<br /> <br /> SAU 2<br /> <br /> SAU 4<br /> <br /> NGHIỆM<br /> <br /> TUẦN<br /> <br /> TUẦN<br /> <br /> (a)<br /> <br /> (b)<br /> <br /> (c)<br /> <br /> 59,67 ±<br /> <br /> 17,83 ±<br /> <br /> 30,17 ±<br /> <br /> (U/l)<br /> <br /> 14,46<br /> <br /> 18,26<br /> <br /> 35,06<br /> <br /> SGPT<br /> <br /> 30,17±<br /> <br /> 28,00 ±<br /> <br /> 34,17 ±<br /> <br /> 9,41<br /> <br /> 7,62<br /> <br /> 14,76<br /> <br /> 81,17 ±<br /> <br /> 87,33 ±<br /> <br /> 98,00 ±<br /> <br /> 9,45<br /> <br /> 5,82<br /> <br /> 13,40<br /> <br /> 4,43 ±<br /> <br /> 4,30 ±<br /> <br /> 1,38<br /> <br /> 1,18<br /> <br /> (U/l)<br /> Creatinin<br /> (umol/l)<br /> Ure<br /> (mmol/l)<br /> <br /> 4,67 ± 0,91<br /> <br /> p<br /> <br /> Hình 1: Hình ảnh tế bào gan thỏ 6 (HE.40x).<br /> <br /> pa-b-c > 0,05<br /> <br /> Kết quả trên cho thấy, hoạt độ enzym<br /> SGOT, SGPT, nồng độ ure và creatinin trong<br /> <br /> Hình 2: Hình ảnh tế bào gan thỏ 1 (HE.200x).<br /> 13<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015<br /> <br /> * Hình thái vi thể của gan:<br /> Sau 28 ngày uống thuốc, các tế bào gan<br /> <br /> này càng khẳng định không có tổn thương<br /> thận khi thỏ dùng altretamin dài ngày.<br /> <br /> không có thoái hóa hoại tử. Xoang mạch và<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> tĩnh mạch trung tâm không xung huyết,<br /> khoảng cửa không viêm (hình 1 và 2). Kết quả<br /> này khá đồng nhất với kiểm tra hoạt tính của<br /> enzym SGOT và SGPT trong giới hạn bình<br /> thường.<br /> <br /> - Altretamin được tổng hợp có LD50 730 ±<br /> 60 (mg/kg) trên chuột nhắt.<br /> - Bằng đường uống với liều tương ứng 21<br /> mg/kg/24 giờ liên tục trong 28 ngày, altretamin<br /> không gây ảnh hưởng đến sự phát triển trọng<br /> lượng cơ thể, số lượng tiểu cầu máu ngoại vi,<br /> chức năng và mô bệnh học gan, thận, nhưng<br /> làm làm giảm số lượng hồng cầu và bạch cầu<br /> trong máu ngoại vi của thỏ thực nghiệm.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Bộ Y tế. Quy định về nghiên cứu dược lý các<br /> thuốc y học cổ truyền dân tộc, 1996, QĐ 371/QĐYT. 1996.<br /> <br /> Hình 3: Hình ảnh tế bào thận thỏ 4 (HE.200x).<br /> <br /> 2. Phan Đình Châu, Vũ Bình Dương, Nguyễn<br /> Thị Thu Hằng, Bùi Thị Thu Hà. Nghiên cứu quy<br /> trình sản xuất altretamin là thuốc điều trị ung thư.<br /> Tạp chí Dược học. 2014, số 462, tr.2-6.<br /> 3. Nguyễn Bá Đức. Hóa chất điều trị ung thư.<br /> NXB Y học. Hà Nội. 2003, tr.130-137.<br /> 4. Archives Internationales de Pharmacodynamie et<br /> de Therapie. 1966, Vol 160, p.83.<br /> 5. Cancer Research. 1980, Vol 40, p.2762.<br /> 6. Herzog TJ. Recurrent ovarian cancer: how<br /> important is it to treat to disease progression?. Clin<br /> <br /> Hình 4: Hình ảnh tế bào thận thỏ 1 (HE.200x).<br /> * Hình ảnh vi thể thận:<br /> Sau 28 ngày uống thuốc, cầu thận kích<br /> thước đều, không xung huyết, mô kẽ không<br /> viêm, ống thận không có tổn thương. Kết quả<br /> <br /> 14<br /> <br /> Cancer Res. 2004, 10 (22), pp.7439-7749.<br /> 7. National Technical Information Service. Vol<br /> PB293-046.<br /> 8. Penson RT, Seiden MV. Topotecan: weighing in<br /> when there are many options. Oncologist. 2005, 10<br /> (9), pp.698-700.<br /> <br />