Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu phát hiện một số đột biến gen ty thể trên bệnh nhân cơ não người Việt Nam

I H QU GI H N I

TRƢ NG Đ I HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trƣơng Thị Huệ

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ TRÊN BỆNH NHÂN CƠ NÃO NGƢ I VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH H C

Hà Nội, 2013 I H QU GI H N I

TRƢ NG Đ I HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trƣơng Thị Huệ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ TRÊN BỆNH NHÂN CƠ NÃO NGƢ I VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 30 15

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH H C

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA H C:

1. PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa

2. PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh

Hà Nội, 2013

I CAM ĐOAN

T i xin a an y ng nh nghi n ứ i hực hiện dưới sự

hướng dẫn của PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa v PGS.TS. Nguyễn Thị V n nh

ố iệ ế n ng ận n ng hự v hưa ng ư ai ng ố ng

ấ ng nh n h

NCS. Trương Thị Huệ

L I C M ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa, người thầy tâm huyết đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hướng cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Người thầy đã hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất, luôn dành cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt quá trình làm nghiên cứu khoa học. Tôi xin gửi đến Thầy lời tri ân nhất về những điều mà Thầy đã dành cho tôi.

i in ày tỏ lòng c ơn tới PGS. Nguy n hị ân nh, đã ch ẫn và

giúp đỡ t i trong qu tr nh thực hiện luận án.

i in chân thành c ơn đến GS.TS. Nguy n hanh Liê , Gi đốc Bệnh viện Nhi rung ương cùng c c B c sĩ Phạm Thị ân nh, B c sĩ rịnh Thúy Ngọc đã nhiệt t nh giúp đỡ, cung cấp và chia sẽ thông tin về bệnh nhân trong quá trình thu thập mẫu nghiên cứu.

Tôi xin chân thành c ơn đến toàn thể quý thầy, cô trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, rường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành c ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh –K NN, rường Đại học Quy Nhơn, c c thầy, cô giáo, các anh chị bạn è đồng nghiệp trong Khoa Sinh học, các thành viên trong nhóm nghiên cứu Phòng Protein tái tổ hợp, Phòng Thí nghiệm trọng điể ng nghệ n y và Prot in, rường Đại học Khoa học ự nhiên

i in gửi lời c ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng au Đại học, Ban hủ nhiệm Khoa Sinh học và c c Phòng chức năng của rường Đại học Khoa học ự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều iện cho t i học tập, hoàn thành c c thủ t c cần thiết của một nghiên cứu sinh.

Luận n đã được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của đề tài NAFOSTED 106.06.123.09 và b n thân t i cũng đã được hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với tư cách là một nghiên cứu sinh của đề tài.

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới c c ậc ố, chồng con, gia đ nh, những người đã lu n ên t i, cổ vũ, động viên và tạo điều iện thuận lợi nhất cho tôi có thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận n

NCS. Trương Thị Huệ

MỤC LỤC

Trang

LỜI M O N i

LỜI M N ii

M L iii

NH M K HI U V H VIẾT TẮT vi

NH M NG viii

NH M H NH V TH ix

MỞ ẦU .................................................................................................................. 1

HƯ NG 1 TỔNG QUAN TÀI LI U ........................................................... 5

1.1. CẤU TRÚC VÀ CHỨ NĂNG ỦA TY THỂ NGƯỜI ....................................... 5

1.1.1. Cấu trúc của ty thể ..................................................................................... 5

1.2. H GEN TY THỂ VÀ SỰ DI TRUYỀN CỦA CÁC GEN TY THỂ..................... 12

1.1.2. Chứ năng ủa ty thể ................................................................................. 7

1.2.1. Hệ gen ty thể ............................................................................................ 12

1.2.2. Sự di truyền theo mẹ và thuyế “nú ổ chai di truyền” .......................... 16

1.2.3. Tính chấ h ng ồng nhấ v ngưỡng biểu hiện của ột biến ................ 18

1 3 T BIẾN TRONG H GEN TY THỂ NGƯỜI VÀ CÁC B NH LIÊN

QUAN .................................................................................................................... 21

1.2.4. Tố ộ ột biến của DNA ty thể .............................................................. 20

1 3 1 ột biến iểm DNA ty thể ....................................................................... 22

1 3 2 ột biến khác trên DNA ty thể .......................................................... 29

1 4 PHƯ NG PH P PH T HI N T BIẾN GEN TY THỂ ......................... 35

1.3.3. Các bệnh i n an ến rối loạn ty thể d ột biến gen nhân .................. 33

1 4 1 ặ iểm chung của bệnh d ột biến gen ty thể.............................. 35

1 4 2 Ph n í h ột biến iểm DNA ty thể bằng PCR kết h p với RFLP ........ 38

1 4 3 Ph n í h ột biến iểm bằng x ịnh trình tự gen ................................ 39

iii

1 4 4 Ph n í h ột biến gen ty thể bằng một số phương ph p h ................ 39

HƯ NG 2 NGUYÊN LI U V PHƯ NG PH P NGHIÊN ỨU .. 43

2.1. NGUYÊN LI U ................................................................................................ 43

2.1.1. Mẫu máu .................................................................................................. 43

2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT B ................................................................... 43

2 3 PHƯ NG PH P NGHIÊN ỨU ....................................................................... 44

2.1.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác ............................................................... 43

2 3 1 T h hiế N ổng số t mẫu máu ...................................................... 44

2.3.2. Tách chiết DNA plasmid ......................................................................... 44

2.3.3. Kiể a v ịnh ư ng DNA tách chiết .................................................. 45

2.3.4. Nhân b n ạn gen ty thể chứa ột biến bằng kỹ thuật PCR .................. 46

2.3.5. Kỹ thuật PCR kết h p với kỹ thuậ a h nh hiề d i ạn cắt giới

hạn (PCR-RFLP) .............................................................................................. 46

2.3.6. Nhân dòng trực tiếp ạn gen chứa ột biến vào vector pGEM- T ........ 47

2 3 7 Gi i nh ự ạn g n hứa ột biến ................................................. 48

2 3 8 iện di DNA trên gel agarose ................................................................. 50

2 3 9 iện di DNA trên gel polyacrylamide ..................................................... 51

2 3 10 ịnh ư ng ột biến A3243G bằng kỹ thuật real-time PCR ................. 52

2 3 11 ịnh ư ng acid lactic trong máu ............................................................... 56

HƯ NG 3 KẾT QU VÀ TH O LUẬN ................................................. 57

3.1. PHÂN TÍCH Ặ TRƯNG ỦA B NH NHÂN CH N NGHIÊN CỨU

T BIẾN GEN TY THỂ ....................................................................................... 57

3 1 1 ặ iểm về bệnh lý: ......................................................................... 57

3.2. XÂY DỰNG CÁCH THỨC PHÁT HI N M T S T BIẾN IỂM TRONG

H GEN TY THỂ .................................................................................................... 60

3 1 2 ặ iểm về tuổi và giới tính: ........................................................... 59

3.2.1. Tách chiết DNA t mẫ v nh gi ộ tinh sạch ........................... 60

3.2.2. Thiết kế các cặp mồi ặc hiệu và lựa chọn enzyme cắt cho kỹ thuật PCR-

RFLP dùng ể phát hiện ột biến iểm trong hệ gen ty thể ........................ 61

3 2 3 X ịnh iều kiện thích h p cho phân tích PCR-RFLP ......................... 66

3 2 4 X y dựng ch thức phát hiện ột biến iểm trong DNA ty thể ............. 72

3.3. SÀNG L S T BIẾN GEN TY THỂ Ở B NH NHÂN

NÃO ...................................................................................................................... .73

3.3.1. Sàng lọ ột biến A3243G bằng PCR-RFLP .......................................... 73

3.3.2. Sàng lọ ột biến A8344G / mấ ạn 9 bp bằng PCR-RFLP ................ 77

3.4. SỰ BIỂU HI N CỦ T BIẾN GEN TY THỂ Ở MỨ GI NH .......... 88

3.3.3. Sàng lọ ột biến T14728C bằng PCR-RFLP ......................................... 82

3.4.1. Nghiên cứ ột biến A3243G thuộc hội chứng MELAS ........................ 88

3.4.2. Sự di truyền phân tử của ột biến mấ ạn 9 bp (nucleotide 8272-8280) .. 101

3.4.3. Sự di truyền phân tử của ột biến T14727C thuộc hội chứng ơ n ... 105

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH ......................................................................... 111

M T S ÔNG TR NH Ã ÔNG LIÊN QU N ẾN LUẬN

ÁN .......................................................................................................................... 112

TÀI LI U THAM KH O...........................................................................113

DANH MỤC C C HIỆU V CHỮ VIẾT TẮT

APS Ammonium persulfate

Amp Ampicillin

ANT Adenine nucleotide translocase

bp Base pair (cặp azơ)

BFQ Black fluorescence quencher (chất hấp phụ hu nh quang)

COII Cyt c oxidase II

CoQ Coenzyme Q CPEO Chronic progressive external ophthalmoplegia

(liệt mắ ơ ng i iến triển kinh niên)

Cyt c Cytochrome c

Cyt b Cytochrome b

D-loop Vòng chuyển vị

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate

ddH2O Deionized distilled H2O (nước cất loại ion, khử trùng)

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

EtBr Ethidium bromide FAD+ Flavin adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

FADH2 Flavin adenine dinucleotide (dạng khử)

Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside IPTG

Kilobase kb

KSS Kearns-Sayre syndrome (hội chứng KSS)

LB Luria Bertani

LHON L ’ h di a y p i n pa hy

(liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber)

LNA Locked nucleic acid (nucleotide dạng khóa)

MELAS Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes

(não giậ ơ ăng a id a i v gi tai biến mạch)

MERRF Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres

( ộng kinh giậ ơ với các s i ỏ xé rách)

MIDD Maternally inherited diabetes and deafness

(bệnh tiể ường v iếc di truyền theo mẹ)

MRI Magnetic resonance image

(hình nh chụp cộng hưởng t )

mtDNA Mitochondrial DNA (DNA ty thể)

nDNA Nuclear DNA (DNA nhân) NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng khử)

NARP Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos

(hội chứng gây liệt, mất sự iều hòa và viêm võng mạc

OD Optical density (mậ ộ quang học)

PCR Polymerase chain reaction (ph n ứng chuỗi polymerase)

PEO Progressive external ophthalmoplegia (liệ ơ ắt ngoài tiến triển)

RFLP Restriction fragment length polymorphism

(sự a h nh ạn phân cắt giới hạn)

ROS Reactive oxygen species (dạng oxy ph n ứng)

SDS Sodium dodecylsulphate

TAE Tris -Acetate-EDTA

TBE Tris -Borate-EDTA

TEMED N N N’ N’- Tetramethyl-Ethylenediamine

Tm Melting temperature (nhiệ ộ nóng ch y)

vii

X-gal 5-Bromo-4 chloro-3-indolyl--D galactopyranoside

DANH MỤC CÁC B NG

B ng 1.1. Các gen trong hệ gen ty thể ..................................................................... 14

ng 2 1 Thành phần trong b n gel polyacrylamide ............................................... 51

B ng 2.2. Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real-time PCR..............................54

B ng 3.1. ặ iểm lâm sàng và tỷ lệ bệnh nhân bị ộng .............................................57

B ng 3.2. Trình tự mồi và chế ộ nhiệt cho PCR ..................................................... 63

B ng 3.3. Enzyme giới hạn dùng ng ph n í h ột biến ......................................69

B ng 3.4. Một số ột biến trong hệ gen ty thể ư c phát hiện ở bệnh nh n ơ n ............86

B ng 3.5. Tỷ lệ ột biến A3243G của bệnh nh n v người thân trong các gia

nh ........................................................................................................................... 94

B ng 3.6. Triệu chứng lâm sàng và tỷ lệ ột biến A3243G của người con trong

viii

gia nh ..................................................................................................................... 98

DANH MỤC C C H NH

Hình 1. 1. Các hình dạng khác nhau của ty thể ........................................................... 5

Hình 1. 2. Cấu trúc của ty thể...................................................................................... 6

Hình 1.3. Cấu trúc màng trong ty thể .......................................................................... 7

Hình 1.4. Ty thể v nh a ổi năng ư ng trong tế bào .................................. 9

H nh 1 5 ơ hế của sự lão hoá theo thuyết ty thể .................................................. 10

Hình 1.6. Sự tổng h p và nh hưởng của ROS trong ty thể ..................................... 10

Hình 1.7. Hệ gen ty thể người ................................................................................... 13

Hình 1.8. Thuyết nút cổ chai di truyền ..................................................................... 17

Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide c i biến dạng LNA ............................................. 53

Hình 2.2. Nguyên lý hoạ ộng của mẫu dò Taqman ............................................... 54

Hình 2.3. Biểu ồ mộ ường biểu diễn khuế h ại (A) và biể ồ chuẩn về mối

quan hệ giữa số b n N í h ó ng ẫu chuẩn và chu k ngưỡng ương

ứng (B) ...................................................................................................................... 55

Hình 3.1.Tỷ lệ các nhóm tuổi của bệnh nhân ................................................................ 59

H nh 3 2 iện di s n phẩm DNA tổng số t mẫu máu của các bệnh nhân .............. 60

H nh 3 3 iện di s n phẩ P R nh n ạn gen chứa ột biến t mẫu máu của bệnh

nhân. .......................................................................................................................... 67

H nh 3 4 iện di s n phẩm PCR - RFLP ạn gen chứa ột biến của các bệnh nhân

................................................................................................................................... 71

H nh 3 5 iện di s n phẩ P R nh n ạn gen 3134-3331 trong hệ gen ty thể của

các bệnh nhân. ........................................................................................................... 73

H nh 3 6 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) của một số bệnh nhân

nghi bị ột biến A3243G. .......................................................................................... 73

H nh 3 7 iện di s n phẩm PCR kiểm tra kết qu biến nạp sử dụng cặp mồi

pUC19-Fw/pUC19-Rv (A) và cặp mồi MAG (B) của ột biến A3243G ................. 75

H nh 3 8 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) kiểm tra s n phẩm ............

biến nạp chứa ột biến A3243G t khuẩn lạc trắng .................................................. 75

Hình 3.9. So sánh trình tự n id ạn gen 3134-3331 của ty thể bệnh nhân ... 76

Hình 3.10. Một phần trình tự nucleotide của ạn DNA ty thể chứa ột biến

A3243G của ệnh nh n N4 .................................................................................... 76

H nh 3 11 iện di s n phẩ P R nh n ạn gen 8155-8366 trong hệ gen ty thể của

các bệnh nhân ............................................................................................................ 77

H nh 3 12 iện di s n phẩ P R ư c cắt bằng BanII của một số bệnh nhân ...... 78

Hình 3.13. iện di s n phẩm PCR kiểm tra kết qu biến nạp sử dụng cặp mồi ...........

pUC19-Fw/ pUC19-Rv (A) và cặp mồi MRAG (B)................................................. 79

Hình 3.14. So sánh trình tự n id ạn gen 8155-8366 của ty thể bệnh nhân

(mẫu BN2, phụ lụ 2) nghi ang ột biến mấ ạn với trình tự gen chuẩn ........... 80

Hình 3.15. Một phần trình tự nucleotide của ạn DNA ty thể (8155-8366) ........... 80

H nh 3 16 iện di s n phẩ P R ư c cắt bằng BanII của một số bệnh nhân ...... 81

Hình 3.17. So sánh trình tự n id ạn gen 8155-8366 của ty thể bệnh nhân .....

(mẫu BN22, phụ lụ 2) nghi ang ột biến với trình tự gen chuẩn ......................... 82

Hình 3.18. Một phần trình tự nucleotide của ạn DNA ty thể (8155-8366) chứa ột

biến G8251A ............................................................................................................. 82

H nh 3 19 iện di s n phẩm PCR nhân nh n ạn gen 14601-14753 trong hệ gen

ty thể của các bệnh nh n 83

H nh 3 20 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng DraI) của một số bệnh nhân

nghi bị ột biến T14728C ......................................................................................... 83

H nh 3 21 iện di s n phẩm PCR kiểm tra kết qu biến nạp sử dụng cặp mồi

pUC19-Fw/ pUC19-Rv (A) và cặp mồi ETC-Fw/ETC-Rv (B) ................................ 84

Hình 3.22. So sánh trình tự nucleotid ạn gen 14601-14753 của ty thể bệnh

nhân (mẫu BN7, phụ lụ 2) nghi ang ột biến T14728C với trình tự gen chuẩn .. 85

Hình 3.23. Một phần trình tự nucleotide của ạn DNA ty thể (14601-14753) chứa

ột biến T14727 ở ệnh nh n N7 ........................................................................ 85

Hình 3.24. Ph hệ các gia nh ang ột biến A3243G ........................................... 89

H nh 3 25 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) ạn g n ang ột biến

A3243G của h nh vi n ng gia nh ệnh nhân ....................................... 90

Hình 3.26. So sánh trình tự ạn gen chứa ột biến A3243G t các thành viên

của gia nh N42 ( ) v gia nh N58 ( ) .......................................................... 91

Hình 3.27. Biể ồ khuế h ại ằng a - i P R ạn gen ty thể ang ột biến

3243G ử dụng N h h nh vi n ủa 5 gia nh ệnh nh n v p a id

ang ạn g n ở nồng ộ h nha ................................................................ 95

H nh 3 28 iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng BanII) ạn g n ang ột biến

mấ ạn của h nh vi n ng gia nh ệnh nh n ang ột biến ............ 102

Hình 3.29. So sánh trình tự ạn gen chứa mất ạn 9 bp t các thành viên của

gia nh N15 ......................................................................................................... 102

Hình 3.30. Ph hệ của hai gia nh ệnh nh n ang ột biến T14727C ................ 105

H nh 3 31 iện di s n phẩm PCR-RFLP ạn g n ang ột biến T14727C của các

h nh vi n ng hai gia nh ệnh nhân ................................................................. 106

Hình 3.32. So sánh trình tự ạn gen chứa ột biến T14727C t các thành viên

của gia nh N7 ( ) v gia nh N50 ( ) .......................................................... 107

Hình 3.33. Cấu trúc bậc 2 của RNA vận chuyển acid glutamic ở ty thể người và vị

í ột biến T14727C . ............................................................................................. 108

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Ty hể bào quan ó ặ ng hầu hết ế nhân chuẩn với chứ năng

chính là s n xuấ năng ư ng dưới dạng ATP cho tế bào. Ty thể tạo ra năng ư ng

bằng cách oxy hóa các acid hữ ơ v a id é thông qua quá trình phosphoryl hóa

oxy hóa x y ra bên trong ty thể. ATP là nguồn năng ư ng lớn ư c sử dụng cho tất

c nh a ổi chất cần thiết bên trong tế bào.

Ty thể có hệ gen riêng, có cấu trúc s i i, DNA mạch vòng với í h hước

16.569 bp, gồm 37 gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptide của chuỗi vận chuyển iện

tử, 22 RNA vận chuyển (tRNA) và 2 RNA ribosome (rRNA) khác nhau liên quan

ến hoạ ộng chứ năng ủa y hể. So với DNA của nhân tế bào thì DNA của ty

thể dễ bị tổn hương d ty thể là một i ường giàu chất oxy ph n ứng và do thiếu

ơ hế sửa chữa hiệu qu dẫn ến nhiề ột biến xuất hiện trong hệ gen ty thể. Nă

1988, Wallace và tập thể ng ố ột biến iể ầu tiên trên hệ gen ty thể người

gây bệnh i n an ến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (L ’ h di a y

optic neuropathy - LHON). Sự mấ ạn N ũng ư c tìm thấy ở ơ ủa

bệnh nhân liệ ơ ắt ngoài tiến triển mãn tính (chronic progressive external

ophthalmoplegia - CPEO) và hội chứng Kearns-Sayre (KSS) ũng ư c phát hiện

vào cùng nă 1988. h ến nay hơn 300 ột biến khác nhau trong hệ gen ty thể

người ư x ịnh, trong ó ó hơn 200 ột biến có kh năng g y ệnh và kèm

theo nhiều hội chứng khác nhau.

Gần như ất c các tế ều dựa vào nguồn năng ư ng ổn ịnh do ty thể

cung cấp, d ó những sai hỏng trong DNA của ty thể có thể gây ra sự rối loạn a

hệ thống nh hưởng ến nhiều loại tế bào, nhiều loại mô và tổ chức. Các bệnh do

ột biến gen ty thể có thể khởi phát ở mọi lứa tuổi với diễn biến khác nhau. Mứ ộ

nghiêm trọng của bệnh ty thể ăng h ộ tuổi và tỷ lệ DNA ty thể (mtDNA) ột

biến có mặt trong các mô bị ộng. Biểu hiện lâm sàng do các rối loạn ty thể thay

ổi rất lớn, có thể i n an ến nhiề ơ an phức tạp hoặ ặ ưng h ng mô.

Các triệu chứng lâm sàng hay thấy ở n ơ ắt và giác quan. Các triệu chứng ó

có thể kết h p với nhau trong các hội chứng riêng biệ như hội chứng KSS, hội

chứng não giậ ơ è h i ơ ỏ xé rách (myoclonic epilepsy with ragged-red

fibres – MERRF), hội chứng não giậ ơ ăng a id a i v gi tai biến mạch

(mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes – MELAS)

hoặc viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh (hội chứng Leigh). Tuy nhiên các triệu

chứng ó ũng ó hể không nằm trong một bệnh c nh cụ thể nào, mộ v i ột biến

thể hiện kiể h nh ương ự nhau làm cho việc chẩn n ệnh dựa trên lâm sàng trở

nên rấ hó hăn. Vì vậy bệnh d ột biến gen ty thể hó ó ư c những chẩn n

chính xác nếu chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng và các chỉ tiêu cận lâm sàng.

Hiện nay, phân tích DNA là những phương ph p hiện ại nhất cho phép phát hiện

nhanh v hính x ột biến gen gây bệnh. Nghiên cứ ột biến trong hệ

gen ty thể cho phép phát hiện ra nguyên nhân của nhiều bệnh khác nhau.

Hiện nay, trên thế giới ó nhiều công trình nghiên cứu về bệnh d ột

biến gen ty thể. Tuy nhiên, do tính phức tạp ng ộng lâm sàng, mô bệnh học,

ơ hế phát sinh và biểu hiện bệnh nên sự sai sót trong hệ gen ty thể ở nhiều bệnh

nhân vẫn hưa ư c phát hiện v h ng ó phương ph p iều trị hiệu qu .

Ở Việt Nam, bệnh d ột biến gen ty thể òn í ư c nghiên cứu, h ến

nay chỉ mới có một vài công trình mang tính chất khởi ầu trong phát hiện bệnh ty

thể ở mứ ộ gen và protein. ặc biệ hưa ó ng nh n i nghi n ứu

mứ ộ h ng ồng nhất (heteroplasmy) của ột biến gen ty thể ũng như ự liên

quan giữa mứ ộ h ng ồng nhất với triệu chứng lâm sàng của bệnh.

ề tài luận án của húng i ư ặt ra với mục tiêu áp dụng và thiết lập

phương ph p phân tích chính xác v x ịnh mứ ộ h ng ồng nhất một số ột

biến gen ty thể ở các bệnh nh n người Việt Nam nhằm góp phần vào công tác khám

và iều trị các bệnh do rối loạn hệ gen ty thể.

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Xây dựng ư c cách thức phát hiện một số ột biến gen ty thể phổ biến và

sàng lọc ột biến gen ty thể này ở bệnh nh n ơ n (encephalomyopathy).

- Thiết lập ư c phương ph p x ịnh mứ ộ h ng ồng nhấ của một

loại ột biến gen ty thể (MELAS) ể ướ ầu tìm hiểu mối liên quan giữa ứ ộ

h ng ồng nhấ và tình trạng bệnh lý.

3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài

Đối tượng nghiên cứu của đề tài:

Các bệnh nhân nghi bị bệnh do rối loạn ty thể ến h v iều trị tại Bệnh

viện Nhi T ng ương

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Thu thập mẫu bệnh phẩm và tách chiết DNA tổng số t các bệnh nhân nghi

bị bệnh do rối loạn ty thể ến h v iều trị tại Bệnh viện Nhi T ng ương

- Thiết kế mồi ặc hiệu và lựa chọn enzyme giới hạn phù h p cho việc sàng

lọc phát hiện ột biến gen ty thể bằng kỹ thuật PCR-RFLP.

- Xây dựng cách thức phát hiện một số ột biến gen ty thể phổ biến và áp

dụng cách thức thiết lập ư c ể sàng lọ ột biến này ở người Việt Nam,

nghiên cứ ột biến gen ty thể ở mứ ộ gia nh

- ịnh ư ng số b n a ang ột biến bằng phương ph p a -time PCR sử

dụng mẫu dò hu nh quang c i tiến, tìm hiểu sự liên quan giữa mứ ộ h ng ồng

nhất và tình trạng bệnh lý của một loại ột biến gen ty thể.

4. Địa điểm thực hiện đề tài

Các nghiên cứu của luận n ư c thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng iểm

Công nghệ Enzy v P in T ường ại học Khoa học Tự nhi n ại học Quốc

gia Hà Nội.

5. Đóng góp mới của đề tài

- ã thiết lập ư c cách thức phát hiện 15 loại ột biến iểm trong hệ gen ty

thể ở người Việt Nam bao gồm: các ột biến T3271C và T3291C (hội chứng

MELAS); A8344G và T8356C (hội chứng MERRF); G11778A, G3460A và

T14484C (hội chứng LHON); T8993G/C và T9176G (hội chứng Leigh), A1555G

(hội chứng iếc) v ột biến G4298A, T10010C, T14727C, T14728C và

T14709C (hội chứng ơ n nói h ng).

- Thiế ập ư phương ph p ph hiện v ịnh ư ng ứ ộ h ng ồng

nhấ ủa ộ iến 3243G h ộ hội hứng MEL S v ướ ầ h hấy ối liên

quan giữa mứ ộ h ng ồng nhấ và tình trạng bệnh lý.

- L ng nh ầu tiên phát hiện thấy ột biến mới T14727C trên gen

MTTE mã hóa cho tRNAGlu ở bệnh nh n ơ n .

6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài

Cách thức phát hiện các ột biến gen ty thể ư c tạo ra trong nghiên cứu

này có thể dễ dàng phát triển h nh y nh ể áp dụng vào việc xét nghiệm

bệnh do rối loạn ty thể ở các bệnh viện.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CẤU TRÚC V CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƢ I

1.1.1. Cấu trúc của ty thể

Ty thể là bào quan có ở hầu hết các tế bào nhân thật, bắ ầ ư c nghiên

cứu t giữa thế kỷ XIX Nă 1857, nhà gi i phẫu họ người Thụy Sĩ K i ần

ầu tiên tìm thấy bào quan này trong tế ơ Hơn a ươi nă a (1890), nhà

mô họ người ức, Richard Altmann, bằng phương ph p nh ộm fuchsine an

sát ư c ty thể ở nhiều tế h nha dưới kính hiển vi quang học.

Hình dạng ặ ưng ủa ty thể là thon dài với ường kính 0,5-2 µm và chiều

dài 7-10 µm (hình 1.1 A). Phụ thuộc vào trạng thái tế bào hay loại tế bào, ty thể có

hình dạng v í h hước khác nhau (hình 1.1 B, C). Ty thể có kh năng hay ổi

í h hước, hình dạng, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấ ú d i hơn h ặc

phân ra thành những cấu trúc ngắn hơn Ng i a, ty thể có kh năng di h yển ể

ph n ứng với những hay ổi sinh lý trong tế bào [30].

Hình 1. 1. Các hình dạng khác nhau của ty thể [30]

A: Dạng thon dài, B và C: Dạng biến ổi

Trong tế bào, ty thể nằm r i rác ở nguyên sinh chấ nhưng ũng ó hể nằm

tập trung ở khu vực cần nhiề năng ư ng như i ủa tinh trùng. Số ư ng của ty

thể ở một tế ũng phụ thuộc vào nhu cầu sử dụng năng ư ng của tế ó ó

thể t vài ty thể ở tế da h ến vài nghìn ty thể ở tế ơ [30].

Ty thể có cấu trúc gồm hai lớp màng lipoprotein, màng ngoài và màng trong,

ương ự như màng sinh chất. Hai lớp màng này bao lấy chất nền ở phía trong,

khoang giữa hai ng ư c gọi là xoang gian màng. Màng trong ty thể ăn v

chất nền tạo thành các ăng ư c [16, 38].

Hình 1. 2. Cấu trúc của ty thể

[http://micro.magnet.fsu.edu/cells/mitochondria/mitochondria.html]

Màng ngoài ty thể ó ộ d y 6 n ng ó p in hiếm kho ng 60% và

lipid chiếm kho ng 40%. Màng có nhiều protein lỗ (porin), kênh ion cho phép các

chất với khối ư ng phân tử lớn ến 10 kDa và các ion di chuyển tự do t ngoài

nguyên sinh chấ v x ang gian ng v ngư c lại. Màng ngoài ty thể còn chứa

nhiều enzyme quan trọng như các transferase, các kinase, cytochrome-reductase,

acyl CoA synthetase [16]. Màng trong của ty thể ũng ng ip p in ó ộ

dày 6 nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%, và mộ ư ng nhỏ cholesterol. Tỷ lệ

giữa cholesterol/phospholipid là 1/53. Màng trong ăn v hất nền tạo nên các

ăng ư c. Cấ ú “ ” ăng diện tích bề mặt của màng trong gấp ba lần

so với màng ngoài và iề n y i n an ến chứ năng của nó là ăng ường vận

chuyển iện tử và tổng h p ATP. Màng trong chứa nhiều protein vận chuyển chủ ộng ATP, ADP, acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na+, K+, Ca2+ và H+. M ng ng nơi ủa 5 phức h p thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận

chuyển iện tử (phức h p I-IV), ATP synthase (phức h p V, còn gọi là F1F0- ATPase) và adenine nucleotide translocase (ANT) [16, 38].

Hình 1.3. Cấu trúc màng trong ty thể [73]

Xoang gian màng (khoang hẹp giữa màng ngoài và màng trong ty thể) nơi trung chuyển các chất giữa hai màng. Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ t chất

nền i a d h ạ ộng của chuỗi vận chuyển iện tử, chứa cytochrome c (Cyt c) là

chấ ang iện tử ơ ộng cho chuỗi hô hấp, gi i phóng Cyt c v ương sẽ

hoạt hóa enzyme caspase có vai trò trong quá trình tự chết của tế bào (apoptosis).

Chất nền (matrix) của ty thể chứa các enzyme của chu trình Krebs, các

enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty

thể Như vậy, ở tế bào ộng vật, thực vậ v người ngoài hệ gen nhân, còn có hệ gen

tế bào chất nằm trong ty thể [16, 38].

Khi ạ í h hước lớn tối a y hể tiến h nh ph n i tạo ra hai ty thể mới.

T ước tiên, hệ gen ty thể ư c sao chép ể ăng ố ư ng b n a Sa ó ng

trong thắt lại rồi ến màng ngoài và hai ty thể con tách nhau ra. Tuy nhiên, nhiều ty

thể h ng ph n i v ị phân hủy ng yz h ơ hế tự tiêu (autophagy).

ơ hế này giúp duy trì số ư ng ty thể ặ ưng ng ột tế bào [30].

1.1.2. Chức năng của ty thể

1.1.2.1. y thể và qu tr nh trao đổi năng lượng trong tế ào

Ty thể là bào quan s n xuấ năng ư ng cho tế bào bằng cách oxy hóa các

h p chất hữ ơ tạo ra CO2, H2O và gi i phóng toàn bộ năng ư ng (hình 1.4). Các ph n ứng n y ư c xúc tác bởi các phức h p của chuỗi hô hấp I, II, III và IV nằm ở

màng trong của ty thể [36, 61]. Nguồn tạ a năng ư ng trong ty thể là

carbohydrate, chất béo và protein ư c lấy t thứ ăn ng ó hủ yếu là

carbohydrate. Các h p chấ n y ư c oxy hóa ể tạo ra các chất khử gi năng

ư ng a ó ương ư ng khử ư c chuyển h nh năng ư ng dự trữ ở dạng

liên kế ph pha a năng ng TP thông qua n ường hóa thẩm. Có hai giai

ạn tạo ra ATP ở ty thể ó h nh K diễn ra trong chất nền và quá trình

phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển iện tử nằm ở màng trong ty thể với sự

xúc tác của các phức hệ enzyme.

Các h p chất carbohydrate, chủ yếu là glucose ư c phân cắt và biến ổi qua

nh ường phân (glycolysis) tạo thành s n phẩm cuối cùng là pyruvate, một ít

năng ư ng ATP và chất khử NADH. Pyruvate sau khi ư ưa v y hể thì bị

oxy hóa decarboxyl hóa ể tạo thành acetyl-CoA (acetyl-CoA có thể t quá trình

oxy hóa acid béo) và tiếp tụ ư c oxy hóa hoàn toàn trong chu trình Krebs ể tạo

thành CO2, H2O và năng ư ng gi i phóng chủ yếu ư c tích trữ dưới dạng ATP. Trong quá trình oxy hóa các h p chất thông qua h nh K iện tử và proton H+ ư c tách ra và chuyển ến các phân tử nhận iện tử là NAD+ và FAD trong

chuỗi vận chuyển iện tử ể tạo thành NADH và FADH2. Chuỗi vận chuyển iện tử gồm 4 phức h p bao gồm nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase

(NADH-CoQ reductase) (phức hệ I), succinate CoQ reductase (phức hệ II),

ubiquinol cytochrome b reductase (phức hệ III), cytochrome c oxidase (phức hệ IV)

và hai phân tử vận chuyển iện tử giữa các phức hệ là coenzyme ubiquinone (CoQ)

và Cyt c. Phức hệ I và II xúc tác cho sự nhận iện tử của CoQ t NADH và

succinate. Phức hệ III xúc tác cho quá trình chuyển iện tử t Q ến Cyt c. Cuối

cùng phức hệ IV xúc tác sự vận chuyển iện tử t Cyt c tới chất nhận cuối cùng là

oxy phân tử. Ở mỗi ước, iện tử i a phức hệ năng ư ng ư c gi i phóng ra kèm theo việc ơ các proton (H+) t chất nền qua màng trong ra xoang gian

màng và làm xuất hiện iện thế màng. Nhờ thế, hệ thống ATP synthase hoạ ộng

và tổng h p ATP t ADP và ph pha v ơ (Pi).

ATP là nguồn năng ư ng lớn ư c sử dụng cho tất c nh a ổi

chất cần thiết bên trong tế bào [37, 73] ó khi ty thể bị tổn hương quá trình

s n inh a năng ư ng ể cung cấp cho tế v ơ hể bị chậm lại, thậm chí bị

ng ng lại hoàn toàn.

Hình 1.4. Ty thể và quá trình trao đổi năng lƣợng trong tế bào [100]

Gần như ấ ế ề dựa v ng ồn năng ư ng ổn ịnh d y hể

ng ấp d ó ự ổn hương ủa y hể ó hể g y a ự ối ạn a hệ hống, nh

hưởng ến nhiề ại ế nhiề ại v ơ an T iệ hứng ủa ệnh y hể

h ng giống nha ởi v người ệnh ó hể ó ộ hỗn h p y hể nh hường ẫn

y hể ộ iến với ự ph n ố i ng ng ơ hể i hi ố y hể nh hường ủ

ể ù ắp h những y hể ị ộ iến [38].

1.1.2.2. Ty thể và quá trình lão hóa

Lão hóa là một quá trình sinh học phức tạp, x y ra tất yế ng ơ hể sinh

vậ v h ng i n an ến ơ hế tế bào chết h hương nh (apoptosis).

Thuyết gốc tự d i n an ến lão hoá lần ầu tiên ư ề xuất bởi Harman

v nă 1956. Thuyết này cho rằng ty thể là nguồn gốc của phần lớn các dạng oxy

ph n ứng ROS (reactive oxygen species,hình 1.5). Theo thuyết này, những tổn

hương í h ỹ theo tuổi ng N ng y n nh n i è với những rối

loạn chứ năng y hể, dẫn tới việc s n xuất nhiều ROS và phá huỷ mtDNA. Kh

năng ạ năng ư ng ATP của ty thể gi v ăng nh xy h hư hại cấu

thành tế bào [38, 63, 84].

Hình 1.5. Cơ chế của sự lão hoá theo thuyết ty thể [54]

Hô hấp tế bào là nguyên nhân sinh ra các gốc tự do gắn liền với b n chất của

sự sống. Sự hô hấp tế bào về b n chất là sự chuyển iện tử t chấ dinh dưỡng ến

oxy phân tử thông qua phức hệ các enzyme vận chuyển iện tử trong ty thể. Hơn 95%

O2 ư c tiêu thụ bởi ty thể và biến ổi ể tạo thành H2O ở cytochrome oxidase

(phức hệ IV của chuỗi hô hấp). Kho ng 2-4% O2 nhận iện tử ở các mức khác nhau và trực tiếp tạo ra các gốc tự do oxy ph n ứng (gốc superoxide – O.- 2, peroxide hydro – H2O2 và gốc hydroxyl ph n ứng – OH-,hình 1.6). Các gốc tự do có hại khi

có mặt mộ ư ng lớn v h ng ư c trung hòa bởi các chất chống oxy hóa. Các

gốc tự do này có thể làm tổn hương màng tế bào, DNA và các enzyme của quá

trình phosphoryl hóa oxy hóa [38].

Hình 1.6. Sự tổng hợp và ảnh hƣởng của ROS trong ty thể [15]

Trong số ROS h ộc hại nhất là gốc HO*, vì nó là gốc tự d iển hình

có kh năng h ạ ộng khá mạnh. ROS có thể tác dụng lên các chất có khối ư ng

phân tử lớn theo cách liên ứng, chúng lần ư t tạo ra các gốc tự do t các phân tử bị

tấn công nối tiếp nhau, gốc tự d a ư c tạo thành t các phân tử ước và

khuế h ại tác dụng tấn ng an ầu.

Gốc tự do có thể phá rách màng tế bào khiến chấ dinh dưỡng thất thoát, tế

h ng ăng ưởng h ng ư c sửa chữa và chết. ROS phá hủy hoặ ngăn n

sự tổng h p p in ipid ường, tinh bột, enzyme trong tế bào, làm cho collagen,

elastin mấ ính n hồi khiến da nhăn nh ơ hớp cứng nhắc.

ROS và các gốc tự do g y a ột biến gen, ăng ự h nh h nh v í h ũy

ột biến DNA ty thể ở các mô trong quá trình lão hóa. ồng thời các gốc tự do

oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại việc loại th i chất bã và tiếp nhận chất dinh

dưỡng; ROS tấn công ty thể, lạp thể khác và phá vỡ nguồn cung cấp năng ư ng,

các gốc tự do làm gi m kh năng iều hòa và hoạt tính xúc tác của enzyme dẫn ến

ơ hể h ng ăng ưởng ư Gốc tự do là nguyên nhân của sự tự huỷ hoại, sự

lão hoá ở cấp ộ tế bào [38, 42, 63].

mtDNA ịnh vị ở màng trong ty thể ư c xem là thuận l i cho quá trình hô

hấp nhưng ại rất gần với bộ phận s n sinh ra ROS. Gốc tự do superoxide tấn công

trực tiếp vào DNA của tế bào hoặc làm xuất hiện các gốc tự do thứ phát có kh

năng ấn công DNA và protein. Theo thuyết ty thể về lão hoá, việc tích luỹ những

tổn hương ở các thành phần bên trong ty thể bao gồm mtDNA, protein, lipid làm

nh hưởng ến chứ năng của ty thể. Nói chung, những tổn hương của mtDNA

trong phạm vi rộng với thời gian dài dẫn ến ty thể bị rối loạn, thậm chí ng ng hoạt

ộng là nguyên nhân làm cho tế bào chế v ơ hể bị lão hoá.

1.2.2.3. Ty thể và quá trình tự chết của tế bào (apoptosis)

Ty thể óng vai ò h n hốt trong quá trình tự chết của tế bào. y là một

quá trình quan trọng trong sự phát triển v iều hành mô của sinh vậ a

Chết tế h hương nh ó i n an ến 1.500 gen phân bố trong

nhân và ty thể [76, 103]. Tuy nhiên, vai trò của ty thể ng “ hế h hương nh”

rất phức tạp và hưa ư c biế ến ầy ủ; có thể quá trình tạ năng ư ng của ty

thể có liên quan tới “ hế h hương nh”; có thể do chuỗi hô hấp của ty thể tạo

ra s n phẩm phụ là các dạng ROS và d ơ hế sửa chữa của hệ gen ty thể kém nên

Ty hể òn ó h năng í h ũy v giữ ư ng i n anxi iề n y ấ an

ng ăng nh này.

ọng ng việ iề hòa a ổi hấ ổng h p TP v iề hòa hần inh hể

dị h. Ng i a y hể òn óng ộ vai ò an ọng ng nhiề nh h yển

hóa khác như làm ổn hương ế hần inh d h hấ ng gian

g a a ăng inh ế iề hòa ạng h i xy hóa- hử ủa ế ổng h p

nhân heme, steroid [69].

1.2. HỆ GEN TY THỂ V SỰ DI TRUYỀN CỦA C C GEN TY THỂ

1.2.1. Hệ gen ty thể

Ty hể an hiế h i ng ế ó hệ g n i ng nh n n ộ ập

với hệ g n nh n Hệ g n ủa y hể người ư ay n ần ầ i n v nă

1967 ến nă 1981 nd n ng ố nh ự v ấ ú ủa hệ g n y hể

người [9, 16].

mtDNA người tồn tại ở dạng mạch vòng, s i i ó í h hước 16.569 bp,

bao gồm 37 gen (b ng 1.1) mã hóa cho 2 phân tử rRNA, 22 phân tử tRNA và 13

phân tử protein là thành phần cần thiết trong các phức h p của chuỗi hô hấp. ND1-

ND6 và ND4L mã hóa 7 tiểu ơn vị của phức hệ I (NADH–ubiquinone

oxidoreductase), cytochrome b (Cyt b) là tiể ơn vị của phức hệ III chỉ ư c mã

hóa bởi mtDNA (ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX1-3 (COI-COIII)

mã hóa cho 3 tiể ơn vị của phức hệ IV (cytochrome c oxidase-COX), các gen

ATP 6 và ATP 8 mã hóa cho 2 tiể ơn vị của phức hệ V, chính làATP synthase

(hình 1.7). Các phân tử protein còn lại của chuỗi hô hấp ư c mã hóa bởi gen nhân,

ư c dịch mã trong tế bào chất a ó ư c vận chuyển vào bên trong ty thể [56].

ặc biệt, hệ gen ty thể chứa ít trình tự không mã hóa xen kẽ giữa các vùng mã hóa. D-loop nằm giữa gen tRNAPhe (MTTF) và tRNAPro (MTTP), dài kho ng 1,1 kb là

vùng không mã hóa lớn nhất và có vai trò quan trọng iều hòa quá trình sao chép

và phiên mã của hệ gen ty thể, chứa promoter cho sự phiên mã chuỗi nặng (chuỗi

H), chuỗi nhẹ (chuỗi L) và chứa iểm khởi ầu của quá trình tái b n. Có một số

ạn ngắn và cặp base của hệ gen ty thể không liên quan trực tiếp ến sự mã hóa

cho RNA hoặc protein (chẳng hạn như n id ad nin ở vị trí 7517 và trình tự 5

bp t 5580–5586 giữa gen mã hóa tRNA vận chuyển Trp và tRNA vận chuyển Ala).

D-loop chứa 3 ạn ngắn HVS-I, HVS-II và HVS-III ương ứng với HVR1, HVR2

và HVR3 ở một vài loài. Chứ năng ủa vùng n y hưa ư c biế ầy ủ nhưng

dường như húng an ọng ối với quá trình tái b n và phiên mã của hệ gen. Hai

gen mã hóa cho rRNA (rRNA 12S và 16S) và 22 gen mã hóa h 22 RN ư c

nằm giữa các gen mã hóa cho protein. Các gen này cung cấp các RNA cần thiết cho

sự tổng h p protein bên trong ty thể. a ố h ng in ư c mã hóa trên chuỗi nặng,

gồm các gen mã hóa cho 2 rRNA, 14 tRNA và 12 chuỗi polypeptide. Các gen trên

chuỗi nhẹ mã hóa cho 8 tRNA và 1 chuỗi polypetide.

Hình 1.7. Hệ gen ty thể ngƣời

Các gen mã hóa các tiể ơn vị của phức I (ND1-ND6 và ND4L) có màu xanh, Cyt c

oxydase (COI-COIII) ó ỏ, Cyt c của phức hệ III có màu xám và các tiể dơn vị của

ATPase synthase (ATPase 6 và 8) có màu vàng; 2 rRNA (rRNA 12S và 16S) có màu tím

v 22 RN ó n [100].

Bảng 1.1. Các gen trong hệ gen ty thể [16]

Sản phẩm

Gen

Vị trí

ATPase 6 của ATP synthase (phức h p V)

MTATP6

8527–9207

ATPase 8 của ATP synthase (phức h p V)

MTATP8

8366–8572

Tiể ơn vị I của Cyt c oxidase (phức h p IV)

MTCO1

5904–7445

Tiể ơn vị II của Cyt c oxidase (phức h p IV)

MTCO2

7586–8269

Tiể ơn vị III của Cyt c oxidase (phức h p IV)

MTCO3

9207–9990

14747–15887

Apocytochrome b subunit of ubiquinol (phức h p III)

MTCYB

ND1 của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

MTND1

3307–4262

ND2 của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

MTND2

4470–5511

ND3 của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

MTND3

10059–10404

ND4 của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

MTND4

10760–12137

ND4L của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

MTND4L

10470–10766

ND5 của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

MTND5

12337–14148

ND6 của ubiquinone oxidoreductase (phức h p I)

MTND6

14149–14673

MTRNR1

1671–3228

rRNA 16S

MTRNR2

648–1601

MTTA

5587–5655

MTTC

5761–5826

MTTD

7518–7585

MTTE

14674–14742

MTTF

577–647

MTTG

9991–10058

MTTH

12138–12206

MTTI

4263–4331

MTTK

8295–8364

MTTL1

3230–3304

MTTL2

12266–12336

MTTM

4402–4469

MTTN

5657–5729

MTTP

15955–16023

MTTQ

4329–4400

MTTR

10405–10469

MTTS1

7445–7516

MTTS2

12207–12265

MTTT

15888–15953

MTTV

1602–1670

MTTW

5512–5576

MTTY

5826–5891

rRNA 12S tRNAAla tRNACys tRNAAsp tRNAGlu tRNAPhe tRNAGly tRNAHis tRNAIle tRNALys tRNALeu (UUR) tRNALeu (CUN) tRNAMet và tRNAfMet tRNAAsn tRNAPro tRNAGln tRNAArg tRNASer tRNASer tRNAThr tRNAVal tRNATrp tRNATyr

Khác với DNA nhân (nDNA), mtDNA không liên kết với protein histone,

iều này làm cho mtDNA giống DNA của vi khuẩn. DNA ty thể không có intron

(ngoại tr một số nucleotide không mã hóa ở giữa một vài gen) và có các gen nằm

gối lên nhau.

Hệ g n y hể a hép ộ ập với hệ g n nh n ằng ộ hệ hống i ng

trong ty hể nhưng enzyme cho quá trình i n ại d hệ g n nh n hóa Q

nh phi n v dị h ủa N ư iề hiển ởi g n nh n Hệ g n y hể

ư phi n ộ iể hởi ầ nằm trên vùng D-loop, n phi n a ó

ư nd n a ph n ắ ể h nh h nh n n ph n ử RN rRNA 12S và

16S, RNA thông tin (mRNA) iền h n Ph n ử RN h n hiện ủa y hể h ng

ư gắn ũ nhưng ư gắn i p y [9].

iểm khởi ầu sao chép (origin) ở hai mạch H và L là khác nhau và duy nhất.

Quá trình sao chép của ty thể vẫn là một vấn ề ang ư c nghiên cứu và bàn luận.

T ng ó hai h nh hiế ư hế là tái b n chuyển vị (displacment replication),

ng ó ạch mới bổ sung với mạ h H ư c tổng h p gần hoàn thiện thì mạch mới

bổ sung với mạch L mới bắ ầu tổng h p; tái b n đồng thời (symmetric

p i a i n) ng ó hai ạch mới ư c tổng h p ồng thời [23].

Ty thể người có hệ thống dịch mã riêng với các mã di truyền ặc biệt là mã

khởi ầu và mã kết thúc có nhiề iểm khác biệt so với các mã di truyền của hệ gen

nhân. Ở N người, bộ ba UGA chỉ mã hóa cho tryptophan mà không ph i là bộ

ba kết thúc, AUA mã hóa cho methionine mà không mã hóa cho isoleucine, AGA

và AGG là các bộ ba kết thúc, AUA và AUG là các bộ ba khởi ầu. Gen COI và

URF6 có mã kết thúc là AGA và AGG hay gen ATP6 có mã khởi ầu là GUG [9].

C 22 phân tử tRNA do hệ gen ty thể hóa ều tham gia vào quá trình tổng h p

các protein. Ở người, các nhà nghiên cứu không tìm thấy hiện ư ng phân tử tRNA

do hệ g n nh n hóa i nguyên sinh chất vào ty thể ể tham gia tổng h p

protein [49]. Tuy nhiên, ở một số ối ư ng h như nấm men, hiện ư ng này có

x y a v hướng nghiên cứ ơ hế vận chuyển tRNA t tế bào chất vào ty thể ở ối

ư ng trên mở ường h phương ph p ưa RN nh hường vào ty thể của người ể

iều trị các bệnh i n an ến ột biến trên gen tRNA của ty thể [89].

Các tế người có thể chứa hàng ngàn b n sao mtDNA trong một tế bào và

có số ư ng da ộng tùy thuộc vào nhu cầu sử dụng năng ư ng của t ng loại tế

bào. Số b n sao mtDNA gi m nhiều lần trong quá trình tạ inh ùng nhưng dường

như ăng ột ngột trong quá trình tạo trứng. Số ư ng b n sao N hay ổi rất

lớn ở h nha v ư c kiểm soát nghiêm ngặt trong thời k ầu của quá

trình phát triển của ộng vật. Số b n sao N ăng hi nh a ổi chất

ăng [16].

1.2.2. Sự di truyền theo mẹ và thuyết “nút cổ chai di truyền”

Sự di yền ủa các gen trên N ự di yền a ế hấ ối với

g n nằ ng nh n ủa ế inh vậ nh n h ẩn húng n h y

ậ h ạ ộng ủa nhiễ ắ hể ng ơ hế ph n Nhưng hệ g n y hể ại

h ng n h những y ậ ó ính ạng d húng x ịnh ó những

iể di yền i ng ặ ưng h húng Giống như ấ N ng i nh n

N ư di yền h ẹ Người ẹ yền hệ g n y hể h người n

và hỉ ó những người con gái ới yền hệ g n ó h hế hệ iếp h o.

Ở người ế ứng ó ấ nhiề y hể h ng hơn 100 000 n a ng

hi ó inh ùng hỉ hứa h ng 100-1.500 n a ập ng ở i inh ùng

Khi hụ inh nh n inh ùng i v ứng òn i inh ùng ụng a ế inh

ùng hỉ óng góp hệ g n nh n h ế ứng hứ h ng óng góp hệ g n y hể

ó gần như h ng ó y hể ủa inh ùng i v ng ứng nhưng nế ó h

ế ứng ó ơ hế i diệ y hể n y V vậy y hể ng h p ử ới ạ

thành hoàn toàn là ủa ế ứng v ấ ính ạng ư hóa n hệ g n

y hể ư di yền ẹ ang n [16]. Tuy nhiên, ối ạn ủa N

h ng ph i n n ư di yền h ẹ Mộ v i ộ iến iể x ấ hiện ở

ứ ộ hể v hỉ ở ộ ố Mấ ạn với í h hướ ớn ng N

hường x y a ngẫ nhi n v h ng ư ph hiện ở người ẹ h ặ hế hệ con cái

[92]. Th hống h ng 2/3 ệnh i n an N hứa ộ iến ư di

yền h ẹ òn 1/3 ối ạn ở dạng ngẫ nhiên [22].

ột biến N ư c truyền t mẹ sang con nhưng ỷ lệ số b n sao mang

ột biến ở mẹ và con khác nhau, các cá thể mang ột biến trong một ph hệ gia nh

ũng ó ự hay ổi về tần suấ ột biến vì vậy mứ ộ biểu hiện bệnh ở mẹ và các

con có thể rất khác nhau. Sự hay ổi tỷ lệ ột biến trong số các con của mộ người

phụ nữ ư x ịnh ở giai ạn ầu trong quá trình tạo trứng ở người mẹ ước

hi h nh h nh n n ầu tiên. Các nghiên cứu ở nhiều ph hệ cho rằng ơ hế

ương ự ũng h ạt ộng trong quá trình truyền ột biến mtDNA gây bệnh [23]. Một

nghiên cứ x ịnh tỷ lệ ột biến ở 82 n n ơ ấp t buồng trứng ắt bỏ

của mộ người phụ nữ ang ột biến A3243G cho thấy tần suất phân bố của ư ng

ột biến ng n n như dự n h “ h yết nút cổ hai” ó nhiều noãn

bào có tỷ lệ ột biến lớn hơn tỷ lệ trung bình và nhiều noãn bào có tỷ lệ ột biến

nhỏ hơn (tỷ lệ ột biến A3243G trung bình trong nghiên cứu này là 12%). iều này

chứng tỏ rằng tỷ lệ ột biến 3243G ng n n ơ ấp của người n

n y ư c quyế ịnh bởi sự di truyền ngẫu nhiên qua “nút cổ chai di truyền” x y ra

ở giai ạn ầu trong quá trình phát triển ở tử cung [22].

Trứng của người phụ nữ ư c hình thành ở giai ạn rất sớm trong quá trình

phát triển. Tế bào tiền thân phân chia thành nhiều trứng, vì thế ty thể t tế ó

ư c phân phối ngẫu nhiên thông qua các trứng này và chỉ có mộ ư ng nhỏ phân

tử mtDNA t người mẹ ư c truyền cho thế hệ sau. Các trứng khác nhau có thể

chứa mộ ư ng N ột biến h nha iều này quyế ịnh ư ng nguyên liệu

di truyền ột biến ư c truyền cho thế hệ sau. Sự khác nhau này có thể gi i thích sự

khác nhau về mứ ộ nghiêm trọng của bệnh giữa người con [80, 96].

Các nghiên cứ n hứng tỏ sự tồn tại nút cổ chai di truyền trong sự di

truyền của DNA ty thể nghĩa hỉ có mộ ư ng nhỏ phân tử mtDNA t người mẹ

ư c truyền cho thế hệ sau (hình 1.8).

Hình 1.8. Thuyết nút cổ chai di truyền [100]

1.2.3. Tính chất không đồng nhất và ngƣỡng biểu hiện của đột biến

Các tế bào chứa nhiều b n sao mtDNA. Vì vậy, khi xuất hiện ột biến thì

trong cùng một mô có thể có c N nh hường và mtDNA ột biến, hiện

ư ng n y ư c gọi là ính h ng ồng nhất (heteroplasmy) của mtDNA, còn nếu

tất c các b n sao của mtDNA giống nhau thì gọi là ính ồng nhất (homoplasmy)

[35, 70, 91].

Lư ng N ột biến trong một tế ư c gọi là mứ ộ h ng ồng

nhất, là một nhân tố quan trọng quyế ịnh mứ ộ nghiêm trọng của bệnh. a ố

ột biến mtDA gây bệnh ều tồn tại ở dạng h ng ồng nhất. Tỷ lệ N ột

biến có thể hay ổi rất lớn giữa người mẹ và các con, giữa ơ an v ngay

c các tế bào trong cùng một cá thể. Do tế bào có chứa số ư ng ty thể khác nhau

n n ột biến trong hệ gen ty thể có những ặ ưng i ng ơ hể ang ột biến

có thể có c b n a ó ột biến và b n a h ng ó ột biến. Hiện ư ng dị ột

biến ó vai ò y ịnh mứ ộ biểu hiện của bệnh ột biến gây nên [36, 70].

Các tế bào có kh năng “ hị ựng” ỷ lệ N ột biến cao (70-90%)

ước khi chuỗi hô hấp tổn hương v ư c gọi ngưỡng biểu hiện của ột biến. Tỷ

lệ ty thể ột biến ph i ạ ến ngưỡng thì mới gây ra kiểu hình lâm sàng. Ngưỡng

biểu hiện của ột biến hay ổi tùy thuộc t ng loại ột biến và t ng loại mô [34, 88].

Nói chung, ở h ng ph n hia như ơ v hần kinh chứa tỷ lệ mtDNA

ột biến a ng hi ó ở ph n hia nhanh như ạch cầu máu chứa tỷ lệ

N ột biến thấp. Tuy nhiên, tỷ lệ N ột biến a ũng ư c phát hiện ở

biể ường tiết niệu, y là loại ăng inh ất nhanh. Các mô cần nhiề năng

ư ng như ơ i n ó ngưỡng biểu hiện của ột biến thấp và dễ bị tổn hương

hi ó ột biến mtDNA [22].

Kiểu hình của một dòng tế bào có thể hay ổi trong quá trình phân chia tế

bào do ty thể phân bố một cách ngẫu nhiên giữa các tế bào nữ giới. Vì vậy, trong

một tế bào nếu cùng tồn tại N nh hường v N ột biến thì trong quá

trình phân chia sẽ có ba kiểu hình khác nhau có thể tồn tại: ồng nhất một b n sao

N nh hường hay N ột biến và tồn tại ồng thời hai loại mtDNA này.

Vì vậy kiểu hình của loại mang ty thể dạng h ng ồng nhất sẽ phụ thuộc vào tỷ lệ

N ột biến. Nếu số phân tử mtDNA ang ột biến ương ối thấp thì có sự bù

ắp của N nh hường nên không thấy sự ộng của ột biến. Khi mtDNA

ột biến vư a ngưỡng thì nó sẽ biểu hiện kiểu hình gây bệnh (hiệu ứng ngưỡng).

Nếu quá trình tổng h p TP dưới mức tối thiểu cần thiết cho chứ năng ủa mô thì

bệnh sẽ xuất hiện. Ở mỗi ơ an h nha thì số phân tử mtDNA là khác

nhau phụ thuộc vào nhu cầ năng ư ng cần thiết của mỗi mô. Vì vậy các mô cần

nhiề năng ư ng như hệ thần inh ng ương ơ i ụy, thận và gan rất dễ

bị ộng [94].

Khi tế bào phân chia, tỷ lệ N ột biến ở các tế bào ở nữ giới có thể

hay ổi. Nếu tỷ lệ ột biến vư a ngưỡng biểu hiện của t ng mô thì kiểu hình có

thể hay ổi. Vì vậy bệnh nh n ang ột biến gây bệnh dạng h ng ồng nhất sẽ có

ộng ng hay ổi theo thời gian [91]. ó 2 ơ hế có thể dẫn ến sự thay

ổi ư ng ột biến ở các tế người. ó i) quá trình tái b n ộc lập (relaxed

replication) x y ra không phụ thuộc vào chu k tế ng hi ó ư ng mtDNA

tổng số vẫn h ng ổi, các phân tử mtDNA dường như ư c chọn lọc một cách

ngẫu nhiên cho sự thoái hóa và tái b n nên trong một tế bào quá trình này có thể dẫn

ến sự hay ổi tỷ lệ phân tử N ột biến v h ng ột biến và ii) sự phân chia

nguyên phân nhưng v ự phân chia không bằng nhau mtDN ột biến và mtDNA

h ng ột biến x y ra trong suốt quá trình phân chia tế bào nên ũng ó hể dẫn ến

sự hay ổi tỷ lệ mtDNA ột biến v h ng ột biến ở ăng inh.

Các tế bào chứa h ư ng N ột biến n ngưỡng sẽ biểu hiện khiếm

khuyết về năng ư ng, có thể ơ hể sẽ có sự chọn lọc thích nghi, kết qu là mất

N ột biến t quần thể tế bào qua thời gian iề n y ư c quan sát ở các

mẫu máu lấy t các bệnh nhân mắc bệnh ty thể. ối với nhiều mô ở người v ặc

biệt trong suốt quá trình phát triển của n người, c quá trình tái b n ặ ưng và

sự ph n hia ng y n ph n ều dẫn ến sự hay ổi mứ ộ h ng ồng nhất. Nếu

mộ ột biến x y ra bên trong tế bào mầm hoặ ng ơ hể ang ph iển thì số

ư ng phân tử ột biến có thể ăng a ở các cá thể ó h ặc tham gia vào các tế bào

mầm và có mặt ở các thế hệ tiếp theo [23].

Nhiều nghiên cứu về mối liên quan giữa tỷ lệ N ột biến phổ biến

A3243G, A8344G, T8993G/C với kiểu hình lâm sàng cho thấy rằng ư ng mtDNA

ột biến ở ó i n an ương ứng với mứ ộ nghiêm trọng của bệnh và

dường như ũng ó ối liên quan giữa ư ng ột biến của người mẹ và tần suất tác

ộng ến người n ối với nhiề ột biến, chỉ có thể ư vấn di truyền cho

bệnh nh n v người nhà khi hiể ầy ủ về ơ hế di truyền, sự phân chia trong

nguyên phân và sự biểu hiện của ột biến mtDNA vì những ộng phức tạp

của mtDNA trong suốt quá trình phát triển và những hay ổi của ư ng ột biến

trong máu và ơ ng ời sống cá thể [22].

Mứ ộ khiếm khuyế d ột biến mtDNA phụ thuộc vào loại ột biến,

ư ng N ột biến có mặt trong tế v ngưỡng biểu hiện của Ngưỡng

biểu hiện của mô phụ thuộc vào mứ ộ khiếm khuyết của chuỗi hô hấp và nhu cầu

năng ư ng của ó hệ thần inh ng ương nhạy c m nhất với sự khiếm khuyết

của ty thể a ó ơ i hệ nội tiết và thận [36].

Người ta cho rằng các nhân tố di truyền trong nhân có thể hay ổi mứ ộ

h ng ồng nhất của ột biến mtDNA. iều này rất quan trọng bởi vì nó nh hưởng

ến sự di truyền các khiếm khuyết của mtDNA dạng h ng ồng nhất v ũng ó

thể nh hưởng ến sự tiến hóa của mtDNA ở mứ ộ quần thể [23].

1.2.4. Tốc độ đột biến của DNA ty thể

Hệ gen ty thể người ó ặ iểm là di truyền theo mẹ, chị ộng của hiệu

ứng ngưỡng, mứ ộ h ng ồng nhất và tố ộ ột biến cao.

mtDNA có tốc ộ ột biến cao gấp 10-20 lần so với nDNA, do hệ gen ty thể

ở dạng trần (không liên kết với protein b o vệ kiể hi n như hệ gen nhân), không

chứa các trình tự không mã hóa, hệ gen ty thể dễ dàng tiếp xúc với các gốc tự do,

s n phẩm của quá trình oxy hóa các h p chất hữ ơ v ó tác dụng gây ra ột biến.

Ngoài ra, ty thể h ng ó ơ hế sữa chữa DNA hiệu qu , mtDNA không có kh

năng ự phục hồi dễ d ng như n N . Sự hay ổi trình tự giữa các cá thể trong

cùng một loài rất lớn, kho ng 770 nucleotide và trong một cá thể thì sẽ có một

ư ng nhỏ mtDNA hay ổi ư c tạ a ng ời sống cá thể [66, 94]. h ến nay,

hơn 300 ột biến trong hệ gen ty thể người ư c phát hiện, ng ó ó hơn 200

ột biến gây bệnh, chủ yếu tập ng v ơ hần kinh, chứ năng h yển hoá của

ơ hể [114].

1.3. C C ĐỘT BIẾN TRONG HỆ GEN TY THỂ NGƢ I V C C BỆNH IÊN

QUAN

Những nghiên cứu dịch tễ học gần y h ằng bệnh d ột biến mtDNA ở

người phổ biến hơn nhiều so với các hiểu biết ướ ó Trong 8.000 người Châu

Âu thì tối thiểu phát hiện ư 1 người bị bệnh d ột biến mtDNA và trong 15.000

người lớn thì ít nhấ ó 1 người bị ộng bởi ột biến mtDNA. Vì nhiều lý do

hưa õ ự mấ ạn mtDNA quy mô lớn có thể h ng ư c truyền lại cho thế hệ

sau. Vì vậy ột biến không có mặt trong ph hệ bên mẹ và không góp phần vào sự

tiến hóa mtDNA ở mức ộ quần thể. Trái lại, nhiề ột biến iể ư c di truyền t

mẹ sang con [23].

Wallace và tập thể [104] là những người ầu tiên công bố ột biến iểm

trong hệ gen ty thể gây bệnh ở người (hội chứng LHON). Sự mấ ạn mtDNA

ũng ư c tìm thấy ở ơ của bệnh nhân CPEO và hội chứng Kearns Sayre vào

nă 1988 v ột biến iể N ư c tìm thấy ở các bệnh nhân MELAS

v nă 1990 h ến nay, hơn 200 ột biến iểm và mấ ạn khác nhau có kh

năng g y ệnh ư c báo cáo. ột biến trong hệ gen ty thể gây ra sự khiếm

khuyết trong chuỗi hô hấp do nh hưởng ến quá trình tổng h p protein nói chung.

Một số rối loạn ty thể chỉ nh hưởng ến mộ ơ an nhưng ũng ó những rối

loạn nh hưởng ến rất nhiề ơ an v hường có những ặ iểm nổi trội ặc

biệ ộng mạnh ến hệ thần kinh- ơ Những rối loạn ty thể có thể x y ra ở bất

k lứa tuổi nào. Hầu hế ột biến gen ty thể ều làm suy gi m chứ năng ủa ty

thể, t ó g y n n hội chứng bệnh khác nhau tập trung chủ yếu ở ơ thần kinh

và chứ năng h yển hóa của ơ hể.

ột biến mtDNA có kh năng g y ệnh tập trung vào 2 nhóm: sắp xếp lại

mtDNA (chủ yếu là mấ ạn) v ột biến iểm. ó ũng ó hể chia những

bệnh do DNA ty thể gây ra thành hai dạng hính ó ệnh do sự sắp xếp lại

mtDNA và các bệnh d ột biến iểm mtDNA [23].

1.3.1. ột biến iểm DNA ty thể

ột biến iểm là ột biến (thay thế, mất hoặc thêm) x y ra trong cấu trúc của

gen tại mộ iểm (thay thế, mất hoặc thêm một nucleotide) trên phân tử DNA. Các

ột biến iểm có thể x y ra ở g n i n an ến sự tổng h p protein (gen mã hóa

cho tRNA hoặc rRNA) hoặc gen mã hóa cho protein (một trong 13 gen mã hóa cho

các tiể ơn vị của các thành phần trong chuỗi hô hấp). T ng ó, ột biến iểm

trên các gen mã hóa cho tRNA của ty thể là nguyên nhân phổ biến nhất của bệnh ty thể ặc biệt, nhiề ột biến ư c báo cáo ở gen mã hóa cho tRNALeu iều này

hỉ ra rằng vùng n y iểm nóng x y a ột biến [92].

1.3.1.1. Các loại đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa tRNA và các hội chứng ty

thể

Hội chứng MELAS (mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and

stroke-like episodes) là hội chứng não giậ ơ ăng acid lactic máu và gi tai biến

mạch, là bệnh ơ n phổ biến nhất và ư c di truyền theo mẹ [1, 2, 3]. y hội

chứng iển hình trong các hội chứng i n an ến ty thể. Sự biểu hiện của bệnh rất

a dạng, phụ thuộc nhiề ến các yếu tố như ỷ lệ ột biến ng ơ hể, những mô

có chứa ột biến và mứ ộ ph n ứng của mỗi mô với sự gi m sút quá trình chuyển

hóa.

Ng y n nh n d ộ ng ại ộ iến A3243G, T3271C, T3291C, A3252G, A3260G, C3256T trên gen MTTL1 mã hóa cho tRNALeu; ộ iến

G13513A, A12770G và A13514G trên gen MTND5 mã hóa cho ND5 ubiquinone oxidoreductase ủa phứ h p I, G583A trên gen MTTF mã hóa cho tRNAPhe, G1642A trên gen MTTV mã hóa cho tRNAVal, A5814G trên gen MTTC mã hóa cho tRNACys. T ng ó ộ iến 3243G hiế 80% ố a ang hội hứng MEL S,

iếp theo ộ iến T3271C x y a h ng 7 5% MEL S ó hể g y a ởi ộ

iến iể N ở g n h như COXIII, ND1, ND5 hoặc gen mã hóa tRNAPhe, tRNAVal, tRNACys, rRNA hoặc mấ ạn với í h hước ngắn. Tuy nhiên,

ột biến trên tRNALeu vẫn ột biến phổ biến nhấ i n an ến kiểu hình

MELAS [33, 40, 55, 58, 97]. T ng ố ó ộ iến A3243G ư ầ i n trên gen mã hóa cho tRNALeu v ộ iến phổ iến nhấ ở ấ hủng ộ [67].

Như vậy ộ iến 3243G ộ hỉ i an ọng ể hẩn n hội hứng

MEL S ng i iể a ng

ột biến 3243G ột biến trên hệ gen ty thể, A thay thế G ở vị trí 3243,

ột biến nằm trên gen MTTL1, mã hóa cho phân tử RNA vận chuyển leucine (UUR) (tRNALeu(UUR)). Ở mứ ộ phân tử ột biến hay ổi cấu trúc, rối loạn chức năng ủa tRNALeu(UUR gây ra gi m sút quá trình tổng h p protein, làm hỏng sự kết

thúc phiên mã và biến ổi bộ a ối mã. Ở mứ ộ tế ột biến tồn tại dạng

h ng ồng nhất và các bằng chứng về hình thái họ iển h nh như i ơ ỏ xé

rách. Ở mứ ộ ơ an ột biến gây ra bệnh ơ ệnh n ăng a id a i máu và

dịch não tủy, ngoài ra còn có các kiểu hình khác [58].

Nă 1990 G v ập thể công bố ột biến A3243G lần ầu tiên ở các bệnh

nhân có hội chứng MEL S v y ũng hội chứng rõ nét nhấ i n an ến ột

biến A3243G [34]. Ngoài ra, ột biến A3243G ũng ư c phát hiện ở các bệnh

nhân tiể ường type 2 v nă 1998 [47]. Bệnh tiể ường d ột biến A3243G

ư c phát hiện ở mộ gia nh người Trung Quốc với 4 thế hệ ều bị bệnh tiểu

ường h ến nay ơ hế gây bệnh của ột biến vẫn òn ư c tiếp tục nghiên

cứu [57].

Nghiên cứu về chứ năng ủa tRNA trong ty thể ở in vitro chứng tỏ rằng ột

biến 3243G gi m kh năng i n ết giữa tRNA với acid amin t 12-25 lần

so với g n h ng ột biến [16]. ột biến A3243G có thể dẫn ến nhiều biểu hiện

lâm sàng và hội chứng bao gồm MELAS, tiể ường và iếc, bệnh ơ hần

phân liệt, bệnh tim, co giật, bệnh thận, hội chứng CPEO hay MERRF. T ng ó

ộng lâm sàng phổ biến nhất của ột biến này là MELAS [26, 40, 58, 72]. Thực ra,

kho ng 40% bệnh nhân ang ột biến A3243G có kiể h nh MEL S ầy ủ. ơ

chế biểu hiện a dạng ặ iể ng hưa ư c hiể ầy ủ, có lẽ liên quan

ến mứ ộ h ng ồng nhất, ngưỡng biểu hiện của ột biến, sự phân bố của

mtDNA ở các mô, yếu tố di truyền của gia nh v hể, nhân tố i ường và

tuổi tác [20, 26, 58].

Nă 1975 hội hứng MELAS ần ầ i n ư è h gi ai iến

ạ h ăng a id a i v ơi ơ ỏ xé rách. n ạnh ặ iể này phổ

ng MEL S ó hể hay ổi ấ ộng iể hiện h ó hể vó người nhỏ

bé ấ h năng ngh ệnh im [26, 40]. T ộng ng iển h nh nhấ ủa

ệnh nh n MEL S như ơ a ầ n n ửa hường x y n hờ hẫn iế v

ấ í iến iển ộng ướ ổi 15 v x ấ hiện iệ hứng ng giống

ộ ỵ ướ ổi 40 Khi inh hiế ơ ó ự hay ổi về í h hướ ủa i ơ

v i ơ ỏ xé h hi nh ộ G i i h ở ấ ệnh nh n Khi

nghi n ứ về enzyme h ạ ính enzyme phứ hệ I, III ng y hể ủa ơ xương

gi ng ể ở ấ ệnh nh n ó ộ iến n y Tuy nhiên, h ạ ính enzyme

ủa phứ hệ II, III và succinate dehydrogenase (SDH) ng giới hạn nh hường

òn h ạ ính enzyme phứ hệ IV nh hường h ặ ó gi chút í . T ng hội

hứng MEL S ộng inh iể hiện ng h phổ iến ặ iệ hể ộng

inh ng giậ ơ iến iển ế h p với i ơ ỏ xé rách ư ng

hội hứng MERRF ó ần hẩn n ph n iệ 2 hội hứng MEL S v

MERRF. T ộng ng ủa MEL S hường x y a ở ẻ với iệ hứng

dần dần xấ i ặ iể ng hay ổi ấ ớn giữa ệnh nh n ặ iể

phổ iến nhấ ủa hội hứng MEL S a ầ ng ơn è h n n ửa iệ

hứng n y n n ó ặ ở ấ ệnh nh n giậ x y a ở phần ớn ệnh

nh n h ng 95% H ư ng a id a i ng ăng v ặ iệ dị h n

ủy an ọng h hẩn n MEL S v nó hể hiện ự ấ hứ năng ủa y

hể ở a ố ường h p

Tần suất xuất hiện của hội chứng MELAS là 1:15.000, là một trong các bệnh

thần kinh di truyền phổ biến nhất và có tỷ lệ tử vong cao [82]. Bệnh i n an ến

não, ơ i hận có lẽ gây ra tử v ng ước tuổi ưởng thành [6]. Ở Phần Lan,

kho ng 6000 người lớn thì phát hiện 1 người ang ột biến A3243G. Tỷ lệ sống sót

của người bị bệnh tiể ường d ột biến A3243G kho ng 1% [72]. Mặ dù ột

biến ú ầ ư c phát hiện trong mtDNA t ơ y nhi n nó n n ó ặt

ở tất c các mô của bệnh nh n v ư ng N ột biến khác nhau ở các mô [91].

Tỷ lệ của ột biến 3243G ng í hơn ng ơ T y nhi n inh hiế ơ

mộ phương ph p g y hương ổn cho bệnh nhân, không thể thực hiện một cách

thông dụng trong chẩn n ệnh ty thể. Vì vậy phát hiện ột biến A3243G trong

máu là một phương ph p iện l i trong sàng lọc bệnh ty thể [58].

Hội chứng MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) là hội

chứng ơ n y hể ư c di truyền theo mẹ ó ặ iểm là ộng kinh giậ ơ với

các s i ơ ỏ xé rách. Ngoài ặ iể iển hình trên, có thể kèm theo mất trí,

iếc, bệnh ơ d y hần kinh thị giác, tổn hương hô hấp và tim. Hội chứng lần ầ i n ư c mô t d ột biến A8344G trên gen mã hóa cho tRNALys của ty thể

[18]. Nguyên nhân phổ biến của hội chứng MERRF là d ột biến A8344G, T8356C và G8363A nằm trên gen MTTK mã hóa cho tRNALys gây ra. Tất c ột

biến ều tồn tại ở dạng h ng ồng nhất [36, 94]. ột biến A8344G là phổ biến

nhất, chiếm 80-90% số ca mang hội chứng MERRF [16]. MERRF ũng ư c mô t

ở bệnh nhân bị mấ ạn mtDNA. Các hội chứng gối nhau với ặ iểm MELAS/MERRF ư c báo cáo ở ột biến T7572C và T8356C trên tRNASer [36].

ộ tuổi ộng hay ổi rất lớn, có thể t lúc nhỏ ến 50 tuổi. Bệnh biểu

hiện sớ hường i n an ến triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng dẫn ến chết ở

tuổi ưởng thành. Triệu chứng của bệnh là co giật, mấ iều hòa tiểu não, liệ ơ

n ơn ộng inh ấ h năng ngh ăng a id a i i ơ ỏ xé rách

[40]. ột biến gây ra sự khiếm khuyết các phức hệ enzyme của chuỗi hô hấp a ố

i n an ến NADH-CoQ reductase và cytochrome c oxidase. Mặc dầ ột biến

ư c di truyền theo mẹ nhưng iể h nh ng hay ổi rất lớn trong một ph hệ

gia nh iều này phù h p với ột biến tồn tại ở dạng h ng ồng nhất [18].

ộ tuổi ộng và mứ ộ nghiêm trọng của MERRF ó i n an ến tỷ lệ

N ột biến [98]. Tuy nhiên, có những ường h p ệnh nặng nhưng ơ

ính với y xida h ặ h ng ó i ơ ỏ xé h hi inh hiế Những

dữ iệ n y ở ộng giới hạn iể h nh ủa MERRF Vì vậy việ ph n í h

mtDNA an ọng ở nhiề ường h p ó ự ối ạn hệ hống h ng õ ng

Hội chứng CPEO (chronic progressive external ophthalmoplegia) là hội

chứng liệt ơ ắt ngoài tiến triển, triệu chứng iển hình của bệnh là liệ ơ ắt, sa

mí mắt, rối loạn tâm thần v ột tử.

Ng y n nh n ủa CPEO d ộ iến 3243G nằ n g n hóa tRNALeu(UUR) v ộ iến T4274 nằ n g n hóa tRNAIle. Ng i ặ iể

a í ắt, PEO òn iể hiện ấ í ộng kinh, giậ ơ v gi tai iến ạ h.

ệnh nh n PEO ó hể ang ộ iến ấ ạn hay ộ iến iể nhiề ộ iến iể ư ở PEO a gồ ộ iến n RN Leu, tRNAIle và tRNAAsp

ng ó ó ộ iến iểm 3243G g y hội hứng MEL S [36].

Ng i a ấ nhiề ộ iến iể h n g n mã hóa cho tRNA có liên

an ến ộ ố hội hứng như hội hứng ơ n ( n pha y pa hy) d ộ

iến T10010 G4298 T14728 T14709C, G1606 ; ệnh ơ iến iển hậ d

12320G; ệnh ơ i ( a di y pa hy) d ộ iến 4269G 3243G

G8363A; ệnh iể ường v iế di yền h ẹ ( aternally inherited

diabetes and deafness - MI ) i n an ến ộ iến 12258 3243G [81].

1.3.1.2. c đột biến điểm phổ biến trên gen mã hóa protein và các hội chứng liên

quan

Hội chứng Leigh (bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh)/NARP

(neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos)

Triệu chứng lâm sàng của hội chứng Leigh lần ầu tiên ư c phát hiện vào

nă 1951 bởi Dennish Leigh, là sự thoái hóa thần kinh tiến triển ở trẻ, có thể dẫn

ến cái chết trong vài tháng hoặ v i nă . ột biến gây ra hội chứng L igh ư c

tìm thấy ở c nDNA và mtDNA. Phần lớn ường h p Leigh do khiếm khuyết

của gen nhân [95].

Hầu hế ột biến gen ty thể gây ra hội chứng L igh ư c báo cáo là trên

các gen MTATP6, MTND3 và MTND5, mộ v i ột biến ư x ịnh trên các gen

MTND2, MTND6 và MTND4. Ngoài ra, còn có ường h p trên gen liên quan ến quá trình tổng h p protein ó gen MTTV mã hóa cho tRNAVal, gen MTTL1 mã hóa cho tRNALeu, gen MTTW mã hóa cho tRNATrp và gen MTTK mã hóa cho tRNALys. T ng ường h p của hội chứng L igh a ố ột biến nằm trên

gen MTATP6 ặc biệt tại vị trí T8993G hoặc T9176C. Sự biến ổi T thành G tại

8993 ng N người là một ng ột biến ty thể kèm theo hội chứng

L igh ư c mô t nhiều nhấ ột biến này thay thế leucine thành arginine tại vị trí

156 trên ATPase 6 của ty thể, một trong hai tiể ơn vị của tiểu phần Fo của phức

hệ ATPase (phức hệ V), làm cho quá trình tổng h p ATP bị lỗi, tạo ra nhiều gốc

oxy tự do, gây nên các triệu chứng lâm sàng khác nhau [68].

ột biến iểm T8993G trên gen ATPase6 lần ầ i n ư c mô t ở một

người lớn bị yế ơ ấ iều hòa vận ộng và hỏng sắc tố võng mạc, y ũng

các biểu hiện lâm sàng phổ biến của hội chứng. Kho ng 20% bệnh nhân mang hội

chứng Leigh có sự biến ổi T thành G hoặc T thành C tại vị trí 8993 trên gen

ATPase 6 ở phức hệ V của chuỗi hô hấp. Mứ ộ nghiêm trọng của bệnh có mối

ương an in cậy với tỷ lệ ột biến. Bệnh nhân Leigh có tỷ lệ ột biến rất cao, hơn

90% ột biến, kèm theo các triệu chứng lâm sàng rất nghiêm trọng hoặc chết. Khi

ư ng ột biến t 60-90% thì thể hiện triệu chứng lâm sàng của hội chứng NARP

ó ối loạn thần kinh, mấ iều hòa vận ộng và viêm võng mạc, ng hi ó

ư ng ột biến í hơn 60% nói h ng h ng è h iệu chứng lâm sàng hoặc

bị ộng nhẹ [36, 96].

Một số nghiên cứu chứng tỏ rằng tỷ lệ ột biến T8993G giống nhau ở các mô

khác nhau, khác với ột biến n g n RN ư ng ột biến h nha ng

kể ở các mô khác nhau. Vì vậy, việc nghiên cứu ở mứ ộ phân tử ột biến T8993G

v ặc biệt việc chẩn n ướ inh ư c xem là tin cậy hơn với ột biến

mtDNA khác chẳng hạn như ột biến trên gen tRNA [40].

Hội chứng Leigh còn liên an ến sự biến ổi T12706C của gen ND5, dẫn

ến thay thế phenylalanine bằng leucine ở vị trí 124. ND5 là gen chứ năng gồm

1812 bp (t vị trí 12337 tới 14148) ư c mã hóa bởi chuỗi nặng của mtDNA. S n

phẩm của gen ND5 là một thành phần của phức hệ NADH-ubiquinon

oxidoreductase. S n phẩm của gen ND5 nằm ở phần kỵ nước của phức hệ I. Protein

này là một trong 7 tiểu phần ư c mã hóa bởi mtDNA trong số 42 tiểu phần của

phức hệ I của chuỗi hô hấp ột biến trên gen ND5 có liên quan tới nhiều bệnh

t ng ó ó LHON L igh v MEL S [99].

Hội chứng LHON (Leber herteditary optic neuropathy) là hội chứng liệt

thần kinh thị giác di truyền theo Leber, ộng hủ yế ến võng ạ g y hội

hứng d y hần inh hị gi ấ h năng nh n hấy ở hai ắ ệnh có

thể gây mù khi còn trẻ v hường xuất hiện ở nam giới. Kho ng 95% ường h p

LHON gây ra bởi ột biến i n an ến các tiể ơn vị của phức hệ I, bao gồm

ột biến G11778A trên gen ND4 (50-70% ường h p) ột biến G3460A trên gen

ND1 (15% ường h p) v ột biến T14484C trên gen ND6 (10% ường h p). ột

biến G11778A là nguyên nhân phổ biến nhất của LHON. Ngoài ra, còn có c ột

biến hiếm khác i n an ến gen ND5 và ND6. Kho ng 50% nam giới và 10% nữ

giới mất kh năng nh n iều này có thể gi i thích do các gen nhân hoặc các yếu tố

i ường hay ổi sự biểu hiện của bệnh [17].

ộ iến n g n ND6 a gồ T14484 T14459 ộ iến n y

h ng những g y a iệ hứng ủa hội hứng LHON òn g y a hội hứng

L igh ộ iến G14453 ũng n g n n y ộng ng phứ ạp hơn è

h iệ hứng ủa LHON òn ó iể hiện ủa MEL S [21].

Trái với ột biến trong hội chứng MELAS và MERRF, các ột biến

thuộc LHON hường ở dạng ồng nhất trong máu và ở các mô khác. Mặc dù ở a ố

gia nh ột biến ư c di truyền t mẹ sang con nhưng h ng 1/3 bệnh nhân

có bệnh sử gia nh không bị bệnh về mắt. Ngay c gia nh mang hội chứng

LHON thì tất c người thân bên mẹ ang ột biến dạng ồng nhất nhưng nam giới

ó ộng lâm sàng phổ biến hơn iều này có thể là do locus nhạy c m với việc

mất kh năng nh n hấy liên kết với nhiễm sắc thể X mặc dù bằng chứng di truyền

n y h ng ư c xác nhận bởi các nhóm nghiên cứu khác khi nghiên cứu ph hệ của

bệnh nh n ang ột biến [40, 113].

Bệnh không chịu được vận động (excercise intolerance): D ột biến

trên gen CYTB (MTCYB), gen CYTB mã hóa cho Cyt b của phức hệ III, có chiều dài

1141 bp, t vị í 14747 ến 15887, không chứa intron. Chuỗi polypeptide dài 380

acid amin do gen CYTB mã hóa có vai trò quan trọng trong chuỗi hô hấp tế bào

thông qua việc xúc tác cho quá trình vận chuyển iện tử t ubiquinol ến Cyt c và

sử dụng năng ư ng ể vận chuyển các proton t màng trong ty thể ra màng ngoài

ty thể ột biến G15615A dẫn ến thay thế Gly bằng Asp ở vị í 290 ư c phát

hiện ở một bệnh nhân 25 tuổi với triệu chứng không chị ư c vận ộng. ột biến

G14846A dẫn ến thay Gly bằng Ser ở vị í 34 ư c phát hiện t một trong 5 bệnh

nhân bị bệnh không chị ư c vận ộng ngay t khi còn nhỏ với triệu chứng yế ơ

ăng a id a i kèm theo các s i ơ ỏ xé rách [10]. Ngoài ra, người ta còn

phát hiện thấy một số ột biến h như G15242A [46], G15150A [50], G14985A,

T15572C [73], T14849C, A15579G [107] ề i n an ến gen CYTB.

1.3.1.3. c đột biến điểm trên gen mã hóa rRNA

Bệnh d ột biến trên gen mã hóa rRNA chiếm tỷ lệ rất nhỏ. ột biến

A1555G và C1494T ư c phát hiện n RN 12S y iểm nóng cho các ột

biến gây mất kh năng ngh d í h thích bởi aminoglycoside và mất kh năng

nghe không có hội chứng. T ng ó ột biến A1555G phổ biến hơn 1494T [91].

Ngoài biểu hiện mất kh năng ngh ệnh nh n ang ột biến này còn có các

triệu chứng khác kèm theo bao gồm tóc bạ ước tuổi ưởng thành, ngón tay, ngón

chân dị dạng, bệnh ơ i v LHON [37]. Bệnh nhân với ột biến A1555G có tác

ộng lâm sàng muộn T y nhi n ũng ó ường h p triệu chứng lâm sàng biểu

hiện ở bệnh nhân nhỏ hơn 2 ổi ộ tuổi ộng thay ổi rất lớn giữa các thành

vi n ng gia nh ặ dù a ố bệnh nhân thể hiện triệu chứng ước tuổi 40 [40].

ột biến khác trên gen rRNA 12S là T1095C, ư c phát hiện ở 3 gia nh

người Trung Quốc mất kh năng ngh ột biến n y ũng ư c mô t ở một gia

nh người Ý bị bệnh Parkinson, thần kinh ngoại biên và mất kh năng ngh ột

biến T1095C hay ổi base b o thủ ở vòng xoắn 25 của rRNA 12S, nucleotide này

nằm ở vị trí P của ribosome, có vai trò quan trọng ng giai ạn khởi ầu của quá

trình tổng h p protein của ty thể. Sự hay ổi cấu trúc bậc ba của rRNA 12S làm

nh hưởng ến quá trình tổng h p protein, vì vậy dẫn ến mất chứ năng ủa ty thể

và gây ra mất kh năng ngh [112].

1.3.2. Các đột biến khác trên DNA ty thể

Ng i ột biến iểm, hệ gen ty thể người òn ó ột biến mấ ạn và lặp

ạn T ng ó, mấ ạn ở quy mô lớn là loại ột biến N ầ i n ư c phát

hiện. a số ường h p mấ ạn/lặp ạn x y ra ngẫu nhiên trong quá trình tạo

trứng hoặc giai ạn ầu của quá trình tạo phôi. Trong mộ v i ường h p ột biến

mấ ạn/lặp ạn ư c di truyền t mẹ sang con [16].

Hội chứng Kearns-Sayre (KSS) do mấ ạn mtDNA kho ng 2-4 kb,

hường là 4997 bp t vị trí 8488-13460. Tại iể ứ g y hường có mộ ạn 13 bp

lặp lại. KSS là sự rối loạn a hệ thống ộng ước tuổi 20 [40]. Ngoài những

triệu chứng như ơ, sa mí mắt, yế ơ ặt, thoái hóa sắc tố võng mạc, KSS còn

xuất hiện một trong các triệu chứng h như nghẽn tim, hội chứng liên quan tiểu

não, iếc, tiể ường. Bệnh nhân KSS có tỷ lệ ột biến mấ ạn cao trong mô [91].

Hội chứng Pearson lần ầ i n ư c phát hiện v nă 1979 bởi Pearson,

là một bệnh hiếm gặp n n ó ộng xấu trong những nă ầ ời. Trẻ em

có hội chứng Pearson biểu hiện hôn mê, thiếu máu hồng cầu, tủy xương, khiếm

khuyết phần ngoại tiết của tuyến tụy a ố bệnh nh n ều hỏng gan là nguyên nhân

của cái chết. Các bệnh nhân này luôn luôn chết sớ nhưng ột vài cá thể có thể

sống sót và thể hiện triệu chứng lâm sàng của KSS [12].

Mặc dù không tìm thấy mối liên quan giữa ặ iểm lâm sàng và vị trí hay

í h hước của ạn mất nhưng phần lớn các trẻ bị rối loạn a hệ thống thì có

kho ng 40% bệnh nhân KSS hoặ PEO ang ột biến mấ ạn phổ biến 5 kb. a

số các bệnh nhân ang ột biến mấ ạn mtDNA một cách ngẫu nhiên. Người mẹ

và các người con của bệnh nh n ó ặ iể ng nh hường và không phát

hiện thấy sự mấ ạn. iều này chứng tỏ rằng sự mấ ạn mới xuất hiện ở giai

ạn ầu trong quá trình phát triển của phôi hoặc chỉ x y ra ở mứ ộ cá thể. Tuy

nhiên, ũng ó ột số ường h p mấ ạn ư c di truyền theo mẹ [91].

Bệnh liệt cơ mắt ngoài tiến triển (progressive external ophthalmoplegia-

PEO) d ột biến mất một số ạn trên mtDNA gây ra, với các triệu chứng khác so

với bệnh liệt mắt tiến triển inh ni n ( PEO) như như ơ a í ắt, yế ơ ặt,

h ơ [111].

Bệnh Parkinson/hội chứng MELAS gối nhau d ộ iến ấ ạn TT

ắ ầ ở vị í 14787 ủa g n CYTB. ệnh nh n iể hiện ối ạn iến iển nặng

ắ ầ 6 ổi với iể hiện hó phối h p v ập ng vận ộng Sa n y ệnh

nhân hể hiện hội hứng Parkinson ng giậ ơ v nhồi n [25].

Ng i a ộ ố ệnh y hể òn i n an ến ự ạn Nghi n ứ ầ

i n về ộ ộ iến ạn trong mtDNA g y ệnh ơ ư ph hiện ởi

M i v ập hể v nă 2000. ó ộ người n ng 43 ổi ngay hi òn

nhỏ khó vận ộng v a ơ ệnh nh n ư ph hiện ang ộ iến ạn 7

nucleotide (ACCTTGC thành GCAAGGT) ở vùng 3902-3908 h ộ g n hóa h

ND1 ủa N H i inone oxidoreductase ộ iến ạn n y dẫn ến hay

hế 3 acid amin (D199G, L200K, và A201V) ó ính hủ a ng h ỗi

p yp p id ộ iến ở dạng h ng ồng nhấ 80% và ư ph hiện ng ơ

nhưng h ng có ng ệnh nhân. Sự hay ổi 3 a id a in i n iếp p-Leu-

Ala thành Gly-Lys-Va i n an ến ộ vùng hủ a ủa g n ND1 có vai trò

an ọng ng việ gắn i in n [71].

Mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA x y ra ở vùng không mã hóa nằm giữa gen mã cho cytochrome oxidase II (COII) và tRNALys trong hệ gen ty thể. Vùng không mã

hóa gồm hai trình tự lặp lại nối tiếp nhau dài 18 bp t vị trí 8272-8289 trên hệ gen

ty thể. Hiện ư ng mấ ạn 9 bp ư c xem là một dạng ột biến của hệ gen ty thể

và có tỷ lệ cao ở các quần thể người châu Á bao gồm Trung Quốc (15%), Việt Nam

(20%), Thái Lan (29%) và Nhật B n (20%) [108].

ựa v ấ ạn 9 p người a nghi n ứ h nh nh di ư ủa n người

ầ i n ấ ạn 9 p ư ph hiện hấy ở h ần hể hởi ầ

P yn ia v người Mỹ n ịa a ó ph hiện ở h Phi v h Â với ỷ ệ

ấ ạn ấ hấp [14, 83]. Mộ nghi n ứ hự hiện trên 1.091 hể ại diện 15

d n ộ ở Ind n ia h hấy ần ố ấ ạn 9 p hay ổi ở nhó d n ộ

h nha Mộ ố nhó d n ộ ó ự h iệ nh ự ặp ủa n id ầ 5’

hay ầ 3’ ( h ấ T) ộ ố ại ó h 1 n py nữa ủa ạn 9 p

hứng ỏ ự a dạng di yền ng d n ố ủa ần hể n y [39]. Nghi n ứ hiện

ư ng n y ẽ góp phần hiể ư ấ ú ần hể v ng ồn gố ph inh ủa ần

hể Việ Na ồng hời x ịnh ộ ố ệnh i n an ấ ạn 9 p ở người Việ

Nam.

ộ iến ấ ạn x ấ hiện d những ai hỏng ng nh i n

h ng ư ửa hữa h ặ d nh a hép ị ỗi V vậy ấ ạn 9 p ó ẽ

x ấ hiện như ế ủa ộ ỗi h ng ư ửa hữa ng nh a hép ủa

mtDNA.

Hiện ư ng mấ ạn 9 bp ư x xé n hai phương diện ó nguồn

gốc tiến hóa và mối liên quan giữa mấ ạn 9 bp với bệnh tậ ặc biệt là các rối

loạn ty thể. Một số nghiên cứ i hiểu sự liên quan giữa mấ ạn 9 bp

với một số ột biến khác trên hệ gen ty thể và thấy rằng ở bệnh nhân MELAS,

MERRF hay những người mắc bệnh a nang buồng trứng thì tỷ lệ mấ ạn 9 bp

a hơn nhiều so với những người khỏe mạnh. Khi x ịnh sự liên quan giữa hiện

ư ng mấ ạn 9 bp CCCCCTCTA ở các bệnh nh n a nang ồng trứng thì thấy

tỷ lệ mấ ạn là 23,5%, so với người khỏe mạnh thì tỷ lệ này chỉ có 7,1% và các

tác gi nhận ịnh có sự liên quan giữa mấ ạn và bệnh a nang ồng trứng [114].

Một nghiên cứu ở các bệnh nh n người i L an mang hội chứng MELAS và

MERRF cho thấy tỷ lệ mấ ạn 9 p 47% ng hi ó ỷ lệ này ở người khỏe

mạnh là 21% [53]. Một nghiên cứ h ph hiện thấy trong 9 bệnh nhân bị

bệnh Ga h yp I h 6 người ó ột biến mấ ạn 9 bp, trong 3 bệnh nhân bị

Ga h yp II h 2 người mấ ạn 9 p iều này chứng tỏ có mối liên quan nào

ó giữa hiện ư ng mấ ạn 9 bp này và bệnh Gaucher [43]. Mấ ạn 9 bp ũng

ư c phát hiện ở một bệnh nhân mang hội chứng Kearns-Sayre (mấ ạn 5,5 kb ở

vùng 8278-13770) trong một gia nh người Nga dòng dõi Slavic. Mẹ bệnh nhân

ũng ó ấ ạn 9 p ương ự như người con trai. Ở hai ường h p này, mấ ạn

9 bp ều ở dạng ồng nhất [102].

Ở Việ Na dường như h ng ó dữ iệ về ấ ạn 9 p ng d n ố

ng hi ó nhiề ố gia ử dụng hỉ hị n y ể iề a nhó ắ ộ v

ộ ạ ể hiể ối an hệ di yền ng ồn gố iến hóa v ph inh ự di ư

v nh hưởng ủa yế ố nhập ư ũng như nh h ộ ịa hóa Mấ ạn 9 p

ng hệ g n y hể ư di yền h ẹ ng ụ hữ í h ể iể a ối an

hệ di yền giữa hể y vậy h ến nay hưa ó h ng in n về ự i n

an ủa ấ ạn 9 p với nh ạng ệnh ý ặ ưng

T ng ộ nghi n ứ ủa a ing v ập hể [14] về ấ ạn 9 p ở

người h h hấy ỷ ệ ấ ạn 9 p ng nh ở người d n Việ Na

17,9%. Nă 1999 Vũ T iệ n v nh h a họ Ph p [44] nghi n ứ ính

a h nh N y hể ủa người Việ Nam n 50 người Kinh hỏ ạnh ằng ph n

í h ử dụng 6 nzy ắ giới hạn (HpaI, BamHI, HaeIII, MspI, AvaII, HincII) và

ph hiện ấ ạn 9 p ở 10 người hiế ỷ ệ 20% T y vậy gi ũng

hưa ó nhận xé g về hiện ư ng ấ ạn với iệ hứng ệnh y hể

1.3.3. Các bệnh liên quan đến rối loạn ty thể do đột biến gen nhân

Ty thể có vai trò tổng h p TP nhưng hệ gen ty thể chỉ mã hóa cho một số

thành phần protein/enzyme cần thiết của chuỗi hô hấp ó hứ năng của ty thể

ư c thực hiện còn nhờ vào các protein/enzyme do gen nhân mã hóa. Hơn 90%

protein của ty thể ư c mã hóa bởi g n nh n ó i n an ến chuỗi hô hấp. Các

p in n y ư c tổng h p trong tế bào chất rồi ư c vận chuyển ến ty thể. Chính

vì vậy, các rối loạn của ty thể có thể phát sinh do những ột biến ở gen nhân hoặc

gen ty thể. Tuy nhiên, các rối loạn của ty thể do khiếm khuyết gen nhân hưa ư c

phát hiện nhiều [40].

Bệnh do rối loạn ty thể bắt nguồn t ột biến gen nhân có thể do sự khiếm

khuyết của các gen hay ổi ộ ổn ịnh của mtDNA, hay các gen nhân mã hóa

cho các thành phần của phức h p chuỗi hô hấp hoặc các gen mã hóa cho protein

không liên quan trực tiếp ến chuỗi hô hấp.

Bệnh do sự rối loạn của các gen nhân kiểm soát sự ổn ịnh của N iển

hình là bệnh liệ ơ ắt ngoài tiến triển trên nhiễm sắc thể hường (autosomal

dominant progressive external ophthalmoplegia-adPEO). a ố gia nh ang

adPEO chứa ột biến ở một trong 3 gen: ANT1 (adenine nucleotide translocator-

1) mã hóa cho chất hoạt t i ad nin ặ ưng h ơ i Twinkle mã hóa enzyme

helicase của mtDNA và POLG (DNA polymerase gamma) mã hóa tiể ơn vị  của

nzy p y a ặ ưng ủa ty thể ột biến ở POLG1 ũng ư c phát

hiện ở các anh chị em ruột mang hội chứng PEO trên nhiễm sắc thể hường [111].

ột biến trên gen mã hóa thymidine phosphorylase (TP) và ANT1 có lẽ phá

hỏng vùng nucleotide tự do bên trong ty thể dẫn ến hình thành sự mấ ạn

mtDNA thứ cấp [22].

ặ iể ng iển hình của adPEO là yế ơ iến triển, a ố ộng

nghiêm trọng ến ơ ắt ngoài. M ơ iểu hiện các s i ơ ỏ xé rách và gi m hoạt

tính của các enzyme của chuỗi hô hấp. Mấ iều hòa vận ộng, mất kh năng ngh

thần kinh ngoại vi v ục nhân mắt biểu hiện ở mộ v i gia nh [108]. Bệnh adPEO

với mấ ạn N ầ i n ư c mô t ở mộ gia nh người Ý với ặ iểm

lâm sàng giống như hội chứng liệ ơ ắt tiến triển (PEO) bao gồm sa mi mắt, nuốt

khó, khó phát âm, yế ơ ặt và chết ở tuổi trung niên [36].

ột biến trên gen mã hóa hy idin ph ph y a (TP) ư c báo cáo

ở các bệnh nhân bị bệnh ơ n kèm theo hội chứng dạ dày-ruột (mitochondrial

neurogastrointestinal encephalomyopathy-MNGIE). TP là một nhân tố quan trọng

liên quan ến việc kiểm soát và duy trì pyrimidine nucleoside của tế bào, khiếm

khuyết TP sẽ làm mất cân bằng dTTP làm nh hưởng ến tố ộ và sự chính xác

của quá trình tái b n của mtDNA [16, 22].

Hội chứng suy gi m mtDNA (mtDNA depletion syndrome-MDS) là một

nhóm các rối loạn ó ặ iểm là gi m số b n sao mtDNA, ặ iểm lâm sàng bao

gồm bệnh ơ ở ộ tuổi còn nhỏ kèm theo hội chứng DeToni–Fanconi, khiếm khuyết

chuỗi hô hấp, hỏng gan và chế ước 3 tuổi. MDS bao gồ ột biến trên 2 gen

i n an ến nh a ổi dNTP bao gồm thymidine kinase 2 (TK2) và deoxy-

guanosine kinase (dGK), có thể gây ra bệnh ơ ( hiếm khuyết TK2) hoặc bệnh não

kèm theo tổn hương gan (khiếm khuyết dGK). Hai g n n y i n an ến sự kiểm

soát và duy trì nucleotide của ty thể giống như TP ng hội chứng MNGIE. Các ột

biến trên các gen mã hóa cho các thành phần của phức hệ I, phức hệ II, phức hệ IV

và V của chuỗi hô hấp, gây ra nhiều bệnh như L igh hội chứng giống Leigh, hội

chứng Barth, hội chứng mấ iều hòa vận ộng (F id i h’ a axia), bệnh ơ ăng

acid lactic, teo dây thần kinh thị giác v.v [111].

1.4. C C PHƢƠNG PH P PH T HIỆN ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ

1.4.1. Các đặc điểm chung của bệnh do đột biến gen ty thể

Bệnh i n an ến ty thể là một nhóm các rối loạn ó h ng ặ iểm là tổn

hương chuỗi hô hấp và nh hưởng ến quá trình s n xuất ATP [94, 106]. ột

biến mtDNA là một trong những nguyên nhân chủ yếu của bệnh, các rối loạn ty thể

có thể nh hưởng ến nhiều mô, nhiề ơ an và bất k ở lứa tuổi nào. Trong ó,

ột biến mtDNA ộng chủ yế ến hệ thần inh v ơ v vậy các hội

chứng i n an ến thần inh v ơ ự thể hiện lâm sàng hay gặp nhất của rối

loạn ty thể n n òn ư c gọi là bệnh ơ n [76].

Kiểu hình lâm sàng phổ biến nhất là rối loạn vận ộng, co giật, tâm thần

phân liệt, sa mi mắt hay liệ ơ ắt, bệnh i n an ến sắc tố thị giác, teo dây thần

kinh thị giác và ù iếc, bệnh ơ i mất chứ năng ủa tụy và gan, tiể ường,

chậm phát triển tinh thần vận ộng, thiếu máu, ăng a id lactic [94]. ặ iểm

hóa sinh, di truyền và ộng lâm sàng của sự rối loạn mtDNA là cực k phức

tạp. Các bệnh nhân lớn tuổi thể hiện các dấu hiệu như bệnh ơ è h ấ iều

hòa vận ộng, mất kh năng ngh giật, bệnh i n an ến sắc tố võng mạc. Một

vài bệnh nhân chỉ yế ơ h ặc không chị ư c vận ộng. Bằng chứng về hình thái

học tốt nhất có lẽ là s i ơ ỏ xé rách khi nhuộm Gomori trichrome do sự í h ũy

của nhiều ty thể h ng nh hường ở ng a ơ bằng chứng phổ biến khác là

ph n ứng âm tính với cytochrome c oxidase của s i ơ ăng a id a i h ặc

pyruvic. Ở các bệnh nhân nhi, triệu chứng lâm sàng hay gặp nhất là co giật, chậm

phát triển tinh thần vận ộng, gi ương ự ơ nôn mửa t ng t, ăng a id

lactic trong máu và dịch não tủy, gi m kh năng h hấp, có thể bao gồm các hội

chứng a hệ thống, bệnh ơ n ệnh ơ i hi è h ệnh tim. Hình nh

cộng hưởng t n h ng nh hường, tuy nhiên các s i ơ ỏ xé rách có thể không

ư c phát hiện ng ơ inh hiết. Nghiên cứu cho thấy iều tra phân tử vẫn

không x ịnh ư c sự khiếm khuyết của các gen ở 50% bệnh nh n ưởng thành

bị ộng bởi sự rối loạn ty thể mặc dầu ư c thể hiện ở h nh h i v ặ iểm hóa

inh ặ ưng ối với các rối loạn ty thể ở bệnh nhân nhi, tỷ lệ ường h p

không chẩn n ư gia ăng 80-90% iều này chứng tỏ những hó hăn ủa

nh iều tra trong việc gi i thích các vấn ề di truyền ơ n của rối loạn ty thể

[111].

T ộng về mặt lâm sàng, hình thái và hóa sinh học của bệnh do rối loạn ty

thể hay ổi rất lớn vì vậy việc phân loại bệnh hường dựa v ặ iểm di

truyền của ột biến mặc dầu trong mộ v i ường h p, cùng một ột biến có thể

biểu hiện các kiểu hình lâm sàng khác nhau. Sự thể hiện lâm sàng ở bất k một

bệnh nh n n ều bị nh hưởng bởi các nhân tố như b n chất của ột biến, mứ ộ

h ng ồng nhất ột biến thứ cấp hoặ ính a h nh hệ gen ty thể và gen nhân,

ũng như nh n ố i ường và miễn dịch, nhu cầ năng ư ng và kh năng ù

ắp những hư hại của mô [87, 94]. Mỗi hội chứng có thể ó ặ iể i ng nhưng

ề ó h ng ặ iểm là kiểu hình lâm sàng chịu sự ộng của các yếu tố di

truyền ty thể ó di yền theo mẹ, sự phân chia ngẫu nhiên N ột biến

trong quá trình tái b n v ngưỡng biểu hiện của t ng mô. Tỷ lệ N ột biến có

thể hay ổi giữa các mô và cao nhất ở các mô bị ộng. a ố ột biến mtDNA

gây bệnh hường ở dạng h ng ồng nhất a hi ph n N ột biến ư c

phân chia vào các tế người con gái một cách ngẫu nhiên, kết qu là khác nhau

về mứ ộ h ng ồng nhất giữa Khi N ột biến ư í h ũy v ạt

mứ ộ ngưỡng của mô bị ộng, nó có thể gây ra kiể h nh h ng nh hường.

Sự phân chia một cách ngẫu nhi n ương ự có thể x y ra trong quá trình tạo trứng,

n n ư c tạo ra chứa mộ ư ng N ột biến khác nhau. Vì vậy một

người phụ nữ ang ột biến mtDNA có thể chuyển mộ ư ng N ột biến

h nha h người n iều này có thể dẫn ến sự hay ổi về mặt lâm sàng

giữa người con trong cùng mộ gia nh [95, 106]. Vì vậy, việc dự n ước

sinh về các rối loạn d ột biến mtDNA là một công việ hó hăn ởi vì không thể

x ịnh ư c cách thứ ột biến mtDNA dạng h ng ồng nhất phân chia

ở các mô và sự biểu hiện kiểu hình lâm sàng của ột biến này [86].

ột biến mtDNA dạng ồng nhất ư c truyền cho tất c n i a ố ột

biến gây hội chứng LHON ó ặ iểm là ồng nhất, mặc dầ ột biến ư c truyền

cho tất c các n nhưng hỉ có mộ v i người con biểu hiện bệnh, kho ng 50% nam

và chỉ có 10% nữ bị ộng. Mộ ột biến mtDNA dạng ồng nhất khác là

G1555A trên gen mã hóa rRNA là nguyên nhân quan trọng của bệnh iếc. Sự biểu

hiện lâm sàng của ột biến này phụ thuộc vào aminog y id ng ó iểm nổi

bật là tầm quan trọng của nhân tố i ường trong sự biểu hiện của bệnh mtDNA

dạng ồng nhất. Một số nghiên cứu cho rằng sự có mặt của ột biến mtDNA gây

bệnh là cần thiế nhưng h ng ủ ể kích thích biểu hiện thành kiểu hình lâm sàng,

húng ư c kiểm soát bởi nhân tố i ường ính a h nh ủa mtDNA hoặc nh

hưởng của g n nh n T y nhi n ơ hế phân tử ặ ưng về sự óng góp ủa các

nhân tố này vẫn hưa ư c hiểu mộ h ầy ủ [111].

Các bệnh di truyền ty thể hường có liên quan với nha ư c biểu hiện bởi

các triệu chứng khá giống nhau. Mứ ộ nghiêm trọng của bệnh ăng h ộ tuổi

và tỷ lệ N ột biến có mặt trong các mô bị ộng. ể chẩn n ệnh do

rối loạn ty thể, cách thức tiện l i là dựa vào các triệu chứng lâm sàng và các nghiên

cứu mô hóa học ở ơ Tuy nhiên, rất hăn ể chẩn n hính x ệnh bởi vì

ính a dạng của ộng lâm sàng và vấn ề sinh thiết cho nghiên cứu mô

bệnh học [55].

Tất c ặ iểm của N ư c mô t ở trên làm cho việc x ịnh các

rối loạn i n an ến mtDNA trở nên phức tạp. Khó hăn ầu tiên là việ x ịnh

sự liên quan giữa kiểu hình lâm sàng và sự rối loạn mtDNA. Một số hội chứng thể

hiện các dấu hiệ iển hình còn một số hội chứng ó ặ iểm lâm sàng gối

nhau. Sự di truyền theo mẹ là một chỉ số cho việc kiểm tra mtDNA nhưng nhiều gia

nh ang ột biến mtDNA lại không thể hiện bằng chứng bệnh ư c di truyền

theo mẹ. iề n y hường là do mứ ộ h ng ồng nhất, tỷ lệ ty thể mang ột biến

thấp ở các thành viên gia nh dẫn ến triệu chứng có thể khác nhau. Mộ iề ng

ư ý là mứ ộ h ng ồng nhất n n hay ổi ở các mô khác nhau v ư ng

ột biến có thể hay ổi theo thời gian. Vì vậy, loại ư c phân tích có lẽ quyết

ịnh cho việc chẩn n bệnh do rối loạn ty thể. Các phân tích về hình thái học và

hóa sinh học là quan trọng và có thể g i ý về các khiếm khuyết N ặ ưng

[7, 91]. Tuy nhiên, những nghiên cứu này chỉ cung cấp thêm thông tin cho việc

chẩn n nhưng h ng x ịnh ư c chính xác bệnh do rối loạn ty thể. Hiện nay,

phân tích DNA là những phương ph p hiện ại nhất cho phép phát hiện nhanh và

hính x ột biến gen gây bệnh. Ngoài ra, phân tích mtDNA là cần thiết cho

ư vấn di truyền về bệnh d ột biến gen ty thể.

1.4.2. Phân tích đột biến điểm DNA ty thể bằng PCR kết hợp với RFLP

Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) là kỹ thuật phân

tích ính a hình chiều dài của ph n ạn DNA ư c phân cắt giới hạn. Nguyên

tắc của kỹ thuật này dựa n ộ ặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn ối với vị trí

nhận biết của chúng trên DNA. Sự hay ổi về trình tự nucleotide của DNA có thể

dẫn ến sự thêm hay bớ iểm phân cắt của enzyme giới hạn h ạn

DNA phân cắ ó í h hước khác nhau, có thể nhận biế ư c dựa trên phổ ăng

khi iện di. Như vậy, ột biến x y ra trong trình tự của DNA tại những vị trí giới

hạn ặc hiệu sẽ dẫn ến ính a h nh ng hiều dài của ạn DNA giới hạn khi

ư c cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn ặc hiệu. Hiện ư ng n y ạo ra sự

a dạng trong chiều dài của ạn N hi iện di chúng trên gel thì có thể

phát hiện ư c các ột biến này.

Cùng với sự phát triển của kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction), kỹ

thuật RFLP trở n n ơn gi n hơn Trong kỹ thuật PCR, phối h p kh năng ai ặc

hiệu của DNA và kh năng kéo dài chuỗi của N p y a ể nhân b n các

ạn DNA khác nhau lên hàng triệu lần so với an ầu. Do DNA polymerase hoạt

ộng theo nguyên tắc cần phức h p khuôn-mồi ng i ường thích h p có các

dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành s i bổ sung với s i khuôn. Vì vậy ể nhân b n ư c

ạn N í h người ta cần thiết kế các mồi (p i ) ặc hiệu. Kỹ thuật PCR rất

nhạy, chỉ cần mộ ư ng nhỏ DNA khuôn (ng hoặc thấp hơn) thì ph n ứng có thể diễn ra.

Phối h p PCR-RFLP sẽ tạ iều kiện thuận l i cho việc phát hiện các ột

biến di truyền ng ó ó ột biến iểm mtDNA. PCR-RFLP là công cụ chẩn n

ư c sử dụng phổ biến nhấ ể phát hiện ột biến iểm trong mtDNA. Phương

pháp này bao gồ ước sau: (1) ạn mồi ư c thiết kế ể khuế h ại ạn

mtDNA chứa vị í ột biến; (2) s n phẩ P R ư c phân cắt bằng enzyme giới

hạn thích h p; (3) ạn cắ ư iện di trên gel agarose hay polyacrylamide

không biến tính, nhuộm ethidium bromide v ư c phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.

[89]. Các s n phẩm cắt có thể ư c iện di trên gel polyacrylamide và nhuộm bạc

với ộ nhạy a hơn Việc chọn lựa enzyme giới hạn ó ý nghĩa quyế ịnh trong việc

phát hiện ột biến iểm trong mtDNA. Dựa trên trình tự nhận biết của enzyme có sẵn

n ạn DNA chứa ột biến hoặc ư c chủ ộng tạo ra do cách thiết kế mồi trong PCR

mà có thể x ịnh ư c mẫu bị ột biến v h ng ột biến sau ph n ứng cắt enzyme.

Trong phòng thí nghiệ ng ột biến N hường ư c phát

hiện bằng phân tích PCR-RFLP, phương ph p phổ biến nhấ ư c sử dụng ể

phát hiện ột biến iểm mtDNA. y phương ph p ơn gi n v hiệ ể

ph hiện N ộ iến hi ng ọ với ố ư ng ẫ ớn PCR-RFLP bỏ qua

ước lai nên giá thành rẻ hơn v í ng y hiể hơn phương ph p ASO. Tuy nhiên,

phương ph p n y ó ộ nhạy ương ối, i hi ột biến hó ư c phát hiện vì sự

có mặt của ăng N ờ nhạt trên gel nếu tỷ lệ mt N ột biến trong mẫu

nghiên cứu thấp [29]. Giới hạn phát hiện của phân tích PCR-RFLP nhuộm ethidium

bromide (EtBr) là 5-10% [13].

1.4.3. Phân tích đột biến điểm bằng xác định trình tự gen

ột biến trong mtDNA có thể ư c phát hiện bằng kỹ thuật PCR-RFLP

và khẳng ịnh lại bằng x ịnh trình tự gen. Kỹ thuật gi i trình tự òn ư c sử

dụng ể phát hiện, tìm kiế ột biến mới trong hệ gen ty thể [48].

X ịnh trình tự nucleotide có thể phát hiện và khẳng ịnh chắc chắn loại

ột biến trên DNA ty thể. Tuy vậy y ũng ỹ thuật tốn nhiều thời gian và chi

phí cao, vì vậy kỹ thuậ x ịnh trình tự thường ư c sử dụng ể khẳng ịnh sự có

mặt của ột biến ng ó ó ột biến trong mtDNA.

1.4.4. Phân tích đột biến gen ty thể bằng một số phƣơng pháp khác

1.4.4. K thuật lai ot-blot (allele specific oligonucleotide – ASO)

Ph n í h d -blot ử dụng ẫu dò ặ ưng có gắn phóng xạ 32P cho phép

ph hiện ư nhiề ộ iến iể ùng ú Trình tự mtDNA ộ iến v h ng

ộ iến ư c khuế h ại nhờ ph n ứng PCR. S n phẩ P R ư c nhỏ vào màng

ni n í h iện dương Số chấm trên màng phụ thuộc vào số mẫ dò hay ư ng ột

biến ư c phân í h Mẫ dò SO d i h ng 19 n id ộ iến iể ư

ặ giữa ẫ dò ư nh dấu bằng 32P-ATP, sử dụng polynucleotide kinase.

Trong quá trình lai cần ph i có mẫu dò cho mt N h ng ột biến ối chứng

âm. N nh hường chỉ lai với mẫ dò ặ ưng h nh ự h ng ột biến,

các mẫu chứa ột biến dạng ồng nhất chỉ lai với mẫ dò ặ ưng h nh ự ột

biến òn ột biến dạng h ng ồng nhất sẽ lai với c hai loại mẫu dò trên. Phương

pháp này cho phép phát hiện ột biến với ộ nhạy kho ng 2% [13, 92].

1.4.4 K thuật P singl -stranded conformational polymorphism)

Phương ph p n y dựa trên nguyên tắc ng iều kiện iện di không biến

tính, các mạ h ơn N ẽ có cấu trúc nhấ ịnh tùy theo trình tự của nó. Các cấu

hình khác nhau ngay c khi chỉ khác biệt một nucleotide. Sự khác biệt này dẫn ến

sự khác biệt về kh năng di h yển trong gel polyacrylamide. Vì vậy, khi xuất hiện

ột biến trong phân tử mtDNA sẽ hay ổi cấu trúc bậc hai, cho phép phân tách

s i N ột biến v h ng ột biến. Phương ph p n y ó hể áp dụng ể ng ọ

ộ iến iể hưa iế ở ệnh nh n nghi ngờ ối ạn tDNA.

ầu tiên, vùng gen chứa ột biến ư c h ế h ại ( h ng 200-350 p ố

nhấ N có í h hướ h ng 150 bp) với một mồi có gắn phóng xạ ( nh dấ dATP-P32 h ặ h nh ang) v ột mồi không gắn phóng xạ ể tạ n n ạn

DNA s i i ngắn S n phẩ P R ư iến ính h nh i ơn v ph n h ằng

iện di n g p ya y a id h ng iến ính G n y h phép i ơn hồi

tính, hình thành cấu trúc bậc hai khác nhau. T nh ự h nha hay ổi ấ

ú N d ó ăng DNA ang ộ iến ư ph n iệ ởi ự di ú hi iện

di. Hình nh ư c ph n í h ự ộng ằng iện di a n h ặ ằng phóng xạ tự

ghi, s nh với ối hứng v phát hiện ột biến [70]. SSCP là một kỹ thuậ ơn

gi n, hiệu qu ể phát hiện ính a h nh v ột biến trong DNA ng ó ó

mtDNA [62].

1.4.4.3. Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống c m biến sinh học

Biochip là một kỹ thuật mới, ư c sử dụng trong sàng lọc phát hiện ột

biến mtDNA, với tố ộ rất nhanh, chính xác dựa n ơ ở ph n í h ột biến bằng

vi tính.

ể n x ấ hip N ặp ẫ dò ư hiế ế ặ hiệ h ng

ại ộ iến a gồ ẫ dò h nh ự nh hường v ẫ dò h nh ự ột

iến Mẫ dò ư i trên phiến ính ộ h ự ộng mỗi phiến ính với diện í h h ng 1 2 ó hể hứa h ng ă ến h ng ng n ẫ dò khác nhau. DNA

khuôn ư nh dấ v ai với ẫu dò. phương ph p nh dấ a gồ

gắn ự iếp hấ nh dấ v DNA khuôn P R với ồi nh dấ h ặ dùng

enzyme iến ổi ự iếp nh ự í h

Mộ nghi n ứ hử nghiệm biochip trên 7 ệnh nh n MEL S 5 ệnh

nh n MERRF 1 ường h p nghi nghờ MERRF v 25 người hỏ ạnh Sử dụng

N h n gắn hấ h nh ang y5 a ó h ế h ại ằng P R ồi iến h nh

ai với 31 ẫ dò ặ hiệ h 31 ại ộ iến iể g y n n MEL S v MERRF.

Các ín hiệ h nh ang ấ iể n i hip ư ắ giữ ởi ầ ọ

ín hiệ h nh ang ại ướ óng 635 n h y5 Kế h hấy ấ ệnh

nh n hẩn n MEL S ó ộ iến 3243G n RNLeu ở dạng h ng ồng

nhấ ng những ệnh nh n MERRF ó 4 ường h p ộ iến 8344G n

tARNLys dạng ồng nhấ ) 1 ường h p T8356 n RNLys ở dạng không

ồng nhấ , kh ng ai ng ố người hỏ ạnh ang những ộ iến n y [27].

Nhìn chung, ó ấ nhiề ỹ h ậ ư ử dụng ể ph hiện ộ iến iể

ng hệ g n y hể ỗi phương ph p ề ó những ư v như iể riêng. Tuy

nhiên phương ph p P R-RFLP vẫn ộ phương ph p ơn gi n, hiệ ư

ử dụng phổ iến ng ng ọ ệnh y hể h ến nay ó nhiề ng nh

nghi n ứ ph hiện ộ iến iể ng hệ g n y hể ằng phương ph p P R-

RFLP. iển h nh nghi n ứ ng ọ ph hiện ộ iến g n y hể với y

ớn [24, 31, 76, 110].

Ở Việt Nam, ột biến gen ty thể ũng ướ ầu ư c phát hiện bằng kỹ

thuật PCR-RFLP. Nă 2004 một bệnh nh n MEL S ang ột biến 3243G

ư c phát hiện lần ầu tiên bởi Lê Thị Bích Th o và tập thể [5] bằng phương ph p

PCR-RFLP và gi i trình tự nucleotide. Trong nghiên cứu này, các tác gi hiết kế

cặp mồi ặc hiệu mt-7F/mt-7R ể nhân b n ạn N ó í h hước 400 bp và

phát hiện ột biến A3243G dựa vào các phổ ăng N a hi ắt trực tiếp s n

phẩm PCR bằng enzyme ApaI Nă 2007 một bệnh nhân thứ hai mang hội chứng

MELAS chứa ột biến 3243G ư c phát hiện bởi Trần Thị Minh Nguyệt và tập

thể [3] bằng phương ph p P R-RFLP như ng nghi n ứu của Lê Thị Bích Th o

và tập thể. ột biến 3243G òn ư c phát hiện bằng kỹ thuật PCR-RFLP c i tiến

trong nghiên cứu của Trịnh L Phương v ập thể [4]. Trong nghiên cứu này, bằng

cách thiết kế cặp mồi không bắt cặp hoàn toàn, các tác gi ấ i iểm cắt

của HaeIII tại vùng mồi trong s n phẩm PCR, vì vậy có thể dễ dàng sử dụng HaeIII

trong kỹ thuật PCR-RFLP ể phát hiện ột biến A3243G.

Như vậy ột biến gen ty thể ở bệnh nhân Việt Na ướ ầ ư c nghiên

cứu. Tuy nhiên, h ng in ó ư c còn rất hạn chế. Vì thế, việ i nghi n

cứu một số bệnh do ột biến gen ty thể ở người Việt Na ó ý nghĩa h a học và

thực tiễn cao.

CHƢƠNG 2. NGUYÊN IỆU V PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN IỆU

2.1.1. Mẫu máu

Mẫu máu ngoại vi của 106 bệnh nhân người Việt Nam (59 nam và 47 nữ)

nghi bị bệnh ty thể (phụ lục 1) và 34 mẫu máu của bố mẹ v người thân của 11 gia

nh có bệnh nh n ang ột biến ư c lấy t Bệnh viện Nhi T ng ương t tháng 08 nă 2009 ến h ng 06 nă 2012 ẫ ư c b o qu n ở - 800C. Trong

nghiên cứu này, các bệnh nh n ư c nghi ngờ bệnh do rối loạn ty thể dựa trên sự có

mặt tối thiểu hai trong ba ặ iểm sau:

- T ộng lâm sàng liên quan ến 3 hoặc nhiề hơn 3 ơ an: hệ thần kinh

ng ương ơ xương v ơ i yến nội tiết, mắt và hệ tiêu hóa.

- Tăng a id a i ng h ặc dịch não tủy.

- Hình nh chụp cộng hưởng t n h ng nh hường.

2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác

Kit tách chiết DNA tổng số và DNA plasmid ư c mua t Qiagen; các cặp

mồi ư c mua t Invitrogen, Integrated DNA Technologies (IDT) và Bio Basic Inc;

thang chuẩn DNA, hỗn h p dNTP, dung dịch gốc (master mix) cho real-time PCR

ư c mua t h ng F n a ; Ta N p y a ư c mua t hãng

Enzynomics; các enzyme giới hạn ư c mua t Fermentas, New England Biolabs

(NEB); kit nhân dòng trực tiếp s n phẩm PCR pGEM T a y T4 N iga ư c

mua t hãng Promega; chủng vi khuẩn E. coli H5α ư c mua t hãng Novagen;

mẫ dò Ta an LN ư c mua t Integrtaed DNA Technology, hóa chất cho gi i

trình tự gen của Beckman Coulter.

Các hóa chất còn lại ề ư c mua t các hãng tin cậy (Sigma, Merk) v ạt

ộ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.

2.2. M Y MÓC V TRANG THIẾT BỊ

Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: máy PCR gradient

Mastercycler EP gradient S (Eppendorf), máy real-time PCR iQ5 cycler (Biorad), tủ

ấm nuôi vi khuẩn, máy lắc ổn nhiệt (Satorius), máy ly tâm Sigma 30K, máy ly tâm

lạnh 5417 R (Eppendorf), hệ thống gi i trình tự CEQ 8000 (Beckman coulter), thiết

bị iện di ngang iện di ứng (Biorad) và hệ thống chụp nh iện di Geldoc

(Biorad).

2.3. PHƢƠNG PH P NGHIÊN CỨU

2.3.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu

DNA tổng số ư c tách và tinh sạch t máu ngoại vi của các bệnh nhân theo

QIAamp DNA Mini Kit của Qiagen. Quy trình thực hiện như a :

Mộ ống 1 5 ạ h ư h ần ư 20 µ p a Qiag n v 200 µ ẫ

a ó ư ổ ng 200 µ ệ L v 4 µ RNa 10 g/ Hỗn h p ư

trộn ều bằng máy vortex ng 15 gi y ể h ư c một dung dị h ồng nhất và ư c ủ ở 56oC trong 10 phút. Sa ó hỗn h p ư y nhẹ 3 000 vòng/phú

Tiếp h hỗn h p ư ổ ng 200 µ han 100% ộn ề v y nhẹ

3 000 vòng/phú ng dị h ng ống ư h yển v ộ Qiag n, ly tâm ở 8000

vòng/phú ng 1 phú v dị h i a ộ ư ại ỏ ộ ư ổ ng 500 µ

AW1 và ly tâm ở 8 000 vòng/phú ng 1 phú a ó dị h i a ộ ư ại ỏ

ộ iếp ụ ư h h 500 µ W2 y 14 000 vòng/phú ng 2 phú v

dị h i a ộ ư ại ỏ ộ ư h yển ang ộ ống 1 5 ạ h h v ư

ổ ng 150 µ nướ ấ v ùng v ể y n ng 1 phú a ó ư y ở 8.000 vòng/phú ng 1 phú ị h i a ộ N ổng ố Mẫ ư n ở -20oC

cho ến hi ử dụng

2.3.2. Tách chiết DNA plasmid

N p a id ư c tinh sạch theo kit Qiaprep-miniprep của Qiagen với các

dung dị h ệm kèm theo: N3, PB, PE, EB. Quy trình thực hiện như a :

Một khuẩn lạc (E. coli) mang plasmid biến nạp mong muốn ư c nuôi trong 5

i ường LB lỏng có bổ sung ampicillin 50 g/ v ư c nuôi lắ a ở 370C kho ng 200 vòng/phút trong 14-16 giờ. Dịch nuôi cấy ư c ly tâm với tố ộ

6.000 vòng/phú ng 10 phú ể thu tế Sa ó ế ư c hoà trở lại trong

250  ệm P1 có chứa RNase A 10 mg/ml, trộn ều bằng vortex. Tiếp ó 250 l

ệ P2 ư c bổ sung vào hỗn h p n o nhẹ 4-6 lần v ặt ở nhiệ ộ phòng 5

phú ể phá vỡ tế bào gi i phóng plasmid. Hỗn h p ư c trung hoà bằng 350 l

ệ N3 ư c làm lạnh o nhẹ 4-6 lần ặ n 5 phú ịch nổi ư c thu lại

bằng y 13 000 vòng/phú ng 10 phú v ư c chuyển lên cộ Qiag n ng

cấp sẵn trong kit, tiếp tục ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch ch y

qua. Cộ Qiag n ư c rửa 2 lần, lần thứ nhất bằng 500  ệm PB, ly tâm ở 13.000

vòng/phút trong 1 phút loại bỏ dịch ch y qua; lần thứ 2 bằng 750  ệm PE và tiếp

tụ y ể loại bỏ dịch ch y a ể loại bỏ hoàn toàn thành phần ethanol có

ng ệm PE, cộ ư c ly tâm thêm một lần nữa ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút.

DNA trên cộ a ó ư c thu lại bằng cách bổ sung 100  ệm EB (Tris-HCl 10

mM pH 8,5) hoặ nước cất khử ion khử trùng vào giữa cộ v ể cộ ứng trong 1

phút, tiến hành ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút thu dịch ể h ư c DNA

nhiều nhất có thể chiết cột hai lần, mỗi lần bằng 50  ệm EB với ước tiến

h nh ương ự.

2.3.3. Kiểm tra và định lƣợng DNA tách chiết

Sự có mặt của N ư c kiểm tra bằng iện di trên gel agarose 1%. 7µl

N ư c trộn với 2µ ệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 µg/ml), tra lên

giếng g aga 1% ng ệm TAE 1X. iện di ư c thực hiện với hiệ iện thế

ổn ịnh 10 v / g ăng DNA ư c phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.

Nồng ộ của DNA tách chiế ư ịnh ư ng bằng h ậ ộ hấp thụ

ánh sáng tử ngoại của các acid nucleic ở ước sóng 260 nm (A260) trên máy

NanoDrop. Nguyên tắc của phương ph p dựa vào kh năng hấp thụ ánh sáng tử

ngoại ở ước sóng 260 nm (A260) của các phân tử DNA. T giá trị mậ ộ quang ở

ước sóng 260 nm của các phân tử DNA, với hệ số A260 = 1 ương ương với hàm

ư ng DNA s i i 50 μg/ ử dụng công thức C = A260 x 50 x n ( ng ó n

số lần pha ng) ể ịnh ư ng DNA có trong mẫu tách chiết.

ộ tinh sạch của DNA tách chiết ư x ịnh bằng tỷ số A260/A280. DNA

ư c cho là sạch khi giá trị A260/A280 nằm trong kho ng 1,8 - 2,0.

2.3.4. Nhân bản đoạn gen ty thể chứa đột biến bằng kỹ thuật PCR

ạn gen ty thể chứa ột biến A3243G, T3271C, T3291C (MELAS),

A8344G, T8356C (MERRF), G11778A, G3460A, T14484C (LHON), T8993G/C,

T9176G (L igh) 1555G ( iếc), G4298A, T10010C, T14728C, T14709C (hội

chứng ơ n ) ư c khuế h ại bằng ph n ứng chuỗi polymerase (PCR).

PCR với các cặp mồi ặc hiệu ư c thiết kế và chế ộ nhiệt như trong

b ng 3.2, khuôn cho ph n ứng PCR là DNA tổng số ư c tách chiết t mẫu máu

bệnh nhân. Theo tính toán lý thuyết, với trình tự các cặp mồi ư c thiết kế thì các

ạn gen chứa ột biến ó í h hước ương ứng (b ng 3.2) sẽ ư c nhân lên bằng

kỹ thuật PCR.

Thành phần của ph n ứng PCR bao gồm: 2,5 l ệ Taq DNA polymerase

10X; 0,5 l Taq N p y a (5 ơn vị/ l); 2,5 l dNTPs 2mM; 1 l ồi x i

10 pmol; 1 l ồi ngư 10 pmol; 1 l DNA khuôn (40-45 ng/l) và 16,5 l dd

H2O h ổng hể í h 25 l. Hỗn h p ph n ứng ư c trộn ề ặt vào máy PCR và

tiến hành chạy với 3 ước chính: biến tính DNA, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Mẫ ối

chứng âm tính (không chứa N ) ư ặt cùng thí nghiệ ể kiểm tra kh năng

nhân b n h ng ặc hiệu.

S n phẩ ph n ứng a ó ư iể a ằng iện di n g aga 2%

Sau khi PCR kết thúc, 7µl s n phẩ ư c trộn ều với 2µl dung dị h ệm tra mẫu

có chứa Ethidium bromide ở nồng ộ 50 µg/ml, tra lên giếng gel h ẩn bị trong

ệm TAE 1X. Thang chuẩn DNA 100 p ư iện di song song cùng với mẫu.

iện di ư c thực hiện với hiệ iện thế ổn ịnh 10 v / g h ến khi vạch

màu cách mép b n gel kho ng 2 cm. B n gel chứa ăng N ư c quan sát

trên máy soi và chụp nh bằng hệ thống Geldoc (Biorad).

2.3.5. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới

hạn (PCR-RFLP)

T ng nghi n ứ n y ộ iến iể N y hể ư ph hiện ằng ỹ

h ậ P R-RFLP (v ư hẳng ịnh ằng ỹ h ậ x ịnh nh ự n id ).

ạn g n hứa ộ iến ư nh n n ằng ỹ h ậ P R như

ở phần 2 3 4. n phẩ P R ủa ỗi ại ộ iến a hi iể a n g

agarose 2% ư ắ ự iếp ằng nzy giới hạn hí h h p ương ứng (b ng

3.3). Ph n ứng ắ ư hự hiện với h nh phần như sau: 3 l ệ nzy giới

hạn 10X; 1 l nzy giới hạn (10 ơn vị/l); 15 l n phẩ P R v 11 l dd

H2O h ổng hể í h 30 l hỗn h p ph n ứng ư giữ ở 37o 8-12 giờ Sa ó

s n phẩ ắ ư iện di n g agarose 2% hay polyacrylamide 10% và ộ iến

ư ph hiện dựa v ính a h nh ủa ạn ắ hi an dưới nh ng ử

ng ại

2.3.6. Nhân dòng trực tiếp đoạn gen chứa đột biến vào vector pGEM- T

2.3.6.1. Ph n ứng gắn đoạn gen chứa đột biến vào vector

Các s n phẩm của ph n ứng P R a hi iểm tra trên gel agarose 2%

ư c gắn trực tiếp vào vector nhân dòng pGEM-T theo kit của Promega. Ph n ứng

có thể thực hiện ư c là do kh năng gắn thêm một gốc adenosine monophosphate

(A) ở ầ 3’ của s n phẩm PCR nhờ hoạt tính terminal transferase không phụ thuộc

vào trình tự DNA khuôn của Taq N p y a T ng hi ó v nh n dòng

ầu T (pGEM-T) ư c thiết kế có chứa một gốc thymidine monophosphate (T) ở

ầ 3’ Như vậy, s n phẩm của ph n ứng PCR có thể ư c gắn chính xác vào vector

nhân dòng.

Thành phần của ph n ứng gắn s n phẩm PCR vào vector pGEM-T trên tổng

thể tích 10 l như a : 5 l ệm T4 DNA ligase, 1 l T4 DNA ligase, 1 l vector

pGEM-T, 2 l s n phẩm PCR và 1 l ddH2O. Hỗn h p ph n ứng ư c ủ ở 22oC trong 2-3 giờ hoặc 4o a v giữ ở -20o h ến khi biến nạp.

2.3.6.2. Biến nạp bằng phương ph p sốc nhiệt vào tế bào E. coli kh biến

ể biến nạp plasmid vào tế bào kh biến E. coli DH5, tế h iến ( ư xử ý ng iề iện ạnh v ó i n a2+ ư n ở -80o ) ư ấy a

ể n 10-20 phú h an dần Sa ó 10 µl hỗn h p ph n ứng gắn ở n ư

ổ ng v d ng dị h ế ộn nhẹ v ể n 20 phú ạ iề iện h

v n h nh ế a ó ư ố nhiệ ở 42o ng 45 gi y v ư

h yển ngay n 2 phú 300-500  i ường L ỏng ư ổ ng v hỗn h p iến nạp Mẫ a ó ư n i ấy ĩnh ng ủ ấ ở 37oC trong 10 phút và tiếp ến nuôi lắc ở tố ộ 150 vòng/phút, 37o ng 50 phú ể phụ hồi ế

a hi ị ố nhiệ . 50-100  hỗn h p iến nạp ư ấy i ế n ĩa p i

hứa i ường L ặ ó 50 g/ml ampicillin, 20 l X-gal 20 mg/ml và 20 l IPTG 100 M v n i ng ủ ấ 37oC h ến hi an hấy ự h nh h nh

h ẩn ạ õ ệ ( a 12- 30 giờ n i ấy)

Các khuẩn lạc E. coli DH5α tạ h nh ư c kiểm tra bằng phương ph p P R

trực tiếp. Khuẩn lạc mang vector tái tổ h p sẽ ư c chọn lọc và nuôi trong môi

ường LB lỏng, chuẩn bị h ước tách plasmid.

ơ ở ể chọn lọc khuẩn lạc là nhờ có gen lacZ trong vector pGEM-T mã

hóa cho β-galactosidase có kh năng ph n gi i ư ơ hất X-gal thành β-

galactose và h p chất 5-bromo-4-chloro indolyl. H p chất này tác dụng với oxy

trong không khí và chuyển h nh 5 5’-dibromo-4 4’-dichloro indigo có màu xanh da

trời. Vì vậy, ng i ường có ơ hất X-gal và chất c m ứng IPTG thì các khuẩn

lạc có chứa vector nguyên b n sẽ có màu xanh, còn các khuẩn lạc với các tế bào

mang vector tái tổ h p có gen chèn vào vị trí gene lac Z sẽ có màu trắng (do gen

lacZ bị bất hoạt). ăn ứ vào màu của khuẩn lạ n i ường nuôi cấy có

ampicillin, Xgal và IPTG, có thể nhận ra các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ h p.

2.3. . Giải trình tự các đoạn gen chứa đột biến

ột biến mtDNA ư c phát hiện bằng PCR-RFLP ư c khẳng ịnh lại

bằng x ịnh trình tự gen chứa ột biến.

Nguyên tắ : x ịnh trình tự dựa h phương ph p ết thúc bằng ầu tận

cùng chứa dideoxynucleotide (ddNTP) [85] Khi ddNTP ư c gắn vào chuỗi

N ang ổng h p thì chúng sẽ làm cho quá trình kéo dài chuỗi bị ng ng lại (do

các nucleotide này chỉ chứa 3’–H hay h 3’–OH) Như vậy, t mộ ạn DNA

an ầu, nhiề ạn s i ơn ới ư nh dấu ở mộ ầu tận cùng bằng ddNTP sẽ

ư c tổng h p v ạn n y ó ộ dài khác biệt nhau mộ n id ạn

s i ơn ới tổng h p ư ph n h n g iện di acrylamide dạng mao qu n.

M y ọc trình tự sẽ tự ộng phân tích kết qu ể ưa a nh ự ạn DNA gốc.

Gi i trình tự ư c tiến h nh a 2 ước: ước PCR thông hường ể khuếch

ại ạn trình tự cần ọ v ướ P R h x ịnh trình tự.

P a id inh ạ h ư ử dụng h n h P R h ng hường (P R ần

1) với ặp ồi pU 19-Fw và pUC19-Rv ( ó nh ự nằ n v pGEM-T) ể

h ế h ại ạn nh ự ần ọ . S n phẩ P R ần 1 ư iện di iể a n

gel agarose 2% và pha ng ở nồng ộ hí h h p ( h ng 50-100 p ) ư dùng

làm khuôn h P R ng x ịnh nh ự (P R ần 2) Th nh phần ph n ứng P R

h x ịnh nh ự gồ : 4  hỗn h p T S ( y ina y n ing)

Master mix, 0,5 l khuôn, 1  ồi pU 19 Fw/Rv và H2O hử i n hử ùng v a

ủ 20  Về ơ n ph n ứng P R n y ó h nh phần giống như P R h ng

hường nhưng ó ộ ố h iệ h ự ó ặ ủa các ddNTP ư nh dấ

h nh ang v hỉ ần dùng ộ ại ồi ( ồi x i h ặ ồi ngư ) P R ư hự hiện như a : 96o ng 1 phú ể hởi ộng nóng an ầ iếp h 30 chu gồ 3 ướ : 96oC trong 20 gi y ể iến ính N 56oC trong 30 gi y ể gắn ồi 60o ng 4 phú ể é d i h ỗi Mẫ a ó ư ủ iếp ở 60oC trong 7 phú v giữ ở 4o h ến hi ph n í h

S n phẩ P R ần 2 ư xử ý ướ hi ưa v y ọ nh ự Q

nh xử ý ẫ gồ ướ a :

- ng dị h d ng ph n ứng ư h ẩn ị ngay ướ hi dùng a gồ : 20

l Kali-acetate 3 M, pH 5,2; 20 l EDTA 100 mM, pH 8; 10  g y g n v ộn

ề 5  d ng dị h d ng ph n ứng ư ổ ng v ỗi ống n phẩ ph n ứng P R

v ộn ề hậ ỹ

- 60  han 95% giữ ở -20o ư ổ ng v hỗn h p v ộn ề Sa ó hỗn h p ph n ứng ư y ngay ở 13 000 vòng/phú ng 20 phú ở 4oC.

ị h nổi ư hú ỏ nhẹ nh ng v h ế ủa Kế ủa ư ửa 2 ần ỗi ần ằng

200  han 70% giữ ở -20o v ư y ở 13 000 vòng/phú ng 5 phú ở

4oC. Dịch nổi sau ly tâm ư hú ỏ ẩn hận ằng pip h ế ủa v ư ể

h ở nhiệ ộ phòng Kế ủa ư h an ở ại ằng 40  d ng dị h ệ a

ẫ SLS ( a p ading i n) Mẫ a hi xử ý ư gi i nh ự ằng hệ

hống ọ nh ự EQ-8000 ủa h ng an

Kế ọ nh ự ạn g n ng ẫ ệnh nh n ư nh với nh

ự g n y hể ương ứng ư ăng ý n ng n h ng g n hế giới với ố

J01415.2 [9] ằng phần ề G n yx-Win (phi n n 4 0).

2.3.8. Điện di DNA trên gel agarose

Nguyên tắc: Các phân tử N p yani n n n ng i ường trung tính

và kiề dưới tác dụng của iện ường chúng sẽ di chuyển về cự dương Mứ ộ di

chuyển của các phân tử N ng iện ường phụ thuộc chủ yế v í h hước của

chúng và nồng ộ gel. Phân tử có í h hước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn ph n ử có

í h hước lớn.

Gel agarose 1-2% ư c chuẩn bị ng ệm TAE với nồng ộ EDTA 1-2

M ể tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease. Mẫ N ư c trộn với ệm mẫu có

chứa glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xylene cyanol và ethidium

bromide (EtBr) ở nồng ộ 50 g/l và tra vào các giếng n g Q nh iện di

ư c thực hiện với hiệ iện thế ổn ịnh 10 v / g ến khi vạch màu

bromophenol xanh cách mép gel kho ng 2 cm thì d ng lại. Sau khi kế hú iện di,

b n g ư c lấy a v i dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp nh Geldoc

(Biorad).

Phương ph p an N ng g agarose thuận l i nhất là dùng thuốc

nhuộm hu nh quang EtBr. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của acid

nucleic và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel. Mặ dù ính inh ộng

iện di của DNA s i i ạch thẳng gi m khi có mặt thuốc nhuộm (kho ng 15%),

nhưng h năng x ịnh gel trực tiếp dưới ánh sáng UV trong suố nh iện

di hoặc ở giai ạn cuối ó ư hế rõ rệt.

2.3.9. Điện di DNA trên gel polyacrylamide

G p ya y a id ư c trùng h p t acrylamide và bis-acrrylamide cùng

với ammonium persulphate và TEMED. Ph n ứng trùng h p chuỗi ư c bắ ầu

ng ó a y a id n ư c trùng h p thành một chuỗi dài. Khi bis-

a y a id ư c bổ sung trong ph n ứng polymer hóa, các chuỗi sẽ liên kế hé ể

tạo thành dạng g Kí h hước lỗ g ư x ịnh bởi chiều dài của chuỗi và mức

ộ liên kết chéo. Chiều dài của chuỗi polyac y a id ư x ịnh bằng nồng ộ

acrylamide trong ph n ứng polymer hóa. Gel polyacrylamide 10% ư c tổng h p

với các thành phần như ng ng 2.1.

Bảng 2.1. Thành phần trong bản gel polyacrylamide

STT

Thành phần

Thể tích

Dung dịch acrylamide 30%

2 ml

TBE 5X

1 ml

APS 10%

35 µl

TEMED

3,5 µl

Nước cất khử trùng

2 ml

5 ml

Tổng thể tích

S n phẩm nhân b n gen bằng P R a hi ư c cắt bằng enzyme giới hạn

ư c trộn với ệm mẫu v a v ường chạy iện di ng ệm TBE 0,5X với hiệu

iện thế ổn ịnh 10 vol/cm gel cho tới khi vạch chỉ thị h y n gel 0,5 cm

thì d ng lại G ư c nhuộm bằng E hòa ng nước, sau kho ng 5 phút, b n gel

ư c lấy ra, rửa dưới vòi nướ v i dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel

IQ5 (Biorad), cá ăng gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng ăng ng n

nền g n

Trong nghiên cứu này, DNA òn ư c nhuộm bạc với ộ nhạy a hơn

Thuốc nhuộm bạ ư c sử dụng hiệu qu ể phát hiện mộ ư ng nhỏ (picogram)

acid nucleic. Giới hạn phát hiện DNA s i i hi an ằng mắ hường là kho ng 1pg/mm2 mặt cắt ngang của ăng N nhạy gấp 1.000-10.000 lần phương

pháp nhuộm Etbr. Quá trình nhuộm bạc ư c thực hiện theo phương ph p ủa

Budowle và tập thể, 1991 [19] có c i tiến, bao gồ ước sau:

- ăng N ư c cố ịnh trong acid acetic 10% ng 5 phú ể ngăn

c n sự khuếch tán của các phân tử a id n i ư c phân tách trong gel, loại bỏ

và trung hòa các hóa chất không mong muốn.

- Gel ư c rửa bằng nước khử ion trong 5 phút, lặp lại 3 lần ể loại bỏ acid

acetic, các chất bẩn dạng vết và phần th a của các thành phần gel hòa tan sau khi cố

ịnh.

- C ăng N ư c cố ịnh lần 2 trong acid nitric 1% trong 5 phút.

- Gel ư c rửa ng nước khử ion trong 2 phút, lặp lại 3 lần ể loại bỏ acid

nitric.

- Gel ư c nhuộm trong dung dịch bạc nitrat 0,012 M với thời gian tối ư

kho ng 20 phút và rửa nhanh b n gel trong 10 gi y ể loại bỏ thuốc nhuộm th a

bám trên b n gel, có thể gây ra kết tủa màu nâu trong quá trình hiện màu.

- C ăng N ư c hiện màu bằng hỗn h p dung dịch chứa sodium

carbonate 0,28 M, formaldehyde 0,019% và sodium thiosulfate 4 M ể gi m màu

nền h ng ặc hiệu một cách hiệu qu .

- Ph n ứng phát triển màu ư c d ng lại khi h ư c hình nh tối ư ng

nhanh càng tốt bằng cách dùng acid acetic 10%.

2.3.10. Định lƣợng đột biến A3243G bằng kỹ thuật real-time PCR

Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện v ịnh ư ng s n phẩm khuếch

ại khi tiến trình ph n ứng ang diễn ra dựa n ơ ở ph n ứng hu nh quang, trong

ó ự ăng n về số ư ng N ương ứng với sự ăng n ủa tín hiệu hu nh

quang. Tín hiệu hu nh ang ư c ph n ánh số ư ng s n phẩ ư c khuếch

ại trong mỗi chu k . Tùy thuộc vào số ư ng b n N í h an ầu có trong ống

ph n ứng mà giá trị Ct (chu k ngưỡng) của các mẫu là khác nhau. Dựa v ặc

iểm này có thể x ịnh số b n a N í h ó ng ẫu nghiên cứu dựa trên

mẫu chuẩn iết rõ số ư ng N í h an ầu.

Trong thí nghiệm này, mẫu dò hu nh quang Taqman có trình tự bổ sung với

trình tự ặc hiệ n N í h ầ 5’ ủa mẫu dò có gắn chất phát hu nh quang

(reporter) FAM (495/520 nm) cho mẫ dò ặc hiệu với trình tự ột biến và HEX

(535/556 nm) cho mẫu dò ặc hiệu với trình tự h ng ột biến, còn ầ 3’ của mẫu

dò có gắn chất hấp phụ ương ứng (quencher) là IBFQ (Iowa black fluorescence

quencher).

Ng i a ể ăng nhiệ ộ tách chuỗi (Tm) v ính ặc hiệu của mẫu dò, trong

trình tự của mẫu dò còn có nucleotide c i biến dạng khóa bằng cầu methyl (locked

nucleic acid) (hình 2.1).

Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNA [http://www.proligo.com]

Nguyên tắc của phương ph p: Khi hưa ó ự xuất hiện của s n phẩm

khuế h ại ặc hiệu t N í h h ẫu dò Taqman vẫn còn nguyên vẹn nên

hu nh quang phát ra t reporter sẽ bị quencher hấp phụ, ống ph n ứng sẽ không

ph ư c hu nh quang khi nhận ư c nguồn sáng kích thích. Khi bắ ầu có sự

xuất hiện s n phẩm khuế h ại ặc hiệu thì mẫu dò Taqman sẽ bắt cặp với khuôn và

bị enzyme Taq DNA polymerase cắt bỏ ể kéo dài mồi tổng h p s i bổ sung, do

vậy reporter sẽ rời xa quencher và phát hu nh quang khi nhận nguồn sáng kích

thích (hình 2.2). S n phẩm khuế h ại càng nhiều thì số ư ng reporter tự do càng

nhiều v ường ộ hu nh quang phát ra càng lớn và máy sẽ ghi nhận ư c tín hiệu

hu nh quang.

Hình 2.2. Nguyên lý hoạt động của mẫu dò Taqman

Cách tiến h nh: ột biến 3243G ư ịnh ư ng bằng real-time PCR sử

dụng cặp mồi mtMEL-F2 và mtMEL-R2 và mẫu dò Taqman LNA (locked nucleic

a id) ặc hiệu cho trình tự í h ( ng 2.2).

Bảng 2.2. Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real time PCR

Mồi/Mẫu dò

Trình tự

Vị trí trên DNA ty thể

mtMEL-F2

5’-CCA CAC CCA CCC AAG AAC AG-3’

3206 - 3225

mtMEL-R2

3267 - 3295

5’-AGG AAT TGA ACC TCT GAC TGT AAA GTT TT-3’

Wt-MEL-HEX-1 HEX- CCG GGC+T+CT GCC AT-IBFQ

3237 - 3250

Mt-MEL-FAM-1 6FAM-CCG GGC+CCT GCC AT-IBFQ

3237 - 3250

Ghi chú: dấu + chỉ nucleotide LNA

ạn DNA chứa ột biến A3243G dài 90 bp t vị trí 3206-3295 ư c nhân

b n với cặp mồi mtMEL-F2 và mtMEL-R2 v n id ột biến ư c phát hiện

bằng mẫ dò ặc hiệu Wt-MEL-HEX-1 và Mt-MEL-FAM-1.

Thành phần của ph n ứng real-time PCR gồm qPCR master mix (2X), 0,4

µmol/L mỗi loại mồi, 0,08 µmol/L mỗi loại mẫu dò (Wt-MEL-HEX-1/Mt-MEL-

FAM-1) và 10 ng DNA khuôn cho tổng thể tích 25 l. Real- i P R ư c thực

hiện với chế ộ nhiệt 95°C, 10 phút tiếp nối 40 chu k với 95° 15 gi y ể biến

ính v 60° 60 gi y ể bắt cặp và kéo dài chuỗi.

ường ộ tín hiệu hu nh ang ư c ghi nhận và phân tích bởi hệ thống iQ5

cycler (Biorad). Sau khi hoàn tất các chu k nhiệt, các mẫu chuẩn và mẫu phân tích

ó ường biểu diễn khuế h ại ương ứng (hình 2.3 A). T giá trị ngưỡng (Ct)

của mẫu nghiên cứu, dựa v ường chuẩn ư c thiết lập (hình 2.3 B) bằng cách

trộn mẫ N p a id ang ột biến v h ng ang ột biến với các tỷ lệ khác

nhau t ó % ột biến của mẫu ph n í h ư c tính ra.

Hình 2.3. Biểu đồ một đƣờng biểu diễn khuếch đại (A) và biểu đồ chuẩn về mối quan

hệ giữa số bản DNA đích có trong các mẫu chuẩn và chu kỳ ngƣỡng tƣơng ứng (B)

Cụ thể p a id ang N ó ột biến và không ột biến 3243G ư c

tách và tinh sạch theo kit của Qiagen. Số b n sao DNA chứa ột biến v h ng ột

biến ư c tính dựa n í h hước hay trọng ư ng phân tử và nồng ộ của DNA

plasmid. Dãy DNA plasmid t 5.103 - 5.108 b n sao/µl (hệ số pha loãng 10) chứa

trình tự ột biến v h ng ột biến ư c chạy cùng với mẫu và trong mỗi ph n ứng

có mặ ồng thời p a id ang ột biến v p a id h ng ang ột biến Lư ng

ột biến trong mỗi mẫ ư 3 ần (n = 3) v ư c xử lý th phương ph p

thống kê.

2.3.11. Định lƣợng acid lactic trong máu

Nguyên tắc: Acid lactic bị oxi hóa bởi lactate oxidase (LOD) tạo thành acid

pyruvic và hydrogen peroxide (H2O2). H2O2 tác dụng với chất sinh màu dạng khử và

bị xy hóa dưới tác dụng của enzyme peroxidase tao thành chất có màu. ường ộ

màu tỉ lệ với nồng ộ acid lactic có trong bệnh phẩm. S n phẩ ư ằng

y ang phổ tự ộng AU2700.

h iến h nh: M n phần ủa ệnh nh n ẽ dụng với hấ hống

ng H pa in a ó y ng 3 phú với vận ố 5.000 vòng/phú ể h h yế

ương. Ph n í h ẫ ngay ập ứ h ặ h h yế ương v n ạnh ngay

ng vòng 15 phú a h hập ẫ Sau ó ặ ống ẫ ư y v vị í

trên hay hứa ẫ ; vận h nh y AU2700 h hướng dẫn ủa nh n x ấ và

y ẽ ự ộng h ế a hi h n ấ nh ph n í h Kế ư nh

giá dựa n gi ị acid lactic ha hiế ối với ệnh nhi (í hơn 2,2 mmol/L).

Trong nghiên cứu này, thông số về h ư ng acid lactic trong máu bệnh

nh n ư c cung cấp bởi Bệnh viện Nhi T ng ương.

CHƢƠNG 3. ẾT QU VÀ TH O LUẬN

3.1. PHÂN TÍCH C C ĐẶC TRƢNG CỦA BỆNH NHÂN CHỌN NGHIÊN CỨU

ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ

3.1.1. Các đặc điểm về bệnh lý

106 bệnh nhân nghi ngờ bệnh do rối loạn ty thể ư c sàng lọc trong nghiên

cứu này. Theo các dẫn liệu khám bởi ĩ ở Bệnh viện Nhi T ng ương, các bệnh

nhân trong nghiên cứu ều thể hiện các triệu chứng i n an ến bệnh ơ n ty

thể với ặ iểm lâm sàng (phụ lục 2) ư c tổng kết ở b ng 3.1

Bảng 3.1. Đặc điểm lâm sàng và tỷ lệ bệnh nhân bị tác động

Đặc điểm lâm sàng

Số lƣợng bệnh nhân bị tác động

Tỷ lệ bệnh nhân bị tác động (%)

Tổn hương n

Bệnh ơ

53,9

Co giật

46,1

83,3

Chậm phát triển tinh thần, vận ộng

a ầu, gi m nhận thức

33,3

Mấ iều hòa vận ộng

19,6

Mất kh năng ngh nh n

14,7

Thiếu máu

8,8

Nôn mửa

28,4

Sụp mi mắt

15,7

Chứng rậm lông

3,9

Tăng a id a i trong máu

4,9

Ghi chú: Tỷ lệ bệnh nhân bị ộng ư c tính trên tổng số bệnh nhân có bệnh án (102

ường h p). Tỷ lệ bệnh nh n ó h ư ng a id a i ăng ư c tính trên tổng số bệnh nh n ư c kiể a (74 ường h p).

97,3

Như nh y trong b ng 3.1, co giật là một trong những triệu chứng

lâm sàng phổ biến nhất ở các bệnh nhân này, chiếm 83,3%; ng ó a ố ường

h p là co giật toàn thân với ặ iể ơn giật kéo dài kho ng 1-2 phút, một

số ường h p có kèm theo nôn mửa; chỉ một số ít ường h p co giật x y ra cục bộ.

Bệnh não là triệu chứng lâm sàng phổ biến thứ hai, hơn 53,9% bệnh nhân có hình

nh chụp cộng hưởng t n (MRI) h ng nh hường như teo não, vôi hóa hạch

trung tâm, to phồng não thất, tổn hương nh n x ng ương x ất huyết não,

gi m tỷ trọng khu trú vùng nhân bèo hai bên, loạn dưỡng não chất trắng ặc biệt

có những ường h p thể hiện hình nh não hương tổn giống như tai biến mạch

máu não x y ra ở bệnh nhân lớn hơn 12 ổi. Bệnh ơ chiếm 46,1%, ng ó như c

ơ và rối loạn ương ự ơ ư c phát hiện hơn 80%; một số ường h p nặng biểu

hiện ơ hay iệt tứ chi.

H ư ng acid lactic trong máu cao chiếm 97,3% tổng số bệnh nh n ư c

kiểm tra, trung bình là 4,2 mmol/L ó ường h p h ư ng acid lactic ăng ến

12,3 mmol/L (trẻ nh hường: í hơn 2,2 mmol/L) (dẫn liệu t Bệnh viện Nhi Trung

ương). Trong nghiên cứu này, có 8,8% ường h p mất kh năng ngh nh n; 3,9%

bệnh nhân có triệu chứng sụp mi mắt và 4,9% có biểu hiện chứng rậm lông. Kho ng

19,6% ường h p thể hiện gi m nhận thức và có triệu chứng a nửa ầ iển hình.

Trong các biểu hiện lâm sàng thì thiếu máu ũng là một ộng phổ biến, chiếm

28,4% bệnh nhân. Kho ng 50% bệnh nh n ó vó người nhỏ bé và trọng ư ng ơ

thể thấp ư c so sánh với trẻ nh hường theo tiêu chuẩn của WHO.

Phần lớn trẻ có triệu chứng an ầu là chậm phát triển ở những h ng nă

ầu ời; 33,3% bệnh nhân thể hiện tinh thần-vận ộng chậm phát triển, mấ iều

hòa vận ộng ăng iến. Trong 106 bệnh nhân, 4 ường h p ư c chẩn n

sàng là mang hội chứng MEL S 6 ường h p MERRF, 15 ường h p Leigh và

hội chứng West và phần lớn các ường h p ư c nghi ngờ bệnh ơ n do rối loạn

ty thể nói chung (theo dẫn liệu khám t ĩ ủa Bệnh viện Nhi T ng ương)

Trong nghiên cứu của chúng tôi, phần lớn các bệnh nhân có triệu chứng lâm

sàng khá giống nhau, ó giật, bệnh biểu hiện có sự ộng phối h p của não

v ơ; ường h p còn lại thể hiện triệu chứng ng h ng iển hình. Một

số ường h p, c người thân của gia nh ệnh nhân nghi ngờ bệnh do rối loạn

ty thể ũng có biểu hiện bệnh không giống nhau. iều này g y hó hăn ng

chẩn n ệnh nếu chỉ dựa trên các triệu chứng lâm sàng.

3.1.2. Các đặc điểm về tuổi và giới tính

ộ tuổi của bệnh nhân là t 2 ngày tuổi ến 15 tuổi, nhỏ hơn 5 ổi chiếm

65%, t 5 tuổi ến 10 tuổi là 15% ường h p và 20% ường h p lớn hơn 10 ổi

(hình 3.1). Tỷ lệ nam/nữ là 1,25 (59 nam và 47 nữ). Hầu hết các bệnh nh n người

dân tộc Kinh.

Hình 3.1 . Tỷ lệ các nhóm tuổi của bệnh nhân

3.2. XÂY DỰNG C CH THỨC PH T HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRONG

HỆ GEN TY THỂ

3.2.1. Tách chiết DNA từ mẫu máu và đánh giá độ tinh sạch

T ước tiên, chúng tôi tiến hành thu thập mẫu máu của bệnh nhân nghi bị

bệnh do rối loạn ty thể t Bệnh viện Nhi T ng ương, a ó tách chiết DNA tổng

số t bạch cầu máu ngoại vi của các mẫu bệnh nhân này.

DNA tổng số t 200 µl mẫu máu của bệnh nh n ư c tách theo kit của

Qiagen như giới thiệu ở mục 2.3.1, chế phẩm DNA tổng số ư iện di trên gel

agarose 1%. Kết qu iện di s n phẩm DNA tổng số t mẫu máu của các bệnh nhân

(hình 3.2) cho thấy các chế phẩm DNA tổng số t mẫu máu của các bệnh nhân ều có

mộ ăng DNA rõ nét, với ộ di ộng iện thấp (gần vạch xuất phát), chứng tỏ DNA tổng

số h ư ều nguyên vẹn.

Hình 3.2. Điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân

1: Thang chuẩn DNA 1kb

2: ối chứng âm

3-7: DNA tổng số t mẫu máu của các bệnh nhân

húng i ũng iến h nh ậ ộ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của chế

phẩm DNA tổng số t 106 mẫu bệnh nh n ể nh gi ộ tinh sạ h ũng như x

ịnh h ư ng DNA. Kết qu h ư c (phụ lục 3) cho thấy các mẫ N ều có

tỷ số A260/A280 nằm trong kho ng 1,8-2,0, chứng tỏ chế phẩm ít lẫn protein hay

RN H ư ng N ng nh h a ạt 52,6 ng/µl. Như vậy, các s n phẩm DNA

tổng số ạt yêu cầ ể tiến h nh ước thí nghiệm tiếp theo.

3.2.2. Thiết kế các cặp mồi đặc hiệu và lựa chọn enzyme cắt cho kỹ thuật PCR-

RF P dùng để phát hiện các đột biến điểm trong hệ gen ty thể

ể phát hiện ột biến iể ng N húng i dùng phương ph p

PCR kết h p với RFLP. y là kỹ thuật ư c sử dụng phổ biến nhất ể chẩn n

chính xác bệnh ty thể [29, 92].

ột biến iểm trong hệ gen ty thể có thể làm xuất hiện hoặc làm mất vị

trí nhận biết của enzyme giới hạn. L i dụng iề n y ạn gen nghiên cứu có thể

ư c cắt bằng enzyme giới hạn thích h p a ó phát hiện ột biến dựa vào sự

khác nhau về í h hước của s n phẩm cắt. Tuy nhiên ng a ố ường h p, sự

xuất hiện của ột biến không làm mất i hay xuất hiện iểm cắt của enzyme giới

hạn. Vì vậy, chúng tôi hay ổi 1-2 nucleotide gần vị í ột biến trong quá trình

khuế h ại PCR. Sự thay thế n id ạo ra vị trí nhận biết mới cho enzyme

giới hạn hi ó hay h ng ó ột biến. ể thực hiện iều này, mồi ư c thiết kế

theo kiểu không bắt cặp hoàn toàn (mismatch), có 1 hoặc 2 nucleotide không ghép

cặp với trình tự í h. Ngoài ra, mồi mismatch còn ư c thiết kế ó í h hước tối

thiểu là 20 nucleotide, mồi còn lại ư iều chỉnh phù h p ể ạn cắt có kích

hước ủ lớn ể có thể phát hiện ăng N hi iện di phân tách trên gel

polyacrylamide.

Dựa v ặ iểm lâm sàng của bệnh nhân (b ng 3.1) và tần suất xuất hiện

của các loại ột biến iểm ư c trình bày ở 1.3.1, chúng tôi tiến hành sàng lọc 15

loại ột biến iểm mtDNA phổ biến, tập trung vào 6 hội chứng ty thể bao gồm các

ột biến A3243G, T3271C và T3291C thuộc hội chứng MELAS; ột biến A8344G

và T8356C thuộc hội chứng MERRF; ột biến G11778A, G3460A và T14484C

thuộc hội chứng LHON, các ột biến T8993G/C và T9176G thuộc hội chứng Leigh;

ột biến A1555G thuộc hội chứng iếc và ột biến G4298A, T10010C,

T14728C và T14709C thuộc hội chứng cơ n do rối loạn ty thể nói chung.

Dựa v ộ ố ng ố ủa gi ướ ó và dựa n nh ự ủa hệ

gen y hể người ư ăng ý n ng n h ng dữ iệ g n ố ế [9], trình ự

ặp ồi ư hiế ế v i iến ộ h phù h p ể h ế h ại ặ hiệ vùng

g n hứa ộ iến ần nghi n ứ ( ng 3.2). T ng nghi n ứ n y, ổng ố ó 15

ặp ồi ư hiế ế ặ hiệ h 15 ại ộ iến ng ó ó 10 ặp ồi ư

hiế ế h iể mismatch, a gồ ặp ồi MAG, MTC71, MTC91, MRAG,

MRTC, LHTC, DAG, EGA, ETC, TC14. Sa ó ặp ồi ư iể a ằng

phần ề P i p i (phi n n 5 0 Premier Biosoft, Palo Alto, CA).

Bảng 3.2. Trình tự mồi và chế độ nhiệt cho PCR

Trình tự mồi

Chế độ nhiệt

Hội chứng

Đột biến/Mồi

Tham khảo và những cải tiến

Sản phẩm PCR

Fw: 5’ G G T GG TT TT 3’ (3134-3155)

198 bp

A3243G/ MAG

94o C: 30 giây 56 o C: 30 giây 72 o C: 30 giây

Rv: 5’GG GT GG GGT TAG CCA TGG G 3’ (3310-3331)

- Mồi xuôi (Fw) chứa 1 nucleotide không bắt cặp tại 3149 ( ư c thay bằng T) và mồi ngư c (Rv) chứa 1 nucleotide không bắt cặp tại 3318 (G ư c thay bằng ) ể loại bỏ bớ 2 iểm cắt của HaeIII thuận l i hi iện di [4]

148 bp

T3271C/ MTC71

94 o C: 30 giây 56 o C: 30 giây 72 o C: 1 phút

- Mồi Rv chứa 1 iểm không bắt cặp tại 3275, G ư c thay bằng ể tạ iểm cắt cho DdeI khi N ột biến [55].

MELAS

309 bp

T3291C/ MTC91

94 o C: 30 giây 54 o C: 30 giây 72 o C: 1 phút

- Mồi Fw chứa 2 iểm không bắt cặp, tại 3287 (C ư c thay bằng G) v 3288 ( ư c thay bằng G) làm xuất hiện iểm cắt cho BamHI [49]. Mồi Rv ư c thiết kế theo trình tự của Anderson [9].

A8344G/ MRAG

94 o C: 30 giây 58 o C: 30 giây 72 o C: 1 phút

212 bp

Mồi Rv chứa 1 nucleotide không bắt cặp (T ư c thay bằng G) tại vị trí 8347, tạ iểm cắt cho enzyme BanII khi tRNALys bị ột biến [18].

MERRF

220 bp

T8356C/ MRTC

94 o C: 10 giây 60 o C: 1 phút 72 o C: 1 phút

- Mồi Rv ư c hay ổi 1 nucleotide tại 8359 (G ư c thay bằng T) ể tạo vị trí nhận biết mới cho DraI khi không có mặt của ột biến.

Fw: 5’ T T T G G TT 3’ (3148-3169) Rv: 5’ G G G TTG T TGA CTC T 3’ (3295-3272) Fw:5’ TT TT T AGT CAG AGG TTG G T 3’ (3261- 3290) Rv: 5’ GGG GTT T GT G G G G TG 3’ ( 3569- 3546) Fw: 5’GGT T T GG T TG T 3’ (8155-8175). Rv: 5’ TTT TGT G G GTGTGG G 3’ (8366-8345) Fw: 5’ GT T G T TG TCT GTG GAG (8166-8189) Rv: 5’GT GT TTT GT TGG GGC ATT TCA CTT TA (8385-8357)

Fw: 5’ G T G G GTT TT T 3’(3275-3295)

306 bp

G3460A/ LHGA34

94 o C: 30 giây 60 o C: 30 giây 72 o C: 1 phút

- Tham kh o theo [17]. Tuy nhiên, chúng tôi i tiến hay ổi mồi Rv t 3577 (A) – 3557 (T) thành 3580 (C) -3559 ( ) ể ăng kh năng ắt cặp ặc hiệu của mồi.

Rv: 5’ GT TGG GG GGG GGG TT T G 3’(3580-3559)

Fw 5’ TT GG G GT T T 3’ (11683- 11702)

318 bp

LHON

G11778A/ LHGA

- Mồi ư c thiết kế dựa trên trình tự hệ gen ty thể.

94 o C: 1 phút 56 o C: 1 phút 72 o C: 1 phút

Rv 5’ GTT GTG GT T TG T G G 3’ (12000- 11981)

Fw: 5’ T G TGT GT T T AAA GAC AAC G 3’(14455-14483)

124 bp

T14484C/ LHTC

94 o C: 10 giây 62 o C: 1 phút 72 o C: 1 phút

- Mồi Fw chứa 1 nucleotide tại 14482 không ghép cặp ( ư c thay bằng G) tạo vị trí nhận biết mới cho Sau3AI [70]

Rv: 5’G T TGT T G GG TGT GGT GG GTG TGT T T T 3’(14578- 14548)

Fw: 5’ T T T G G 3’( 8768-8785)

402 bp

- Tham kh o theo [28]

T8993G/C LTG

94 o C: 10 giây 55 o C: 40 giây 72 o C: 1 phút

Rv: 5’ TG GT GG TT GG T 3’ (9169-9151)

Leigh

Fw: 5’ T G T G T GT G TT 3’ (9130-9151)

163 bp

T9176G/ LTG91

94 o C: 10 giây 60 o C: 30 giây 72 o C: 30 giây

- Tham kh o theo [7]. Tuy nhiên, mồi Fw ư hay ổi bắ ầu t 9130 (C) thay cho 9132 ( ) ể ăng h năng ắt cặp của mồi với trình tự í h

Rv: 5’ G G GT TT GG GG G T G 3’ (9292-9273)

Fw: 5’ G G GT G T G 3’( 1301-1322)

282 bp

iếc

A1555G/ DAG

94 o C: 30 giây 61 o C: 1 phút 72 o C: 40 giây

Rv: 5’ GT TT TGT TAC GAC TGG 3’ (1582-1556)

- Mồi ư c thiết kế dựa trên trình tự hệ gen chuẩn [9]. Mồi Rv chứa 1 nucleotide không ghép cặp (T ư c thay bằng G) tạ iểm cắt cho HaeIII hi ó ột biến.

Fw: 5’ G TT G T G T 3’ (4141- 4161)

181 bp

G4298A/ EGA

94 o C: 10 giây 52 o C: 1 phút 72 o C: 1 phú

Rv: 5’ GGG GTT T G T T TT ATG T 3’ (4321-4299)

- Mồi ư c thiết kế dựa trên trình tự hệ gen chuẩn [9]. Mồi Rv chứa 1 nucleotide không ghép cặp (T ư c thay bằng G) tạ iểm cắt cho RsaI khi h ng ó ột biến.

Fw: 5’ T TT G GG T T GG T 3’ (9764-9789)

357 bp

T10010C/ ETC10

94 o C: 1 phút 56 o C: 30 giây 72 o C: 40 giây

Fw: 5’GT T TT TT GT GT G G T G 3’ (10095-10120 )

ơ n

- Mồi ư c thiết kế dựa trên trình tự hệ gen chuẩn [9].

Fw: 5’ G G G G T T G G 3’ (14601-14622)

153 bp

T14728C/ ETC

94 o C: 10 giây 58 o C: 1 phút 72 o C: 30 giây

Rv: 5’ GGG T TTG GTG TT TTG TAG TTT A 3’(14753-14729)

- Mồi Fw ư c c i tiến ngắn hơn 3 n id ở ầ 3’ ể tránh lặp 4C. Mồi Rv chứa 1 nu không bắt cặp (G ư c thay bằng T) tại 14730, tạ iểm cắt cho DraI khi tRNAGlu không bị ột biến [75].

Fw: 5’ GG T G ACC AAT C T 3’ (14684-14708)

127 bp

T14709C/ TC14

94 o C: 10 giây 58 o C: 1 phút 72 o C: 30 giây

Rv: 5’ GG GGT G TG TG AGT GG (14810-14791)

- Mồi Fw chứa 1 nucleotide không bắt cặp (G ư c thay bằng C) tạ iểm cắt cho NdeI hi h ng ó ột biến [78], mồi Rv do chúng tôi thiết kế.

3.2.3. Xác định điều kiện thích hợp cho phân tích PCR-RFLP

Sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi ặc hiệ ư c thiết kế ở trên, khuôn

cho ph n ứng PCR là DNA tổng số ư c tách chiết t mẫu máu của bệnh nhân. Qua

nhiều thử nghiệ húng i ư c chế ộ nhiệt thích h p h P R ối với

t ng cặp mồi như ư c nêu trong b ng 3.2.

Kế iện di n phẩ P R n g aga 2% (hình 3.3) h hấy n

phẩ N nh n n ủa ỗi ại ộ iến ó í h hướ như ính n ý h yế .

Kế n y hứng ỏ việ ử dụng ặp ồi hiế ế h phép nh n n h nh

công ạn N ặc hiệu của 15 loại ột biến khác nhau t mẫu máu của các bệnh

nhân.

Q

Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen chứa đột biến từ mẫu máu của bệnh

nhân. A) ột biến A3243G; B) ột biến T3271C; C) ột biến T3291C; D) ột biến

A8344G; E) ột biến T9176G; F) ột biến G11778A; G) ột biến G3460A; H) ột

biến T14484C; I) ột biến T8993G/C; K) ột biến T9176G; L) ột biến A1555G; M)

ột biến G4298A; N) ột biến T10010C; P) ột biến T14728C; Q) ột biến T14709C

1: Thang chuẩn N 100 p; 2: ối chứng âm; 3-9: S n phẩm PCR t mẫu DNA của

các bệnh nhân.

Sau khi khuế h ại ạn g n hứa ộ iến ằng P R v iể a n phẩ

trên gel agarose 2%, n phẩ P R ủa ỗi ại ộ iến ư ắ ự iếp ằng

nzy giới hạn hí h h p ( ng 3 3) ủ 8 -12 giờ ở 37oC. Sa hử nghiệ

h nha húng i ư nồng ộ DNA hí h h p h ph n ứng ắ 15l

n phẩ P R v 10 ơn vị nzy giới hạn trên 30  hể í h ph n ứng.

ột biến A3243G, T3291C và T8993G/C tạ iểm cắt cho enzyme giới hạn,

vì vậy những mẫ ó ột biến sẽ bị cắ h nh 2 ạn ương ứng, còn mẫu không có

ột biến vẫn giữ ng y n í h hướ an ầu.

ột biến T8356C, G11778A, G3460A, T14484C, T9176G, G4298A,

T10010C, T14728C và T14709C làm mấ iểm cắt của enzyme giới hạn, vì vậy

những mẫu chứa ột biến sẽ không có sự phân cắt x y ra và giữ ng y n í h hước

an ầu, còn mẫ h ng ó ột biến sẽ bị cắt thành 2 ạn ó í h hướ ương ứng.

ối với ột biến T3271C và A1555G, sau khi cắt bằng enzyme giới hạn thì

mẫu không chứa ột biến sẽ ó 2 ạn (DNA không ột biến ó ộ iểm cắt

của enzyme giới hạn); mẫu không chứa ột biến A8344G sẽ có 3 ạn (DNA không

có ột biến ó ẵn 2 iểm cắt của enzyme BanII), ng hi ó mẫ ó ột biến

sẽ ó h 1 ăng DNA nữa (các ột biến này làm xuất hiện thêm mộ iểm cắt của

enzyme giới hạn) như ở b ng 3.3.

S n phẩm cắ ư iện di n g aga 2% ( ột biến T8993G/C,

G11778 G3460 T10010 ) hay p ya y a id 10% ( ột biến A3243G,

T3271C, T3291C, A8344G, T8356C, T14484C, T9176G, A1555G, G4298A,

T14728C và T14709C) và phát hiện ột biến dựa vào sự khác nhau về í h hước

của phổ ăng N dưới ánh sáng tử ngoại. Kết qu iện di s n phẩ P R ư c cắt

bằng enzyme giới hạn ư c minh họa ở hình 3.4.

Bảng 3.3. Enzyme giới hạn dùng trong phân tích đột biến

Sản phẩm cắt

Enzyme giới hạn

Loại đột biến

Đệm dùng cho enzyme

(trình tự cắt)

DNA đột biến

DNA không đột biến

A3243G

198 bp

HaeIII (GG/CC)

111 bp và 87 bp

DdeI

79 bp,

103 bp

T3271C

NE 3

(C/TNAG)

24 bp và 45 bp

và 45 bp

BamHI

T3291C

27 bp và 282 bp

309 bp

(G/GATTC)

BanII

99 bp, 41 bp,

99 bp,

A8344G

Tango

(GRGCY/C)

52 bp và 20 bp

41 bp và 72 bp

DraI

192 bp

T8356C

Tango

220 bp

(TTT/AAA)

và 28 bp

G11778A

NE 3

318 bp

213 bp và 105 bp

G3460A

306 bp

SfaNI (GCATC(N)5/) BsaHI (GR/CGYC)

184 bp và 122 bp

T14484C

Bsp143I

124 bp

Sau3AI (/GATC)

27 bp và 97 bp

T8993G/C

402 bp

Tango

HpaII (C/CGG)

224 bp và 178 bp

BfaI

46 bp

T9176G

Tango

163 bp

(C/TAG)

và 117 bp

HaeIII

164 bp

164 bp,

A1555G

(GG/CC)

91 bp và 27 bp

và 118 bp

RsaI

159 bp

G4298A

Tango

181 bp

(GT/AC)

và 22 bp

T10010C

Tango

357 bp

RsaI (GT/AC)

247 bp và 110 bp

T14728C

Tango

153 bp

DraI (TTT/AAA)

129 bp và 24 bp

T14709C

Ez IV

127 bp

NdeI (CA/TATG)

23 bp và 104 bp

Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR - RFLP đoạn gen chứa đột biến của các bệnh nhân

) ột biến 3243G; ) ột biến T3271C; ) ột biến T3291C; ) ột biến

A8344G; E) ột biến T8356 ; F) ột biến G11778 ; G) ột biến G3460 ; H) ột

biến T14484C; I) ột biến T8993G/ ; K) ột biến T9176G; L) ột biến A1555G; M)

ột biến G4298A; N) ột biến T10010C; P) ột biến T14728C; Q) ột biến T14709C

1: Thang chuẩn DNA; 2: ối chứng âm; 3: ối chứng dương (h nh 3 3 A và 3.3 I); 3-9:

S n phẩm PCR t mẫu DNA của các bệnh nhân (tr ường chạy 3 hình 3.3 A và 3.3 I)

Kế ở hình 3.4 h hấy n phẩ ắ ủa ỗi ại ộ iến h ư ó

í h hướ như ính n ý h yế ế n y hứng ỏ ối ư ư iề

iện h ph n í h P R-RFLP ể ph hiện các ộ iến iể N ựa họn.

Các mẫu nghi ngờ chứa ột biến a phương ph p P R-RFLP ư c khẳng

ịnh lại bằng cách gi i trình tự ạn gen chứa ột biến trong vector pGEM-T tái tổ

h p.

ối với ộ iến g n y hể ồn ại ở dạng h ng ồng nhấ thì ạn DNA

trong các vector tái tổ h p ở khuẩn lạc trắng có thể ó ột biến hay h ng ó ột

biến. Vì vậy, một số khuẩn lạc trắng khác nhau ư c chọn ể kiểm tra sự có mặt

của ột biến bằng phương ph p P R-RFLP trực tiếp. Plasmid i ổ h p ó hứa

ạn g n nh n n ang ộ iến ư h v inh ạ h dùng h nghi n ứ

iếp h ể biết chính xác trình tự nucleotide của ạn gen nghi ngờ ang ột

biến, chúng i tiến hành gi i trình tự ạn gen này trong vector pGEM-T tái tổ

h p h ư c. Kết qu gi i trình tự gen nghiên cứu a ó ư c so sánh với trình tự

g n ương ứng ư c công bố trong ngân hàng gen thế giới (J01415.2).

3.2.4. Xâ dựng cách thức phát hiện đột biến điểm trong DNA ty thể

T thực nghiệ húng i x y dựng ư c cách thức phát hiện ột biến

iểm trong hệ gen ty thể bằng PCR kết h p với RFLP, các mẫu nghi ngờ mang ột

biến qua PCR-RFLP ư c khẳng ịnh lại bằng x ịnh trình tự gen.

ể phát hiện ột biến iểm trên hệ gen ty thể ước hết, DNA tổng số t

máu ngoại vi của các bệnh nhân nghi bị bệnh do rối loạn ty thể ư c tách và tinh

sạ h a ó ạn DNA ty thể chứa vị trí ột biến ư c khuế h ại bằng PCR với

cặp mồi ặc hiệ ư c thiết kế cho t ng loại ột biến (b ng 3.2). Thành phần của

ph n ứng PCR cho thể tích 25 l bao gồm: 2,5 l ệ Taq DNA polymerase 10X;

0,5 l Taq N p y a (5 ơn vị/l); 2,5 l dNTPs 2mM; 1 l ồi xuôi (Fw)

10 pmol; 1 l ồi ngư (Rv) 10 pmol; 16,5 l dd H2O và 1 l DNA khuôn (30-40

ng). Ph n ứng h ế h ại ạn g n hứa ộ iến với h nh nhiệ ặ ưng h

ng ặp ồi ( ng 3.2).

ước tiếp theo, s n phẩm PCR ư iện di kiểm tra trên gel agarose 2%.

Kết qu iện di s n phẩm PCR nghi chứa ột biến ư c minh họa ở hình 3.3.

S n phẩm PCR cắt bằng enzyme giới hạn ư iện di trên gel agarose 2%

( ối với ột biến G17778A, G3460A, T8993G/C và T10010C) hoặc polyacrylamide

10% ( ối với ột biến A3243G, T3271C, T3291C, A8344G, T8356C, T14484C,

T9176G, A1555G, G4298A, T14728C và T14709C). ột biến ư c phát hiện dưới

ánh sáng tử ngoại dựa v í h hước của phổ ăng P R-RFLP ư c minh họa ở

hình 3.4.

3.3. SÀNG LỌC SƠ BỘ CÁC ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ Ở BỆNH NHÂN CƠ NÃO

Áp dụng cách thức phát hiện ột biến ư c thiết lập húng i iến

hành sàng lọc 15 loại ột biến iểm phổ biến trên 106 mẫu bệnh nhân nghi bị bệnh

do rối loạn ty thể ư c chẩn n ởi Bệnh viện Nhi T ng ương

3.3.1. Sàng lọc đột biến A3243G bằng PCR-RFLP

ể phát hiện ột biến 3243G oạn gen chứa ột biến A3243G t 3134-

3331 (198 bp) t hệ gen ty thể của các bệnh nh n ư c nhân b n bằng kỹ thuật PCR

với cặp mồi ặc hiệ như ng phương ph p ướ y [4]. Kết qu iện

di s n phẩm PCR trên gel agarose 2% cho thấy húng i nh n n ư ạn

N ặc hiệ ó í h hướ 198 p như ính n ý h yết t DNA tổng số của các

bệnh nhân (hình 3.5).

Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen 3134-3331 trong hệ gen ty thể của các bệnh nhân. Thang chuẩn N (1) ối chứng âm (2), bệnh nhân (3-9).

Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) của một số bệnh nhân nghi bị đột biến A3243G. Thang chuẩn DNA (1), s n phẩm PCR không cắt bằng HaeIII (2) ối chứng dương ( ẫu chứa ột biến 3243G ư x ịnh bằng gi i trình tự gen trong nghiên cứ ướ y (3) [4], bệnh nhân (4-10).

S n phẩ P R ang ột biến 3243G ó iểm cắt của HaeIII ư c cắt h nh 2 ạn 111 bp và 87 bp, còn mẫ h ng ang ột biến vẫn giữ nguyên kích

hướ an ầu 198 bp. Kết qu iện di s n phẩm PCR cắt bằng HaeIII (PCR-RFLP)

cho thấy có 6 trong số 106 bệnh nhân cho phổ ăng P R-RFLP của ột biến

A3243G thuộc hội chứng MELAS (hình 3.6 ường chạy 4-9) ương ự như ối chứng dương ang ột biến 3243G ư c phát hiện bởi Trịnh L Phương và tập

thể [4] bên cạnh mẫ h ng ột biến chỉ cho mộ ăng í h hước 198 bp (hình 3.6,

ường chạy 10). Sự có mặt của ăng ó í h hướ như an ầu (198 bp) ở các mẫu

này là do bệnh nhân có c những b n a g n h ng ang ột biến A3243G (dạng

heteroplasmy). Kết qu ở hình 3.6 còn cho thấy mứ ộ ậm nhạt của ăng ắt ở các mẫu là không giống nhau, mẫu bệnh nh n ường chạy số 8 có ăng 111 bp và ăng 87 bp ít rõ nét ng hi ó ăng ương ứng này ở các mẫu 4-7 và mẫu số

9 không sai khác nhau nhiều về ộ sáng. Sự sai khác này g i ý về tỷ lệ số b n sao

ang ột biến/ h ng ột biến ở mẫu số 8 thấp hơn ẫu còn lại.

ể khẳng ịnh chắc chắn sự tồn tại của ột biến 3243G ạn DNA nhân

b n 198 bp h ư c t 6 bệnh nh n ư c nhân dòng vào vector pGEM-T và

phân tích trình tự nucleotide. Sau khi khuế h ại ạn gen chứa ột biến A3243G

ó í h hước 198 bp bằng PCR và kiểm tra n phẩ P R ằng iện di n g

agarose 2%, ạn gen này ư c gắn vào vector pGEM-T v iến nạp v ế

h iến E.coli hủng H5α Hình 3.7 là kết qu nh n dòng ạn gen chứa ột biến

A3243G vào vector pGEM-T. Kế iện di n g aga 2% n phẩ P R

ử dụng cặp mồi pUC19-Fw và pUC19-Rv v N 3 h ẩn ạ ắng, 1 h ẩn

ạ xanh h n (h nh 3.7 ) h hấy n phẩ P R h ẩn ạ xanh h

ăng N ó í h hướ h ng 0 3 ( ường hạy 3) v n phẩ P R

h ẩn ạ ắng ề h ăng N ó í h hướ h ng 0 49 ( ường hạy 4-6). Khi ử dụng P R với ặp ồi ặ hiệ MAGFw/MAGRv (hình 3.7 ) h hấy n phẩ P R h ẩn ạ ắng h ăng N í h hướ h ng 0 2 kb ương ứng với ạn N nh n n hứa ộ iến 3243G ( ường hạy 4-6); trong hi ó ối với h ẩn ạ xanh h ng hứa ạn g n an n n h ng h ăng n y ( ường hạy 3) Như vậy húng i h ư h ẩn ạ ang p a id

i ổ h p pGEM-T có chứa ạn g n nh n n í h hướ h ng 0 2 kb (theo lý

h yế 198 p) ang ộ iến 3243G.

Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra kết quả biến nạp sử dụng cặp mồi pUC19- Fw/pUC19-Rv (A) và cặp mồi MAG (B) của đột biến A3243G

1: Thang h ẩn N 100 p 2: Mẫ ối hứng (-), không có DNA

3: S n phẩ P R h ẩn ạ xanh 4-6: S n phẩ P R h ẩn ạ ắng 1 2 v 3

ột biến A3243G tồn tại ở dạng h ng ồng nhất, nên ạn DNA trong

các vector tái tổ h p ở khuẩn lạc trắng có thể ó ột biến hay h ng ó ột biến.Vì

vậy ạn N 198 p ang ột biến A3243G ư c kiểm tra bằng PCR-RFLP

trực tiếp t khuẩn lạc.

Hình 3.8. Điện di sản phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) kiểm tra sản phẩm

biến nạp chứa đột biến A3243G từ khuẩn lạc trắng

1: Thang h ẩn N 25-700 bp

2: Mẫ ối hứng (-) h ng ắ ằng HaeIII 3-5: S n phẩ ắ h ẩn ạ ắng 1 2 v 3

Kết qu iện di trên gel polyacrylamide s n phẩm PCR-RFLP t 3 khuẩn lạc

trắng (hình 3.8) cho thấy khuẩn lạc 3 và 4 ó 2 ăng với í h hước 111 bp và 87 bp

còn khuẩn lạc 5 chỉ ó 1 ăng 198 p hứng tỏ khuẩn lạc 3, 4 chứa ạn DNA có

ột biến A3243G còn khuẩn lạc 3 chứa ạn DNA không mang ột biến A3243G.

Các v i ổ h p h ẩn ạ 3, 4 ư h a ở dạng inh ạ h ể h x

ịnh nh ự g n

Kế gi i nh ự ạn g n hứa ộ iến v pGEM-T h ư

a ó ư nh với trình tự ạn g n ương ứng trên ngân hàng gen thế giới (J0

1415.2).

Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide đoạn gen 3134-3331 của ty thể bệnh nhân (mẫu BN4, phụ lục 2) nghi mang đột biến A3243G với trình tự gen chuẩn.

Hình 3.10. Một phần trình tự nucleotide của đoạn DNA ty thể

chứa đột biến A3243G của ệnh nhân BN4

Hình 3.9 và 3.10 inh họa ế gi i nh ự n id ủa một trong

6 ệnh nh n (BN4, BN42, BN58, BN80, BN89 và BN101) ư nghi n ứ (v ế

h n n giống nha ) ạn gen nghiên cứu t 6 mẫu bệnh nhân có phổ ăng

PCR-RFLP dạng mang ột biến ều có 3 vị trí sai khác so với trình tự chuẩn

công bố ng ó ự sai khác ở 2 vị trí 3149 và 3318 là do chúng tôi chủ ộng thay

thế nucleotide trong quá trình thiết kế mồi, còn vị trí 3243 có sự hay ổi A thành G,

phù h p với kết qu phân tích PCR-RFLP ở trên.

3.3.2. Sàng lọc đột biến A8344G/mất đoạn 9 bp bằng PCR-RFLP

ầ i n ột biến A8344G ở 72 bệnh nhân nghi bị hội chứng ơ n (t mẫu

BN1-BN72, phụ lục 2) ư iều tra, sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi ư c thiết

kế ở n ể nhân b n ạn gen t 8155-8366 (212 bp) t hệ gen ty thể của các bệnh

nhân.

Kết qu iện di s n phẩm PCR của một số bệnh nh n ư c nghiên cứu (hình

3.11) cho thấy húng i nh n n thành công ạn N ặc hiệu với í h hước

212 p như ính n ý h yết (các mẫu ở ường chạy 4 v 5) ồng thời ph

hiện thấy 23 ường h p ó ăng nh n n chạy nhanh hơn ( ường chạy 3, 6-9,

hình 3.11), chứng tỏ ó í h hước ngắn hơn v g i ý về kh năng mấ ạn 9 bp

trong các mẫu này.

Hình 3.11. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen 8155-8366 trong hệ gen

ty thể của các bệnh nhân

Giếng 1: Thang chuẩn DNA.

Giếng 2: ối chứng âm.

Giếng 3-9: S n phẩm PCR t mẫu DNA của các bệnh nhân.

ể phát hiện ột biến A8344G, s n phẩ P R ư c cắt trực tiếp bằng

enzyme BanII. Theo cách thiết kế của thí nghiệm, s n phẩm PCR của người không

ang ột biến A8344G sẽ ó 3 ăng 99 p 72 p v 41 p òn nế ó ột biến

A8344G thì s n phẩm PCR sẽ ó 4 ăng 99 p 52 p 20 p v 41 p ( ăng 72

p ư ắ h nh ăng 52 p v 20 bp).

Hình 3.12. Điện di sản phẩm PCR đƣợc cắt bằng BanII của một số bệnh nhân

1: Thang chuẩn DNA

2: S n phẩm PCR không cắt bằng BanII.

3-9: S n phẩm PCR-RFLP t mẫu DNA của các bệnh nhân

húng i h ng ph hiện ư c sự sai khác này trong tổng số 72 mẫu

nghiên cứu, chứng tỏ ối ư ng n y h ng ang ột biến A8344G. Tuy vậy,

kết qu iện di s n phẩm PCR cắt bằng BanII (hình 3.12) cho thấy các mẫ ó ăng

nhân b n chạy chậ h ư c ở hình 3.11 ( ường chạy 4 v 5) ó 3 ăng 99 p

72 p v 41 p h như ính n ý h yết, còn các mẫ h ăng nh n n chạy

nhanh hơn ( ường chạy 3, 6-9) có 3 ăng 99 p 72 p v 1 ăng ngắn hơn ăng

41 bp. Kết qu này một lần nữa g i ý về kh năng ấ ạn 9 bp. Ngoài ra, kết qu

ở hình 3.12 ũng h hấy các mẫu nghi mấ ạn ề h ng ó ăng 41 p hứng

tỏ ính ồng nhất về loại cấu trúc này ở tất c các b n copy của DNA ty thể.

ể hẳng ịnh hắ hắn ự ồn ại ủa ộ iến ấ ạn v í h hướ ủa

ạn ấ ạn g n hứa ộ iến ấ ạn ư nh n dòng vào vector pGEM-T

và gi i nh ự ạn N ó í h hướ 212 p vector pGEM-T i ổ h p

Hình 3.13. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra kết quả biến nạp sử dụng cặp mồi

pUC19-Fw/ pUC19-Rv (A) và cặp mồi MRAG (B)

1: Thang h ẩn N

2: Mẫ ối hứng (-), không có DNA

3: S n phẩ P R h ẩn ạ xanh

4-6: S n phẩm PCR t khuẩn lạc trắng 1, 2 và 3

Kế iện di n phẩ P R h ẩn ạ h ư a ướ nh n dòng

(hình 3.13) h hấy n phẩ P R ự iếp h ẩn ạ xanh với ặp ồi pU 19-

Fw và pUC19-Rv h ăng N ó í h hướ h ng 0 3 theo tính toán lý

h yế 296 bp (hình 3.13 ường hạy 3) òn với ặp ồi MR G-Fw và

MRAG-Rv kh ng h ăng N n (h nh 3 13 ường hạy 3) S n phẩ P R

với h ẩn ạ ắng hi ử dụng ặp ồi pUC19-Fw và pUC19-Rv (hình 3.13,

ường hạy 4 5 6) h ăng N ó í h hướ h ng 0 5 h ính n

ý h yế 508 p òn với ặp ồi MR G (hình 3.13 B, ường hạy 4, 5, 6) cho

ăng N ó í h hướ h ng 0 21 Như vậy h ẩn ạ ắng ó v i ổ

h p hứa ạn g n nh n n í h hướ h ng 0 21 ang ộ iến ấ ạn

ư h nhận.

Kết qu x ịnh và so sánh trình tự gen quan tâm với trình tự g n ương ứng

(J01415.2) trong ngân hàng gen thế giới (hình 3.14) cho thấy ạn gen nghiên cứu

t các mẫu bệnh nhân ó ộ ương ồng 95,28% so với trình tự chuẩn ng ố,

sự sai khác ở vị trí 8347 (A ư c thành bằng C) là do chúng tôi chủ ộng thay thế

nucleotide trong quá trình thiết kế mồi, mẫ ó ăng N nh n n chạy nhanh bị

mất 9 bp với trình tự CCCCCTCTA (8272-8280) so với mẫu chuẩn ũng như với

mẫ ó ăng N nh n n chạy chậ ư c phát hiện ở hình 3.11.

Hình 3.14. So sánh trình tự nucleotide đoạn gen 8155-8366 của ty thể bệnh nhân

(mẫu BN2, phụ lục 2) nghi mang đột biến mất đoạn với trình tự gen chuẩn

Hình 3.15. Một phần trình tự nucleotide của đoạn DNA ty thể (8155-8366)

) ạn DNA ty thể không chứa ột biến mấ ạn ) ạn DNA ty thể chứa ột biến

mấ ạn.

ũng h h hiết kế thí nghiệ ể sàng lọ ột biến A8344G, chúng tôi

ph hiện mộ ột biến khác. Phân tích PCR-RFLP cho thấy mẫ h ng ó ột

biến A8344G có 3 ăng 99 72 và 41 bp. Tuy nhiên mẫu ở ường chạy 6 (hình 3.16)

chỉ ó 2 ăng 72 p v 1 ăng h ng 140 bp (có í h hước bằng tổng kích

hước của ăng 99 p v 41 p) iều này chứng tỏ ng ạn 140 bp không có vị

trí nhận biết của enzyme BanII ó nghĩa x ất hiện một ột biến trong vùng nhận

biết của BanII.

Hình 3.16. Điện di sản phẩm PCR đƣợc cắt bằng BanII của một số bệnh nhân

1: Thang chuẩn DNA

2: S n phẩm PCR không cắt bằng BanII

3-8: S n phẩm PCR t mẫu DNA của các bệnh nh n ư c cắt bằng BanII.

ể x ịnh ột biến ng ạn gen ó í h hước 140 bp t 8155-8294,

trình tự ạn gen t 8155-8366 ( ạn g n ư c thiết kế ể phát hiện ột biến

A8344G) ư x ịnh, kết qu gi i trình tự ạn gen khi so sánh với trình tự

tham chiếu (hình 3.17) cho thấy ạn gen trên có sự sai khác ở 2 vị trí, vị trí 8347

(A ư c thay bằng C) là do chủ ộng thay thế nucleotide trong quá trình thiết kế

mồi còn vị trí 8251 có sự hay ổi G thành A. Sự hay ổi tại vị í 8251 ất

iểm cắt của BanII, vì vậy ạn 140 p h ng ư c cắ h nh 2 ạn 99 bp và 41 bp

như húng i nhận ịnh ú ầu, phù h p với kết qu của PCR-RFLP.

Hình 3.17. So sánh trình tự nucleotide đoạn gen 8155-8366 của ty thể bệnh nhân

(mẫu BN22, phụ lục 2) nghi mang đột biến với trình tự gen chuẩn

Hình 3.18. Một phần trình tự nucleotide của đoạn DNA ty thể (8155-8366)

chứa đột biến G8251A

3.3.3. Sàng lọc đột biến T14728C bằng PCR-RFLP

T ước hế ạn gen chứa ột biến T14728C ở 106 bệnh nhân nghi bị hội

chứng ơ n y hể ư c khuế h ại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ư c thiết

kế ở n ể nhân b n ạn gen t 14601-14753 (153 bp) t hệ gen ty thể của các

bệnh nhân. Kết qu iện di s n phẩm PCR trên gel agarose 2% cho thấy ạn DNA

ặc hiệ nhân b n thành công với ó í h hướ 153 p như tính toán lý thuyết

(hình 3.19).

Hình 3.19. Điện di sản phẩm PCR

Hình 3.20. Điện di sản phẩm PCR-

nhân đoạn gen 14601-14753 trong hệ

RFLP (cắt bằng DraI) của một số bệnh

gen ty thể của các bệnh nhân.

nhân nghi bị đột biến T14728C.

Thang chuẩn N (1) ối chứng âm

Thang chuẩn DNA (1), s n phẩm PCR

(2), bệnh nhân (3-9).

không cắt bằng DraI (2), bệnh nhân (3-9)

ể phát hiện ột biến T14728C, s n phẩ P R ư c cắt trực tiếp bằng

enzyme DraI. Kết qu iện di s n phẩm PCR cắt bằng DraI (h nh 3 20) cho thấy 2

trong số 106 mẫ ( ường chạy 8 và 9) chỉ ó 1 ăng N với í h hước 153 bp,

các mẫu còn lại ( ường chạy 3-7) ó 2 ăng 129 p v 24 p Như vậy các mẫu ở

ường chạy 8 và 9 có thể mang ột biến T14728C. Ngoài ra, kết qu ở hình 3.20

ũng h hấy 2 mẫ nghi ột biến T14728C chỉ ó 1 ăng N 153 p Kết qu

này cho thấy ột biến dường như ồn tại ở dạng ồng nhất.

ể khẳng ịnh sự tồn tại của ột biến T14728C, ạn gen 153 bp chứa ột

biến T14728C t bệnh nhân (mẫu BN7, phụ lục 2) ư c nhân dòng vào vector

pGEM-T và gi i trình tự. Kết qu iện di s n phẩm PCR sau nh n dòng ạn gen

chứa ột biến T14728C vào vector pGEM-T (hình 3.21 A) cho thấy n phẩ P R

khi sử dụng cặp mồi pUC19-Fw và pUC19-Rv DNA ủa h ẩn ạ xanh ó í h

hướ h ng 0 3 ( ường hạy 3) v n phẩ P R h ẩn ạ ắng ề

h ăng N ó í h hướ h ng 0 45 ( ường hạy 4-6).

S n phẩ P R với ặp ồi ặ hiệ ETC-Fw/ETC-Rv (hình 3.21 B) cho

hấy ăng N h ẩn ạ ắng ó í h hướ h ng 0 15 ương ứng với

ạn N nh n n hứa ộ iến T14728C ( ường hạy 4-6); ng hi ó với

h ẩn ạ xanh h ng h ăng n y ( ường hạy 3) Như vậy h ẩn ạ mang

p a id i ổ h p pGEM-T ó hứa ạn g n nh n n í h hướ h ng 0 15 kb

ang ộ iến T14728 ư h nhận.

Hình 3.21. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra kết quả biến nạp sử dụng

cặp mồi pUC19-Fw/ pUC19-Rv (A) và cặp mồi ETC-Fw/ETC-Rv (B)

1: Thang h ẩn N

2: Mẫ ối hứng (-), không có DNA

3: S n phẩ P R h ẩn ạ xanh

4-6: S n phẩm PCR khuẩn lạc trắng 1, 2 và 3

Sa ó ạn g n nghi hứa ộ iến T14728 v pGEM-T ư gi i

nh ự v nh với trình tự ạn gen tham chiếu ương ứng trên ngân hàng gen

thế giới (J01415.2). Kế h ư (hình 3.22 và 3.23) h hấy ng i ự sai

khác ở vị í 14730 ( ổi thành A) do chúng tôi chủ ộng cài vào khi thiết kế mồi

( ể tạ iểm cắt của DraI), thì so với trình tự chuẩn ng ố ạn gen của bệnh

nhân có sự thay thế T bằng C ở vị trí 14727 chứ không ph i 14728 như hờ i

an ầu. Thí nghiệm ư c lặp lại v hi x ịnh trình tự gen của bệnh nhân

(mẫu BN50, phụ lục 2) ều cho kết qu h n n ương ự.

Hình 3.22. So sánh trình tự nucleotide đoạn gen 14601-14753 của ty thể bệnh

nhân (mẫu BN7, phụ lục 2) nghi mang đột biến T14728C với trình tự gen chuẩn

Hình 3.23. Một phần trình tự nucleotide của đoạn DNA ty thể (14601-14753) chứa đột

biến T14 2 C ở ệnh nhân BN7

ựa v iề iện P R-RFLP ư hiế ập, chúng i ũng tiến

hành sàng lọc 12 ột biến còn lại bao gồ ột biến T3271C, T3291C, T8356C,

T8993G/C, T9176G, G11778A, G3460A, T14484C, A1555G, G4298A, T10010C,

và T14709C trên 106 mẫu bệnh nhân. Tuy nhiên, qua phân tích PCR-RFLP, chúng

i h ng ph hiện ư c sự sai khác nào trong tổng số 106 mẫu nghiên cứu,

chứng tỏ các bệnh nhân này không mang các ột biến nêu trên.

Qua sàng lọc, húng i ph hiện ư c 3 loại ột biến iểm bao gồm

A3243G, G8251A, T14727C và 1 ột biến mấ ạn 9 bp với trình tự

CCCCCTCTA (8272-8280). ột biến 3243G ư c phát hiện ở 6 bệnh nhân (4

nam và 2 nữ), tần suấ ột biến là 5,7%; 1 bệnh nhân nữ mang ột biến G8251A,

chiếm 0 9%; ột biến T14727 ư c phát hiện ở 2 bệnh nhân nam, tần suấ ột biến

là 1 9% v 23/72 ường h p mấ ạn 9 bp chiếm tỷ lệ 31,9 % (b ng 3.4).

Bảng 3.4. Một số đột biến trong hệ gen ty thể đƣợc phát hiện ở bệnh nhân cơ não

Tần suất

Loại

Số lƣợng

Tỷ lệ

đột biến

bệnh nhân

giới tính

phát hiện (%)

A3243G

4 nam : 2 nữ

5,7

23/72

15 nam : 8 nữ

31,9

Mấ ạn 9 bp (8272-8280)

G8251A

nữ

0,9

T14727C

2 nam

1,9

Như vậy, có 9 ường h p ang ột biến iểm mtDNA ư c phát hiện

trong 106 bệnh nh n ư c kiểm tra, chiế 8 5%; ng ó ph hiện ư 1 ột biến

iểm gây bệnh ( ột biến A3243G) h như hiết kế thí nghiệ ú ầu, chiếm 5,7%.

Nă 2010 một nghiên cứu sàng lọ 8 ột biến iểm mtDNA phổ biến ở 1559 bệnh

nh n người Trung Quốc bị bệnh ơ n cho thấy ó 158 ường h p ang ột biến

gây bệnh, chiếm tỷ lệ 10 1% ương ự ở bệnh nhân Bồ Nha h tỷ lệ này là 11,5%

và ở bệnh nh n nhi người Úc là 11,6% [24].

Kết qu nghiên cứ ũng h hấy rằng ột biến 3243G ột biến gây

bệnh phổ biến ở bệnh nh n ơ n người Việt Nam. Kết qu n y ũng phù h p với

các kết qu sàng lọc của Cao và tập thể [24], trong nghiên cứ n y ột biến

3243G ũng ột biến ư c phát hiện nhiều nhất ở bệnh nh n MEL S người

Trung Quốc. Trong một nghiên cứu khác trên 552 bệnh nh n ơ n người Trung

Quốc cho thấy tỷ lệ ột biến A3243G là 12,6%, chỉ ó 0 7% ột biến A8344G, 0,4%

ột biến T8993 v 0 2% ột biến T8993C [110].

Tần suất phát hiện ột biến A3243G trong nghiên cứu của chúng tôi là 5,7%.

Trong hi ó ần suất ột biến A3243G của người Hungary là 2,2%; còn ở bệnh

nh n người Trung Quốc thì tỷ lệ ột biến A3243G là 12,6% hay khi sàng lọc 1725

bệnh nhân lớn tuổi người Úc, tỷ lệ phát hiện ột biến A3243G là 6,2% [24, 31, 110].

Tần suất phát hiện ột biến A3243G hay ổi ở các quốc gia khác nhau. Sự khác

nhau về dân tộc, ặ iểm di truyền và cách thiết kế thí nghiệm (tiêu chuẩn chọn lựa

bệnh nhân, chọn lọc mô nghiên cứu phương ph p ph hiện ột biến) góp phần

cho sự khác nhau này. Bên cạnh ó ộ tuổi của bệnh nh n ũng ột nhân tố

quan trọng nh hưởng ến tần suất phát hiện ột biến [24, 31].

Hiện nay có rất nhiề phương ph p ph hiện ột biến iể N như

PCR-RFLP, SS P x ịnh trình tự gen, DGGE (denaturing gradient gel

electrophoresis), real-time PCR [27]. Tuy nhiên, PCR-RFLP vẫn là một kỹ thuật

phân tử ơn gi n, hiệu qu , phù h p cho việc sàng lọc thông dụng mộ ư ng mẫu

lớn ở bệnh viện. Cao và tập thể [24] ử dụng PCR-RFLP ể sàng lọc 1.559 mẫu

bệnh nhân và phát hiện 158 ường h p ang ột biến mtDNA gây bệnh, tất c các

ường h p ư c khẳng ịnh lại bằng x ịnh trình tự g n ều phù h p với kết qu

phân tích PCR-RFLP. Trong một nghiên cứu khác trên 552 bệnh nh n người Trung

Quố 70 ường h p ang ột biến gây bệnh trong hệ gen ty thể ư c phát hiện

bằng phương ph p P R-RFLP [110]. Nghiên cứu sử dụng phương ph p PCR-RFLP

ể iề a ột biến A3243G ở 500 bệnh nhân, ph hiện 17 ường h p trong 10

gia nh dương ính với ột biến này [48]. Khi phân tích tần suấ ột biến A3243G ở

bệnh nh n người Hungari, bằng phương ph p P R-RFLP phát hiện 2,2% bệnh

nh n ang ột biến A3243G trong 631 ường h p ư c sàng lọc [31].

Sàng lọc phát hiện bệnh d ột biến gen ty thể trong nghiên cứu của chúng

tôi là cuộ iề a ầu tiên về 15 loại ột biến mtDNA ở bệnh nh n người Việt

Nam nghi ngờ bệnh do rối loạn ty thể. Mặ dù ũng ó báo cáo ướ ó về việc

phát hiện ột biến A3243G ở bệnh nhân MELAS [3, 4, 5] nhưng ó h ng ph i là

ang ính iều tra các ột biến gen ty thể ở bệnh nhân ơ n người

Việt Nam vì số ư ng mẫu trong các nghiên cứu này quá ít.

Sàng lọc các ột biến mtDNA gây bệnh phổ biến với quy mô lớn ở Việt Nam

là cần thiế ể hiểu rõ về nguyên nhân gây bệnh và c i thiện việ iều trị lâm sàng

ũng như ư vấn di truyền cho bệnh nhân và các thành viên trong gia nh T y

nhiên trong nghiên cứu này, a ố bệnh nhân nghi ngờ bệnh liên quan ty thể ến t

nhiều vùng xa xôi nên việc sàng lọc mở rộng gặp nhiề hó hăn

T ộng lâm sàng của bệnh do rối loạn ty thể hay ổi rất lớn ở các bệnh

nhân khác nhau. Vì vậy ể ăng ỷ lệ phát hiện ột biến thì các tiêu chuẩn chẩn

n ệnh n n ư c chuẩn hóa và các kiểu hình phổ biến n n ư c sàng lọc kết h p.

T n ơ ở ó húng i ng ọc kết h p 15 loại ột biến phổ biến trên 106 mẫu

bệnh nhân.

Bệnh do ột biến gen ty thể ó ặ iểm là tỷ lệ N ột biến hay ổi ở

các mô khác nhau vì vậy c ư c sử dụng cho sàng lọc có nh hưởng ng ể

ến hiệu qu phát hiện ột biến mtDNA. Tế bào máu phân chia nhanh nên ty thể bị

ột biến í h ũy í hơn với các tế h ng ph n hia như tế ơ hay ế bào

thần kinh. Vì vậy, bạch cầu máu ngoại vi không ph i là nguồn ý ưởng cho việc

nghiên cứu bệnh do rối loạn ty thể. Tuy nhiên, khi so sánh với phương ph p inh

thiế ơ h việc phát hiện ột biến mtDNA sử dụng máu ngoại vi là mộ phương

pháp tiện l i, không g y hương ổn ến bệnh nhân và có giá trị cho việc chẩn n

bệnh, ư c sử dụng phổ biến trong sàng lọc bệnh do rối loạn ty thể ở bệnh viện [24,

58].

3.4. SỰ BIỂU HIỆN CỦA ĐỘT BIẾN GEN TY THỂ Ở MỨC ĐỘ GIA Đ NH

3.4.1. Nghiên cứu đột biến A3243G thuộc hội chứng MELAS

6 bệnh nhân bị bệnh ơ v n ư c phát hiện ang ột biến A3243G

thuộc hội chứng MELAS bao gồm 4 nam và 2 nữ ộ tuổi t 5 tháng -15 tuổi, trong

ó 1 bệnh nhân (mẫu BN80) không ư c nghiên cứu ph hệ gia nh (vì mẹ bệnh

nh n ất), nên chúng tôi chỉ tập trung phân tích sự biểu hiện của ột biến

A3243G của 5 gia nh (BN4, BN42, BN58, BN89 và BN101). Các thành viên

ng 5 gia nh bệnh nh n ang ột biến 3243G ư c thể hiện ở hình 3.24.

Hình 3.24. Phả hệ các gia đình mang đột biến A3243G

ể khẳng ịnh tính chất di truyền t mẹ sang con của ột biến A3243G,

húng i iểm tra phổ ăng P R-RFLP của các thành viên trong 5 gia nh

ang ột biến (hình 3.25). Bố của các bệnh nhân chỉ ó 1 ăng N 198 bp

( ường chạy 7, 16, 23, 29, 36) ng hi ó ệnh nh n ( ường chạy 4, 14, 20, 27, 34),

anh/em của bệnh nh n ( ường chạy 5, 21) và mẹ của bệnh nh n ( ường chạy 6, 15,

22, 28, 35) ều có phổ ăng P R-RFLP ương ự nhau với 3 ăng 198 p 111 p

và 87 bp. Kết qu này khẳng ịnh ột biến ư c truyền t mẹ cho con v ều tồn

tại ở dạng h ng ồng nhất. Dễ dàng nhận thấy rằng ăng 111 p v 87 p ủa mẹ

bệnh nh n é õ né hơn ăng 198 p ất nhiều, chứng tỏ tỷ lệ b n sao gen mang

ột biến/ h ng ột biến của mẹ bệnh nhân thấp hơn nhiều so với bệnh nhân.

Hình 3.25. Điện di sản phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) đoạn gen mang đột biến

A3243G của các thành viên trong các gia đình ệnh nhân mang đột biến.

Thang chuẩn DNA (1, 11, 17, 24, 31); s n phẩm PCR không cắt bằng HaeIII (2, 12, 18, 25,

32); ối chứng dương (3, 13, 19, 26, 33); gia nh BN4 (4-10), gia nh BN42 (14-16), gia

nh BN58 (20-23), gia nh BN89 (27-30), gia nh BN101 (34-38); bệnh nhân (4, 14, 20,

27, 34); em/anh bệnh nhân (5, 21); mẹ bệnh nhân (6, 15, 22, 28, 35); bà ngoại/dì/cậu (8, 9,

10, 30, 37, 38) và bố bệnh nhân (7, 16, 23, 29, 36).

Qua PCR-RFLP nhuộm ethidium bromide, chúng tôi không phát hiện thấy

ột biến A3243G ở ai gia nh BN4 ( ường chạy 5), mẹ bệnh nh n gia nh

BN89 ( ường chạy 28) v người thân phía mẹ ở gia nh N4 N89 và BN101

( ương ứng ường chạy 8-10, 30, 37, 38). Vì vậy ột biến A3243G ở gia nh

này ư c kiểm tra lại bằng phương ph p PCR-RFLP nhuộm bạc với ộ nhạy cao

hơn. Kết qu cho thấy không có sự sai khác về phổ ăng P R-RFLP ở các ường

h p này (phụ lục 4).

oạn gen chứa ột biến A3243G t h nh vi n ng 5 gia nh ó

bệnh nh n ang ột biến ũng ư x ịnh trình tự. Các s n phẩm PCR chứa

ạn gen nhân b n (198 bp) chứa ột biến A3243G t mẫu máu ngoại vi của bố,

mẹ, anh, em trong 5 gia nh ư c gắn trực tiếp vào vector nhân dòng và xác

ịnh trình tự. Hình 3.26 ế gi i nh ự n id ủa gia nh N42 v

BN58. Trình tự ạn gen chứa ột biến A3243G của các thành viên trong gia nh

BN4, BN89 và BN101 có kết qu ương ự. Kết qu phân tích các trình tự

nucleotide của ạn gen nghiên cứ h ư c khi so sánh với trình tự gen tham

chiếu (J01415.2) cho thấy ột biến A3243G chỉ có ở DNA ty thể của mẹ/anh em

bệnh nhân và không có ở bố bệnh nhân, phù h p với kết qu PCR-RFLP an ầu.

iề n y hẳng ịnh tính chất di truyền theo mẹ của các gen trên hệ gen ty thể.

Hình 3.26. So sánh trình tự các đoạn gen chứa đột biến A3243G từ các thành viên của gia đình BN42 (A) và gia đình BN58 (B) với trình tự gen chuẩn.

a ố ột biến mtDNA gây bệnh tồn tại ở dạng h ng ồng nhất, trong

ó ó ột biến A3243G. Mứ ộ h ng ồng nhất là một yếu tố quan trọng nh

hưởng ến sự hay ổi về kiểu hình và tính nghiêm trọng của bệnh. Tỷ lệ của ty thể

ột biến ph i ạ ến ngưỡng thì mới thể hiện kiểu hình lâm sàng [13, 74]. Phụ

thuộc vào mứ ộ h ng ồng nhất và mô bị ộng, bệnh nhân mang ột biến

A3243G có thể biểu hiện bệnh hay ổi rất lớn t dạng không bị ộng ến tiểu

ường iếc, hoặc thể hiện ầy ủ ặ iểm của hội chứng MELAS [6, 59]. Vì

vậy, việc phát hiện ột biến A3243G và x ịnh tỷ lệ số b n a ang ột biến là

ơ ở phân tử cho việc chẩn n hính x ệnh d ột biến gây ra. Ngoài ra, tần

suấ ộng của ột biến ến thế hệ con cái có thể i n an ến mứ ộ không

ồng nhất ng người mẹ [93].

Ở Việ Na hưa ó ng nh n i nghi n ứu mứ ộ h ng ồng

nhất của ột biến gen ty thể ũng như ự liên quan giữa mứ ộ h ng ồng nhất

với triệu chứng lâm sàng của bệnh. Trong nghiên cứu này với mong muốn tìm hiểu

õ hơn về ơ hế di truyền của ột biến mtDNA gây bệnh, vai trò của ư ng ột

biến trong sự ộng ến sự biểu hiện của bệnh d ột biến A3243G ở bệnh nhân

MELAS người Việt Na húng i tiến hành x ịnh tỷ lệ ột biến A3243G ở

tất c các h nh vi n ng 5 gia nh.

Phần lớn các nghiên cứ ướ y x ịnh ư ng ột biến iểm mtDNA

chủ yếu bằng phương ph p P R-RFLP ó nh dấu nucleotide bằng phóng xạ,

SSCP hay pyrosequencing. a ố các kỹ thuậ n y ó như iểm là tốn nhiều thời

gian ộ nhạy thấp, x ịnh ư c lư ng ột biến t 2-5% i hi giới hạn phát hiện

5-10% [32, 93]. Trong nghiên cứu này, a phương ph p P R-RFLP, chúng tôi

thực hiện thí nghiệm nhiều lần mới có thể phát hiện ư ột biến A3243G của mẹ

bệnh nhân gia nh BN4 và BN58 nhưng h ng phát hiện ư ột biến A3243G

của người thân bên mẹ ở gia nh BN4, BN89 và BN101. Vì vậy cần có một

phương ph p nhạy hơn và tin cậy ể phát hiện v x ịnh ư c tỷ lệ ột biến thấp

ở bệnh nhân v người thân ng gia nh ồng thời nh ư c việc sử dụng

n id nh dấu phóng xạ, là những ặ iểm chủ yếu của phương ph p

chúng tôi mong muốn. Hiện nay, phương ph p ng in ậy nhấ ể x ịnh ư ng

ột biến iểm mtDNA là real-time PCR sử dụng mẫu dò Taqman [32]. Trong kỹ

thuật này, mẫu dò hu nh quang ư c phân cắt bởi enzyme Taq DNA polymerase có

hoạ ính 5’-exonuclease chỉ hi g n í h ư c khuế h ại. Mẫu dò hu nh quang

bao gồm mộ ạn nucleotide bắt cặp ặc hiệu với trình tự í h ư nh dấu

reporter và quencher. Khi mẫu dò nguyên vẹn, quencher làm gi m tín hiệu hu nh

quang t reporter do sự cộng hưởng năng ư ng hu nh quang (nguyên lý FRET). Sự

phân cắt của mẫ dò ng hi P R gi i phóng p ăng ậ ộ hu nh

quang và máy sẽ ghi nhận ư c tín hiệu. y phương ph p ph hiện v ịnh

ư ng ộ iến nhanh nhạy v hính x có giá trị hi x ịnh tỷ lệ ột biến

mtDNA thấp [93].

Bai và Wong [13] ịnh ư ng ột biến A3243G sử dụng real-time PCR

với mẫu dò Ta an h ng hường cho tín hiệu nền cao do việc gắn h ng ặc

hiệu của mẫu dò vào trình tự í h vì vậy không có giá trị ể x ịnh tỷ lệ ột biến

thấp. Vì vậy trong thí nghiệm của chúng tôi ể x ịnh chính xác tỷ lệ ột biến

A3243G thì một trong những thách thứ ơ n là thiết kế mẫu dò Taqman ph i có

kh năng phân biệt ư c g n í h hỉ khác nhau một nucleotide. iề n y ạt

ư c khi kho ng cách ΔTm giữa Tm của mẫu dò bắt cặp hoàn toàn (mẫu dò match) và Tm của mẫu dò bắt cặp không hoàn toàn (mẫu dò mismatch) càng lớn. ể gi i quyết vấn ề này, mẫu dò bắt cặp úng v ắt cặp sai cần có nhiệ ộ tách chuỗi (Tm) cao hơn (Tm) của mồi kho ng 10oC và mẫu dò ph i ngắn h ộng của sự thay ổi một nucleotide càng lớn nên mẫu dò bắt cặp ặc hiệ hơn Vì vậy, húng i

c i tiến mẫu dò Taqman dưới dạng Taqman LNA. LNA là dạng acid nucleic có

chứa nucleotide c i biến với cầu methylene giữa vị í xy 2’ v a n 4’ ủa gốc

ường. Liên kết này hạn chế ính inh ộng của nucleotide bị khóa n n ăng

ộ bền nhiệ v ộ ặc hiệu của mẫu dò trong quá trình lai [109].

ể thiết lập iều kiện cho ph n ứng P R ịnh ư ng sử dụng mẫu dò

Taqman LNA, các thử nghiệ ư c thực hiện sử dụng DNA khuôn là hỗn h p N p a id ột biến v h ng ột biến ư c pha loãng khác nhau t 5.103 -5.108

b n sao/µl. Qua nhiều lần hă dò húng i x ịnh ư c nồng ộ mẫu dò

thích h p cho ph n ứng real-time PCR là 0,08 µmol/L mỗi loại mẫu dò cho 25l thể

tích ph n ứng; với h ư ng mẫ dò n y h ường ộ hu nh ang ư c ghi nhận là cao nhất. Nhiệ ộ bắt cặp của mồi và mẫu dò là 60o y nhiệ ộ bắt cặp tối

ư ủa mẫu dò Taqman, với nhiệ ộ bắt cặp này mẫu dò sẽ bắt cặp vào s i í h

ước khi mồi bắt cặp, nhờ ó nzy Ta N p y a ó ơ hội thủy gi i

ư c mẫu dò Ta an y hính ý d gi i thích tại sao mẫu dò ph i ư c thiết kế có Tm a hơn Tm của mồi kho ng 10oC.

Chúng tôi tiến hành khuế h ại oạn DNA ty thể chứa ột biến A3243G

dài 90 bp t vị trí 3206-3295 bằng PCR sử dụng cặp mồi mtMEL-F2 và mtMEL-R2

v n id ột biến ư c phát hiện bằng mẫ dò ặc hiệu Wt-MEL-HEX-1 và

Mt-MEL-FAM-1. Kết qu phân tích real-time PCR (hình 3.27) cho thấy ường

chuẩn màu xanh là của N ó ang ột biến v ỏ là dạng h ng ang ột

biến, tạo ra bằng việc sử dụng các tỷ lệ nồng ộ khác nhau giữa plasmid chứa ạn

gen ty thể ang ột biến 3243G v h ng ang ột biến ó ộ tuyến tính cao, giá trị của hệ số ương an R2 giữa số b n sao DNA ty thể và số chu k ngưỡng với c

mẫu dò Wt-MEL-HEX-1 và Mt-MEL-FAM-1 nằm trong kho ng 0,985-0,990,

chứng tỏ kết qu h ư c là tin cậy [32].

Áp dụng chế ộ real- i P R hiết lập ể phân tích tỷ lệ ột biến trong 5

gia nh (3 ần lặp lại) húng i ính ư c phần ă (%) số b n sao gen mang

ột biến A3243G của 5 bệnh nh n v h nh vi n ng 5 gia nh ( ng 3.5).

Bảng 3.5. Tỷ lệ đột biến A3243G của bệnh nhân và ngƣời thân trong các gia đình

Bệnh nhân và gia đình

Gia nh N4

Gia nh N42

Gia nh N58

Gia nh BN89

Gia nh N101

Bệnh nhân Em trai Mẹ Bà ngoại/Dì/Cậu Bệnh nhân Mẹ Bệnh nhân Anh Mẹ Bệnh nhân Mẹ Dì Bệnh nhân Mẹ Dì 1/Dì 2

Tỷ lệ đột biến (%) 52,05 ± 0,64 Không phát hiện ột biến 3,68 ± 0,42 Không phát hiện ột biến 73,02 ± 0,58 9,24 ± 1,10 80,85 ± 1,09 54,69 ± 1,24 3,77 ± 0,35 4,23 ± 0,32 Không phát hiện ột biến Không phát hiện ột biến 58,1 ± 0,58 10,9 ± 0,66 Không phát hiện ột biến

Gia nh N4

Gia nh N42

Gia nh N58

Gia nh N89

Gia nh N101

Hình 3.27. Biểu đồ khuếch đại ằng real-time PCR đoạn gen ty thể mang đột biến

A3243G sử dụng DNA tách từ các thành viên của 5 gia đình ệnh nhân và plasmid

mang đoạn gen ở các nồng độ khác nhau.

A: ường cong biểu thị mứ ộ nhân b n của ạn g n í h : Tương an giữa

nồng ộ n a g n ang ột biến 3243G (xanh) v h ng ang ột biến ( ỏ) với gi

ị h ngưỡng

Kết qu ở b ng 3.5 cho thấy các bệnh nhân ở gia nh BN4, BN42, BN58,

BN89 và BN101 có tỷ lệ ột biến ương ứng là 52,05%, 73,02%, 80,85%, 4,23% và

58,1%; tỷ lệ ột biến giữa các bệnh nh n da ộng rất lớn t 4,23% - 80,85%. Bệnh

nhân BN89 có tỷ lệ ột biến rất thấp (4,23%) phù h p với phổ ăng PCR-RFLP rất

mờ so với 4 bệnh nhân còn lại. Kết qu trên còn cho thấy giữa người con trong

ùng gia nh ũng ó tỷ lệ ột biến hay ổi ng ể, không phát hiện thấy ột biến

ở em trai của bệnh nh n gia nh N4, ng hi ó người anh có tỷ lệ ột biến là

52,05%; tỷ lệ ột biến của bệnh nhân gia nh BN58 là 80,85% và người anh là

54,69%. ặc biệt, chúng tôi không phát hiện thấy ột biến ở mẹ và dì của bệnh

nhân gia nh BN89; c người thân bên mẹ của bệnh nhân gia nh N4 bao gồm

bà ngoại, dì, cậu và các dì của bệnh nh n gia nh BN101. Tỷ lệ ột biến của bệnh

nhân gia nh BN58 là cao nhất (80,85%) a hơn ệnh nhân BN42 (73,02%)

nhưng ẹ của bệnh nhân BN58 có tỷ lệ ột biến (3,77%) thấp hơn ẹ bệnh nhân

BN42 (9,24%).

Singh và tập thể [93] ũng ử dụng real- i P R ể phát hiện v ịnh

ư ng ột biến A3243G. Tuy nhiên các tác gi dùng các mẫu dò gắn hu nh quang

(VIC và FAM) ở ầ 5’ òn ầ 3’ ư c gắn với protein liên kết khe nhỏ của DNA

(minor groove binding protein-MGB). Việc gắn MG v ầ 3’ giúp h nhận tín

hiệu hu nh quang của VIC/FAM khi chúng ở dạng mẫ dò ồng thời ăng

nhiệ ộ tách chuỗi (Tm) của mẫu dò. Trong nghiên cứu của chúng tôi, dựa n ặc

tính của các oligonucleotide khi chứa nucleotide c i biến với cầu methylene giữa vị

í xy 2’ v a n 4’ ủa gố ường (gọi tắt là mẫu dò acid nucleic bị khóa LNA)

thì vẫn gắn ặc hiệu với nucleotide bổ sung và có nhiệ ộ Tm a hơn với dạng h ng hường t 3-8oC/nucleotide bị c i biến [51], nhờ ó ẫu dò gắn hu nh

quang của chúng tôi thiết kế chỉ cần d i 14 n id nhưng vẫn ó T a hơn

Tm của mồi (dài 20-30 n id ) m b o cho việc gắn ặc hiệ v ạn gen

í h

ể gi i thích hiện ư ng vì sao tỷ lệ số b n a ang ột biến ở mẹ và con

khác nhau mặc dầu chính mẹ yền ột biến cho con cái, một số nghiên cứu cho

rằng chỉ có mộ ư ng nhỏ phân tử DNA ty thể t người mẹ ư c truyền cho thế hệ

sau (thuyế “nú ổ chai ty thể”) v y hể t tế bào tiền thân của người mẹ ư c

phân phối ngẫu nhiên ở các trứng, vì vậy các trứng khác nhau có thể chứa một

ư ng DNA ty thể ang ột biến khác nhau [80]. Thực tế, trong một nghiên cứu về

ột biến A3243G ở người thân bên mẹ t các nguồn mẫ h nha ph

hiện thấy rằng trong 3 trong số 5 gia nh ó người mẹ mang ột biến 3243G ều

ó người con (nam và nữ) h ng ang ột biến này (bên cạnh người con

h ang ột biến). Tác gi cho rằng ột biến có thể h ng ư c truyền cho thế hệ

tiếp theo hoặ d ộ tuổi còn nhỏ [58]. Trong nghiên cứ n y người em trai của gia

nh BN4 ũng ó iểu hiện yếu ơ nhưng ở mứ ộ nhẹ (gi m vận ộng 2 chân t

lúc 15 tháng tuổi), dấu hiệu bệnh khởi ph ương ự như người anh (dữ liệu t Bệnh

viện Nhi T ng ương), vì vậy chúng tôi cho rằng có thể do tuổi còn nhỏ hoặc do sự

phân bố ngẫu nhiên của ty thể n n ư ng ột biến í h ũy í hoặc không có

trong máu vì vậy không thể phát hiện ư c bởi real-time PCR.

Chúng tôi h ng ph hiện ư c ột biến A3243G ở mẹ và dì của bệnh

nhân gia nh BN89 mặc dầ người n ang ột biến này, có thể ột biến mới

xuất hiện ở người con và ở mứ ộ cá thể [55, 59].

ột biến A3243G nằm trên gen MTTL1 mã hóa cho tRNALeu, ột biến

mtDNA phổ biến nhất và có kiểu hình lâm sàng hay ổi rất lớn ng ó MEL S

là kiểu hình phổ biến nhất, chiế ến 80% ường h p [47]. Ng i MEL S ột

biến 3243G òn ư c phát hiện ở các bệnh ty thể h như iể ường v iếc, hội

chứng Kearns–Sayre, PEO hoặc Leigh [47, 65]. Phụ thuộc vào tỷ lệ N ột

biến và mô bị ộng, bệnh nh n ang ột biến A3243G có thể biểu hiện bệnh

hay ổi rất lớn t dạng không bị ộng ến tiể ường iếc, hoặc thể hiện ầy

ủ ặ iểm của hội chứng MELAS [45, 59]. Trong nghiên cứu này, các bệnh

nhân ang ột biến A3243G ó ộ tuổi t 5 h ng ến 15 tuổi, các bệnh nhân biểu

hiện triệu chứng lâm sàng với nhiều mứ ộ khác nhau ( ư c tóm tắt trong b ng

3.6).

Bảng 3.6. Triệu chứng lâm sàng và tỷ lệ đột biến A3243G của các ngƣời con trong gia

đình

Tuổi

Đặc điểm lâm sàng

Giới tính

Các ngƣời con trong gia đình

Tỷ lệ đột biến trong máu

52,05 ± 0,64

Nam

Teo ơ ấ iều hòa vận ộng, nói kém, khó thở, tuyến giáp to.

Bệnh nhân

15 tuổi

Bệnh sử gia đình Bình hường

T ơ ứ ộ nhẹ

Gia đình BN4

Nam

3 tuổi

Không phát hiện

Bình hường

73,02 ± 0,58

Nữ

Bệnh nhân

12 tuổi

Gia đình BN42

80,85 ± 1,09

Nam

Bình hường

Bệnh nhân

11 tuổi

Gia đình BN58

Co giật n h n a ầu t ng t, nhồi máu não, nghe kém, nói kém, sụp mi 2 mắt, không nhìn thấy, liệ ơ ắt, liệt nửa người ph i, gi m sút nhận thức, tuyến giáp to, rậm lông toàn thân, acid lactic máu ăng (5,8 mmol/L) và dịch não tủy ăng (7,0 mmol/L). Bệnh diễn biến nặng. Co giật các chi nhiề ơn ng ng y, a ầu, tổn hương n hùy h i dương i v hùy hẩm hai bên, sốt, nôn mửa, nghe kém, nói khó, liệt nửa người ph i, mất ý thức, khó thở, rậm lông toàn thân, rất gầy yếu (18 kg), acid lactic máu ăng (9,2 mmol/L) và dịch não tủy ăng (7,4 mmol/L). Bệnh diễn biến nặng.

Anh

Nam

Khỏe mạnh

54,69 ± 1,24

Co giật, acid lactic máu ăng (4 mmol/L)

4,23 ± 0,32

Bệnh nhân

Bình hường

Nữ

Gia đình BN89

17 tuổi 5 tháng

Bình hường

58,10 ± 0,58

12 tuổi

Bệnh nhân

Gia đình BN101

Gi m vận ộng nửa người ph i au ầu, co giật nửa người ph i, gi m thính lực, tổn hương vùng chẩm và thùy thái dương i, acid lactic máu ăng (8,5 mmol/L)

Nam

Kết qu phân tích các triệu chứng lâm sàng của các bệnh nhân MELAS

(b ng 3.6) cho thấy hầu hết bệnh nh n ều thể hiện dấu hiệu của bệnh ơ và não,

y ặ iểm lâm sàng phổ biến g y a d ột biến A3243G. Trong nghiên cứu

này, hội chứng MELAS là kiểu hình lâm sàng phổ biến g y a d ộng của ột

biến A3243G ở các bệnh nhân này. Yế ơ a ầu t ng ơn è h nôn mửa,

co giật, tổn hương n gi m thị lực và thính lực, mất ý thức, ăng acid lactic máu

và dịch não tủy ộng iển hình của hội chứng MEL S ư c thể hiện rất

rõ ở bệnh nh n gia nh BN42 và BN58. ặc iể iển hình của MELAS là hiện

ư ng gi tai biến mạch máu não (qua hình nh MRI não) ũng thể hiện rõ ở hai

bệnh nhân này. Bệnh nhân gia nh BN42 và BN58 có triệu chứng lâm sàng rất

nghiêm trọng, bệnh diễn biến nặng, hai ường h p này có tỷ lệ ột biến ương ứng

là 73,02% và 80,85%. Mứ ộ nghiêm trọng của bệnh ở 2 bệnh nhân này có lẽ do tỷ

lệ ột biến cao trong máu. Bệnh nhân gia nh BN4 và BN101 ũng ó ột vài dấu

hiệu lâm sàng của MELAS ó yếu ơ ấ iều hòa vận ộng, tổn hương n

a ầ ăng acid lactic máu. Hai ường h p này biểu hiện bệnh có phần nhẹ hơn

có tỷ lệ ột biến A3243G trong máu thấp hơn bệnh nhân BN42 và BN58. Riêng

bệnh nh n gia nh BN89 với biểu hiện lâm sàng chỉ có co giậ v ăng a id a i

trong máu, y bệnh nhân có tỷ lệ ột biến thấp nhất trong nghiên cứu này

(4,23%) v ường h p ặc biệt ư c phát hiện ở ộ tuổi còn nhỏ (5 tháng tuổi).

Dựa vào số ư ng ơ an ị ộng, số chứ năng ị nh hưởng và mứ ộ tác

ộng của t ng chứ năng ở mỗi bệnh nhân, kết qu phân tích cho thấy ặ iểm lâm

sàng của bệnh có liên quan với tỷ lệ ột biến A3243G trong máu của các bệnh nhân

trong nghiên cứu này.

Kết qu phân tích cho thấy ặ iểm lâm sàng gây ra do ột biến

A3243G ở bệnh nhân Việt Nam trong nghiên cứu chủ yếu bao gồm co giật, yếu ơ

mấ iều hòa vận ộng, nhận thức kém, gi m thị lực và thính lực, h ư ng acid

lactic ăng 2-4 lần so với nh hường a ầu t ng ơn chứng rậm lông,

hình nh MRI thể hiện gi m tỷ trọng vỏ v dưới vỏ của hùy ỉnh-chẩm và một

phần h i dương hai n h hấy hình nh của tổn hương giống dạng nhồi máu não.

Những bằng chứng này là phù h p với ặ iểm lâm sàng của ột biến A3243G

ư c mô t ở các nghiên cứ ướ ó [55, 59]. Tuy nhiên, cần ph i x xé ường

h p biểu hiện ng h ng iển hình bao gồm co giật v ăng a id a i máu

như bệnh nhân BN89 trong nghiên cứu của chúng tôi.

Chúng tôi tìm thấy sự ương an giữa tỷ lệ ột biến A3243G và mứ ộ

nghiệm trọng của bệnh ở người em bệnh nh n gia nh BN4 và các người mẹ ở gia

nh BN4, BN42, BN58 và BN101. C ối ư ng n y ều khỏe mạnh nh hường

ương ứng với tỷ lệ ột biến rất thấp hoặc không phát hiện thấy ột biến. Tuy nhiên,

húng i h ng hấy dấu hiệ ương an n y ở người anh ai gia nh

BN58, ường h p này có tỷ lệ ột biến 54 69% nhưng ơ hể khỏe mạnh bình

hường. ơ hế biểu hiện a dạng ặ iểm lâm sàng d ột biến A3243G hưa

ư c hiể ầy ủ, có lẽ ngoài mứ ộ h ng ồng nhất, ngưỡng biểu hiện của ột

biến thì sự phân bố của mtDNA ở các mô, yếu tố di truyền của gia nh v hể,

nhân tố i ường và tuổi tác ó ộng ến sự biểu hiện của ột biến [20, 26,

58].

Kết qu ịnh ư ng tỷ lệ ột biến trong nghiên cứu này là phù h p với kết

qu phân tích PCR-RFLP ướ ó ồng thời ũng h phép gi i thích vì sao mẹ

của bệnh nhân không có biểu hiện của hội chứng MELAS (theo kết qu khám của

bệnh viện) mặc dầ ó ang ột biến này.

Sự ộng lâm sàng của bệnh ty thể là không giống nhau, phụ thuộc vào

ngưỡng biểu hiện ở t ng mô và sự phân bố của N ột biến ở các mô khác

nhau. Tỷ lệ của ty thể ột biến ph i ạ ến ngưỡng thì mới thể hiện kiểu hình lâm

sàng. Tỷ lệ mt N ó i n an ến tuổi tác và mứ ộ nghiêm trọng của bệnh [97].

Như vậy, việc phát hiện ột biến và mứ ộ h ng ồng nhất của ột biến là rất

quan trọng trong chẩn n Kết qu phát hiện v ịnh ư ng ột biến iểm

A3243G bằng real-time PCR trong nghiên cứu của húng i ng in ậy. Tuy

nhiên, cần có sự nghiên cứu trên diện rộng với số ư ng bệnh nhân nhiề hơn ể có

khẳng ịnh chính xác về sự liên quan giữa mứ ộ h ng ồng nhất và tình trạng

bệnh ý d ột biến gây ra.

Hội hứng MEL S ó hể gây ra d ộ iến 3243G T3271 v

T3291C. Tuy nhiên, ấ ệnh nh n MEL S ng nghi n ứ ủa húng i ề

d ộ iến 3243G hứng ỏ ầ an ọng v ự phổ iến ủa ộ iến n y ở

100

ệnh nh n MEL S người Việ Nam. Kế n y là phù h p v ộ iến 3243G

x y a h ng 80% ệnh nh n MEL S ần ấ ộ iến n y a , chúng tôi

hiế nghĩ hi hẩn n ệnh nh n nghi ngờ ang hội hứng MEL S thì iể a

ộ iến A3243G ằng phương ph p P R/RLFP ng ại vi ủa ệnh nh n

ph i iể a ph n ử ầ i n y ộ hử nghiệ ph n ử ơn gi n ối với

ệnh d hiế h yế di yền

3.4.2. Sự di truyền phân tử của đột biến mất đoạn 9 bp (nucleotide 8272-8280)

Hiện ư ng mấ ạn 9 bp (CCCCCTCTA) ở vùng gen giữa cytochrome oxidase II và tRNALys trong hệ gen ty thể ư c xem là một dạng ột biến của hệ gen

ty thể và có tỷ lệ cao ở các quần thể người ng Na Á [108]. Mấ ạn 9 bp là

công cụ hữ í h ể kiểm tra mối quan hệ di truyền giữa các cá thể [102, 105], tuy

vậy h ến nay hưa ó h ng in n về sự liên quan của mấ ạn 9 bp với các

tình trạng bệnh ý ặ ưng

Nă 1999 Ivan va và tập thể [44] ướ ầu nghiên cứu DNA ty thể của

người Việt Nam và phát hiện một số ường h p mấ ạn 9 bp nêu trên, tuy vậy

các tác gi ũng hưa ó nhận xét gì về hiện ư ng mấ ạn với các triệu chứng

bệnh ty thể. Trong nghiên cứu này, chúng tôi kết h p việc sàng lọc các ột biến ở

các bệnh nhân nghi bị bệnh ơ n với hiện ư ng mấ ạn 9 bp với hy vọng tìm ra

ư c sự i n an n ó giữa các loại ột biến này trong các hội chứng bệnh ty thể.

ể tìm hiể ơ hế di truyền và biểu hiện của mấ ạn 9 bp, chúng i

kiểm tra 4 gia nh của các bệnh nhân BN15, BN16, BN28 và BN65 trong số các

gia nh ó ệnh nhân mang dấu hiệu mấ ạn phát hiện ư c qua PCR-RFLP. Kết

qu iện di ở hình 3.28 cho thấy s n phẩm PCR với mẫu DNA khuôn của bố bệnh

nhân ở 4 gia nh a hi ắt bằng BanII ó 3 ăng N 99 bp, 72 bp và 41 bp

giống như ẫ nh hường ( ường chạy 5, 8, 13 và 16) T ng hi ó n phẩm

PCR với DNA khuôn của mẹ bệnh nhân ở 4 gia nh ư c cắt bằng BanII ều cho

phổ ăng N ó í h hước giống như ẫu bệnh nhân chứa ột biến mấ ạn

( ường chạy 4, 7, 12 và 15). Kết qu này chứng tỏ sự ương ồng về í h hước của

101

ạn gen nhân b n giữa mẹ và bệnh nhân.

Hình 3.28. Điện di sản phẩm PCR-RFLP (cắt bằng BanII) đoạn gen mang đột biến

mất đoạn của các thành viên trong các gia đình ệnh nhân mang đột biến

Thang chuẩn DNA (1, 9); s n phẩm PCR không cắt bằng BanII (2, 10); gia nh BN15 (3- 5), gia nh N16 (6-8), gia nh N28 (11-13), gia nh N65 (14-16); bệnh nhân (3, 6,

11, 14); mẹ bệnh nhân (4, 7, 12, 15) và bố bệnh nhân (5, 8, 13, 16).

oạn gen chứa mấ ạn 9 bp t bố và mẹ bệnh nhân ở 4 gia nh ũng

ư x ịnh trình tự. Các s n phẩm PCR chứa ạn gen nhân b n (212 bp) mang

trình tự mấ ạn 9 bp t mẫu máu ngoại vi của bố và mẹ trong 4 gia nh ư c

gắn trực tiếp vào vector nhân dòng pGEM-T và x ịnh trình tự. Hình 3.29 ế

gi i nh ự n id ủa gia nh BN15, trình tự ạn gen chứa mấ ạn 9

bp của bố và mẹ ở gia nh BN16, BN28 và BN65 ũng ó ết qu ương ự như

trình tự ạn gen chứa mấ ạn 9 bp của bố và mẹ ở gia nh BN15.

Hình 3.29. So sánh trình tự các đoạn gen chứa mất đoạn 9 bp từ các thành viên của

gia đình BN15 với trình tự gen chuẩn.

102

Kết qu h ư c cho thấy hiện ư ng mấ ạn 9 bp chỉ có ở DNA ty thể

của mẹ và không có ở bố bệnh nhân, phù h p với kết qu P R ũng như P R-

RFLP an ầ iều này cho thấy hiện ư ng mấ ạn 9 p ư c truyền t mẹ sang

con. Kết qu gi i trình tự ạn DNA (8155-8366) trên hệ gen ty thể hứng tỏ

rằng việc phát hiện các bệnh nh n ó ột biến mấ ạn h phương ph p P R-

RFLP là tin cậy.

Kết qu x ịnh mấ ạn 9 bp của 72 bệnh nh n ư c nghiên cứu cho thấy

rằng, trong số 72 bệnh nhân nghi bị bệnh ơ n ó ới 23 bệnh nhân có hiện ư ng

mấ ạn 9 bp trong hệ gen ty thể, chiếm 31,9%; trong số này có tới 15 bệnh nhân

nam và chỉ có 8 bệnh nhân nữ Ng i a hi iều tra sự có mặt của ột biến

A3243G thuộc hội chứng MELAS, chúng tôi chỉ phát hiện thấy 01 bệnh nhân nam

v a ang ột biến A3243G v a có hiện ư ng mấ ạn 9 bp.

Tỷ lệ mấ ạn 9 bp ở vùng gen giữa COII và tRNALys ở người Việt Nam

khoẻ mạnh là 20% [44]. Trong nghiên cứu này, tần suất xuất hiện sự mấ ạn 9 bp giữa vùng COII và tRNALys ở các bệnh nhân Việt Nam nghi hội chứng ơ n y hể

ương ối cao so với những người khoẻ mạnh. Trong một nghiên cứu x ịnh sự

liên quan giữa hiện ư ng mấ ạn 9 bp (CCCCCTCTA) ở các bệnh nh n a nang

buồng trứng thì thấy tỷ lệ có mấ ạn là 23,5%, so với người khỏe mạnh thì tỷ lệ

này chỉ có 7,1% và các tác gi nhận ịnh có sự liên quan giữa mấ ạn và bệnh a

nang buồng trứng [114]. Một nghiên cứu khác ở các bệnh nh n người i L an

thuộc hội chứng MELAS và MERRF cho thấy tỷ lệ mấ ạn 9 bp là 47% trong khi

ó ỷ lệ này ở người khỏe mạnh là 21% [53]. Một số tác gi cho rằng có sự bất ổn ịnh của vùng gen COII/tRNALys ở các bệnh nhân bị bệnh ty thể v iểm nóng

cho sự mấ ạn [90, 114]. Hiện ư ng mấ ạn 9 bp trong hệ gen ty thể có lẽ ư c

di truyền cùng với một số ột biến DNA ty thể gây bệnh trong quá trình di truyền

và tiến hóa lâu dài của hệ gen ty thể. Trong nghiên cứ n y húng i hưa ph

hiện thấy sự liên quan tin cậy nào giữa hiện ư ng mấ ạn 9 bp với mứ ộ bị ột

biến A3243G trong hội chứng MELAS v ột biến A8344G trong hội chứng

103

MERRF hay các ột biến h ư c sàng lọc.

Sự mấ ạn 9 bp nằm giữa cytochrome oxidase II và và tRNALys, y ư c

xem vùng h ng hóa ó hiện ư ng mấ ạn 9 bp này có thể không ph i

là mộ ột biến gây bệnh. Tuy nhiên, tỷ lệ mấ ạn cao ở những bệnh nhân ơ n

nên chúng tôi nhận ịnh hai kh năng: hứ nhất, có thể ở những bệnh nhân này bị

rối loạn hoạ ộng ty thể nên quá trình sao chép của gen ty thể bị lỗi và gây ra sự

mấ ạn ặc biệt ở những vùng có trình tự lặp lại ương ồng; thứ hai, liệu sự mất

ạn 9 bp có di truyền cùng với các rối loạn ty thể húng i hưa ph hiện

ư c ở các bệnh nhân trên và sự mấ ạn n y góp phần cho những biểu hiện a

dạng của bệnh ty thể ở người.

Theo các dẫn liệu Bệnh viện Nhi T ng ương ng ấp, 23 bệnh nh n ư c

phát hiện mấ ạn 9 bp trong nghiên cứu này có biểu hiện ặ iểm của bệnh do

rối loạn ty thể (phụ lục 2) a số bệnh nhân biểu hiện lâm sàng kết h p tối thiểu 3

trong các dấu hiệu bao gồm ộng kinh, gi ương ự ơ ơ iệt nửa người,

chậm phát triển tinh thần vận ộng, gi m thị lực, hình nh cộng hưởng t não không

nh hường như gi m tỷ trọng khu trú và nhồi máu vùng nhân bèo 2 bên, teo bán

cầu não, tổn hương hùy h i dương ỉnh, thiếu má n a ổ. Hầu hết các bệnh

nhân ó h ư ng acid lactic trong máu cao, trung bình là 4,3 mmol/L (trẻ bình

hường í hơn 2 2 /L) (dẫn liệu t Bệnh viện Nhi T ng ương). Hiện ư ng

ăng a id a i ng của bệnh nhân là một dấu hiệu bấ hường của quá trình

a ổi chất nói chung và phần lớn là do khiếm khuyết quá trình oxy hóa các h p

chất bên trong ty thể. Hầu hế ơ an ổ chứ ng ơ hể duy trì hoạ ộng

nhờ vào nguồn năng ư ng hiế hí ư c cung cấp t quá trình oxy hóa hoàn toàn

phân tử ường g ng ó vai ò hủ yếu là các thành phần của chuỗi hô hấp

ở màng trong ty thể. Tuy nhiên, khi ty thể bị hỏng thì tế bào sẽ sử dụng toàn phần

hay một phần năng ư ng t nguồn oxy hóa glucose yếm khí và s n sinh acid lactic

khuếch tán vào máu [85, 101]. id a i ăng ng ủa bệnh nhân là một chỉ

tiêu hóa sinh quan trọng ể chẩn n ự rối loạn a ổi chất ở ty thể. Tuy nhiên,

acid a i ăng hưa ph i là dấu hiệu tin cậy hoàn toàn về sự rối loạn ty thể mà cần

104

ph i kết h p với các ặ iểm lâm sàng, bằng chứng bệnh học về rối loạn thần kinh,

bệnh ơ hoặc những dấu hiệ h ng nh hường ặ ưng ủa hình nh cộng

hưởng t não (MRI), sinh thiế ơ.

Mấ ạn 9 bp không thuộc vùng gen mã hóa cho RNA hay protein, nên có

thể không ph i là nguyên nhân trực tiếp gây nên các khiếm khuyết chứ năng y hể.

Tuy nhiên, các dấu hiệu như ăng acid lactic máu kết h p với biểu hiện bấ hường

về thần inh ơ ở 23 bệnh nhân này cho thấy rất có thể i n an ến sự có mặt của

ột biến khác trong hệ gen ty thể hưa ư c phát hiện trong nghiên cứu này. Tỷ lệ

ột biến mấ ạn 9 p a (32%) hơn người nh hường trong nghiên cứu của chúng

tôi có thể cho rằng có sự liên quan nhấ ịnh giữa mấ ạn 9 bp với kh năng ị ột

biến khác trong hệ gen ty thể. Tuy nhiên cần có sự nghiên cứu ầy ủ hơn về ột

biến khác trong mtDNA ở các bệnh nhân này ể có thể khẳng ịnh chắc chắn về

mối liên quan giữa sự mấ ạn 9 bp trong hệ gen ty thể và sự xuất hiện bệnh ty thể

ở người Việt Nam.

3.4.3. Sự di truyền phân tử của đột biến T14727C thuộc hội chứng cơ não

ể tìm hiểu về ặ iểm phân tử của sự rối loạn ty thể d ột biến T14727C,

húng i nghi n ứ 2 gia nh của bệnh nhân BN7 và BN50 ang ột biến

(hình 3.30).

Hình 3.30. Phả hệ của hai gia đình ệnh nhân mang đột biến T14727C

105

Khi kiểm tra phổ ăng P R-RFLP (hình 3.31) của các thành viên trong 2 gia

nh ang ột biến, kết qu cho thấy s n phẩm PCR với mẫu DNA khuôn của bố

bệnh nhân ở 2 gia nh a hi ắt bằng DraI ó 2 ăng N 129 bp và 24 bp

( ường chạy 7 v 14) ng hi ó ệnh nh n ( ường chạy 3 và 11), anh/chị của

bệnh nh n ( ường chạy 4, 5 và 12 ), mẹ của bệnh nh n ( ường chạy 6 và 13) và bà

ngoại của bệnh nh n ( ường chạy 8) ều có phổ ăng P R-RFLP ương ự nhau và

chỉ ó 1 ăng 153 p Kết qu này khẳng ịnh ột biến ư c truyền t mẹ cho

con.

Hình 3.31. Điện di sản phẩm PCR-RF P đoạn gen mang đột biến T14727C của các

thành viên trong hai gia đình ệnh nhân mang đột biến.

Thang chuẩn DNA (1, 9); s n phẩm PCR không cắt bằng DraI (2 10); gia nh BN7 (3-8),

gia nh BN50 (11-14), bệnh nhân (3, 11), anh/chị bệnh nhân (4, 5, 12), mẹ bệnh nhân (6,

13), bố bệnh nhân (7, 14) và bà ngoại bệnh nhân (8).

ột biến T14727C nằm trên gen MTTE mã hóa cho tRNAGlu a ố ột biến

trên gen này tồn tại ở dạng h ng ồng nhất. Tuy nhiên, qua phân tích PCR-RFLP

(hình 3.31) cho thấy ột biến T14727 dường như ở dạng ồng nhất. Vì vậy, chúng

tôi hẳng ịnh lại kết qu phân tích phổ ăng P R-RFLP ở 2 gia nh ằng

nhuộm bạc với ộ nhạy a hơn T y nhi n ết qu là hoàn toàn tương ự (phụ lục

4), chứng tỏ ột biến T14727C tồn tại ở dạng ồng nhất ng ( ồng nhất về

cấu trúc này ở tất c các b n copy của mtDNA).

oạn gen chứa ột biến trên t bố, mẹ, anh chị em và bà ngoại của bệnh

nhân ở c 2 gia nh ũng ư c gi i trình tự. Kết qu phân tích các trình tự

106

nucleotide của gen chứa ột biến h ư c khi so sánh với trình tự gen tham chiếu

(J01415.2) (hình 3.32) cho thấy ột biến T14727C chỉ có ở DNA ty thể của mẹ,

anh/chị, bà ngoại của bệnh nhân và không có ở bố bệnh nhân. Kết qu h ư c

khẳng ịnh tính phù h p với kết qu PCR-RFLP an ầ ồng thời khẳng ịnh ột

biến ư c truyền t mẹ cho con.

Hình 3.32. So sánh trình tự các đoạn gen chứa đột biến T14727C từ các thành viên

của gia đình BN (A) và gia đình BN50 (B) với trình tự gen chuẩn (J01415.2)

107

Sự hay ổi nucleotide T thành C tại vị trí 14727 không ph i là sự hay ổi a

hình trong DNA ty thể vì không phát hiện thấy những thay thế T bằng các

nucleotide khác ở vị trí 14727 ở 104 bệnh nhân còn lại. Sự hay ổi này nh hưởng ến nucleotide trong vòng DHU của tRNAGlu (hình 3.33). hay ổi trong vòng

DHU có thể làm mất chứ năng ủa ty thể bằng h hay ổi sự ương ng cấu trúc bậc 2 hay sự cuộn gập của tRNAGlu và nh hưởng ến quá trình tổng h p

protein [75].

Hình 3.33. Cấu trúc bậc 2 của RNA vận chuyển acid glutamic ở ty thể ngƣời

và vị trí đột biến T14727C [8].

Mộ iều thú vị ột biến mtDNA gây bệnh T14728 ư ước ó [74] nằm kề với ột biến T14727C trong vòng DHU của tRNAGlu ư c phát hiện

trong nghiên cứu của chúng tôi, mặc dầu sự iể hiện ng ủa hai ộ iến n y

h nha ng ể. ột biến T14728C tồn tại gần như ở dạng ồng nhất (97%)

ng ơ và hầ như h ng ư c phát hiện ng dấ hiệ ng ủa

ột biến thể hiện muộn, bệnh nhân nữ 54 tuổi xuất hiện các triệu chứng như hóng

mặt t ng ơn ấ iều hòa vận ộng, gi m kh năng ngh nh n. Trong nghiên cứu

này, 2 bệnh nhân biểu hiện bệnh rất sớm (t 7 tháng tuổi và 2 tuổi), c 2 ường h p

ó ặ iểm lâm sàng gần như ương ự nha với iệu chứng như co giật toàn

108

thân, yế ơ chậm phát triển tinh thần vận ộng (theo kết qu khám của bệnh viện).

Sự h nha ng ộng và mứ ộ nghiêm trọng của bệnh giữa 2 ột biến kề

nhau có thể một phần là do vị trí của n id ột biến trong gen [75, 77].

ột biến T14727C trên gen MTTE mã hóa cho tRNAGlu ũng ư c nhóm

tác gi Liu và tập thể [52] ề cập trong các bệnh nhân ung hư ồng trứng. Tuy

nhiên các tác gi ũng hưa nêu là nó tồn tại ở dạng ồng nhấ hay h ng ồng nhất

v ó i n an g ến hội chứng ơ n o hay không. Chính vì vậy y ng nh ầu tiên phát hiện ư ột biến T14727C ở bệnh nh n ơ n Tương ự như ột biến n g n RN h ột biến trên gen mã hóa cho tRNAGlu kèm theo

các dấu hiệ ng hay ổi rất lớn bao gồm, bệnh ơ iể ường, bệnh n ăng tiến ơ n v PEO [8]. a ố ột biến trên gen mã hóa tRNAGlu ó ặ iểm

là h ng ồng nhất. Tuy nhiên gần y ột biến T14674 ũng n g n n y ở

dạng ồng nhất, là nguyên nhân của bệnh ơ d hiếm khuyết COX ở trẻ [41]. ơ chế di truyền và gây bệnh của ột biến trên gen mã hóa tRNAGlu rất phức tạp, ột biến T14709C ũng là ột biến trên gen tRNAGlu v ư c khẳng ịnh ở dạng

h ng ồng nhất trong nhiều nghiên cứu [60, 65, 78]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu

ở mộ gia nh người Anh, ó 3 h nh vi n ang ột biến T14709C ở dạng ồng

nhất, ng ó 2 người biểu hiện bệnh ơ v iể ường rất nghiêm trọng còn 1

ường h p thì khỏe mạnh nh hường [64]. Sự hay ổi về kiểu hình ở các cá thể

ang ột biến dạng ồng nhất òn ư c thể hiện trong nghiên cứu về ột biến T14674C trên gen mã hóa tRNAGlu, trong nghiên cứu này tác gi phát hiện chỉ có

7 ng 22 người ang ột biến biểu hiện yế ơ òn a ố ường h p khác

hưa a giờ biểu hiện bệnh [41].

Mứ ộ h ng ồng nhất n ư c xem là một trong các tiêu chuẩn ơ n

ể x ịnh kh năng g y ệnh của ột biến. Tuy nhiên, dạng ồng nhất của ột

biến không nên loại tr hi nh gi ự biểu hiện bệnh của ột biến iề n y ư c

thể hiện ở 2 bệnh nh n ang ột biến T14727C trong nghiên cứu của chúng tôi

ũng như 2 ường h p ang ột biến T14709 ng gia nh người Anh v a ố

ột biến gây bệnh thuộc hội chứng LHON [60]. Hơn nữa, sự hay ổi về kiểu hình

109

giữa các cá thể ang ột biến dạng ồng nhất h hấy sự óng góp ủa các nhân

tố như g n nh n v i ường trong biểu hiện lâm sàng của ột biến trên tRNA

của ty thể [65].

Trong nghiên cứu này, ở gia nh N7, chị của bệnh nhân ũng iểu hiện

bệnh giống như ệnh nhân nhưng mẹ và anh của bệnh nhân lại khỏe mạnh bình

hường; còn mẹ và anh của bệnh nhân ở gia nh BN50 không biểu hiện bệnh (dẫn

liệ ư c cung cấp t Bệnh viện Nhi T ng ương). ột biến T14727C tồn tại ở

dạng ồng nhất nhưng ứ ộ biểu hiện bệnh giữa người n v người mẹ là

khác nhau. iều này có thể do mứ ộ biểu hiện bệnh phụ thuộc vào nhiều nhân tố

như ặ ưng h ng mô, gen nh n i ường, tuổi tác [41, 60, 75, 77]. Vì vậy

việ x ịnh các nhân tố góp phần hay ổi kiểu hình của ột biến và những

110

hiểu biết về ơ hế phát sinh bệnh d ột biến gen ty thể là cần thiết.

KẾT LUẬN

1. x y dựng ư c cách thức ể phát hiện 15 loại ột biến iểm trong hệ gen ty

thể người bao gồm ột biến T3271C và T3291C (MELAS); A8344G và T8356C

(MERRF); G11778A, G3460A và T14484C (LHON); T8993G/C và T9176G

(Leigh); A1555G (hội chứng iếc) và G4298A, T10010C, T14727C, T14728C,

T14709C (hội chứng ơ n nói h ng) bằng phương ph p P R-RFLP kết h p

với gi i trình tự.

2. sàng lọc sự có mặt của 15 loại ột biến nêu trên ở 106 bệnh nhân nghi bị

bệnh do rối loạn ty thể và phát hiện ư 6 ường h p ột biến A3243G (chiếm

5 7%); 2 ường h p ột biến T14727C (chiế 3 9%) 1 ường h p ột biến G8251A (chiếm 0,9%). ột biến T14727C trên gen MTTE mã hóa cho tRNAGlu

ột biến mới ư c phát hiện lần ầu tiên trên bệnh nh n ơ n ng nghi n

cứu này.

3. ph hiện ư 23/72 ường h p ấ ạn 9 bp (nucleotide 8272-8280),

chiế 31 9% nhưng hưa ph hiện thấy sự liên quan tin cậy nào giữa hiện

ư ng mấ ạn 9 bp với 15 ột biến ư c sàng lọc.

4. ột biến A3243G, T14727C và mấ ạn 9 p ư c di truyền t mẹ sang

n T ng ó ột biến A3243G tồn tại ở dạng h ng ồng nhấ òn ột biến

T14727C và mấ ạn 9 bp ở dạng ồng nhấ .

5. hiế ập ư phương ph p phát hiện v ịnh ư ng mứ ộ h ng ồng nhấ

của ột biến A3243G thuộc hội chứng MELAS bằng real-time PCR với mẫu dò

Taqman mang nucleotide dạng khóa bằng cầu methyl. Kết qu ph n í h ịnh

ư ng cho phép gi i thích ự ương an h ận giữa mứ ộ biểu hiện bệnh và ỷ

ệ ang ộ iến.

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục sàng lọ ột biến gen khác trong hệ gen ty thể ở các bệnh nhân nghi

bị bệnh do rối loạn ty thể ể có thể tìm ra nguyên nhân gây bệnh.

2. Cần tiếp tục phát triển phương ph p ịnh ư ng mứ ộ h ng ồng nhất với các

ột biến h ể có thể thấy ư c sự liên quan giữa tỷ lệ ang ột biến và tình

111

trạng bệnh ý d ột biến gây ra.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GI

IÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Trƣơng Thị Huệ, Phạm Minh Huệ, Lê Ngọc Yến, Phạm Thị Vân Anh, Ngô

Diễm Ngọc, Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Ph hiện mấ ạn 9 bp trong hệ gen ty

thể ở một số bệnh nhân nghi hội chứng ơ n ”, Tạp chí Sinh học 34 (2), tr.

246-252.

2. Trƣơng Thị Huệ, Nguyễn Văn Liệu, Phạm Vân Anh, Nguyễn Thị Vân Anh,

Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Ph hiện v ịnh ư ng ột biến A3243G trong hệ gen

ty thể ở hội chứng MEL S”, Tạp chí Công nghệ sinh học 10 (3), tr. 423-429.

3. Truong Thi Hue, Phan Tuan Nghia, Nguyen Thi Van Anh, Pham Le Anh Tuan,

Pham Van Anh (2012), “ n w a i n in h g n n oding for mitochondrial transfer RNA of glutamic acid (tRNAGlu) in two Vietnamese encephalomyopathy

112

pa i n ”, VNU J. Sci. Technol. 28 (2S), pp. 123-128.

TÀI LIỆU THAM KH O

I. Tài liệu Tiếng Việt

1. L ứ Hinh L Văn Thính Ng yễn Vư ng, Trần Thị Minh Nguyệt, Nguyễn

í h Nhi Phan Văn hi (2007) “Hội chứng MEL S” Y học lâm sàng 18, tr.

27-31.

2. Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phạ V n nh Phan Văn hi (2006)

“Ph n í h hệ protein huyết thanh của bệnh nh n ang ột biến A3243G trong gen tRNALeu ty thể” Y học Việt Nam 4, tr. 24-28.

3. Trần Thị Minh Nguyệt, Nguyễn í h Nhi L ứ Hinh Phan Văn hi (2007)

“ ường h p: một bệnh nhân MELAS Việ Na ang ột biến A3243G hệ gen tRNALeu ty thể” Tạp chí Y học Việt Nam 1, tr. 4-9.

4. Trịnh L Phương h Văn Mẫn, Phan Tuấn Nghĩa (2009) “Ph hiện ột

biến gen A3243G của hội chứng MELAS bằng phương ph p P R-RFLP c i

tiến” Tạp chí Di truyền và ứng d ng 4, tr. 6-9.

5. Lê Thị Bích Th ỗ Qu nh Hoa, Nguyễn í h Nhi N ng Văn H i, Phan

Văn hi Phạm Thị Vân Anh, Ninh Thị Ứng (2004) “X ịnh ột biến A3243G trên gen tRNALeu ty thể t các bệnh nhân mắc bệnh ty thể” Báo cáo

khoa học Hội nghị khoa học toàn quốc. Những vấn ề nghiên cứ ơ n trong

khoa học sự sống, tr. 463-465.

II. Tài liệu Tiếng Anh

6. Aharoni S. , Traves T.A., Melamed E., Cohen S., Silver E.L. (2010) “MEL S

syndrome associated with both A3243G-tRNALeu mutation and multiple

i h nd ia N d i n ” J. Neurol. Sci. 296, pp. 101–103.

7. Akagi M., Inui K., Tsukamoto H., Sakai N., Muramatsu T., Yamada M.,

Matsuzaki K., Goto Y., Nonaka I., O ada S (2002) “ p in a i n f

i h nd ia TPa 6 g n in L igh ynd ” Neuromuscul. Disord. 12,

113

pp. 53-55.

8. Alston C.L., Lowe J., Turnbull D.M., Maddison P., Taylor R.W. (2010), “A novel mitochondrial tRNAGlu (MTTE) gene mutation causing chronic

progressive external ophthalmoplegia at low levels of heteroplasmy in

”, J. Neurol. Sci. 98, pp. 140-144.

9. Anderson S., Bankier A.T., Barrell B.G., deBruijin M.H., Coulson A.R.,

Drouin J., Eperon I.C., Nierlich D.P., Rose B.A., Sanger F., Schreier P.H.,

Smith A.J.H., Staden R., Y ng I G (1981) “S n and ganiza i n f

h h an i h nd ia g n ”, Nature 290, pp. 457-465.

10. Andreu A.L., Bruno C., Dunne T.C., Tanjik K., Shanske S., Sue C.M.,

Krishna S., Hadjigeorgiou G.M., Shtilbans A., Bonilla E., DiMauro S. (1999),

“ n n n a i n (G15059 ) in h y h g n in a pa i n wi h

x i in an and y g in ia”, Ann. Neurol. 45, pp. 127-130.

11. Andreu A.L., Hanna M.G., Reichmann H., Bruno C., Penn A.S., Tanji K.

Panllotti F., Iwata S., Bonilla E., Lach B., Morgan-Hughes J., Dimauro S.

(1999) “Ex i in an d a i n in h y h b gene of

i h nd ia N ” New Engl. J. Med. 341, pp. 1037-1044.

12. Ayed I.B., Chamkha I., Mkaouar-Rebai E., Kammoun T., Mezghani N.,

Chabchoub I., Aloulou H., Hachicha M., Fakhfakh F. (2011) “ T ni ian

patient with Pearson syndrome harboring the 4.977 kb common deletion

associated to two novel large- a i h nd ia d i n ” Biochem.

Biophys. Res. Commun. 411, pp. 381-386.

13. Bai R.K., Wong L.J.C. (2004), “ i n and uantification of heteroplasmic

mutant mitochondrial DNA by real-time amplification refractory mutation

system quantitative PCR analysis: A single-step app a h” Clin. Chem. 50,

pp. 996–1001.

14. Ballinger S.W., Schurr T.G., Torroni A., Gan Y.Y., Hodge J.A., Hassan K.,

Chen K.H., Wallace D.C. (1992) “S h a ian i h ndrial DNA

ana y i v a g n i n in i y f an i n M g id ig a i n ” Genetics

114

130, pp. 139-152.

15. Baughman J.M., Mootha V.K. (2006), “Buffering mitochondrial DNA

va ia i n”, Nature Genet. 38, pp. 1232 – 1233.

16. Berdanier C. D. (2005), Mitochondria in healthy and disease, CRC Press.

17. a G M M n K La d P n J (1996) “L ' h di a y

optic neuropathy: heteroplasmy is likely to be significant in the expression of

LHON in fa i i wi h h 3460 N 1 a i n” Br. J. Ophthalmol.

80, pp. 915-917.

18. L Ka pa i G Sh idg E (1992) “ i i i n and h h d expression of the tRNALys mutation in skeletal muscle of patients with

myoclonic epilepsy and ragged- d fi (MERRF)”, Am. J. Hum. Genet. 51,

pp. 1187-1200.

19. Budowle B., Chakraborty R., Giusti A.M., Eisenberg A.J., Allen R.C. (1991),

“ na y i f h VNTR 1S80 y h P R f w d y high-resolution

P GE” Am. J. Hum. Genet. 48, pp. 137-144.

20. Calvaruso M.A., Willemsen M.A., Rodenburg R.J., Brand M.V.D., Smeitink J.A.M., Nijtmans L (2011) “N w i h nd ia RN HIS mutation in a

family with lactic acidosis and stroke-like pi d (MEL S)”,

Mitochondrion 11, pp. 778-782.

21. Chinnery P.F., Brown D.T., Andrews R.M., Singh-Kler R., Riordan-Eva P.,

Lind y J pp ga h T n M H w N (2001) “Th

i h nd ia N 6 g n i a h p f a i n ha a L ’

h di a y p i n pa hy” Brain. 124, pp. 209-218.

22. hinn y P F (2002) “Inh i an f i h nd ia di d ”

Mitochondrion 2, pp. 149-155.

23. Chinnery P F (2006) “Mi h nd ia N in Ho o api ns”, Nucleic Acids

Mol. Biol. 18, pp. 3-11.

24. Cao Y., Ma Y., Zhang Y., Li Y., Fang F., Wang S., Bu D., Xu Y., Pei P., Li L.,

Xiao Y., Wua H, Yang Y., Zou L. Qi Y (2010) “ i n f igh

115

frequently encountered point mutations in mitochondria in Chinese patients

suggestive of mitochondrial encepha y pa hi ” Mitochondrion 10, pp.

330–334.

25. De Coo I.F., Renier W.O., Ruitenbeek W., Ter Laak H.J., Bakker M.,

Schagger H., Van Oost B.A., Smeets H.J (1999) “ 4-base pair deletion in

the mitochondrial cytochrome b gene associated with parkinsonism/Melas

v ap ynd ” Ann. Neurol. 45, pp. 130-133.

26. Deschauer M., Wieser T., Neudecker S., Lindner A., Zierz S. (1999),

“Mi h nd ia 3243G a i n (MELAS mutation) associated with painful

iffn ” Neuromuscul. Disord. 9, pp. 305-307.

27. Du W., Li W., Chen G., Cao H., Tang H., Tang X., Jin Q., Sun Z., Zhao H.,

Zh W H S Lva Y Zha J Zhang X (2009) “ i n f n wn a

substitution mutations in human mitochondrial DNA of MERRF and MELAS

y i hip hn gy” Biosen. Bioelectron. 24, pp. 2371-2376.

28. Enn G M ai R K E W ng L J (2006) “M a –clinical

correlations in a family with variable tissue mitochondrial DNA T8993G

an ad” Mol. Genet. Metab. 88, pp. 364–371.

29. Fan H., Civalier C., Booker J.K., Gulley M.L., Prior T.W, Farber R.A. (2006),

“Detection of common disease-causing mutations in mitochondrial DNA

(Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis with stroke-like episodes

MTTL1 A3243G and myoclonic epilepsy associated with ragged-red fibers

MTTK A8344G) by real-time polymerase chain r a i n”, J. Mol. Diagn. 8,

pp. 277-281.

30. Fawcett D.W. (1981), The Cell, W. B. Saunders Company, NewYork.

31. Gal A., Komlosi K., Maasz A., Pentelenyi K., Remenyi V., Ovary C.,

Valikovics A., Dioszeghy P., Bereczki D., Melegh B., Molnár M.J. (2010),

“ na y i f N 3243G a i n f n y in H nga y” Cent. Eur. J.

Med. 5, pp. 322-328.

32. Genasetti A., Valentino M.L., Carelli V., Vigetti D., Viola M., Karousou E.G.,

116

d’E i G V M L a G Pa i Pa i F (2007) “Assessing

heteroplasmic load in Leber’ h di a y p i n pa hy utation

G3460A/MT-ND1 with a real-time PCR quantitative app a h” J. Mol. Diagn.

9, pp. 538-545.

33. Glatz C., ’ K S i h S S ndh i N (2011) “Mutation in the

mitochondrial tRNAVal causes mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis

and stroke-like episodes” Mitochondrion 11, pp. 615–619.

34. Goto Y. N na a I H ai S (1990) “ a i n in h RN L (UUR) g n

a ia d wi h h MEL S g p f i h nd ia n pha y pa hi ”

Nature 348, pp. 651-653.

35. G p an L (2001) “ iagn i and a n f hi dh d i h nd ia

di a ”, Pediatr. Neurol. 1, pp. 185-194.

36. G p an L (2004) “Th n gi a p n a i n f hi dh d and ad

i h nd ia di a : a i h d ynd and ph n ypi va ia i n ”

Mitochondrion 4, pp. 503–520.

37. Guan M.X. (2011) “Mi h nd ia 12S RN a i n a ia d wi h

a in g y id xi i y” Mitochondrion 11, pp. 237–245.

38. Gvozdjáková A. (2008), Mitochondrial medicine, Springer Science + Business

Media B.V.

39. Handoko H. Y., Lum J. K., Rismalia G., Kartapradja H., Sofro A. S. M., Marzuki

S. (2001), “Length variations in the COII-tRNALys intergenic region of

i h nd ia N in Ind n ian p p a i n ” Hum. Biol. 73, pp. 205-223.

40. Holt I.J. (2003), Genetics of mitochondrial disease, Oxford University Press

Inc., NewYork.

41. Horvath R., Kemp J.P., Tuppen H.A.L., Hudson G., Oldfors A., Marie S.K.N.,

Moslemi A.R., Servidei S., Holme E., Shanske S., Kollberg G., Jayakar P.,

Pyle A., Marks H.M., Holinski-Feder E., Scavina M., Walter M.C., Coku J.,

Gunther-Scholz A., Smith P.M., McFarland R., Chrzanowska-Lightowlers

117

Z.M.A., Lightowlers R.N., Hirano M., Lochmuller H., Taylor R.W., Chinnery

P.F., Tulinius M., DiMauro S. (2009) “Molecular basis of infantile reversible

Cyt c xida d fi i n y y pa hy” Brain 132, pp. 3165–3174.

42. H n V W hn V San J H (2006) “Role of mitochondrial DNA

in xi p n xida iv ” DNA Repair 5, pp. 145–152.

43. Ida H., Rennert O.M., Iwasawa K., Kobayashi M., Et Y (1999) “ ini a

and genetic studies of Japanese homozygotes for the Gaucher disease L444P

a i n” Hum. Genet. 105, pp. 120-126.

44. Ivanova R., Astrinidis A., Lepage V., Djoulah S., Wijnen E., Vu-Trieu A.,

Hors J., Charron D. (1999), “Mi h nd ia N p y phi in h

Vi na p p a i n” Eur. J. Immunogenet. 26, pp. 417- 422.

45. Jacobi F.K. M y J P h M Wi ing (2001) “Q an i a i n f

heteroplasmy in mitochondrial DNA mutations by primer extension using

VentR ®(exo-) N p y a and RFLP ana y i ” Mut. Res. 478, pp.

141–151.

46. Keightley J.A., Anitori R., Burton M.D., Quan F., Buist N.R., Kennaway N.G.

(2000) “Mi h nd ia n pha y pa hy and p x III d fi i n y

associated with a stop-codon mutation in the y h g n ” Am. J. Hum.

Genet. 67, pp. 1400-1410.

47. Kim D.S., Jung D.S., Park K.H., Kim I.J., Kim C.M., Lee W.H., Rho S.K.

(2002), “Histochemical and molecular genetic study of MELAS and MERRF

in Korean pa i n ” J. Korean Med. Sci. 17, pp. 103-112.

48. Kirby D.M., Milovac T., Thorburn D.R (1998) “ fai -positive diagnosis

for the common MELAS (A3243G) mutation caused a novel variant (A3426G)

in h N 1 g n i h nd ia N ” Mol. Diagn. 3, pp. 211-216.

49. Kolesnikova O.A., Entelis N.S., Mireau H., Fox T.D., Martin R.P., Tarassov

I.A. (2000), “S pp i n f a i n in i h nd ia N y RN

i p d f h y p a ” Science 289, pp. 1931-1933.

50. Legros F., Chatzoglou E., Frachon P., Ogier De Baulny H., Laforet P., Jardel

118

C., Godinot C., Lomb (2001) “F n i na ha a iza i n f n v

a i n in h h an y h g n ” Eur. J. Hum. Genet. 9, pp. 510-

518.

51. Letertre C., Perelle S. i a F a K Fa h P (2003) “Eva a i n f h

p f an f LN and MG p in 5’ n a P R a ay ” Mol. Cell

Probes 17, pp. 307-311.

52. Liu V.W.S., Shi H.H., Cheung A.N.Y., Chiu P.M., Leung T.W., Nagley P.,

W ng L Ngan H Y S (2001) “High incidence of somatic mitochondrial

N a i n in h an va ian a in a ” Cancer Res. 61, pp. 5998-

6001.

53. Liu C.S., Cheng W.L., Chen Y.Y., Ma Y.S., Pang C.Y., Wei Y.H. (2005),

“High prevalence of the COII/tRNALys intergenic 9-bp deletion in

mitochondrial DNA of Taiwanese patients with MELAS or MERRF

ynd ”, Ann. N.Y. Acad. Sci. 1042, pp. 82-87.

54. L L Wa a Ma in G M (2005) “The mitochondrial theory of

aging and its relationship to reactive oxygen species damage and somatic

N a i n ” Nat. Acad. Sci. 102, pp. 18769-18770.

55. Lorenzoni P.J., Scola R.H., Kay C.S.K., Arndt R.C., Freund A.A., Bruck I.,

Santos M.L.S.F., Lineu C., Werneck L.C. (2009), “MELAS-Clinical features,

i p y and a g n i ”, Arq. Neuropsiquiatr. 67, pp. 668-676.

56. L Y T J Yang T J ng Y J W i Y H (2002) “ i n f N

mutations associated with mitochondrial diseases by Agilent 2100

i ana yz ” Clin. Chimica. Acta 318, pp. 97-105.

57. Lu J., Wang D., Li R., Li W., Ji J., Zhao J., Ye W., Yang L., Qian Y., Zhu Y.,

G an M X (2006) “Maternally transmitted diabetes mellitus associated with

the mitochondrial tRNALeu(UUR) A3243G mutation in a four-generation

Han hin fa i y”, Biochem. Biophys. Res. Commun. 348, pp. 115–119.

58. Ma Y., Fang F., Yang Y., Zou L., Zhang Y., Wang S., Xu Y., Pei P., Qi Y.,

(2009), “Th dy f i h nd ia 3243G a i n in diff n a p ”

119

Mitochondrion 9, pp. 139-143.

59. Ma Y. , Fang F., Cao Y., Yang Y., Zou L., Zhang Y., Wang S., Zhu S., Xu Y.,

Pei P., Qi Y. (2010), “ inical features of mitochondrial DNA m.3243A>G

a i n in 47 hin fa i i ” J. Neurol. Sci. 291, pp. 17–21.

60. Mancuso M., Ferraris S., Nishigaki Y., Azan G., Mauro A., Sammarco P.,

Krishna S., Tay S.K.H., Bonilla E., Romansky S.G., Hirano M., DiMauro S.

(2005) “ ng ni a a -onset myopathy in patients with the T14709C

N a i n”, J. Neurol. Sci. 228, pp. 93-97.

61. Martin-Kleiner I., Gabrilovac J., Bradvica M., Vidovi T., Cerovski B., Fumic

K ani M (2006) “L ’ hereditary optic neuroretinopathy (LHON)

associated with mitochondrial DNA point mutation G11778A in two Croatian

fa i i ” Coll. Antropol. 30, pp.171–174.

62. Mashima Y., Saga M., Hiida Y., Oguchi Y., Wakakura M., Kudoh J., Shimizu

N. (1995), “Quantitative determination of heteroplasmy in Leber's hereditary

optic neuropathy by single-strand conformation p y phi ” Invest.

Ophthalmol. Vis. Sci. 36, pp. 1714-1720.

63. Masoro E.J., Austad S.N. (2006), Handbook of the biology of aging, 6th

Edition, Academic Press, USA.

64. McFarland R., Schaefer A.M., Gardner J.L., Lynn S., Hayes C.M., Barron

M.J., Walker M., Chinnery P.F., Taylor R.W., Turnbull D.M. (2004),

“Fa i ia y pa hy: n w in igh in h T14709 i h nd ia RN

a i n”, Ann. Neurol. 55 (4), pp. 478-484.

65. Mezghania N., Mkaouar-Rebaia E., Mnif M., Charfi N., Rekik N., Youssef S.,

id M Fa hfa ha F (2010) “Th h p a i 14709TNC mutation in

h RN G g n in w T ni ian fa i i wi h i h nd ia dia ” J.

Diab. Compl. 24, pp. 270-277.

66. Miller F.J., Losenfeldt F.L., Zhang C., Linnane A.W., Nagley P. (2003),

“P i d ina i n f i h nd ia N py n in h an a

120

and cardiac muscle by a PCR- a d a ay” Nucleic Acids Res. 31, pp. 1-7.

67. Mimaki M., Hatakeyama H., Ichiyama T., Isumi H., Furukawa S., Akasaka M.,

Kamei A., Komaki H., Nishino I., Nonaka I., Goto Y. (2009) “Different

effects of novel mtDNA G3242A and G3244A base changes adjacent to a

common A3243G mutation in patients with mit h nd ia di d ”,

Mitochondrion 9, pp. 115–122.

68. Mkaouar-Rebai E., Chaari W., Younes S., Bousoffara R., Sfar M.T., Fakhfakh

F (2009) “Ma na y inh i d L igh ynd : T8993G a i n in a

T ni ian fa i y” Pediatr. Neurol. 40, pp. 437-442.

69. Montero M., Alonso M.T., Albillos A., Cuchillo-Ibanez I., Olivares R.,

Vi a va J (2002) “Eff f in i 1 4 5-triphosphate receptor stimulation on mitochondrial (Ca2+) and i n in h affin ”

Biochem. J., 365, pp. 451-459.

70. Moraes C.T., Atencio D.P., Oca-Cossio J., Diaz F. (2003), “Techniques and

pitfalls in the detection of pathogenic mitochondrial DNA mutations” J. Mol.

Diagn. 5, pp. 197-208.

71. Musumeci O., Andreu A.L., Shanske S., Bresolin N., Comi G.P., Rothstein R.,

Schon E.A., and DiMauro S. (2000), “In ag ni inv i n f N : n w

type of pathogenic mutation in a pa i n wi h i h nd ia y pa hy” Am. J.

Hum. Genet. 66, pp. 1900-1904.

72. Navia x R K (2004) “ v ping a y a i app a h h diagn i ”

Mitochondrion 4, pp. 351-361.

73. Nelson D.L., Cox M.M. (2008), Lehninger principles of biochemistry, Worth

publishers, Inc.

74. Nig M Pa fai a E O ivi J L (1998) “ i n and

quantification of the A3243G mutation of mitochondrial DNA by ligation

d i n a i n”, Mol. Cell. Probes 12, pp. 273-282.

75. Nogueira C. , Nunes J., Evangelista T., Fattori F., Tessa A., Pereira C.,

121

Santorelli F. M., Vilarinho L. (2007), “A new mtDNA-tRNAGlu mutation

(T14728C) presenting a late- n i h nd ia n pha y pa hy”

Mitochondrion 7, pp. 396-398.

76. Ohkubo K., Yamano A., Nagashima M., Mori Y., Anzai K., Akehi Y.,

Nomiyama R., Asano T., Urae A., Ono J. (2001) “Mi h nd ia g n

mutations in the tRNALeu(UUR) region and diabetes: prevalence and clinical

ph n yp in Japan”, Clin. Chem. 47, pp. 1641–1648.

77. Pereira C., Nogueira C., Barbot C., Tessa A., Soares C., Fattori F., Guimaraes

A. , Santorelli F.M., Vilarinho L. (2007), “Identification of a new mtDNA

a i n (14724G> ) a ia d wi h i h nd ia n pha pa hy”

Biochem. Biophys. Res. Commun. 354, pp. 937–941.

78. Perucca-Lostanlen D., Taylor R.W., Narbonne H., de Camaret B.M., Hayes

C.M., Saunieres A., Paquis–Flucklinger V., Turnbull D.M., Vialettes B.,

Desnuelle C. (2002), “M a and f n i na ff f h T14709 p in

mutation in the mitochondrial DNA of a patient with maternally inherited

diabetes and deafness” Biochim. Biophys. Acta 1588, pp. 210–216.

79. Polyak K., Li Y., Zhu H., Lengauer C., Willson J. K., Markowitz S.D., Trush M.A., Kinzer K.W V g in (1988) “S a i a i n f h

i h nd ia g n in h an a ” Nat. Genet. 20, pp. 291-

293.

80. Poulton J., Macaulay V., Marchington D.R. (1998), “Mitochondrial

G n i ’98 i h n a d ?”, Am. J. Hum. Genet. 62, pp. 752-757

81. P T Hanna M G (2001) “H an i h nd ia N di a ”, Adv.

Drug Deliv. Rev. 49, pp. 27-43.

82. Rahman S., Poulton J., Marchington D., Suomalainen A. (2001) “ a f

A3243G mtDNA mutation from blood in MELAS syndrome: a longitudinal

s dy” Am. J. Hum. Genet. 68, pp. 238–240.

83. Redd A.J., Takezaki N., Sherry S.T., McGarvey S.T., Sofro A.S., Stoneking M.

(1995), “Ev i na y hi y f h OII/ RN Ly in g ni 9 a pai d i n

122

in h an i h nd ia N f h Pa ifi ” Mol. Biol. Evol. 12, pp. 604-615

84. Reeve A.K., K i hnan K J T n (2008) “Mi h nd ia N

mutations in disease, aging and neurod g n a i n” Ann. NY Acad. Sci. 1147,

pp. 21-29.

85. R in n H (2006) “La i a id ia and i h nd ia di a ”, Mol.

Genet. Metab. 89, pp. 3-13.

86. Rotig A., Lebon S., Zinovieva E., Mollet J., Sarzi E., Bonnefont J.P., Munnich

A. (2004) “M a diagn i f i h nd ia di d ” Biochim.

Biophys. Acta 1659, pp. 129-135.

87. Sacconi S., Salviati L., Gooch C., Bonilla E., Sahnske S., Dimauro S. (2002),

“ p x n gi ynd a ia d wi h h G1606 a i n f

mitochond ia N ” Arch. Neurol. 59, pp. 1013-1015.

88. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977), “DNA sequencing with chain-

ina ing inhi i ”, Biochemistry 74 (12), pp. 5463-5467.

89. Schneider A., Marechal- a d L (2000) “Mitochondrial tRNA import: are

h di in hani ?” Cell Biol. 10, pp. 509-513.

90. Schon E.A., Rizzuto R., Moraes C.T., Nakase H., Zeviani M., DiMauro S. (1989) “ di p a i a h p f a g -scale deletion of human

i h nd ia N ” Science 244, pp. 346-349.

91. Shanske S., Pancrudo J., Kaufmann P., Engelstad K., Jhung S., Lu J., Naini A.,

DiMauro S., De Vivo D.C. (2004) “Va ying ad f h i h nd ia N

A3243G mutation in different tissues: implications for diagn i ” Am. J. Med.

Genet. 130A, pp. 134-137.

92. Shanskea S., Wong L.J.C. (2004), “Molecular analysis for mitochondrial DNA

di d ” Mitochondrion 4, pp. 403-415.

93. Singh R., Ellard S., Hattersley A., Harries L.W. (2006) “Rapid and sensitive

real-time polymerase chain reaction method for detection and quantification of

3243G i h nd ia p in a i n” J. Mol. Diagn. 8, pp. 225-230.

94. Solano A., Playán A., López-Pé z M J M n ya J (2001) “Genetic diseases

123

of human mi h nd ia N ” Salud. Publica. Mex. 43, pp. 151-161.

95. Suzuki Y., Wada T., Sakai T., Ishikawa Y., Minami R., Tachi N., Saitoh S.

(1998) “Ph n ypi va ia i i y in a fa i y wi h a i h nd ia N T8993

a i n” Pediatr. Neurol. 19, pp. 283-286.

96. Tajima H., Sueoka K., Moon S.Y., Nakabayashi A. Sakurai T., Murakoshi Y.,

Watanabe H., Iwata S., Hashiba T., Kato S., Goto Y., Yoshimura Y. (2007),

“Th d v p n f n v an ifi a i n a ay f i h nd ia N

heteroplasmy aimed at preimplantation genetic diagnosis of Leigh

encephalopathy” J. Assist. Reprod. Genet. 24, pp. 227-232.

97. Tanahashi C., Nakayama A., Yoshida M., Ito M., Mori N., Hashizume Y.,

(2000) “MELAS with the mitochondrial DNA 3243 point mutation: a

n pa h gi a dy” Acta. Neuropathol. 99, pp. 31–38.

98. Tanno Y., Yoneda M., Nonaka I., Tanaka K., Miyatake T., Tsuji S. (1991),

“Q an i a i n f i h nd ia N a ying a i n in MERRF pa i n tRNALys”, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, pp. 880-885.

99. Taylor R.W., Morris M H hin n M T n M (2002) “Leigh

di a a ia d wi h a n v i h nd ia N N 5 a i n” Eur. J.

Hum. Genet. 10, pp. 141-144.

100. Tay R W T n M (2005) “Mi h nd ia DNA mutations in

h an di a ”, Nature Genet. 6, pp. 389-402.

101. Ueki I., Koga Y., Povalko N., Akita Y., Nishioka J., Yatsuga S., Fukiyama

R Ma i hi T (2006) “Mi h nd ia RN g n a i n in pa i n

having i h nd ia di a wi h a i a id i ”, Mitochondrion 6, pp. 29-

36.

102. Vassilina A.S., Vadim B.V., Thomas D., Catherine H., Dominique R.,

Catherine G. (2002), “ R ian fa i y f S avi igin a ying

mitochondrial DNA with a 9-bp deletion in region V and a long C-stretch in

D- p” Mitochondrion 1, pp. 479-483.

103. Wang X (2001) “Th xpanding f i h nd ia in ap p i ” Genes

124

Dev. 15, pp. 2922–2933.

104. Wallace D.C., Singh G., Lott M.T., Hodge J.A., Schurr T.G., Lezza A.M.,

Elsas L.J., Nikoskelainen E.K. (1988), “Mitochondrial DNA mutation

associated with Leber's hereditary optic neuropathy”, Science 242, pp. 1427-

1430.

105. Watkins W.S., Bamshad M., Dixon M.E., Rao B.B., Naidu J.M., Reddy P.

G., Prasad B.V.R., Das P.K, Reddy P.C., Gai P.B., Bhanu A., Kusuma Y.S.,

Lum J.K., Fischer P., Jorde L.B. (1999), “M ip igin f h mtDNA 9-

bp deletion in p p a i n f S h India”, Am. J. Phys. Anthropol. 109, pp.

147-158.

106. White H.E., Durston V.J., Seller A., Fratter C., Harvey J.F., Cross N.C.P.

(2005), “ a d i n and an i a i n f h p a i i h nd ia

point mutations by py n ing”, Genet. Test. 9, pp. 190-199.

107. Wibrand F., Ravn K., Schwartz M., Rosenberg T., Horn N., Vissing J.

(2001) “M i y di d a ia d wi h a i nse mutation in the

i h nd ia y h g n ” Ann. Neurol., 50, pp. 540-543.

108. Yao Y.G., Watkins W.S. , Zhang Y.P (2000) “Evolutionary history of the

mtDNA 9-bp deletion in Chinese populations and its relevance to the peopling

of east and h a ia”, Hum. Genet. 107, pp. 504-512.

109. You Y., Moreira B.G., Behlke M.A., Owczarzy R. (2006), “ ign f LN

p ha i p v i a h di i ina i n” Nucleic Acids Res. 34, pp. 1-

11.

110. Yu Q., Zhang Y., Wang Z., Yang Y. , Yuan Y., Niu S., Pei P., Wang S, Ma

Y., Bu D., Zou L., Fang F., Xiao J., Sun F., Zhang Y., Wu Y., Wang S., Xiong

H W X (2007) “S ning f n i h nd ia a i n in hin

pa i n wi h i h nd ia n pha y pa hi ’ Mitochondrion 7, pp. 147–

150.

111. Zeviani M., na S (2004) “Mi h nd ia di d ”, Brain 127, pp.

125

2153–2172.

112. Zhao L., Young W.Y., Li R., Wang Q., Qian Y., Guan M.X. (2004),

“Clinical evaluation and sequence analysis of the complete mitochondrial

genome of three Chinese patients with hearing impairment associated with the

12S RN T1095 a i n” Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, pp.

1503-1508.

113. Zhou X., Zhang H., Zhao F., Ji Y., Tong Y., Zhang J., Zhang Y., Yang L.,

Qian Y L F Q J G an M X (2010) “V y high p n an and

n f L ’ h di a y p i n pa hy in a a g Han hin

pedigree carrying the ND4 G11778 a i n”, Mol. Genet. Metab. 100, pp.

379–384.

114. Zh G F ng G L ng J Y L Jiang Y (2010) “ 9-bp deletion

homoplasmy in women with polycystic ovary syndrome revealed by

126

mitochondrial genome- a i n n” Biochem. Genet. 48, pp. 157-163.

PHỤ LỤC 1

Danh sách các bệnh nhân nghi ngờ bệnh do rối loạn ty thể ư c lấy mẫu cho nghiên cứu

Ng yễn Minh L

3 th

BN1

inh Việ Ng

10 t

BN2

Ng yễn Văn T

2 t

BN3

Vũ Th nh L

15 t

BN4

Nguyễn D.

5th

BN5

T ần y Kh

5 th

BN6

Kiề Văn Th

2 t

BN7

Ng yễn Văn

BN8

Ng yễn nh Ngh

7 th

BN9

Ng yễn Văn T

2 t

BN10

Ng yễn Văn H i

5 th

BN11

L nh Mạnh Q

12 th

BN12

ặng X n Ph

BN13

Nguyễn Thị Y

5 t 12 t

BN14

Hoàng Thị Như Q

1 t

BN15

Nguyễn Thị Th.

7 th

BN16

Nguyễn Vũ Q

9 th

BN17

Kim Tuấn H.

12 t

BN18

Nguyễn Thị T.

3 t

BN19

Trịnh Hồng Ph.

8 th

BN20

Nguyễn Như Ng

1 t

BN21

H ng Phương L

4 th

BN22

n Thị Vân A.

15 t

BN23

Nguyễn Thị Th.

5 t

BN24

Nguyễn Thùy D.

3 t

BN25

Nguyễn Thị Thu H.

12 t

BN26

ùi nh

25 th

BN27

127

STT Tên bệnh nhân Tuổi Ký hiệu mẫu

Lê mai L.

10 t

BN28

L Văn T

7,5 th

BN29

Bùi Thanh Th.

3 t

BN30

Trần Xuân B.

16 th

BN31

Nguyễn Hoàng A.

3 t

BN32

Nguyễn Thị Hồng H.

15 t

BN33

Trần Thanh B.

5 th

BN34

Nguyễn Thị Lan A.

2 t

BN35

Trần An N.

11 th

BN36

inh Ngọc Qu.

5 t

BN37

Nguyễn Phương Th

4 t

BN38

Hà Việt H.

3 t

BN39

Phạm Thị Tâm A.

8 t

BN40

Nguyễn Anh Th.

10 th

BN41

Phạm Thị Huyền Tr.

12 t

BN42

Hoàng Ngọc Cẩm A.

30 th

BN43

Nguyễn Thị Phương Nh

2 t

BN44

Nguyễn Thị Hồng Qu.

5 th

BN45

Phan Nhật Qu.

2 t

BN46

Lê Tuấn A.

7 t

BN47

Lê Duy H.

12 t

BN48

Nguyễn Thế M.

3 t

BN49

Nguyễn Duy A.

7 th

BN50

Vũ Qúy M

6 th

BN51

Phạm Khắc T.

8 th

BN52

Phạm Thanh H.

4 t

BN53

Nguyễn Thụy Khánh H.

6 th

BN55

Bùi Linh Ch.

2 th

BN55

ỗ T ường Ph.

2 t

BN56

Phạm Thị Thu H.

1 t

BN57

128

Nguyễn Văn

11 t

BN58

Trần Văn H

13 t

BN59

Phan Thị Thanh H.

1 t

BN60

Lê Doãn Xuân Tr.

17 th

BN61

Nguyễn Qu nh Tr.

7 th

BN62

Nguyễn Mạnh D.

15 t

BN63

Vũ Thị Qu nh Ch.

BN64

Nguyễn Thị Phương Kh

8 t

BN65

Trần nh Việt D.

3 th

BN66

Trần Quế Ph.

53 ng

BN67

Bùi Minh A.

9 t

BN68

Nguyễn Thị Lan A.

10 th

BN69

Th i S

3 th

BN70

Nguyễn Hồng Quốc A.

5 t

BN71

Cao Xuân H.

7,5 th

BN72

Nguyễn Thị Thùy D.

8 th

BN73

Cao Th o D.

3 t

BN74

Lâm Thị Ch.

9 th

BN75

Hồ Hữu N.

6 t

BN76

Nguyễn nh H

1 t

BN77

Lư nh T

3,5 t

BN78

Vũ Gia H

1 t

BN79

Nguyễn Anh D.

9 t

BN80

Hoàng Thị Phương Th

8 th

BN81

Trần Tuệ Ng.

2 ng

BN82

Nguyễn Văn

2 t

BN83

Chử Hoàng A.

6 th

BN84

Nguyễn Thị Anh Th.

2 t

BN85

Nguyễn Thị Kim Ng.

40 ng

BN86

Nguyễn Hoàng A.

12 t

BN87

129

Trần Thị Thanh H.

3 t

BN88

Trần Thị Thu H.

5 th

BN89

Nguyễn Kim H.

BN90

Nguyễn Minh Th.

2 th

BN91

Nguyễn Danh H.

75 ng

BN92

Nguyễn Thị Lan A.

2 t

BN93

Nguyễn Danh Tr.

5 t

BN94

Trịnh Mai L.

15 th

BN95

Nguyễn Hoàng A.

3 t

BN96

Nguyễn Thị Y.

14 t

BN97

Vũ Ngọc L.

4 t

BN98

ương Minh H

8 th

BN99

100

inh Thị H.

5 t

BN100

101

Phan văn M

12 t

BN101

102

Phan Qu nh A.

7 th

BN102

103

Phan Văn Th

8 t

BN103

104

Bùi Thị Minh Ng.

10 t

BN104

105

Nguyễn Văn Ph

BN105

106

Lê Thị Thúy Th.

5 t

BN106

130

PHỤ LỤC 2 ặ iểm lâm sàng của các bệnh nh n ư c nghiên cứu phát hiện ột biến gen ty thể

Đặc điểm lâm sàng

Chậm

Đau

Mất

Acid

Ký hiệu

Giới

Tổn

Sụp

Chứng

phát

đầu,

điều

khả

STT

Tuổi

Bệnh

Co

Thiếu

Nôn

lacic

mẫu

tính

thƣơng

mi

rậm

triển

giảm

hòa

năng

cơ

giật

máu

mửa

(mmol/

não

tinh thần

nhận

mắt

lông

vận

nghe

l)

vận động

thức

động

nhìn

BN1

3 th

Nam

2,6

-

BN2*

10 t

Nam

+++

3,0

-

BN3

2 t

Nam

3,4

-

15 t

Nam

BN4

+++

-

BN5*

3 t

Nam

+++

-

BN6

5 th

Nam

+++

2,0

-

BN7

2 t

Nam

+++

4,3

-

BN8

3 t

Nam

BN9*

7 th

Nam

6,3

-

10 BN10*

2 t

Nam

+++

3,3

-

11 BN11

5 th

Nam

3,2

-

12 BN12

1 t

Nam

+++

3,0

-

+++

-

13 BN13 14 BN14

5 t 12 t

Nam Nữ

++ -

- +++

+++ -

- -

- +

- -

++ -

2,7 X

-

15 BN15*

1 t

Nữ

+++

9,0

-

16 BN16*

7 th

Nữ

+++

4,0

-

17 BN17

9 th

Nam

+++

2,9

-

18 BN18

12 t

Nam

+++

-

19 BN19

3 t

Nữ

3,4

-

8 th

Nam

+++

20 BN20

5,0

-

21 BN21

1 t

Nam

3,2

-

22 BN22

4 th

Nữ

+++

12,3

-

23 BN23

15 t

Nữ

+++

3,5

-

24 BN24

5 t

Nữ

+++

4,5

+++

3,0

-

25 BN25*

3 t

Nữ

26 BN26

12 t

+++

27 BN27

2 t

Nam

2,7

28 BN28*

10 t

Nữ

+++

5,1

29 BN29

7,5 th Nam

4,0

30 BN30

3 t

Nữ

31 BN31

16 th

Nam

+++

-

32 BN32

3 t

Nữ

+++

-

33 BN33

15 t

Nữ

7,4

-

+++

34 BN34*

5 th

Nữ

5,4

-

35 BN35

2 t

Nữ

+++

-

36 BN36*

11 th

Nam

-

Nam

37 BN37

5 t

+++

3,3

-

Nữ

+++

38 BN38

4 t

Nam

+++

39 BN39*

3 t

2,4

-

40 BN40

8 t

Nữ

+++

2,9

-

41 BN41

10 th

Nữ

+++

2,8

42 BN42

12 t

Nữ

+++

5,8

43 BN43

30 th

Nữ

4,4

-

44 BN44*

2 t

Nữ

+++

2,2

-

45 BN45

5 th

Nữ

+++

-

46 BN46*

2 t

Nam

-

47 BN47

7 t

Nam

+++

-

48 BN48

12 t

Nam

+++

7,5

-

49 BN49

Nam

3,8

-

50 BN50

7 th

Nam

+++

4,5

-

+++

51 BN51*

6 th

Nam

3,1

+++

52 BN52

8 th

Nam

4,0

53 BN53*

4 t

Nữ

+++

54 BN54

6 th

Nữ

4,7

55 BN55

2 th

Nữ

3,3

+++

56 BN56*

2 t

Nam

5,5

57 BN57

1 t

Nữ

4,9

+++

58 BN58*

11 t

Nam

9,2

+++

59 BN59*

13 t

Nam

4,3

60 BN60

1 t

Nữ

2,8

+++

3,4

61 BN61*

17 th

Nam

+++

62 BN62

7 th

Nữ

3,4

63 BN63*

15 t

Nam

64 BN64

1 t

Nữ

65 BN65*

8 t

Nữ

+++

5,1

66 BN66*

3 th

Nam

+++

4,1

67 BN67

53 ng

Nữ

+++

3,1

68 BN68

9 t

Nam

+++

2,8

69 BN69

10 th

Nữ

+++

70 BN70*

3 th

Nam

+++

71 BN71

5 t

Nam

3,6

+++

72 BN72

7,5 th Nam

4,8

+++

73 BN73

8 th

Nữ

3,4

+++

74 BN74

3 t

Nam

4,0

+++

75 BN75

9 th

Nữ

2,9

+++

76 BN76

6 t

Nam

4,0

+++

77 BN77

1 t

Nam

4,0

+++

78 BN78

3,5 t

Nam

79 BN79

1 t

Nam

3,5

+++

80 BN80

9 t

Nam

7,7

81 BN81

8 th

Nữ

+++

82 BN82

2 ng

Nam

5,4

+++

83 BN83

2 t

Nam

2,0

+++

6 th

Nữ

84 BN84

4,1

2 t

Nữ

85 BN85

+++

Nữ

86 BN86

40 ng

5,4

12 t

Nữ

87 BN87

3 t

Nữ

88 BN88

3,2

Nữ

89 BN89

5 th

+++

4,1

Nữ

90 BN90

7 th

Nữ

91 BN91

2 th

4,1

92 BN92

75 ng

Nam

+++

4,1

93 BN93

2 t

Nữ

+++

94 BN94

5 t

Nam

Nữ

95 BN95

15 th

+++

5,8

Nữ

96 BN96

3 t

+++

Nữ

97 BN97

14 t

Nữ

98 BN98

4 t

+++

4,7

99 BN99

8 th

Nam

+++

2,8

100 BN100

5 t

Nữ

+++

3,6

101 BN101

12 t

8,5

Nam

+++

102 BN102

7 th

2,4

Nữ

+++

103 BN103

8 t

Nam

104 BN104

10 t

Nữ

+++

105 BN105

2 t

Nam

106 BN106

5 t

Nữ

6,4

+++

Ghi chú: BN*: mấ ạn 9 bp, +: nhẹ; ++: trung bình; +++: nghiêm trọng; - : không có triệu chứng; X : hưa x ịnh; t: tuổi; th: tháng; ng: ngày

PHỤ LỤC 3

H ư ng N v hỉ ố A260 /A280 ủa ẫ ệnh nh n nghi n ứ

118

Ghi chú: Số thứ tự (STT) trong ph l c 3 tương ứng với số thứ tự và tên bệnh nhân trong ph l c 1.

PHỤ LỤC 4

Điện di sản phẩm PCR-RFLP nhuộm bạc đoạn gen mang đột biến A3243G của các

thành viên trong ba gia đình ệnh nhân mang đột biến.

Thang chuẩn DNA (1, 11, 18); s n phẩm PCR không cắt bằng HaeIII (2, 12, 19); ối

chứng dương (3 13 20); gia nh BN4 (4-10) gia nh N89 (14-17) gia nh N101

(21-25), bệnh nhân (4, 14, 21), em bệnh nhân (5), mẹ bệnh nhân (6, 15, 22), bà

ngoại/dì/cậu (8, 9, 10, 17, 24, 25) và bố bệnh nhân (7, 16, 23).

Điện di sản phẩm PCR-RFLP nhuộm bạc đoạn gen mang đột biến T14727C của các

thành viên trong hai gia đình ệnh nhân mang đột biến.

Thang chuẩn DNA (1, 8); s n phẩm PCR không cắt bằng DraI (2, 9); gia nh N7 (3-7),

gia nh N50 (10-13), bệnh nhân (3, 10), anh/chị bệnh nhân (4, 5, 11), mẹ bệnh nhân (6,

12), bố bệnh nhân (7, 13).

119

PHỤ LỤC 5

Kế ph n í h ịnh ư ng ố n py 3243G ộ iến n hệ hống iQ5 cycler (Biorad). Gia đình ệnh nhân I

Lần 1.

Lần 2.

120

Lần 3.

Gia đình ệnh nhân II

Lần 1.

Lần 2.

121

Lần 3.

Gia đình ệnh nhân III

Lần 1.

Lần 2.

122

Lần 3.

Gia đình ệnh nhân IV

Lần 1

Lần 2

Lần 3

123

Gia đình ệnh nhân V

Lần 1.

Lần 2.

Lần 3.

124