Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Giáp (Paphiopedilum malipoense) bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRỊNH THỊ TUYẾT

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI GIÁP

(Paphiopedilum malipoens) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRỊNH THỊ TUYẾT

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI GIÁP

( Paphiopedilum malipoens) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Văn Duy

THÁI NGUYÊN - 2016

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự

hướ ng dẫn của TS. Nguyễn Văn Duy. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa

từng ai công bố trong một công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Trịnh Thị Tuyết

ii

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Duy và

ThS. Nguyễn Thị Tình, Khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn

thành luận văn này.

Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo và các anh chi ̣ kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm

nuôi cấy mô tế bào thực vật , Khoa CNSH - CNTP, Trường đại học Đại học Nông Lâm

Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn thạc sĩ.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa ho ̣c - Đại học

Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Khoa ho ̣c Sự số ng và các thầy cô giáo, cán bộ trong

Khoa, đặc biệt là sự quan tâm, giúp đỡ của các anh chi ̣ kỹ thuâ ̣t viên phòng thí nghiệm

Khoa Khoa ho ̣c sự số ng.

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động

viên tạo động lực để tôi hoàn thành luận văn này.

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận được

sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể làm tốt hơn.

Tác giả luận văn

Trịnh Thị Tuyết

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC ............................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................... v DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vi DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ vii MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ...................................................... 3 4.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................... 3 4.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................... 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4 1.1. Tổng quan về phân loại và đặc điểm của lan Hài và lan Hài Giáp ............ 4 1.1.1. Đặc điểm thực vật học của lan Hài (Paphiopedilum) ......................... 4 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của lan Hài Giáp .......................................... 11 1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào .............................................................. 15 1.2.1. Các vấn đề thường gặp trong nhân giống in vitro ............................. 15 1.2.2. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô ........................... 16 1.2.3. Quy trình nhân giống in vitro ............................................................ 18 1.2.4. Ứng dụng của nuôi cấy mô trong nghiên cứu và ứng dụng trong nông nghiệp ................................................................................................ 20 1.3. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước . 21 1.3.1. Trên thế giới ...................................................................................... 21 1.3.2. Trong nước ........................................................................................ 24 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 26 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ............................................................. 26 2.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 27 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 27

iv

2.4. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu ................................................................ 28 2.4.1. Hóa chất ............................................................................................. 28 2.4.2. Thiết bị .............................................................................................. 28 2.4.3. Dụng cụ ............................................................................................. 28 2.5. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 29 2.5.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường và điều kiện nuôi cấy ................ 29 2.5.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro .......................................................... 30 2.5.3. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................. 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 33 3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1 % đến quả lan Hài Giáp ................................................................. 33 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt lan Hài Giáp ............................................................................................... 35 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp ...................................... 36 3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân nhanh chồi lan hài Hài Giáp ........................................................................................... 36 3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp ..................................................................... 39 3.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết của quả chuối xanh tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp ............................................................ 42 3.4. Kết quả nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh ...................................... 45 3.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của lan Hài Giáp ...................................................................................................... 45 3.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính tới khả năng ra rễ .............................................................................................. 48 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan Hài Giáp .......................................................................... 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 54 PHỤ LỤC ................................................................................................................

v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADN: Deoxyribonucleic acid

B5: Gamborg cs, 1976

6 - benzyl amino purine BA :

CT : Công thức

CS : Cộng sự

ĐC : Đối chứng

KC: Knudson C

MS : Murashighe và Skoog, 1962

NAA : Naphthalene acetic acid

PCR: Polymerase Chain Reaction

RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA

THT : Than hoạt tính

SH: Schenk and Hildebrandt, 1972

VW : Vacin and Went

WPM : Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các nhó m lan Hài Viê ̣t Nam theo thứ ha ̣ng bảo tồ n củ a Tổ chứ c Bảo tồ n Thiên nhiên Quố c tế (IUCN). ......................................................................... 9

Bảng 2.1: Hóa chất nghiên cứu ........................................................................... 28

Bảng 2.2: Thiết bị nghiên cứu ............................................................................. 28

Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch

HgCl2 0,1% đến quả lan Hài Giáp ...................................................................... 33

Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm

của hạt .................................................................................................................. 35

Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân nhanh lan

Hài Giáp .............................................................................................................. 37

Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA tới khả năng

nhân nhanh chồi lan Hài Giáp ............................................................................. 40

Bảng 3.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết của quả chuối xanh tới khả

năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp .................................................................... 43

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của NAA tới sự ra rễ ....................................................... 46

Bảng 3.7: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính ảnh

hưởng tới khả năng ra rễ ..................................................................................... 48

Bảng 3.8: Sự phát triển của lan Hài Giáp trên một số giá thể ngoài môi trường tự

nhiên (sau 8 tuần) ................................................................................................ 51

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình thái lan Hài Giáp ........................................................................ 13

Hình 2.1: Cây và quả lan Hài Giáp ..................................................................... 27

Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm ................................................................................. 29

Hình 3.1: Ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt sau 12 tuần ..... 36

Hình 3.2: Ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp ....... 39

Hình 3.3: Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA tới khả năng nhân nhanh chồi lan

Hài Giáp .............................................................................................................. 42

Hình 3.4: Ảnh hưởng dịch chiết của quả chuối xanh tới khả năng nhân nhanh của

lan Hài Giáp......................................................................................................... 44

Hình 3.5: Ảnh hưởng của NAA tới khả năng ra rễ của lan Hài Giáp ................. 47

Hình 3.6: Ảnh hưởng của NAA kết hợp với THT tới khả năng ra rễ của lan Hài Giáp ..... 50

Hình 3.7: Ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan

Hài Giáp ............................................................................................................. 52

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Hoa lan được con người biết đến rất sớm từ 2.800 năm TCN, nó được coi

một trong những đỉnh cao tiến hóa của các loài hoa. Hiện nay trên thế giới với

800 chi và 25.000 – 30.000 loài. Họ Lan (Orchidaceae) chiếm vị trí thứ hai sau

họ Cúc (Asteraceae) trong ngành thực vật hạt kín [20]. Vì vậy hình thái, cấu tạo

cũng như hệ thống phân loại của họ này rất đa đa dạng và phức tạp.

Việt Nam là quốc gia được đánh giá có sự đa dạng sinh học phong phú,

phong lan Việt Nam đa dạng về số loài, màu sắc và chủng loại với trên 140 loại

phong lan chia ra thành 1000 giống nguyên thủy. Chúng thường phân bố ở các

vùng rừng núi Cao Bằng, Sa Pa, Lào Cai, Huế, Hải Vân, Quy Nhơn, Kontum,

Pleiku, Ban Mê Thuật, Phan Rang, Đà Lạt, Di Linh, v.v...[13]. Trong số các loài

lan của Việt Nam có rất nhiều cây quý hiếm điển hình là giống Lan Hài

(Paphiopedilum) gồm hơn 66 loài phân bố từ Ấn Độ, New Ghine và vùng Đông

Nam Á, người Pháp gọi loài thuộc giống này là Hài Vệ Nữ Sabot de Venus và

người Anh dùng với ý nghĩa tương tự Lady's slippers [1]. Hiện nay Việt Nam đã

tìm thấy 22 loài thuộc chi Paphiopedilum trong đó có 8 loài đặc hữu có giá trị chỉ

xuất hiện tại Việt Nam như lan Hài Đỏ, lan Hài Vàng, lan Hài Tía, lan Hài Trắng,

lan Hài Vân, lan Hài Vân Duyên, lan Hài Đốm, lan Hài Lông hay lan Hài

Râu,…[1].

Lan Hài Giáp là loài lan chỉ xuất hiện ở một số tỉnh miền núi phía bắc như

Bắc Kạn, Hà Giang, Hòa Bình, Lạng Sơn, Sơn La,…Loài này chỉ sinh sống tại

các khu rừng nguyên sinh rậm, thường xanh cây lá rộng hỗn giao và cây lá kim

trên núi đá vôi kết tinh bị bào mòn mạnh ở độ cao từ 600 đến 1200m [16]. Đây

là một loài lan Hài đặc biệt có hoa đẹp tao nhã với lá đài và cánh hoa xanh lá

cây, môi xám, xanh nhạt và nhị lép trắng với chóp màu nâu tía, hoa có mùi thơm

táo nhẹ. Chúng có lá rộng kẻ ô chữ nhật hoặc đốm khảm xanh lá cây tươi hoặc

xanh thẫm, đốm tím tía ở mặt dưới và cụm hoa thường dài mang một hoa to đơn

2

độc [1]. Chính vẻ đẹp tao nhã, có giá trị thẩm mỹ cao nên rất được thế giới ưa

chuộng dẫn đến tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài Giáp ồ ạt không kiểm

soát được, khiến các cá thể càng khan hiếm trong tự nhiên. Đồng thời với tình

trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan Hài Giáp càng

biến mất nhanh chóng. Trước tình hình đó lan Hài Giáp đã được xếp vào nhóm

nguy cấp (EN) trong Sách đỏ Việt Nam và nhóm IA (các loài bị nghiêm cấm

khai thác và sử dụng vì mục địch thương mại) trong nghị định 32 năm 2006 của

Chính Phủ [16].

Đặc thù riêng của lan Hài Giáp là cây sinh trưởng chậm, tỷ lệ nảy mầm của

hạt trong tự nhiên thấp [20] vì vậy việc nghiên cứu nhân giống lan Hài rất được

chú trọng nhằm mục đích thương mại và bảo tồn nguồn gen thực vật quý hiếm.

Trước đây các nhà nghiên cứu đã tiến hành nhân giống các loài lan Hài bằng

nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương

pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như chất lượng cây thấp, không đồng đều

và số lượng cây ít [6]. Để khắc phục được điều này, phương pháp nhân giống in

vitro đã ra đời nhằm khắc phục những hạn chế trên. Phương pháp này cho số

lượng cây lớn, chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh, đây là điều mà phương

pháp truyền thống không thực hiện được. Hiện nay nhân giống bằng kỹ thuật

nuôi cấy in vitro đang phát triển mạnh mẽ có thể tạo ra số lượng cây con lớn,

sạch bệnh, ổn định về mặt di truyền trong một thời gian ngắn và đáp ứng được

giá cả phải chăng của thị trường được coi là một giải pháp lý tưởng để bảo tồn

loài lan Hài khỏi nguy cơ bị tuyệt chủng [6].

Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu khả năng

nhân nhanh lan Hài Giáp (Paphiopedilum malipoense) bằng phương pháp in

vitro”

2. Mục đích nghiên cứu

- Xác định được ảnh hưởng của môi trường và chất kích thích sinh trưởng

tới quá trình nhân giống in vitro lan Hài Giáp.

3

- Xác định được giá thể thích hợp để đưa cây từ trong ống nghiệm ra môi

trường tự nhiên.

3. Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu khử trùng quả lan Hài Giáp tạo mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm.

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt lan Hài

Giáp.

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng và chất hữu

cơ đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi lan Hài Giáp trong

ống nghiệm.

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ chồi

lan Hài Giáp trong ống nghiệm.

3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của

cây con in vitro ngoài vườn ươm.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu xác định được môi trường thích hợp cho nhân giống lan

Hài Giáp bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh giá được ảnh

hưởng của các chất kích thích sinh trưởng, thành phần môi trường nuôi cấy và

thời gian khử trùng mẫu cấy, bổ sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các loại

cây lan khác.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu sẽ cố gắng cung cấp được số lượng cây giống có chất

lượng cao, đồng đều cho sản xuất.

4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về phân loại và đặc điểm của lan Hài và lan Hài Giáp

1.1.1. Đặc điểm thực vật học của lan Hài (Paphiopedilum)

1.1.1.1. Phân loại

Về mặt thực vật ho ̣c, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là:

- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thườ ng đươ ̣c go ̣i là Hài Vê ̣ Nữ phân

bố ở các vù ng ôn đớ i.

- Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25

loài phân bố ở vù ng nhiệt đớ i Châu Mĩ.

- Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiê ̣t đớ i châu Á từ Nam

Ấ n Độ và Đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon.

Ở Viê ̣t Nam các loài lan Hài đều thuô ̣c giớ i Thực vâ ̣t (Plantae), ngành Ha ̣t kín (Angiospermatophyta), lớ p Một lá mầm (Monocotyledoneae), phân lớ p Hành (Liliidae), bô ̣ Lan (Orchidales), ho ̣ Lan (Orchidaceae), họ phu ̣ Epidendroideae,

tông Cypripedioideae, chi Paphiopedilum [1].

1.1.1.2. Nguồn gố c

Chi Paphiopedilum có nguồ n gố c từ vùng lu ̣c đi ̣a Đông Nam Á trong đó có Viê ̣t Nam. Các loài nguyên thuỷ nhất của chi này đươ ̣c tìm thấy chủ yếu ở Trung Quốc và miền Bắc Việt Nam, mỗi loa ̣i trong chi này đều có khu phân bố rất ha ̣n

chế [1].

Hầu như tất cả các loài lan đều bắ t nguồ n từ các tổ tiên kiểu hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vò ng ngoài go ̣i là ba lá đài và ba mảnh bao vò ng

trong go ̣i là ba cánh hoa) và sáu nhi ̣ đư ̣c (ba nhi ̣ đư ̣c ở vò ng ngoài và ba nhi ̣ đư ̣c

ở vò ng trong). Xu hướ ng tiến hoá củ a ho ̣ Lan là giảm số lươ ̣ng nhi ̣ đư ̣c và sự dính liền giữa nhi ̣ đư ̣c hữu thu ̣ vớ i nhi ̣ cái là sự biến đổ i hoa cơ bản nhất dẫn đến sư ̣ tiến hoá củ a ho ̣ Lan. Sư ̣ giảm liên tu ̣c số lươ ̣ng nhi ̣ đư ̣c dẫn đến sư ̣ hình thành

5

các nhó m lan có ba, hai hay mô ̣t nhi ̣ đư ̣c tồ n ta ̣i trong hoa. Trong ho ̣ chi lan Hài

(thuô ̣c tông Cypripedioideae) là dò ng tiến hoá có hai nhi ̣ đư ̣c cò n tồ n ta ̣i trong

hoa [1]; [20].

1.1.1.3. Đă ̣c điểm hình thá i

Theo Nguyễn Thiện Tịnh (2001), các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có hình dạng bên ngoài rất đa da ̣ng, chúng mang những đă ̣c điểm hình thái chung như sau [20]:

- Da ̣ng cây: là các loài thân cỏ có kích thướ c trung bình với thân mang nhiều lá mo ̣c thành hai hàng xếp thành hình qua ̣t, đôi khi có da ̣ng thân bò . Tất cả các loài đều có thân rễ nhưng đa số rất ngắn.

- Lá: thường có hình trứng ngươ ̣c hay bầu dục thuôn và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ 3-50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoă ̣c khảm bở i các mảng đâ ̣m nha ̣t không đều vớ i các gân màu xanh lá nổ i rõ. Mă ̣t dưới lá có các đố m tím dày đă ̣c hoă ̣c vết tím xỉn chỉ thấy rõ ở gần gố c lá. Lá củ a các loài điển hình cho điều kiê ̣n số ng khô đều dày, mo ̣ng nướ c và cứ ng.

- Cu ̣m hoa: thườ ng thẳng đứng hay cong, mô ̣t số loài có cuố ng hoa nằm ngang, mô ̣t số loài lại có cuố ng hoa chú c xuố ng, nhưng hầu hết các loài đều có cuố ng hoa dựng đứng. Phần lớn các loài chỉ có mô ̣t hoa riêng lẻ, tuy nhiên cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, song rất hiếm. Tru ̣c cu ̣m hoa có lông tơ dầy và ngắn hay có lông nhung hoă ̣c nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng

rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến

hình bầu dục tròn. Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa

nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở

mô ̣t số loài có lá hoa nhẵn.

- Hoa: gồ m hai lá đài ở vò ng ngoài, mô ̣t lá đài lưng, mô ̣t lá đài hơ ̣p và ba cánh hoa ở vò ng trong. Lá đài lưng thườ ng lớ n, hướ ng thẳng lên trên và thườ ng

6

nổ i bâ ̣t vớ i các va ̣ch hay chấm ở mă ̣t trong. Lá đài lưng nằm đố i diê ̣n vớ i lá đài hơ ̣p ở vi ̣ trí thấp hơn và hướ ng xuố ng phía dướ i. Lá đài hơ ̣p nằm phía sau củ a môi thườ ng có mô ̣t màu tố i xỉn và kém nổ i bâ ̣t hơn so vớ i lá đài lưng. Cả hai lá đều thườ ng có lông tơ dày ở mă ̣t ngoài.

Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè

xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay

tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa

giữa thứ ba biến da ̣ng rõ rê ̣t thành mô ̣t môi giố ng như cái bao hoă ̣c hình chiếc hài. Môi dạng tú i sâu và phồ ng lên, hình giầy, có lông ở mă ̣t trong và nhẵn ở mă ̣t ngoài.

Nhi ̣ bất thụ củ a vò ng ngoài và nhụy cái hơ ̣p thành cô ̣t nhi ̣ – nhụy. Hai nhị đư ̣c hữu thu ̣ của vò ng trong có chỉ nhi ̣ ngắ n dính liền ở phía sau nú m nhụy và hai bên cuốn cô ̣t. Bầu dưới, mô ̣t ô, đỉnh noãn bên là điểm đă ̣c trưng củ a chi này. Hầu hết các loài lan Hài bầu có lông tơ, hình tru ̣, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn.

- Quả: da ̣ng quả nang, khô, dài, có mô ̣t ô với ba van rô ̣ng và ba van he ̣p. Quả mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứ t. Quả thường chín trong điều kiên tự nhiên sau khi

thu ̣ phấn từ sáu đến mười tháng.

- Ha ̣t: có hình bầu dục, hình con suố t chỉ ngắn,da ̣ng thuôn dài hay he ̣p và thường có chiều dài từ 0,4 – 1,1 mm, phôi nhỏ dài từ 0,3 – 0,4 mm. Ha ̣t không có nô ̣i nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điều kiê ̣n tự nhiên.

- Rễ: rễ chùm, có một lớ p mô xố p bo ̣c xung quanh các rễ thâ ̣t, lớ p màng xố p này có vai trò trong viê ̣c giữ nướ c và ngăn chă ̣n ánh sáng gay gắt. Sau khi rễ trưởng thành thì có da ̣ng sơ ̣i mảnh vớ i hê ̣ floem phát triển ma ̣nh và không có các bú i nấm xung quanh rễ.

1.1.1.4. Sinh thá i

Các loài lan Hài ở Viê ̣t Nam có thể chia thành hai nhó m riêng. Mô ̣t nhó m phân bố ở vù ng nú i đá vôi phía Bắc Viê ̣t Nam từ đô ̣ cao mă ̣t nướ c biển lên đến

7

1600m, nhó m cò n la ̣i phân bố ở khu vực có đá me ̣ silicat, đá phiến và cát kết ở đô ̣ cao từ 700m – 2200m. Ngoài ra có mô ̣t vài cá thể trong nhó m này cò n mo ̣c bám ở các khe nứ t hay rìa củ a các vách nú i dựng đứ ng đá granit [16].

Lan Hài củ a Viê ̣t Nam có thể số ng trên đất, bám đá và phu ̣ sinh mùn. Các loài sống trên đất thườ ng mo ̣c ở nơi có ít ánh sáng củ a tán cây rừ ng, ở nơi sườ n núi dố c, các nền đất có nhiều lá rơi bi ̣ phân huỷ ma ̣nh và giàu chất mù n. Các loài lan Hài mo ̣c trên đá thường mo ̣c dướ i bóng cây củ a kiểu rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá và ngay bên dướ i các đườ ng đỉnh. Các loài phu ̣ sinh mù n chủ yếu số ng bám trên vỏ cây gỗ trong các vù ng rừ ng mây mù ẩm đô ̣ cao 1200m – 1500m [16].

Ta ̣i Viê ̣t Nam lan Hài thường phân bố ở vùng có lươ ̣ng mưa lớ n, ẩm đô ̣ cao. Tuy nhiên do đặc trưng là vù ng khí hậu nhiê ̣t đới gió mù a nên chú ng thường phải

trải qua mô ̣t giai đoa ̣n khô ha ̣n. Sự xuất hiê ̣n lá dày, dai và mo ̣ng nướ c là hướ ng thích nghi tốt để cây có thể sống só t đươ ̣c qua đơ ̣t khô ha ̣n đi ̣nh kỳ và chú ng sẽ nhanh chó ng phu ̣c hồ i khi mùa mưa trở la ̣i. Đô ̣ ẩm xung quanh rễ, kiểu đất, đô ̣ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thu ̣ phấn và cường đô ̣ ánh sáng là các nhân tố quan tro ̣ng trong sự hình thành và phát triển củ a quần thể lan Hài.

Trong rừ ng nguyên sinh lan Hài phân bố đều nhau ở các hướ ng củ a sườ n nú i. Nhưng trong các vù ng rừ ng đã bị xuố ng cấp, lan Hài có khuynh hướ ng phát triển ở các sườn núi phía Bắc, Đông Bắc và Tây Bắc. Ngày nay thườ ng chỉ tìm thấy lan Hài mọc thành từ ng đám nhỏ. Các nơi số ng tự nhiên bi ̣ phá huỷ bở i con người, sự thay đổ i các điều kiê ̣n môi trường và viê ̣c thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính gây ra sự tuyê ̣t chủ ng nhanh chó ng của lan Hài trên khắp các vù ng củ a Viê ̣t Nam [5]; [16].

1.1.1.5. Hiê ̣n tra ̣ng cây lan Hà i Viê ̣t Nam

Lan Hài là chủ ng ho ̣ lan có giá tri ̣ thương ma ̣i cao, được sưu tầm và tìm kiếm rất nhiều. Vớ i sư ̣ hiê ̣n hữu củ a hơn 20 loài thuô ̣c chi Paphiopedilum, Viê ̣t Nam là mô ̣t trong các quố c gia có nguồ n lan Hài tư ̣ nhiên phong phú . Không

8

những phong phú về chủ ng loa ̣i, Viê ̣t Nam cò n có nhiều loài lan đă ̣c hữu có giá tri ̣ thẩm mĩ cao đươ ̣c thế giớ i ưa chuô ̣ng [15]. Vì vậy tình tra ̣ng thu thâ ̣p và xuất khẩu lan Hài mô ̣t cách ồ a ̣t, không kiểm soát dẫn đến viê ̣c lan Hài ngày càng hiếm trong tự nhiên đồ ng thờ i vớ i tình tra ̣ng môi trườ ng tư ̣ nhiên bi ̣ khai thác ca ̣n kiê ̣t như hiê ̣n nay lan Hài càng biến mất nhanh chó ng.

Dựa trên những nghiên cứu thực đi ̣a gần đây, tình tra ̣ng bảo tồ n các loài lan Hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ ha ̣ng về mức đô ̣ đe doa ̣ tuyê ̣t chủ ng củ a tổ chứ c bảo tồ n thiên nhiên Quốc tế (IUCN) đươ ̣c tổ ng kết ở bảng 1.1.

9

Bả ng 1.1: Cá c nhó m lan Hài Viê ̣t Nam theo thứ ha ̣ng bả o tồn củ a Tổ chứ c Bả o tồn Thiên nhiên Quố c tế (IUCN).

Tên loài (tiếngviê ̣t)

Tên loài (tiếng Latinh) Tình trạng

P. vietnamense Hài Bóng

Đã bi ̣ tuyê ̣t chủ ng ngoài thiên nhiên

P. delenatii Hài Đỏ

Đang bị tuyê ̣t chủ ng trầm trọng Đang bi ̣ tuyê ̣t chủ ng

Sắ p bi ̣ tuyê ̣t chủng

Chưa rõ tên go ̣i Hài Lô ̣c Hài Vân Hài Xoắn Hài Hương Lan Hài Đuôi công Hài Hằng Hài Hê Len Hài Henry Hài Herman Hài Jack Hài Giáp Hài Mố c Hồng Hài Tía Hài Trần Liên Hài Cánh Sen Hài Gia Đi ̣nh Hài Tiên biến di ̣ Hài Tiên Hài Lông

P.  aspersum P.barbigerum var. lokianum P. callosum P. dianthum P. emersonii P. gratrixianum P. hangiannum P. helenae P. henryanum P.  herrmannii P. malipoense var. jackii P. malipoense P. micranthum P. purpuratum P. tralienianum P. appletonianum P. concolor P. hirsutissimum var. chiwuawnum P. hirsutissimum var. esquirolai P. villosun var. annamense P.  affine P.  datalanse Thiếu dẫn liệu

P. villosum var. boxalli

Hài Hoà Chưa rõ tên go ̣i Chưa rõ tên go ̣i

(Nguồn: Averyanov và cs 2004 )

10

Trên thực tế mức đô ̣ đe doa ̣ tuyê ̣t chủ ng đố i vớ i tất cả các loài lan Hài Viê ̣t Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bi ̣ thay đổ i nhiều trong thờ i gian gần đây do sự suy giảm nhanh các quần thể được biết. Trong những năm gần đây, qua các đợt điều tra

thực địa đã phát hiê ̣n ra tốc đô ̣ phá huỷ ma ̣nh mẽ trên diê ̣n rô ̣ng củ a những khu rừ ng cò n só t la ̣i củ a Viê ̣t Nam chủ yếu trên các đỉnh nú i đá vôi [1]; [16]; [20].

Trướ c tình hình lan Hài ca ̣n kiê ̣t ngoài thiên nhiên, nhiều chương trình quố c gia về bảo tồ n loài hoa quý này đã đươ ̣c triển khai chủ yếu là thu thâ ̣p, phân loa ̣i, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồ n môi trườ ng số ng tự nhiên củ a chú ng. Một công trình hơ ̣p tác quố c tế về lĩnh vực này là mô tả các giố ng lan Hài ở Viê ̣t Nam của nhó m tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lô ̣c và Nguyễn Tiến Hiê ̣p năm 2004 [1].

Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam.

Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như:

- Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà

(Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum.

- Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo

tồn loài P. callosum.

- Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng

Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn

P.dalatensis.

- Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà

Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P.micranthum.

- Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P.emersoii,

P.hangianum, P. malipoense varijackii.

- Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài

P.gratrixianum.

- Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae.

11

- Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha

đang bảo tồn loài P. malipoense.

Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa ho ̣c đã nghiên cứ u và ứ ng du ̣ng phương pháp

nuôi cấy mô tế bào thực vâ ̣t in vitro nhằm nhân nhanh số lươ ̣ng lớ n lan Hài. Đầu

tiên phải kể đến PGS. TS. Dương Tấn Nhựt ngườ i đầu tiên nuôi cấy thành công

lan Hài Hồ ng năm 2005. Sau đó đã có nhiều nhà nghiên cứ u khác đã nuôi cấy in

vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằng, hài Tam Đảo bằng các

phương pháp nuôi cấy mô khác nhau.

1.1.2. Đặc điểm thực vật học của lan Hài Giáp

1.1.2.1. Nguồn gố c và sự phân bố

Năm 1954, hai nhà thực vật học Trung Quốc là Chen S. C. và Tsi Z. H. đã đưa ra bản mô tả về Hài Giáp (Paphipedilum malipoense) dựa trên tiêu bản thực

vật do Feng K. M. thu thâ ̣p đươ ̣c năm 1947 ở gần Malipo, đông nam tỉnh Vân

Nam sát biên giới Việt Nam. Tiêu bản gốc được lưu giữ tại phòng Tiêu bản thực

vật thuộc Viện Thực vật Bắc Kinh. Tuy đươ ̣c mô tả năm 1954 nhưng chỉ được đưa vào trồ ng từ năm 1984, từ đó Hài Giáp đươ ̣c xuất đi khỏ i Trung Quốc và đươ ̣c

trồ ng phổ biến từ năm 1984 .

Mặc dù đã có một lượng lớn được xuất ra khỏi Trung Quốc nhưng trong một

thời gian dài sự phân bố tự nhiên và nơi sống của chúng vẫn chưa được biết rõ

ràng. Ban đầu nó được thu từ những ngọn núi gần thị trấn Malipo, bên cạnh địa

điểm thu mẫu chuẩn này, quần thể tự nhiên của loài này cũng được quan sát thấy

dọc theo ranh giới nam của cao nguyên đá vôi Quý Châu ở độ cao 800-1100 m,

về phía tây của tỉnh Quảng Tây. Rất nhiều quần thể củ a loài lan này đươ ̣c phát hiê ̣n ở Bắc Viê ̣t Nam thông qua các đơ ̣t nghiên cứ u thực đi ̣a năm 1994 – 1997

[20]; [42].

Lan Hài Giáp phân bố ở phía Bắc Viê ̣t Nam (Bắc Kạn, Hà Giang, Hòa Bình, Lạng Sơn, Sơn La, Thanh Hoá và Tuyên Quang) trong các khu rừ ng nguyên sinh

12

râ ̣m, thườ ng xanh, nử a ru ̣ng lá hỗn giao và rừ ng cây lá kim trên nú i đá vôi bi ̣ bào mò n ma ̣nh ở đô ̣ cao 600 – 1200 m [20].

1.1.2.2. Hình thá i

Theo Nguyễn Thiện Tịnh (2001) lan Hài Giáp có đặc điểm [20]:

- Da ̣ng thân: thân cỏ mọc trên đất hay đá, có thân rễ ít nhiều kéo dài vớ i

đườ ng kính 2 – 3,5 mm

- Da ̣ng lá: có 4 – 6 lá mọc thành 2 hàng, lá dai, gần dựng đứng, có hình bầu dục

thuôn hay bầu dục hẹp, nhọn không đối xứng ở chóp, dài 10 – 16 cm, rộng 2,5 - 5

cm, có đốm khảm xanh lá cây tươi hoặc xanh sẫm ở mặt trên của lá, có đốm tím dày và gờ ở mặt dưới củ a lá, cuố ng lá dài 2 – 4 cm, có lông rìa trắng ở mép gố c.

- Da ̣ng hoa:

+ Cụm hoa dài 30 – 50 cm, cuống xanh, có đốm tía nâu hoặc lông tơ trắng,

lá hoa hình trứng hay mũi giáo hẹp, dài khoảng 1,5 cm, có lông rìa trắng ở mép,

lông tơ trắng ở mặt ngoài. Hoa rộng 8 – 12 cm, có mù i thơm ngọt dịu, lá đài và cánh hoa có màu xanh táo, có đốm và sọc tím – hồng, môi vàng hoặc xám xanh nhạt, có những đốm tím hồng ở mặt trong, nhị lép trắng tuyền, nâu thẫm hạt dẻ ở

nửa trên, cuống hoa và bầu dài khoảng 4 cm, có lông trắng và mở ở chóp.

+ Lá đài lưng hình trứng rộng tới hình mũi giáo – bầu dục với mũi nhọn ở

chóp, dài 4,4 – 7,1 cm, rộng 1,8 – 4,5 cm, có lông tơ trắng lưa thưa ở mặt trong,

không có ở bên ngoài.

+ Lá đài hợp hình trứng rộng tới hình mũi giáo - trứng, nhọn hoặc đôi khi

có 2 răng ở chóp, 2 gờ ở lưng, dài 3,8 – 5,3 cm, rộng 2,4 – 4,8 cm.

+ Cánh hoa hình trứng, hơi nhọn, dài 4 – 7,1 cm, rộng 3,4 – 5,1 cm, có lông

tơ trắng ở gốc, lông nhung trắng ở mặt trong.

13

+ Môi nằm ngang, hình túi sâu, dài 4,5 – 6,5 cm, rộng 3,8 – 5,4 cm, gần

như hình cầu, mép không cuộn vào trong, có lông tơ trắng phía trong gốc, lông

mịn bên ngoài.

+ Nhị lép lồi, từ hình trứng rộng tới thuôn, dài 13 – 14 mm, rộng 11 – 13

mm, cụt ở chóp, gần như không có cuống, có lông mép trắng và lông nhung ở nửa

dưới, có gờ ở lưng, có bướu lồi tròn trên bề mặt ở nửa trên.

- Dạng quả: da ̣ng quả nang dài, 3 gờ , hình tru ̣, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh

nứ t. Quả chín trong điều kiê ̣n tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng.

- Dạng rễ: Rễ chù m, màu nâu.

Hình 1.1: Hình thái lan Hài Giáp ( Nguồn: Nguyễn Thiện Tịnh 2001 [20])

14

1.1.2.3. Cá c điều kiê ̣n cơ bả n để nuôi trồng giố ng lan Hài Giáp [13]; [15]

- Nhiê ̣t độ: Theo quy luâ ̣t chung những cây có lá màu xanh thường thích số ng ở nơi có nhiê ̣t đô la ̣nh đến trung bình, ban đêm là từ 13 – 16°C, ban ngày là 18 – 24°C. Các loài Hài có lá vằn thích hơ ̣p vớ i điều kiê ̣n nhiê ̣t từ trung bình đến ấm, ban đêm là 16 – 18°C, ban ngày là 21 – 25°C.

- Á nh sáng: Lan Hài không cần ánh sáng mă ̣t trờ i đầy đủ , hầu hết lan Hài ưa ánh sáng yếu. Nếu lá bi ̣ vàng hoặc phát hoa ngắn chứ ng tỏ chú ng đang dư

ánh sáng, nếu lá màu xanh đâ ̣m và mềm hoă ̣c phát hoa dài, yếu, chú ng đang

thiếu ánh sáng.

- Đô ̣ ẩm không khí: không khí ẩm và lưu thông tố t là rất cần thiết, nhất là trong mù a hè giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cây không bi ̣ khô quá nhanh. Độ ẩm có thể đươ ̣c nâng lên bằng cách đă ̣t châ ̣u cây lên trên các

khay sỏ i nhe ̣ với 50% đô ̣ ẩm là lý tưở ng.

- Phân bó n: Có thể bó n phân NPK với tỉ lê ̣ 20:20:20 hoă ̣c 14:14:14, bổ sung khoáng Ca2+ 40mg/l và Mg2+ 20 – 30 mg/l. Tưới nước đậm trướ c và sau khi bó n phân, nếu thấy đầu lá bi ̣ nâu khô thì nên dừ ng hẳn viê ̣c tưới phân. Sang châ ̣u khi giá thể trồ ng có dấu hiê ̣u mu ̣c nát.

- Giá thể trồng: P. malipoense có thể trồ ng trên giá thể như dớn, xơ dừa, sỏi, vỏ thông,.. có thể tướ i thêm phân bó n 2 lần/ tuần trong suố t mù a sinh trưở ng củ a cây lan.

1.1.2.4. Cá c phương phá p nhân giố ng vô tính lan Hài Giáp

- Phương pháp tách chiết thông thườ ng: Lan Hài Giáp là loài đơn thân nên chỉ có thể tách chồ i non ra khỏ i cây me ̣, trồng vào chính giữa châ ̣u mới. Cần cô ̣t chă ̣t cây vào châ ̣u bằng một cây tựa sau đó phun mô ̣t dung di ̣ch NAA 0,1 ppm và vitamin B1 và treo cây vào nơi thoáng mát. Sau khi cây bén rễ thì bổ sung thêm

chất trồ ng vào châ ̣u sau đó đă ̣t cây vào nơi có điều kiê ̣n ánh sáng thích hơ ̣p cho sự phát triển lâu dài củ a cây [22].

15

- Phương pháp cấy mô: đây là phương pháp duy nhất hiê ̣n nay có thể nhân giống lan Hài trên quy mô công nghiê ̣p, cây con đươ ̣c sản xuất hoàn toàn giố ng

nhau từ mô ̣t cây bố me ̣. So vớ i phương pháp tách chiết thông thườ ng có tố c đô ̣ phát triển 1cây/năm thì phương pháp nuôi cấy mô sẽ sản xuất được khoảng 4 triê ̣u cây/năm. Các loài lan Hài thườ ng đươ ̣c nuôi cấy trên môi trườ ng Murashige & Skoog 1962, Heller, Vacin & Went có bổ sung chất điều hoà sinh trưởng như NAA, 2,4D, BA, TDZ, Kinetin,…trong điều kiện vô trùng hoàn toàn. Nhờ tiến bộ khoa học ngày nay ngườ i ta có thể cấy nhiều bô ̣ phâ ̣n khác nhau củ a cây lan để hình thành các thể giố ng protocorm như đỉnh sinh trưở ng, chồ i bên, co ̣ng hoa, lá, đố t thân hoặc rễ [10].

1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào

1.2.1. Các vấn đề thường gặp trong nhân giống in vitro

1.2.1.1. Tính bất định về mặt di truyền

Tính bất định về mặt di truyền là do tác động của một số chất kích thích sinh

trưởng, tần số biến dị thường khác nhau và không lặp lại. Tần số biến dị trong

nuôi cấy mô sẹo thường cao hơn nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Tần số biến dị xảy ra

còn phụ thuộc vào các yếu tố: Kiểu di truyền hay giống cây nuôi cấy, loại mô cấy,

số lần cấy chuyển nhiều hay ít [22].

1.2.1.2. Sự nhiễm mẫu

Do môi trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng cho mô tế bào thực vật

phát triển đồng thời nó cũng là môi trường thích hợp cho các loài nấm và vi khuẩn

phát triển. Sự nhiễm mẫu xảy ra có thể là do nồi hấp không đạt yêu cầu, yêu cầu

về điều kiện vô trùng trong phòng cấy không đảm bảo hoặc do thao tác của người

nuôi cấy [22].

1.2.1.3. Sự hóa thủy tinh thể

Hiện tượng thủy tinh thể là một dạng bệnh lí của cây bị mất nước khi chuyển

cây từ môi trường in vitro ra môi trường ngoài. Những biện pháp hạn chế sự

16

thủy tinh thể: Giảm bớt sự hút nước của cây bằng cách tăng nồng độ đường trong

môi trường cấy hoặc dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao, tránh gây thương

tổn trên mẫu cấy khi khử trùng, giảm hàm lượng ethylen trong bình nuôi cấy

bằng cách thông gió tốt, tăng cường ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy [22].

1.2.1.4. Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu

Trong quá trình nuôi cấy mô thường thấy hiện tượng hóa nâu hay hóa đen

mẫu khiến cho sự sinh trưởng của mẫu bị chậm lại thậm chí hư mẫu. Hiện tượng

này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hay polyphenol, chúng có nhiều

trong mô già hơn mô non. Các biện pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu: Tách các

phân tử phenol ra khỏi môi trường, ngăn chặn hoạt động của enzym phenolaza,

giảm lượng phenol có sẵn trong mẫu bằng môi trường lỏng giống môi trường rắn,

chuẩn bị mẫu có vết cắt nhỏ, gây vết thương nhỏ nhất trên mẫu khi khử trùng, sử

dụng mô mẫu cấy nhỏ từ mô non [22].

1.2.2. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô

1.2.2.1. Ưu điểm

- Tạo ra số lượng lớn cây đồng nhất về mặt di truyền.

- Có thể nhân giống từ bất cứ bộ phận nào của cây.

- Khắc phục được đặc tính khó nhân giống, hệ số nhân giống thấp và tính bất

thụ ở cây trồng, rút ngắn thời gian nhân giống.

- Kiểm soát được các yếu tố gây bệnh cho cây, tạo ra các dòng cây sạch bệnh.

- Ứng dụng vào lĩnh vực di truyền nhằm tạo ra những giống mới mà phương

pháp truyền thống không làm được như: giống đơn bội, giống đa bội,…

- Là công cụ giúp bảo tồn và phát triển nguồn gen thực vật.

- Là công cụ để nghiên cứu đặc tính sinh lí thực vật.

- Cảm ứng được sự trẻ hóa của mô, do vậy sự sinh trưởng của những cây

nuôi cấy in vitro thường mạnh hơn vì chúng đã được trẻ hóa và sạch bệnh.

17

- Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống ex vitro.

- Một số cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây bất

thụ đực, cây bất thụ do đột biến,… có thể được duy trì và nhân giống nhờ phương

pháp nhân giống in vitro.

- Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân

hàng gen.

- Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu dụng trong việc lai soma:

+ Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp ( nguồn dinh

dưỡng và điều kiện môi trường) nên có thể sản xuất cây con quanh năm.

+ Có thể sử dụng cây mẹ in vitro để sử dụng cho các bước nhân giống tiếp theo.

+ Nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng mẫu cấy ban đầu rất nhỏ nên có điều kiện

đểchọn mẫu được kỹ càng.

+ Các cây sạch bệnh có thể dễ dàng trao đổi với các nơi khác nhau do cây có

kích thước nhỏ và không trồng trong đất [2]; [9].

1.2.2.2. Nhược điểm

- Việc nhân giống in vitro đòi hỏi có kỹ thuật cao, phòng nuôi cấy yêu cầu

về trang thiết bị đắt tiền, yêu cầu cao về mức độ vô trùng.

- Kiểu gen thực vật không ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy.

- Đặc biệt đối với một số loại cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện.

- Việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm rất khó thực hiện. Cây dễ bị

héo do khí khổng hoạt động không ổn định, cây rất dễ bị sâu bệnh tấn công, vì

vậy giá thể dùng làm môi trường sống của cây cần được xử lí cẩn thận. Tỉ lệ sống

của cây con khi chuyển ra vườn ươm rất thấp.

- Đối với một số mô, việc vô trùng mẫu trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện.

- Khả năng tái sinh cây có thể bị mất do việc cấy chuyền mô sẹo nhiều lần.

18

- Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm giá thành

của sản phẩm tăng cao [2]; [9].

1.2.3. Quy trình nhân giống in vitro [13]

1.2.3.1. Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tính và tính tra ̣ng củ a cây me ̣ ban đầu nên trong giai đoạn này cần chọn lọc cây mẹ cẩn thâ ̣n. Cây mẹ

thườ ng là cây có nhiều đă ̣c tính ưu viê ̣t, khoẻ, có giá trị kinh tế cao. Sau đó , chọn cơ quan để lấy mẫu thườ ng là mô non, đoa ̣n thân có chồ i ngủ, lá non hoă ̣c hoa non... Mô cho ̣n để nuôi cấy thường là mô có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi cấy sa ̣ch bê ̣nh, giữ được các đă ̣c tính sinh ho ̣c quý củ a cây me ̣, ít nguy cơ biến dị. Tuỳ theo điều kiện, giai đoa ̣n này có thể kéo dài 3-6 tháng [16].

1.2.3.2. Thiết lập hệ thống cấy vô trùng

Là giai đoạn chuyển mẫu vâ ̣t từ ngoài vào môi trường nuôi cấy để tạo

nguyên liệu sa ̣ch bê ̣nh cho nhân giố ng, giai đoạn này đươ ̣c tiến hành theo các bướ c: Khử trù ng bề mă ̣t mẫu vâ ̣t và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy. Cấy mẫu vật vào ống nghiê ̣m hoă ̣c bình nuôi cấy có sẵn môi trườ ng nhân ta ̣o (giai đoa ̣n này là giai đoa ̣n cấy mẫu in vitro). Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm, virus sẽ được nuôi trong phòng nuôi cấy vớ i điều kiện nhiệt độ ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất đi ̣nh, từ mẫu nuôi cấy đã bắ t đầu xuất hiê ̣n các cu ̣m tế bào hoặc các cơ quan hoă ̣c các phôi vô tính. Giai đoa ̣n

này phu ̣ thuô ̣c vào từng đố i tượng đem nhân giố ng, thông thường kéo dài từ 2 – 12 tháng hoă ̣c ít nhất 4 lần cấy chuyển [16].

1.2.3.3. Nhân nhanh chồi

Đây là giai đoa ̣n sản xuất cây nhân giố ng quyết đi ̣nh hiê ̣u quả củ a quá trình nuôi cấy mô, cây đươ ̣c nhân nhanh theo nhu cầu củ a ngườ i nuôi cấy. Khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra, từ đó nhâ ̣n đươ ̣c các cu ̣m chồ i và các phôi vô tính sinh trưở ng tố t trong quá trình nuôi cấy sẽ bướ c vào giai đoa ̣n sản xuất. Ngườ i ta cần ta ̣o ra

19

tố c đô ̣ nhân nhanh cao nhất trong điều kiê ̣n nuôi cấy. Thành phần và điều kiện

môi trườ ng cần tố i ưu hoá để ta ̣o đươ ̣c mu ̣c tiêu nhân nhanh. Đố i vớ i môi trường nhân chồ i, ngườ i ta sử du ̣ng các chất kích thích sinh trưở ng thuô ̣c nhó m cytokinin (BAP, kinetin) vớ i nồ ng đô ̣ khác nhau tuỳ từ ng đố i tươ ̣ng cây. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồ i thườ ng trong khoảng 1 – 2 tháng tuỳ loài cây, tỷ lệ nhân nhanh khoảng 2 – 8 lần sau mô ̣t lần cấy chuyển. Nhìn chung giai đoạn này thường kéo dài 10 – 36 tháng. Giai đoa ̣n nhân nhanh chồ i từ mô ̣t vài chồ i ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh sự hình thành biến dị soma.

1.2.3.4.Tạo rễ

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát triển rễ tự sinh, nhưng thông thường các chồ i này phải cấy chuyển sang mô ̣t môi trườ ng khác để kích thích tạo rễ. Đối vớ i môi trường tạo rễ, người ta thường sử du ̣ng chất kích thích sinh trưở ng thuô ̣c nhó m auxin như NAA, IAA, IBA. Thông thườ ng giai đoa ̣n này kéo dài 2 – 8 tuần tuỳ đối tươ ̣ng. Khi cây có đủ các bô ̣ phâ ̣n thân, lá, rễ vớ i kích thích nhất định đảm bảo cho sinh trưở ng, phát triển bình thường ngoài tự nhiên ngườ i ta mớ i tiến hành giai đoạn tiếp theo là đưa cây ra ngoài môi trườ ng

tự nhiên.

1.2.3.5. Chuyển cây ra đất trồng

Đây là giai đoa ̣n đầu cây đươ ̣c chuyển từ điều kiê ̣n vô trù ng trong ố ng nghiê ̣m ra ngoài môi trườ ng tự nhiên, giai đoa ̣n này quyết đi ̣nh khả năng ứ ng du ̣ng củ a quy trình nhân giố ng in vitro. Đa số các loài cây trồ ng chỉ sau khi chồ i đã ra rễ ta ̣o thành cây hoàn chỉnh vớ i kích thướ c nhất đi ̣nh mớ i đươ ̣c huấn luyê ̣n và chuyển ra ngoài vườ n ươm. Cây nuôi cấy in vitro đươ ̣c sinh trưở ng và phát triển trong những điều kiê ̣n tố i ưu về nhiê ̣t đô ̣, đô ̣ ẩm, pH, dinh dưỡng... Vì vâ ̣y trướ c khi đưa ra trồ ng, ngườ i ta cần huấn luyê ̣n cây để thích nghi vớ i điều kiê ̣n tự nhiên. Quá trình thích nghi vớ i điều kiê ̣n bên ngoài củ a cây ở giai đoa ̣n đầu yêu cầu cần đươ ̣c chăm só c đă ̣c biê ̣t. Vì vâ ̣y cây đươ ̣c chuyển từ môi trườ ng từ bão hoà hơi nướ c sang vườ n ươm vớ i những điều kiê ̣n khó khăn hơn nên vườ n ươm cần phải đáp

20

ứ ng các yêu cầu: che cây non bằng nilon và có hê ̣ thố ng phun sương cung cấp đô ̣ ẩm và làm mát cây, giá thể trồng cây có thể là đất mùn, hoă ̣c các hỗn hơ ̣p nhân ta ̣o không chứ a đất, mùn cưa và bọt biển... Giai đoa ̣n này đò i hỏ i 4 – 16 tuần.

1.2.4. Ứng dụng của nuôi cấy mô trong nghiên cứu và ứng dụng trong nông

nghiệp

1.2.4.1. Vi nhân giống

Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro được áp dụng phổ biến

trong nông nghiệp nhờ có hệ số nhân nhanh hơn phương pháp thông thường.Vi

nhân giống được ứng dụng để: Phục tráng giống cây trồng bị bệnh, nhân nhanh

các giống cây trồng mà khả năng nhân giống thông thường khó khan, nhân nhanh

số lượng lớn các cây giống trong thời gian ngắn và đảm bảo đặc tính di truyền của

bố mẹ [19] .

1.2.4.2. Sản xuất và bảo quản giống cây sạch bệnh

Nuôi cấy in vitro có khả năng sản xuất hàng loạt cây sạch bệnh từ những cây

bị nhiễm virus nhờ kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây sạch bệnh có khả năng

nhân nhanh, trao đổi giống và bảo quản in vitro [19].

1.2.4.3. Bảo quản giống in vitro

Phương thức duy nhất an toàn cho lai giống và tạo giống mới là phải có ngân

hàng giống. Giữ tập đoàn giống cho đến nay là một vấn đề nan giải cho những

cây trồng nhân vô tính hay cây đa bội. Bảo quản in vitro trong thời gian dài bằng

phương pháp sinh trưởng chậm bước đầu đã giải quyết được một phần. Hạn chế

của phương pháp này là có những biến đổi về mặt di truyền do thời gian nuôi cấy

kéo dài [19].

21

1.2.4.4. Biến dị tế bào soma

Cây để tái sinh in vitro từ nuôi cấy cơ quan, mô sẹo và protoplast thường có

những thay đổi về hình thái hay nói một cách khác là biến dị tế bào soma. Những

thay đổi qua nuôi cấy in vitro có thể do tình trạng sinh lí mẫu cấy, thể bội của cây

trồng, trao đổi chéo DNA, thời gian, điều kiện nuôi cấy và môi trường nuôi cấy…

Những biến dị tế bào soma thu được này có thể dẫn đến hình thành giống mới qua

chọn dòng. Phương thức chọn dòng này có thể thu ngắn một nửa thời gian chọn

giống mới [10].

1.2.4.5. Lai đơn bội

Cây đơn bội được tạo ra qua nuôi cấy hạt phấn và túi phấn. Cây đơn bội thể

hiện được đặc tính thuần khiết của giống và là nguyên liệu hoàn hảo được sử dụng

trong lai giống [19].

1.3. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước

1.3.1. Trên thế giới

Thông thườ ng Paphiopedilum được nhân giống bằng gieo trồ ng ha ̣t hay tách cây con đã trưở ng thành ra khỏ i cây me ̣. Tuy nhiên tỷ lệ hạt nảy mầm trong tự

nhiên lại rất thấp vì hạt lan Hài quá nhỏ, không chứa chất dự trữ và chỉ có một

phôi chưa phân hóa nên không thể phát triển theo phương thức bình thường được

do đó các loài lan Hài rất hiếm dạng dại vì thế hiệu quả nhân giống thấp nên không

đáp ứ ng nhu cầu củ a thi ̣ trườ ng [6]. Phương pháp nuôi cấy in vitro cho phép tạo ra một lượng lớ n cây con trong thời gian ngắn đã trở thành một giải pháp để bảo

vê ̣ lan Hài thoát khỏ i nguy cơ tuyê ̣t chủ ng.

Các nghiên cứ u đầu tiên về nuôi cấy mô lan Hài đươ ̣c thực hiê ̣n bở i Bubeck

năm 1973, ông đã tiến hành nuôi cấy mô phân sinh của 3 loại lan Hài và 8 loại lan

Hài lai. Môi trường nuôi cấy chủ yếu sử dụng MS (1962) hoặc môi trường này

nhưng có cải biên [23]. Năm 1975 Stewart và cs tiến hành cảm ứ ng chồ i bên để ta ̣o ra mô se ̣o, đôi khi có sự hình thành mô ̣t vài cây con trong quá trình nuôi cấy.

22

Tuy nhiên các mô se ̣o rất khó tái sinh, sau mô ̣t thờ i gian nuôi cấy những mô se ̣o này sẽ chết. Vì lý do này nên hầu hết các nghiên cứ u về nuôi cấy mô Paphiopedilum đều sử du ̣ng nguồ n vâ ̣t liê ̣u ban đầu từ ha ̣t [40].

Theo Liu và cộng sự (2006) thì loài lan Hài P.armeniacum có khoảng thời

gian từ khi hạt nảy mầm đến khi hình thành cây phải mất 4 năm [35].

Những nỗ lực để tạo ra các khối mô sẹo của lan Hài từ các đoạn gốc, thân đã

không thành công. Tuy nhiên một vài loài lan Hài lai đã thành công trong việc tạo

ra protocorms, mô sẹo, chồi, hạt. Điều đó nói lên rằng lan Hài lai dễ nhân hơn so

với các loài bản địa. Do đó việc nhân giống các loài lan Hài chủ yếu đạt được

bằng cách tạo ra sự cộng sinh của hạt để thuận lợi cho sự nảy mầm của hạt trong

nuôi cấy mô [24]; [29]; [34].

Kết quả nghiên cứu của Ding và cs (2004) về ảnh hưởng sự chín của hạt

giống, môi trường nuôi cấy, nguồn carbon và các chất phụ gia hữu cơ đến sự nảy

mầm, phát triển protocorm của lan P.armeniacum đã cho thấy khi sử dụng hạt

giống đạt 200 ngày tuổi tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt cao nhất trong khi tỷ lệ nảy

mầm của hạt sau thụ phấn 300 ngày là thấp nhất. Điều này là do sau khi thụ phấn

kéo dài thì hạt có hiện tượng hình thành vỏ (được quan sát dưới kính hiển vi) và

nó đã ngăn cản sự hấp thu dinh dưỡng của hạt làm cho tỷ lệ nảy mầm giảm đi

đáng kể [27].

Theo Lee (1998) sự nảy mầm của loài P.delenatii tối ưu tại thời điểm 150

ngày sau thụ phấn (68%), tỷ lệ nảy mầm giảm mạnh khi hạt thu ở 210 ngày sau

thụ phấn do khi này hạt đã chín đầy đủ. Ở 150 ngày sau thụ phấn, lớp cutin được

hình thành đầy đủ và các tế bào noãn đã hình thành không bào, do đó cho phép sự

hấp thu dinh dưỡng tốt nhất [31].

Kết quả nghiên cứu của Lee (1998), Ding và cs (2004) cho thấy ảnh hưởng

của sự trưởng thành hạt giống đến sự nảy mầm phụ thuộc vào loài. Sự nảy mầm

của hạt lan là tương đối thấp do nội nhũ không phát triển trong quá trình phát

triển của hạt, hơn nữa vỏ hạt rất mỏng có thể không đủ để bảo vệ phôi từ sự khô

23

hạn. Sự hình thành của một lớp biểu bì trên bề mặt phôi có thể đảm bảo duy trì

độ ẩm cho các tế bào phôi cũng như bảo vệ sự tác động của điều kiện vật lý. Tuy

nhiên lớp biểu bì làm giảm tỷ lệ nảy mầm của hạt trong ống nghiệm [27], [31].

Các kết quả nghiên cứu về thành phần môi trường nuôi cấy đến sự nảy mầm

của hạt lan Hài của Lee và cs (2010) đã cho thấy có mối quan hệ giữa lượng muối

khoáng tương đối thấp và nồng độ N vô cơ trong môi trường KC và VW (nồng

độ muối khoáng KC: 13,42 mM; WV: 16,3 mM; nồng độ N vô cơ KC: 12,25

mM; VW: 3,78 mM ). Sự nảy mầm đạt cao nhất trên môi trường KC. Hiệu quả

kích thích sự nảy mầm của hạt lan trên môi trường KC do có một lượng canxi

tương đối cao nồng độ (4,23 mM) so với VW (1,94 mM), và ¼ MS, ½MS (0,75

và 1,5 mM). Việc cung cấp canxi ảnh hưởng đến tăng trưởng và sự phân chia

nhân của thực vật. Protocorm thu được trên VW lớn hơn trên ½ MS, do nồng độ

phosphate tương đối cao (4,74 mM) của VW so với ¼ MS và ½ MS (0,32 mM

và 0,62 mM) và KC (1,84 mM). Phosphate được hấp thu bởi rễ đã kích thích

tăng trưởng protocorm [33].

Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nguồn carbon khác nhau đến sự nảy mầm

của hạt lan Hài loài P.armeniacum và P.micranthun, Chen và cs đã nhận thấy sự

nảy mầm của hạt đạt cao nhất trên môi trường có bổ sung glucose và cao gấp 2

lần so với môi trường có saccarose [25].

Theo Chyuam và cs (2011) thì số lượng chồi của lan Hài lai tăng gấp hai lần

sau 12 tuần nuôi cấy khi môi trường có bổ sung BA và NAA. Trong khi đó TDZ

ức chế sự dài ra của chồi cũng như rễ [26]. Kết quả của Chen và cộng sự (2004)

cho thấy rằng, trong nhiều trường hợp lan Hài hình thành chồi ít hơn so với các

loại hoa lan khác [24].

Năm 2011 Liao và các cô ̣ng sự cũng đã tái sinh chồ i từ mô se ̣o củ a cây con

hoàn chỉnh từ nu ̣ hoa củ a P. deperle và P. armeni. Tuy nhiên cần rất nhiều thờ i gian để cho cây lan Hài ra hoa vì vâ ̣y phương pháp này kém hiê ̣u quả hơn các phương pháp khác [33].

24

1.3.2. Trong nước

Trước kia do lan Paphiopedilum là giống lan đơn thân nên người ta thường

dùng phương pháp tách bụi để nhân giống. Đây là phương pháp đơn giản, dễ thực

hiện và cây con tách ra có tỷ lệ sống cao nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu cây

giống nên người ta ít sử dụng phương pháp này [14].

Khi nghiên cứu đa dạng di truyền loài lan Hài Đốm (Paphiopedilum concolor

Pfitzer) bản địa của Việt Nam (2009), tác giả Khuất Hữu Trung và cộng sự đã

nhận xét: Loài lan Hài Đốm (P. concolor Pfitzer) bản địa của Việt Nam rất đa

dạng và phong phú. Các mẫu giống thu thập tại các vùng sinh thái khác nhau đều

có các đặc điểm đặc trưng riêng về hình thái. Kết quả phân tích bằng kỹ thuật

RAPD – PCR chỉ ra hệ số tương đồng di truyền của các mẫu Hài đốm dao động

từ 0,56 đến 0,94; 16 mẫu lan Hài Đốm nghiên cứu được phân thành 6 nhóm khác

nhau. Phương pháp mô tả các đặc điểm hình thái và phương pháp đánh giá đa hình

di truyền ở mức độ ADN có thể bổ sung và hỗ trợ lẫn nhau để công việc phân loại

dưới loài trở nên chính xác hơn, phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử

dụng một cách có hiệu quả các nguồn gen lan Hài bản địa của Việt Nam [21].

Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005, 2007) đã nhân giống được loài lan Hài

Hồng (Paphiopedilum delenatii) một loài lan đặc hữu của Việt Nam bằng kỹ thuật

gây vết thương cơ giới, nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân có chứa mắt để tái sinh

chồi từ việc sử dụng các hạt lan sáu tháng tuổi được nuôi cấy trên môi trường

Knudson C kết hợp với việc gây vết thương và nuôi cấy trên môi trường lỏng đã

thu được 5,2 chồi/mẫu ban đầu khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung TDZ

1,0 mg/l. Còn các cây sau khi được kéo dài đoạn thân bằng cách sử dụng ánh sáng

trắng của đèn huỳnh quang và ánh sáng đỏ của đèn LED, được cắt thành từng đốt

rồi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng khác

nhau. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo chồi cao nhất (75%) khi môi trường có bổ sung

BA 2 mg/l, còn trên môi trường có bổ sung Zeatin 1,5 mg/l hoặc TDZ 1,5 mg/l

thì cho chất lượng chồi tốt nhất [15]; [36]; [37]; [38].

25

Vào năm 2006 các nhà khoa học thuộc Viện Ứng dụng Công nghệ đã nhân

giống thành công hai loài lan quý: Hài Hằng và Hài Tam Đảo bằng kỹ thuật gieo

hạt trong ống nghiệm và kỹ thuật gây vết thương trên cây con trong ống nghiệm.

Hai loài lan này nhân giống rất khó vì hạt nhỏ, dài chừng 1 – 2 mm, rộng chừng

1mm, chứa rất ít và hầu như không có chất dinh dưỡng để tạo điều kiện cho hạt

nảy mầm. Do đó nếu gieo hạt trong môi trường đất hạt rất dễ bị mất mát và khó

nảy mầm. Từ những kết quả đạt được, nhóm nghiên cứu do PGS.TS. Đặng Xuyến

Như phụ trách đã xây dựng được qui trình nhân giống hai loài lan Hài quí trên

bằng phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm. Đồng thời họ cũng tìm ra phương

pháp tách mầm như một biện pháp bổ sung để nhân giống Hài Hằng và Hài Tam

Đảo. Không dừng tại đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành công việc nuôi

trồng những cây con nói trên trong vườn ươm [14] .

Trong nghiên cứu của Vũ Quốc Luận và cs (2014) về lan Hài Hồng cho thấy

các chồi non lan Hài Hồng có 4 lá được cấy vào môi trường SH có bổ sung BA

0,5 mg/l; NAA 0,5 mg/l; đường sucrose 30 g/l; agar 9,0 g/l; than hoạt tính 1 g/l

và được nuôi trong điều kiện che tối hoàn toàn trong 4 tháng nhằm kéo dài các

đốt thân, sau đó được đưa ra điều kiện chiếu sáng thêm 2 tháng để lá tổng hợp

diệp lục tố và các năng lượng cần thiết cho cây. Kết quả cho thấy các chồi non

được kéo dài trung bình 10,5 cm, với số lá mới hình thành trung bình 5 lá/chồi,

tương ứng với 5 đốt/chồi thu được sau 120 ngày nuôi trong điều kiện tối. Sau đó

các chồi được đưa sang điều kiện chiếu sáng 60 ngày, các chồi non tiếp tục hình

thành lá mới tuy nhiên không nhận thấy có sự phân đốt. Sau 180 ngày nuôi cấy

các chồi được cắt thành 5 đốt riêng biệt với 1 lá và 1 rễ, riêng phần đỉnh chồi được

giữ nguyên với 3 lá và 2 rễ. Cuối cùng các đốt thân được trồng trên giá thể dớn

Đài Loan thu được kết quả cao nhất ở vị trí đốt thân số 1 với tỷ lệ sống sót (100%)

sau 12 tháng [8].

Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) nghiên cứ u nhân giố ng in vitro và nuôi trồng giố ng lan Hài P. hangianum perner Gurss (Hài Hằng). Kết quả nghiên cứ u

26

cho thấy, môi trường nhân nhanh protocorm và tạo chồi là môi trường RE có bổ

sung nướ c dừa 150 ml/l và chuố i chín 100 g/l cho hệ số nhân cao nhất (4,3 lần).

Bổ sung NAA 0,4 mg/l – 0,6 mg/l vào môi trường cho khả năng ra rễ tố t nhất.

Các kết quả thí nghiệm ngoài vườn ươm cho thấy, cây đạt tiêu chuẩn ra vườn ươm

cao 3 – 4 cm, có từ 3 – 4 lá, 4 – 5 rễ [4].

Ở Việt Nam, nhóm tác giả Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và

Nguyễn Tiến Hiệp đã có những nghiên về mặt thực vật học đối với lan Hài Việt

Nam thông qua những chuyến khảo sát thực tế. Trong cuốn sách “Lan Hài Việt

Nam” nhóm tác giả đã giới thiệu khá đầy đủ và chi tiết các loài lan Hài có ở Việt

Nam cùng các đánh giá về thực trạng của các loài này [1].

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

27

- Đối tượng nghiên cứu: Giống lan Hài Giáp khoẻ mạnh, sạch bệnh, được

lưu giữ tại vườn lan Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm Thái

Nguyên.

- Vật liệu nghiên cứu: Quả loài lan Hài Giáp được sử dụng để làm nguồn vật

liệu ban đầu cho thí nghiệm.

Hình 2.1: Cây và quả lan Hài Giáp

(Nguồn: www.vuonhoalan.net) [42]

2.2. Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng nhân nhanh và ra rễ giống lan Hài Giáp bằng phương

pháp in vitro quy mô phòng thí nghiệm.

2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực

vật, bộ môn CNSH thuộc Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại Học Nông Lâm – Đại

học Thái Nguyên

- Thời gian nghiên cứu: Từ 11/2015 đến 10/2016.

28

2.4. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.4.1. Hóa chất

Bảng 2.1: Hóa chất nghiên cứu

Hóa chất Hãng sản xuất

Than hoạt tính Việt Nam

Agar, đường Sacarose Việt Nam

Biobasic, Canada HgCl2

NAA Sigma, Đức

BA Sigma, Đức

MS Duchefa, Hà Lan

B5 Duchefa, Hà Lan

WPM Duchefa, Hà Lan

Cồn Việt Nam

2.4.2. Thiết bị

Bảng 2.2: Thiết bị nghiên cứu

Thiết bị Hãng sản xuất

Tủ cấy vô trùng cấp I Airtech

Cân điện tử Olhous – Vietlabcu

Nồi hấp khử trùng ALP

Tủ sấy Memmert

Máy chuẩn pH Hanna HI2210

Bộ pippet Kingson

2.4.3. Dụng cụ

Panh, dao, kéo, thìa, đĩa peptri, ống đong, cốc đong, đèn cồn, giấy thấm, bình

nuôi cấy, túi nilon.

29

2.5. Phương pháp nghiên cứu

Các bước nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Quả lan Hài Giáp

Khử trùng

Tạo protocorm

Tạo đa chồi

Tạo rễ

Tạo cây hoàn chỉnh

Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm

2.5.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường và điều kiện nuôi cấy

2.5.1.1. Chuẩn bị môi trường

Môi trường nuôi cấy sử dụng các loại môi trường cơ bản như: MS

(Murashige and Skoog), B5 (Gamborg), WPM (Woody Plant Medium) có bổ sung

thêm 1 số thành phần như đường sacarose 30 g/l, nước dừa 150 ml/l, agar 6

g/l,…Môi trường được điều chỉnh pH 5,6 – 5,8.

30

Các chất kích thích sinh trưởng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với

hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm.

Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1atm trong 20 phút.

2.5.1.2. Điều kiện nuôi cấy

Các thí nghiệm nuôi cấy trong phòng được duy trì trong điều kiện: Nhiệt độ

phòng: 22 – 25oC; cường độ chiếu sáng thấp, ẩm độ: 60 – 65%; quang chu kì:

16h sáng/8h tối.

2.5.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro

2.5.2.1. Khử trùng hạt

Khử trùng sơ bộ: Quả lan Hài Giáp sau thu thập được rửa sạch bằng dung

dịch xà phòng loãng sau đó tráng sạch dưới vòi nước và dùng nước cất tráng mẫu

từ 3 – 4 lần.

Khử trùng trong box cấy: Ngâm mẫu với dung dịch cồn 70o trong 1 phút và

tráng sạch bằng nước cất nhiều lần. Tiếp tục ngâm mẫu trong dung dịch HgCl2

0,1% ở các mức thời gian khác nhau: 0 phút, 2 phút, 5 phút, 8 phút, 10 phút, sau

đó tráng nước cất 5 – 7 lần.

Gắp mẫu đặt lên giấy thấm đã được vô trùng. Dùng dao cấy cắt bỏ phần bị

hóa chất bào mòn. Dùng dao tách quả, tiến hành gieo hạt trên nền môi trường đã

chuẩn bị trước. Sau đó đưa vào phòng nuôi, tiến hành theo dõi mẫu (quan sát bằng

mắt thường).

Chỉ tiêu theo dõi:

+ Tỷ lệ bình mẫu sống không nhiễm

+ Tỷ lệ bình mẫu sống nhiễm

+ Tỷ lệ bình mẫu chết

31

2.5.2.2. Môi trường nuôi cấy

(1) Môi trường nảy mầm hạt

Sau khi quả lan được khử trùng, tiến hành gieo hạt trên các môi trường nền

dinh dưỡng khác nhau: Môi trường đối chứng (không chứa khoáng đa lượng, vi

lượng), môi trường MS, B5, WPM để thăm dò khả năng kích thích nảy mầm trong

điều kiện tối ưu của từng loài môi trường.

Chỉ tiêu theo dõi:

+ Tỷ lệ nảy mầm của hạt.

(2) Môi trường nhân chồi

Hạt nảy mầm tạo thành các cụm chồi sẽ được chuyển qua môi trường để

nhân nhanh cụm chồi. Môi trường thích hợp ở thí nghiệm 2 + đường saccarose 30

g/l + than hoạt tính 1 g/l + agar 6 g/l + nước dừa 150 ml/l sẽ được dùng làm môi

trường nền có bổ sung các chất kích sinh trưởng và chất hữu cơ thích hợp tùy từng

thí nghiệm.

Chỉ tiêu theo dõi:

+ Hệ số nhân

+ Chiều cao chồi

+ Chất lượng chồi

(3) Môi trường tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Những chồi tạo ra trên môi trường nhân nhanh có từ 2 – 3 lá được cấy chuyển

sang môi trường tạo rễ bổ sung chất kích thích sinh trưởng NAA và than hoạt tính

ở các nồng độ khác nhau nhằm thăm dò khả năng kích thích ra rễ.

Chỉ tiêu theo dõi:

+ Tỷ lệ chồi ra rễ

+ Số rễ trung bình/chồi

32

+ Chiều dài rễ

+ Chất lượng rễ

2.5.2.3. Đưa cây ra ngoài tự nhiên

Phương pháp ra cây: Trước khi đưa cây con ra trồng ngoài tự nhiên, thường

tiến hành huấn luyện để cây quen dần với điều kiện môi trường bên ngoài bằng

cách: đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên, không cho ánh sáng

chiếu trực tiếp vào bình nuôi cấy. Thời gian này kéo dài khoảng 10 ngày, tăng dần

cường độ vào những ngày cuối để tăng nhanh khả năng thích nghi của cây. Sau

đó, các bình cây được mở nắp, đổ nước vào ngâm 15 phút, lắc nhẹ để thạch rời

ra khỏi rễ, dùng panh gắp nhẹ các cây ra khỏi bình không để dập nát. Rửa sạch

phần thạch bám vào vì đó thường là môi trường thích hợp cho nấm bệnh phát triển

hoặc côn trùng tấn công. Sau đó để cây chỗ râm mát rồi đem trồng vào giá thể.

Cần xử lý các giá thể bằng thuốc tím để khử trùng nấm trước khi trồng cây.

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các loại giá thể khác nhau nhằm đánh

giá ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan Hài Giáp.

Chỉ tiêu theo dõi:

+ Tỷ lệ sống

+ Chiều cao cây

2.5.3. Phương pháp xử lí số liệu

- Sau khi tiến hành nuôi cấy và thu thâ ̣p số liệu, số liệu thu được sẽ được

tính toán trên phần mềm Excel theo hướ ng dẫn củ a Chu Văn Mẫn [11].

33

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch

HgCl2 0,1 % đến quả lan Hài Giáp

Trong quá trình nuôi cấy in vitro vô trùng mẫu là giai đoạn khở i đầu và quyết đi ̣nh sự thành công củ a quá trình nuôi cấy. Để có được vật liệu khởi đầu sạch nấm và vi khuẩn, việc lựa chọn chất khử trùng, nồng độ, thời gian rất quan trọng. Trong

quá trình nghiên cứu và tìm hiểu khả năng tạo mô sạch trong nuôi cấy in vitro trên

đối tượng Phong lan nói chung và lan Hài nói riêng, chúng tôi nhận thấy có nhiều

nhất chất hóa học có hoạt tính diệt nấm và vi khuẩn mạnh như Calcium

hypochlorid Ca(OCl)2, thuỷ ngân clorua (HgCl2), hydroxid (H2O2),....Tuy

nhiên HgCl2 được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng bởi chúng có hoạt tính khử

trùng tốt, cho tỷ lệ mẫu sống vô trùng cao [19]. Vì vâ ̣y trong đề tài này chúng tôi cho ̣n HgCl2 ở nồng độ 0,1% với các mức thời gian khử trùng khác nhau để

ta ̣o vâ ̣t liê ̣u nuôi cấy vô trùng. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng

dung dịch HgCl2 0,1% đến quả lan Hài Giáp

Tỷ lệ bình Tỷ lệ bình Thời gian mẫu sống Tỷ lệ bình Công mẫu sống khử trùng không nhiễm mẫu chết (%) thức (CT) nhiễm (%) (phút) (%)

0 100 0 0 CT 1

45,94 ± 2,4 43,88 ± 2,2 10,18 ± 2,7 2 CT 2

71,78 ± 1,3 16,72 ± 1,8 11,5 ± 1,3 5 CT 3

61,16 ± 1,1 15,92 ± 1,5 22,92 ± 0,9 8 CT 4

10 54,22 ± 1,8 13,64 ± 0,8 32,14 ± 1,6 CT 5

34

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy:

Xét về chỉ tiêu bình mẫu sống không nhiễm, chúng tôi nhận thấy thời gian

khử trùng có ảnh hưởng rõ rệt tới chỉ tiêu này. Ở nồng độ HgCl2 0,1% từ CT3

đến CT4 tương ứng với thời gian khử trùng từ 5 đến 8 phút cho hiệu quả khử

trùng cao nhất. Ở CT3 tỷ lệ bình mẫu sống không nhiễm đạt 71,78%. Tuy nhiên

khi thời gian khử trùng tăng lên 10 phút tỷ lệ bình mẫu sống không nhiễm giảm

xuống còn 54,22%.

Xét về chỉ tiêu bình mẫu sống nhiễm, ở công thức đối chứng khi không sử

dụng chất khử trùng toàn bộ hạt sẽ bị nhiễm sau 15 ngày theo dõi. Khi tăng thời

gian khử trùng từ 2 phút lên 10 phút tỷ lệ bình mẫu sống nhiễm giảm từ 43,88 %

xuống còn 13,64%, đồng thời tỷ lệ bình mẫu chết tăng lên từ 10,18% lên 32,14%.

Điều này được giải thích rằng: Khi khử trùng mẫu bằng HgCl2 ở mô ̣t nồ ng đô ̣ nhất đi ̣nh, thờ i gian khử trù ng càng dài khả năng tiêu diê ̣t vi khuẩn, nấm càng tăng do đó tỷ lệ mẫu nhiễm càng giảm. Tuy nhiên HgCl2 là loa ̣i hoá chất có khả năng gây độc và làm chết mẫu nên thờ i gian khử trù ng mẫu càng dài và nồ ng đô ̣ chất khử trùng càng cao thì hoá chất khử trù ng sẽ ngấm vào mẫu càng nhiều và làm tăng tỷ lê ̣ mẫu chết.

Chúng tôi đã sử dụng phương pháp so sánh mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi

tham số của Kruskal và Wallis. Kết quả phân tích cho thấy tỉ lệ bình mẫu sống

không nhiễm ở các công thức thực sự khác nhau ở độ tin cậy 95%. Sử dụng hàm

Anova Single Factor phân tích phương sai một nhân tố (thời gian khử trùng trong

HgCl2 0,1%) nhằm tìm nguyên nhân của sự sai khác trên, kết quả cho thấy F > F

crit, do đó tỉ lệ bình mẫu sống không nhiễm ở các công thức khác nhau là do khác

nhau về thời gian xử lí HgCl2 0,1%.

Vì vậy để khử trùng quả lan Hài Giáp được hiệu quả, chúng tôi lựa chọn

công thức sử dụng cồn 70o kết hợp với HgCl2 0,1% trong 5 phút.

35

3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt lan Hài Giáp

Dương Tấn Nhựt và cs (2005) đã nhân giống thành công lan Hài Hồng

(Paphiopedilum delentii) bằng phương pháp gieo hạt in vitro. Sau đó tái tạo chồi

bằng cách gây vết thương trên các mầm thu được từ gieo hạt và nuôi cấy trên môi

trường lỏng đã thu được hệ số nhân là 5,2 lần [37]; [38]. Dựa vào nền tảng đó,

chúng tôi cũng mong muốn tìm ra được môi trường thích hợp để nhân giống loài

lan Hài Giáp bằng phương pháp gieo hạt in vitro.

Thí nghiệm sử dụng các nền môi trường dinh dưỡng phổ biến gồm MS, B5,

WPM để tiến hành gieo hạt. Hạt được nuôi cấy trên các môi trường nền khác nhau

có bổ sung đường 30 g/l + than hoạt tính 1 g/l + agar 5,5 g/l + nước dừa 150 ml/l

để đánh giá tỷ lệ nảy mầm của hạt. CT đối chứng là môi trường không bổ sung

khoáng đa lượng và vi lượng. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2.

Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy

mầm của hạt

Tỷ lệ nảy mầm của hạt (%) Công thức Môi trường (CT) 4 tuần 8 tuần 12 tuần

Đ/c 3,97 ± 0,8 18,17 ± 1,3 22,33 ± 1,64 CT 1

CT 2 MS 41,77 ± 1,8 67,57 ± 1,4 84,7 ± 2,3

B5 37,2 ± 1,45 55,57 ± 1,96 71,93 ± 1,8 CT 3

WPM 28,07 ± 1,3 41,5 ± 1,5 62,93 ± 1,9 CT 4

Kết quả bảng số liệu 3.2 cho thấy, môi trường nền khác nhau có ảnh hưởng

khác nhau tới sự nảy mầm của hạt

Sau 4 tuần theo dõi, tỷ lệ nảy mầm của hạt lan là rất thấp. Ở công thức đối chứng

tỷ lệ nảy mầm chỉ đạt 3,97 %. Sau 8 tuần ở hầu hết các công thức đều có hiện tượng

nảy mầm, tuy nhiên tỷ lệ nảy mầm chưa cao. Môi trường cho tỷ lệ nảy mầm cao

nhất sau 8 tuần đạt 67,57% là môi trường MS.

Sau 12 tuần theo dõi, tỷ lệ nảy mầm của hạt ở tất cả các công thức đã tăng

lên rõ rệt, đặc biệt là công thức 2 (môi trường MS) với thành phần môi trường

36

giàu dinh dưỡng cho tỷ lệ nảy mầm đạt 84,7%, chất lượng hạt nảy mầm tốt,

đồng đều và khỏe. Ở công thức 3 cho tỷ lệ nảy mầm đạt 71,93%, chồi có mầu

xanh, hạt nảy mầm khỏe nhưng không đồng đều so với công thức 2. Ở công

thức 4 tỷ lệ này đạt tương ứng là 62,93%, chồi nảy mầm không đồng đều, có

màu nâu nhạt.

Qua thí nghiệm trên chúng tôi cho rằng các nền môi trường MS, WPM, B5

đều có khả năng kích thích hạt nảy mầm và có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng

nảy mầm của hạt, trong đó môi trường MS cho tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt 84,7%,

cao hơn các nền môi trường còn lại, điều đó cho thấy hạt lan thích hợp nảy mầm

trong môi trường giàu dinh dưỡng.

ĐC

Môi trường MS

Hình 3.1: Ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt sau 12 tuần

3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp

chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp

3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân nhanh chồi

lan hài Hài Giáp

BA (6 - Benzylaminopurine) là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc

nhóm cytokinin, được sử dụng khá phổ biến trong môi trường nuôi cấy mô nhằm

kích thích sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan,

37

gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ [2]. Thí nghiệm được thực

hiện nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA bổ sung vào môi trường nuôi

cấy đến khả năng nhân nhanh của lan Hài Giáp. Kết quả của thí nghiệm được thể

hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân

nhanh lan Hài Giáp

Nồng Công thức Hệ số nhân Chiều cao độ BA Chất lượng chồi ( CT) (lần) chồi (mg/l)

Sau 6 tuần

1,1 ± 0,17 1,88 ± 0,06 Chồi nhỏ, xanh nhạt 0 CT 1

1,6 ± 0,07 1,54 ± 0,08 Chồi nhỏ, xanh đậm 1 CT 2

2,24 ± 0,18 1,32 ± 0,04 Chồi mập, xanh đậm 2 CT 3

1,95 ± 0,06 1,5 ± 0,031 Chồi mập, xanh đậm 3 CT 4

1,37 ± 0,08 1,24 ± 0,06 Chồi nhỏ, xanh nhạt 5 CT 5

Sau 12 tuần

1,57 ± 0,14 1,97 ± 0,04 Chồi nhỏ, xanh nhạt 0 CT 1

1,9 ± 0,13 1,99 ± 0,06 Chồi nhỏ, xanh đậm 1 CT 2

2,41 ± 0,08 1,93 ± 0,05 Chồi mập, xanh đậm 2 CT 3

2,5 ± 0,16 1,96 ± 0,03 Chồi mập, xanh đậm 3 CT 4

1,87 ± 0,1 1,53 ± 0,09 Chồi nhỏ, xanh nhạt 5 CT 5

Sau 6 tuần nuôi cấy khi bổ sung BA vào môi trường nền, hệ số nhân chồi

tăng lên tỷ lệ thuận với hàm lượng BA (0 – 3mg/l). Ở tất cả các công thức có bổ

sung BA đều cho hệ số nhân chồi cao hơn so với công thức đối chứng. Ở công

thức CT 1 hệ số nhân chồi chỉ đạt 1,1 lần. Hệ số nhân cao nhất đạt 2,24 lần (CT

3), tiếp tục tăng nồng độ BA lên 5 mg/l hệ số nhân có xu hướng giảm còn 1,37

lần, chất lượng chồi kém.

38

Sau 12 tuần theo dõi hệ số nhân chồi của các công thức tăng theo thời gian

nuôi cấy. Khi tăng nồng độ BA từ 0 – 3 mg/l hệ số nhân chồi tăng từ 1,57 lần lên

2,5 lần, đặc biệt là công thức 4 ở nồng độ 3 mg/l cho hệ số nhân cao nhất đạt 2,5

lần. Có thể thấy CT 3 và CT 4 là hai công thức tốt nhất trong thí nghiệm 3. Cả 2

công thức đều cho chất lượng chồi tốt, CT 4 cho hệ số nhân chồi cao hơn CT 3 sau

12 tuần theo dõi, tuy nhiên sự sai khác này không có ý nghĩa ở độ tin cậy 95%. Bên

cạnh đó, sử dụng CT 3 sẽ giúp hạn chế lượng BA bổ sung vào môi trường, giảm

được khả năng tạo biến dị không mong muốn, đồng thời tiết kiệm kinh phí cho thí

nghiệm hơn so với CT4.

Ở chỉ tiêu chiều cao chồi, khi bổ sung BA chiều cao chồi giảm dần so với

công thức đối chứng (không bổ sung BA). Chiều cao chồi giảm từ 1,90 cm (CT2)

đến 1,53 cm (CT5), trong khi công thức đối chứng chồi đạt chiều cao là 1,97 cm.

So sánh hai mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis (công

thức đối chứng và công thức 2). Kết quả phân tích cho thấy sự sai khác về chiều

cao chồi là không có ý nghĩa, độ tin cậy 95%. Do đó, lựa chọn công thức đối chứng

hoặc công thức 2 đều cho sự sinh trưởng của chồi tốt.

Chất lượng chồi ở thí nghiệm được đánh giá từ mức kém đến mức tốt. Trong

đó, CT 2 và CT 5 (nồng độ BA là 1 mg/l, 5 mg/l) có sự sai khác về chất lượng

chồi là không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%, ở công thức đối chứng khi không

bổ sung BA cho chất lượng chồi kém nhất; công thức 3 và 4 cho chồi chất lượng

cao hơn đối chứng và được đánh giá ở mức tốt.

Phân tích phương sai một nhân tố kết quả cho thấy F > F crit. Vì vậy, số

chồi/mẫu ở các công thức khác nhau là do khác nhau về hàm lượng BA bổ sung

vào môi trường. Nếu xét đồng thời các chỉ tiêu (số chồi/mẫu, chiều cao chồi và

chất lượng chồi) thì chỉ tiêu số chồi/mẫu được coi là ưu tiên trong giai đoạn nhân

nhanh. Do đó có thể kết luận: CT 3 (bổ sung BA 2 mg/l vào môi trường nền MS

+ đường sucrose 30 g/l + agar 5,5 g/l + 150 ml/l nước dừa) là thích hợp nhất trong

39

thí nghiệm, cho số chồi/mẫu đạt 2,41 chồi, sự sinh trưởng của chồi đảm bảo, chất

lượng chồi tốt.

Tác giả Nguyễn Thị Cúc và cs (2014) đã kết luận nồ ng đô ̣ BA thích hơ ̣p nhất cho nhân nhanh chồ i củ a lan hài P. delenatii khi nuôi cấy trên môi trườ ng MS là

2 mg/l, tỷ lê ̣ đạt 75% sau 30 ngày nuôi cấy [3]. So sánh kết quả nghiên cứ u củ a

chú ng tôi vớ i kết quả nghiên cứ u củ a tác giả trên thấy kết quả nghiên cứ u củ a tôi hoàn toàn phù hơ ̣p. Điều này chứ ng tỏ BA có tác du ̣ng tích cực trong việc nhân nhanh chồ i lan Hài nó i chung và kích thích nhân nhanh chồ i lan Hài Giáp nó i riêng. Vì vậy công thức bổ sung BA nồng độ 2 mg/l vào môi trường nền được

chọn để sử dụng trong nghiên cứu các thí nghiệm nhân nhanh tiếp theo (BA kết

hợp với NAA).

Hình 3.2: Ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp

A: 0 mg/l (Đ/c) C: 5 mg/l BA E: 2 mg/l BA

B: 1 mg/l BA D: 3 mg/l BA

3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA tới khả năng

nhân nhanh chồi lan Hài Giáp

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ

thống nuôi cấy mô. Đối với sự phát sinh phôi, sự tạo callus và rễ cần có tỷ lệ

auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và

40

chồi nách [9]. Theo Chyuam và cs (2011) thì số lượng chồi của lan Hài lai tăng gấp

hai lần sau 12 tuần nuôi cấy khi môi trường có bổ sung BA và NAA [26].

Thí nghiệm được thực hiện nhằm nghiên cứu sự ảnh hưởng của việc bổ sung

đồng thời hai chất kích thích sinh trưởng thực vật BA (thuộc nhóm cytokinin) và

NAA (thuộc nhóm auxin) vào môi trường nuôi cấy đến khả năng nhân nhanh lan

Hài Giáp. CT đối chứng là môi trường nền có bổ sung đường 30 g/l + than hoạt

tính 1 g/l + agar 5,5 g/l + nước dừa 150 ml/l, các CT thí nghiệm còn lại có hàm

lượng BA cố định là 2 mg/l, đồng thời bổ sung NAA tăng từ 0,1 – 1 mg/l. Kết quả

được thể hiện trong bảng 3.4.

Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA tới khả

năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp

Công thức Nồng độ Hệ số Chiều cao Chất lượng chồi

( CT) NAA nhân chồi (cm)

(mg/l) (lần)

Sau 6 tuần

0 1,23 ± 0,07 1,54 ± 0,12 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 1

0,1 2,01 ± 0,1 1,65 ± 0,09 Chồi mập,xanh nhạt CT 2

0,3 2,61 ± 0,06 1,8 ± 0,04 Chồi mập, xanh đậm CT 3

0,5 2,45 ± 0,09 1,85 ± 0,06 Chồi mập,xanh đậm CT 4

1 2,1 ± 0,07 1,91 ± 0,1 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 5

Sau 12 tuần

0 1,92 ± 0,07 2,02 ± 0,09 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 1

0,1 2,8 ± 0,17 2,16 ± 0,1 Chồi mập,xanh nhạt CT 2

0,3 3,16 ± 0,15 2,22 ±0,07 Chồi mập,xanh đậm CT 3

0,5 3,28 ± 0,09 2,19 ± 0,14 Chồi mập,xanh đậm CT 4

1 2,62 ± 0,16 2,32 ± 0,13 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 5

41

Qua bảng 3.4 chúng tôi nhận thấy:

Sau 6 tuần theo dõi ở công thức 3 khi bổ sung NAA 0,3 mg/l kết hợp với BA

2 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 2,61 lần; chiều cao chồi đạt 1,8 cm.

Sau 12 tuần theo dõi hệ số nhân chồi tăng lên đáng kể khi bổ sung đồng thời

BA và NAA vào môi trường. Hệ số nhân chồi tăng hơn hẳn so với công thức đối

chứng, tăng từ 1,92 lần lên 3,28 lần. Đặc biệt cùng với mức BA (2 mg/l), khi tăng

nồng độ NAA lên 0,3 mg/l (CT3), 0,5 mg/l (CT4) thì hệ số nhân chồi tăng dần lần

lượt là 3,16 lần và 3,28 lần. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng hàm lượng NAA thì hệ

số nhân chồi có xu hướng giảm xuống còn 2,62 lần (CT 5 1mg/l). Khi tăng nồng

độ NAA, chỉ tiêu chiều cao chồi có sự thay đổi nhưng không đáng kể so với CT

đối chứng tuy nhiên chất lượng chồi xấu đi nguyên nhân là do nồng độ NAA cao

gây độc cho mẫu.

Từ những nhận xét trên chúng tôi thấy, CT3 và CT4 là 2 công thức tốt nhất

trong thí nghiệm. Mặc dù CT4 có giá trị hệ số nhân cao hơn CT3, tuy nhiên khi

sử dụng phương pháp so sánh hai mẫu độc lập giữa CT 3 và CT 4 thì sự sai khác

này không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 0,05. Bên cạnh đó CT3 cho chỉ tiêu

chiều cao chồi và chất lượng chồi tốt hơn. Đồng thời sử dụng CT3 sẽ giúp giảm

lượng NAA sử dụng trong thí nghiệm do đó làm giảm chi phí ban đầu. Hệ số nhân

chồi này có phần cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Huang và cs (2000) [29],

đồng thời tương tự với các kết quả nghiên cứu của Chen và cộng sự (2004a) cho

thấy rằng trong nhiều trường hợp lan Hài hình thành chồi ít hơn so với các loại

hoa lan khác [24].

Từ đó đưa ra kết luận công thức 3 bổ sung BA 2 mg/l + NAA 0,3 mg/l NAA

vào môi trường nền MS cho hệ số nhân chồi cao đạt 3,16 lần; chiều cao chồi đạt

2,22 cm, sự sinh trưởng của chồi đảm bảo, chất lượng chồi tốt.

42

ĐC CT 3

Hình 3.3: Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA tới khả năng nhân nhanh

chồi lan Hài Giáp

3.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết của quả chuối xanh tới khả

năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp

Theo Van Staden và cs (1975), dịch chuối chứa nhiều thành phần dinh dưỡng

quan trọng về mặt sinh lý là serotonin, norepinephrine cùng với dopamine và một

số catechomaline chưa xác định [41]. Việc bổ sung dịch nghiền chuối vào môi

trường nuôi cấy hoa lan thường kích thích sự sinh trưởng bởi dịch chuối có hàm

lượng fructose, glucose và nitrat cao. Khi được bổ sung vào môi trường nuôi cấy

làm tăng hàm lượng đường cũng như hàm lượng khoáng của môi trường. Tác

dụng kích thích của dịch chiết chuối hiệu quả do khả năng ổn định pH của môi

trường nuôi cấy. Bổ sung dịch chiết chuối vào môi trường đóng vai trò như một

chất kháng acid và trung hòa nồng độ acid. Ngoài ra, dịch chiết chuối có chứa một

hàm lượng lớn như sắt, kali, vitamin B6, B12 và trypthophan thúc đẩy PLBs tăng

trưởng [7].

Việc bổ sung dịch chiết dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy đa số loài lan

đều đem lại các hiệu quả khác nhau. Việc bổ sung dịch chiết chuối có tác dụng

kích thích đối với khả năng tạo protocorm và sinh trưởng chồi [4]. Do đó chúng

tôi tiến hành bổ sung dịch chiết của quả chuối xanh vào môi trường nuôi cấy để

khảo sát khả năng nhân nhanh chồi loài lan Hài Giáp. Kết quả được thể hiện trong

bảng 3.5.

43

Bảng 3.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết của quả chuối xanh tới

khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp

Nồng độ Hệ số Công thức Chiều cao dịch chuối nhân Chất lượng chồi (CT) chồi (cm) (g) (lần)

Sau 6 tuần

0 (Đ/C) 1,46 ± 0,3 2,03 ± 0,14 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 1

50 1,82 ± 0,18 1,8 ± 0,1 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 2

100 2,28 ± 0,16 1,86 ± 0,09 Chồi mập, xanh đậm CT 3

120 1,98 ± 0,19 1,63 ± 0,15 Chồi mập, xanh đậm CT 4

150 1,72 ± 0,06 1,44 ± 0,06 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 5

Sau 12 tuần

0 (Đ/C) 1,91 ± 0,05 2,34 ± 0,13 Chồi nhỏ, xanh nhạt CT 1

50 2,21 ± 0,31 1,98 ± 0,05 Chồi mập, xanh nhạt CT 2

CT 3 100 2,76 ± 0,1 2,02 ± 0,08 Chồi mập,xanh đậm

120 2,47 ± 0,12 1,94 ± 0,03 Chồi mập, xanh đậm CT 4

150 2,36 ± 0,19 1,89 ± 0,1 Chồi mập, xanh nhạt CT 5

Qua bảng 3.5 cho thấy việc bổ sung dịch chiết của quả chuối xanh vào

môi trường nuôi cấy có hiệu quả tác động đến khả năng nhân nhanh của chồi

lan Hài Giáp.

Sau 6 tuần theo dõi, hệ số nhân chồi cao nhất đạt được khi bổ sung 100 g/l

dịch chiết chuối là 2,28 lần, chiều cao chồi đạt 1,86 cm, chồi mập, xanh, chất

lượng chồi tốt.

Sau 12 tuần theo dõi, ở CT đối chứng cho hệ số nhân chồi là 1,91 lần. Khi

tăng lượng dịch chuối từ 0 - 100 g/l (CT2 và CT3) hệ số nhân chồi tăng. Tuy nhiên,

khi tiếp tục tăng lượng dịch chuối vượt quá mức 100 g/l thì hệ số nhân sẽ bị giảm

đi. Có thể nhận thấy, CT3 cho tỷ lệ tạo chồi cao nhất với hệ số nhân chồi là 2,76

lần, chiều cao chồi đạt 2,02 cm. Tuy nhiên, hệ số nhân chồi này thấp hơn so với kết

44

quả hệ số nhân chồi lan Hài Hằng, khi bổ sung 100 g/l dịch chiết chuối vào môi

trường nuôi cấy cho hệ số nhân đạt 4,3 lần [4]. Trong nghiên cứu của Vũ Quốc

Luận và cs (2014) sau 90 ngày nuôi cấy, kết quả thu được cho thấy có sự gia tăng

đáng kể khi hàm lượng dịch chiết chuối tăng từ 50 - 100 g/l, đạt cao nhất khi bổ

sung 100 g/l dịch chuối thể hiện qua các chỉ tiêu theo dõi như khối lượng tươi (1,50

g/chồi), chiều dài lá (4,60 cm), chiều dài rễ (4,37 cm). Tuy nhiên khi hàm lượng

dịch chiết chuối tăng trên 150 g/l tất cả các chỉ tiêu theo dõi đều có xu hướng giảm

dần, các lá non hầu như không phát triển, lá khằn và đặc biệt có sự hình thành của

các chồi bên. Khi hàm lượng bột chuối trong môi trường nuôi cấy quá cao làm ức

chế sự phát triển của chồi, có thể do áp lực thẩm thấu của môi trường cao và ngăn

chặn sự hấp thu nước và các chất cần thiết cho sự phát triển của chồi [7].

Ở chỉ tiêu chiều cao chồi, khi bổ sung dịch chiết chuối thì chiều cao chồi cũng

tăng nhưng không đáng kể. So sánh hai mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham số của

Kruskal và Wallis (công thức đối chứng và công thức 3). Kết quả phân tích cho thấy

sự sai khác về chiều cao chồi là không có ý nghĩa ở mức tin cậy 95%.

Từ kết quả nghiên cứu trên có thể kết luận: Môi trường nền MS khi bổ sung

100 g/l dịch chiết của quả chuối xanh là thích hợp nhất cho thí nghiệm, cho hệ số

nhân đạt 2,76 lần, sự sinh trưởng của chồi đảm bảo, chất lượng chồi tốt.

Hình 3.4: Ảnh hưởng dịch chiết của quả chuối xanh tới khả năng nhân

nhanh của lan Hài Giáp

45

3.4. Kết quả nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh

3.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của lan

Hài Giáp

Bô ̣ rễ là cơ quan quan trọng đố i vớ i tất cả các loài thực vâ ̣t. Trong nuôi cấy mô sau khi nhân chồi vớ i số lươ ̣ng lớn, giai đoa ̣n tiếp theo là ta ̣o cây hoàn chỉnh để đưa ra ngoài vườn ươm. Khi cây được chuyển ra ngoài tự nhiên cần phải có bộ rễ khỏe mạnh, hoàn chỉnh giúp cây có khả năng hút nước và dinh dưỡng khoáng

tốt, làm tiền đề cho sự sinh trưởng và phát triển sau này. Vì vậy giai đoạn kích

thích tạo rễ của các chồi là giai đoạn quan trọng và không thể thiếu [9]. Sau khi

kết thúc giai đoạn nhân nhanh tạo ra số lượng chồi lan Hài Giáp đồng nhất và

khỏe mạnh, các chồi tạo thành đạt tiêu chuẩn sẽ được tách ra đưa vào mỗi trường

kích thích ra rễ.

Trước khi trồng ngoài vườn ươm, chồi lan Hài Giáp phải trải qua giai đoạn

tạo rễ nhờ việc bổ sung chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin. Trong đó

IBA và NAA là những chất kích thích được dùng phổ biến trong nuôi cấy mô

nhằm thúc đẩy quá trình phân bào và kích thích sự hình thành rễ [19]. NAA là

chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm auxin, được tổng hợp bằng con đường hóa

học, có hoạt tính sinh lý như một auxin tự nhiên có tác du ̣ng nhiều mặt lên quá trình sinh trưởng củ a tế bào, hiện tượng ưu thế ngọn, tính định hướ ng củ a thực vâ ̣t, đă ̣c biệt là kích thích tạo rễ [19]. NAA được sử du ̣ng ở nồng độ từ 0,1mg/l -

2,0mg/l có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp. Nghiên cứ u ảnh hưởng của NAA tới

sự sinh trưởng củ a lan Hài Giáp, chúng tôi sử du ̣ng các thang nồng độ từ 0 mg/l

– 1,5 mg/l. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.6.

46

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của NAA tới sự ra rễ

Công Nồng Tỷ lệ chồi Số rễ trung Chiều dài Chất thức độ NAA ra rễ (%) bình (rễ/chồi) rễ (cm) lượng rễ (CT) (mg/l)

Sau 4 tuần

Đ/c CT 1 35,02 ± 0,91 1,58 ± 0,12 1,28 ± 0,08 Ngắn,nhỏ

0,4 62,58 ± 0,99 2,03 ± 0,11 2,12 ± 0,08 Dài, mập CT 2

0,6 57,68 ± 1,00 1,93 ±0,11 1,86 ± 0,05 Dài, mập CT 3

1,0 51,84 ± 1,20 1,87 ± 0,04 1,78 ± 0,07 Dài, nhỏ CT 4

1,5 41,9 ± 1,27 1,75 ± 0,09 1,72 ±0,06 Dài, nhỏ CT 5

Sau 8 tuần

Đ/c 54,9 ± 0,33 2,02 ± 0,08 2,26 ± 0,07 Ngắn,nhỏ CT 1

CT 2 0,4 88,54 ± 0,54 3,96 ± 0,08 3,64 ± 0,10 Dài, mập

0,6 82,2 ± 0,97 3,7 ± 0,12 3,4 ± 0,11 Dài, mập CT 3

1,0 69,44 ± 0,81 3,12 ±0,09 3,04 ± 0,10 Dài, nhỏ CT 4

1,5 65,18 ± 0,87 2,88 ± 0,10 2,7 ± 0,11 Dài, nhỏ CT 5

Qua bảng 3.7 chúng tôi nhận thấy nồ ng độ NAA có tác du ̣ng rõ rê ̣t đến sự

hình thành rễ đố i vớ i cây lan Hài Giáp.

Sau 4 tuần nuôi cấy tỷ lệ chồi ra rễ tăng dần khi tăng nồng độ NAA, ở công

thức 2 (0,4 mg/l) và công thức 3 (0,6 mg/l) cho tỷ lệ ra rễ đạt cao nhất tương ứng

là 62,58 % và 57,68 %. Khi tăng nồng độ NAA lên 1,5 mg/l, tỷ lệ ra rễ giảm xuống

còn 41,9%, chất lượng rễ kém.

Sau 8 tuần nuôi cây, tỷ lệ chồi ra rễ ở tất cả các công thức đều tăng đáng kể,

tỷ lê ̣ mẫu ra rễ cao nhất đa ̣t đươ ̣c ở CT 2 là 88,54%, chất lươ ̣ng rễ thu đươ ̣c ngắn, mâ ̣p. Tiếp theo là CT3 đa ̣t 82,2% , CT4 đa ̣t 69,44% và CT 5 đa ̣t 65,18%, rễ thu

47

đươ ̣c ngắn, nhỏ . Kết quả trên đươ ̣c giải thích như sau: NAA có du ̣ng kích thích chồ i ta ̣o rễ. Ở CT đố i chứ ng (CT1) vì không bổ sung NAA nên số mẫu ta ̣o rễ không lớ n và ít rễ. Nồ ng đô ̣ NAA 0,4 mg/l (CT2) cho nhiều cây ra rễ và có số rễ lớ n nhất là do NAA ở nồ ng đô ̣ này có tác du ̣ng kích thích chồ i lan ra rễ ma ̣nh nhất đồ ng thờ i ta ̣o điều kiê ̣n cho cây sinh trưở ng và phát triển tố t nhất. Ở CT3, CT4, CT5 nồ ng đô ̣ NAA lần lươ ̣t là 0,6 mg/l; 1 mg/l; 1,5 mg/l cho thấy tỷ lê ̣ ra rễ và số rễ giảm dần, bở i vì NAA ở nồ ng đô ̣ cao gây ứ c chế chồ i phát triển, chồ i yếu nên số lươ ̣ng rễ hình thành cũng giảm, rễ sinh ra dài và nhỏ .

Qua phân tích từng chỉ tiêu về số rễ trung bình và chiều dài rễ bằng phương

pháp phân tích phương sai một nhân tố thấy rằng sự có mặt của NAA trong môi

trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng tới hai chỉ tiêu này, ở CT 2 (0,4 mg/l) số rễ trung

bình đạt 3,96 rễ/chồi, cao gấp 1,94 lần so với CT đối chứng không bổ sung NAA.

Trong nghiên cứu của tác giả Hoàng Thi ̣ Giang và cs (2010) nghiên cứ u quy trình nhân nhanh giố ng lan hài Hằng đã báo cáo: Nồ ng đô ̣ NAA thích hơ ̣p nhất cho giai đoa ̣n ra rễ lan Hài Hằng là 0,4 – 0,6 mg/l, số rễ/cây đa ̣t 1,96 – 2,03 rễ/cây [4]. Theo Ngô Thị Nguyệt và cs (2013) khi sử dụng nồng độ NAA 0,5 mg/l cho

tỷ lệ ra rễ đạt 60%, số rễ trung bình trên cây là 2,53 rễ, chiều dài rễ đạt 0,47 cm ở

cây lan Hài Vệ Nữ [13]. Như vậy kết quả nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn phù

hợp với các kết quả đã công bố trước đây. Do đó với nồng độ NAA 0,4 mg/l khi

bổ sung vào môi trường MS cho tỷ lệ chồi ra rễ đạt 84,38 %, chất lượng rễ tốt.

Hình 3.5: Ảnh hưởng của NAA tới khả năng ra rễ của lan Hài Giáp

48

3.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính tới

khả năng ra rễ

Than hoạt tính là một hơ ̣p chất vô cơ thườ ng được sử du ̣ng trong giai đoa ̣n

ra rễ trong nuôi cấy mô tế bào thực vâ ̣t. Than hoa ̣t tính có vai trò là ta ̣o điều kiê ̣n

“tố i” cho môi trườ ng nuôi cấy, hấp thụ các chất độc và các chất ứ c chế sinh trưở ng

thực vâ ̣t. Ngoài ra than hoạt tính còn có khả năng làm giảm hiê ̣n tươ ̣ng thuỷ tinh thể ở mô ̣t số loài thực vật [2].

Để số mẫu nuôi cấy có thể ra nhiều rễ vớ i chất lươ ̣ng rễ tố t, trong thí nghiê ̣m này chú ng tôi sử dụng nồng đô ̣ NAA 0,4 mg/l thích hơ ̣p nhất cho quá trình ra rễ kết hợp với than hoạt tính ở các hàm lươ ̣ng khác nhau để thử nghiê ̣m khả năng ra rễ củ a cây lan Hài Giáp. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7.

Bảng 3.7: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt

tính ảnh hưởng tới khả năng ra rễ

Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Chiều dài rễ (cm) Chất lượng rễ Công thức (CT) Số rễ trung bình/ chồi (rễ/chồi) Nồng độ NAA (mg/l) Nồng độ THT (mg/l)

Sau 4 tuần

0,0 51,44 ± 1.38 2,2 ± 0,12 2,81 ± 0,11 Ngắ n, nhỏ CT 1

0,5 58,72 ± 1,36 2,64 ± 0,09 3,07 ± 0,16 Ngắ n, mâ ̣p CT 2

1,0 86,16 ± 1,5 3,5 ± 0,12 CT 3 3,51 ± 0,13 Dài, mâ ̣p 0,4 mg/l 1,5 77,3 ± 1,51 3,06 ± 0,12 3,2 ± 0,14 CT 4 Dài, nhỏ

2,0 68,9 ± 1,12 2,99 ± 0,1 2,95 ± 0,1 CT 5 Dài, nhỏ

Sau 8 tuần

0,0 70,02 ± 0,64 2,88 ± 0,10 3,02 ± 0,88 Ngắn,nhỏ CT 1

0,5 77,2 ± 0,93 3,24 ± 0,11 3,32 ± 0,12 Ngắn, mập CT 2

CT 3 1,0 91,46 ± 0,81 3,9 ± 0,11 3,84 ± 0,13 Dài, mập

0,4 mg/l 1,5 83,12 ± 0,76 3,6 ± 0,15 3,5 ± 0,14 Dài, nhỏ CT 4

2,0 78,6 ± 1,35 3 ± 0,07 3,48 ± 0,16 Dài, nhỏ CT 5

49

Từ bảng kết quả 3.8 cho thấy:

Môi trườ ng MS bổ sung NAA và có mặt củ a than hoa ̣t tính từ 0,0 – 2,0 g/l

có ảnh hưở ng rõ rê ̣t đến khả năng ra rễ củ a cây lan Hài Giáp.

Ở chỉ tiêu tỷ lệ chồi ra rễ, các công thức thí nghiệm đều có sự sai khác nhau

có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Các công thức có bổ sung than hoạt tính đều

cho tỷ lệ chồi ra rễ cao hơn so với công thức đối chứng không bổ sung than hoạt

tính. Sau 8 tuần theo dõi ở CT3 khi bổ sung 1,0mg/l than hoạt tính cho tỷ lệ chồi

ra rễ cao nhất đạt 91,46%, chiều dài rễ 3,84 cm.

Ở chỉ tiêu số lươ ̣ng rễ, các công thứ c thí nghiệm có sự sai khác có ý nghĩa ở mứ c đô ̣ tin câ ̣y 95%. Số rễ /chồi thấp nhất ở công thức đố i chứ ng là 2,88 rễ/chồi, số rễ /chồi cao nhất khi bổ sung THT 1,0 g/l (CT3) vớ i 3,9 rễ/chồi. Khi tăng dần hàm lươ ̣ng THT thì đồng thờ i số lươ ̣ng rễ giảm dần xuố ng. Ở chỉ tiêu chất lươ ̣ng rễ: Các CT1, CT2, CT5 cho chất lượng rễ ngắn, mâ ̣p. Ở CT3 và CT4 tương ứ ng vớ i hàm lươ ̣ng than hoa ̣t tính 1,0 ; 1,5 g/l cho rễ dài và mâ ̣p.

Kết quả trên đươ ̣c giải thích như sau:

Ở công thức đối chứ ng không bổ sung than hoa ̣t tính tỷ lệ chồi ra rễ thấp hơn. Ở các công thức có bổ sung than hoa ̣t tính, hàm lươ ̣ng than hoa ̣t tính tăng thì khả năng ra rễ của cây cũng tăng, số lươ ̣ng rễ tăng. THT 0,5 g/l (CT2) tạo điều kiê ̣n tố i kích thích chồi ra rễ nhiều hơn CT1 (công thứ c Đ/c). Ở CT3 khi bổ sung 1 mg/l THT thúc đẩy cây ra rễ nhanh và ma ̣nh nhất. Tuy nhiên khi tăng dần hàm lượng THT lên 1,5 g/l (CT4) và 2 g/l (CT5) thì ánh sáng không thể chiếu tớ i rễ mo ̣c trong các bình nuôi cấy nên sẽ ha ̣n chế sự phát triển của rễ, đồng thờ i THT ở hàm lượng cao sẽ ngăn cản quá trình trao đổ i chất củ a chồ i nên cũng ha ̣n chế sự hình thành rễ củ a chồ i.

Tác giả Nguyễn Thi ̣ Sơn và cs (2011) nghiên cứ u nhân giố ng in vitro loài

lan Dendrobium fimbriatum Hook (lan Hoàng Thảo Long Nhãn) đã kết luâ ̣n: Hàm lươ ̣ng than hoạt tính phù hơ ̣p nhất cho lan Hoàng Thảo Long Nhãn ra rễ là 1,0 g/l,

50

tỷ lê ̣ ra rễ đa ̣t 100% sau 30 ngày nuôi cấy, số rễ đa ̣t/cây cao nhất là 5,6 rễ/cây, chiều dài rễ lớ n nhất là 2,87 cm, khi hàm lươ ̣ng than hoạt tính cao hơn 1,0 g/l chiều cao cây thấp dần [17]. Kết quả nghiên cứ u củ a chú ng tôi cho thấy: Hàm lươ ̣ng than hoạt tính phù hơ ̣p nhất cho cây lan Hài Giáp ra rễ là 1,0 g/l, cho tỷ lê ̣ ra rễ đa ̣t 91,46% sau 8 tuần nuôi cấy, số rễ/chồi đạt 3,9. So vớ i kết quả nghiên cứ u củ a tác giả trên thấy: Tỷ lê ̣ mẫu ra rễ củ a tôi thấp hơn kết quả nghiên cứ u củ a Nguyễn Thi ̣ Sơn, nguyên nhân là do mẫu nuôi cấy, môi trườ ng và điều kiên nuôi cấy ở hai thí nghiê ̣m là khác nhau.

Từ kết quả thí nghiệm kết luận hà m lượng THT thích hơ ̣p nhất cho cây lan Hài Giáp ra rễ là 1,0 g/l cho số rễ/chồi đạt 3,9 rễ; chiều dài rễ 3,84 cm, chất lượng rễ dài, mập.

Hình 3.6: Ảnh hưởng của NAA kết hợp với THT tới khả năng ra rễ của lan Hài Giáp

3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và

phát triển của lan Hài Giáp

Đưa cây ra ngoài vườ n ươm là giai đoa ̣n quan trọng bao gồm việc tạo rễ,

huấn luyện thích nghi vớ i điều kiện thay đổi củ a nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nướ c, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Việc lựa chọn giá thể phù hợp để ra cây ngoài vườn ươm là một khâu phải thực hiện tỉ mỉ và

thận trọng. Giá thể phù hợp là giá thể cho tỉ lệ cây sống cao, cây sinh trưởng, phát

triển tốt.Vì vậy thành công của giai đoạn này có ý nghĩa quan trọng quyết định tới

hiệu quả nhân giống [19].

51

Để nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển

của lan Hài Giáp, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên trên các loại giá thể khác

nhau: sơ dừa, dớn, đất, sơ dừa + trấu hun (2:1), dớn + trấu hun (2:1). Kết quả được

thể hiện ở bảng 3.8.

Bảng 3.8: Sự phát triển của lan Hài Giáp trên một số giá thể ngoài môi

trường tự nhiên (sau 8 tuần)

Số cây Công Số cây ra Tỷ lệ sống Chiều cao Loại giá thể sống thức (cây) (%) cây (cm) (cây) (CT)

13 65.06 ± 1.07 4.64 ± 0.50 Đất 20 CT 1

15 75.98 ± 0.54 4.94 ± 0.34 Dớn 20 CT 2

20 Sơ dừa 14 70.14 ± 0.55 4.8 ± 0.28 CT 3

Dớn + trấu hun

20 (2:1) 18 90.44 ± 0.94 6.02 ± 0.34 CT 4

Sơ dừa + trấu

20 hun (2:1) 17 85.04 ± 0.71 5.48 ± 0.20 CT 5

Bảng 3.8 thể hiện kết quả ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng

và phát triển của cây con. Giá thể dớn cho tỷ lệ cây sống đạt 75,98 %, chiều

cao cây là 4,94 cm, giá thể sơ dừa cho tỷ lệ cây sống là 70,14 %, chiều cao cây

đạt 4,8 cm. Khi phối trộn hai loại giá thể cho tỷ lệ cây sống tăng rõ rệt, đặc biệt

là ở công thức 4 (Dớn + trấu hun 2:1) cho tỷ lệ cây sống cao nhất đạt 90,44%,

chiều cao cây 6,02 cm. Sử dụng phương pháp so sánh mẫu độc lập theo tiêu

chuẩn phi tham số của Kruskal và Wallis, kết quả cho thấy tỷ lệ cây sống ở các

công thức thực sự khác nhau có ý nghĩa ở độ tin cậy 95 %. Sử dụng hàm Anova

52

Single Factor để phân tích phương sai một nhân tốnhằm tìm nguyên nhân của sự

sai khác trên, kết quả cho thấy F > F crit. Vì vậy, tỉ lệ cây sống ở công thức khác

nhau là do khác nhau về giá thể ra cây.

Ở chỉ tiêu chiều cao cây, khi so sánh mẫu độc lập theo tiêu chuẩn phi tham

số của Kruskal và Wallis cho kết quả sai khác về chiều cao cây trong các thí

nghiệm không có ý nghĩa ở mức tin cậy 95%. Vì vậy, đánh giá ảnh hưởng của giá

thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm

thì chỉ tiêu tỷ lệ cây sống là quan trọng nhất. Công thức 4 với giá thểlà dớn + trấu

hun (2:1) là công thức thích hợp (tỷ lệ cây sống là 90,44%, chiều cao cây 6,02

cm) cho sự sinh trưởng và phát triển của cây lan Hài Giáp ngoài vườn ươm

Hình 3.7: Ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của

lan Hài Giáp (sau 8 tuần)

53

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1. Kết luận

- Công thức khử trùng quả lan Hài trong cồn 70º kết hợp với HgCl2 0,1% cho

hiệu quả khử trùng cao nhất với tỷ lệ mẫu sống không nhiễm đạt 71,78%.

- Công thức môi trường MS cho tỷ lệ nảy mầm của hạt cao nhất đạt 84,7%.

- Công thức tốt nhất để nhân nhanh chồi lan Hài Giáp: MS cơ bản + BA 2 mg/l +

NAA 0,3 mg/l cho hệ số nhân đạt 3,16 lần. Khi bổ sung 100 g/l dịch chiết chuối

vào môi trường cho hệ số nhân cao nhất so với các công thức còn lại

- Môi trường thích hợp cho sự tạo rễ của chồi lan Hài Giáp trong ống nghiệm là:

MS cơ bản + NAA 0,4 mg/l + than hoạt tính 1 g/l.

- Giá thể thích hợp cho cây con sau in vitro là dớn + trấu hun (2:1) cho tỷ lệ sống

đạt 90,44%.

2. Đề nghị

- Tiếp tục nghiên cứu thêm ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng

khác đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp

- Nghiên cứu thêm giá thể thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển cây con

in vitro.

- Ứng dụng môi trường thích hợp vào nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

tế bào thực vật để nhân nhanh cây lan Hài Giáp

54

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I Tài liệu tiếng việt

1. Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp (2008), Lan

Hài Việt Nam, Nxb Giao thông Vận tải TP Hồ Chí Minh.

2. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhi ̣, Lê Thi ̣ Muội (2002), Công nghê ̣ sinh học thực

vật trong cải tiến giống cây trồng, Nxb Khoa ho ̣c và Kỹ thuâ ̣t.

3. Nguyễn Thị Cúc, Nguyễn Văn Kết, Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thị Kim Lý

(2014),“ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ lên quá trình sinh

trưởng và phát triển cây lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii ) in vitro”,

Tạp chí Sinh học, tập 36 (số 1), trang 250 – 256.

4. Hoàng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu

Hà (2010), “ Nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan Hài

quý Paphiopedilum hangianum pernergurss (Hài Hằng)”, Tạp chí Khoa

học và Phát triển,tập 8(số 2), trang 194 – 201.

5. Trần Hợp (1990), Phong lan Việt Nam (tập 1,2), Nxb Khoa học và Kỹ thuâ ̣t.

6. Lê Quang Luân (2007), “Nghiên cứu nhân giống in vitro tạo nguồn nguyên

liệu gây đột biến hoa lan quý ở Việt Nam”, Báo cáo tổng kết đề tài cấp Cơ

sở Tp. HCM.

7. Vũ Quốc Luận, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh,

Dương Tấn Nhựt (2014), “ Ảnh hưởng của các chất bổ sung hữu cơ lên quá

trình sinh trưởng và phát triển của chồi lan Vân Hài (Paphiopedilum

callosum) nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, tập 52 (số

1), trang 49 – 62.

8. Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Đỗ Khắc Thịnh, Dương Tấn Nhựt

(2014), “ Sử dụng phương pháp cắt đốt và trồng trực tiếp ra vườn ươm cây

lan Hài Hồng ( Paphiopedilum delenatii)”, Tạp chí sinh học,tập 36 (số 1),

trang 272 – 276.

55

9. Mai Xuân Lương (2005), Công nghệ sinh học thực vật, Nxb Đại học Đà

Lạt.

10. Nguyễn Thị Tuyết Mai (2011), “ Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở

cây lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài ( Paphiopedilum

callosum) bằng phương pháp chiếu xạ”, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường

Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM.

11. Chu Văn Mẫn (2009), Tin học trong Công nghệ Sinh học, Nxb Giáo dục

Việt Nam.

12. Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch, Đỗ Đức Thịnh, Hoàng Minh Tú

(2008), “Xây dựng quy trình nhân nhanh giống Địa lan Hồng Hoàng

(Cymbidiumiridioides) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào”, Tạp chí Khoa

học vàPhát triển, tập 6 (số 4), trang 387 – 394..

13. Ngô Thị Nguyệt, Tô Phương Thảo, Đặng Thị Chinh, Hoàng Thị Thế

(2013), Thu thập, lưu trữ nguồn gen và ứng dụng công nghệ sinh học trong

bảo tồn và phát triển một số loài lan quý ở Quảng Ninh, Báo cáo tổng hợp

kết quả khoa học công nghệ đề tài, Trung tâm Khoa học và Sản xuất Lâm

Nông nghiệp Quảng Ninh.

14. Đặng Xuyến Như (2006), Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống và nuôi trồng

cây giống của hai loài lan Hài Việt Nam, Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ

thuật đề tài, Viện Ứng dụng Công nghệ.

15. Dương Tấn Nhựt (2007), Một số kỹ thuật mới trong nhân giống vô tính

cây Lan Hài (Paphiopedilum delenatii), Báo cáo khoa học tại Hội thảo ứng

dụng các kỹ thuật mới trong nhân giống và nuôi trồng hoa lan tại Tp Hồ

Chí Minh.

16. Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành, Phạm Thị Oanh (2013), “Nghiên

cứu sơ bộ hiện trạng và đề xuất giải pháp bảo tồn các loài thực vật có nguy

cơ bị tuyệt chủng tại khu bảo tồn thiên nhiên Hang Kia, Pa Cò, Hòa Bình”,

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29,

Số 4 (2013) 36-43.

56

17. Nguyễn Thị Sơn, Từ Bích Thủy, Đặng Thị Nhàn, Nguyễn Thị Lý Anh,

Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch (2011), “Nhân giố ng in vitro giố ng

lan Dendrobiu fimbriatum Hook. (Lan Hoàng Thảo Long nhãn)”, Tạp chí

Khoa học và Phát triển, tâ ̣p 10 (số 2), trang 263 – 271.

18. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Lý Anh (2003), “Nghiên cứ u xây dựng quy trình nhân giố ng và nuôi trồng phong lan Phalaenopsis (lan Hồ Điệp)”, Báo cáo khoa học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật.

19. Nguyễn Đứ c Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bà o thực vật - Nghiên cứ u và

ứ ng dụng, Nxb Nông nghiê ̣p.

20. Nguyễn Thiện Tịnh (2001), Lan Việt Nam, Nxb Nông nghiệp Tp Hồ

Chí Minh.

21. Khuất Hữu Trung, Kiều Thị Dung, Nguyễn Thúy Điệp, Bùi Thị thu Hương,

Trần Duy Dương, Đặng Trọng Lương (2007), “ Nghiên cứu đa dạng di truyền

loài lan Hài đốm (Paphiopedilum concloro pfizer) bản địa của Việt Nam” , Tạp

chí Khoa học và Công nghệ, số 3 (tập 2), trang 70 – 77.

22. Đỗ Đăng Vịnh (2002), Công nghê ̣ sinh học cây trồ ng, Nxb Nông nghiê ̣p.

II.Tài liệu tiếng Anh

23. Bubeck S. K. (1973), A suty of Paphiopedilum meristem culture,Ph.D

Thesis, Rutgers University Microfilm International, Ann Arbor, Mivhigan,

The USA.

24. Chen T. Y., Chen J. T., Chang W. C. (2004a), “Plant regeneration through

direct shoot bud formation from leaf cultures of Paphiopedilum orchids”,

Plant Cell Tiss Organ Cult,Vol 76: 11–15.

25. Chen Z. L., Ye X. L., Liang C. Y., Duan J. (2004b),“Seed germination in

vitro of Paphiopedilum armeniacum and P.micranthum”, Acta Hortic

Sinica, Vol 31 (4): 540–542.

57

26. Chyuam Y. N., Saleh N. M. (2011), “In vitro propagation of Paphiopedilum

orchid through formation of protocorm-like bodies”, Plant. Cell. Tiss. Org.

Cult, Vol 105: 193 – 202.

27. Ding C. C., Wu H., Liu F. Y. (2004), “Factors affecting the germination of

Paphiopedilum armeniacum”, Acta Bot Yunnanica, Volume 26(6): 673–

677.

28. Edy S. W. U., Hery P., Thin D. (2015), “Asymbiotic seed germination and

in vitro seedling development of Paphiopedilum liemianum fowlie an

endangered Jerrestrial Orchid in Nothern Sumatra Indonesia”, Journal of

plant sciences, Vol10 (1): 25 – 34.

29. Huang L.C., Lin C. J. (2000), "Paphiopedilum clonning in vitro", Scientia

Horticulturae , Vol 91: 111-121.

30. Koshiro K. (2006), "Clonal propagation of Paphiopedilum by tissue

culture in vitroculture of ovaries", Flower Stalks and Undevelop Flower

Buds, Vol 5 (2): 35 – 46.

31. Lee Y. I., (1998), The study of embryo development and seed germination

in vitro in slipper orchids, MSc thesis. National Taiwan University,

Taiwan.

32. Lee Y. I., Chen M. C., Huang C. Y. (2010), Effect of medium composition

on a asymbiotic seed germination of five phalaenopsis species, ISHS Acta

Horticulturae 878, International Orchid Symposium November 25th.

33. Liao Y. J., Tsai Y. C., Sun Y. W., Lin R. S., Wu F. S. (2011), “In vitro

shoot induction and plant regeneration from flower buds in Paphiopedilum

orchids”, In vitro Cell, Dev. Biol. plant 47, pp.702 – 709.

34. Lin Y. H., Chang C., Chang W. C. (2000), “Plant regeneration from callus culture

of aPaphiopedilum hybrid”, Plant. Cell. Tiss. Org. Cult. Vol 62: 21 – 25.

35. Liu Z. J., Liu K. W., Chen L. J. (2006), “Conservation ecology of

endangered species Paphiopedilum armeniacum (Orchidaceae)”,Acta Ecol

Sinica, Vol 26(9):2791–2800.

58

36. Nhut D. T., Thuy D. T. T., Dong N. T. (2007), “In vitro stem elongation

of Paphiopedilum Delenatii Guillaumin and shoot regeneration via stem

node culture”, Propagation of Ornamental Plants, Vol 7 (1): 29 – 36.

37. Nhut D. T., Thuy D. T. T., Luan V. Q., Dong N. T., Khiem D. V., Van T.

T. (2005), “ Micropropagation of Paphiopedilumdelenatii via stem node

culture”, Vietnam – Korea International Symposium, Bio-Technology &

Bio-System Engineering, pp. 184 – 190.

38. Nhut D. T., Trang P. T. T., Vu N. H., Thuy D. T. T., Khiem D. V., Binh N.

V., Van T. T. (2005), “ A wounding method and liquid culture in

Paphiopedilum delenatiii propagation”, Propagation of Ornamental

Plants, Vol 5 (3): 156 – 161.

39. Songjun Z., Wang J., Wu K. (2012), “In vitro propagation of

Paphiopedilum hangianum Perner and Gruss”, Scientia Horticulturae, Vol

151: 147 – 156.

40. Stewart J., Button J. (1975), “Tissue culture studies in Paphiopedilum”,

American Orchid Society Bulletin, Vol 44: 591 – 599.

41. Van Staden J, Stewart J. (1975), “Cytokinins in banana fruit”,

Zpflanzenphysiol, Vol 76: 280-283

Trang Web

42. www.vuonhoalan.net

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Thành phần cơ bản của môi trường MS

Nồng độ hóa

Nồng độ hóa

Lượng lấy cho

Dung

chất trong 1 lít

chất trong 1 lít

Hóa chất

1 lít môi trường

dịch mẹ

dung dịch mẹ

môi trường

nuôi cấy (ml/l)

nuôi cấy (mg/l)

(g/l)

82,5

1650,0

NH4NO3

MS I

20

95,0

1900,0

KNO3

37,0

370,0

MgSO4. 7H2O

2,23

22,3

MnSO4. 4H2O

MS II

10

1,058

10,6

ZnSO4. 7H2O

0,0025

0,025

CuSO4. 5H2O

44,0

440,0

CaCl2. 2H2O

MS III

KI

0,083

10

0,83

0,0025

0,025

CoCl2. 6H2O

17,0

170,0

KH2PO4

MS IV

0,62

10

6,2

H3BO3

0,025

0,25

Na2MoO4. 2H2O

2,784

27,85

FeSO4. 7H2O

MS V

10

3,724

37,25

Na2EDTA. 2H2O

Nicotinic acid

0,5

0,5

Pyridocine HCl

0,5

0,5

Vitamins

Thiamine HCl

0,1

0,1

Glycine

2,0

2,0

Inositol

100,0

Sucrose

30000

Agar

5400

pH

5,6 - 5,8

5,6 - 5,8

Phụ lục 2: Thành phần cơ bản của môi trường WPM (Woody Plant Medium –

Lioyd và Mc Cown, 1980)

Muối khoáng

Nồng độ (mg/l)

0.25

CuSO4.5H2O

37.2

Na2EDTA.2H2O

6.20

H3BO3

Vi lượng

22.30

MnSO4.H2O

27.8

FeSO4.7H2O

8.6

ZnSO4.7H2O

96

CaCl2.2H2O

556

Ca(NO3)2.4H2O

170

KH2PO4

Đa lượng

990

K2SO4

370

MgSO4.7H2O

400

NH4NO3

0.25

NaMoO4.2H2O

Myo – inositol

100

Pyridoxine HCl

0.5

Glycine

2.0

Các chất hữa cơ

Nicotinic acid

0.5

Thiamine HCl

1.0

Agar

6

Đường

30

Phụ lục 3: Thành phần cơ bản của môi trường B5 (Gamborg cs, 1976)

Muối khoáng

Nồng dộ (mg/l)

134

(NH4)2SO4

150

CaCl2.2H2O

246

MgSO4.7H2O

2.258

KNO3

10

MnSO4.2H2O

KI

0.75

Đa lượng

0.25

Na2MoO4.2H2O

150

Na2H2PO4.2H2O

2.0

ZnSO4.7H2O

37.2

Na2EDTA.2H2O

3

H3BO3

0.025

CoCl2.6H2O

0.025

CuSO4.5H2O

Vi lượng

27.8

FeSO4.7H2O

Myo- inositol

100

Nicotinic acid

1

Pyrodoxine HCl

1

Các chất hữu cơ

Thiamine

10

Đường

30

Phụ lục 4: Kết quả xử lý số liệu

4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến QUẢ

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average Variance

5

0

0

0

ct 1

5

229.7

45.94

29.508

ct 2

5

358.9

71.78

8.722

ct 3

5

305.8

61.16

7.103

ct 4

5

271.1

54.22

16.852

ct 5

ANOVA

Source of Variation

SS

Df

MS

F

P-value

F crit

Between Groups

15380.42

4 3845.105 309.1666 1.13E-17 2.866081

Within Groups

248.74

20

12.437

15629.16

24

Total

Lan Hài Giáp

Kết luận: Qua kết quả phân tích trên cho thấy F >F crit nên thời gian xử lý HgCl2

0,1% ảnh hưởng đến kết quả khử trùng quả lan Hài Giáp.

4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum Average Variance

ct1

5

67 22.33333 8.163333

ct2

5 254.1

84.7

17.01

ct3

5 215.8 71.93333 10.17333

ct4

5 188.8 62.93333 9.823333

ANOVA

Source of

Variation

SS

Df

MS

F

P-value

F crit

Between

Groups

6609.743

4 1652.436 142.6645 8.96E-09 3.47805

Within

Groups

115.8267

10 11.58267

Total

6725.569

14

lan Hài Giáp.

Kết luận: Qua kết quả nghiên cứu cho thấy F > Fcrit vì vậy môi trường khác nhau

có ảnh hưởng tới khả năng nảy mầm của hạt.

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average Variance

5

7.85

1.57

0.102

ct1

5

9.52

1.904

0.09758

ct2

5

12.05

2.41

0.03425

ct3

5

12.5

2.5

0.1148

ct4

5

9.35

1.87

0.052

ct5

ANOVA

Source of

Variation

SS

Df

MS

F

P-value

F crit

Between Groups 3.081064

4 0.770266 9.613184 0.000167 2.866081

Within Groups

1.60252

20 0.080126

Total

4.683584

24

4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp 4.3.1 Chỉ tiêu hệ số nhân chồi

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum Average Variance

ct 1

5

9.85

1.97

0.0095

ct2

5

9.95

1.99

0.02175

ct3

5

9.65

1.93

0.0045

ct4 ct5

5 5

9.8 7.65

1.96 1.53

0.01675 0.047

ANOVA

Source of Variation

SS

Df

MS

F

P-value

F crit

Between Groups

0.7576

4

0.1894 9.517588 0.000177 2.866081

Within Groups

0.398

20

0.0199

Total

1.1556

24

Kết luận: Qua kết quả phân tích trên cho thấy F >F crit nên số hệ số nhân chồi khác nhau là do sự khác nhau về hàm lượng BA khác nhau. 4.3.2 Chỉ tiêu chiều cao chồi.

Kết luận: Qua kết quả phân tích trên cho thấy F >F crit nên chiều cao chồi khác nhau là do sự khác nhau về hàm lượng BA khác nhau.

4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA tới khả năng nhân nhanh

chồi lan Hài Giáp

Anova: Two-Factor Without Replication

SUMMARY

Count

Sum

Average

Variance

5

13.45

2.69

0.4055

BA 2 mg/l

5

12.45

2.49

0.513

BA 2 mg/l

5

14.13

2.826

0.31138

BA 2 mg/l

5

14.92

2.984

0.34753

BA 2 mg/l

5

13.95

2.79

0.288

BA 2 mg/l

5

9.6

1.92

0.02575

NAA 0 mg/l

5

14

2.8

0.15

NAA 0,1 mg/l

5

15.8

3.16

0.11675

NAA 0,3 mg/l

5

16.4

3.28

0.15595

NAA 0,5 mg/l

5

13.1

2.62

0.137

NAA 1 mg/l

ANOVA

Source of

Variation

SS

Df

MS

F

P-value

F crit

Rows

0.66576

4

0.16644 1.588888093 0.225425025 3.00691728

Columns

5.7856

4

1.4464 13.80778502 4.66784E-05 3.00691728

Error

1.67604

16 0.104753

Total

8.1274

24

4.4.1 Chỉ tiêu hệ số nhân chồi

Qua kết quả phân tích trên cho thấy:

F rows (BA) < F crit (BA) nên hàm lượng BAkhông ảnh hưởng tới số chồi/ mẫu.

F colum (NAA) > F crit (NAA) nên hàm lượng NAA ảnh hưởng tới số chồi/ mẫu.

Anova: Two-Factor Without Replication

SUMMARY

Count

Sum Average

Variance

BA 2 mg/l

5

10.7

2.14

0.04425

BA 2 mg/l

5

10.5

2.1

0.07875

BA 2 mg/l

5

11.6

2.32

0.08075

BA 2 mg/l

5 11.65

2.33

0.0311

BA 2 mg/l

5

10.3

2.06

0.063

NAA 0 mg/l

5 10.27

2.054

0.04808

NAA 0,1 mg/l

5

10.8

2.16

0.05675

NAA 0,3 mg/l

5 11.12

2.224

0.02813

NAA 0,5 mg/l

5 10.95

2.19

0.103

NAA 1 mg/l

5 11.61

2.322

0.09442

ANOVA

Source of

Variation

SS

Df

MS

F

P-value

F crit

Rows

0.32

0.08 1.278057353 0.319606187 3.00691728

4

Columns

0.18988

0.04747 8.758367282 0.567281274 3.00691728

4

Error

1.00152

16 0.062595

Total

1.5114

24

4.4.2 Chỉ tiêu chiều cao chồi

Qua kết quả phân tích trên cho thấy:

F rows (BA) < F crit (BA) nên hàm lượng BA không ảnh hưởng tới chiều cao chồi.

F colum (NAA) > F crit (NAA) nên hàm lượng NAA ảnh hưởng tới chiều cao chồi.

4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết chuối tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp.

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average Variance

5

9.55

1.91

0.0155

ct1

5

11.05

2.21

0.4905

ct2

5

13.8

2.76

0.05175

ct3

5

12.33

2.466

0.08378

ct4

5

11.82

2.364

0.18748

ct5

ANOVA

Source of

Variation

SS

Df

MS

F

P-value

F crit

Between

1.97316

4

0.49329 2.975175 0.044382 2.866081

Groups

Within

3.31604

20 0.165802

Groups

Total

5.2892

24

4.5.1 Chỉ tiêu hệ số nhân chồi

Kết luận: Vì F> Fcrit do đó hàm lượng dịch chuối có ảnh hưởng tới chỉ tiêu hệ

số nhân.

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average Variance

5

11.72

2.344

0.08693

ct1

5

9.9

1.98

0.01575

ct2

5

10.1

2.02

0.037

ct3

5

9.72

1.944

0.00668

ct4

5

9.47

1.894

0.05168

ct5

ANOVA

Source of

Variation

SS

Df

MS

F

P-value

F crit

Between

Groups

0.634416

4 0.158604 4.004343 0.015183 2.866081

Within Groups

0.79216

20 0.039608

Total

1.426576

24

4.5.2 Chỉ tiêu chiều cao chồi.

Kết luận: Vì F> Fcrit do đó hàm lượng dịch chuối có ảnh hưởng tới chỉ tiêu chiều

cao chồi

4.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA tới khả năng ra rễ của lan Hài Giáp

Anova: Single

Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average Variance

5

274.5

54.9

0.55

ct 1

5

442.7

88.54

4.463

ct2

5

411

82.2

4.83

ct3

5

347.2

69.44

3.313

ct4

5

325.9

65.18

3.862

ct5

ANOVA

Source of

SS

Df

MS

F

P-value

F crit

Variation

5.02552

Between

3615.3704

4 903.8426

265.5549

E-17 2.866081402

Groups

Within Groups

68.072

20

3.4036

Total

3683.4424

24

4.6.1 Chỉ tiêu tỷ lệ chồi ra rễ

Kết luận: F > Fcrit do đó nồng độ NAA có ảnh hưởng tới chỉ tiêu tỷ lệ chồi ra rễ

4.6.2 Chỉ tiêu số rễ/chồi.

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average Variance

5

10.09

2.018

0.03262

ct1

5

19.79

3.958

0.03832

ct2

5

18.5

3.7

0.075

ct3

5

15.6

3.12

0.037

ct4

5

14.4

2.88

0.057

ct5

ANOVA

P-

Source of

Variation

SS

Df

MS

F

value

F crit

7.24E-

Between

11.54746

4 2.886866 60.15808

11 2.866081

Groups

Within

0.95976

20 0.047988

Groups

Total

12.50722

24

Kết luận: Kết quả nghiên cứu cho thấy F > F crit nên nồng độ NAA ảnh hưởng

tới chỉ tiêu số rễ/chồi

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum Average Variance

5

11.3

2.26

0.028

ct1

5

18.2

3.64

0.053

ct2

5

17

3.4

0.065

ct3

5 15.22

3.044

0.05068

ct4

5

13.5

2.7

0.065

ct5

ANOVA

Source of

Variation

SS

Df

MS

F

P-value

F crit

Between

6.043744

4 1.510936 28.86992 4.68E-08 2.866081

Groups

Within

1.04672

20 0.052336

Groups

Total

7.090464

24

4.6.3 Chỉ tiêu chiều dài rễ

Kết luận: Kết quả nghiên cứu cho thấy F > F crit nên nồng độ NAA ảnh hưởng

tới chỉ tiêu chiều dài rễ.

4.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính

4.7.1 Chỉ tiêu tỷ lệ chồi ra rễ

Anova: Two-Factor Without Replication

SUMMARY

Count

Average

Variance

79.78 79.68 82.04 80.14 78.76

62.732 69.147 40.828 85.818 69.063

Sum 5 398.9 5 398.4 5 410.2 5 400.7 5 393.8 5 350.1 5 386 5 457.3 5 415.6 393 5

70.02 77.2 91.46 83.12 78.6

2.107 4.375 3.343 2.902 9.115

NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l THT 0mg/l THT 0,5 mg/l THT 1 mg/l THT 1,5 mg/l THT 2mg/l ANOVA

Source of Variation

df

MS

F

P-value

SS 29.188 1252.172 58.18

4 4 16

313.043 3.63625

7.297 2.006737711 0.142020164 86.0895153 1.30569E-10

1339.54

24

Rows Columns Error Total

4.7.2 Chỉ tiêu số rễ/chồi

Anova: Two-Factor Without Replication

SUMMARY

Variance

Average 3.46 3.18 3.42 3.18 3.38

0.178 0.182 0.287 0.217 0.257

Count Sum 5 17.3 5 15.9 5 17.1 5 15.9 5 16.9 5 14.4 5 16.2 5 19.5 18 5 15 5

2.88 3.24 3.9 3.6 3

0.057 0.053 0.065 0.115 0.025

NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l THT 0mg/l THT 0,5 mg/l THT 1 mg/l THT 1,5 mg/l THT 2mg/l

ANOVA

Source of Variation

F

F crit

Rows

SS 0.3616

df 4

MS 0.0904 1.609973286

P-value 0.220173 3.006917 1.9209E-

0.8964 15.96438112

05 3.006917

4 16

0.05615

Columns Error Total

3.5856 0.8984 4.8456

24

4.7.3 Chỉ tiêu chiều dài rễ

Anova: Two-Factor Without Replication

Variance

Sum 16.9 18 17.6 16.3 17.02

Count 5 5 5 5 5

Average 3.38 3.6 3.52 3.26 3.404

0.032 0.25 0.117 0.158 0.23208

5 5 5 5 5

3.02 3.32 3.84 3.5 3.484

0.037 0.082 0.093 0.095 0.12328

F

P-value

F crit

SS 0.345184 1.780384 1.375936

MS 0.086296 1.003488534 0.434525 3.00691728 0.445096 5.175775617 0.007189 3.00691728 0.085996

15.1 16.6 19.2 17.5 17.42 df 4 4 16 24

SUMMARY NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l NAA 0,4 mg/l THT 0mg/l THT 0,5 mg/l THT 1 mg/l THT 1,5 mg/l THT 2mg/l ANOVA Source of Variation Rows Columns Error Total

3.501504

4.8 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của

lan Hài Giáp.

4.8.1 Chỉ tiêu tỷ lệ cây sống

Anova: Single Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average Variance

ct1

5

325.3

65.06

5.743

ct2

5

379.9

75.98

1.502

ct3

5

350.7

70.14

1.523

ct4

5

452.2

90.44

4.428

ct5

5

425.2

85.04

2.568

ANOVA

Source of Variation

SS

df

MS

F

P-value

F crit

3.349E-

Between Groups

2176.9384

4 544.2346 172.6194

15 2.8660814

Within Groups

63.056

20

3.1528

Total

2239.9944

24

Kết luận: Kết quả nghiên cứu cho thấy F > F crit nên giá thể có ảnh hưởng tới chỉ

tiêu tỷ lệ sống của cây.

4.8.2 Chỉ tiêu chiều cao cây.

Anova: Singl

Factor

SUMMARY

Groups

Count

Sum

Average Variance

5

23.2

4.64

1.208

CT1

5

24.7

4.94

0.583

CT2

5

30.1

4.8

0.587

CT3

5

27.4

6.02

0.192

CT4

5

24

5.48

0.41

CT5

ANOVA

Source of

Variation

SS

Df

MS

F

P-value

F crit

Between Groups

6.4456

4

1.6114 2.703691 0.05982 2.866081

Within Groups

11.92

20

0.596

Total

18.3656

24

Kết luận: Kết quả nghiên cứu cho thấy F < F crit nên giá thể không ảnh hưởng tới

chỉ tiêu chiều cao cây.