Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ Sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống bioreactor

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM

VÀ ĐÀO TẠO

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

----------------------

NGUYỄN ĐÌNH TRỌNG

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ SÂM DÂY

(Codonopsis sp.) TRONG HỆ THÔNG BIOREACTOR

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội, 2015

1

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM

VÀ ĐÀO TẠO

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

----------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ SÂM DÂY

(Codonopsis sp.) TRONG HỆ THÔNG BIOREACTOR

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

Học viên: Nguyễn Đình Trọng

Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Chu Hoàng Hà

Hà Nội, 2015

2

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn được hoàn thiện bằng quá trı̀nh nghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn trực tiếp của PGS. TS.

Chu Hoàng Hà cùng với cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công

nghệ sinh học. Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn này

là trung thực, không sao chép bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người

khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam

đoan của mình trước hội đồng khoa ho ̣c.

Hà Nội, tháng 12 năm 2015

Học viên

Nguyễn Đình Trọng

3

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lỏng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn, giúp

đỡ tận tịnh tôi hoàn thành luận văn này:

PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Trưởng phòng

Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ sinh học, đã hướng dẫn và hỗ trợ tận

tình, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện

đề tài.

TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện

Công nghệ sinh học, người cô, người chị đã trực tiếp hướng dẫn, luôn theo sát thí

nghiệm của tôi để đưa ra những lời khuyên bổ ích và kịp thời cho tôi ngay từ những

ngày đầu tiên tôi bước vào phòng thí nghiệm.

GS. TS. Lê Trần Bình, PGS. TS. Lê Văn Sơn, TS. Chu Nhật Huy, KS. Nguyễn

Khắc Hưng, CN. Nguyễn Phú Tâm và các cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật

đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình về chuyên môn.

Trong những năm học tập và nghiên cứu tại phòng Công nghệ tế bào thực vật,

tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành của tập thể

cán bộ phòng. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo tại cơ sở Viện Sinh thái

và Tài nguyên Sinh vật đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian

học tập vừa qua.

Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn

ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này.

Hà Nội, tháng 12 năm 2015

Học viên

Nguyễn Đình Trọng

4

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ------------------------------------------------------------------------------------------------------ -

LỜI CẢM ƠN ------------------------------------------------------------------------------------------ -

MỤC LỤC ------------------------------------------------------------------------------------------------ i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT -------------------------------------------------------------------- iii

DANH MỤC BẢNG ---------------------------------------------------------------------------------- iv

DANH MỤC HÌNH ----------------------------------------------------------------------------------- v

MỞ ĐẦU ------------------------------------------------------------------------------------------------ 1

1.1.Đặt vấn đề -----------------------------------------------------------------------------------------------------------1

1.2.Mục đích nghiên cứu --------------------------------------------------------------------------------------------2

1.2.1. Mục tiêu tổng quát ------------------------------------------------------------------------------- 2

1.2.2. Mục tiêu cụ thể ----------------------------------------------------------------------------------- 2

1.3.Nội dung nghiên cứu --------------------------------------------------------------------------------------------3

1.4.Ý nghĩa khoa học -------------------------------------------------------------------------------------------------3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ---------------------------------------------------------- 4

1.1.Tổng quan về cây Sâm dây -----------------------------------------------------------------------------------4

1.1.1. Giới thiệu về phân bố địa lý -------------------------------------------------------------------- 4

1.1.2. Phân loại------------------------------------------------------------------------------------------- 4

1.1.3. Hình thái------------------------------------------------------------------------------------------- 4

1.1.4. Tác dụng dược lý của cây Sâm dây ----------------------------------------------------------- 5

1.1.5. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây Sâm dây ------11

1.2.Nuôi cấy sinh khối rễ tơ – giải pháp tạo nguồn dược phẩm sạch phục vụ sức khoẻ cộng đồng ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12

1.2.1. Giới thiệu về nuôi cấy nuôi cấy sinh khối tế bào -------------------------------------------12

1.2.2. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phương pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật---- -----------------------------------------------------------------------------------------------------------13

1.2.3. Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật --------------------------------14

1.2.4. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ ------------------------------------------------------------------------17

1.2.5. Ứng dụng hệ thống bioreactor trong nuôi cấy sinh khối rễ tơ ----------------------------22

1.2.6. Ảnh hưởng của elicitor đến khả năng tích luỹ các chất thứ cấp --------------------------24

1.3.Một số phương pháp tách chiết, phương pháp định tính và định lượng saponin -- 26

1.3.1. Phương pháp tách chiết ------------------------------------------------------------------------26

1.3.2. Một số phương pháp định tính saponin ------------------------------------------------------27

1.3.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ trong định lượng saponin tổng số ------------------28

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -------------------------- 29

2.1.Vật liệu nghiên cứu -------------------------------------------------------------------------------------------- 29

i

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

2.2.Thiết bị và hoá chất nghiên cứu -------------------------------------------------------------------------- 29

2.3.Phương pháp nghiên cứu ----------------------------------------------------------------------------------- 29

2.3.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật --------------------------------------------------29

2.3.2. Đánh giá các dòng chuyển gen bằng phương pháp PCR ----------------------------------30

2.3.3. Đánh giá khả năng tăng sinh của các dòng rễ tơ Sâm dây --------------------------------31

2.3.4. Xác định kích thước mẫu cấy phù hợp cho nuôi cấy --------------------------------------32

2.3.5. Xác định loại môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ trên môi trường thạch.--------32

2.3.6. Xác định loài môi trường lỏng thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ -----------------------------33

2.3.7. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sinh trưởng và tích luỹ chất khô trong rễ tơ Sâm dây--------------------------------------------------------------------------------------------------33

2.3.8. Lựa chọn mô hình nuôi cấy bioreactor phù hợp --------------------------------------------34

2.3.9. Phương pháp nuôi cấy sinh khối rễ tơ trong hệ thống bioreactor ------------------------34

2.3.10.Phương pháp tách chiết saponin từ sinh khối rễ tơ ---------------------------------------35

2.3.11.Phương pháp bán định lượng hàm lượng saponin trong sinh khối rễ tơ ---------------35

2.3.12.Phương pháp tính toán ------------------------------------------------------------------------36

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN --------------------------------------------------- 37

3.1. Kiểm tra đánh giá các dòng rễ tơ chuyển gen bằng phương pháp PCR --------------- 37

3.2. Đánh giá tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ Sâm dây ----------------------------------- 39

3.3. Xác định kích thước mẫu phù hợp cho nuôi cấy ------------------------------------------------- 41

3.4.Xác định loại môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ trên môi trường đặc -------- 42

3.5.Kết quả nuôi cấy rễ tơ trên các môi trường lỏng khác nhau -------------------------------- 43

3.6.Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sinh trưởng và tích luỹ hợp chất thứ cấp trong rễ tơ Sâm dây ------------------------------------------------------------------------------------------------- 45

3.7.Lựa chọn mô hình nuôi cấy bioreactor phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất tại Viện Công nghệ sinh học ----------------------------------------------------------------------------------------- 47

3.8.Kết quả nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên các mô hình bioreactor ------------------------------- 49

3.9.Kết quả bán định lượng hàm lượng saponin tổng số trong sinh khối rễ tơ, so sánh với sâm tự nhiên ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 52

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ --------------------------------------------------- 55

1.1.Kết luận ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 55

1.2.Kiến nghị ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO ------------------------------------------------------------------------- 56

ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A. rhizogenes :

Agobacterium rhizogenes

A. tumefaciens : Agrobacterium tumefaciens

Aux

: Auxin

B5 : Gamborg B5, 1968

bp

:

Base pair

DNA

: Desoxyribonucleic acid

GusA

:

β-glucuronidase

kp

: Kilobase pair

LB

:

Left border

MS : Murashige and Skoog, 1962

MeOH : Methanol

:

RB

Right border

:

Ri-plasmid

Root induction plasmid

Rol

: Root locus

SA : Salicylic acid

:

SH

Schenk và Hildebrandt, 1972

:

sp

Species

:

ss T-DNA

Single strain T-DNA

vir

: Virulence genes

JA : Jasmonic acid

WPM : McCown’s Woody Plant, 1981

iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Cấu trú c hó a ho ̣c 7 saponin trong Codonopsis lanceolata ------------------- 6

Bảng 1.2. Khả năng ức chế khối u ở chuột của CPPW1 và CPPW1B ------------------ 8

Bảng 1.3. Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh học ------ 20

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu --------------------------------------- 30

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân gen rolA, rolB, rolC--------------------- 31

Bảng 3.1. Sự phát triển của các đoạn rễ tơ sâm dây có kích thước khác nhau ------ 41

Bảng 3.2. Sự phát triển của rễ tơ sâm dây trên các loại môi trường khác nhau ----- 42

Bảng 3.3. So sánh thành phần của các môi trường cơ bản MS, B5, WPM, SH ----- 43

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của SA đến sự sinh trưởng của rễ tơ Sâm dây ----------------- 45

Bảng 3.5. Kết quả nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên các hệ thống bioreactor khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy ------------------------------------------------------------------------------- 51

Bảng 3.6. Kích thước củ Sâm dây 1 -3 tuổi thu thập ở Kon Tum --------------------- 52

Bảng 3.7. Kết quả xác định hàm lượng saponin tổng số ------------------------------- 53

iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cây Sâm dây ------------------------------------------------------------------------ 4

Hı̀nh 1.2. Cấu trú c hó a ho ̣c saponin trong sâm dây (Ichikawa et al., 2009) ----------- 6 Hình 1.3. Cơ chế chuyển gen chung của Agrobacterium ------------------------------- 15

Hình 1.4. Các hệ thống rễ tơ Sâm dây được nuôi cấy tại Viện Công nghệ sinh học 19

Hình 1.5. Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu ----------------------------------------- 24

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen rolA, rolB, rolC bằng kỹ thuật PCR -------------------------------------------------------------------------------------------------- 38

Hình 3.2. Kết quả khảo sát tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ Sâm dây --------- 40

Hình 3.3. Sự phân nhánh và kéo dài của các mẫu rễ tơ sau 2 tuần nuôi cấy trên các môi trường khác nhau.----------------------------------------------------------------------- 42

Hình 3.4. Đường cong sinh trưởng của rễ tơ sâm dây trên các môi trường khác nhau -------------------------------------------------------------------------------------------------- 44

Hình 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của SA đến sinh trưởng rễ tơ Sâm dây ----- 46

Hình 3.6. Hệ thống bioreactor mà TS. Nguyển Hữu Hổ sử dụng tại Viện Sinh học nhiệt đới --------------------------------------------------------------------------------------- 48

Hình 3.7. Hệ thống bioreactor PGS. TS. Dương Tấn Nhựt sử dụng tại Viện Sinh học Tây Nguyên ----------------------------------------------------------------------------------- 48

Hình 3.8. Hệ thống bioreactor trong ngành công nghiệp dược phẩm ở Hàn Quốc - 48

Hình 3.9. Hệ thống bioreactor đang được sử dụng tại Viện Công nghệ sinh học --- 49

Hình 3.10. Rễ tơ thu được sau 4 tuần nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít ------- 50

Hình 3.11. Các mẫu củ Sâm dây thu thập tại Kon Tum -------------------------------- 52

v

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Sâm dây hay Đẳng sâm có danh pháp khoa học là Codonopsis sp., một loài

thực vật lâu năm thuộc họ Hoa chuông (Campanulaceae). Chúng có nguồn gốc

từ khu vực Đông Bắc châu Á và bán đảo Triều Tiên. Rễ của đẳng sâm được sử

dụng trong y học cổ truyền từ xa xưa với tác dụng bổ ngũ tạng, tăng sức dẻo dai,

tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể, có tác dụng bổ huyết, chống mệt mỏi,

giảm stress. Trong sâm dây chứa các hoạt chất chủ yếu như saponin,

polysaccharide, triterpen, steroid… Do có nhiều công dụng trong y dược nên sâm

dây có nguy cơ bị khai thác quá mức làm giảm khả năng tái sinh và phát triển.

Cây Sâm dây đã được đưa vào chương trình bảo tồn các loài cây quí hiếm và

được đưa vào sách đỏ vào năm 1996 ( theo Sách đỏ Việt Nam – phần Thực vật,

NXB KHTNCN, 2007).

Những giá trị y dược quý của cây Sâm dây hiện nay đã được trong và ngoài

nước công nhận, do đó việc khai thác, sử dụng và quản lý bền vững nguồn tài

nguyên này cần được quan tâm triệt để. Những năm gần đây, cùng với xu hướng

chung trên thế giới, ở nước ta hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực

vật để sản xuất các sản phẩm thứ cấp đã bắt đầu được quan tâm đầu tư phát triển.

Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật để làm giảm hoặc

mất tính biệt hoá ở các mô tế bào nuôi cấy cần bổ sung các chất điều hoà sinh

trưởng vào trong môi trường nuôi cấy. Vấn đề này là một trong những trở ngại

lớn nhất do tồn dư của các chất điều hoà sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi

cấy. Điều này đã ảnh hướng trực tiếp đến sản phẩm cũng như sức khoẻ người tiêu

dùng. Việc này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ.

Rễ tơ là một loại bệnh xuất hiện ở thực vật bậc cao do sự xâm nhiễm của vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes gây ra. Đặc biệt, rễ tơ có thể sinh trưởng và phát

triển tốt trên môi trường không có chứa chất điều hòa sinh trưởng. Do khả năng

1

sinh trưởng nhanh, kỹ thuật nuôi cấy đơn giản kết hợp hệ thống bioreactor, rễ tơ

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

đã và đang được ứng dụng nhằm thu nhận các hợp chất thứ cấp từ các loài thực

vật có giá trị dược liệu cao. Các dược chất của sâm dây chủ yếu được tích lũy ở

rễ nên rất thích hợp cho việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy sinh khối rễ tơ. Hướng

nghiên cứu này cho khả năng thu nhận lượng lớn sinh khối rễ sâm dây tạo nguồn

nguyên liệu ốn định đáp ứng nhu cầu làm thuốc hay thực phẩm chức năng. Bên

cạnh đó còn góp phần bảo tồn đa dạng sinh học của loài Sâm dây ngoài tự nhiên.

Nuôi cấy rễ tơ trong hệ thống bioreactor gặp một số vấn đề đó là hình thái

rễ tơ của các loài thực vật khác nhau là hoàn toàn khác nhau, đặc điểm như độ

dày, độ dài, độ phân nhánh của rễ bị ảnh hưởng bởi các loài thực vật và các chủng

A. rhizogenes sử dụng cho cảm ứng tạo rễ tơ. Ngoài ra, sự tăng trưởng tế bào và

sản xuất chất chuyển hóa là không đồng nhất trong rễ tơ đã làm khó khăn trong

việc tối ưu hóa hệ thống bioreactor.

Xuất phát từ các ưu điểm trên của hệ thống nuôi cấy rễ tơ và những tác dụng

dược lý quý của cây Sâm dây, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi

cấy sinh khối rễ tơ Sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống bioreactor”.

Công trình này được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công

nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

1.2. Mục đích nghiên cứu

1.2.1. Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc

tạo sinh khối cây Sâm dây làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm và thực phẩm

chức năng bằng công nghệ nuôi cấy rễ tơ.

1.2.2. Mục tiêu cụ thể:

Lựa chọn dòng rễ tơ sâm dây sinh trưởng và phát triển ổn định. -

Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây. -

- Nuôi cấy nhân sinh khỗi rễ tơ trên các hệ thống bioreactor.

Bước đầu định lượng hàm lượng saponin trong sinh khối rễ tơ so với dược -

2

liệu tự nhiên.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

1.3. Nội dung nghiên cứu

- Phân tích các dòng rễ tơ bằng phương pháp PCR

- Đánh giá sinh trưởng của các dòng rễ tơ

- Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên môi trường đặc

- Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên môi trường lỏng

- Nuôi cấy sinh khối rễ tơ trong hệ thống bioreactor

- Tách chiết hoạt chất

- Bước đầu định lượng saponin tổng số.

1.4. Ý nghĩa khoa học

Làm cơ sở cho việc sản xuất quy mô công nghiệp sinh khối rễ tơ cây Sâm

3

dây cho mục đích làm nguyên liệu dược phẩm và thực phẩm chức năng.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về cây Sâm dây

1.1.1. Giới thiệu về phân bố địa lý

Cây Sâm dây hay Đảng sâm có tên khoa học là Codonopsis sp. là loài cây

dược liệu sử dụng củ. Cây thân leo, sống lâu năm, thường phân bố tại các vùng

núi cao có khí hậu mát mẻ quanh năm. Cây sâm dây thuộc họ Hoa chuông

(Campanulaceae).

Đảng sâm phân bố nhiều ở vùng Đông Bắc Á. Ở Việt Nam, trong thời gian

1961-1985 viện Dược liệu đã phát hiện Đảng sâm ở 14 tỉnh vùng núi phía Bắc;

còn ở phía Nam chỉ thấy xuất hiện ở vùng Tây Nguyên. Vùng phân bố tập trung

nhất ở các tỉnh Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Gia

Lai, Kon Tum, Quảng Nam, Đà Nẵng, Lâm Đồng.

1.1.2. Phân loại

Giới : Plantae

Phân giới : Tracheobionta

Nhóm lớn : Spermatophyta

Nhóm : Magnoliopsida

Bộ : Campanulales

Họ : Campanulaceae

Loài : Codonopsis sp.

Hình 1.1. Cây Sâm dây (Nguồn: http://www.rolv.no)

1.1.3. Hình thái

Sâm dây là cây thảo sống lâu năm, có xu hướng leo bằng thân quấn, phân

nhánh nhiều, phía dưới hơi có lông, phía ngọn nhẵn (Hình 1.1). Toàn thân có mủ

trắng. Lá mọc đối, ít khi mọc so le; gốc lá hình tim; đầu lá nhọn, phiến lá mỏng

4

hình trứng rộng, dài 3 - 8 cm, rộng 2 – 4 cm; mép nguyên lượn sóng hoặc hơi

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

khía răng cưa; mặt trên màu lục nhạt; mặt dưới màu trắng xám, nhẵn hoặc có lông

rải rác. Hoa mọc riêng ở kẽ lá. Có cuống dài 2 – 6 cm. Đài có 5 phiến hẹp; tràng

hình chuông, màu trắng hoặc hơi vàng, có vân tím ở họng; chia 5 thuỳ, nhị 5, chỉ

nhị hơi dẹt; bao phấn dính gốc; bầu hình cầu có 5 ô. Quả nang hình cầu, có 5 cạnh

mờ, đầu bẹt, phía trên có một núm nhỏ hình nón, đường kính 1 – 2 cm, có đài tồn

tại; khi chín màu tím hoặc đỏ; hạt nhiều, màu vàng nhạt, bóng. Rễ hình trụ dài,

đường kính có thể đạt 1 – 1,7 cm. Đầu rễ phình to, trên có nhiều vết sẹo lồi của

thân cũ, phía dưới thường phân nhánh; mặt ngoài màu vàng nhạt, khi khô màu

vàng xám (Đỗ Tất Lợi, 2005).

1.1.4. Tác dụng dược lý của cây Sâm dây

Tác dụng dược lý của cây Sâm dây đã được công bố rộng rãi trên thế giới

thông qua nhiều đề tài nghiên cứu khoa học về điều trị bệnh tiểu đường, khả năng

tăng cường sức khoẻ, tác dụng với hệ tiêu hoá, tác dụng với hệ tim mạch, tác dụng

đối với máu và hệ thống tạo máu, đối với điều hoà huyết áp, chống mệt mỏi,

chống oxy hoá, kháng ung thư, kháng khuẩn và tăng cường hệ thống miễn dịch

(Ueda et al., 2002; Li et al., 2004; Chan et al., 2009; Wang et al., 1996; Luo et

al., 2007; Liu et al., 1988; Yongxu et al., 2008; He et al., 2015; He et al., 2014).

Các dược tính của Codonopsis sp. có thể là do các thành phần hợp chất có trong

cây có khả năng cải thiện sức khoẻ con người, bao gồm: cacbohydrates,

glycosides, steroids, alkaloids, terpenes… Theo C. G. Fu và cs (2007) ở loài

Codonopsis lanceolata có 6 flavonoids, 4 alkaloids, 12 triterpenes và sterol, 10

loại hợp chất dễ bay hơi, 12 nguyên tố vi lượng và 17 acid amin (Fu et al., 2007).

Dịch chiết Codonopsis sp. có thể ngăn ngừa và bảo vệ tế bào gan chống lại tổn

thương do rượu (Bai et al., 2008; Zhang et al., 2007), và có tác dụng chống đột

biến, chống oxy hoá, chống lão hoá, cải thiện khả năng miễn dịch, chống mệt

5

mỏi, buồn ngủ, giảm đau , hạ huyết áp… (Peng et al., 2009).

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Thành phần saponin đã làm nên công du ̣ng chı́nh củ a Đảng sâm cũng như các vi ̣ thuố c sâm khác. Theo Ichikawa và cs (2009) khi phân tı́ch HPLC pha đảo kết hơ ̣p đầu dò khố i phổ ion hó a tia điê ̣n phát hiê ̣n trong rễ Codonopsis lanceolata

chứ a 7 saponin gồ m: lancemaside A, lancemaside B, lancemaside C, lancemaside E, lancemaside G, Foetidissimoside A và aster saponin Hb. Hàm lươ ̣ng lancemaside A thay đổ i từ 2,65 đến 3,64 mg/g rễ khô đố i vớ i mẫu Codonopsis Hàn Quố c, nhưng chı̉ đa ̣t 0,101 mg/g đố i vớ i mẫu có nguồ n gố c từ Nhâ ̣t Bản

(Ichikawa et al., 2009)

Hı̀nh 1.2. Cấ u trú c hó a học saponin trong sâm dây (Ichikawa et al., 2009) Bả ng 1.1. Cấ u trú c hó a học 7 saponin trong Codonopsis lanceolata (Ichikawa et al., 2009)

Aglycone

R1

R2

Hơ ̣p chất

β-GlcA

Lancemaside A

I

β–Xyl-(13)-β–Xyl-(14)-α- Rha-(12)-α-Ara

β-GlcA

Lancemaside B

I

β-Xyl-(13)-β–Xyl-(14)-α- Rha-(12)-α-Ara-(13)-Glc-β

β-GlcA

Lancemaside C

I

β-Xyl-(14)-α-Rha-(12)-α- Ara-(13)-Glc-β

Lancemaside E

I

β-Xyl-(13)-β-Xyl-(14)-α- Rha-(12)-α-Ara-(13)

β- Glc(13)- β-GlcA

II

Lancemaside G

β-GlcA

β-Xyl-(13)-β-Xyl-(14)-α- Rha-(12)-α-Ara-(13)

I

Foetidissimoside A

β-GlcA

β-Xyl-(14)-α-Rha-(12)-α-Ara

I

aster saponin Hb

β-GlcA

α-Rha-(12)-α-Ara

6

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Joh và cs (2010) cho thấy Lancemaside A có khả năng tăng tính kháng viêm

gây ra bởi các lipopolysaccharide ở trên chuột thử nghiệm. Lancemaside A làm

giảm sự hoạt động của các tác nhân gây viêm, bên cạnh đó, nhóm tác giả cho thấy

hoạt chất này có khả năng kháng viêm dựa trên cơ chế kết hợp với tác nhân gây

viêm là lipopoly saccharide và TLR4 (một protein tham gia vào quá trình phát

hiện tác nhân gây bệnh ở người và động vật) (Joh et al., 2010). Kim và cs (2014)

cho thấy Lancemaside A tách chiết từ rễ cây Codocopsis lanceolata có khả năng

điều khiển cơ chế đáp ứng viêm gián tiếp qua bạch cầu và đại thực bào (Kim et

al., 2014). Ngoài khả năng, tăng khả năng kháng viêm ở động vật thử nghiệm,

năm 2013 Hyam và cs cho thấy Lancemaside A có khả năng gây ức chế đối với

TNBS- một tác nhân gây viêm ruột kết ở chuột thí nghiệm (Hyam et al., 2013).

Bên cạnh các saponin, rễ Codonopsis sp. còn chứa các polysaccharide có

dược tính quý trong điều trị một số bệnh ở người, tính gây độc đối với các khối

u, tăng cường khả năng miễn dịch ở người.

Hoạt động chống khối u: Polysaccharide từ C. pilosula có thể ức chế sự hoạt

động của các tế bào ung thư dạ dày người và các tế bào ung thư gan (Yang et al.,

2011). Một pectic polysaccharide ở rễ Codonopsis sp. có khả năng gây độc với tế

bào ung thư phổi người (Yang et al., 2013). Một nghiên cứu in vitro sử dụng tế

bào HO- 8910 (ung thư buồng trứng) cho thấy một polysaccharide có tính axit có

nguồn gốc từ rễ C. pilosula có thể làm giảm sự xâm nhập và di căn của các tế bào

khối u thông qua việc giảm biểu hiện CD44 (Xin et al., 2012). Khả năng gây ức

chế sự phát triển khối u đã được ghi nhận ở những con chuột được tiêm tế bào

khối u và uống 50 hoặc 100mg/kg một trong hai polysaccharides của C. pilosula

7

sẽ làm ức chế khoảng 22,86 - 56,73 % sự phát triển của khối u (Xu et al., 2012).

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Bảng 1.2. Khả năng ức chế khối u ở chuột của CPPW1 và CPPW1B

(Xu et al., 2012)

TT

Trọng lượng khối u (g)

Tỷ lệ ức chế (%)

Trọng lượng lá lách tương đối (mg/g)

Trọng lượng tuyến ức tương đối (mg/g)

NC

2,45 ± 0,24

6,01

2,16

PC

0,89b

63,67

5,12

1,90

CL

1,64b

33,06

7,34b

2,45a

CH

1,06b

56,73

8,46b

2,61b

CBL

1,89a

22,86

6,14

2,24

CBH

1,56b

36,33

6,35

2,31

NC: Đối chứng âm; PC: đối chứng dương; CL: CPPW1 (50 mg/kg); CH: CPPW1 (100 mg/kg); CBL: CPPW1B (50 mg/kg); CBH: CPPW1B (100 mg/kg); aP<0,05 và bP<0,01.

Tác dụng trên hệ miễn dịch, chống viêm: Zhang và Wang thấy rằng 6 ngày

uống polysaccharide (800 mg/kg/ngày) từ C. pilosula có tác dụng trên chuột suy

giảm miễn dịch gây ra bởi cyclophosphamide, bao gồm tăng cường hoạt động các

tuyến ức, lách và các hoạt động thực bào của các đại thực bào phúc mạc và phục

hồi hoạt động của α - naphthyl - acetate esterase trong tế bào lympho ngoại vi.

Trong một nghiên cứu miễn dịch in vitro, một polysaccharide tan trong nước ở

liều 50, 100 và 200 mg/mL có thể tăng sinh tế bào lympho kích thích bởi

concanavalin A- hoặc lipopolysaccharide (LPS) (Sun, 2009). Ngoài ra, chiết xuất

methanol của C. pilosula gây ức chế cảm ứng nitric oxide synthase và oxy hóa

protein trong quá trình kích thích LPS ở dòng tế bào đại thực bào chuột RAW

264.7 (Yoo et al., 2013). Một nghiên cứu in vitro khác cho thấy, một

polysaccharide từ C. pilosula có thể kích thích sự biệt hóa của tế bào lách trong

chống viêm kích thích bởi LPS (Yongxu et al., 2008). Vai trò chống viêm còn

được chứng minh khi một polysaccharide từ C. pilosula biểu hiện tăng sản xuất

kháng nguyên khi dùng chung với một loại vắc-xin, cho thấy polysaccharide này

8

có thể được sử dụng như một chất bổ trợ (Sun, 2009). Một nghiên cứu đánh giá

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

hoạt động của các đại thực bào thực bào cho thấy một polysaccharide có khả năng

tăng hoạt động thực bào, sau khi uống 50 hoặc 100mg/kg dịch chiết C. pilosula

mỗi ngày, có thể làm tăng khả năng thực bào tương ứng là 15,6% và 28,7% (Xu

et al., 2012).

Trong kết quả nghiên cứu về hiệu quả tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết

các cây Panax quinquefolium, Panax notoginseng, Codonopsis pilosula,

Pseudostellaria heterophylla và Glehnia littoralis của nhóm tác giả T.B. Ng và

cs (2004) cho thấy dịch chiết từ cây Codonopsis pilosula và Glehnia littoralis có

tác dụng cao nhất trong việc ức chế hiện tượng huyết tán. Các kết quả cũng cho

thấy nếu chỉ quan tâm đến hoạt động chống oxi hóa thì các cây Panax

notoginseng, Codonopsis pilosula, Pseudostellaria heterophylla và Glehnia

littoralis là các đối tượng thay thế rẻ hơn cây nhân sâm.

Nghiên cứu của Chen và cs (2013) cho thấy dịch chiết từ cây Codonopsis

javanica có khả năng làm giảm dần hiện tượng insulin cao và quá trình peroxide

hóa ở những con chuột kháng insulin được nuôi bằng fructose. Yang và cs (2013),

đã tách chiết và xác định được cấu trúc một pectic polysaccharide (CPP1b) từ cây

Codonopsis pinocuda. Theo nghiên cứu này, CPP1b được tách chiết bằng phương

pháp sắc kí cột cellulose DEAE, phân tử này có khối lượng khoảng 1,45x 105 Da.

Pectic CPP1b có khả năng kháng khối u do pectic này thể hiện tính gây độc với

các tế bào ung thư phổi A549 (Yang et al., 2013).

Khi thử nghiệm đánh giá hiệu quả chống lại bệnh béo phì của cây

Codonopsis lanceolata ở những con chuột bị béo phì. Các kết quả nghiên cứu gợi

ý rằng cây Codonopsis lanceolata có một tiềm năng lớn để ứng dụng trong việc

chống lại bệnh béo phì vì nó giảm sự hình thành và tích lũy quá mức các chất

béo. Cây Codonopsis lanceolata có tiềm năng là thực phẩm chức năng có thể sử

dụng trong kiểm soát và điều trị bệnh béo phì (Choi et al., 2013)

Các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như dược tính của các loài

9

Codonopsis được thực hiện chủ yếu trên đối tượng rễ củ tự nhiên. Hiện chỉ có

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

một số ít nghiên cứu thành phần hoạt chất trên đối tượng là sinh khối tế bào

Codonopsis sp.

Trong nghiên cứu sự cảm ứng tạo rễ bất định và tách chiết chất Codonopside

từ Codonopsis lanceolata của Krishna và cs (2007). Theo nhóm tác giả này việc

tạo rễ trực tiếp từ mẫu lá của cây Codonopsis lanceolata trên môi trường MS với

30 g/L sucrose và các nồng độ khác nhau của các chất điều hòa sinh trưởng IAA,

IBA thì môi trường cơ bản với 3 mg/L IBA đạt được kết quả mọc rễ tối đa là

100%. Các rễ này tiếp tục được nuôi trên các môi trường lỏng B5, SH, MS để

thiết lập môi trường nuôi cấy rễ tối ưu. Kết quả là môi trường B5 với nồng độ

IBA 0,5 mg/L có hiệu quả lớn nhất đối với sự sinh trưởng của rễ bất định trong

bình nuôi cấy 250 ml cũng như nuôi cấy bioreactor. Trọng lượng rễ tươi là 6,19

gam tương đương với 0,81 gam trọng lượng khô ở bình nuôi cấy thể tích 250 ml,

ở bình nuôi cấy bioreactor thể tích 2 lít là 48,56 gam trọng lượng tươi và 8,26

trọng lượng khô, sau thời gian nuôi cấy một tháng. Các rễ thu được trong điều

kiên nuôi cấy này cũng dày hơn, cứng cáp hơn rễ tơ và phát triển được trong môi

trường có sục khí mạnh. Thành phần saponin ở các rễ nuôi cấy này được tách

chiết và phân tích bằng dự liệu phổ, dữ liệu này khớp với các dữ liệu đã được

công bố trước đó. Nhóm tác giả cũng đã phát triển được một phương pháp đơn

giản và hiệu quả để sản xuất được các Codonopside từ rễ bất định của Codonopsis

lanceolata (Krishna et al., 2007). Codonopside có tác dụng cảm ứng chết theo

chương trình của các tế bào bạch cầu hạt non trong điều trị bệnh ung thư máu ở

người (Lee et al., 2005). Do đó, việc nuôi cấy rễ tơ cây Codonopsis lanceolata

trong bioreactor có thể coi là nguồn nguyên liệu thay thế cho việc tách chiết hoạt

chất sinh học có giá trị cao.

Theo các nghiên cứu khoa học ở Việt Nam, sâm dây có tác dụng tăng cường

sức khoẻ, chống mệt mỏi và tăng sự thích nghi của động vật thử nghiệm trong

môi trường nhiệt độ cao. Đối với hệ tiêu hóa, sâm dây có tác dụng tăng cường

10

trương lực của hồi tràng và cường độ co bóp càng tăng nếu tăng nồng độ thuốc.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Đối với hệ tim mạch, sâm dây làm tăng cường độ co bóp của tim, tăng lượng máu

cho não, chân và nội tạng, còn đối với máu và hệ thống máu: sâm dây có tác dụng

làm tăng số lượng hồng cầu, huyết sắc tố, làm giảm số lượng bạch cầu. Ngoài ra,

sâm dây còn có tác dụng hạ huyết áp, tăng cường miễn dịch của cơ thể, có tác

dụng kháng viêm, hóa đàm, giảm ho, kháng khuẩn...

Công trình “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của vị thuốc Đảng

sâm Việt Nam” của Hoàng Minh Chung và cs (2002) là nghiên cứu lần đầu tiên

công bố các thành phần hóa học của cây Đảng sâm Việt Nam. Bằng một số

phương pháp định tính và định lượng trên các mẫu củ sâm tươi và cao sâm, nhóm

tác giả này đã đưa ra một số kết luận về đặc điểm thực vật của cây sâm dây mọc

ở Sapa; các thành phần có trong rễ sâm dây khô và tươi: đường khử, acid amin,

chất béo và saponin; thành phần và hàm lượng của các loại acid amin có trong rễ

sâm dây. Nhóm tác giả này cũng đã công bố kết quả những nghiên cứu về hợp

chất saponin có trong sâm dây. Loại saponin chủ yếu là saponin triterpenoid, hàm

lượng saponin vào khoảng 3,12 ± 0,08 %.

Các nghiên cứu trong nước trên cây Sâm dây còn rất hạn chế, mới chỉ dừng

lại ở phân tích thành phần hóa học, các tác dụng dược lý và nhân nhanh giống cây

sâm dây bằng phương pháp nuôi cấy mô.

1.1.5. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây

Sâm dây

Do giá trị y dược quý của cây Sâm dây hiện nay đã được nhiều người biết

đến và giá trị kinh tế cao nên sâm dây bị khai thác quá mức làm giảm khả năng

tái sinh và phát triển của cây, dẫn đến cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng. Cây

sâm dây đã được đưa vào chương trình bảo tồn các loài cây quý hiếm ở Việt Nam.

Trước tình hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu giá trị của cây Sâm dây ở

Việt Nam, phân tích dược tính để đưa ra những hướng dẫn chiết xuất, sử dụng tốt

11

nhất phục vụ sức khoẻ cộng đồng, cần sớm nghiên cứu áp dụng nuôi cấy sinh

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

khối tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu cấp thiết của

ngành công nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng.

1.2. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ – giải pháp tạo nguồn dược phẩm sạch phục

vụ sức khoẻ cộng đồng

1.2.1. Giới thiệu về nuôi cấy nuôi cấy sinh khối tế bào

Trên thế giới công nghệ sinh khối tế bào thực vật dựa trên cơ sở tính toàn

năng và tính biệt hóa của tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều

lĩnh vực: dược phẩm, thực phẩm chức năng, chất phụ gia thực phẩm, nông nghiệp,

lâm nghiệp,… vừa tạo ra nguyên liệu, vừa giúp bảo tồn nguồn gen quý hiếm.

Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất có nguồn gốc thực vật mang giá trị kinh tế

cao là sản phẩm của sinh khối tế bào thực vật:

i) Các hoạt chất dùng trong dược phẩm như caffein thu được từ nuôi cấy tế

bào (Coffea arabica), betalain từ mô sẹo củ cải đường, berberin từ cây (Coptis

japonica) (loài cây này phải trồng từ 4-6 năm mới thu được hàm lượng Berberin

đáng kể trong rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần nuôi cấy.

ii) Các chất khác như chất dùng trong thực phẩm bao gồm các chất tạo màu

(Anthocyanin, crocin), các chất tạo mùi (vani, mùi hành và mùi tỏi)

iii) Các chất khác như shikonin – chất có khả năng diệt khuẩn và Paclitaxel.

Một ví dụ điển hình về ứng dụng hệ thống bioreactor 10.000 lít trong sản xuất

reserpine (alkaloid chiết xuất từ cây Ba gác có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp

và các bệnh rối loạn tuần hoàn máu) có thể sản xuất được 3500 kg resperin trong

thời gian 30 ngày, tương đương với lượng hàng năm cả thế thu được từ cây rễ đó.

Với sâm đã có rất nhiều các nghiên cứu về tạo sinh khối sâm từ tế bào

huyền phù, mô sẹo, từ nuôi cấy rễ bất định hay rễ tơ để thu hoạch các hoạt chất

quý (Kawaguchi et al., 1990; Asada et al., 1993; Zhao et al., 2001; Jeong et al.,

2002; Palazon et al., 2003; Woo et al., 2004). Hiện nay, một số nước tiêu thụ và

12

xuất khẩu sâm lớn như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc đã ứng dụng nuôi cấy

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

sinh khối tế bào từ nhân sâm trong sản xuất các sản phẩm chức năng hay làm

thuốc bổ, thuốc phòng chống bệnh tim mạch, chống gốc tự do, tăng cường chức

năng hệ thần kinh trung ương, các loại mỹ phẩm (Jeong et al., 2002; Nguyen et

al., 1993). Trong khi đó, có rất ít nghiên cứu về nuôi cấy sinh khối tế bào cây bá

bệnh. Gần đây, nhóm nghiên cứu của Maziah và cs (2009) đã thành công trong

nuôi cấy cảm ứng tạo hoạt chất chống ung thư 9-methoxycanthin-6-one từ mô

sẹo (Maziah et al., 2009).

Trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm giảm hoặc mất

tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần thiết bổ sung các chất điều tiết sinh

trưởng vào trong môi trường nuôi cấy. Vấn đề này là một trong những trở ngại

lớn làm nản lòng các nhà nghiên cứu do tồn dư của các chất điều tiết sinh trưởng

trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe

người sử dụng. Tuy nhiên việc này này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi

cấy sinh khối từ rễ tơ sẽ được đề cập ở mục sau.

1.2.2. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phương pháp tạo rễ tơ ở tế

bào thực vật

Agrobacterium rhizogenes, tên khoa học khác là Rhizobium rhizogenes, là

một loài vi khuẩn đất Gram âm, thuộc họ Rhizobiaceae nằm trong bộ Rhizobiales

cố định đạm. Chúng có khả năng nhận biết được các phân tử tín hiệu từ các tế

bào thực vật bị tổn thương và tấn công vào vị trí đó. Mô tế bào thực vật bị nhiễm

bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes cảm ứng và phát triển mạnh mẽ các rễ.

Do đó Agrobacterium rhizogenes là một yếu tố cần được quan tâm đến trong việc

cảm ứng tạo rễ bất định từ tế bào thực vật in vitro (Britton et al., 2008).

Agrobacterium được biết đến từ rất lâu trong nông nghiệp với vai trò là các

vi khuẩn cố định đạm, cung cấp nguồn nitơ cho cây trồng. Trong những thập kỉ

gần đây thì các nhà khoa học đã chú ý đến vai trò của hai loài vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes và Agrobacterium tumefaciens trong mục đích

13

chuyển gen vào thực vật. Chúng được xem như là các “kĩ sư trao đổi chất”, được

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

sử dụng để chuyển gene vào tế bào thực vật nhằm mục đích đẩy mạnh quá trình

sinh tổng hợp ra các hợp chất thứ cấp cần thiết. Trong đó, Agrobacterium

tumefaciens được biết đến với vai trò cảm ứng tạo ra các khối u (mô sẹo) và

Agrobacterium rhizogenes thì được biết đến với vai trò cảm ứng tạo ra các rễ bất

định ở thực vật hai lá mầm (Britton et al., 2008; Sevon et al., 2002).

1.2.3. Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật

Khi tế bào thực vật bị thương tiết ra các polyphenol hấp dẫn các vi khuẩn,

và thực hiện chuyển đoạn T-DNA (transfer DNA) từ Ri-plasmid vào hệ gen của

tế bào vật chủ. Tuy nhiên, ngày nay người ta nhận ra rằng các vi khuẩn này đáp

ứng với các hợp chất phenol nhất định của thực vật như acetosyringone và

hydrocy acetosyringone (Bernard et al., 2010). Nhìn chung cơ chế quá trình xâm

nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình vận chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của

vi khuẩn A. tumefaciens và A. rhizogenes được chứng minh là tương tự nhau

14

(Hình 1.3).

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Hình 1.3. Cơ chế chuyển gen chung của Agrobacterium

(Hà Thị Mỹ Ngân, 2013)

Ban đầu Agrobacterium sẽ phải tiếp xúc với tế bào thực vật. Quá trình này

được thực hiện nhờ các gen chvA và chvB. Hai gen này đảm nhiệm việc mã hóa

và vận chuyển β-1,2-glucans vào không gian giữa thành tế bào và màng sinh chất.

Polysacharid này giữ vai trò quan trọng trong việc giữ vi khuẩn Agrobacterium

tiếp xúc với tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này sẽ không có sự truyền

T-DNA. T-DNA được truyền sang tế bào thực vật nhờ vào hệ thống gen vir.

Quá trình chuyển gen hoạt động dựa vào hệ thống protein virA/virG. Sau

khi tiếp xúc, protein virA có chức năng như một sensor sẽ nhận biết các phân tử

tín hiệu từ tế bào thực vật. Các tín hiệu này chính là các hợp chất do tế bào thực

vật bị tổn thương tiết ra. Protein virA tự phosphoryl hóa rồi sau đó phosphoryl

hóa protein virG. Các tín hiệu hóa học này sẽ được dẫn truyền từ protein virA

sang protein virG (Schmulling et al., 1988). Sản phẩm của protein virG tiếp tục

15

làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại mà hai gen được hoạt hóa cuối cùng là

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

virB và virE. Trước đó, khi virD được hoạt hóa, sản phẩm của gen này sẽ thực

hiện quá trình tạo sợi đơn T-DNA chiều 3’ đến 5’ ss T-DNA từ sợi kép ban đầu.

Hai protein virD1 và virD2 nhận biết hai trình tự 25 kb đặc hiệu tại biên trái (LB)

và biên phải (RB), sau đó đoạn T-DNA đơn được cắt ra khỏi sợi kép, virD2 liên

kết chặt chẽ với đầu 5’. Đoạn ss T-DNA sẽ được bảo vệ, bao bọc chặt chẽ bởi

protein virE khỏi sự phân giải bởi các nuclease nội bào. Tiếp đến phức hợp ss T-

DNA sẽ được đưa sang tế bào thực vật thông qua kênh vận chuyển được tạo bởi

các protein virB, có khoảng 11 loại protein được mã hóa bởi gen virB.

Khi vào đến nhân tế bào thực vật, bước cuối cùng và cũng là quan trọng nhất

là gắn kết sợi đơn T-DNA vào genome tế bào thực vật. Hai protein có chức năng

quan trọng trong quá trình này là protein virE2 và virD2. Protein virE2 là một

loại protein bám sợi đơn có chức năng bao bọc bảo vệ đoạn T-DNA khỏi bị các

endonuclease phân hủy. Trong khi đó, protein virD2 có chức năng tối quan trọng

đó là gắn kết T-DNA vào hệ genome. Protein virD2 không chỉ phân cắt tạo sợi

đơn mà còn có khả năng gắn kết đầu 5’ của T-DNA vào đầu kết thúc 3’ của

genome tế bào chủ. Quá trình gắn kết diễn ra tại vị trí ngẫu nhiên. Trong quá trình

chèn, một số đoạn DNA ngắn của tế bào thực vật bị mất đi, bên cạnh đó, các biên

của T-DNA xuất hiện sự tương đồng với DNA thực vật tại vị trí chèn (Bernard et

al., 2010). Để thực hiện chức năng gắn kết này, protein virD2 có chức năng như

một ligase (Schmulling et al., 1988). Giai đoạn gắn kết là giai đoạn cuối cùng của

quá trình biến nạp và thực sự cần các protein của tế bào chủ tham gia vào chu

trình. Chức năng của các protein này là chuyển đoạn T-DNA từ dạng sợi đơn trở

về dạng sợi kép và tồn tại lâu dài trong genome thực vật.

T-DNA ở Ri-plasmid bao gồm 2 vùng chính là vùng biên trái (LB) và vùng

biên phải (RB). Hai vùng này có kích thước khoảng 15-20 kb và được xen kẽ bởi

một đoạn DNA, đoạn DNA này sẽ không được chuyển vào hệ gen của tế bào vật

chủ. Vùng biên phải mang các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin (tms1 và tms2),

16

vùng biên trái bao gồm 18 khung đọc (ORFs), trong đó có 4 locus 10, 11, 12 và

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

15 mã hóa cho rolA, B, C và D. Các gen rolA, rolB, rolC đóng vai trò quan trọng

trong quá trình cảm ứng tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm. Trong 3 gen

rol trên, gen rolB đóng vai trò quan trọng hơn cả, khi gen rolB được biểu hiện,

mô tế bào thực vật được cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ, trong khi đó bất hoạt gen

rolB không tạo được kiểu hình rễ tơ.

T-DNA sau khi chuyển vào tế bào thì sẽ được gắn ổn định vào bộ gen của

thực vật. Tuy các gen mã hóa T-DNA có nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng nó có

mang các trình tự điều tiết ở Eukaryote nên có thể biểu hiện được trong tế bào

thực vật.

1.2.4. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ

Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các lông rễ được sản sinh ra mạnh mẽ tại vị trí

bị nhiễm bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes. T-DNA từ A. rhizogenes sau

khi chuyển vào tế bào thực vật thì chúng sẽ được gắn vào bộ gene của thực vật,

từ đó tế bào thực vật sẽ làm nhiệm vụ biểu hiện các gene rol và gen aux (tổng hợp

ra IAA nội sinh) làm tăng khả năng tạo các lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị

trí bị tổn thương ở mô thực vật đó. Số lượng các lông rễ được tạo ra khá nhiều,

phát triển thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ.

Với sự chuyển đổi gen của A. rhizogenes vào tế bào, rễ tơ có khả năng tổng

hợp ra nhiều loại hợp chất tự nhiên với hiệu suất cao mà các tế bào không phân

hóa và các rễ bất định không chuyển gen không tổng hợp được hay tổng hợp với

hàm lượng không đáng kể. Rễ tơ được xem như là một nguồn nguyên liệu có giá

trị trong sản xuất các hợp chất tự nhiên có lợi như dược phẩm, chất phụ gia trong

thực phẩm và mỹ phẩm (Bulgakov et al., 2003; Casanova et al., 2005). Nhờ vào

những đặc điểm như phát triển nhanh, dễ duy trì ổn định và khả năng tổng hợp

một số lượng lớn các hợp chất tự nhiên, hệ thống rễ tơ thể hiện tiềm năng lớn

trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên trên quy mô công nghiệp với hiệu suất

cao, giảm chi phí sản xuất từ đó giảm giá thành sản phẩm. Những nghiên cứu về

17

rễ tơ hiện đã và đang phát triển trong nước, cho ra những dòng rễ sinh tổng hợp

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

những hoạt chất phục vụ trong y học. Phạm Bích Ngọc và cs (2012) đã thành

công trong việc tìm ra qui trình chuyển gen tạo rễ tơ vào cây Bá Bệnh thông qua

chủng vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834. Nhóm tác giả đã chọn vật liệu cho

quá trình biến nạp là thân và lá cây mầm. Kết quả thu được tỷ lệ cảm ứng tạo rễ

tơ cao nhất là 71 % và thấp nhất là 64,5 % và môi trường phù hợp cho việc nuôi

cấy là WPM. Thông qua quá trình chọn lọc đã tuyển chọn được 23 dòng rễ tơ có

khả năng sinh trưởng nhanh, có thể nâng cấp ứng dụng cho công nghệ nuôi cấy

sinh khối bioreactor (P.B. Ngọc et al., 2013).

Tại Hàn Quốc, một số công ty đang sản xuất rễ tơ nhân sâm với bioreactor

có dung tích 10.000 đến 20.000 lít. Sản phẩm này được làm nguyên liệu cho các

dạng thực phẩm chức năng và thực phẩm khác nhau trên thị trường. Đã có rất

nhiều nghiên cứu thành công trong tạo các hoạt chất từ nuôi cấy sinh khối rễ tơ.

Vào năm 2002, Sevon đã tổng kết lại những hợp chất alkaloid quan trọng

nhất trong ngành dược được sản xuất bởi các hệ thống rễ tơ, bao gồm A.

tropabelladonna L., Catharanthus tricophyllus L., và Datura candida (Dodds et

al., 1995).

Nghiên cứu của Lodhi (1996) đã chứng minh rằng hàm lượng anthraquinone

và alizarin trong hệ thống nuôi cấy rễ tơ của Rubia peregrina L. tăng cao khi gắn

đoạn gen mã hóa ra enzyme isochorismate synthase vào đoạn T-DNA; và theo

Banerjee và cs (2002) thì rễ tơ của A. belladonna được chuyển gen P450 2E1 thể

hiện khả năng tổng hợp chất tự nhiên với mức độ rất cao (Lodhi et al., 1996;

18

Banerjee et al., 2002).

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Hình 1.4. Các hệ thống rễ tơ Sâm dây được nuôi cấy tại Viện CNSH

A- Sâm dây trên môi trường lỏng; B,C- Sâm dây trên hệ thống bioreactor; D- thu sinh khối Sâm dây

Nhờ vào những đặc điểm như phát triển nhanh, dễ duy trì ổn định và khả

năng tổng hợp một số lượng lớn hợp chất tự nhiên, hệ thống rễ tơ thể hiện tiềm

năng lớn trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên thông qua các hệ thống nuôi

cấy liên tục. Điều này có ý nghĩa lớn trong việc sản xuất các sản phẩm hợp chất

tự nhiên trên quy mô công nghiệp với hiệu xuất cao, giảm chi phí trong quá trình

sản xuất từ đó giảm giá thành sản phẩm. Bên cạnh việc chuyển T-DNA của A.

rhizogenes vào tế bào thì ta còn có thể chuyển các gene ngoại lai vào trong tế bào

thông qua việc tái tổ hợp đoạn gen đó vào trong đoạn T-DNA của A. rhizogenes.

Các gene này có thể là gen biểu hiện ra các hợp chất mục tiêu hay có thể là các

gene mã hóa các enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp ra hợp chất tự

nhiên mong muốn. Phương pháp này có thể giúp ta điều khiển hay định hướng

cho quá trình sinh tổng hợp hợp chất tự nhiên ở rễ tơ để tổng hợp ra một loại hợp

19

chất tự nhiên với hàm lượng cao.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Sản xuất hợp chất thứ cấp

Thông thường, nuôi cấy rễ cần có sự xuất hiện của các chất điều hòa sinh

trưởng ngoại sinh, hay là sự có mặt của các chất này trong môi trường nuôi cấy.

Phương pháp nuôi cấy rễ này tạo các dòng rễ sinh trưởng rất chậm và có thể dẫn

đến tình trạng thiếu hụt hay tổng hợp kém các hoạt chất thứ cấp. Tuy nhiên, rễ tơ

đã cải tiến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong thu nhận các hợp chất có giá

trị sinh học cao. Rễ tơ cũng đã cung cấp một nguồn hóa chất thiên nhiên dồi dào

cho các ngành công nghiệp dược phẩm, hóa mỹ phẩm và phụ gia thực phẩm (Giri

et al., 2000).

Kim và cs (2009) đã sử dụng 3 chủng A. rhizogenes là R1000, A4 và ATCC

15834 cảm ứng với loài Taxus cuspidata và thu nhận được 107 dòng rễ tơ. Trải

qua quá trình sàng lọc cho 3 dòng rễ tơ có thể sinh trưởng tốt trên môi trường MS

không chất điều hòa sinh trưởng, và có khả năng sinh tổng hợp taxol-một hợp

chất có công dụng mạnh trong điều trị ung thư (Kim et al., 2009).

Bảng 1.3. Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh học

(Giri et al., 2000).

Cây chủ

Hoạt chất thứ cấp

Artemisia annua

Artemisinin

Panax ginseng

Saponin

Panax hybird

Ginsenosides

Taxus cuspidata

Taxus

Quá trình sinh tổng hợp các hợp chất trong rễ tơ được kiểm soát bởi hệ gen,

nhưng nó cũng bị ảnh hưởng bởi yếu tố dinh dưỡng và các nhân tố môi trường.

Để có thể đạt được hiệu suất cao nhất, các điều kiện nuôi cấy cần được tối ưu hóa

và được kiểm soát chặt chẽ. Các yếu tố ảnh hưởng có thể là nguồn cacbon, nguồn

20

nitơ tổng, hàng loạt các yếu tố khác liên quan đến điều kiện nuôi cấy: ánh sáng,

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

nhiệt độ hay sự hiện diện của các chất hóa học có khả năng đẩy mạnh sự tổng

hợp.

Ứng dụng của rễ tơ trong phân tích chức năng của gen

Rễ tơ không chỉ được ứng dụng để sản xuất hợp chất thứ cấp mà còn được

sử dụng trong các thí nghiệm nghiên cứu chức năng gen. Các đoạn gen chức năng

được tái tổ hợp với gen chỉ thị Gus, hoặc chỉ thị bằng huỳnh quang và được đưa

vào A. rhizogenes để chuyển vào thực vật. Thông qua quá trình biểu hiện của gen

chỉ thị Gus mà các gen chuyển vào rễ tơ được nghiên cứu chức năng. Một ví dụ

là gen Gus kết hợp với promotor alcohol dehydrogenase (Adh) và được chuyển

vào rễ tơ đậu nành. Chức năng của promotor được nghiên cứu dưới các điều kiện

môi trường như: nhiệt độ thấp, thiếu khí, bị tổn thương và xử lý acid abscisic. Tất

cả các chức năng đều được nghiên cứu thông qua sự biểu hiện của gen gus (Zhi

et al., 2006).

Biểu hiện protein ngoại lai

Rễ tơ còn được dùng để biểu hiện các protein công nghiệp và các loại protein

chức năng. Nhờ vào khả năng chuyển một đoạn gen ngoại lai vào thực vật, A.

rhizogenes đã được thiết kế mang các vector tái tổ hợp để có thể biểu hiện các

loại protein trong rễ tơ. Các gen ngoại lai này được gắn kết vào genome thực vật

và ổn định về mặt di truyền nên khả năng biểu hiện không bị suy giảm. Ryan

(2008) đã tạo thành công dòng rễ tơ mang gen mã hóa cho acetylcholinesterase-

một protein có khả năng xử lý các hợp chất phosphat gây độc cho cơ thể. Các

dòng rễ này tuy tăng trưởng chậm nhưng có hàm lượng acetylcholinesterase lên

tới 3,3 % hàm lượng protein tổng số (Ryan et al., 2008). Mặt khác, các nghiên

cứu cho thấy có thể tạo rễ tơ mang cấu trúc kháng thể ở người hay cấu trúc vỏ

protein của các virus gây bệnh nhằm bước đầu tạo nguồn vaccine thực vật. Sharp

(2001) đã thành công trong việc tạo dòng rễ tơ thuốc lá mang kháng thể đơn dòng

21

IgGI ở người (Sharp et al., 2001).

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Với tiềm năng to lớn của hệ thống rễ tơ, các hệ thống rễ tơ của nhiều loài

thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất hợp chất tự nhiên in

vitro. Đặc biệt là rễ tơ của những cây thuốc quý có ứng dụng lớn trong ngành

công nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng.

1.2.5. Ứng dụng hệ thống bioreactor trong nuôi cấy sinh khối rễ tơ

Khái niệm chung

Về cơ bản, hệ thống bioreactor là một thiết bị mà trong đó các mô, cơ quan,

hay sinh vật được nuôi trồng sinh trưởng và phát triển để tạo thành các sản phẩm

mong muốn. Nó là một hệ thống được thiết kể để cung cấp đầy đủ các yếu tố cần

thiết cho các hoạt động trao đổi chất và sự phát triển tối ưu của đối tượng nuôi

cấy.

Mục tiêu cuối cùng của phương pháp thu nhận các hoạt chất sinh học từ sinh

khối tế bào thực vật là khả năng nâng cấp, nuôi cấy trong các pilot hay các hệ

thống bioreactor công suất lớn. Tuy nhiên, bên cạnh các yếu tố về môi trường

nuôi cấy, khả năng sinh trưởng và tích tụ hợp chất thứ cấp của rễ tơ trong

bioreactor phụ thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính loài thực vật cùng các điều kiện

như: loại bình nuôi cấy, nhiệt độ, tốc độ khuấy, tốc độ cung cấp oxy... Trong nuôi

cấy sinh khối rễ tơ, hai yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của sinh khối

rễ là số lượng rễ thứ cấp phát sinh trên rễ chính và độ dài của rễ thứ cấp (Han et

al., 2004). Khác với nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy sinh khối rễ có nhược

điểm là các hệ sợi rễ bám quện với nhau gây cản trở khả năng tiếp xúc với oxy

cũng như với môi trường (Bordonaro et al., 2000). Khả năng cung cấp oxy có thể

cải thiện bằng cách nuôi sinh khối rễ ở pha khí, một số bioreactor được thiết kế

để cung cấp môi trường dinh dưỡng dưới dạng phun sương hay nhỏ giọt nhằm

cải thiện khả năng cung cấp oxy hòa tan. Một ưu điểm của bioreactor dạng phun

sương là có thể giảm hiện tượng trương nước của rễ. Do đó, đặc tính của rễ tơ và

hiệu quả cung cấp oxy là hai yếu tố chính trong việc thiết kế và tối ưu một hệ

22

thống nuôi cấy rễ tơ.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Theo Choi và cs (2008) có 4 loại hệ thống nuôi cấy rễ tơ được sử dụng rộng

rãi trên thế giới bao gồm(Choi et al., 2008):

Hệ thống bioreactor có cánh khuấy

Ở loại bioreactor này, sự chuyển động của cánh khuấy hay cánh tuabin làm

cho chất lỏng luôn được đảo trộn cùng không khí sạch. Bộ phận cánh khuấy có

khả năng đảo trộn các thành phần có trong bioreactor nhưng cũng làm ảnh hưởng

đến rễ tơ hay gây ra hiện tượng đứt gãy rễ. Hệ thống này được sử dụng rộng rãi

trong nuôi cấy sinh khối vi sinh vật, lên men hay nuôi cấy tế bào thực vật.

Hệ thống bioreactor dạng sục

Ở bioreactor dạng sục khí, chuyển động của dòng khí và môi trường ảnh

hưởng bởi việc cung cấp khí. Việc cấp khí cũng như đảo trộn dưới tác dụng của

sục khí có thể giảm khả năng đứt gẫy, đây là một lợi thế của dạng bioreactor này.

Mặt khác, nhược điểm không kiểm soát được dòng khí lưu động bên trong đã gây

cản trở cho khả năng sinh trưởng khi nuôi cấy với mật độ cao. Loại bioreactor

này phù hợp cho việc nuôi cấy tế bào thực vật và các cơ quan đó là nhạy cảm với

các stress tế bào.

Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu

Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu được thiết kế dựa trên nguyên lý hoạt động

tương tự với bioreactor dạng sục khí. Các bình bioreactor có cấu trúc đơn giản

bao gồm bình chứa chính, đường cung cấp khí vào, đường thoát khí, các màng

lọc khí vào và khí ra để đảm bảo vô trùng, hệ thống kiểm soát các điều pH, nhiệt

độ, độ oxy hòa tan... Bioreactor dạng này ít tạo ra lực xé, phù hợp với việc nuôi

cấy rễ tơ (Hình 1.5.). Son và cộng sự thiết kế bioreactor dạng hình cầu cho khả

năng sinh trưởng của tế bào cao hơn so với bioreactor dạng sục khí và cánh khuấy

ở tế bào Taxus cuspidata. Sinh khối rễ bất định sâm Hàn Quốc nuôi cấy trong

bioreactor hình cầu cao hơn gấp 3 lần khi nuôi cấy trong biorreactor cánh khuấy

23

ở cùng dung tích 20L. Lượng sinh khối rễ bất định sâm Hàn quốc đạt giá trị cao

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

nhất 2,2 kg sau khi nuôi cấy 42 ngày trong bình có dung tích 20L với 240 g rễ

ban đầu (Choi et al., 2013).

Hình 1.5. Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu

(Nguồn: http://www2.hawaii.edu/)

Hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời

Trong hệ thống bioreactor ngập chìm tạm thời, rễ được tiếp xúc với không

khí xung quanh, hoặc hỗn hợp khí và chất lỏng dinh dưỡng, phân tán ở dạng phun

sương vào rễ tơ. Hệ thống này được thiết kế ứng dụng chủ yếu cho nuôi cấy mô

thực vật.

1.2.6. Ảnh hưởng của elicitor đến khả năng tích luỹ các chất thứ cấp

Khái niệm chung

Elicitor là các hợp chất kích thích mọi dạng tự vệ của thực vật. Định nghĩa

rộng về các elicitor bao gồm các chất có nguồn gốc từ yếu tố gây bệnh (ngoại

sinh) hoặc được giải phóng bởi chính thực vật do phản ứng với yếu tố gây bệnh

(nội sinh). Các elicitor có thể gây ra một loạt các phản ứng phòng vệ dẫn đến gen

được biểu hiện và kích thích tích luỹ các chất có hoạt tính sinh học trong điều

24

kiện không gây ảnh hưởng đối với thực vật hay trong nuôi cấy tế bào.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Hình 1.6. Cơ chế tác động lên tế bào của elicitor (Baenas et al., 2014)

Phân loại các elicitor

Theo Radman và cs năm 2004, về bản chất tự nhiên thì các elicitor thì có thể

chia thành hai loại: Elicitor sinh học bao gồm các elicitor sinh học từ nấm, vi

khuẩn, virus hay động vật, các thành phần của vách tế bào thực vật và elicitor phi

sinh học như các ion kim loại, các thành phần vô cơ (Radman et al., 2004).

Sự truyền tín hiệu elicitor

Sự tiếp nhận tín hiệu nhờ các receptor tương ứng là bước đầu tiên trong con

đường truyền tín hiệu elicitor. Sau khi nhận các tín hiệu elicitor, các receptor được

hoạt hóa và sau đó lần lượt hoạt hóa những cơ quan phản ứng lại kích thích

(effector) của chúng như kênh ion, các protein gắn GTP (G-protein) và các protein

kinase. Các effector được hoạt hóa truyền tín hiệu elicitor thành những thông tin

thứ cấp, khuếch đại tín hiệu elicitor khởi động những phản ứng xuôi dòng khác.

Trình tự đáp ứng phòng vệ được cảm ứng bởi elicitor có thể được thiết lập như

sau: Sự tiếp nhận elicitor nhờ receptor => Phosphoryl hóa và phản phosphoryl

25

hóa thuận nghịch của các protein màng plasma và các protein tế bào chất => Sự

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

vận chuyển Ca2+ tế bào chất => Sự khử phân cực màng plasma => Sự di chuyển

ra ngoài của Cl- và K+/sự di chuyển vào của H+ => Sự kiềm hóa ngoại bào và sự

acid hóa tế bào chất => Hoạt hóa protein kinase bởi tác nhân phân bào (MAPK)

=> Hoạt hóa NADPH oxidase và sự sản sinh các dạng oxy phản ứng à Sự biểu

hiện gen phòng vệ à Sản sinh ethylene và jasmonate => Biểu hiện gen đáp ứng

phòng vệ => Sự tích lũy hợp chất biến dưỡng thứ cấp (Hình 1.6).

Các hormon thực vật như là các elicitor

Salicylic acid (SA) và Jasmonic acid (JA) được coi là các tín hiệu quan trọng

cho sự biểu hiện gen tự vệ. Mọi người thường được nghĩ rằng SA điều hòa sự

kháng lại các yếu tố gây bệnh là nấm, vi khuẩn và virus trong khi JA lại kích thích

sự sản sinh ra nhiều loại protein thông qua con đường octadecanoid để cung cấp

cho cây khả năng chống lại các loài côn trùng. Tuy nhiên sự phân biệt này giữa

hai con đường không thực sự rõ ràng và các yếu tố gây bệnh và các loài chân đốt

đôi khi kích thích cả hai con đường này. SA và JA cũng như các chất tổng hợp

tương tự có thể được sử dụng từ bên ngoài thực vật để cảm ứng sự thay đổi trao

đổi chất tương tự để dẫn đến khả năng kháng như khi được kích thích bởi tác nhân

gây bệnh và các côn trùng. Với các loại elicitor thông thường như JA và SA,

những hiểu biết về con đường trao đổi chất hóa học mà chúng kích thích khiến

chúng trở nên có ích trong việc nghiên cứu các quá trình elicitation hóa, ví dụ như

nhiều gen bị kích thích bởi JA hoặc các loại hợp chất liên quan đến JA đã được

xác định.

1.3. Một số phương pháp tách chiết, phương pháp định tính và định lượng

saponin

1.3.1. Phương pháp tách chiết

Xác định hàm lượng hoạt chất có trong sinh khối tế bào là bước cần thiết

trong cả quá trình nuôi cấy. Việc định lượng hàm lượng hoạt chất cho phép xác

26

định hiệu quả của quá trình nuôi cấy. Đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

học của các loài thực vật khác nhau được thực hiện, tuy nhiên, mỗi đối tượng thục

vật cũng như mỗi nhóm chất yêu cầu một phương pháp tách chiết riêng.

Các phương pháp tách chiết saponin có thể được phân thành hai nhóm: nhóm

các phương pháp truyền thống và nhóm các phương pháp thân thiện với môi

trường.

Nhóm các phương pháp truyền thống: Các phương pháp thuộc nhóm này bao

gồm: phương pháp ngâm chiết, phương pháp chiết ngược (Reflux extraction) và

sử dụng bình chiết Soxhlet.

Nhóm các phương pháp thân thiện với môi trường: Các phương pháp thuộc

nhóm này bao gồm: phương pháp kết hợp siêu âm (UAE), phương pháp kết hợp

vi sóng (MAE) và phương pháp chiết dung môi gia tốc (ASE).

So với các phương pháp tách chiết truyền thống, nhóm phương pháp này sử

dụng ít hóa chất độc hại hơn, tiết kiệm năng lượng, các nguyên liệu có khả năng

tái chế và giảm bớt sự ô nhiễm.

1.3.2. Một số phương pháp định tính saponin

Dựa trên tính chất tạo bọt: Ðây là tính chất đặc trưng nhất của saponin do

phân tử saponin lớn và có cả một đầu ưa nước và một đầu kỵ nước. Người ta dựa

trên hiện tượng tạo bọt ở môi trường kiềm và acid để sơ bộ phân biệt saponin

steroid và triterpenoid.

Dựa trên tính chất phá huyết: Ðây cũng là tính chất đặc trưng của saponin.

Tuy nhiên cũng có một vài saponin không thể hiện rõ tính chất này. Khả năng

phá huyết cũng khác nhau nhiều tùy loại saponin. Người ta cho rằng tính phá

huyết có liên quan đến sự tạo phức với cholesterol và các ester của nó trong màng

hồng cầu nhưng lại thấy rằng giữa chỉ số phá huyết và khả năng tạo phức với

cholesterol có nhiều trường hợp không tỷ lệ thuận với nhau nên người ta cho rằng

phải xét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành phần khác của màng hồng cầu.

27

Qua việc theo dõi tính phá huyết của saponin người ta thấy rằng cấu trúc của phần

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

aglycon có tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết nhưng phần đường cũng có ảnh

hưởng. Hồng cầu của các động vật khác nhau cũng bị tác động khác nhau đối với

một saponin.

Dựa trên độ độc đối với cá: Cá là động vật rất nhạy cảm với saponin nên

người ta dùng các cây có saponin để gây độc cho cá (đừng nhầm với rotenon). Ðể

đánh giá nguyên liệu chứa saponin, người ta có thể dựa vào chỉ số cá. Chỉ số cá

cũng phải tiến hành trong những điều kiện quy định: môi trường, loại cá,...

Dựa trên khả năng tạo phức với cholesterol: Những saponin triterpenoid

tạo phức kém hơn loại steroid. Trong loại steroid thì digitonin kết hợp với

cholesterol gần như hoàn toàn, do đó digitonin được dùng làm thuốc thử để định

lượng cholesterol trong hoá sinh.

Các phản ứng màu: Acid sulfuric đậm đặc hòa tan các saponin và cho màu

thay đổi thành vàng, đỏ, lơ-xanh lá hay lơ-tím (phản ứng Salkowski). Saponin tác

dụng với antimoin trichlorid trong dung dịch chloroform rồi soi dưới đèn phân

tích tử ngoại thì saponin triterpenoid có huỳnh quang xanh còn saponin steroid

thì vàng.

1.3.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ trong định lượng saponin tổng số

Định lượng saponin thực vật thường được thực hiện bằng phương pháp

quang phổ và phương pháp sắc ký. Sự khác biệt giữa hai phương thức này là

phương pháp quang phổ cho biết giá trị saponin tổng số trong khi phương pháp

sắc ký định lượng một hợp chất saponin cụ thể.

Phương pháp quang phổ đã trở thành một phương pháp phổ biến trong việc

định lượng saponin từ thực vật vì tính đơn giản, nhanh chóng và tiết kiệm chi phí.

Saponin tổng số, hay thử nghiệm vanillin-sulfuric acid, là phương pháp quang

phổ thường được sử dụng phổ biến nhất trong định lượng saponin. Tuy nhiên

phương pháp này cần xem xét việc lựa chọn các tiêu chuẩn, bước sóng và một số

28

yếu tố khác.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Để thực hiện đề tài, chúng tôi sử dụng 23 dòng rễ tơ cây Sâm dây là kết quả

của đề tài “Nghiên cứu tạo rễ tơ ở cây Sâm dây (Codonopsis sp.) thông qua vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes” do Chu Hoàng Hà, phòng Công nghệ tế bào

thực vật làm chủ nhiệm.

Mẫu Sâm dây có nguồn gốc tự nhiên 1, 2, 3 năm tuổi (thu thập ở Kon Tum)

được sử dụng làm mẫu chuẩn cho thí nghiệm bán định lượng hàm lượng saponin

trong sinh khối rễ.

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 01 – tháng 12 năm 2015.

2.2. Thiết bị và hoá chất nghiên cứu

- Hoá chất: Các môi trường nuôi cấy cơ bản môi trường MS (Murashige &

Skoog, 1962), môi trường Gamborg B5 (Gamborg B5, 1968), môi trường WPM

(McCown’s Woody Plant, 1981), môi trường SH (Schenk and Hidebrandt, 1972),

sucrose, gellan, cefotaxime, valinin 0,08%; Acid sulfuric 75%; Ethanol; Nước

deion; n – butanol, …

- Thiết bị nghiên cứu: Box cấy, nồi hấp khử trùng, tủ lắc, tủ nuôi cấy trong

tối do phòng Công nghệ tế bào thực vật cung cấp, hệ thống bioreactor do phòng

Công nghệ lên men – Viện Công nghệ sinh học cung cấp, máy đo quang phổ UV

– 1650PC, UV-VISIBLE SPECTROPHOTOMETER của hãng SHIMADZU, bể

ổn nhiệt, máy vontex…do phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen cung cấp.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Dòng rễ tơ sâm dây được cắt thành các đoạn nhỏ có kích thước khác nhau

29

rồi chuyển lên môi trường thạch nuôi cấy có bổ sung cefotaxime 500 mg/l. Sau

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

thời gian 2 -3 tuần nuôi cấy nhóm nghiên cứu chuyển sang các bình nuôi cấy

bioreactor để tiến hành nuôi cấy trên môi trường lỏng.

Môi trường nuôi cấy

Trong nghiên cứu, các môi trường cơ bản MS, Gamborg B5, WPM, SH

(Trigiano et al., 1999) được bổ sung 30g/l sucrose, điều chỉnh pH đến 5,8 (nếu là

môi trường thạch bổ sung thêm 2,5 g/l gellan) và hấp khử trùng ở 1170C trong

thời gian 20 phút ở 1 atm.

Điều kiện thí nghiệm

Rễ tơ được nuôi trong tủ tối, nhiệt độ phòng nuôi 25oC ± 2oC, độ ẩm tương

đối 70%, đối với môi trường lỏng rễ tơ được lắc ở 90 vòng/phút. Các thí nghiệm

được nhắc lại 3 lần cho mỗi công thức thí nghiệm. Tất cả các dụng cụ thí nghiệm

được hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 20 phút ở 1 atm.

Các dòng rễ tơ sinh trưởng tốt trên môi trường chọn lọc (MS + cefotacxime

2.3.2. Đánh giá các dòng chuyển gen bằng phương pháp PCR

500 mg/l) được đem kiểm tra sự có mặt của gen tạo rễ thông qua phương pháp

PCR với cặp mồi đặc hiệu của các gen tạo rễ tơ rolA, rolB, rolC (đây là những

gen quan trọng trong quá trình tạo rễ và có mặt trong hầu hết các Ri-plasmid).

Tách chiết DNA tổng số rễ tơ theo phương pháp CTAB của Collins và Symons

(1992). DNA tổng số được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Phản ứng

khuếch đại được thực hiện trong hệ thống máy gene Amp® PCR System 9700,

sử dụng mồi 22-mer oligonucleotide đặc hiệu cho từng gen rol.

Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi

Trình tự mồi

Nhân gen hoặc đoạn gen/ kích thước (Kb)

RolA_F

ACGGTGAGTGTGGTTGTAGG

Gen rolA/0,4

RolA_R

GCCACGTGCGTATTAATCCC

CCGAGCTCTTAGGCTTCTTTCTTCAG

RolB_F

Gen rolB/0,8

30

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

GCTCTAGAATGGATCCCAAATTGCTA

RolB_R

RolC_F

TGTGACAAGCAGCGATGAGC

Gen rolC/0,5

RolC_R

AAACTTGCACTCGCCATGCC

Thành phần phản ứng PCR như bảng sau:

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân gen rolA, rolB, rolC

STT Thành phần

Thể tích (µl)

Nước khử ion Đệm PCR 10X

1 2

9,5 2,5

MgCl2 (25mM)

3

2,5

dNTPs (10 mM)

4

2,5

Mồi xuôi (10 pM)

5

1

Mồi ngược (10 pM)

6

1

DNA mẫu (50 ng/µl)

7

5

Taq polymerase (5u/µl)

8

1

Tổng

25

Phản ứng PCR nhân gen rolA, rolB, rolC bằng các cặp mồi tương ứng thực

hiện theo chu kỳ nhiệt độ như sau: 94oC/5 phút; 30 chu kì [94oC/30 giây, 55oC/30

giây, 72oC/1 40 giây]; 72oC/7 phút và kết thúc phản ứng ở 4oC.

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8 %.

2.3.3. Đánh giá khả năng tăng sinh của các dòng rễ tơ Sâm dây

Mục đích thí nghiệm

Kiểm tra trong các dòng rễ tơ thu được dòng rễ tơ nào sinh trưởng tốt nhất

làm nguyên liệu ban đầu cho hệ thống bioreactor

Mô tả thí nghiệm

Các dòng rễ tơ Sâm dây khác nhau được nuôi cấy trên môi trường thạch MS

+ cefotaxime 500 mg/l (MSC). Mỗi đĩa petri chứa 25 ml môi trường MSC và 0,2

31

g rễ tơ Sâm dây các dòng. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau 3 tuần nuôi cấy

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

đánh giá các chỉ tiêu. Dòng rễ tơ Sâm dây có tốc độ sinh trưởng tốt nhất được sử

dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.

Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng tươi, khối lượng khô, tỷ lệ tăng trưởng và hàm

lượng khô.

2.3.4. Xác định kích thước mẫu cấy phù hợp cho nuôi cấy

Mục đích thí nghiệm

Tìm được kích thước mẫu phù hợp nhất để rễ tơ sinh trưởng và phát triển tốt

nhất trên môi trường nuôi cấy.

Mô tả thí nghiệm

Cắt nhỏ các đoạn rễ tơ sâm dây (dòng rễ tơ sinh trưởng tốt nhất theo kết quả

thí nghiệm 2.3.3) mang đỉnh sinh trưởng thành những đoạn có kích thước khác

nhau (0,25; 0,5; 1; 1,5; 2 cm) rồi đặt trên môi trường MS thạch có bổ sung

cefotaxime 500 mg/l, nuôi trong tủ tối ở nhiệt độ 25 ± 2oC để kiểm tra sự phân

nhánh, và phát triển nhánh của từng loại kích thước mẫu khác nhau. Thí nghiệm

gổm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi đĩa cấy 10 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi: Số nhánh sau 2 tuần nuôi cấy, chiều dài nhánh sau 2 tuần

2.3.5. Xác định loại môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ trên môi trường

thạch.

Mục đích thích nghiệm

Tìm ra môi trường thạch thích hợp nhất cho dòng rễ tơ Sâm dây sinh trưởng

và phát triển

Mô tả thí nghiệm

Dòng rễ tơ Sâm dây được cắt nhỏ và đặt lên trên các loại môi trường thạch

khác nhau bao gồm: môi trường MS, B5, WPM, SH có bổ sung cefotaxime 500

mg/l. Các môi trường này được khử trùng ở nhiệt độ 117oC trong thời gian 20

32

phút ở 1atm. Rồi được chia ra đĩa Petri, để khô tự nhiên và đặt các đoạn rễ tơ có

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

kích thước 1cm tiến hành nuôi. Các đĩa thạch được nuôi cấy trong điều kiện tối,

nhiệt độ 25 ± 2oC. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại

3 lần.

Chỉ tiêu theo dõi: Sau 2 tuần thí nghiệm kiểm tra sự phân nhánh và kích thước

nhánh cũng như kích thước rễ chính để xác định môi trường cho hiệu quả phân

nhánh tốt nhất.

2.3.6. Xác định loài môi trường lỏng thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ

Mục đích thích nghiệm

Tìm ra môi trường lỏng thích hợp nhất cho dòng rễ tơ Sâm dây sinh trưởng và

phát triển

Mô tả thí nghiệm

Rễ tơ sâm dây trên đĩa thạch được cắt nhỏ thành các đoạn có kích thước phù

hợp (khoảng 1g rễ tơ) rồi chuyển lên các loại môi trường lỏng khác nhau bao

gồm: môi trường MS, B5, WPM, SH có bổ sung cefotaxime 500 mg/l (các bình

tam giác thể tích 250ml được sử dụng trong thí nghiệm, mỗi bình được bổ sung

50 ml môi trường các loại). Các môi trường này được khử trùng ở nhiệt độ 117oC

trong thời gian 20 phút ở 1atm. Rồi chia vào các bình tam giác 250 ml. Các bình

tam giác được nuôi cấy trong điều kiện tối, nhiệt độ 25 ± 2oC, tốc độ lắc 90

vòng/phút. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

Mỗi nghiệm thức gồm 3 bình thí nghiệm.

Chỉ tiêu theo dõi: Cứ mỗi tuần nhóm nghiên cứu tiến hành lấy 3 bình cân khối

lượng rễ tơ để kiểm tra tỷ lệ tăng trưởng của rễ tơ ở từng môi trường khác nhau.

Dựa trên tỷ lệ tăng trưởng để lập đường cong sinh trưởng sau 4 tuần thí nghiệm

2.3.7. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sinh trưởng và tích luỹ chất khô

trong rễ tơ Sâm dây

33

Mục đích thí nghiệm

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Kiểm tra ảnh hưởng của elicitor (salicylic acid) lên sự sinh trưởng và tích

luỹ chất khô trong rễ tơ Sâm dây

Mô tả thí nghiệm

Rễ tơ sâm dây trên đĩa thạch được cắt nhỏ thành các đoạn có kích thước

phù hợp (khoảng 0,2 g rễ tơ) rồi chuyển lên các môi trường lỏng thích hợp (đã

tìm được tại thí nghiệm 2.3.6). Sau 1 tuần nuôi cấy các bình nuôi cấy được bổ

sung salicylic acid với các nồng độ khác nhau (0 µM; 50 µM; 100 µM; 150 µM;

200 µM; 250 µM) theo thể tích môi trường đem nuôi cấy ban đầu. Các môi trường

này được khử trùng ở nhiệt độ 117oC trong thời gian 20 phút ở 1atm. Rồi chia

vào các bình tam giác 250 ml. Các bình tam giác được nuôi cấy trong điều kiện

tối, nhiệt độ 25 ± 2oC, tốc độ lắc 90 vòng/phút. Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức,

mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 3 bình thí nghiệm.

Chỉ tiêu theo dõi: Sau 4 tuần kiểm tra khối lượng tươi, khối lượng khô và đặc

điểm hình thái của rễ tơ.

2.3.8. Lựa chọn mô hình nuôi cấy bioreactor phù hợp

Dựa trên mục 1.2.5. và các điều kiện thực tế tại phòng thí nghiệm để chọn

lựa loại mô hình bình bioreactor sục khí nuôi cấy rễ tơ phù hợp.

2.3.9. Phương pháp nuôi cấy sinh khối rễ tơ trong hệ thống bioreactor

Đầu tiên, toàn bộ hệ thống bioreactor bao gồm bình nuôi cấy, hệ thống dây

nối sục khí, màng lọc … được khử trùng ở 121oC trong thời gian 30 phút ở áp

suất 1atm. Sau đó môi trường tối ưu ở thí nghiệm 2.3.6. được cho vào bình nuôi

cấy và khử trùng ở 117oC trong thời gian 20 phút ở áp suất 1atm để nguội. Rễ tơ

được cắt với kích thước khoảng 1cm và chuyển vào bên trong bình nuôi cấy và

34

cắm hệ thống sục khí, tiến hành nuôi cấy.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

2.3.10. Phương pháp tách chiết saponin từ sinh khối rễ tơ

Cân chính xác 1(g) khô các mẫu Sâm dây chuyển vào ống nghiệm. tiến hành

chiết mẫu với methanol (MeOH) trong ba lần, mỗi lần chiết với 10 ml dung môi.

Gom dịch chiết và tiến hành cô quay chân không ở điều kiện nhiệt độ 50oC, tốc

độ quay 80 vòng/phút. Sau khi bay hơi dung môi, thực hiện thu cặn chất. Cân

khối lượng cặn chất. Hòa lại cặn chất trong MeOH sao cho nồng độ dịch đạt 0,5

mg/ml. Dịch chiết được sử dụng trong thí nghiệm bán định lượng hàm lượng

saponin bằng phương pháp quang phổ (Hiai et al., 1976).

2.3.11. Phương pháp bán định lượng hàm lượng saponin trong sinh khối rễ

tơ

Sinh khối khô rễ tơ được nuôi cấy trong môi trường phù hợp được kiểm tra

hàm lượng saponin tổng số bằng phương pháp đo quang phổ theo.

Chuẩn bị mẫu: Các cắn dịch chiết được hòa tan trong dung môi methanol và

điều chỉnh về nồng độ giống nhau 0,5mg/ml. Thành phần cho 1 tube phản ứng: 117

µl dịch chiết, 83 µl vanillin 0,08% và 800 µl H2SO4 75%. Mix mẫu với mày voltex.

Ủ trong bể ổn nhiệt 60oC trong 10 phút. Sau đó, chuyển mẫu sang ủ trong đá trong

10 phút và tiến hành đo giá trị hấp thụ ở bước sóng 538 nm (Do sử dụng chất chuẩn

là Oleanolic acid với M = 456,71 g/mol). Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần sau đấy

lấy giá trị trung bình để tiến hành tính toán.

msaponine=

Trong đó:

M: Khối lượng phân tử chất chuẩn

Abs: Giá trị hấp thụ ở bước sóng 538 nm

35

max: Giá trị hấp thụ của 1 mol chất trong cuvet có chiều dày 1mm

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

2.3.12. Phương pháp tính toán

- Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, số liệu được xử lý thống kê bằng phần

mềm Microsoft Office Excel theo phương pháp phân tích phương sai ANOVA.

ố ượ ố

- Tỷ lệ tăng trưởng của các dòng rễ tơ tính theo công thức

ố ượ ẫ đầ

Tỷ lệ tăng trưởng =

ố ượ ô ấ

- Hàm lượng chất khô tính theo công thức:

ố ượ ươ ẫ

36

Hàm lượng khô (%) = × 100

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kiểm tra đánh giá các dòng rễ tơ chuyển gen bằng phương pháp PCR

Dựa trên kết quả nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu tạo rễ tơ ở cây Sâm dây

(Codonopsis sp.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” do PGS. TS.

Chu Hoàng Hà làm chủ nhiệm. Qua quá trình sàng lọc trên môi trường MS không

chứa chất điều hoà sinh trưởng, chúng tôi thu nhận được 23 dòng rễ với nhiều

dạng hình thái khác nhau với khả năng sinh trưởng khác nhau.

Từ năm 1981 Tepfer và Tempe đã nêu ra khái niệm “kiểu hình rễ tơ” để chỉ

các hình thái khác nhau của các dòng rễ tơ có thể sinh trưởng tốt trên môi trường

không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (Tepfer et al., 1981). Theo quan điểm

của Alpizar và cs (2008) ở rễ tơ cây Coffea arabica (Alpizar et al., 2008) hay P.

B. Ngọc và cs (2009) có hiện tượng phân chia các dòng rễ tơ thành 3 dạng: dạng

có tốc độ tăng trưởng trung bình với nhiều rễ nhánh phát triển, dạng có tốc độ

sinh trưởng chậm và ít rễ nhánh và dạng có tốc độ tăng trưởng nhanh có nhiều rễ

nhánh phát triển tốt. Tương tự, chúng tôi cũng thu nhận được ba dạng hình thái

chủ yếu: rễ có hình thái mập mạp, phân nhánh và phát triển nhanh; rễ có kích

thước nhỏ, mảnh, phân nhánh mạnh và hình thái rễ tạo ra phát triển theo chiều

dài rễ, không thấy sự phân nhánh hay phân nhánh chậm (Hình 3.1. D-F). Việc

biểu hiện hình thái khác nhau của các dòng rễ tơ có thể do trong quá trình biến

nạp, số lượng khuẩn tác động hay là số lượng bản sao đoạn T-DNA được chuyển

vào và vị trí gắn kết với genome thực vật ở mỗi mẫu là khác nhau. Nếu sự hợp

nhất của gen chuyển xảy ra ở vùng tích cực dịch mã, kết quả biểu hiện gen có thể

bị ảnh hưởng bởi các trình tự điều hoà ở phía đầu gen và ngược lại nếu gen chuyển

được chèn vào vùng dị nhiễm sắc, sự bất hoạt của gen chuyển có thể xảy ra (Phạm

Bích Ngọc et al., 2009).

Các rễ tơ không mang gen chuyển sẽ không có khả năng phát triển ổn định

trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật và khả năng tổng

37

hợp các hợp chất tự nhiên của chúng cũng rất thấp so với những dòng rễ đã chuyển

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

gen. Nếu như khi đưa vào sản xuất hợp chất tự nhiên mà trong hệ thống nuôi cấy

có lẫn tạp nhiều rễ không mang gen chuyển thì khả năng tổng hợp hợp chất tự

nhiên sẽ kém hơn nhiều so với môi trường đồng nhất các dòng rễ tơ có mang gen

chuyển. Không những thế các dòng không mang gen chuyển đó sẽ không duy trì

ổn định được trong suốt thời gian sản xuất. Vì vậy để đảm bảo tất cả hệ thống rễ

tơ đưa vào sản xuất phải đều mang gen đã chuyển từ vi khuẩn A. rhizogenes cần

phải tiến hành bước kiểm tra và chọn lọc.

Qua quá trình sàng lọc chúng tôi thu nhận được 8 dòng rễ có khả năng sinh

trưởng và phát triển ổn định trên môi trường thạch MS không bổ sung chất điều

hòa sinh trưởng.Được đánh số thứ tự từ T1 đến T8. Sau khi sàng lọc, chúng tôi

tiến hành kiểm tra sự có mặt của các gen rol để xác định được các dòng rễ là rễ

chuyển gen.

(+) M T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8

A

D

T8 T7 T6 T5 T4 T3 T2 T1 M

B

E

T8 T7 T6 T5 T4 T3 T2 T1 M

C

F

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen rolA, rolB, rolC bằng kỹ thuật PCR (M : thang DNA ; + : đối chứng dương – khuẩn lạc TR105) (A – C) ; hình thái khác nhau của các dòng rễ tơ (D – F) ; 1 bar tương đương 1cm.

Kết quả điện di (Hình 3.1 A-C) cho thấy, mỗi dòng rễ và đối chứng dương

khi thực hiện phản ứng với cặp mồi đặc hiệu với từng gen rol đều cho 1 băng

sáng duy nhất. Qua kết quả điện di có thể thấy các băng rolA của các mẫu đều

dưới vạch 500 bp của marker, như vậy gen rolA khuếch đại được có kích thước

38

khoảng 400 bp. Các băng gen rolB gần với vạch 1000 bp vào khoảng 800 bp và

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

gen các băng của gen rolC đều có kích thước khoảng 500 bp. Bên cạnh đó, các

băng điện di của các mẫu đều có độ lớn tương xứng với các băng của mẫu đối

chứng là pRi plasmid có chứa các đoạn gen rolA, rolB, rolC. Do đó, chúng tôi

kết luận các mẫu kiểm tra đều có mang các đoạn gen rolA, rolB, rolC trong

genome.

Như vậy, thông qua kiểm tra sự có mặt của các gen rol, chúng tôi ghi nhận

8 dòng rễ thu nhận được là các dòng rễ chuyển gen tạo ra từ quá trình chuyển gen

thông qua vi khuẩn A. rhizogenes TR105.

3.2. Đánh giá tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ Sâm dây

Do mỗi dòng rễ tơ có hình thái cũng như tốc độ sinh trưởng là hoàn toàn

khác nhau nên việc đầu tiên trong nuôi cấy sinh khối là tìm ra dòng rễ tơ phát

triển tốt nhất để sử dụng làm nguồn mẫu ban đầu cho nuôi cấy bioreactor.

Chính vì thế, chúng tôi đã tiến hành đánh giá tốc độ sinh trưởng của 8 dòng

rễ tơ thu được. Kết quả theo dõi sau 3 tuần nuôi cấy được thể hiện trong hình 3.2.

2,0

1,693

1,621

1,361

1,340

1,5

1,126

0,867

1,0

0,613

0,367

0,5

0,0

T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

Khối lượng tươi sau 3 tuần (g)

250

182,270

175,878

200

144,069

143,724

150

114,446

87,385

100

61,119

37,660

50

0

T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

39

Khối lượng khô (mg)

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

15

10,840

10,803

10,782

10,551

10,271

10,185

10,083

9,982

10

5

0

T1

T2

T3

T4

T5

T6

T7

T8

Hàm lượng khô (%)

Hình 3.2. Kết quả khảo sát tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ Sâm dây

Kêt quả thu được cho thấy, các loại rễ tơ có hình thái khác nhau thì có tốc độ sinh

trưởng hoàn toàn khác nhau. Sau 3 tuần theo dõi, khối lượng tươi trung bình rễ

tơ thu được của dòng T7 là lớn nhất, đạt 1,693 g. Khối lượng khô trung bình thu

được đạt 182, 27 mg chiếm 10,782 % khối lượng sinh khối.

Trong khi đó, dòng T3 có khối lượng rễ tơ trung bình là thấp nhất chỉ đạt

0,367 g, khối lượng khô trung bình đạt 37,66 mg chiếm 10,271 % khối lượng sinh

khối.

Dựa trên biểu đồ khối lượng tươi sau 3 tuần nuôi cấy chúng ta có thể thấy rõ

ràng sự phân chia nhóm của 3 dạng rễ tơ về tốc độ sinh trưởng bao gồm: dạng rễ

tơ có tốc độ sinh trưởng thấp (dòng T1, T2, T3 với khối lượng rễ trung bình đạt

từ 0, 367 – 0, 867), dòng rễ tơ có tốc độ sinh trưởng trung bình (dòng T4, T6, T8

với khối lượng rễ trung bình đạt từ 1, 126 – 1, 361), dòng rễ tơ có tốc độ sinh

trưởng cao (dòng T5 và T7 với khối lượng rễ trung bình đạt từ 1, 621 – 1, 693).

Còn hàm lượng khô của các dòng rễ tơ là tương đối đồng đều đạt khoảng từ 9,928

– 10, 840 %, điều này cho thấy hàm lượng khô không phụ thuộc nhiều vào kiểu

hình rễ tơ.

Dựa trên nghiên cứu này, tôi sử dụng dòng rễ tơ T7 cho các thí nghiệm tiếp

40

theo.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

3.3. Xác định kích thước mẫu phù hợp cho nuôi cấy

Môi trường cơ bản đầu tiên được sử dụng trong các nghiên cứu nuôi cấy mô

tế bào thực vật nói chung và nghiên cứu rễ tơ nói riêng là môi trường MS

(Murashige & Skoog, 1962). Các môi trường cơ bản khác sau này chỉ thay đổi ở

thành phần một số loại muối khoáng hay một số loại vitamin nhất định.

Bảng 3.1. Sự phát triển của các đoạn rễ tơ sâm dây có kích thước khác nhau

Loại kích thước (cm)

Số nhánh sau 2 tuần

0,25 0,5 1 1,5 2

1,6 ± 0,13 1,7 ± 0,22 2,7 ± 0,15 2,4 ± 0,25 2,5 ± 0,18

Chiều dài nhánh sau 2 tuần (cm) 0,3 ± 0,12 0,5 ± 0,26 0,5 ± 0,13 0,6 ± 0,14 0,6 ± 0,22

Sau 2 tuần thí nghiệm nhóm nghiên cứu thu được các rễ tơ phát triển tốt trên

đĩa thạch. Ở các kích thước khác nhau, thì sự phân nhánh của rễ tơ là hoàn toàn

khác nhau. Với các rễ tơ bị cắt thành các kích thước quá nhỏ sẽ ảnh hưởng đến

sự phát triển của rễ, do bị tổn thương lớn nên khả năng phân nhánh là rất kém. Rễ

tơ có kích thước khoảng 1cm được coi là phân nhánh tốt nhất sau 2 tuần số nhánh

lên tới 2,7 ± 0,15 (Bảng 3.1.). Còn với đoạn có kích thước khác thì số lượng nhánh

chỉ đạt từ 1,6 ± 0,13 – 2, 5 ± 0,18. Vậy sau 2 tuần nuôi cấy các đoạn rễ có kích

thước 1 cm cho khả năng phân nhánh là tốt nhất. Phù hợp để thực hiện các nghiên

41

cứu tiếp theo.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

3.4. Xác định loại môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ trên môi trường

đặc

SH

B5

WP

MS

Hình 3.3. Sự phân nhánh và kéo dài của các mẫu rễ tơ sau 2 tuần nuôi cấy trên các môi trường khác nhau.

Sau 2 tuần thí nghiệm nhóm nghiên cứu thu được các dòng rễ tơ phát triển

tốt trên đĩa thạch. Ở các môi trường khác nhau, thì sự phân nhánh của dòng rễ tơ

là hoàn toàn khác nhau. Theo hình 3.3. và bảng 3.2., rễ tơ trên môi trường WPM

cho khả năng phân nhánh và kéo dài nhánh là tốt nhất (số nhánh trung bình đạt

3,1 ± 0,16 với chiều dài rễ nhánh trung bình đạt 0,75 ± 0,35 cm), sau đó là môi

trường SH, môi trường B5 và kém nhất là môi trường MS (chỉ đạt trung bình 2,

6 ± 0,21 và chiều dài nhánh trung bình đạt 0,58 ± 0,07 cm), nhưng ở môi trường

MS thì khả năng kéo dài của rễ chính là tốt nhất (đạt 1,9 ± 0,35 cm). Bên cạnh

đo, sự phân nhánh ở nhóm môi trường WPM là đồng đều hơn cả điều này thể

hiện qua sai số thống kê tương đối nhỏ.

Bảng 3.2. Sự phát triển của rễ tơ sâm dây trên các loại môi trường khác nhau

Loại môi trường

Số nhánh sau 2 tuần

MS

2,6 ± 0,21

Chiều dài rễ chính sau 2 tuần (cm) 1,9 ± 0,35

Chiều dài nhánh sau 2 tuần (cm) 0,58 ± 0,07

42

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

B5 SH WPM

2,7 ± 0,18 2,8 ± 0,28 3,1 ± 0,16

0,54 ± 0,32 1,6 ± 0,23 1,7 ± 0,37 0,82 ± 0,28 1,85 ± 0,09 0,75 ± 0,05

Vậy môi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên môi trường

thạch là WPM.

3.5. Kết quả nuôi cấy rễ tơ trên các môi trường lỏng khác nhau

Sau khi tiến hành kiểm tra sự phát triển của rễ tơ trên các loại môi trường

đặc khác nhau, nhóm nghiên cứu tiến hành kiểm tra sự ảnh hưởng của các loại

môi trường lỏng đến sự sinh trưởng và phát triển của rễ tơ sâm dây.

Bảng 3.3. So sánh thành phần của các môi trường cơ bản MS, B5, WPM, SH (Trigiano et al., 1999)

Cứ mỗi tuần nhóm nghiên cứu tiến hành cân đo khối lượng rễ tơ để kiểm tra

mức độ tăng trưởng của rễ tơ trong từng loại môi trường khác nhau. Sau đây là

đồ thị thể hiện đường cong sinh trưởng của rễ tơ sâm dây sau 4 tuần nuôi cấy trên

43

các môi trường khác nhau thể hiện trên hình 3.4.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Đường cong sinh trưởng rễ tơ Sâm dây trên môi trường SH

Đường cong sinh trưởng rễ tơ Sâm dây trên môi trường MS

8,441

12,612

10

15

8,325

12,321

) n ầ

) n ầ

l

l

8

10

6

6,124

3,355

2,463

4

3,341

5

2

0

0

× ( g n ở ư r t g n ă t ệ

× ( g n ở ư r t g n ă t j ê

1

2

3

4

1

2

3

4

l ỷ T

l ỷ T

Thời gian nuôi cấy (tuần)

Thời gian nuôi cấy (tuần)

Đường cong sinh trưởng rễ tơ Sâm dây trên môi trường B5

Đường cong sinh trưởng rễ tơ Sâm dây trên môi trường WPM

10,513

10,242

10,123

10,092

) n ầ

) n ầ

l

l

5,723

5,654

3,634

2,752

× ( g n ở ư r t g n ă t ệ

l

× ( g n ở ư r t g n ă t ệ

12 10 8 6 4 2 0

12 10 8 6 4 2 0

ỷ T

1

2

3

4

1

2

3

4

l ỷ T

Thời gian nuôi cấy (tuần)

Thời gian nuôi cấy (tuần)

Hình 3.4. Đường cong sinh trưởng của rễ tơ sâm dây trên các môi trường khác nhau

Dựa trên đường cong sinh trưởng trên các môi trường khác nhau của rễ tơ

sâm dây, chúng tôi nhận định môi trường tốt nhất cho sự phát triển của rễ tơ sâm

dây trên môi trường lỏng là môi trường SH với tốc độ tăng trưởng tăng lên tới

12,612 lần sau 3 tuần nuôi cấy. Môi trường MS có tốc độ sinh trưởng là thấp nhất

chỉ đạt 8,441 lần sau 3 tuần nuôi cấy. Còn ở môi trường WPM và B5 cũng chỉ đạt

từ 10,242 – 10,513 lần. Điều này có thể là do trong môi trường SH có nồng độ

ion K+ và myo-inositol cao hơn hẳn so với các môi trường khác (Bảng 3.3), phù

hợp với nghiên cứu của Hayashi và cộng sự (1988) rằng môi trường nuôi cấy có

nồng độ ion K+ cao có lợi cho sự tăng trưởng của tế bào thực vật (Hayashi et al.,

1988). Bên cạnh đó tuy không phải là một vitamin nhưng một carbohydrate, myo-

inositol được thêm vào môi trường nuôi cấy có khả năng kích thích tăng trưởng

tế bào của phần lớn các loài thực vật (Vasil et al., 1998). Mặt khác, đường cong

44

sinh trưởng của rễ tơ Sâm dây ở các môi trường cơ bản khác nhau đề có điểm

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

chung là tốc độ sinh trưởng đạt tối đa vào tuần thứ 3 và giảm dần ở các tuần tiếp

theo. Đúng với lý thuyết về sự phát triển của mọi hệ thống nuôi cấy sinh khối.

3.6. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sinh trưởng và tích luỹ hợp chất

thứ cấp trong rễ tơ Sâm dây

Trong quá trình nuôi cấy rễ tơ chuyển gen, việc sử dụng các yếu tố stress

sinh học hoặc phi sinh học có ảnh hưởng lớn đến sự sinh tổng hợp, tích luỹ các

hợp chất thứ cấp. Việc sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (phân loại

dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất trong quá

trình nuôi cấy tế bào được đánh giá có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất

cao. Một số elicitor được thử nghiệm để thu hợp chất saponin cho hiệu quả tốt

như jasmonic acid, methyl jasmonate hoặc dimethyl jasmonate, salicylic acid,

acetylsalicylic acid (Sivakumar et al., 2005; Satdive et al., 2007).

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của salicylic

acid đến sự sinh trưởng ở rễ tơ Sâm dây, kết quả thí nghiệm sau 4 tuần nuôi cấy

thế hiện trên bảng 3.4 và hình 3.4.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của SA đến sự sinh trưởng của rễ tơ Sâm dây

Đặc điểm của rễ

Công thức

ĐC

Salicylic acid (µM) 0

Trắng, vừa, khoẻ

CT1

50

CT2

100

Trắng ngả vàng, hơi mảnh, khoẻ Vàng nhạt, mảng

CT3

150

CT4

200

Vàng hơi đậm, rất mảnh Vàng đậm, rất mảnh

CT5

250

Khối lượng tươi (g) 2,564 ± 0,052 2,320 ± 0,106 2,239 ± 0,007 2,220 ± 0,102 1,945 ± 0,116 1,583 ± 0,035

Khối lượng khô (g) 0,238 ± 0,031 0,246 ± 0,012 0,258 ± 0,007 0,313 ± 0,019 0,242 ± 0,036 0,223 ± 0,008

Tốc độ sinh trưởng của rễ (lần) 12,822 ± 0,261 11,599 ± 0,528 11,196 ± 0,034 11,100 ± 0,509 9,727 ± 0,578 7,913 ± 0,176

Vàng đậm, rất mảnh, yếu

45

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

3

2,564

2,320

2,239

2,220

3

1,945

2

1,583

2

1

1

0

0 µM

50 µM

100 µM

150 µM

200 µM

250 µM

Ảnh hưởng của SA đến khối lượng tươi (g)

0,4

0,313

0,258

0,3

0,246

0,242

0,238

0,223

0,2

0,1

0,0

0 µM

50 µM

100 µM

150 µM

200 µM

250 µM

Ảnh hưởng của SA đến khối lượng khô (g)

Hình 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của SA đến sinh trưởng rễ tơ Sâm dây

Kết quả thí nghiệm cho thấy, khi bổ sung salicylic acid vào môi trường nuôi

cấy – hợp chất này làm giảm tốc độ tăng trưởng của rễ. Cụ thể trên công thức đối

chứng là SH không chứa chất điều hoà sinh trưởng, tốc độ tăng trưởng của rễ đạt

12,8 ± 0, 26 lần sau 3 tuần nuôi cấy. Khi bổ sung salicylic acid tăng dần vào môi

trường nuôi cấy thì tốc độ tăng trưởng tương ứng giảm dần từ 11,6 ± 0,53 xuống

7,9 ± 0,18 lần. Như vậy, có thể thấy rằng khi bổ sung salicylic acid vào môi trường

nuôi cấy, đã làm giảm tốc độ sinh trưởng của mẫu cấy. Yu và cs năm 2000, khi

nghiên cứu ảnh hưởng của một elicitor khác là jasmonic acid (JA) lên sự sinh

trưởng của rễ tơ Panax ginseng cũng nhận thấy sự tăng nồng độ JA đã ức chế

mạnh sự phát triển của rễ tơ (Yu et al., 2000).

Bên cạnh đó, việc bổ sung elicitor nói chung và SA nói riêng vào nuôi cấy

mô tế bào thực vật lại rất hữu ích cho việc nâng cao hàm lượng các hợp chất thứ

cấp (Zhao et al., 2000). Khi xử lý thực vật với SA, ngoài vai trò khởi động quá

trình già hoá, SA còn tham gia vào con đường truyền tín hiệu và kích thích các

46

enyzme xúc tác các phản ứng sinh hoá, hình thành các hợp chất thứ cấp trong cây

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

như polyphenol, alkaloid, quinone, terpnoid… Do đó, việc xử lý thực vật với các

elicitor sinh học và phi sinh học được xem là một phương pháp để tăng cường

tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong công nghệ nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật

nói chung và sinh khối rễ tơ nói riêng (Jian et al., 2005; Dicosmo et al., 1984).

3.7. Lựa chọn mô hình nuôi cấy bioreactor phù hợp với điều kiện cơ sở vật

chất tại Viện CNSH

Hiện nay, tại viện Công nghệ sinh học chưa có hệ thống nuôi cấy rễ tơ riêng

biệt. Dựa trên hệ thống bioreactor lên men vi sinh vật, nhóm nghiên cứu kết hợp

với phòng Công nghệ lên men thiết kế một số mẫu bioreactor sử dụng được cho

các thí nghiệm nuôi cấy sinh khối với các dung tích 5 – 20 lit.

Sau quá trình tham khảo, chúng tôi lựa chọn mô hình bioreactor dạng sủi bọt

dạng cầu để nuôi cấy rễ tơ sâm dây. Bioreactor sủi bọt dạng cầu có cấu trúc đơn

giản nhất trong các dạng bình bioreactor, chỉ bao gồm bình chứa chính, đường

cung cấp khí vào, đường thoát khí, các màng lọc khí vào và khí ra để đảm bảo vô

trùng, hệ thống kiểm soát các điều pH, nhiệt độ, độ oxy hòa tan… Bioreactor

da ̣ng nà y ı́t ta ̣o ra lực xé, phù hơ ̣p vớ i viê ̣c nuôi cấy rễ tơ, và đơn giản khi tiến hành lắp ráp cũng như khử trùng một cách dễ dàng. Bên cạnh đó nhóm nghiên

cứu còn tiền hành thiết kế các mẫu lồng đỡ sinh khối rễ giúp rễ tơ bám vào và

phát triển tốt hơn.

So sánh với các hệ thống bioreactor đang sử dụng ở Việt Nam cũng như trên

thế giới thì hiện nay một số phòng thí nghiệm của Việt Nam cũng đang sử dụng

hệ thống bioreactor tương tự như ở Viện Công nghệ sinh học như Nguyễn Hữu

Hổ ở Viện Sinh học nhiệt đới, hay Dương Tấn Nhựt ở Viện Sinh học Tây Nguyên

cũng đang sử dụng hệ thống bioreactor có dung tích nhỏ từ 5 – 20 lit. Bên cạnh

đó, trên thế giới đặc biệt là Hàn Quốc đất nước của các loài sâm cũng như ngành

công nghiệp dược phẩm từ sâm thì hệ thống bioreactor của họ đang sử dụng cũng

là hệ thống nuôi cấy dạng bọt khí bên cạnh các cải tiến để tối ưu hoá các điều

47

kiện sinh trưởng cho rễ tơ sâm.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

B

A

Hình 3.6. Hệ thống bioreactor mà TS. Nguyển Hữu Hổ sử dụng tại Viện Sinh học nhiệt đới (A – 5 lit; B – 10 lit)

Hình 3.7. Hệ thống bioreactor PGS. TS. Dương Tấn Nhựt sử dụng tại Viện Sinh học Tây Nguyên

Hình 3.8. Hệ thống bioreactor trong ngành công nghiệp dược phẩm ở Hàn Quốc

48

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

B

A

Hình 3.9. Hệ thống bioreactor đang được sử dụng tại Viện Công nghệ sinh học

(A – 5 lit; B – 10 lit)

3.8. Kết quả nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên các mô hình bioreactor

Sau khi tìm được một số điều kiện thích hợp cho việc nuôi cấy trên mô hình

bioreactor của rễ tơ sâm dây, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy trên mô hình

bioreactor theo các kết quả của các nghiên cứu trước đó.

Hai hệ thống bioreactor được sử dụng là hệ thống bioreactor 5 lit và hệ thống

bioreactor 10 lit. Hệ thống bioreactor loại 5 lit được thiết kế từ một bình nuôi cấy

lên men vi sinh tiêu chuẩn có thể bổ sung cánh khuấy có giá đỡ bằng thép không

ghỉ, bên trong là bình nuôi cấy bằng thuỷ tinh chịu lực; hệ thống sục khí đi kèm

bình cho khả năng không khí sạch phân tán đều trong môi trường; nhóm nghiên

49

cứu còn tiến hành lắp hệ thống giá đỡ sinh khối cho rễ tơ có điểm bám phát triển.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Còn hệ thống bioreactor loại 10 lit được phòng Công nghệ lên men tiến hành

nghiên cứu với hệ thống quả sục giống như ở bể cá và bình thuỷ tinh chịu lực;

với thiết kế này hệ thống sục khí không giúp không khí sạch phân tán đều như ở

hệ thống bioreactor 5 lit, mặt khác do cổ bình thuỷ tinh quá nhỏ nên việc thiết kế

hệ thống giá đỡ đang gặp rất nhiều khó khăn.

Đầu tiên, toàn bộ hệ thống bioreactor được khử trùng ở 1210C trong thời

gian 30 phút ở áp suất 1atm. Sau đó môi trường SH được cho vào bình nuôi cấy

và khử trùng ở 1170C trong thời gian 20 phút ở áp suất 1atm để nguội. Rễ tơ được

cắt với kích thước khoảng 1cm và chuyển vào bên trong bình nuôi cấy và tiến

hành cắm hệ thống sục khí, tiến hành nuôi cấy.

Sau 4 tuần nuôi cấy nhóm nghiên cứu thu được các kết quả như hình 3.10

và bảng 3.5.

A

B

C

D

Hình 3.10. Rễ tơ thu được sau 4 tuần nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít (B, D) và 10 lít (A, C).

50

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Bảng 3.5. Kết quả nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên các hệ thống bioreactor khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy

Loại bình Bioreactor

Hàm lượng khô (%)

Khối lượng khô (g)

Tỷ lệ tăng trưởng (lần)

Khối lượng tươi mẫu thu (g)

Loại 5 lit Loại 10 lit

510 393

28 38

42,5 6,55

5,49 9,67

Khối lượng mẫu ban đầu (g) 12 60

Theo nghiên cứu của Choi và cs năm 2008 ở đối tượng rễ tơ Panax ginseng

thì sau 42 ngày ở bình bioreactor 4 lit, từ khối lượng ban đầu cho vào bình nuôi

cấy là 20 g rễ tơ đã tạo thành 520 g rễ tươi (tỷ lệ tăng trưởng lên tới 26 lần, và tạo

ra được 48 g rễ khô, hàm lượng khô lên tới 9,23 %) (Choi et al., 2008). Trong khi

đó với đối tượng nghiên cứu rễ tơ Sâm dây và bình bioreactor loại 5 lit có thêm

hệ thống giá đỡ do Viện Công nghệ sinh học thiết kế thì sau 4 tuần nuôi cấy với

12 g rễ tơ ban đầu đã tạo ra được 510 g rễ tơ tươi (tỷ lệ tăng trưởng lên tới 42, 5

lần, và tạo được 28 g rễ khô, hàm lượng khô là 5,49 %) Nhưng tốc độ tăng trưởng

của rễ tơ ở bình bioreactor loại 10 lit chỉ đạt 6,55 lần. Điều này có thể là do loại

bình nuôi 5 lit có thêm lồng đỡ sinh khối rễ tơ nên các rễ tơ có khả năng sinh

trưởng tốt hơn trong môi trường lỏng do các rễ tơ bám lên khắp bề mặt lồng đỡ

và làm tăng khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng và không khí. Nhưng khối lượng

khô ở bình bioreactor 10 lit đạt tới 38 g so với 28 g ở loại 5 lit. Điều này có thể

là do trao đổi chất trong bình rễ tơ 10 lit diễn ra mạnh hơn nên khả năng tích luỹ

chất khô ở trong rễ tơ cao hơn. Những kết quả trên đây mới chỉ là những kết quả

ban đầu do điều kiện thí nghiệm đang còn nhiều hạn chế. Cần phải tiếp tục tối ưu

51

phương pháp nuôi cấy rễ tơ trong hệ thống bioreactor.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

3.9. Kết quả bán định lượng hàm lượng saponin tổng số trong sinh khối rễ

tơ, so sánh với sâm tự nhiên

Các phương pháp chiết sử dụng dung môi hữu cơ chủ yếu dựa trên tính phân

cực của các hợp chất hoá học. Các hợp chất phân cực sẽ tan trong dung môi phân

cực và hợp chất không phân cực sẽ tan trong dung môi không phân cực. Giai đoạn

khảo sát sự có mặt của saponin trong hệ dung môi chiết là cần thiết cho quá trình

xác định hàm lượng saponin có trong sinh khối rễ. Kết quả khảo sát hàm lượng

saponin trong mẫu rễ tơ sẽ góp phần đánh giá chất lượng sinh khối tạo thành cũng

như hiệu quả của quá trình nuôi cấy.

Các mẫu củ Sâm dây 1, 2, 3 năm tuổi thu thập tại Kon Tum có chiều dài củ

và đường kính củ cực đại của 10 củ Sâm dây mỗi loại lấy ngẫu nhiên theo bảng

3.6.

3 năm

2 năm

1 năm

Hình 3.11. Các mẫu củ Sâm dây thu thập tại Kon Tum

Bảng 3.6. Kích thước củ Sâm dây 1 -3 tuổi thu thập ở Kon Tum

Loại củ

Chiều dài (cm)

Đường kính max (cm)

Sâm dây 1 năm tuổi

16,2 ± 2,77

0,9 ± 0,1

Sâm dây 2 năm tuổi

18,1 ± 2,99

1,2 ± 0,18

Sâm dây 3 năm tuổi

20,5 ± 4,2

1,6 ± 0,2

52

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Mẫu rễ tơ Sâm dây và các mẫu Sâm dây 1,2,3 năm tuổi được thu thập ở

KonTum được chiết hoạt chất theo quy trình đã mô tả ở phần 2.3.10. Dịch chiết

methanol được mang đi xác định sự có mặt của hợp chất saponin hay triterpenoid

qua phản ứng oxy hoá sử dụng acid sulfuric với thuốc thử vanillin và bước đầu

đánh giá hàm lượng saponin tổng số có trong dịch chiết. Kết quả thu nhận được

thể hiện ở bảng 3.7.

Bảng 3.7. Kết quả xác định hàm lượng saponin tổng số

Mẫu

Abs 538 nm

Dung môi

Nồng độ (µmol)

Khối lượng (µg)

MeOH

STN 3 năm STN 2 năm STN 1 năm Rễ tơ

0,320 0,56 0,18 0,38

0,037 0,066 0,021 0,044

16,99 29,99 9,45 19,99

Khối lượng cặn chiết (µg) 100 300 350 585

Hàm lượng saponin theo phần trăm khối lượng w/w 16,99 % 9,99 % 2,70 % 3,42 %

Kết quả khảo sát cho thấy có phát hiện được saponin trong dịch chiết

methanol của Sâm dây. Hiện tượng này xảy ra do cấu trúc của saponin và tính

phân cứu của dung môi methanol. Methanol là dung môi phân cực mạnh nên dễ

dàng hoà tan được các chất có cấu trúc phân cực trong đó có saponin. Việc phát

hiện saponin trong dịch chiết methanol phù hợp với những công bố về thành phần

saponin của Sâm dây. Các nghiên cứu chỉ ra, sâm dây có chứa 7 loại saponin. Các

loại saponin này có cấu trúc khác nhau dẫn đến độ phân cực là hoàn toàn khác

nhau.

Qua kết quả thí nghiệm cho thấy mối tương quan giữa hàm lượng saponin

có trong mẫu rễ tơ Sâm dây và 3 mẫu đối chứng (củ sâm dây 1, 2, 3 năm tuổi).

Hàm lượng saponin trong củ sâm dây được tích luỹ theo thời gian ngày một tăng

từ 2,70 % ở củ 1 năm tuổi lên 16,99 % ở củ 3 năm tuổi. Còn đối với mẫu rễ tơ

Sâm dây in vitro thì hàm lượng saponin thấp hơn chỉ đạt 3,42 %. Điều này là do

trong điều kiện tự nhiên và thời gian nuôi lâu nên hàm lượng saponin tích tụ trong

53

mẫu tự nhiên là cao hơn so với mẫu rễ tơ nuôi cấy.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

Bên cạnh đó hàm lượng saponin ở rễ tơ sâm dây đạt 3,42 % cao hơn so với

hàm lượng saponin có trong củ sâm dây 1 năm tuổi, chỉ đạt 2,70 %. Điều này có

thể là do sâm dây 1 năm tuổi chưa đủ thời gian và tuổi cây để tích luỹ saponin

nên hàm lượng saponin là thấp hơn nhiều so với sâm dây 2 năm tuổi (9,99 %) và

54

sâm dây 3 năm tuổi (16,99 %).

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1.1. Kết luận

1. Đã lựa chọn được dòng rễ tơ sâm dây T7 sinh trưởng và phát triển ổn định.

2. Đã tối ưu được môi trường nuôi cấy rễ tơ Sâm dây thích hợp trên môi trường

thạch là WPM cho trung bình 3,14 nhánh và chiều dài đạt 0,75 ± 0,05 cm, và trên

môi trường lỏng là SH cho tốc độ sinh trưởng lên tới 12,321 lần sau 3 tuần nuôi

cấy.

3. Đã tối ưu được môi trường có nồng độ salicylic acid tốt nhất cho sự tăng

trưởng khối lượng khô là SH + 150 µM salicylic acid + 500 mg/l cefotaxime.

4. Hệ thống bioreactor được sử dụng trong nghiên cứu là dạng sủi bọt dạng cầu

với quy mô 5 lít và 10 lít. Bước đầu nuôi cấy đã tạo được sinh khối có tốc độ tăng

trưởng lên tới 42,5 lần ở quy mô bình bioreactor loại 5 lít.

5. Bước đầu xác định được hàm lượng saponin có trong rễ tơ là 3,4 % cao hơn

so với hàm lượng saponin ở củ sâm dây 1 năm tuổi (chỉ đạt, 2,70 %).

1.2. Kiến nghị

- Tiếp tục tìm các điều kiện tối ưu khác cho rễ tơ Sâm dây phát triển như

thành phần muối khoáng đa lượng và vi lượng; pH, nguồn carbon hydrate, thời

điểm bổ sung elicitor hay các loại elicitor khác, nồng độ oxy...

- Tiến hành tách chiết một số hoạt chất từ sinh khối rễ tơ và đánh giá chất

lượng sinh khối rễ tơ và sâm dây tự nhiên.

- Tiếp tục tiến hành nuôi cấy bioreactor với dung tích lớn hơn.

55

- Đánh giá một số hoạt tính sinh dược học của dịch chiết sinh khối rễ tơ.

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Sách đỏ Việt Nam – phần Thực vật (2007), Nhà Xuất bản Khoa học tự nhiên và

1. Đỗ Tất Lợi (2005) “Những Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản Y học. 2. Hà Thị Mỹ Ngân (2013) “Chuyển gen tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” – Luận văn thạc sĩ. 3. Hoàng Hà (2012) “Nghiên cứu quy trình tạo rễ tơ cây bá bệnh (Eurycoma longifolia) làm cơ sở cho việc sản xuất sinh khối dược liệu” – Luận văn thạc sĩ. 4. Hoàng Minh Chung, Phạm Xuân Sinh, Nguyễn Mạnh Tuyển (2002) “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của vị thuốc Đảng sâm Việt Nam”. Tạp chí Dược Liệu 7(1): 3 – 6. 5. Công nghệ. 6. Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Đình Trọng, Hoàng Hà, Lâm Đại Nhân, Chu Hoàng Hà (2012) “Nghiên cứu khả năng tạo rễ tơ của cây Bá Bệnh (Eurycoma longifolia JACK) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes”. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 50(3B): 166-173.

7. Phạm Bích Ngọc, Nguyễn Đình Trọng, Nguyễn Khắc Hưng, Nguyễn Thị Thúy Hường, Lâm Đại Nhân, Nguyễn Hữu Cường, Lê Trần Bình, Dương Tấn Nhựt, Chu Hoàng Hà (2013). “Nghiên cứu khả năng tạo rễ tơ của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes” Tạp chí Sinh học 11(4): 689 – 695.

Tài liệu Tiếng Việt

8. Alpizar, E., Dechamp, E., Lapeyre-Montes, F., Guilhaumon, C., Bertrand, B., Jourdan, C., Lashermes, P., and Etienne, H. (2008), "Agrobacterium rhizogenes- transformed roots of coffee (Coffea arabica): conditions for long-term proliferation, and morphological and molecular characterization", Ann Bot. 101(7), pp. 929-40.

9. Asada, Y., Saito, H., Yoshikawa, T., Sakamoto, K., and Furuya, T. (1993), "Biotransformation of 18 beta-glycyrrhetinic acid by ginseng hairy root culture", Phytochemistry. 34(4), pp. 1049-52.

10. Baenas, N., Garcia-Viguera, C., and Moreno, D. A. (2014), "Elicitation: a tool for enriching the bioactive composition of foods", Molecules. 19(9), pp. 13541-63.

11. Bai, X. S., Han, C. J. , and Bao, J. (2008), "Studys on the mechanism of the compound Codonopsis lanceolata on alcoholic hepatic injury", Journal of Toxicology. 22(1), pp. 42-44.

12. Banerjee, S., Shang, T. Q., Wilson, A. M., Moore, A. L., Strand, S. E., Gordon, M. P., and Lafferty Doty, S. (2002), "Expression of functional mammalian P450 2E1 in hairy root cultures", Biotechnol Bioeng. 77(4), pp. 462-6.

13. Bernard, R. G., Jack, J. P., and Cheryl, L. P. (2010), "Molecular Biotechnology: Principles and applications of recombinant DNA. ", New York: ASM press.

56

Tài liệu Tiếng Anh

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

14. Bordonaro, J. L. and Curtis, W. R. (2000), "Inhibitory role of root hairs on transport within root culture bioreactors", Biotechnol Bioeng. 70(2), pp. 176-86.

15. Britton, M. T. and Escobar, M. A., et al. (2008), The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium: From Biology to Biotechnology. , T. Tzfira and V. Citovsky., New York. , 524-565.

16. Bulgakov, V. P., Tchernoded, G. K., Mischenko, N. P., Shkryl, Y. N., Glazunov, V. P., Fedoreyev, S. A., and Zhuravlev, Y. N. (2003), "Effects of Ca(2+) channel blockers and protein kinase/phosphatase inhibitors on growth and anthraquinone production in Rubia cordifolia callus cultures transformed by the rolB and rolC genes", Planta. 217(3), pp. 349-55.

17. Casanova, E., Trillas, M. I., Moysset, L., and Vainstein, A. (2005), "Influence of rol genes in floriculture", Biotechnol Adv. 23(1), pp. 3-39.

18. Chan, J. Y., Lam, F. C., Leung, P. C., Che, C. T., and Fung, K. P. (2009), "Antihyperglycemic and antioxidative effects of a herbal formulation of Radix Astragali, Radix Codonopsis and Cortex Lycii in a mouse model of type 2 diabetes mellitus", Phytother Res. 23(5), pp. 658-65.

19. Choi, H. K., Won, E. K., Jang, Y. P., and Choung, S. Y. (2013), "Antiobesity Effect of Codonopsis lanceolata in High-Calorie/High-Fat-Diet-Induced Obese Rats", Evid Based Complement Alternat Med. 2013, p. 210297.

20. Choi, Y.E. , Kim, Y.S., and Paek, K.Y. (2008), "Types and designs of bioreactors for hairy root culture", Plant Tissue Culture Engineering. Springrer, pp. 161-172.

21. Dicosmo, F. and Tower, GHN. (1984), "Stress and secondary metabolism in ciltured plant cells", Phytochemical Adaptation to Stress. Plenum, New York, pp. 97- 175.

22. Dodds, J. H. and Roberts, L. W. (1995), Experiments in Plant Tissue Culture, Cambridge University Press England.

23. Fu, C. G., Wen, L. K., and Dong, R. (2007), "The research progress on chemical constituents and pharmacological activities of Codonopsis lanceolata", Journal of Chinese Medicinal Materials. 30(4), pp. 497-499.

24. Giri, A. and Narasu, M. L. (2000), "Transgenic hairy roots. recent trends and applications", Biotechnol Adv. 18(1), pp. 1-22.

25. Han, B., Linden, J. C., Gujarathi, N. P., and Wickramasinghe, S. R. (2004), "Population balance approach to modeling hairy root growth", Biotechnol Prog. 20(3), pp. 872-9.

26. Hayashi, T., Yoshida, K., and Sano, K. (1988), "Formation of alkaloids in suspension cultured Colchicum autumnale", Phytochemistry. 1988(27), pp. 1371-1374.

27. He, J. Y., Ma, N., Zhu, S., Komatsu, K., Li, Z. Y., and Fu, W. M. (2015), "The genus Codonopsis (Campanulaceae): a review of phytochemistry, bioactivity and quality control", J Nat Med. 69(1), pp. 1-21.

28. He, J. Y., Zhu, S., Goda, Y., Cai, S. Q., and Komatsu, K. (2014), "Quality evaluation of medicinally-used Codonopsis species and Codonopsis Radix based on the

57

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

contents of pyrrolidine alkaloids, phenylpropanoid and polyacetylenes", J Nat Med. 68(2), pp. 326-39.

29. Hiai, S., O. H., and Hakajima, T. (1976), "Colour reaction of some sapogenins and saponins with vanillin and sulphuric acid", Planta medica. 29, pp. 116-122.

30. Hyam, S. R., Jang, S. E., Jeong, J. J., Joh, E. H., Han, M. J., and Kim, D. H. (2013), "Echinocystic acid, a metabolite of lancemaside A, inhibits TNBS-induced colitis in mice", Int Immunopharmacol. 15(2), pp. 433-41.

31. Ichikawa, M., Ohta, S., Komoto, N., Ushijima, M., Kodera, Y., Hayama, M., Shirota, O., Sekita, S., and Kuroyanagi, M. (2009), "Simultaneous determination of seven saponins in the roots of Codonopsis lanceolata by liquid chromatography-mass spectrometry", J Nat Med. 63(1), pp. 52-7.

32. Jeong, G. T., Park, D.H., Hwang, B., Park, K., Kim, S. W., and Woo, J. C. (2002), "Studies on mass production of transformed Panax ginseng hairy roots in bioreactor", Appl Biochem Biotechnol. 98-100, pp. 1115-27.

33. Jian, Z, Lawrence, C.D., and Verpoorte R. (2005), "Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites", Biotechnology Advances. 23, pp. 283–333.

34. Joh, E.H. and Kim, D.H. (2010), "Lancemaside A inhibits lipopolysaccharide- induced inflammation by targeting LPS/TLR4 complex", J Cell Biochem. 111(4), pp. 865-71.

35. Kawaguchi, K., Hirotani, M., Yoshikawa, T., and Furuya, T. (1990), "Biotransformation of digitoxigenin by ginseng hairy root cultures", Phytochemistry. 29(3), pp. 837-43.

36. Kim, E., Yang, W. S., Kim, J. H., Park, J. G., Kim, H. G., Ko, J., Hong, Y. D., Rho, H. S., Shin, S. S., Sung, G. H., and Cho, J. Y. (2014), "Lancemaside A from Codonopsis lanceolata modulates the inflammatory responses mediated by monocytes and macrophages", Mediators Inflamm. 2014, p. 405158.

37. Kim, J. A., Kwang, H. B., Young, M. S., Sung, H. S., and Shin, H. (2009), "Hairy Root Cultures of Taxus cuspidata for Enhanced Production of Paclitaxel.", Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry. 52(2), pp. 144-150.

38. Krishna, P.R., Chari, M.A., Kim, M.K., Kalaiselvi, S., and Yang, D.C. (2007), "Induction of adventitious roots and extraction of codonoposide from Codonopsis lanceolata", An Indian Journal 3(3), pp. 129 – 131.

39. Lee, K. W., Jung, H. J., Park, H. J., Kim, D. G., Lee, J. Y., and Lee, K. T. (2005), "Beta-D-xylopyranosyl-(1-->3)-beta-D-glucuronopyranosyl echinocystic acid isolated from the roots of Codonopsis lanceolata induces caspase-dependent apoptosis in human acute promyelocytic leukemia HL-60 cells", Biol Pharm Bull. 28(5), pp. 854-9.

40. Li, W. L., Zheng, H. C., Bukuru, J., and De Kimpe, N. (2004), "Natural medicines used in the traditional Chinese medical system for therapy of diabetes mellitus", J Ethnopharmacol. 92(1), pp. 1-21.

58

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

41. Liu, G. Z., Cai, D. G., and Shao, S. (1988), "Studies on the chemical constituents and pharmacological actions of dangshen, Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf", J Tradit Chin Med. 8(1), pp. 41-7.

42. Lodhi, A. H., Bongaerts, R. J., Verpoorte, R., Coomber, S. A., and Charlwood, B. V. (1996), "Expression of bacterial isochorismate synthase (EC 5.4.99.6) in transgenic root cultures of Rubia peregrina", Plant Cell Rep. 16(1-2), pp. 54-7.

43. Luo, H., Lin, S., Ren, F., Wu, L., Chen, L., and Sun, Y. (2007), "Antioxidant and antimicrobial capacity of Chinese medicinal herb extracts in raw sheep meat", J Food Prot. 70(6), pp. 1440-5.

44. Maziah, M. and Rosli, N. (2009), "The Production of 9-methoxycanthin-6-one from Callus Cultures of (Eurycoma longifolia Jack) Tongkat Ali", Methods Mol Biol. 547, pp. 359-69.

45. Nguyen, M. D., Nguyen, T. N., Kasai, R., Ito, A., Yamasaki, K., and Tanaka, O. (1993), "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. Collected in central Vietnam. I", Chem Pharm Bull (Tokyo). 41(11), pp. 2010-4.

46. Palazon, J., Mallol, A., Eibl, R., Lettenbauer, C., Cusido, R. M., and Pinol, M. T. (2003), "Growth and ginsenoside production in hairy root cultures of Panax ginseng using a novel bioreactor", Planta Med. 69(4), pp. 344-9.

47. Peng, J. H. and Yu, Y. J. (2009), "Advances in study of Codonopsis lanceolata", Special Wild Economic Animal and Plant Research. 1, pp. 70-73.

48. Radman, R., Bucke, C., and Keshavarz, T. (2004), "Elicitor effects on Penicillium chrysogenum morphology in submerged cultures", Biotechnol Appl Biochem. 40(Pt 3), pp. 229-33.

49. Ryan, R., Brian, C. G., and Tsafrir, S. M. (2008), "Hairy roots organ cultures for the production of human acetylcholinesterase.", BMC Biotechnology. 8(95).

50. Satdive, R.K., Fulzele, D.P., and Eapen, S. (2007), "Enhanced production of azadirachtin by hairy root cultures of Azadirachta indica A.Juss by elicitation and media optimization", J Biotechnol. 128, pp. 281-289.

51. Schmulling, T., Schell, J., and Spena, A. (1988), "Single genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development", EMBO J. 7(9), pp. 2621-9.

52. Sevon, N. and Oksman-Caldentey, K. M. (2002), "Agrobacterium rhizogenes- mediated transformation: root cultures as a source of alkaloids", Planta Med 68(10), pp. 859-868.

53. Sharp, J. M. and Doran, P.M. (2001), "Characterization of monoclonal antibody fragments produced by plant cells", Biotechnol Bioeng. 73(5), pp. 338-46.

54. Sivakumar, G., Yu, K.W., Hahn, E.J., and Paek, K.Y. (2005), "Optimization of organic nutrients forginseng hairy roots production in large-scale bioreactors", Current Science. 89 (4), pp. 641 - 649.

55. Sun, Y. X. (2009), "Immunological adjuvant effect of a water-soluble polysaccharide, CPP, from the roots of Codonopsis pilosula on the immune responses to ovalbumin in mice", Chem Biodivers. 6(6), pp. 890-6.

59

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

56. Tepfer, D.A. and Tempe, J. (1981), "Production d'agropine par des racines formees sous l'action d'Agrobacterium rhizogenes, souche A4", C.R. Acad. Sci. Paris. 292, pp. 153-156.

57. Trigiano, R. N. and Gray, D. J. (1999), Plant Tissue Culture Concepts and Laboratory Exercises, ed. Edition, Second, 25.

58. Ueda, J. Y., Tezuka, Y., Banskota, A. H., Le Tran, Q., Tran, Q. K., Harimaya, Y., Saiki, I., and Kadota, S. (2002), "Antiproliferative activity of Vietnamese medicinal plants", Biol Pharm Bull. 25(6), pp. 753-60.

59. Vasil, I.K. and Thorpe, T.A. , eds. (1998), Plant cell and tissue culture, Dordrecht: Kluwer Acad. Publ.

60. Wang, Z.T., Ng, T.B., Yeung, H.W., and Xu, G.J. (1996), "Immunomodulatory effect of a polysaccharide-enriched preparation of Codonopsis pilosula roots", Gen Pharmacol. 27(8), pp. 1347-50.

61. Woo, S. S., Song, J. S., Lee, J. Y., In, D. S., Chung, H. J., Liu, J. R., and Choi, D. W. (2004), "Selection of high ginsenoside producing ginseng hairy root lines using targeted metabolic analysis", Phytochemistry. 65(20), pp. 2751-61.

62. Xin, T., Zhang, F., Jiang, Q., Chen, C., Huang, D., Li, Y., Shen, W., Jin, Y., and Sui, G. (2012), "The inhibitory effect of a polysaccharide from Codonopsis pilosula on tumor growth and metastasis in vitro", Int J Biol Macromol. 51(5), pp. 788-93.

63. Xu, C., Liu, Y., Yuan, G., and Guan, M. (2012), "The contribution of side chains to antitumor activity of a polysaccharide from Codonopsis pilosula", Int J Biol Macromol. 50(4), pp. 891-4.

64. Yang, C., Gou, Y., Chen, J., An, J., Chen, W., and Hu, F. (2013), "Structural characterization and antitumor activity of a pectic polysaccharide from Codonopsis pilosula", Carbohydr Polym. 98(1), pp. 886-95.

65. Yang, F. R., L. Z. M., and Gao, J. P. (2011), "Separation and structural characterization and anti-tumor effect in vitro of polysaccharides from Radix Codonopsis", Lishizhen Med Mater Med Res. 2011(12), pp. 2876–2878.

66. Yongxu, S. and Jicheng, L. (2008), "Structural characterization of a water-soluble polysaccharide from the roots of Codonopsis pilosula and its immunity activity", Int J Biol Macromol. 43(3), pp. 279-82.

67. Yoo, C. S. and Kim, S. J. (2013), "Methanol extract of Codonopsis pilosula inhibits inducible nitric oxide synthase and protein oxidation in lipopolysaccharide- stimulated raw cells", Tropical J Pharm Res. 12(5), pp. 705–710.

68. Yu, K.W., Gao, W.Y., Son, S.H., and Paek, K.Y. (2000), "Improvement of ginsenoside production by jasmonic acid and some other elicitor in hairy root culture of ginseng ( Panax ginseng CA Meyer)", In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 36(5), pp. 424 - 428.

69. Zhang, L., Han, C. J., Li, L. J. , and Tao, L. (2007), "The preventive effect of the compound Codonopsis lanceolata on alcoholic hepatic injury in mice", Journal of Toxicology. 21(4), pp. 265-267.

60

Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng

70. Zhao, J., Zhu, W.H., Hu, Q., and He, X.W. (2000), "Improved indole alkaloid production in Catharanthus roseus suspension cell culture by various chemical", Biotechnology Letters. 22, pp. 1221-1226.

71. Zhao, M. Q., Ding, J. Y., Liu, J., and Hu, B. (2001), "Studies on the arbutin biosynthesis by hairy root of Panax ginseng C.A. Mayer", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 26(12), pp. 819-22.

72. Zhi, B. H. and Min, D. (2006), "Hairy roots and its application in plant genetic engineering.", Journal of intergrative plant biology. 48(2), pp. 121-127.

Tài liệu Web

73. http://www2.hawaii.edu/

61