Nghiên cứu sản xuất Enzyme protease tái tổ hợp trong hệ thống lên men quy mô pilot và thử nghiệm ứng dụng sản xuất nước chấm

Chia sẻ: Ko Ko Lo Ko | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

336
lượt xem 28
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Enzyme là chất xúc tác sinh học đang được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau. Do đó, nhu cầu về enzyme ngày càng tăng do hiệu quả của chúng đem lại. Năm 1995, ước tính ngành công nghiệp enzyme thế giới thu được 1 tỷ USD, năm 2005 khoảng 1,7-2 tỷ USD. Châu Âu sản xuất 60% tổng số enzyme trên thế giới, số còn lại do Mỹ và Nhật Bản sản xuất. Trong các loại enzyme công nghiệp thì hydrolase chiếm lượng lớn nhất (75%), tiếp đến là carbonhydrolase....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu sản xuất Enzyme protease tái tổ hợp trong hệ thống lên men quy mô pilot và thử nghiệm ứng dụng sản xuất nước chấm

Nghiên cứu sản xuất enzyme protease tái tổ hợp trong hệ thống lên men quy mô pilot và thử nghiệm ứng dụng sản xuất nước chấm Ngày cập nhật: 26/03/2012 Đây là đề tài khoa học và công nghệ cấp tỉnh do Viện Tài nguyên Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế chủ trì thực hiện trong 2 năm (2010-2011). Đề tài này đã được Hội đồng Khoa học và Công ngh ệ t ỉnh Thừa Thiên Huế nghiệm thu vào cuối tháng 2 vừa qua. Tổng quan về đề tài Enzyme là chất xúc tác sinh học đang được sử dụng rộng rãi trong nhi ều ngành công nghiệp khác nhau. Do đó, nhu c ầu v ề enzyme ngày càng tăng do hiệu quả của chúng đem lại. Năm 1995, ước tính ngành công nghi ệp enzyme th ế giới thu được 1 tỷ USD, năm 2005 khoảng 1,7-2 t ỷ USD. Châu Âu s ản xu ất 60% tổng số enzyme trên thế giới, số còn lại do Mỹ và Nh ật B ản s ản xu ất. Trong các loại enzyme công nghiệp thì hydrolase chi ếm l ượng l ớn nh ất (75%), ti ếp đ ến là carbonhydrolase. Enzyme vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn enzyme động vật và th ực v ật do chúng có hoạt tính thủy phân cao hơn và sản l ượng l ớn h ơn. Bên c ạnh đó, ngu ồn cung cấp enzyme này ổn định, không ph ụ thu ộc theo mùa và vi sinh v ật sinh trưởng nhanh trên môi trường đơn giản, rẻ ti ền. Kho ảng 2% vi sinh v ật trên th ế giới đã được thử nghiệm là có enzyme. Protease (còn gọi là proteinase hoặc peptidase) là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) c ủa chu ỗi polypeptide. Ch ức năng của protease giống như con dao phân t ử cắt nh ững trình t ự amino acid dài thành những đoạn ngắn. Quá trình này cần thi ết cho s ự t ổng h ợp, ki ểm soát kích thước, thành phần, hình dạng của các phân t ử protein và cu ối cùng là phân h ủy chúng. Protease chiếm khoảng 2% trong genome c ủa ng ười và 1-5% trong genome của côn trùng. Protease điều hòa hầu h ết các quá trình sinh lý thông qua việc kích hoạt tổng hợp protein.
Protease được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nh ư đ ộng v ật (gan, d ạ dày…), thực vật (đu đủ, dứa…) và vi sinh vật (vi khu ẩn, n ấm…). Trong đó, enzyme vi sinh vật có vai trò to lớn trong các ngành s ản xu ất công nghi ệp. S ử dụng enzyme trong sản xuất sẽ nâng cao chất l ượng, hạ giá thành s ản ph ẩm, c ải thiện lao động và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, nh ững k ết qu ả đ ạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease từ vi sinh vật b ằng con đ ường truy ền thống chưa đáp ứng được việc mở rộng qui mô sản xuất và ứng dụng c ủa nhóm enzyme này trong đời sống. Chính vì vậy, việc nghiên c ứu cải thi ện ho ạt tính và tăng khả năng tổng hợp protease bằng các kỹ thuật hiện đại như tạo dòng và biểu hiện gen, thăm dò các điều ki ện nuôi cấy t ối ưu đ ể s ản xu ất m ột l ượng l ớn enzyme này cho sản xuất là vấn đề cần thiết và có ý nghĩa th ực ti ễn to l ớn. Công nghệ DNA tái tổ hợp và kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật là c ơ s ở đ ể sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp như vaccine, hormone, cytokine và enzyme. Nh ờ có những ưu điểm như chu kỳ sinh trưởng ngắn, có th ể nuôi c ấy trên môi tr ường đơn giản nên Escherichia coli là cơ thể vật chủ được sử dụng thường xuyên cho sự biểu hiện protein tái tổ hợp. Ở Việt Nam, chưa có nhiêu công trình nghiên cứu sản xuất protease tái tổ ̀ hợp, sản xuất chế phẩm protease từ nguyên liệu t ự nhiên ở quy mô công nghi ệp cũng trong tình trạng tương tự. Các công trình nghiên c ứu ch ủ y ếu t ập trung vào việc tách chiết enzyme này từ các nguồn tự nhiên (thực vật, đ ộng vật và vi sinh vật), khảo sát các tính chất lý-hóa và hoạt tính sinh h ọc c ủa chúng. Nhìn chung, sử dụng protease ở Việt Nam vẫn còn hạn chế do ngu ồn đáp ứng ch ưa đ ủ và thiếu ổn định. Trước đây, nhóm tác giả cũng đã thành công trong vi ệc t ạo dòng và bi ểu hiện gen mã hóa npr C10 từ Bacillus subtilis C10 trong E. coli BL21 (DE3) nhờ hệ thống vector pET200/D-TOPO. Hoạt tính th ủy phân protein thu đ ược t ừ enzyme tái tổ hợp (NPRC10) rất cao và đây là c ơ s ở đ ể chuy ển qua giai đo ạn tiếp theo, đó là sản xuất enzyme ở quy mô lớn hơn. Trong đề tài này, đối tượng nghiên cứu là ch ủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp có chứa vector pET200/D-TOPO mang gen nprC10 (accession number: FJ822054 trên NCBI) mã hóa enzyme protease trung tính ngo ại bào c ủa ch ủng B. subtilis C10. E. coli BL21 (DE3) là chủng vi khuẩn thương mại không có đ ộc tính, được sử dụng phổ biến trong biểu hiện gen ở prokaryote. Nội dung của đề tài là tập trung vào nghiên c ứu xây d ựng quy trình s ản xuất enzyme protease tái tổ hợp từ vi khuẩn E. coli ở quy mô pilot như thăm dò môi trường nuôi cấy; chất cảm ứng, mật độ tế bào vào thời điểm cảm ứng, t ốc đ ộ khuấy trộn, tỷ lệ cấy giống…; nghiên cứu điều kiện bảo quản enzyme (b ảo qu ản thô, bảo quản có phụ gia và bảo quản trong đệm); và thử nghi ệm ứng d ụng enzyme protease tái tổ hợp để sản xuất nước chấm từ bột đậu nành. Kết quả đạt được Với mục tiêu sản xuất được chế phẩm enzyme protease tái t ổ hợp ở quy mô pilot, ứng dụng thành công enzyme protease tái t ổ h ợp đ ể s ản xu ất n ước chấm và đề xuất phương án sản xuất và hướng mở rộng ứng dụng tại Th ừa Thiên Huế, sau 2 năm triển khai thực hiện, đề tài đã đạt đ ược m ột s ố k ết qu ả nhất định. Theo đó, đề tài đã xây d ựng đ ược quy trình s ản xu ất sinh kh ối ch ủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp có chứa vector pET200/D-TOPO mang gen nprC10. Để sản xuất giống cấp 1, chủng E. coli được nuôi cấy qua đêm ở 37oC trong bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường LB (0,5% dịch chiết nấm men, 1% tryptone
và 1% NaCl, pH 7) có bổ sung 50 mg/l kanamycine, tỷ lệ cấy giống 2% (v/v) và tốc độ lắc 220 vòng/phút cho kết quả tốt nhất, OD 600 đạt 2,86 sau 15 giờ nuôi cấy. Nhân giống cấp 2 được thực hiện trong h ệ lên men 14-l (BioFlo 110, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) chứa 4l môi tr ường LB, ở 37 oC trong 40 giờ, nồng độ chất chống tạo bọt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) là 0,1%, t ốc độ sục khí 2l/phút, tốc độ khuấy 300 vòng/phút và tỷ l ệ c ấy gi ống 2% (v/v) cho kết quả tốt nhất. OD600 đạt 6,60 sau 40 giờ nuôi cấy. Thứ hai đó là sản xuất thành công enzyme NPRC10 ở quy mô pilot. Đ ể sản xuất enzyme NPRC10, chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp được chuyển lên nuôi cấy trong hệ lên men 40-l (BioFlo 510, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, US) chứa 20l môi trường HSG c ải ti ến (3% glycerol, 0,7% d ịch chi ết nấm men, 1,35% tryptone, 0,014% MgSO 4.H2O, 0,15% KH2PO4, 0,23% K2HPO4, 0,5% glycine và 1,5% tinh bột tan) ở nhiệt độ 37 oC, tỷ lệ cấy giống 2%. Trong quá trình sản xuất enzyme, pH 7 của môi trường luôn đ ược duy tri ̀ b ằng cách b ơm t ự động các dung dịch H3PO4 3M và NaOH 3M. Các thông số của quá trình lên men bao gồm tôc độ khuây trôn 500 vòng/phút va ̀ tôc đô ̣ suc khi ́ 5l/phut, ch ất ch ống ́ ́ ̣ ́ ̣ ́ tạo bọt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) là 0,1%. Khi m ật đ ộ t ế bào ở h ệ lên men 40-L đạt OD600 = 2, nhiệt độ trong hệ lên men được giảm xu ống 20 oC, bổ sung 10 mM Ca2+ và nồng độ lactose từ 0,5% để cảm ứng sinh enzyme NPRC10. Enzyme NPRC10 có HĐC cao nhất là 75,99 unit/ml sau 34 gi ờ cảm ứng. Thứ ba, xây dựng được quy trì bảo quản chế phẩm enzyme NPRC10 trong khoảng thời gian 6 tháng. Đối với dịch enzyme thô, ch ế ph ẩm đ ược b ảo qu ản t ốt nhât ở -30oC khi có bổ sung 10% glycerol, HĐC còn lại sau 6 thang là 77%. Đ ối ́ ́ với bảo quản chế phẩm khô, 100ml dung dich enzyme thô đ ược k ết t ủa v ới ̣ ammonium sulphate bão hòa 60% ở 4 oC trong 2 giờ, sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 oC để thu kết tủa. Bổ sung vào kết tủa phu ̣ gia bôt ̣ gao (tỷ lệ 1:4) sau đó hôn hợp được đông khô bằng máy Micro Modulyo (Thermo ̣ ̃ Savant, USA) đến khối lượng không đổi. Chế phâm enzyme khô được bao quan ở nhiệt độ phòng, HĐC con laị sau ̉ ̉ ̉ ̀ 3 thang là 91,1%. Đối với bảo quản trong đệm, enzyme thô sau khi k ết t ủa nh ư ́ trên được hòa tan trở lại trong 20ml đệm (50 mM Tris.HCl, 1 mM DTT, 100 mM NaCl và 10 mM MgCl2, pH 7,9). Chế phâm enzyme tinh sach gi ữ đ ược 86% HĐC ̉ ̣ sau 6 thang bao quan ở -30oC. ́ ̉ ̉ Thứ tư, thử nghiệm thành công sản xuất nước chấm từ bột đậu nành. Quy trình thực hiện như sau: nguyên liệu bột khô đậu nành đ ược x ử lý b ằng cách tr ộn với nước theo tỷ lệ 1g bột/10ml nước, đun sôi rồi sau đó đ ể ngu ội v ề nhiêt đô ̣ ̣ phong, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 10 phút để loaị bo ̉ dich. Sau đó, b ột khô ̀ ̣ đậu nành đã xử lý (600g) được trộn với 50ml chế phẩm enzyme thô (khoang ̉ 3.500 unit) và bổ sung nước cất đến 8,5l. Hỗn hợp được ủ ở nhi ệt đ ộ 50 oC và pH 6,5 trong 2,5 giờ, tôc độ khuây trôn trong qua ́ trinh ủ t ừ 300 vòng/phút. Sau khi x ử ́ ́ ̣ ̀ lý bằng enzyme, phần bã đậu nành còn lại ti ếp t ục đ ược x ử lý b ằng HCl, sau đó bổ sung các chất phụ gia để tạo thành nước chấm. San phâm n ước châm th ử ̉ ̉ ́ nghiệm đat tiêu chuân vệ sinh an toan thực phâm. ̣ ̉ ̀ ̉ Đối với tỉnh Thừa Thiên Huế, chế phẩm enzyme NPRC10 có thể ứng d ụng vào các lĩnh vực như san xuât nước châm từ đâu nanh hoặc đậu ph ụng, x ử ly ́ vo ̉ ̉ ́ ́ ̣ ̀ tôm để thu chitin dùng trong sản xuất glucosamine và có th ể bô ̉ sung vao trong ̀ khâu phân thức ăn chăn nuôi. ̉ ̀ Đóng góp mới của đề tài
Các kết quả trên thế giới tại thời điểm công bố: Tạo dòng và bi ểu hi ện thành công enzyme protease trong E. coli và các loại vật chủ khác; sản xuất enzyme protease ở quy mô pilot; ứng dụng protease trong m ột s ố ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thu ộc da, x ử lý môi trường... Kết quả nghiên cứu của đề tài đã kế thừa nh ững thành t ựu đ ạt đ ược trên thế giới để áp dụng vào Việt Nam (chưa có công trình t ương t ự đ ược công bố tại Việt Nam). Đề tài thực hiện dựa trên gen nprC10 có nguồn gốc từ chủng Bacills subtilis được phân lập tại Thừa Thiên Huế, do đó thích hợp cho nh ững ứng dụng trực tiếp tại địa phương. Từ kết quả đã đạt được, đề tài đã đưa ra được quy trình sản xu ất enzyme NPRC10 có thể áp dụng trong thực tế đồng thời đề xu ất các hướng ứng d ụng của enzyme này trên địa bàn Thừa Thiên Huế. Đề tài cũng m ở ra h ướng m ới cho việc sản xuất các enzyme tái tổ hợp khác ngay trên địa bàn Thừa Thiên Hu ế. Trong tương lai, các nghiên cứu sâu hơn về ứng dụng c ủa enzyme này s ẽ được thực hiện, góp phần nâng cao hiệu quả trong công nghi ệp s ản xu ất n ước chấm, thức ăn chăn nuôi, sản xuất glucosamine đ ồng th ời góp ph ần làm gi ảm ô nhiễm môi trường do sản xuất công nghiệp gây ra. PGS. TS Nguyễn Hoàng Lộc (skhcn.thuathienhue.gov.vn)