Nghiên cứu sự hình thành rễ từ cuống lá cây tam thất hoang (panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng) in vitro và bước đầu định lượng saponin toàn phần trong rễ tạo thành

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> NGHIÊN CỨU SỰ HÌNH THÀNH RỄ TỪ CUỐNG LÁ CÂY<br /> TAM THẤT HOANG (PANAX STIPULEANATUS H. T. TSAI ET<br /> K.M.FENG) IN VITRO V\ BƢỚC ĐẦU ĐỊNH LƢỢNG<br /> SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG RỄ TẠO THÀNH<br /> Nguyễn Thị Ngọc Hương*, Trần Hùng*, Trương Thị Đẹp*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Tất cả các bộ phận c a cây Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng) được<br /> dùng làm thuốc bổ, cầm m{u, tăng cường sinh dục, chống stress. Việc nghiên cứu s hình thành rễ bất định t<br /> cuống lá không chỉ mang ý ngh a quan trọng trong vi nhân giống loài cây thuốc này mà còn góp phần thu nhận<br /> saponin t rễ, đ{p ứng nguồn nguyên liệu cho l nh v c y ược học trong tư ng lai.<br /> Mục tiêu: Phân tích s biến đổi về cấu tạo giải phẫu c a cuống lá trong quá trình tạo mô sẹo và hình thành<br /> rễ bất định. Định lượng saponin toàn phần trong rễ tạo thành.<br /> Đối tượng-phương pháp nghiên cứu: Nuôi cấy cuống lá t cụm chồi Tam thất hoang 3 tháng tuổi trên<br /> môi trường tạo rễ; nh ng thay đổi về đặc điểm giải phẫu c a cuống l{, đặc điểm hình thái c a mô sẹo và rễ bất<br /> định được phân tích, mô tả và chụp hình.<br /> Kết quả: Nồng độ auxin giúp s tạo rễ nhiều nhất t cuống lá là 5 mg/l NAA sau 10 tuần trên môi trường<br /> MS (Murashige & Skoog, 1962). Các tế bào vùng mô mềm gần biểu bì phân chia tạo mô phân sinh ngọn rễ. Các tế<br /> bào mô mềm gần cung libe gỗ tạo nốt tròn phân hóa mạch. Rễ hình thành có hệ thống mạch nối với mạch c a các<br /> nốt tròn ph a trong. H|m lượng saponin chiếm 5,5% trong rễ nuôi cấy.<br /> Kết luận: NAA là auxin thích hợp cho s tạo rễ bất định t cuống lá Tam thất hoang. Rễ tạo thành có khả<br /> năng sinh tổng hợp v| t ch lũy saponin.<br /> Từ khóa: Tam thất hoang, mô sẹo, rễ bất định<br /> <br /> ABSTRACT<br /> STUDY ON MORPHOGENESIS OF ADVENTITIOUS ROOT FROM PETIOLE<br /> OF PANAX STIPULEANATUS H. T. TSAI ET K.M.FENG IN VITRO<br /> AND PRELIMINARY QUANTIFICATION OF TOTAL SAPONINS IN THESE ROOTS<br /> Nguyen Thi Ngoc Huong, Tran Hung, Truong Thi Dep<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 45-51<br /> Background: All parts of the Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng are used as tonics, stopping<br /> bleeding, sexual enhancement, and anti-stress. The study of the morphogenesis of adventitious root from the<br /> petiole is not only important in micropropagation of this medicinal plant, but also contributes to getting saponins<br /> from these roots, to the supply of raw materials for the medical pharmacy field in the future.<br /> Objectives: Analysing anatomical changes of petioles during callus formation and adventitious rooting.<br /> Quantification of total saponins in these roots.<br /> Methods: Petiole explants of 3-month-old plants were cultured on root-induced medium; the anatomical<br /> *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Th Ngọc Hương<br /> ĐT: 0933386054<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Email : ngochuongyd82@gmail.com<br /> <br /> 45<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> changes of petiole, the morphological characteristics of callus and adventitious root were analysed, descriptived<br /> and photoghraphed.<br /> Results: Concentration of auxin induces the most roots from the petiole is 5 mg/l of NAA after 10 weeks on<br /> MS medium (Murashige & Skoog, 1962). The parenchyma cells near epidermis are divided to form root<br /> meristems. The parenchyma cells near xylem and phloem form nodules with xylogenesis. Adventitious roots have<br /> the conducting tissues connect with these of the nodules inside. The content of total saponins in these roots is 5%.<br /> Conclusions: NAA is the auxin suitable for the formation of adventitious roots from Panax stipuleanatus<br /> petiole. These roots are able to biosynthesise and accumulate saponins.<br /> Keyword: Panax stipuleanatus, callus, adventitious rooting<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPH[P NGHI NCỨU<br /> <br /> T t cả các bộ phận của cây Tam th t hoang<br /> (Araliaceae) ều có thể làm thuốc. Thân rễ<br /> thường ược dùng làm thuốc bổ, c<br /> {u, t ng<br /> cường sinh dục, chống stress. Lá và nụ hoa dùng<br /> làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an<br /> th n(9) Do ó, việc phân tích thành ph n hóa học<br /> trong Tam th t hoang ã ược các nhà khoa học<br /> quan tâm nghiên cứu t nh ng n<br /> 1985(13).<br /> Nh ng nghiên cứu g n }y cho th y saponin<br /> trong Tam th t hoang có tác dụng chống ung<br /> thư(1) Đặc biệt, các saponin thuộc nhóm olean t<br /> rễ và thân rễ của Tam th t hoang có t{c ộng<br /> kìm hãm hoạt ộng của HepG2 (dòng t bào ung<br /> thư gan ở người)(4). Với nh ng giá tr ược liệu<br /> như vậy, nên hiện nay, Tam th t hoang ang<br /> khai thác b a ãi S{ch ỏ Việt Nam nêu rõ Tam<br /> th t là nguồn g n ặc biệt quý hi<br /> ối với Việt<br /> Na cũng như tr n th giới v| ang ứng trước<br /> nguy cơ tuyệt chủng cao(9).<br /> <br /> Đố ƣợng<br /> <br /> Việc nuôi c y in vitro rễ b t<br /> nh của<br /> nh ng loài cây thuốc thuộc chi Panax cho th y<br /> tỷ lệ t ng sinh của rễ v| h|<br /> ượng hợp ch t<br /> bi n ưỡng thứ c p trong rễ r t cao có khả<br /> n ng so s{nh với rễ tự nhiên(3,6). Vận dụng<br /> nh ng ưu iểm của phương ph{p nuôi c y mô<br /> hiện ại như hông phụ thuộc thời ti t, khí<br /> hậu, chủ ộng trong quá trình nuôi c y, rút<br /> ngắn thời gian nuôi trồng, ch ng tôi ã ti n<br /> hành nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự phát<br /> sinh rễ t cuống lá của cây Tam th t hoang in<br /> vitro v| nh ượng saponin toàn ph n trong<br /> rễ tạo thành, góp ph n {p ứng nguồn nguyên<br /> liệu cho ĩnh vực y ược học trong tương ai<br /> <br /> 46<br /> <br /> Cuống lá của chồi Tam th t hoang in vitro<br /> (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.Feng) 3 tháng<br /> tuổi có nguồn gốc t mô sẹo thân rễ ược nuôi<br /> trồng tại phòng thí nghiệm bộ môn Sinh lý thực<br /> vật – Khoa Sinh học và Công nghệ sinh học,<br /> trường Đại học khoa học tự nhiên Tp.HCM.<br /> Phƣơn pháp<br /> <br /> Thí nghiệm tạo rễ từ cuống lá<br /> Cuống { có ường kính khoảng 1-2 mm<br /> ược cắt thành nhiều oạn dài 5-7<br /> v| ược<br /> ặt nằ<br /> ngang tr n<br /> ôi trường MS ½<br /> (Murashige và Skoog, 1962)(5) có bổ sung riêng lẻ<br /> IBA và NAA ở các nồng ộ 1, 3, 5 mg/l. Các mẫu<br /> ược che tối ở iều kiện nhiệt ộ 22 ± 2 oC và ẩm<br /> ộ 65%.<br /> Số rễ ược x{c nh tại thời iểm 10 tu n<br /> nuôi c y và thống kê bằng ph n mềm SPSS,<br /> phiên bản 11.5 dùng cho Window. Sự khác biệt<br /> có ý nghĩa ở mức p≤0,05 của các giá tr ược biểu<br /> hiện bằng các mẫu tự khác nhau kèm theo sau.<br /> Sự thay ổi hình thái và c u tạo giải phẫu<br /> của cuống lá trong quá trình phát sinh rễ ược<br /> quan sát l n ượt ở các thời iểm 4 và 10 tu n sau<br /> nuôi c y. Rễ in vitro ở thời iểm 20 tu n ược thu<br /> nhận và ly trích saponin toàn ph n.<br /> <br /> Quan sát hình thái giải phẫu<br /> Cuống { ược cắt ngang bằng dao lam<br /> thành các lát cắt dày 200-300 µm, nhuộm bằng<br /> phương ph{p nhuộm kép của Bộ môn Thực vật Khoa Dược. Quy trình nhuộm: Ngâm vi phẫu<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> v|o nước Jav<br /> n khi trắng. Rửa sạch. Ti p tục<br /> ngâm vi phẫu trong dung d ch acid acetic 10%<br /> trong 10 phút. Nhuộm vi phẫu với thuốc nhuộm<br /> son phèn-lục iod trong 15 phút. Rửa sạch. Quan<br /> sát vi phẫu ã nhuộm bằng kính hiển vi quang<br /> học và chụp ảnh ở vật nh 4 v| 10 ( ộ phóng<br /> ại 40X, 100X).<br /> <br /> Bảng 1: Ảnh hưởng c a IBA đến khả năng tạo rễ bất<br /> định t cuống lá Tam thất hoang sau 12 tuần nuôi<br /> cấy<br /> <br /> Định lượng saponin toàn phần trong rễ tạo<br /> thành bằng phương pháp cân<br /> Mẫu thân rễ, rễ b t nh mọc t thân rễ (cây<br /> trong tự nhiên) và rễ nuôi c y ược ngâm trong<br /> M OH, si u } 20 ph t, thu ược cao MeOH.<br /> Cô cao M OH n khô rồi hòa tan cắn với một ít<br /> nước Cao nước n|y ược lắc phân bố với DCM<br /> cho n khi dung d ch DCM không còn màu thu<br /> ược cao nước và cao DCM. L y cao nước ti p<br /> tục lắc phân bố với n Butano<br /> n khi d ch n<br /> Butanol không màu. Thu cao n Butanol và cô<br /> n cắn.<br /> <br /> Các số trung bình trong cột với các kí tự khác<br /> nhau kèm theo sau thì khác biệt có ý nghĩa ở<br /> mức p≤0,05<br /> <br /> T nh h|<br /> ượng saponin toàn ph n (%):<br /> S=a/M*(1-x)*100<br /> Trong ó: S: h|<br /> ượng<br /> saponin (%), a: khối ượng saponin toàn ph n<br /> (g), M: khối ượng ược liệu (g), x: hàm ẩm<br /> ược liệu (%).<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Ảnh hƣởng củ IB<br /> N<br /> đến sự tạo rễ bất<br /> định của cuống lá Tam thất hoang<br /> Tại thời iểm 10 tu n sau sự nuôi c y,<br /> các mẫu c y trên IBA tạo rễ với tỷ lệ l n<br /> ượt là 12,5; 25,75;18,75 ứng với các nồng<br /> ộ 1, 3, 5 mg/l. Tuy nhiên, tỷ lệ tạo rễ này<br /> cùng với số rễ hông {ng ể vì khác biệt<br /> hông có ý nghĩa thống kê (ở mức p=95%)<br /> (Bảng 1).<br /> Khác với IBA, NAA cho tỷ lệ tạo rễ t ng<br /> d n theo nồng ộ. Ở nồng ộ 3 và 5 mg/l<br /> NAA cho tỷ lệ tạo rễ cao hơn so với nồng<br /> ộ 1 g/ v| hơn 50<br /> Số rễ t ng<br /> n theo<br /> nồng ộ NAA trong ôi trường, nhưng chỉ<br /> ở nồng ộ NAA 5 mg/l số rễ mới khác biệt<br /> so với ối chứng (Bảng 2).<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Nồ<br /> <br /> ộ IBA (mg/L)<br /> 0<br /> 1<br /> 3<br /> 5<br /> <br /> Tỷ lệ ra rễ (%)<br /> a<br /> 0,00 ± 0,00<br /> a<br /> 12,50 ± 7,22<br /> a<br /> 25,75 ± 10,55<br /> a<br /> 18,75 ± 18,75<br /> <br /> Số rễ<br /> a<br /> 0,00 ± 0,00<br /> a<br /> 0,34 ± 0,17<br /> a<br /> 0,75 ± 0,22<br /> a<br /> 0,88 ± 0,38<br /> <br /> Bảng 2: Ảnh hưởng c a NAA đến khả năng tạo rễ<br /> bất định t cuống lá Tam thất hoang sau 12 tuần<br /> nuôi cấy<br /> Nồ<br /> <br /> ộ NAA (mg/L)<br /> 0<br /> 1<br /> 3<br /> 5<br /> <br /> Tỷ lệ ra rễ (%)<br /> b<br /> 0,00 ± 0,00<br /> b<br /> 4,00 ± 4,00<br /> a<br /> 53,33 ± 8,58<br /> a<br /> 63,00 ± 15,62<br /> <br /> Số rễ<br /> b<br /> 0,00 ± 0,00<br /> b<br /> 0,05 ± 0,05<br /> ab<br /> 1,53 ± 0,57<br /> a<br /> 2,32 ± 0,87<br /> <br /> Các số trung bình trong cột với các kí tự khác<br /> nhau kèm theo sau thì khác biệt có ý nghĩa ở<br /> mức p≤0,05<br /> Sự hình thành rễ bấ định từ cuống lá Tam thất<br /> hoang<br /> Vi phẫu cuống lá mặt trên g n như phẳng,<br /> mặt ưới lồi tròn. Biểu bì trên và biểu ì ưới có<br /> lớp cutin mỏng và phẳng. Mô mềm khuy t t<br /> bào hình b u dục, kéo dài, sắp x p lỏng lẻo. Libe<br /> và gỗ c p 1 x p thành cung ở gi a, gỗ ở trên và<br /> libe ở ưới (ảnh 4).<br /> Tại thời iểm 4 tu n, tr n ôi trường MS bổ<br /> sung IBA hoặc NAA ở các nồng ộ khác nhau,<br /> các mẫu cuống lá có d u hiệu t ng ch thước bề<br /> ngang. Hai u v t cắt phù nhiều hơn v| xu t<br /> hiện mô sẹo Sau ó, ô sẹo liên tục t ng sinh<br /> phát triển mạnh quanh v t cắt cho n khi tràn<br /> ra bề mặt ôi trường. Mô sẹo này có màu trắng,<br /> chi t quang kém và rắn chắc (ảnh 2B) Điều này<br /> cho th y, có lẽ mô sẹo này không ti p tục phản<br /> ph}n hóa | t ng trưởng v| t ch ũy ột số ch t<br /> bên trong tạo ra ộ cứng mô sẹo. Thật vậy, các<br /> lát cắt ngang qua khối mô sẹo ở v t cắt sát cuống<br /> lá này cho th y vách các t bào ngoài cùng của<br /> ch ng ã tẩm ch t b n Hơn th n a, nhiều khối<br /> <br /> 47<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> mô mề<br /> ang ph}n hóa th|nh i v| gỗ xu t<br /> hiện n trong c|ng t ng ộ chắc và cứng của<br /> mẫu (ảnh 5, ảnh 6 và ảnh 7).<br /> Khi cắt ngang vùng phù lên sát v t cắt của<br /> cuống lá 4 tu n, các t bào vùng mô mề<br /> ưới<br /> biểu bì và mô mềm g n hệ thống mạch dẫn có sự<br /> ph}n chia u tiên (ảnh 5). Ở tu n thứ 10, nhóm<br /> t bào này tạo thành các vùng phân sinh dạng<br /> nốt tròn. Các nốt tròn phía ngoài có thể hình<br /> th|nh ược mô phân sinh ngọn rễ (ảnh 8). Các<br /> nốt tròn bên trong rải rác t cung libe gỗ ra phía<br /> ngo|i có xu hướng hóa mạch (ảnh 7) Sau ó rễ<br /> mới hình thành nối hệ thống mạch dẫn của mình<br /> với mạch dẫn của các nốt bên trong (ảnh 8). Rễ<br /> ạt ược c u trúc hoàn chỉnh và phá vỡ các nốt<br /> tròn mô sẹo ể xu t hiện ra bên ngoài (ảnh 3 và<br /> ảnh 9). Quá trình tạo mô sẹo ở Tam th t hoang<br /> tương tự với sự khử phân hóa các t bào mô<br /> mềm vỏ ể phân hóa thành ba loại nốt tròn<br /> trong mô sẹo t trụ hạ diệp của cây Keo<br /> (Racosperma mangium (Wi ) P<br /> y) ưới tác<br /> ộng của auxin và cytokinin. Nốt tròn thứ nh t<br /> phân hóa vùng phân sinh, nốt tròn thứ hai phân<br /> hóa mạch còn nốt tròn thứ ba chỉ gồm các t bào<br /> mô mềm(11).<br /> <br /> 48<br /> <br /> Ảnh 1: Cụm chồi Tam thất hoang in vitro.<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> Ảnh 2: Cuống lá trên môi trường MS có bổ sung<br /> NAA 5 mg/l (A, thời điểm 0 tuần, B, thời điểm 4<br /> tuần)<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Ảnh 3: Cuống lá ra rễ sau 14 tuần trên môi trường MS có bổ sung NAA 5 mg/l<br /> <br /> Ảnh 4: Vi phẫu cuống lá Tam thất hoang<br /> <br /> Ảnh 5: Các tế bào mô mềm gần cung libe gỗ mũi tên c a cuống lá<br /> phân chia sau 4 tuần trên môi trường MS có bổ sung NAA 5 mg/l<br /> <br /> Ảnh 6: Các tế bào mô mềm phía ngoài c a cuống lá<br /> phân chia tạo các nốt tròn sau 4 tuần trên môi trường<br /> MS có bổ sung NAA 5 mg/l<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Ảnh 7: Các tế bào mô mềm phía trong c a cuống lá<br /> phân chia tạo các nốt tròn phân hóa mạch mũi tên sau<br /> 4 tuần trên môi trường MS có bổ sung NAA 5 mg/l<br /> <br /> 49<br /> <br />