intTypePromotion=1
ADSENSE

Nghiên cứu tạo chế phẩm nhũ tương từ hợp chất kháng khuẩn của cây bạch đàn trắng (eucalyptus camaldulensis dahnardt) phục vụ phòng bệnh hoại tử gan tụy ở tôm chân trắng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

18
lượt xem
3
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu được tiến hành nhằm mục đích tìm ra các thông số kỹ thuật tối ưu của quy trình trích lý tinh dầu bạch đàn, đánh giá khả năng kháng khuẩn của tinh dầu và chế phẩm nhũ tương tinh dầu bạch đàn đối với 2 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus DHM-03.18, V. parahaemolyticus DHM-04.19 gây bệnh AHPNS ở tôm nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm in vitro. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu tạo chế phẩm nhũ tương từ hợp chất kháng khuẩn của cây bạch đàn trắng (eucalyptus camaldulensis dahnardt) phục vụ phòng bệnh hoại tử gan tụy ở tôm chân trắng

  1. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM NHŨ TƯƠNG TỪ HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA CÂY BẠCH ĐÀN TRẮNG (Eucalyptus camaldulensis Dahnardt) PHỤC VỤ PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY Ở TÔM CHÂN TRẮNG Lê Minh Hải1, Mai Thị Minh Ngọc2 , Đoàn Quốc Hưng1 TÓM TẮT Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPNS) do tác nhân vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra là một trong những nguyên nhân ảnh hưởng trực tiếp tới sự phát triển bền vững của ngành nuôi tôm công nghiệp. Nghiên cứu được tiến hành nhằm mục đích tìm ra các thông số kỹ thuật tối ưu của quy trình trích lý tinh dầu bạch đàn, đánh giá khả năng kháng khuẩn của tinh dầu và chế phẩm nhũ tương tinh dầu bạch đàn đối với 2 chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus DHM-03.18, V. parahaemolyticus DHM-04.19 gây bệnh AHPNS ở tôm nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm in vitro. Kết quả nghiên cứu cho thấy các yếu tố trích lý, có ảnh hưởng đến hiệu suất trích lý tinh dầu bạch đàn và các điều kiện phù hợp để chưng cất tinh dầu bạch đàn bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước là: tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1/7, nhiệt độ 1400C, thời gian 4,5 giờ. Thử nghiệm cho thấy khả năng ức chế các chủng vi khuẩn Vibrio gây AHPNS của dịch chiết tinh dầu cây Bạch đàn trắng tương đối tốt, khả năng ức chế vi khuẩn tỷ lệ thuận với lượng tinh dầu bổ sung. Đường kính vòng vô khuẩn thu được thấp nhất là 9,35 mm ứng với lượng tinh dầu 25 µl và đường kính vòng vô khuẩn thu được cao nhất là 23,55 mm với nồng độ thảo dược là 100 µl. Sử dụng chế phẩm nhũ tương tinh dầu bạch đàn trắng trị bệnh AHPNS trên tôm chân trắng cho thấy tỷ lệ chết giảm. Từ khóa: AHPNS, bạch đàn, tinh dầu, Vibrio, tôm chân trắng. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ2 trị bệnh mà thân thiện với môi trường và đảm bảo an toàn thực phẩm (Cos et al., 2006). Kháng sinh có Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPNS) do tác nhân nguồn gốc thảo dược đã và đang được nghiên cứu vi khuẩn V. parahaemolyticus gây ra là một trong ứng dụng trong phòng trị bệnh (Nguyễn Văn Thanh những nguyên nhân ảnh hưởng trực tiếp tới sự phát và Nguyễn Thanh Hải, 2014). Dịch chiết lá sim và triển bền vững của ngành nuôi tôm công nghiệp. Do dịch chiết hạt sim đều cho kết quả kháng vi khuẩn tác nhân gây AHPNS là vi khuẩn nên việc lạm dụng gây AHPNS trong điều kiện in vitro (Đặng Thị Lụa kháng sinh trong nuôi tôm đã phổ biến thì nay lại và cs., 2015). càng trở nên thường xuyên và tràn lan. Sự lạm dụng thuốc kháng sinh và sự thiếu hiểu biết về kháng sinh Cây bạch đàn trắng được xem là cây dược liệu có trong nuôi trồng thủy sản nói chung đã gây ảnh thể dùng tươi, khô hoặc bào chế thành tinh dầu đều hưởng xấu tới sức khỏe động vật nuôi, môi trường được. Tinh dầu bạch đàn trắng được sử dụng để làm sinh thái và đặc biệt là tạo ra các chủng vi khuẩn thuốc hỗ trợ kháng khuẩn đường hô hấp và chữa một kháng lại thuốc kháng sinh, làm giảm hiệu quả điều số bệnh ngoài da. Là nguyên liệu chính cho chất trị bệnh và tăng nguy cơ nhiễm khuẩn có khả năng gôm, có tác dụng điều trị tiêu chảy, dùng làm săn kháng thuốc cho con người, động vật và tồn dư trong chắc niêm mạc họng, chống nhiễm trùng vết thương, thịt động vật thủy sản (Brown, 1989). Do vậy, hiện chữa họng bị giãn và hỗ trợ cải thiện một số bệnh lý nay hướng nghiên cứu các chất có hoạt tính kháng về nha khoa (Đỗ Tất Lợi, 1999). Nhiều nghiên cứu đã khuẩn nguồn gốc thảo dược được tập trung nghiên khẳng định, hoạt chất chiết xuất từ cây bạch đàn cứu nhằm tạo ra các sản phẩm sử dụng trong phòng trắng có khả năng tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn gây bệnh trong đó đã có những chủng vi khuẩn kháng lại nhiều loại kháng sinh. Trong nghiên cứu này, xác 1 Trường Đại học Vinh định các yếu tố trích ly tối ưu trong trích ly tinh dầu 2 Trường Đại học Mở Hà Nội N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 85
  2. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ bạch đàn và thử nghiệm, đánh giá khả năng kháng khuẩn lạc đơn điển hình. Khuẩn lạc đơn được nuôi khuẩn của tinh dầu bạch đàn trắng và chế phẩm cấy lắc trong bình tam giác với môi trường NB có bổ dạng nhũ tương đối với một số chủng vi khuẩn gây sung 2% NaCl đặt trong tủ ấm lắc ở 290C, tốc độ lắc bệnh AHPNS nguy hiểm trên tôm, làm cơ sở khoa 200 vòng/phút trong 15 giờ. Mật độ vi khuẩn sau khi học cho việc chế tạo các sản phẩm phòng trị bệnh nuôi cấy trong môi trường NB được xác định theo động vật thủy sản có nguồn gốc thảo dược. phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng  = 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 600 nm. Mật độ vi khuẩn sử dụng để định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của mẫu tinh dầu là là 108 2.1. Vật liệu nghiên cứu cfu/ml. Lá bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis 2.2.3. Phương pháp thử nghiệm nồng độ ức chế Dahnardt) được thu hái là loại lá trưởng thành sau tối thiểu (MIC) búp hai lá, được rửa sạch và sấy ở nhiệt độ 400C đến Xác định MIC (Minimum Inhibitory khô. Lá khô được nghiền nhỏ đến đường kính < 0,1 Concentration) được xác định theo phương pháp hòa mm, bảo quản trong túi nilon kín ở 40C làm nguyên tan trong môi trường lỏng TSB. Pha dung dịch đối liệu để tách chiết. Vi khuẩn V. parahaemolyticus chứng và tinh dầu thành dãy nồng độ cần thử. Dãy DHM-03.18, V. parahaemolyticus DHM-04.19 gây nồng độ tinh dầu cần thử là 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, AHPND đang được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm 40 ppm, 80 ppm, 160 ppm, 320 ppm, 640 ppm, 1280 Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Hà ppm, 2560 ppm. Dùng micro pipette hút tinh dầu đã Nội. pha loãng theo dãy nồng độ thử và dung dịch đối Nguyên vật liệu khác bao gồm: Môi trường chọn chứng (DMSO) vào các ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn lọc của vi khuẩn Vibrio là Thiosulfate Citrate Bile môi trường. Lắc đều cho tinh dầu và dung dịch đối Salts (TCBS) rắn, được sử dụng để nuôi cấy vi chứng hòa tan đều vào môi trường. Dùng micro khuẩn. Môi trường Nutrient Broth (NB) dạng lỏng pipette hút 20 µl dịch vi khuẩn đã chuẩn bị đưa vào có bổ sung 2% NaCl, được hấp khử trùng ở 121oC các ống nghiệm. Nuôi ở 290C/24 giờ. Mỗi thí nghiệm trong 15 phút và dùng để nuôi cấy thu dịch vi khuẩn. lặp lại 3 lần. Đọc kết quả, tìm MIC của tinh dầu cho Môi trường Mueller Hinton Agar (MA) bổ sung 2% từng loại vi khuẩn. NaCl được hấp tiệt trùng để nguội tới 40 - 50oC, đổ 2.2.4. Phương pháp bào chế nano nhũ tương vào đĩa petri có đường kính 10 cm với độ dày 4 ± 0,2 mm, sử dụng để thử kháng sinh đồ. - Pha nước: nước, glycerin, dung dịch đệm phosphat pH 7,4 được đun nóng 70 - 750C. 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Pha dầu: Tween 80, tinh dầu, Transcutol HP: 2.2.1. Phương pháp lôi cuốn hơi nước tách chiết đun nóng 65-700C. tinh dầu bạch đàn trắng - Kết hợp 2 pha, siêu âm trong 5 phút; lọc qua Nguyên tắc: Bột lá bạch đàn khô được bổ sung màng cellulose acetat 0,2 µm. nước và gia nhiệt cho đến khi hỗn hợp sôi, hơi nước 2.2.5. Xác định hình thái, kích thước hạt nano tạo thành sẽ lôi cuốn tinh dầu đi lên. 40 g bột lá bạch nhũ tương đàn khô được bổ sung nước cất với tỷ lệ 1/5, 1/6, 1/7, 1/8 và 1/9 (bột lá bạch đàn: nước cất) và gia Dữ liệu được chụp hình bởi sự trợ giúp của máy nhiệt ở nhiệt độ 100-1400C trong thời gian 2,5-5 giờ. TEM (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương). Hỗn hợp hơi lỏng tiếp tục vào hệ thống làm nguội và 2.2.6. Phương pháp thử nghiệm trên động vật thí ngưng tụ tạo thành dung dịch tinh dầu thô. Dung nghiệm dịch này được bổ sung muối khan Na2SO4 với hàm Tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) ở giai lượng 5% khối lượng/thể tích tinh dầu để tách, ly tâm đoạn PL15 được mua từ Tập đoàn Việt Úc, tôm trước thu tinh dầu tinh chế. khi thí nghiệm được xác định âm tính với V. 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn parahaemolyticus bằng kỹ thuật PCR, sau đó tôm được thuần dưỡng ở độ mặn 15‰ trong 15 ngày. Các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus DHM- 03.18, V. parahaemolyticus DHM-04.19 được cấy trên Tôm chân trắng ăn thức ăn bổ sung tinh dầu đĩa thạch TCBS trong tủ ấm 290 C/24 giờ để chọn bạch đàn hoặc nhũ tương tinh dầu bạch đàn sau 30 86 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020
  3. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ngày được gây nhiễm với sinh khối 02 chủng vi tăng thể tích thiết bị. Do vậy, xác định tỉ lệ nguyên khuẩn V. parahaemolyticus DHM-03.18, V. liệu/dung môi thích hợp cho quá trình trích ly để đạt parahaemolyticus DHM-04.19 có mật độ vi khuẩn hiệu quả kinh tế cao nhất là cần thiết. 108CFU/ml bằng phương pháp ngâm (Loc et al., Trong thí nghiệm này đã cố định bột lá bạch đàn 2013). Cụ thể, thí nghiệm gây nhiễm gồm 8 công là 40 g và thay đổi lượng nước thêm vào để đạt tỷ lệ thức thí nghiệm và lặp lại 3 lần, cụ thể 1) công thức nguyên liệu/dung môi từ 1/5 đến 1/9. đối chứng dương: không bổ sung cao chiết và gây nhiễm V. parahaemolyticus; 2) công thức thí nghiệm 0,5%: tinh dầu bạch đàn hoặc nhũ tương tinh dầu bạch đàn mức 0,5% và gây nhiễm V. parahaemolyticus; 3) công thức thí nghiệm 1,0%: tinh dầu bạch đàn hoặc nhũ tương tinh dầu bạch đàn 1,0% và gây nhiễm V. parahaemolyticus; 4) công thức thí nghiệm 1,5%: tinh dầu bạch đàn hoặc nhũ tương tinh dầu bạch đàn 1,5% và gây nhiễm V. parahaemolyticus; 5) công thức đối chứng âm: Hình 1. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi Không bổ sung cao chiết và không nhiễm V. đến lượng tinh dầu bạch đàn parahaemolyticus. Tôm được bố trí trong bể kính có Kết quả nghiên cứu và số liệu trên hình 1 cho thể tích 50 lít, độ mặn là 15‰ và được sục khí liên tục thấy lượng tinh dầu thu được có xu hướng tăng tỷ lệ với số lượng 20 con/bể. Tôm chết sau gây nhiễm thuận với lượng dung môi sử dụng. Với các mẫu tỷ lệ được ghi nhận dấu hiệu bệnh lý và tái định danh lại vi nguyên liệu/dung môi 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, lượng khuẩn gây nhiễm bằng kỹ thuật PCR. tinh dầu thu được tương ứng là 0,51; 0,57; 0,69; 0,69 Tỷ lệ sống (%) = (Tổng số tôm thí nghiệm - Tổng và 0,66 ml. Quy luật biến thiên này cũng phù hợp với số tôm thí nghiệm chết) × 100. công bố trước đây của Nguyễn Hoàng Lan và cộng sự (2014) trong nghiên cứu công nghệ trích ly tinh 2.2.7. Xử lý số liệu dầu từ lá tía tô. Từ kết quả nghiên cứu trên đã lựa Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được chọn tỷ lệ nguyên liệu/nước là 1/7 cho các thí lặp lại 3 lần. Số liệu được xử lý thống kê sinh học sử nghiệm tiếp theo. dụng Paired t-test với sự sai khác có ý nghĩa P < 0,05. 3.1.2. Xác định nhiệt độ trích ly 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan 3.1. Nghiên cứu các điều kiện trích ly tinh dầu trọng ảnh hưởng đến quá trình trích ly tinh dầu. bạch đàn trắng Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các mức nhiệt độ 3.1.1. Xác định tỷ lệ nước bổ sung vào mẫu trích khác nhau (100 - 1400 C) đến lượng thu hồi tinh ly dầu bạch đàn được trình bày trong hình 2. Trong quá trình trích ly bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, nước được bổ sung vào mẫu bột lá bạch đàn và gia nhiệt sẽ thẩm thấu vào trong các lớp tế bào, gây phá vỡ túi tinh dầu và lôi cuốn tinh dầu theo hơi nước trong quá trình chưng cất. Nếu lượng nước quá ít thì không đủ hòa tan các chất keo, muối bao bọc xung quanh túi tinh dầu, làm tinh dầu không thoát ra được. Sử dụng càng nhiều dung môi để trích ly thì khả năng khuếch tán của tinh dầu vào dung Hình 2. Sự biến thiên lượng tinh dầu bạch đàn theo môi càng lớn (Đặng Thị Lụa, 2015). Tuy nhiên, ở một nhiệt độ trích ly giới hạn nhất định lượng tinh dầu thu hồi sẽ tăng lên không đáng kể dù tăng lượng dung môi. Bên cạnh Kết quả nghiên cứu cho thấy lượng tinh dầu thu đó, lượng nước quá nhiều làm giảm hiệu quả kinh tế nhận tăng dần theo các mức nhiệt độ 100, 110, 120, của quá trình chưng cất do tốn năng lượng cấp nhiệt, 130, 1400C và đạt giá trị cao nhất ở 1400C với các giá N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 87
  4. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ trị tương ứng là 0,88; 0,94; 1,12, 1,58; 1,60 ml. Với kết thu được khi tách chiết tinh dầu riềng theo công bố quả thu được đã xác định nhiệt độ chưng cất là của Võ Kim Thành và cộng sự (2010). Mặt khác, thời 1400C. gian trích ly kéo dài làm tiêu hao nhiều năng lượng Kết quả nghiên cứu và công bố trước đây của cho quá trình cấp nhiệt. Nguyễn Hoàng Lan và cộng Nguyễn Thị Hoàng Lan và cộng sự (2014) trong sự (2014) trong nghiên cứu công nghệ trích ly tinh nghiên cứu công nghệ trích ly tinh dầu từ lá tía tô dầu từ lá tía tô thì thời gian trích ly được khảo sát là cho thấy nhiệt độ trích lý tinh dầu ở 5 mức nhiệt độ: 10, 11,12, 13, 14 giờ, kết quả nghiên cứu cho thấy 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, 70oC thì hiệu suất thu nhận thời gian trích ly càng dài thì hiệu suất thu nhận tinh tinh dầu tăng và hiệu suất thu nhận tinh dầu đạt cao dầu càng cao. Tuy nhiên, khi thời gian tăng lên 13 và nhất (92,11%). Tăng nhiệt độ lên 70oC, hiệu suất thu 14 giờ thì hiệu suất thu nhận tinh dầu có tăng nhưng nhận lại giảm (89,91%). Do đó, nhiệt độ 60oC là thích không đáng kể. hợp cho quá trình trích ly tinh dầu tía tô. So sách kết Vì vậy, thời gian thích hợp để trích ly tinh dầu quả nghiên cứu của chúng tôi với nghiên cứu của bạch đàn bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi Nguyễn Hoàng Lan và cộng sự (2014) trong nước là 4,5 giờ. nghiên cứu công nghệ trích ly tinh dầu từ lá tía tô 3.2. Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của tinh thì có sự khác biệt về mức nhiệt độ trích lý giữa 2 dầu bạch đàn loài cây bạch đàn trắng và tía tô. Tác dụng diệt khuẩn của tinh dầu bạch đàn trên 3.1.3. Xác định thời gian trích ly vi khuẩn gây AHPNS Thời gian trích ly phụ thuộc vào các yếu tố: Khả năng diệt vi khuẩn gây AHPNS của tinh dầu nguyên liệu, dung môi, nhiệt độ, bên cạnh đó, về bạch đàn được thể hiện trên bảng 1 và hình 4. Kết nguyên tắc thì thời gian trích ly càng dài thì hàm quả cho thấy tinh dầu bạch đàn có khả năng ức chế lượng tinh dầu thu hồi càng cao (Đặng Thị Lụa, các chủng vi khuẩn Vibrio gây AHPNS, đường kính 2015). Tuy nhiên, khi kéo dài thời gian đến một giới vòng vô khuẩn bình quân tăng dần theo lượng tinh hạn nhất định thì lượng tinh dầu thu được không dầu bạch đàn sử dụng. tăng nữa, đồng thời có thể ảnh hưởng xấu đến chất Bảng 1. Tác dụng tiêu diệt vi khuẩn gây AHPNS của lượng sản phẩm. Do vậy, cần xác định thời gian trích tinh dầu bạch đàn in vitro ly thích hợp. Thời gian trích ly được khảo sát là từ 3- 5 giờ. Lượng Đường kính vòng vô khuẩn (mm)/các tinh chủng vi khuẩn dầu sử dụng V. parahaemolyticus V. parahaemolyticus (µl) DHM-03.18 DHM-04.19 25 9,35 ± 0,05 13,06 ± 0,13 50 12,71 ± 0,18 13,40 ± 0,07 75 13,52 ± 0,25 13,90 ± 0,10 100 23,54 ± 0,51 23,55 ± 0,19 Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng ức chế các chủng vi khuẩn Vibrio gây AHPNS của dịch chiết Hình 3. Sự biến thiên lượng tinh dầu bạch đàn theo tương đối tốt, trong đó tác dụng đối với chủng vi thời gian trích ly khuẩn V. parahaemolyticus DHM-04.19 cao hơn so với Số liệu ở hình 3 cho thấy: lượng tinh dầu thu hồi chủng V. parahaemolyticus DHM-03.18 (Hình 4). Khả có xu hướng tăng theo thời gian trích ly. Cụ thể năng ức chế vi khuẩn tỷ lệ thuận với lượng tinh dầu lượng tinh dầu từ các mẫu thí nghiệm chưng cất ở 3; bổ sung, đối với chủng V. parahaemolyticus DHM- 3,5; 4 giờ thu được tương ứng là: 0,87; 1,08; 1,15; 1,18 03.18, đường kính vòng vô khuẩn thu được thấp nhất ml. Tuy nhiên, khi mẫu được chưng cất ở 5 giờ thì là 9,35 mm ứng với lượng tinh dầu 25 µl và đường lượng tinh dầu thu hồi được tương đương với lượng kính vòng vô khuẩn thu được cao nhất là 23,54 mm tinh dầu thu hồi sau 4 giờ trích ly. Kết quả này cũng ứng với nồng độ thảo dược là 100 µl. Tương tự đối với phù hợp với quy luật biến thiên của lượng sản phẩm chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus DHM-04.19 88 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020
  5. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ đường kính vòng vô khuẩn thu được thấp nhất là hoạt chất không hòa tan trong nước dẫn đến khó áp 13,06 mm và cao nhất là 23,55 mm. Đặc biệt, sự sai dụng trong nuôi trồng thủy sản. khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Các hoạt chất nếu không được tách chiết sẽ khó phát huy tác dụng do khó kiểm soát được liều thực tế của hoạt chất vì vậy không xác định được liều phòng bệnh hay trị bệnh hiệu quả. Bên cạnh đó, đối với các loại chế phẩm ở dạng tinh dầu, do mức độ phân tán và thẩm thấu hạn chế cũng dẫn tới hiệu xuất sử dụng kém làm giảm hiệu quả điều trị. Việc bào chế các chế phẩm nhũ tương ở dạng nano với kích thước 100-400 nm làm giảm sức căng bề mặt, xác định được hàm lượng hoạt chất trong một liều điều trị hiệu quả, giúp phân tán đều chế phẩm trong môi trường, tăng cường sự hấp thu, thẩm thấu chế phẩm trong cơ thể vật chủ để điều trị hiệu quả. Bảng 2. Thành phần của dịch nhũ tương tinh dầu Hình 4. Khả năng kháng vi khuẩn gây AHPNS của bạch đàn tinh dầu lá bạch đàn Thành phần Khoảng biến thiên Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả Nồng độ Span 80 0,5 - 1,5 (%) công bố của một số nhóm nghiên cứu trước về khả Loại chất diện hoạt thân nước 1% năng kháng khuẩn của dịch chiết từ thực vật. Nghiên (Tween 80/Cremophor EL) cứu về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết thảo Tinh dầu bạch đàn 3-5 (%) dược đối với vi khuẩn Vibrio spp. gây AHPNS, Đặng Loại dung môi dầu (Labrafac Thị Lụa và công sự (2015) cũng đã bước đầu cho PG, Isopropyl mirista) 3-5(%) thấy tiềm năng kháng vi khuẩn gây AHPNS của dịch Transcutol HP 1-2(%) chiết lá trầu không và lá ổi với đường kính vòng vô Loại dung dịch đệm (Borat, 0,1 - 0,2 M khuẩn tương ứng dao động từ 15 - 17,3 mm và 14,6 – Phosphate, Citrate) (vừa đủ 100%) 20 mm. So sánh với kết quả trên, khả năng kháng pH 6,5 - 7,5 khuẩn của tinh dầu bạch đàn là cao hơn so với dịch chiết lá trầu không và dịch chiết lá ổi. Trong nghiên cứu này, chế phẩm kháng sinh dạng nhũ tương nano từ lá bạch đàn dùng để phòng Kết quả nghiên cứu này cho biết tinh dầu bạch và điều trị bệnh cho tôm nuôi được bào chế thông đàn có tiềm năng phát triển thành chế phẩm thảo qua hai bước: i) tách chiết tinh dầu bằng phương dược phòng trị AHPNS trên tôm. Hơn nữa, cây bạch pháp lôi cuốn hơi nước và ii) nhũ hóa bằng phương đàn là loại cây rất phổ biến ở nước ta, việc thu hái pháp siêu âm để sản xuất các chế phẩm dạng nhũ như phương pháp đã miêu tả rất đơn giản, dễ làm và tương nano từ thực vật phòng và điều trị bệnh dễ áp dụng là điều kiện thuận lợi để có nguồn vật liệu AHPNS cho tôm nuôi. Việc nhũ tương hóa tinh dầu để sản xuất chế phẩm với số lượng lớn. bạch đàn sẽ tập trung được các hoạt chất với nồng độ 3.3. Nghiên cứu các điều kiện tạo nhũ tương tinh cao, giữ nguyên vẹn được hoạt tính sinh học, không dầu bạch đàn trắng gây ô nhiễm môi trường so với dạng thô, giảm gây Trên thực tế, việc phòng và điều trị bệnh cho thất thoát hoạt chất so với dạng cao đặc, giảm thiểu tôm chủ yếu vẫn sử dụng kháng sinh. Nguyên nhân thất thoát hoạt chất so với dạng tinh dầu. Các chế chủ yếu là do hiệu quả phòng trị bệnh của các chế phẩm nhũ tương dạng nano này với những ưu điểm phẩm thảo dược chưa cao, lượng sử dụng nhiều, thời nổi bật so với phương pháp truyền thống như kích gian sử dụng kéo dài. Trong thực tế, phần lớn các thước nm, được bổ sung chất hoạt động bề mặt giúp hoạt chất kháng sinh, kháng nấm trong thực vật đều tăng độ hòa tan trong nước và có tính ổn định nhiệt được thu nhận bằng những phương pháp truyền động học cao, dễ dàng thẩm thấu vào tế bào và giúp thống, do đó độ ổn định chưa cao, nhất là với những tăng độ hấp thụ ở động vật thủy sản, qua đó có thể N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 89
  6. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ứng dụng tốt trong điều trị bệnh cho tôm nuôi công tăng độ nhớt của nano nhũ tương nên làm chậm tốc nghiệp. độ khuếch tán dược chất ra khỏi hệ. Trong các nghiên cứu này, công thức nhũ hóa 3.3.2. Xác định hình thái, kích thước hạt nano tinh dầu bạch đàn được thực hiện theo bảng 2 với các nhũ tương (TEM) thành phần cơ bản như sau: tinh dầu, glycerin (5%) Cấu trúc nano nhũ tương có tinh dầu bạch đàn Tween 80 (hoặc Cremophor EL, Tween qua chụp TEM cho thấy có sự phân bố giọt đồng đều 80/Cremophor EL (1/1)), Span 80, Labrafac PG nhau và kích thước hạt nằm trong khoảng từ 20 - 250 (hoặc isopropyl myristat), Transcutol HP, đệm borat nm. Điều này có thể cho thấy tinh dầu vừa chứa hoạt (phosphat, citrat) (vừa đủ 100% kl/kl). chất vừa là chất diện hoạt yếu, nó giúp phân tách các 3.3.1. Ảnh hưởng của các thành phần và loại hạt nano nhũ tương nhờ lực đẩy ion vì thế các hạt thành phần tới sự giải phóng của hạt nhũ tương tách rời hẳn nhau và có kích thước khá đồng đều. Về ảnh hưởng của Tween 80 và isopropyl myristat tới mức độ giải phóng dược chất từ nano nhũ tương, kết quả trong hình 5 cho thấy nếu loại dung môi pha dầu là isopropyl myristat tăng và lượng Tween 80 giảm thì sẽ làm tăng mức độ giải phóng. Hình 7. Ảnh chụp TEM của nano nhũ tương chứa tinh dầu bạch đàn 3.4. Nghiên cứu tác dụng phòng bệnh do hoại tử gan tụy ở tôm bằng nhũ tương tinh dầu Hình 5. Ảnh hưởng của isopropyl myristat và Tôm thẻ chân trắng ăn thức ăn bổ sung nhũ Tween 80 tới mức độ giải phóng dược chất từ tương tinh dầu bạch đàn và tinh dầu sau 30 ngày thì nano nhũ tương (Span 80 = 1,0%, Transcutol HP = được gây nhiễm với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus 1,5%, đệm phosphat 0,15 M, pH = 7,0) DHM-03.18, theo dõi các biểu hiện lâm sàng và tỷ lệ sống của tôm sau 14 ngày gây nhiễm. Hình 6. Ảnh hưởng của lượng tinh dầu và Span 80 tới phần trăm giải phóng dược chất sau 6 giờ (isopropyl myristat = 4,0%, Transcutol HP = 1,5%, đệm citrat 0,15 M, pH = 7,0) Kết quả nghiên cứu và hình 6 chỉ ra khi lượng Hình 8. Tỷ lệ sống sót của tôm thí nghiệm sau 14 tinh dầu giảm và lượng Span 80 giảm thì phần trăm ngày thí nghiệm (%) dược chất giải phóng sau 6 giờ tăng. Điều này có thể Kết quả nghiên cứu được trình bày tại hình 8 cho thấy rằng với hoạt chất trong dạng nhũ tương có độ thấy: ở các bể đối chứng âm không xuất hiện tôm tan trong pha nước lớn hơn tinh dầu. Bên cạnh đó, chết, tỷ lệ sống đạt 100% cho đến khi kết thúc thí tinh dầu, bản thân nó cũng là một chất diện hoạt yếu nghiệm, tôm hoạt động bình thường, gan tụy sẫm giúp cho sự hình thành nano nhũ tương một cách dễ màu, ruột đầy thức ăn. Ở bể đối chứng dương, tôm dàng do vậy khi tăng tỉ lệ Tween 80, Span 80 chỉ làm bắt đầu chết vào ngày thứ 2 sau khi gây nhiễm và 90 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020
  7. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ giảm mạnh ở ngày thứ 3-9, tỷ lệ sống của bể đối Nghiên cứu của Jayanthi et al. (2013) cũng cho chứng dương là 15% sau 9 ngày gây nhiễm. Ở các rằng, chiết xuất ethanol của lá cây đậu dầu công thức thí nghiệm bổ sung tinh dầu với hàm (Pongamia pinnata) giúp tăng tỉ lệ sống của tôm sú lượng 1 và 1,5% và bổ sung nhũ tương tinh dầu với (Penaeus monodon) khi gây nhiễm với WSSV. Tỷ lệ hàm lượng 0,5-1% thì tôm ngừng chết sau 5 ngày thí sống của tôm được bổ sung chiết xuất ở mức 200 và nghiệm, riêng công thức thí nghiệm bổ sung 0,5% 300 µg/g khối lượng thân tương ứng là 40% và 80%. tinh dầu thì tôm ngừng chết sau 8 ngày thí nghiệm. Nghiên cứu của Immanuel et al. (2004) sử dụng chiết So sánh tác dụng điều trị bệnh do vi khuẩn V. xuất thầu dầu làm thức ăn cho tôm Peneaus indicus parahaemolyticus gây ra ở tôm của tinh dầu và nhũ (PL30) liên tục trong 30 ngày. Kết quả ghi nhận tỷ lệ tương tinh dầu bạch đàn cho thấy, tỷ lệ sống của tôm sống của tôm ở công thức thí nghiệm bổ sung cao ở các bể sử dụng nhũ tương tinh dầu bạch đàn đạt chiết thầu dầu (58,88%) cao hơn công thức thí cao hơn so với các bể sử dụng tinh dầu ở cùng hàm nghiệm đối chứng (24,44%); ngoài ra, các loại thảo lượng, cụ thể: ở tất cả các bể thí nghiệm với hàm dược khác được sử dụng trong thí nghiệm này cũng lượng nhũ tương tinh dầu, tỷ lệ tôm sống đều đạt 95% mang lại kết quả tương tự. Balasubramanian et al. sau 5 ngày thí nghiệm và duy trì đến ngày thứ 14 (2008) nghiên cứu hoạt tính kháng virus (WSSV) trong khi các bể thí nghiệm với hàm lượng tinh dầu trên tôm sú (P. monodon) của chiết xuất cây cỏ gà là 0,5%, tỷ lệ tôm sống đạt 75% sau 8 ngày thí nghiệm, (Cynodon dactylon). còn các bể thí nghiệm với hàm lượng tinh dầu là 1 và Kết quả nghiên cứu cho thấy chiết xuất C. 1,5% thì tỷ lệ tôm sống đạt 85% sau 5 ngày thí dactylon có hiệu quả cao trong việc phòng bệnh do nghiệm. WSSV; không có tôm chết ở công thức thí nghiệm Bên cạnh đó, quan sát dấu hiệu lâm sàng của bổ sung 2% chiết xuất so với tỷ lệ chết 40% ở công tôm sau khi gây nhiễm đã nhận thấy: sau 12 - 15 giờ thức thí nghiệm bổ sung 1% chiết xuất. Tôm chân gây nhiễm ở các công thức thí nghiệm bổ sung tinh trắng được bổ sung cao chiết Gynura bicolor trong dầu với hàm lượng 0,5; 1 và 1,5% tôm có dấu hiệu 6 ngày và gây nhiễm với V. alginolyticus. Kết quả giảm hoạt động, đặc biệt ở bể đối chứng dương, sau cho thấy tỷ lệ sống của tôm ăn thức ăn bổ sung G. 24 giờ gây nhiễm, tôm có dấu hiệu bơi lờ đờ ít hoạt bicolor ở nồng độ 0,5; 1,0 và 2 g/kg thức ăn (36,7; động, bỏ ăn, ruột rỗng, gan tụy nhạt màu và teo 43,3 và 56,7%) cao hơn đáng kể (p
  8. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Dịch chiết tinh dầu và nhũ tương tinh dầu bạch 8. Nguyễn Văn Đàn và Nguyễn Viết Tựu (1985). đàn trắng có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y Vibrio gây AHPNS tương đối tốt, khả năng ức chế vi học thành phố Hồ Chí Minh. khuẩn tỷ lệ thuận với lượng tinh dầu bổ sung, sự sai 9. Nguyễn Thị Hạnh và Đặng Thị Lụa (2015). khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Tác dụng diệt khuẩn của cây diệp hạ châu đắng Thành phần Tween 80, Span 80 và isopropyl (Phyllanthus amarus) đối với vi khuẩn gây bệnh hoại myristate có ảnh hưởng tới mức độ giải phóng dược tử gan tụy cấp trên tôm nuôi nước lợ. Hội nghị Khoa chất từ nano nhũ tương. Cấu trúc nano nhũ tương có học trẻ Thủy sản toàn quốc lần thứ VI, RIA3, trang 5. tinh dầu bạch đàn qua chụp TEM cho thấy có sự 10. Nguyễn Thanh Hải và Bùi Thị Tho (2013). phân bố giọt đồng đều nhau và kích thước hạt nằm Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết tỏi trong khoảng từ 20 - 250 nm. (Allium sativum L.) đối với E. coli kháng ampicillin, TÀI LIỆU THAM KHẢO kanamycin. Tạp chí Khoa học và Phát triển 2013, tập 1. Ashida, M., and H. I. Yamazaki. (1990). 11, số 6: 804- 808. Biochemistry of the phenoloxidase system in insects 11. Immanuel, G., Vincybai, V. C., Sivaram, V., with special reference to its activation. In: Ohnishi E. Palavesam, A., and Marian, M. P. (2004). Effect of and Ishizaki H. (eds). Molting and Metamorphosis. butanolic extracts from terrestrial herbs and Springer-Verlag, Berlin. pp. 239–265. seaweeds on the survival, growth and pathogen 2. Aureli, P., Costantini, A., and Zolea, S. (1992). (Vibrio parahaemolyticus) load on shrimp Penaeus Antimicrobial activity of some plant essential oils indicus juveniles. Aquaculture. 236(1-4): 53-65. against Listeria monocytogenes. Journal of food 12. Lightner, D. V., Redman, R. M., Pantoja, C. protection. 55(5): 344-348. R., Noble, B. L., Loc, T. (2012). In: M. Shariff, R.P. Subasinghe and J.R. Authur (eds.) Diseases in Asian 3. Balasubramanian, G., Sarathi, M., Kumar, S.R., and Hameed, A. S. (2007). Screening the Aquaculture 1.Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, Philippines.pp. 143-155. antiviral activity of Indian medicinal plants against white spot syndrome virus in shrimp. Aquaculture. 13. Đặng Thị Lụa, Nguyễn Thị Hạnh, Hoàng Hải 263(1): 15-19. Hà, Trường Thị Mỹ Hạnh, Phan Thị Vân (2015). Tác dụng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá trầu không 4. Brown J. (1989). Antibiotics: their use and (Piper betle L.) và dịch chiết lá ổi (Psidium guajava) abuse in aquaculture. World Aquac., 20(2): 34 - 43. đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính 5. Chang, Y. P., Liu, C. H., Wu, C. C., Chiang, C. trên tôm nuôi nước lợ. Tạp chí Nông nghiệp và Phát M., Lian, J. L., and Hsieh, S. L. (2012). Dietary triển nông thôn, 11/2015: 92 – 97. administration of zingerone to enhance growth, non- 14. Đặng Thị Lụa, Lại Thị Ngọc Hà, Nguyễn specific immune response, and resistance to Vibrio Thanh Hải (2015). Tác dụng diệt khuẩn của dịch alginolyticus in Pacific white shrimp (Litopenaeus chiết là sim (Rhodomyrtus tomentosa) đối với vi vannamei) juveniles. Fish & shellfish immunology. khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm nuôi 32(2): 284-290. nước lợ. Tạp chí Khoa học và Phát triển 2015, tập 13, 6. Cos P., Vlietinck A. J., Berghe D. V., and Maes số 7: 1101-1108. L. (2006). Anti-infective potential of natural products: 15. Nguyễn Thị Hoàng Lan, Bùi Quang Thuât, How to develop a stronger in vitro ‘proof of concept’. Lê Danh Tuyên, Ngô Thị Huyền Trang, Đỗ Thị J. Ethnopharmacol., 106(3): 290 -302. Trang (2014). Nghiên cứu công nghệ trích ly tinh 7. Huỳnh Kim Diệu, Lê Thị Loan Em (2011). dầu từ lá tía tô. Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập Đánh giá đặc tính thuần chủng và hoạt tính kháng 12, số 3:404-411. khuẩn của cây cỏ mực (Eclipta prostra) và cây diệp 16. Đỗ Tất Lợi (1968). Những cây thuốc và vị hạ châu thân xanh (Phylilanthus niuri) ở đồng bằng thuốc Việt Nam. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. sông Cửu Long. Tạp chí Khoa học - Trường Đại học 17. Nguyễn Văn Thanh và Nguyễn Thanh Hải Cần Thơ. 2011:19a 149-155. (2014). Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của 92 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020
  9. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ dịch chiết cây mò hoa trắng (Clerodendron fragrans 18. Trịnh Thị Trang và Nguyễn Thanh Hải (2016). Vent.) trên vi khuẩn E. coli, Salmonella spp. phân lập Tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch từ phân lợn con theo mẹ mắc bệnh viêm ruột tiêu chiết lá Trầu không (Piper betle) đối với vi khuẩn chảy và thử nghiệm điều trị. Tạp chí Khoa học và Aeromonas SPP và Streptococcus agalactiae gây bệnh Phát triển, 12(5): 683 - 689. xuất huyết trên cá rô phi. Tạp chí Khoa học Việt Nam 2016, tập 14, số 6: 869- 8761. RESEARCH ON CREATING EMULSION FROM ANTIBACTERIAL COMPOUND OF Eucalyptus camaldulensis FOR PREVENTION TREATMENT OF HEPATOPANCREATIC NECROSIS IN WHITE SHRIMP Le Minh Hai, Mai Thi Minh Ngoc, Doan Quoc Hung Summary Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPNS) caused by V. parahaemolyticus is the main cause affecting the sustainable development of the shrimp farming industry. The study was conducted in order to find out the optimal specifications Eucalyptus essential oil extraction, assessing the antibacterial ability of essential oil and Eucalyptus essential oil to two strains of bacteria V. parahaemolyticus DHM-03.18, V. parahaemolyticus DHM-04.19 causing acute hepatopancreatic necrosis in shrimp cultured in vitro laboratory. The results show that the extraction factors, affecting the efficiency of extracting eucalyptus essential oil and the suitable conditions for distillating eucalyptus oil by steam attraction method are: materials/water ratio of 1/7, 1400C, 4.5 hours. The use of eucalyptus oil to inhibit AHPNS causing vibrio in the testing shows a positive result in which the resistance is positively correlated with the antimicrobial activity of esensial oil. The lowest obtained sterile ring diameter was 9.35 mm, corresponding to the amount of 25 µl of essential oil and the highest diameter of sterile ring was 23.55 mm with an herbal concentration of 100 µl. Using white eucalyptus oil emulsion to treat AHPNS on white shrimp showed that the mortality rate decreased and still developed well. Keywords: Essential oil, Eucalyptus camaldulensis, AHPND, Vibrio, white shrimp. Người phản biện: TS. Bùi Quang Tề Ngày nhận bài: 16/7/2020 Ngày thông qua phản biện: 17/8/2020 Ngày duyệt đăng: 24/8/2020 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 93
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD


intNumView=18

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2